CN109705198A

CN109705198A - OsCKX7蛋白质及其编码基因在调控植物纹枯病抗性中的应用

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Publication number: CN109705198A
Application number: CN201910071781.6A
Authority: CN
Inventors: 左示敏; 章慧敏; 冯志明; 陈宗祥; 张亚芳
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109705198B

Abstract

本发明公开了OsCKX7蛋白质及其编码基因在调控植物纹枯病抗性中的应用。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对受体水稻中的OsCKX7进行了编辑，获得OsCKX7‑KO水稻新品系。通过纹枯病抗性鉴定，发现OsCKX7‑KO水稻新品系相对于野生型对照品种，极显著的提高了水稻对纹枯病的抗性。进一步比较了OsCKX7‑KO水稻新品系与对照品种间的主要农艺性状和产量性状，发现对OsCKX7基因进行编辑不影响水稻的主要农艺性状和产量性状。以上结果表明，OsCKX7基因可以调控水稻纹枯病抗性，编辑OsCKX7基因可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。

Description

OsCKX7蛋白质及其编码基因在调控植物纹枯病抗性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsCKX7蛋白质及其编码基因在调控植物纹枯病抗性中的应用，特别涉及通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑水稻基因 OsCKX7实现水稻对纹枯病抗性的提高。

背景技术

CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein 9)技术是近年新兴的一种高效、便捷的生物基因编辑技术。CRISPR即规律成簇的间隔短回文重复，是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。该系统由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成，在gRNA的引导下，Cas9蛋白能够识别目标序列进行切割造成DNA的双链断裂(Baltes et al.,2015)。目前，CRISPR/Cas9技术已经广泛用于动植物中(SHAH QW,et al. 2013,31(8):686-688；FENGZ Y,et al.2013,23(10):1229-1232；FENG Z Y,et al.2013,23(10):1229-1232.；MAO Y Fet al.2013,6(6):2008-2011.)，已然成为最有价值与应用前景的生物技术之一。

纹枯病是世界性的水稻最重要的病害之一，随着矮化育种及高肥、密植栽培技术的采用，纹枯病危害逐渐加重，在我国南方稻区的许多地方，纹枯病已成为水稻的第一大病害(Eizenga等,Plant disease.2002(86):808-812；Hashiba等,Molecular Biology,Ecology,Pathology and Disease Control.1996:331-340)。水稻纹枯病致病菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)，属于宽寄主范围、强腐生性真菌，其主要为害水稻叶鞘，叶片也可罹病，导致叶片失水死亡，最终造成大幅度减产和品质降低(Lee等,Plantdisease.1983(67):829-833)。水稻对纹枯病的抗性为典型数量性状，易受环境影响，抗病育种中只能利用数量抗性基因，致使水稻抗纹枯病育种一直进展较慢。迄今已经有超过50个抗纹枯病QTLs(quantitative trait loci) 被初步定位(Jia等,Frontiers ofAgriculture in China.2009(3):231-239； Willocquet等,Euphytica.2011(178):1-22；Xu等,Plant Breeding.2011(130): 404-406；左示敏等,中国科学:生命科学.2011:1014-1023；左示敏等,扬州大学学报: 农业与生命科学版.2007(27):57-61)，至今未见克隆的报道。由于这些QTL的抗性效应均较小，影响了这些QTL在抗纹枯病育种新材料创制中的应用进程。

通过基因工程技术对水稻一些基因进行操作发现可以快速获得对水稻纹枯病抗性增强的水稻新材料。如超表达OsOSM1和OsPGIP1基因可以提高水稻对纹枯病的抗性 (XueX,et al.Plant Disease,2016,100(8)：1634-1642.；X.J.Chen,et al.Plant Disease,2015,100,388-395.)，而抑制OsSWEET11基因表达的材料也可增强水稻对纹枯病的抗病性(Gao Y,et al.Mol Plant Pathol.2018,19(9):2149-2161.)。这些研究表明通过基因工程技术改变水稻基因的表达可用于抗纹枯病新材料的创制。

细胞分裂素(CK)在植物的生长发育中具有重要的调节作用。CK脱氢酶(CKXs) 是调控CK降解的重要基因，它通过脱除CK不饱和异戊烯基侧链使细胞分裂素不可逆的失活以催化细胞分裂素不可逆的降解(Mcgaw B.A.,et al.Phytochemistry,1983, 22:1103-1105.)。然而，有关CKXs编码基因与水稻纹枯病抗性间的关系，尤其是通过基因工程技术改变CKX编码基因增强水稻对纹枯病抗性的研究，迄今未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高水稻对纹枯病的抗性，创制水稻纹枯病抗性新种质。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了OsCKX7蛋白质的新用途。

本发明提供了OsCKX7蛋白质在调控植物抗病性中的应用。

上述应用中，所述OsCKX7蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与OsCKX7蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与OsCKX7蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用。

本发明还提供了与OsCKX7蛋白质相关的生物材料在培育抗病性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了与OsCKX7蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码OsCKX7蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的基因组DNA分子或序列2所示的cDNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsCKX7蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsCKX7蛋白质的 cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsCKX7蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码OsCKX7蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsCKX7 蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2 次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，所述抗病性可为纹枯病抗性；所述调控具体体现在：当植物中的OsCKX7蛋白质的活性和/或含量降低时，所述植物对纹枯病的抗性提高；当植物中的OsCKX7蛋白质的活性和/或含量提高时，所述植物对纹枯病的抗性降低。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻；所述水稻品种具体可为徐稻3号(XD3)。

上述应用中，所述植物育种具体可为创制水稻纹枯病抗性新种质。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗病性提高的转基因水稻的方法。

本发明提供的培育抗病性提高的转基因水稻的方法包括降低受体水稻中OsCKX7蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因水稻的步骤；所述转基因水稻的抗病性高于所述受体水稻。

上述方法中，所述抗病性可为纹枯病抗性；所述转基因水稻的抗病性高于所述受体水稻具体体现在转基因水稻的纹枯病病级低于受体水稻和/或转基因水稻的纹枯病病斑长度小于受体水稻。

所述纹枯病病级以文献“Zuo S.M.,Yin Y.J.,Pan C.H.,et al.Fine mapping ofqSB-11LE,the QTL that confers partial resistance to rice sheathblight.Theoretical and Applied Genetics，2013，126:1257-1272.”中改进的纹枯病病级划分为标准。

上述方法中，所述降低受体水稻中OsCKX7蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体水稻中OsCKX7蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现的。

进一步的，可利用CRISPR/Cas9方法对所述受体水稻中OsCKX7蛋白质的编码基因进行敲除。

更进一步的，所述CRISPR/Cas9的靶序列可为序列4所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，利用CRISPR/Cas9方法对所述受体水稻中OsCKX7蛋白质的编码基因进行敲除的方法可按照如下步骤进行：将用于敲除OsCKX7蛋白质的编码基因的CRISPR/Cas9载体导入受体水稻中，得到转基因水稻。所述用于敲除OsCKX7 蛋白质的编码基因的CRISPR/Cas9载体的构建方法具体如下：将序列4所示的靶基因 OsCKX7的18bp基因特异性间隔序列(spacer)采用In-fusion重组酶克隆到入门载体pOs-sgRNA中，然后采用LR重组酶将OsCKX7的18bp基因特异性间隔序列重组到含有CAS9表达盒的目的载体pH-Ubi-cas9-7中，即得到用于敲除OsCKX7蛋白质的编码基因的CRISPR/Cas9载体。

上述方法中，所述受体水稻品种具体可为徐稻3号(XD3)。

本发明首先通过qRT-PCR表达分析发现OsCKX7特异性在水稻叶鞘中表达，而且在纹枯病菌侵染后，该基因受到极显著的诱导表达，暗示OsCKX7基因可能与水稻纹枯病抗性有关。然后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsCKX7进行了编辑，获得 OsCKX7-KO水稻新品系，具体方法如下：将序列4所示的靶基因OsCKX7的18bp基因特异性间隔序列(spacer)采用In-fusion重组酶克隆到入门载体pOs-sgRNA中，然后采用LR重组酶将靶基因OsCKX7的18bp基因特异性间隔序列重组到含有CAS9表达盒的目的载体pH-Ubi-cas9-7中，获得载体CRISPR-Cas-OsCKX7；进而通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻品种徐稻3号(XD3)愈伤组织，获得转基因苗；通过基因测序，获得了OsCKX7被成功编辑的OsCKX7-KO水稻新品系。通过纹枯病抗性鉴定，发现OsCKX7-KO水稻新品系相对于未编辑对照品种(徐稻3号)，极显著提高了水稻对纹枯病的抗性。进一步比较了OsCKX7-KO水稻新品系与对照品种间的主要农艺性状和产量性状，发现对OsCKX7基因进行编辑不影响水稻的主要农艺性状和产量性状。综合上述结果表明，OsCKX7基因可以调控水稻纹枯病抗性，编辑OsCKX7基因可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。

附图说明

图1为水稻中OsCKXs基因的表达模式。A为OsCKXs基因在水稻抽穗期不同部位的表达模式；B为OsCKX7基因在纹枯病菌接种处理后表达模式。注：R表示根；C表示茎；L表示叶；LS表示鞘；P表示穗。

图2为OsCKX7-KO转基因株系测序分析图。A为OsCKX7基因sgRNA示意图；B为T0代转基因潮霉素检测电泳图；C为转基因株系测序分析图；D为转基因株系氨基酸序列分析图。

图3为转基因株系及野生型对照的温室成株期纹枯病杭感表型及大田抗性表型。A为温室分蘖末期接种后5，10和15天病斑长度；B为温室成株期接种表型；C为温室孕穗期接种后5，10和15天病斑长度；D为大田接种30天后病级；E为大田接种30 天后表型。

图4为转基因株系及野生型对照的穗部表型、株型和粒型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的OsCKX7基因位于水稻基因组第2号染色体上，全长2095bp，有2 个内含子，其中编码序列(coding sequence，CDS)编码524个氨基酸。OsCKX7基因序列如序列1所示，CDS序列如序列2所示，OsCKX7基因编码的OsCKX7蛋白质的氨基酸序列如序列3所示。

实施例1、OsCKXs基因的表达特征分析

一、实验材料

取抽穗期水稻品种徐稻3号的不同器官(根、茎、叶、叶鞘、穗)，放入液氮保存。

将水稻品种徐稻3号在正常条件下培养至分蘖末期时接种纹枯病菌，分别在接种前(0h)及接种后12h、24h及48h剪取水稻叶鞘，放入液氮保存。

二、实验方法

1、cDNA的获得

用Trizol(Invitrogen公司)提取各水稻样品的总RNA，再用DNaseI(RNase free，Promega公司)消化总RNA以去除基因组DNA污染(方法参见DNaseI说明书)，继而用逆转录酶(Roche公司)将总RNA逆转录合成cDNA第一链(方法参见逆转录酶说明书)，反应条件为：55℃，30min；85℃，5min；4℃，forever。

2、实时定量PCR

以步骤1获得的cDNA为模板，将Actin基因作为内参基因，利用OsCKXs基因特异性引物进行实时定量PCR，反应条件为：95℃预变性2min，然后进入下列循环： 95℃15sec，60℃15sec，72℃40sec共进行40个循环。

Actin基因扩增引物序列如下：

F1：5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’；

R1：5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’。

OsCKX7基因特异性引物序列如下：

OsCKX1-q-F：5’-ACACATTGACATTATCGCCG-3’；

OsCKX1-q-R：5’-CACCTACACCCACCCACATA-3’。

OsCKX2-q-F：5’-CCTTCATATGCATGTCGATCTC-3’；

OsCKX2-q-R：5’-TTACACCCACAAGACGACGA-3’。

OsCKX3-q-F：5’-GCAGTGTAGTGCTGTGCTG-3’；

OsCKX3-q-R：5’-GCCTATCCTATGTCCCCCTC-3’。

OsCKX4-q-F：5’-GCTTAAAGAACACAGCGGGG-3’；

OsCKX4-q-R：5’-GCTGCTTCGCTTTGAAGTCT-3’。

OsCKX5-q-F：5’-GGCTAGCTAGGCGCATGTAA-3’；

OsCKX5-q-R：5’-GGGCGAGGAATCTACACATC-3’。

OsCKX6-q-F：5’-CCACATCCATGGCTAAACCT-3’；

OsCKX6-q-R：5’-GCACCAACAAAAACACCCTT-3’。

CKX7-q-F：5’-CGGCAGTTATTGGTGATGTG-3’；

CKX7-q-R：5’-GCACCCGATGTCCTCATTAT-3’。

OsCKX8-q-F：5’-GTAAAGGGGAGGTGGTGACA-3’；

OsCKX8-q-R：5’-GCCCTTGTTATAATGCCGAA-3’。

OsCKX9-q-F：5’-CACCATGCATGTGCCTAAAC-3’；

OsCKX9-q-R：5’-GACACATCGTGGAAGCTGAA-3’。

OsCKX10-q-F：5’-TCGGACTTTGGCCATATTGT-3’；

OsCKX10-q-R：5’-GTGATAAGCGGATTAGGGCA-3’。

OsCKX11-q-F：5’-GGACGAGCACAATGATGATG-3’；

OsCKX11-q-R：5’-GAACCGAAACCTCCCTCTTT-3’。

3、结果分析

实时定量PCR检测结果显示OsCKX7主要在叶鞘中高表达，这与水稻纹枯病主要危害叶鞘的特点相吻合(如图1A所示)，并且OsCKX7基因的表达能在立枯丝核菌侵染后被诱导上调(如图1B所示)，暗示OsCKX7基因与水稻纹枯病抗性密切相关。

实施例2、转基因水稻的获得及其纹枯病抗性鉴定

一、转基因水稻的获得

1、载体的构建

1)靶位点序列的设计

通过CRISPR-P v2.0在OsCKX7(LOC_Os02g12780)的编码区靠近ATG的位置找到了一个特异性较高的gRNA，靶位点序列如下：GCGGGCAGTCGCTCGCCC(序列4)。

2)引物的设计

根据(Y Lei，2014)引物设计原则和步骤1)设计的靶位点序列，设计引物 CKX7-crispr-F和CKX7-crispr-R扩增目的片段。引物序列如下：CKX7-crispr-F：5’- AGATGATCCGTGGCAGCGGGCAGTCGCTCGCCCGTTTTAGAGCTATGC-3’；CKX7-crispr-R：5’- GCATAGCTCTAAAACGGGCGAGCGACTGCCCGCTGCCACGGATCATCT-3’。

3)载体构建

参照文献(Miao等，2013Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cassystem. Cell Res,23:1233–1236)中的方法构建载体。具体步骤如下：将序列4所示的靶基因OsCKX7的18bp基因特异性间隔序列(spacer)采用In-fusion重组酶(Takara，货号1710367A)克隆到入门载体pOs-sgRNA中，然后采用LR重组酶(Gateway LR Clonase II，Invitrogen，货号11791020)将OsCKX7的18bp基因特异性间隔序列重组到含有CAS9表达盒的目的载体pH-Ubi-cas9-7中，获得载体CRISPR-Cas-OsCKX7。入门载体pOs-sgRNA和含有CAS9表达盒的目的载体pH-Ubi-cas9-7均记载于文献 (Miao等，2013Targetedmutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.Cell Res,23: 1233–1236)中。

2、重组菌的构建

完成步骤1后，采用冻融法将步骤1构建的载体转入EHA105农杆菌(AngYuBio，AYBIO-G6040)中，得到重组菌，用于侵染水稻愈伤组织。

3、转基因水稻的获得

完成步骤2后，通过农杆菌介导法用步骤2获得的重组菌侵染徐稻3号的愈伤组织，将上述步骤1获得的重组载体转入徐稻3号，最终共获得25个独立的T0代转基因水稻。利用潮霉素标记检测，筛选得到5个阳性T0代转基因水稻。

4、转基因水稻的鉴定

分别以5个阳性T0代转基因水稻的DNA为模板，采用CKX7测序引物(CKX7-cexu-F：TGACCCAACACAACACACAC；CKX7-cexu-R：GACGGTGATGCGGAGGTAGT)进行PCR扩增，对 PCR扩增产物进行测序。通过测序分析发现：5个阳性T0代转基因水稻中有2株转基因水稻在序列2所示的OsCKX7编码基因序列的第304位和第305位之间插入了碱基T，造成OsCKX7基因编码的氨基酸序列出现移码现象，进而使氨基酸提前终止致使OsCKX7 基因功能缺失(图2)，并将这两个基因编辑系分别命名为OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2。将T0代转基因水稻OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2自交，经筛选和鉴定得到T1代转基因水稻OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2，选取T1代转基因水稻OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2用于下述纹枯病抗性分析。

二、转基因水稻的纹枯病抗性鉴定

纹枯病抗性鉴定采用牙签嵌入法接种，具体接种步骤参照文献“Zuo S.M.,Yin Y.J.,Pan C.H.,et al.Fine mapping of qSB-11LE,the QTL that confers partialresistance to rice sheath blight.Theoretical and Applied Genetics,2013,126:1257-1272.”中的方法，接种菌株为中强致病菌株YN-7，该菌株记载于文献“抗纹枯病基因qSB-9^TQ和分蘖角基因TAC1^TQ在抗病育种中的互作效应及育种价值”中。

针对温室成株期抗性鉴定的具体步骤如下：将分蘖末期和孕穗期T1代转基因水稻OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2和野生型对照(徐稻3号)分别各挖3株在温室高温高湿条件下培养至7天后进行接种，调查接种5，10和15天的病斑长度。结果显示：接种 5，10和15天的转基因水稻OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2的纹枯病病斑长度显著小于野生型对照(图3A，B，C)。

针对大田抗性鉴定的具体步骤如下：将2个独立的T1代转基因水稻OsCKX7-KO1 和OsCKX7-KO2设置3次重复，每系2行，每行10株，接种5株，接种调查单株，每株水稻接种3个主茎秆，每茎秆以镊子将接种物嵌入自上而下第3叶鞘内侧，接种于水稻分蘖末期至拔节初期进行。病级调查以文献“Zuo S.M.,Yin Y.J.,Pan C.H.,et al.Fine mapping of qSB-11_LE,the QTL that confers partial resistance to rice sheath blight.Theoretical andApplied Genetics,2013,126:1257-1272.”中改进的纹枯病病级划分为标准，于抽穗后30天左右进行。结果显示，T1代转基因水稻OsCKX7-KO1 和OsCKX7-KO2株系纹枯病病级为5级左右，显著低于野生型对照(图3D，E)。

上述结果表明OsCKX7基因的功能丧失可显著提高水稻对纹枯病的抗性。

三、转基因水稻植株的农艺性状考察

于水稻成熟期调查OsCKX7-KO水稻新品系(OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2)的农艺性状，以株为单位测量各小区的主要农艺性状，包括株高、叶长、叶宽；并将2个OsCKX7-KO 水稻系种子收回实验室进行考种，调查穗长、粒长、粒宽、粒厚、每穗粒数、结实率、千粒重、单株产量等性状。

结果显示，两个OsCKX7-KO水稻系(OsCKX7-KO1和OsCKX7-KO2)与野生型对照(徐稻3号)在各农艺性状上均没有显著差异(表1和图4)。这些结果表明对OsCKX7基因进行编辑，不会影响水稻的主要农艺性状和产量性状。

表1、转基因株系主要农艺性状表

序列表

<110>扬州大学

<120>OsCKX7蛋白质及其编码基因在调控植物纹枯病抗性中的应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2095

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggctgcaa ggtgttcgat cgcgttcatg atcatggcga gctgcctgtc cgtcgtcgtc 60

tccggtgggc ttcccggcga tctcttcgcg ctcagtgtcg cctcgaagct ccgcgtcgac 120

cgcaactcga cggcgagggc gtcgtcggac ttcggccgca ttgtggccgc cgcgccggag 180

gcggtgctcc acccggccac gccggccgag atcgcggagc tcgtccggtt ctcggcgtcg 240

tcgccgtcgc cgttccccgt ggcgccgcgc gggcagggcc actctgcccg cgggcagtcg 300

ctcgccccgg gcggcgtcgt ggtcgacatg cgcgcgctgg cgtcgcgccg cggccgcgtc 360

aacgtgtccg cgggcgcggc gccgtacgtg gacgccggcg gcgagcagct gtgggccgac 420

gtcctccgcg cgacactgga acacggcctg gcgccgcgcg tgtggacgga ctacctccgc 480

atcaccgtcg ccggcacgct ctccaacgcc ggcatcggcg gccaggcgtt ccggcacggc 540

ccgcagatcg ccaacgtgct cgagcttgac gtcatcacag gtaatttact aactaataca 600

actcatcatc ccctttaatt agcaatctaa ttaacttgta ctaatgaaca ttgttaacaa 660

cattaatcaa atgattaagc ggctaatgaa cactgttaac aatgattaat gcaggaacgg 720

gtgatatggt gacgtgctca agggacaagg actcggacct gttcttcgcg gtgctgggtg 780

ggctgggcca gtttgggatc ataacccggg ctcgcattgg gctcatgccg gctccgaagc 840

gggtgcgatg ggtccggctc gcctactcgg atgtggccac gttcactaaa gaccaggagc 900

tgcttatatc aaaacgggct agcgaagccg gcttcgacta cgtcgaagga caagtccagc 960

tcaaccggac actcaccgag ggtcccaagt cgacgccctt cttctctagc agcgatattg 1020

gcaggcttgc tggacttgcc tcgaagtctg tgtcaggagt gatctacgta atcgaaggca 1080

ccatgtatta caatgagtca accagcacca ctatggatca ggtatacaat tatgatccat 1140

ttgtgttcaa tagataccat gtaaaagtac tattgttatc tatggcctca aaggaaataa 1200

tggatatttt gttaatgatc aatgtattgg tttccttgca gaaattggag tcaatactag 1260

ggcagctaag ctttgaggaa ggcttcgtgt tcacaaagga tgtgagatac gtgcaattcc 1320

ttgatcgtgt gagggaggaa gaaagggtgc tccgatcgat cggcatgtgg gatgttccgc 1380

acccatggct aaacctcttc gtccctcgat cacgcatcct tgactttgat gctggtgtgt 1440

ttaagggtgt cttcgctggt gccaaccctg ttggcgtcat cctcatgtat cccatgaata 1500

cgaatatgtg ggatgactgt atgatggcag tggccagcga cgatgatgtg ttctacgctg 1560

tggggttgct ccgttctgcg gcagttattg gtgatgtgga acgcctagag aaagagaacg 1620

aggcggtgtt ggcattctgc cataatgagg acatcgggtg caagcagtat ctgccatatt 1680

acacatcaca agatgggtgg caacgccatt tcggtgctaa gtggagcagg gttgccgatc 1740

taaaggcgaa gtatgaccca cacaggatat tgtcaccagg acagaggatt ttctcatcac 1800

cagcatcaat ggtggtggtg tctatgtagt cggtcaaatg ataattttga ggtaaggagg 1860

agtatagata attaggtgtt tagggattta gttttgaggt aacggagggt gaaaagcaag 1920

ttaagttgct tgtgagaagc tgaaatgctg ataaaaccca aagaactcta gaagagggat 1980

tgcaacttgt tcttagaaga tatatgtaga aaaaaaaatc tggatatggt tgattcaatt 2040

aggaggatgc tgtaggttgt agttgccacg ttattttttt ttaggtttcc ttttg 2095

<210>2

<211>1575

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

atggctgcaa ggtgttcgat cgcgttcatg atcatggcga gctgcctgtc cgtcgtcgtc 60

tccggtgggc ttcccggcga tctcttcgcg ctcagtgtcg cctcgaagct ccgcgtcgac 120

cgcaactcga cggcgagggc gtcgtcggac ttcggccgca ttgtggccgc cgcgccggag 180

gcggtgctcc acccggccac gccggccgag atcgcggagc tcgtccggtt ctcggcgtcg 240

tcgccgtcgc cgttccccgt ggcgccgcgc gggcagggcc actctgcccg cgggcagtcg 300

ctcgccccgg gcggcgtcgt ggtcgacatg cgcgcgctgg cgtcgcgccg cggccgcgtc 360

aacgtgtccg cgggcgcggc gccgtacgtg gacgccggcg gcgagcagct gtgggccgac 420

gtcctccgcg cgacactgga acacggcctg gcgccgcgcg tgtggacgga ctacctccgc 480

atcaccgtcg ccggcacgct ctccaacgcc ggcatcggcg gccaggcgtt ccggcacggc 540

ccgcagatcg ccaacgtgct cgagcttgac gtcatcacag gaacgggtga tatggtgacg 600

tgctcaaggg acaaggactc ggacctgttc ttcgcggtgc tgggtgggct gggccagttt 660

gggatcataa cccgggctcg cattgggctc atgccggctc cgaagcgggt gcgatgggtc 720

cggctcgcct actcggatgt ggccacgttc actaaagacc aggagctgct tatatcaaaa 780

cgggctagcg aagccggctt cgactacgtc gaaggacaag tccagctcaa ccggacactc 840

accgagggtc ccaagtcgac gcccttcttc tctagcagcg atattggcag gcttgctgga 900

cttgcctcga agtctgtgtc aggagtgatc tacgtaatcg aaggcaccat gtattacaat 960

gagtcaacca gcaccactat ggatcagaaa ttggagtcaa tactagggca gctaagcttt 1020

gaggaaggct tcgtgttcac aaaggatgtg agatacgtgc aattccttga tcgtgtgagg 1080

gaggaagaaa gggtgctccg atcgatcggc atgtgggatg ttccgcaccc atggctaaac 1140

ctcttcgtcc ctcgatcacg catccttgac tttgatgctg gtgtgtttaa gggtgtcttc 1200

gctggtgcca accctgttgg cgtcatcctc atgtatccca tgaatacgaa tatgtgggat 1260

gactgtatga tggcagtggc cagcgacgat gatgtgttct acgctgtggg gttgctccgt 1320

tctgcggcag ttattggtga tgtggaacgc ctagagaaag agaacgaggc ggtgttggca 1380

ttctgccata atgaggacat cgggtgcaag cagtatctgc catattacac atcacaagat 1440

gggtggcaac gccatttcgg tgctaagtgg agcagggttg ccgatctaaa ggcgaagtat 1500

gacccacaca ggatattgtc accaggacag aggattttct catcaccagc atcaatggtg 1560

gtggtgtcta tgtag 1575

<210>3

<211>524

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

Met Ala Ala Arg Cys Ser Ile Ala Phe Met Ile Met Ala Ser Cys Leu

1 5 10 15

Ser Val Val Val Ser Gly Gly Leu Pro Gly Asp Leu Phe Ala Leu Ser

20 25 30

Val Ala Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Thr Ala Arg Ala Ser

35 40 45

Ser Asp Phe Gly Arg Ile Val Ala Ala Ala Pro Glu Ala Val Leu His

50 55 60

Pro Ala Thr Pro Ala Glu Ile Ala Glu Leu Val Arg Phe Ser Ala Ser

65 70 75 80

Ser Pro Ser Pro Phe Pro Val Ala Pro Arg Gly Gln Gly His Ser Ala

85 90 95

Arg Gly Gln Ser Leu Ala Pro Gly Gly Val Val Val Asp Met Arg Ala

100 105 110

Leu Ala Ser Arg Arg Gly Arg Val Asn Val Ser Ala Gly Ala Ala Pro

115 120 125

Tyr Val Asp Ala Gly Gly Glu Gln Leu Trp Ala Asp Val Leu Arg Ala

130 135 140

Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Arg Val Trp Thr Asp Tyr Leu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Val Ala Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Gly Gly Gln Ala

165 170 175

Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ala Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile

180 185 190

Thr Gly Thr Gly Asp Met Val Thr Cys Ser Arg Asp Lys Asp Ser Asp

195 200 205

Leu Phe Phe Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr

210 215 220

Arg Ala Arg Ile Gly Leu Met Pro Ala Pro Lys Arg Val Arg Trp Val

225 230 235 240

Arg Leu Ala Tyr Ser Asp Val Ala Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Leu

245 250 255

Leu Ile Ser Lys Arg Ala Ser Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Val Glu Gly

260 265 270

Gln Val Gln Leu Asn Arg Thr Leu Thr Glu Gly Pro Lys Ser Thr Pro

275 280 285

Phe Phe Ser Ser Ser Asp Ile Gly Arg Leu Ala Gly Leu Ala Ser Lys

290 295 300

Ser Val Ser Gly Val Ile Tyr Val Ile Glu Gly Thr Met Tyr Tyr Asn

305 310 315 320

Glu Ser Thr Ser Thr Thr Met Asp Gln Lys Leu Glu Ser Ile Leu Gly

325 330 335

Gln Leu Ser Phe Glu Glu Gly Phe Val Phe Thr Lys Asp Val Arg Tyr

340 345 350

Val Gln Phe Leu Asp Arg Val Arg Glu Glu Glu Arg Val Leu Arg Ser

355 360 365

Ile Gly Met Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro

370 375 380

Arg Ser Arg Ile Leu Asp Phe Asp Ala Gly Val Phe Lys Gly Val Phe

385 390 395 400

Ala Gly Ala Asn Pro Val Gly Val Ile Leu Met Tyr Pro Met Asn Thr

405 410 415

Asn Met Trp Asp Asp Cys Met Met Ala Val Ala Ser Asp Asp Asp Val

420 425 430

Phe Tyr Ala Val Gly Leu Leu Arg Ser Ala Ala Val Ile Gly Asp Val

435 440 445

Glu Arg Leu Glu Lys Glu Asn Glu Ala Val Leu Ala Phe Cys His Asn

450 455 460

Glu Asp Ile Gly Cys Lys Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr Thr Ser Gln Asp

465 470 475 480

Gly Trp Gln Arg His Phe Gly Ala Lys Trp Ser Arg Val Ala Asp Leu

485 490 495

Lys Ala Lys Tyr Asp Pro His Arg Ile Leu Ser Pro Gly Gln Arg Ile

500 505 510

Phe Ser Ser Pro Ala Ser Met Val Val Val Ser Met

515 520

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

gcgggcagtc gctcgccc 18

Claims

1.OsCKX7蛋白质在调控植物抗病性中的应用。

2.与OsCKX7蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

或，与OsCKX7蛋白质相关的生物材料在培育抗病性提高的转基因植物中的应用；

或，与OsCKX7蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述OsCKX7蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码OsCKX7蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsCKX7蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述抗病性为纹枯病抗性。

7.一种培育抗病性提高的转基因水稻的方法，包括降低受体水稻中OsCKX7蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因水稻的步骤；所述转基因水稻的抗病性高于所述受体水稻。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抗病性为纹枯病抗性；

或，所述转基因水稻的抗病性高于所述受体水稻体现在转基因水稻的纹枯病病级低于受体水稻和/或转基因水稻的纹枯病病斑长度小于受体水稻。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述降低受体水稻中OsCKX7蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体水稻中OsCKX7蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现的；

或，利用CRISPR/Cas9方法对所述受体水稻中OsCKX7蛋白质的编码基因进行敲除。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列4所示的DNA分子。