CN110714010B

CN110714010B - 一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA

Info

Publication number: CN110714010B
Application number: CN201911186091.1A
Authority: CN
Inventors: 杨远柱; 周延彪; 赵新辉; 唐倩莹; 唐晓丹; 廖雪
Original assignee: Hunan Ava Seeds Co ltd; Hunan Longping Gaoke Seed Science Research Institute Co ltd; Yuan Longping High Tech Agriculture Co ltd
Current assignee: Hunan Ava Seeds Co ltd; Hunan Longping Gaoke Seed Science Research Institute Co ltd; Yuan Longping High Tech Agriculture Co ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110714010A

Abstract

本发明公开了一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA，属于生物技术领域，包括如下步骤：抑制水稻中所述Waxy基因的表达；所述Waxy基因为编码Waxy蛋白的基因。本发明利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑水稻Waxy基因，通过造成移码突变，敲除了水稻Waxy基因，获得了直链淀粉含量明显降低的新一代水稻新种质。获得的Waxy定点编辑株系与野生型相比，直链淀粉含量均显著降低。

Description

一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用 sgRNA

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA。

背景技术

稻米胚乳的主要成分是淀粉，一般占米粉干重的76％，以不规则多角形颗粒状存在胚乳中。淀粉分为直链淀粉(Amylose)和支链淀粉(Amylopectin)两类，均是由葡萄糖结合而成的多糖物质，并且包被少量的脂肪和蛋白。糯稻中直链淀粉含量低于2％，非糯性粳稻品种直链淀粉含量一般低于籼稻品种。

水稻胚乳中的直链淀粉主要由水稻蜡质基因(Waxy)编码的颗粒结合淀粉合成酶(granule bound starch synthaseⅠ，GBSSⅠ)催化合成，是控制直链淀粉合成的主效基因。国内外对Wx基因的结构和功能已进行了广泛的研究。水稻Wx基因由Wang等(1990)成功克隆，Wx基因位于水稻第6号染色体短臂上，共含有14个外显子和13个内含子，全长6185bp，编码的GBSSⅠ蛋白含有609个氨基酸。该基因基因具有较长的第1内含子，且内含子内有增强基因表达的功能。

直链淀粉是由α-1,4糖苷键连接成的数千单位长的、极少分支的多聚葡萄糖链状线性分子。直链淀粉占总淀粉含量的0～30％，含有很少量的分支结构。一般而言，直链淀粉主要以单螺旋或随机缠绕的方式分布在淀粉颗粒的无定形层中。直链淀粉能溶于水，但不稳定。支链淀粉是由α-1,4糖苷键相连的葡萄糖链和分支点上α-1,6糖苷键共同连接成的高度分支的多聚合体，一般占总淀粉含量的70％以上。支链淀粉每个分子上大约含有220-1050个分支，每个分支链长一般为12dp-60dp。支链淀粉主要以螺旋结构存在于淀粉粒的晶体片层中，不易被酶水解。直链淀粉含量(Amylose content，AC)为直链淀粉占精米粉干重的百分比，是决定稻米蒸煮与食味品质的关键因素之一。根据其含量高低，可将稻米直链淀粉含量分为极低(2％～9％)、低(10％～20％)、中(20％～25％)和高(＞25％)四类，糯稻直链淀粉含量一般低于2％。稻米胚乳中直链淀粉含量能影响蒸煮后米饭柔软性，直链淀粉含量过低，膨胀性小，米饭粘；直链淀粉含量过高，膨胀性大，变冷后质地较硬；中等直链淀粉含量的稻米煮后比较松软，蒸煮品质相对好。

近年来，水稻生产模式和消费取向正在不断进行适应性调整，水稻生产已从以单一的数量型增长为目标转变为以数量和质量并重为目标，高营养、高品质的功能型稻米越来越受到人们喜爱。糯米和糯米制品的市场需求也逐渐扩大，人们对糯稻资源的利用研究和糯米产品的开发利用也不断加强，以糯米为原料，研制开发各种滋补、保健特色食品和饮料供应市场，深受消费者的欢迎，并获得显著的经济效益。糯米虽不适宜作为主食长期食用，但它是酿造、节日食品(如粽子等)、糕点制作以及许多传统副食品(如八宝粥等)生产的主要原料，也是食品加工业的重要原料，因而有着广泛而重要的用途。同时糯米富含蛋白质和脂肪，营养价值较高。它还是东南亚某些地区的人们喜爱的传统食粮。因此，在当前粮食种植结构调整优化的新时期，糯稻的研究和利用尤为重要。

随着CRISPR/Cas9技术在人类与动物细胞系中建立并应用，经过改造的CRISPR/Cas9系统也迅速地被应用到水稻、玉米、小麦和高粱等不同作物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株，为作物的快速育种提供了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA。其具体技术方案为：

一种通过基因编辑降低水稻种子直链淀粉含量的方法，包括以下步骤：

抑制水稻中Waxy基因的表达；所述Waxy基因为编码Waxy蛋白的基因。

所述Waxy蛋白为如下(1)或(2)：(1)由SEQ：ID：NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列3的氨基酸序列经过一个至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。

所述Waxy基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA序列：(1)由SEQ：ID：NO：1和由SEQ：ID：NO：2所示的DNA序列；(2)编码序列表中由SEQ：ID：NO：3所示的蛋白质序列的多核苷酸；(3)在严格条件下可与序列表中序列1和序列2限定的DNA序列杂交且编码所述Waxy蛋白的DNA序列；(4)与序列表中序列1和序列2限定的DNA序列至少具有90％以上同源性，且编码所述Waxy蛋白的DNA序列。

所述抑制水稻Waxy基因的表达是通过对水稻Waxy基因进行基因编辑实现的。所述基因编辑是通过CRISPR/Cas9系统实现的。所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如下：ATCCACAACATCTCCTACCA。所述sgRNA的编码基因如SEQ：ID：NO：5所示。

所述抑制水稻中Waxy基因的表达是通过在水稻中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA的编码基因的特异DNA分子实现的。所述抑制水稻中Waxy基因的表达是通过在水稻中导入含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA的编码基因的DNA分子实现的。所述sgRNA的编码基因如序列表的由SEQ：ID：NO：4核苷酸所示。所述Cas9蛋白的编码基因具体可为序列表的由SEQ：ID：NO：5核苷酸所示。

所述水稻具体可为水稻品种638S和华占。

本发明还保护一种特异sgRNA，其靶标序列如下：ATCCACAACATCTCCTACCA。所述sgRNA的编码基因如序列表的由SEQ：ID：NO：4核苷酸所示。

还包括如下步骤：抑制水稻中所述Waxy蛋白的活性。所述水稻具体可为水稻品种638S和华占。

本发明还保护一种抑制水稻中Waxy基因的表达的方法，包括如下步骤：借助CRISPR/Cas9系统通过对水稻Waxy基因进行基因编辑从而抑制水稻Waxy基因的表达。所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如下：ATCCACAACATCTCCTACCA。所述水稻具体可为水稻品种638S和华占。

本发明利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑水稻Waxy基因，通过造成移码突变，敲除了水稻Waxy基因，获得了直链淀粉含量明显降低的新一代水稻新种质。获得的Waxy定点编辑株系与野生型相比，直链淀粉含量均显著降低。

附图说明

图1 Waxy基因的CRISPR/Cas9载体构建。A:Waxy基因的靶点及CRISPR/Cas9载体构建；B:农杆菌的PCR检测。

图2 T₀代waxy突变体的纯合突变类型；

图3 waxy突变体的稻米表型和直链淀粉含量。A:638S-waxy的稻米表型；B:638S-waxy的直链淀粉含量；C:华占-waxy的稻米表型；D:华占-waxy的直链淀粉含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.基因编辑载体的构建

为了获得638S和华占直链淀粉含量降低的植株，根据CRISPR/Cas9系统识别特点设计靶位点，在Waxy基因的第7外显子区域设计20bp的sgRNA靶点序列ATCCACAACATCTCCTACCA，PAM序列GGG位于靶序列3’末端，通过KpnI和HindIII双酶切方式构建CRISPR/Cas9重组载体(图1A)，重组载体经电击转化农杆菌EHA105。利用重组载体上的GUS报告基因，设计特异性检测正向引物GUS-F:5'CGTCCGTCCTGTAGAAACCC 3'和反向引物GUS-R:5'GTGCGGATTCACCACTTGC 3'进行农杆菌菌液检测，扩增产物大小为718bp，能扩增出目的片段大小的菌液为阳性菌株(图1B)。

2.水稻转化

将检测有目的条带的阳性农杆菌侵染638S和华占成熟胚的愈伤组织，将浸染后的愈伤组织共培养3天(避光，28℃)，再经过含有50mg/L潮霉素的筛选培养基上进行抗性愈伤的筛选以及分化培养基分化出T₀代抗性幼苗，然后将分化出的水稻植株在阴凉处水培炼苗1周，用于转基因检测。

3.转基因植株的获得及突变位点分析

通过载体上特异性引物GUS-F/GUS-R对T₀代组培苗进行PCR检测，筛选阳性转基因植株。为了检测阳性转基因植株的靶位点突变情况，在Waxy基因靶点两端分别设计测序引物Wx-CX-F:5'CCTAAACCTCAACAACAACCCAT 3'和Wx-CX-R:5'CGTGGTTGCGTCGTACTTGG 3'。通过PCR扩增目的片段送测序公司测序，分析突变类型。638S和华占的waxy基因纯合突变类型如图2所示。638S的waxy突变体命名为638S-waxy和华占的waxy突变体命名为华占-waxy，它们在靶位点都有单碱基A的插入，使mRNA移码导致翻译提前终止。

4.直链淀粉含量的检测

将638S-waxy和华占-waxy纯合突变类型的植株移栽大田，直至成熟收种。种子去壳打成精米观察稻米外形。638S-waxy和华占-waxy稻米的粒形与对照相比无显著差异，但是638S-waxy和华占-waxy的稻米呈现乳白色，典型的糯米特征(图3A,C)。进一步对638S-waxy和华占-waxy的稻米进行直链淀粉含量的测定。通过检测，638S-waxy和华占-waxy稻米的直链淀粉含量分别为1.6％和1.8％，而对照638S和华占的直链淀粉含量分别为13.0％和13.6％(图3B,D)。结果说明，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Waxy基因后，突变体植株的种子直链淀粉含量显著低于对照品种。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司

湖南亚华种业科学研究院

湖南隆平高科种业科学研究院有限公司

<120> 一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5035

<212> DNA

<213> 水稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

accattcctt cagttctttg tctatctcaa gacacaaata actgcagtct ctctctctct 60

ctctctctct ctctctctct ctctgcttca cttctctgct tgtgttgttc tgttgttcat 120

caggaagaac atctgcaagt tatacatata tgtttataat tctttgtttc ccctcttatt 180

cagatcgatc acatgcatct ttcattgctc gtttttcctt acaagtagtc tcatacatgc 240

taatttctgt aaggtgttgg gctggaaatt aattaattaa ttaattgact tgccaagatc 300

catatatatg tcctgatatt aaatcttcgt tcgttatgtt tggttaggct gatcaatgtt 360

attctagagt ctagagaaac acacccaggg gttttccaac tagctccaca agatggtggg 420

ctagctgacc tagatttgaa gtctcactcc ttataattat tttatattag atcattttct 480

aatattcgtg tcttttttta ttctagagtc tagatcttgt gttcaactct cgttaaatca 540

tgtctctcgc cactggagaa acagatcagg agggtttatt ttgggtatag gtcaaagcta 600

agattgaaat tcacaaatag taaaatcaga atccaaccaa ttttagtagc cgagttggtc 660

aaaggaaaat gtatatagct agatttattg ttttggcaaa aaaaaatctg aatatgcaaa 720

atacttgtat atctttgtat taagaagatg aaaataagta gcagaaaatt aaaaaatgga 780

ttatatttcc tgggctaaaa gaattgttga tttggcacaa ttaaattcag tgtcaaggtt 840

ttgtgcaaga attcagtgtg aaggaataga ttctcttcaa aacaatttaa tcattcatct 900

gatctgctca aagctctgtg catctccggg tgcaacggcc aggatattta ttgtgcagta 960

aaaaaatgtc atatccccta gccacccaag aaactgctcc ttaagtcctt ataagcacat 1020

atggcattgt aatatatatg tttgagtttt agcgacaatt tttttaaaaa cttttggtcc 1080

tttttatgaa cgttttaagt ttcactgtct ttttttttcg aattttaaat gtagcttcaa 1140

attctaatcc ccaatccaaa ttgtaataaa cttcaattct cctaattaac atcttaattc 1200

atttatttga aaaccagttc aaattctttt aggctcacca aaccttaaac aattcaattc 1260

agtgcagaga tcttccacag caacagctag acaaccacca tgtcggctct caccacgtcc 1320

cagctcgcca cctcggccac cggcttcggc atcgccgaca ggtcggcgcc gtcgtcgctg 1380

ctccgccacg ggttccaggg cctcaagccc cgcagccccg ccggcggcga cgcgacgtcg 1440

ctcagcgtga cgaccagcgc gcgcgcgacg cccaagcagc agcggtcggt gcagcgtggc 1500

agccggaggt tcccctccgt cgtcgtgtac gccaccggcg ccggcatgaa cgtcgtgttc 1560

gtcggcgccg agatggcccc ctggagcaag accggcggcc tcggtgacgt cctcggtggc 1620

ctcccccctg ccatggctgt aagcacacac aaacttcgat cgctcgtcgt cgctgaccgt 1680

cgtcgtcttc aactgttctt gatcatcgca ttggatggat gtgtaatgtt gtgttcttgt 1740

gttctttgca ggcgaatggc cacagggtca tggtgatctc tcctcggtac gaccagtaca 1800

aggacgcttg ggataccagc gttgtggctg aggtaggagc atatgcgtga tcagatcatc 1860

acaagatcga ttagctttag atgatttgtt acatttcgca agattttaac ccaagttttt 1920

gtggtgcaat tcattgcaga tcaaggttgc agacaggtac gagagggtga ggtttttcca 1980

ttgctacaag cgtggagtcg accgtgtgtt catcgaccat ccgtcattcc tggagaaggt 2040

ggagtcatca ttagtttacc ttttttgttt ttactgaatt attaacagtg catttagcag 2100

ttggactgag cttagcttcc actggtgatt tcaggtttgg ggaaagaccg gtgagaagat 2160

ctacggacct gacactggag ttgattacaa agacaaccag atgcgtttca gccttctttg 2220

ccaggtcagt gattacttct atctgatgat ggttggaagc atcacgagtt taccatagta 2280

tgtatggatt cataactaat tcgtgtattg atgctacctg caggcagcac tcgaggctcc 2340

taggatccta aacctcaaca acaacccata cttcaaagga acttatggtg agttacaatt 2400

gatctcaaga tcttataact ttcttcgaag gaatccatga tgatcagact aattccttcc 2460

ggtttgttac tgacaacagg tgaggatgtt gtgttcgtct gcaacgactg gcacactggc 2520

ccactggcga gctacctgaa gaacaactac cagcccaatg gcatctacag gaatgcaaag 2580

gtctatgctt gttcttgcca taccaactca aatctgcatg cacactgcat tctgttcaga 2640

aactgactgt ctgaatcttt ttcactgcag gttgctttct gcatccacaa catctcctac 2700

cagggccgtt tcgctttcga ggattaccct gagctgaacc tctccgagag gttcaggtca 2760

tccttcgatt tcatcgacgg gtatgagtaa gattctaaga gtaacttact gtcaattcgc 2820

catatatcga ttcaatccaa gatccttttg agctgacaac cctgcactac tgtccatcgt 2880

tcaaatccgg ttaaatttca ggtatgacac gccggtggag ggcaggaaga tcaactggat 2940

gaaggccgga atcctggaag ccgacagggt gctcaccgtg agcccgtact acgccgagga 3000

gctcatctcc ggcatcgcca ggggatgcga gctcgacaac atcatgcggc tcaccggcat 3060

caccggcatc gtcaacggca tggacgtcag cgagtgggat cctagcaagg acaagtacat 3120

caccgccaag tacgacgcaa ccacggtaag aacgaatgca ttcttcacaa gatatgcaat 3180

ctgaattttc tttgaaaaag aaattatcat ctgtcacttc ttgattgatt ctgacaaggc 3240

aagaatgagt gacaaatttc aggcaatcga ggcgaaggcg ctgaacaagg aggcgttgca 3300

ggcggaggcg ggtcttccgg tcgacaggaa aatcccactg atcgcgttca tcggcaggct 3360

ggaggaacag aagggccctg acgtcatggc cgccgccatc ccggagctca tgcaggagga 3420

cgtccagatc gttcttctgg tataatataa tacactacaa gacacacttg cacgatatgc 3480

caaaaattca gaacaaattc agtggcaaaa aaaaaactcg aatattaggg aaggacctaa 3540

taatatcaaa taattagaag gggtgaggct ttgaacccag atcgtctagt ccaccacctt 3600

gtggagttag ccggaagacc tctgagcatt tctcaattca gtggcaaatg atgtgtataa 3660

ttttgatccg tgtgtgtttc agggtactgg aaagaagaag ttcgagaagc tgctcaagag 3720

catggaggag aagtatccgg gcaaggtgag ggccgtggtg aagttcaacg cgccgcttgc 3780

tcatctcatc atggccggag ccgacgtgct cgccgtcccc agccgcttcg agccctgtgg 3840

actcatccag ctgcagggga tgagatacgg aacggtatac aatttccatc tatcaattcg 3900

attgttcgat ttcatctttg tgcaatgcaa tgcaattgca aatgcaaatg catgatgatt 3960

ttccttgttg atttctccag ccctgtgctt gcgcgtccac cggtgggctc gtggacacgg 4020

tcatcgaagg caagactggt ttccacatgg gccgtctcag cgtcgacgta agcctataca 4080

tttacataac aatcagatat gacacatcct aataccgata agtcggtaca ctactacaca 4140

tttacatggt tgctggttat atggtttttt tggcagtgca aggtggtgga gccaagcgac 4200

gtgaagaagg tggcggccac cctgaagcgc gccatcaagg tcgtcggcac gccggcgtac 4260

gaggagatgg tcaggaactg catgaaccag gacctctcct ggaaggtata aattacgaaa 4320

caaatttaac ccaaacatat actatatact ccctccgctt ctaaatattc aacgccgttg 4380

tcttttttaa atatgtttga ccattcgtct tattaaaaaa attaaataat tataaattct 4440

tttcctatca tttgattcat tgttaaatat acttatatgt atacatatag ttttacatat 4500

ttcataaaat tttttgaaca agacgaacgg tcaaacatgt gctaaaaagt taacggtgtc 4560

gaatattcag aaacggaggg agtataaacg tcttgttcag aagttcagag attcacctgt 4620

ctgatgctga tgatgattaa ttgtttgcaa catggatttc aggggcctgc gaagaactgg 4680

gagaatgtgc tcctgggcct gggcgtcgcc ggcagcgcgc cggggatcga aggcgacgag 4740

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gagtgattaa ttaatatagc agtatatgga tgagagacga atgaaccagt ggtttgtttg 4860

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tctgggtgtg cttaagtatc ttatcggacc ctgaatttat gtgtgtggct tattgccaat 4980

aatattaagt aataaagggt ttattatatt attatatatg ttatattata cttcc 5035

<210> 2

<211> 1830

<212> DNA

<213> 水稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

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aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgca ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

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cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 3

<211> 609

<212> PRT

<213> 水稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400> 3

Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe

20 25 30

Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu

35 40 45

Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val

50 55 60

Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser

85 90 95

Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met

100 105 110

Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln

115 120 125

Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala

130 135 140

Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val

145 150 155 160

Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly

165 170 175

Lys Thr Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys

180 185 190

Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala

195 200 205

Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu

225 230 235 240

Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn

245 250 255

Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe

260 265 270

Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser

275 280 285

Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys

290 295 300

Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly

325 330 335

Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val

340 345 350

Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile

355 360 365

Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn

370 375 380

Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile

385 390 395 400

Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp

405 410 415

Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile

420 425 430

Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser

435 440 445

Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn

450 455 460

Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val

465 470 475 480

Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg

485 490 495

Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr

500 505 510

Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp

515 520 525

Cys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu

530 535 540

Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val

545 550 555 560

Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn

565 570 575

Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly

580 585 590

Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala

595 600 605

Pro

<210> 4

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 60

ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgc 94

<210> 5

<211> 4101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080

ctgtctcagc tgggaggcga c 4101

Claims

1.一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

抑制水稻中Waxy基因的表达；所述Waxy基因为编码Waxy蛋白的基因，所述Waxy蛋白由序列1所示的DNA序列编码，所述抑制水稻Waxy基因的表达是通过对水稻Waxy基因进行基因编辑实现的；所述基因编辑是通过CRISPR/Cas9系统实现的；所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如下：ATCCACAACATCTCCTACCA 。

2.根据权利要求1所述的通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述抑制水稻中Waxy基因的表达是通过在水稻中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA的编码基因的特异DNA分子实现的；所述抑制水稻中Waxy基因的表达是通过在水稻中导入含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA的编码基因的DNA分子实现的；所述sgRNA的编码基因如序列表的由SEQ：ID：NO：4核苷酸所示；所述Cas9蛋白的编码基因具体可为序列表的由SEQ：ID：NO：5核苷酸所示。

3.根据权利要求1所述的通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述水稻为水稻品种638S和华占。

4.一种特异sgRNA，其特征在于，其靶标序列如下：ATCCACAACATCTCCTACCA。

5.一种抑制水稻中Waxy基因的表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：借助CRISPR/Cas9系统通过对水稻Waxy基因进行基因编辑从而抑制水稻Waxy基因的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如下：ATCCACAACATCTCCTACCA；所述水稻具体可为水稻品种638S和华占。