CN100569949C

CN100569949C - 水稻叶绿素合成酶突变基因及其基因工程应用

Info

Publication number: CN100569949C
Application number: CNB2007100235543A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 吴自明; 张欣; 江玲; 陈亮明; 苏宁; 程治军; 刘世家; 刘喜; 何冰; 王春明
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2027-06-08
Also published as: CN101096676A

Abstract

本发明公开了一个水稻叶绿素合成酶突变基因Osygl1的核苷酸序列及基因工程应用，属于基因工程领域。Osygl1的cDNA序列SEQ ID NO.1及编码的氨基酸序列SEQ IDNO.2。基因OsYGL1为水稻中一个叶绿素合成酶基因，OsYGL1参与水稻的叶绿素a和叶绿素b的合成，mRNA表达分析表明该基因呈组成性表达。该基因的突变(Osygl1基因)导致水稻黄绿叶的表型。转基因实验证明了该基因的黄绿叶功能，利用本发明Osygl1突变基因控制的黄绿叶性状可以作为遗传标记用于农业生产中的品种鉴定以及水稻遗传育种。

Description

水稻叶绿素合成酶突变基因及其基因工程应用

技术领域

本发明一个新的水稻叶绿素合成酶突变基因Osygl1及其基因工程应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及水稻叶绿素合成和水稻叶色发育的基因。

技术背景

植物叶色是叶绿体中各种色素的综合表现，正常叶中叶绿素占优势，通常表现为绿色。叶色变异是高等植物中突变频率较高且易于鉴定的突变性状。迄今为止，在水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、棉花、烟草、玉米、向日葵、番茄、黄瓜、马铃薯、桑树等几乎所有高等植物中都发现了叶色突变体。其突变基因直接或间接影响光合色素，特别是叶绿素的合成和降解，导致各种色素的含量和比例改变，从而引起植物叶色变异。

水稻(Oryza sativa L.)作为我国乃至世界最重要的粮食作物之一，其产量的提高对解决未来全球粮食问题具有十分重要的战略意义。长期以来，传统的杂交育种手段在提高光能利用方面尚未取得令人满意的效果。叶色突变体是研究水稻光能利用的理想材料。目前，虽然在水稻中已得到一些黄绿叶突变体，但大多数研究仅局限于基因的初步定位。深入研究这些黄绿叶突变体的突变基因对于改良水稻光能利用效率和杂交种制种纯度控制具有重要的应用价值。

本研究通过对一个自然变异的水稻黄绿叶突变体ygl1基因的图位克隆和功能分析，从分子水平揭示了引起水稻黄绿叶突变性状的分子机理，且系统研究了该基因与叶绿体形成、光合效率及相关光合指标的关系，提出了利用Osygl1基因进行水稻黄绿叶遗传改良的方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开一个新的水稻叶绿素合成酶突变基因Osygl1及其基因工程应用，该突变基因Osygl1可作为目的基因导入水稻育种材料不育系当中，以改变叶片的叶色，用于水稻两系杂交稻制种或遗传育种。

技术方案

一种水稻叶绿素合成酶突变基因Osygl1，它来自水稻(Oryza sativa L.)，长度为1131bp，相应编码叶绿素合成酶的376个氨基酸，包含第198位氨基酸的突变位点由脯氨酸Pro(TCT)突变为丝氨酸Ser(CCT)，全序列见SEQ ID NO.1。

用转基因的方法将该突变基因Osygl1转移到光敏核不育系材料中，获得含有Osygl1基因，具有黄绿叶表型的不育系材料，可用于水稻两系杂交稻制种。

有益效果

1、本发明公开了一种水稻叶绿素合成酶突变基因(Osygl1基因)及其应用。该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，可作为目的基因导入水稻，使叶片黄绿色，或通过杂交选育，转育黄绿色性状，获得叶色黄绿的水稻品种。检测出连锁标记RM3838(与黄绿叶色突变体中的ygl1基因的遗传距离0.1cM)，可用于水稻杂交育种分子标记辅助选择黄绿叶标记基因ygl1。

2、本发明人提供的Osygl1基因功能是参与植物的叶绿素合成的最后一步反应，mRNA表达分析表明Osygl1基因在水稻中组成性表达。

3、本发明的Osygl1基因来自水稻，所编码的蛋白质具有叶绿素合成酶活性，其与高等植物和藻类生物等具有较高的同源性，与燕麦的叶绿素合成酶ChlG、拟南芥叶绿素合成酶G4、Synechocystis sp.PCC 6803叶绿素合成酶相似性分别为88.39％、74.68％和53.94％，与细菌叶绿素合成酶序列相似性降低为20～30％。其中motif(WAGHDF-197)仅存在于高等植物的叶绿素合成酶中，细菌中缺乏这一motif，黄绿叶突变基因ygl1突变位点(Pro-198)位于该motif的末端。

4、利用野生型OsYGL1基因作为目的基因构建植物表达载体，其转化可使黄绿色叶的水稻品种恢复正常绿色。本发明提供了Osygl1基因的转基因应用方法。

5、用转基因的方法将Osygl1基因转移到光敏核不育系材料中，可获得含有Osygl1基因，具有黄绿叶表型的不育系材料，用于水稻两系杂交稻制种。

具体实施方式

实施例1 水稻叶绿素合成酶突变基因的分子克隆

1、突变基因ygl1位点的定位

利用水稻黄绿叶突变体249黄(ygl1)分别与叶色正常的不同水稻品种培矮64、USSR5、W002和02428等进行正反杂交，得到的F₂群体进行遗传分析，结果表明ygl1的黄绿叶表型由隐性单基因控制。从ygl1突变体与培矮64衍生的F₂群体(12,300株)中，选取了2741个黄叶隐性单株用于该突变体基因精细定位。2005年夏在中国农业科学院作物科学研究所网室种植，在3叶1心期鉴定表型，同时取样提取DNA。从F₂群体中随机挑出11个黄绿叶单株和34个绿叶单株，用候选标记对这个小群体进行PCR扩增，而后分析候选标记与突变位点的连锁关系。发现位于第5染色体中部的SSR标记引物RM516、RM164(RM系列引物公知公用，见网站www.gramene.org)与突变基因连锁。用RM516和RM164分析F₂群体，把突变基因初步定位在SSR标记RM516和RM164之间，与RM516、RM164分别相距4.8cM和13.1cM。选取位于RM516和RM164之间的SSR标记引物，对亲本进行多态性分析。结果只有SSR标记RM3838和RM5454(www.gramene.org)在亲本间表现出多态。利用这两个标记对整个F₂群体进行分析，结果表明二者与突变位点分别相距0.0cM和8.8cM。进一步利用水稻基因组数据设计了23对SSR引物，编号为y1～y23。结果只有y1(SEQ ID NO.3，4)、y5(SEQID NO.5，6)和y22(SEQ ID NO.7，8)在亲本间检测出多态性，其中，标记y1位于RM516和RM3838之间，标记y5和y22位于RM3838和RM5454之间。用这几个多态性标记对F₂代群体2741个隐性单株进行分析，发现突变基因(命名为ygl1，yellow greenleaf1)位于y1和RM3838之间，距y1，RM3838和y22的遗传距离分别为0.2cM、0.1cM和0.7cM。随后根据日本晴和9311基因组的序列信息(www.ncbi.nlm.nih.gov)，在SSR标记y1和RM3838之间，设计了26对CAPS标记，经多态性分析，找出了7对具有多态CAPS标记，其中标记P25(SEQ ID NO.19，20)和P26(SEQ ID NO.21，22)与ygll基因位点共分离，其它标记P20(SEQ ID NO.15，16)、P5(SEQ ID NO.9，10)、P23(SEQ ID NO.17，18)、P8(SEQ ID NO.11，12)和P11(SEQ ID NO.13，14)重组交换单株数分别为8、8、1、5和5。因此，ygl1基因位点被精细定位在BAC AC136221上的标记P23与P8之间，物理距离为11kb。

利用基因分析与预测软件(www.softberry.com)对这11kb区间进行基因预测，发现仅有两个开放阅读框(Open reading frame，ORFs)，一个为叶绿素合成酶基因(Chlorophyll synthetase)，我们把它称为YGL1(GenBank登录号：EF432576)；另一个为em基因(Embryogenic abscisi acid-inducible gene)。

2、突变基因ygl1的克隆

用RT-PCR的方法，引物为SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.24；将野生型OsYGL1和突变体Osygl1目的基因区域编码区cDNA扩增出来，直接回收，并重复测序，然后用DNAstar分析软件进行比对分析。RT-PCR扩增程序如下：94℃2min，94℃40s，59℃40s，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸7min，4℃Pause。

序列分析发现，扩增出野生型OsYGL1基因的编码区cDNA(简称野生型YGL1基因，GenBank登录号：EF432576)和扩增出突变体Osygl1基因的编码区cDNA(简称突变基因ygl1，SEQ ID NO.1)，进行比对，发现两者之间在第8外显子上存在单碱基差异，由胸酰嘧啶(T-592)变成了胞嘧啶(C)，造成脯氨酸(Pro-198)到丝氨酸(Ser)突变。

脯氨酸是一种亚氨基酸，其侧链是氮原子与α碳连接形成的杂环结构。尽管其亚氨基可与其它氨基酸形成肽键，但侧链限制了α碳的自由旋转，因此脯氨酸经常在蛋白质的二级结构元件β转角中存在；丝氨酸是侧链不带电荷的极性氨基酸，其侧链可与其它极性基团形成氢键。如果叶绿素合成酶中脯氨酸突变成丝氨酸，酶的活性可能受到影响。

3、突变基因ygl1、野生型YGL1基因的序列信息与特性分析

野生型YGL1基因的编码区cDNA编码区为1131bp，编码376个氨基酸的41kDa蛋白，N端具有47个氨基酸的前导序列，为质体膜蛋白，该蛋白为一个新的叶绿素合成酶，催化叶绿素酸酯(Chlorophyllide)与植醇焦磷酸(Phytyl-PP)或双牦牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl-PP)植醇化，生成叶绿素a。通过搜索水稻基因组数据库，结果表明YGL1为单拷贝基因，由15个外显子，14个内含子组成。YGL1与高等植物和藻类生物等具有较高的同源性。与燕麦的叶绿素合成酶ChlG、拟南芥叶绿素合成酶G4、Synechocystis sp.PCC 6803叶绿素合成酶相似性分别为88.39％、74.68％和53.94％，与细菌叶绿素合成酶序列相似性降低为20～30％。此外，序列分析发现一个motif(WAGHDF-197)仅存在于叶绿素合成酶当中，细菌叶绿素合成酶缺乏。

突变基因ygl1在第8个外显子上发生单碱基突变，其他的序列信息及特性与野生型YGL1基因相同。

4、突变基因ygl1、YGL1基因的表达分析

应用定量RT-PCR方法，比较了突变基因ygl1和野生型基因YGL1的表达水平，结果表明，突变基因ygl1和YGL1基因在根、茎、叶和穗中都表达，且在突变体和野生型之间没有差异。暗光处理条件和不同发育时期，突变体植株体内的突变基因ygl1和野生型植株体内YGL1基因的表达也没有差异。这些结果表明ygl1基因与YGL1基因组成性表达特性，且单碱基突变并不影响ygl1基因在ygl1突变体内的稳态表达。

5、脯氨酸到丝氨酸改变引起叶绿素合成酶活性下降

利用体外原核表达重组蛋白，应用两种底物GGPP和PhyPP，对重组酶进行酯化活性分析。结果表明：与野生型重组酶相比(设重组酶YGL1催化底物Chlide a酯化GGPP和PhyPP活性值为1)，突变体重组酶ygl1催化底物Chlide a酯化底物GGPP和phyPP的活性都下降，分别为野生型重组酶酯化活性的为35.22％和21.75％，表明ygl1单个氨基酸的改变影响酶的酯化活性。

实施例2 叶绿素合成酶基因YGL1的转基因应用试验及叶绿素合成酶突变基因ygl1的功能验证

(一)含有YGL1编码区cDNA表达载体的构建

用Pst I和Spe I(公知公用)双酶切潮霉素抗性表达载体pCUbi1390(中国农科院生物所路铁钢研究员提供；中国农科院博士论文，彭昊，2005)，回收载体片段，备用；以PCR介导在YGL1基因cDNA序列两端分别加入Pst I/Spe I接头(接头引物序列为SEQ ID NO.25，26)接入pMD18-T载体，测序确认后，酶切、电泳并回收目的片段，并将其连接进入上述表达载体得到YGL1基因重组载体。

(二)农杆菌介导转化

以农杆菌菌株EHA105为介导，将YGL1基因重组载体导入具有ygl1等位基因受体材料黄叶粳品系ygl2(该品系是由黄绿叶突变体ygl1与武运粳8号杂交，然后经过3代回交，5代自交得到的具有黄绿叶特征的黄叶粳稻品系，经分子鉴定含有突变基因ygl1)：

(1)28℃培养含重组YGL1的农杆菌16hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司购买)中，24℃共培养3天；

(3)将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司购买)的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天；

(4)挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素的分化培养基上分化；

(6)分化成苗的再生水稻植株即为所获得的叶绿素合成酶基因YGL1的转基因植株。

(三)转基因植株分子鉴定及ygl1基因功能验证

叶绿素合成酶基因YGL1的转基因植株，经PCR分子检测、Southern blot分析、T₁代分离实验及恢复表型植株叶绿素含量分析，证实了叶绿素合成酶基因YGL1转化成功。其表型为转基因前的黄绿色(ygl1基因为隐性基因)转变为转基因后的绿色(YGL1基因为显性基因)。验证了转基因前的黄叶粳品系的黄绿叶性状是由ygl1基因控制的。

本领域技术人员熟知，ygl1突变基因的转基因应用方法同野生型YGL1的转基因应用。用转基因的方法将该突变基因转移到光敏核不育系材料中，获得含有Osygl1基因，具有黄绿叶表型的不育系材料，可用于水稻两系杂交稻制种。

本发明所涉及公知公用品种如下：

水稻黄绿叶突变体249黄(ygl1)(公知公用品种，龚红兵，陈亮明，刁立平等(2001)水稻叶绿素b减少突变体的遗传分析及其相关特性.中国农业科学，34：686-689)

培矮64(公知公用品种，罗孝和，袁隆平(2000)水稻光亲合系的选育.杂交水稻，2000，15：1-3)

USSR5(公知公用品种，江玲，徐俊锋，魏祥进等(2007)水稻品种USSR5早熟性的遗传分析.遗传学报2007，34(1)：46-55，中国农科院种质资源库对外提供)

W002(公知公用品种，张坚勇，万向元，肖应辉等(2004)水稻品种食味品质性状稳定性分析.中国农业科学2004，37(6)：788-794本实验室对外提供)

02428(公知公用品种，李和标(1989)水稻光亲合资源——02428.中国种业1989，4：4)

序列表

<110>南京农业大学

<120>水稻叶绿素合成酶OsYGL1基因及其转基因工程应用

<130>说明书

<140>00

<141>2007-06-05

<160>26

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1131

<212>DNA

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>Osygl1 gene

<222>(1)..(1131)

<223>

<400>1

atggccacct cccacctcct cgccgccgcc tcctccaccg ccgcctcctc cgccaccttc 60

cgccctcccc tcctcagcct ccgctccccg ccgccctctt ctctccgcct caaccgcagg 120

cgccacttcc aggtggtccg cgcggccgag accgacaaag agacgaaggc caatgcgccc 180

gagaaagctc ccgcgggagg ctccagcttc aaccagctgc tcggcatcaa gggcgccaag 240

caagagaacg acatatggaa gattcgcctt caacttacta agccagtgac atggcctccg 300

cttgtatggg gagtgctttg tggagcagct gcctctggaa atttccactg gacagttgaa 360

gatgttgcaa aatctattgt ctgcatgata atgtctggtc catgtcttac aggatacaca 420

cagacaatta acgactggta tgatcgagat atagatgcga taaatgaacc ttaccgtcct 480

attccttcag gcgctatatc agaaaatgag gtcattactc aaatttgggc actgttgtta 540

gcagggcttg gcctgggtgc tctgttagat gtatgggcag gacatgattt ttctattatt 600

ttttatcttg ctgttggtgg gtccttgctt tcttacatat attcagctcc acctctgaag 660

ctcaagcaga atggatggat tggaaatttt gctcttggtg cgagctacat tggcttgccc 720

tggtgggctg gccaggcatt atttggaacc cttactcctg atattgttgt cctgacttct 780

ttgtatagca tagctgggct agggattgct attgtaaatg actttaagag tgttgaggga 840

gatagagctc tggggcttca gtcactcccg gttgcttttg gtatggaaac tgcaaagtgg 900

atatgtgtag gagcgattga cataactcaa ttatccgttg caggctacct tttcagttcc 960

ggcaagcctt attatgccct ggcactgcta ggactcacaa ttcctcaggt ggtctttcag 1020

ttccaatact tcctcaagga ccctgtgaag tatgacgtca aataccaggc aagcgcgcaa 1080

ccgttcttcg tcttgggcct tctggtgacc gcccttgcaa ccagccactg a 1131

<210>2

<211>376

<212>PRT

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>OsYGL1蛋白质的氨基酸序列

<222>(1)..(376)

<223>

<400>2

Met Ala Thr Ser His Leu Leu Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ala Thr Phe Arg Pro Pro Leu Leu Ser Leu Arg Ser Pro Pro Pro

20 25 30

Ser Ser Leu Arg Leu Asn Arg Arg Arg His Phe Gln Val Val Arg Ala

35 40 45

Ala Glu Thr Asp Lys Glu Thr Lys Ala Asn Ala Pro Glu Lys Ala Pro

50 55 60

Ala Gly Gly Ser Ser Phe Asn Gln Leu Leu Gly Ile Lys Gly Ala Lys

65 70 75 80

Gln Glu Asn Asp Ile Trp Lys Ile Arg Leu Gln Leu Thr Lys Pro Val

85 90 95

Thr Trp Pro Pro Leu Val Trp Gly Val Leu Cys Gly Ala Ala Ala Ser

100 105 110

Gly Asn Phe His Trp Thr Val Glu Asp Val Ala Lys Ser Ile Val Cys

115 120 125

Met Ile Met Ser Gly Pro Cys Leu Thr Gly Tyr Thr Gln Thr Ile Asn

130 135 140

Asp Trp Tyr Asp Arg Asp Ile Asp Ala Ile Asn Glu Pro Tyr Arg Pro

145 150 155 160

Ile Pro Ser Gly Ala Ile Ser Glu Asn Glu Val Ile Thr Gln Ile Trp

165 170 175

Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Gly Leu Gly Ala Leu Leu Asp Val Trp

180 185 190

Ala Gly His Asp Phe Ser Ile Ile Phe Tyr Leu Ala Val Gly Gly Ser

195 200 205

Leu Leu Ser Tyr Ile Tyr Ser Ala Pro Pro Leu Lys Leu Lys Gln Asn

210 215 220

Gly Trp Ile Gly Asn Phe Ala Leu Gly Ala Ser Tyr Ile Gly Leu Pro

225 230 235 240

Trp Trp Ala Gly Gln Ala Leu Phe Gly Thr Leu Thr Pro Asp Ile Val

245 250 255

Val Leu Thr Ser Leu Tyr Ser Ile Ala Gly Leu Gly Ile Ala Ile Val

260 265 270

Asn Asp Phe Lys Ser Val Glu Gly Asp Arg Ala Leu Gly Leu Gln Ser

275 280 285

Leu Pro Val Ala Phe Gly Met Glu Thr Ala Lys Trp Ile Cys Val Gly

290 295 300

Ala Ile Asp Ile Thr Gln Leu Ser Val Ala Gly Tyr Leu Phe Ser Ser

305 310 315 320

Gly Lys Pro Tyr Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Gly Leu Thr Ile Pro Gln

325 330 335

Val Val Phe Gln Phe Gln Tyr Phe Leu Lys Asp Pro Val Lys Tyr Asp

340 345 350

Val Lys Tyr Gln Ala Ser Ala Gln Pro Phe Phe Val Leu Gly Leu Leu

355 360 365

Val Thr Ala Leu Ala Thr Ser His

370 375

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>y1正向引物

<222>(1)..(18)

<223>

<400>3

gcggttgaag gcgtcgta 18

<210>4

<211>22

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>y1反向引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>4

Ala Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Ala Gly Gly Thr

20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>y5正向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>5

ccccaaacta atttcctcct 20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>y5反向引物

<222>(1)..(21)

<223>

<400>6

acatctgtaa ccaatcctcc c 21

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>y22正向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>7

ctgcccttga ataatgacg 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>y22反向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>8

gcgactgatc ggtactcct 19

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P5正向引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>9

ggctagttat gggttagagg gta 23

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P5反向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>10

tcccttttca aatcacacga 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P8正向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>11

cgtgcaggtt gtgtgactct 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P8反向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>12

gttacagagc cagccaggag 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P11正向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>13

tttgatcgcc gtcatgttta 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P11反向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>14

ccggtggtga agtcgtagat 20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P20正向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>15

gcagttattg gaagtcagc 19

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P20反向引物

<222>(1)..(21)

<223>

<400>16

attacatcta cgtgcaaagt c 21

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P23正向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>17

caaccacctc aagctcttt 19

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P23反向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>18

atatttcctt ccctaccca 19

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P25正向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>19

ggaattagtg ccaccaaac 19

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P25反向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>20

gggaatcaac aagaaacga 19

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P26正向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>21

cctcattttc cttggagcag 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P26反向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>22

tcttcgcacc taaggtcaca 20

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>RT-PCR扩增OsYGL1与Osygl1编码区cDNA的正向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>23

cagtctccaa tggccacct 19

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>RT-PCR扩增OsYGL1与Osygl1编码区cDNA的反向引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>24

tgctttcatc agtggctggt 20

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>接头正向引物

<222>(1)..(27)

<223>

<400>25

aactgcagag tctccaatgg ccacctc 27

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>接头反向引物

<222>(1)..(28)

<223>

<400>26

ggactagtgc tttcatcagt ggctggtt 28

Claims

1.一种水稻叶绿素合成酶突变基因Osygl1，它来自水稻(Oryza sativa)，长度为1131bp，相应编码叶绿素合成酶的376个氨基酸，将野生型水稻叶绿素合成酶基因OsYGL1的第198位氨基酸的编码碱基由脯氨酸Pro编码碱基CCT突变为丝氨酸Ser编码碱基TCT，其全序列见SEQ IDNO.1。

2.权利要求1所述一种水稻叶绿素合成酶突变基因Osygl1的基因工程应用。