CN102933072A - 大麦及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括降低水平或活性的淀粉合成酶IIa蛋白以及至少41％(w/w)淀粉含量的大麦籽粒以及生成、鉴定以及使用它的方法。这种籽粒可以包括至少50％的淀粉酶含量、5％-9％(w/w)或大于9％(w/w)的β-葡聚糖含量、和/或3％-11％(w/w)的果聚糖含量。该果聚糖可以包括从大约3至大约12的聚合度。例如，该植物和籽粒包括一个sex6-292等位基因和/或一个amo1突变。一种食物或饮料产品，以及生产食物或饮料产品的方法，包括获得或产生主题籽粒并且加工这种籽粒以生产该产品。还考虑了改善哺乳动物体内的一个或多个健康指标的多种方法，包括施用含有该主题大麦籽粒的一种组合物或含有它的一种产品。

Description

大麦及其用途
技术领域
本说明书描述了变异体大麦植物以及来自它们的籽粒，包括降低水平或活性的SSIIa蛋白并且展示出较高产率的令人希望的淀粉以及非淀粉组分。
背景技术
野生型大麦种子在它的胚乳中包含大约50％至60％的淀粉，即大约25％的直链淀粉和75％的支链淀粉。直链淀粉是一种具有少量α-(1-6)连接的葡聚糖链的基本上是直链的α-(1-4)连接的糖基链，并且具有104至105的分子量。支链淀粉是一种高度分支的葡聚糖，其中具有大致3至60个糖基单位的α-(1-4)连接的糖基链是由α-(1，6)-键连接的，这样大约5％至6％的糖基键是α-(1，6)-键，并且具有105至106的分子量。
涉及谷类淀粉生物合成的一组酶包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.27)、淀粉合成酶(EC2.4.1.21)、淀粉分支酶(EC2.4.1.18)以及淀粉脱支酶(EC 3.2.1.41以及3.2.1.68)。淀粉合成的第一关键步骤是通过酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶进行催化从葡萄糖-1-P和ATP来合成ADP-葡萄糖。然后将ADP-葡萄糖用作底物通过淀粉合成酶来合成淀粉，这些淀粉合成酶将葡萄糖转移到预先存在的淀粉的α-(1-4)连接的糖基链的非还原端上。通过淀粉分支酶切割α-(1-4)连接的葡聚糖的一个区域并且随后将短葡聚糖转移到在淀粉的α-(1-4)连接的葡聚糖上的一个位置形成了淀粉的由α-(1-6)键连接的分支的葡聚糖链。通过脱支酶将过量的α-(1-6)连接的葡聚糖链去除从而将淀粉保持在限定的结构中(参见下面各项中的综述：Kossmann以及Lloyd，《植物科学评论》(Crit Rev Plant Sci)，19：171-226，2000；Rahman等人，《谷物科学期刊》(J Cereal Sci)，31：91-110，2000；Smith，《生物大分子》(Biomacromolecules)，2：335-341，2001；Morell等人，《真核植物》(Euphytica)，119：55-58，2001；Morell等人，《应用糖类物质科学期刊》(JAppl Glycosci)，50：217-224，2003a；Morell等人，“维管植物和藻类中淀粉生物合成的控制”，在Plaxton WC，McManus MT所著的《植物中主要代谢控制。一年生植物综述》，vol22，布莱克韦尔，牛津，pp 258-289，2006中(Controlof starch biosynthesis in vascular plantsand algae.In：Plaxton WC，McManus MT(eds)Control of primary metabolism in plants.Annualplant reviews，vol 22，Blackwell，Oxford，pp 258-289，2006)；Ball和Morell，《植物生物学年鉴》(Annu Rev Plant Biol)，54：207-233，2003；James等人，《植物生物学新见》(Curr Opin Plant Biol)，6：215-222，2003；以及Tetlow等人，《实验植物性期刊》(J Exp Bot)，55：2131-2145，2004)。
在水稻基因组中(Hirose和Terao，《植物》(Planta)，220：9-16，2004)已经鉴定了十个淀粉合成酶基因，并且将它们分类成五个不同的类别：颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)、淀粉合成酶I(SSI)、淀粉合成酶II(SSII)、淀粉合成酶III(SSIII)以及淀粉合成酶IV(SSIV)(Li等人，《功能性整合基因组》(Funct Integr Genomics)，3：76-85，2003)。水稻中存在两种GBSS同种型(GBSSI和GBSSII)、一种SSI同种型、三种SSII同种型(SSIIa[SSII-3]、SSIIb[SSII-2]、以及SSIIc[SSII-1])、两种SSIII同种型(SSIIIa[SSIII-2]以及SSIIIb[SSIII-1])、以及两种SSIV同种型(SSIVa[SSIV-1]和SSIVb[SSIV-2])(Hirose以及Terao，2004(同上)；Fujita等人，《植物生理学》(Plant Physiol)，144：2009-2023，2007)。已经在淀粉颗粒中检测出相应于SSI、SSIIa以及GBSSI的蛋白质，而SSIIIa蛋白仅在造粉粒的可溶相中检出(Li等人，《植物生理学》(PlantPhysiology)，123：613-624，2000)。虽然一些淀粉合成酶的潜在作用已经表征于不同器官以及不同种类中，这些淀粉合成酶单独地以及协作地在决定淀粉颗粒的最终结构方面的准确作用在很大程度上仍然是不确定的。
淀粉合成酶的突变体已经用于确定在一些谷物种类中的这些作用。GBSSI在生物合成直链淀粉方面起决定性作用(Ball等人，《细胞》(Cell)86(3)：349-52，1996)，但是它还可以促使合成长链的支链淀粉(Maddelein等人，《生物化学期刊》(J Biol Chem).269(40)：25150-7，1994；Denyer等人，《植物生理学》(Plant Physiol).112(2)：779-85，1996)。已经检查了大麦和小麦中GBSSI无效突变体对淀粉特性的作用(Andersson等人，《谷物科学期刊》(J.Cereal Sci)30：183-191，1999；Yamamori以及Quynh，《理论应用遗传学》(TheorAppl Genet)，100：32-38，2000)。GBSSI无效突变体大麦具有比野生型少5％的直链淀粉含量(Andersson等人，1999(同上))。小麦的GBSSI无效突变体也具有低直链淀粉含量(Kim等人，《谷物科学期刊》(J Cereal Sci)，37：195-204，2003；Miura等人，《真核植物》(Euphytica)，108：91-95，1999；Miura等人，《真核植物》(Euphytica)，123：353-359，2002)。如通过差示扫描热量法(DSC)确定的GBSSI无效突变小麦还具有比野生型更高的峰值胶化温度以及焓(Yasui等人，《谷物科学期刊》(J Cereal Sci)，24：131-137，1996)。
SSI、SSIIa和SSIII被认为主要涉及支链淀粉合成，支链淀粉合成涉及淀粉分子之内的可用非还原端的特定亚群的延伸。拟南芥和水稻SSI无效突变体的研究显示，SSI涉及拟南芥的叶淀粉(Delvalle等人，《植物期刊》(Plant J).43(3)：398-412，2005)中以及水稻胚乳淀粉中(Fujita等人，《植物生理学》(Plant Physiol).140：1070-1084，2006)支链淀粉簇(8-12dp)的小型外部链的生物合成。来自大麦和小麦SSIIa突变体的淀粉具有增加的DP3-8链，表明SSIIa酶在将较短的葡聚糖链DP3-8延伸至较长的葡聚糖链DP12-35中起作用(Morell等人，《植物期刊》(Plant J).34：173-185，2003b；Yamamori等人，《理论应用遗传学》(Theor Appl Genet)，101：21-29，2000；Konik-Rose等人，《理论应用遗传学》(Theor ApplGenet)，115：1053-1065，2007)。玉米和水稻中缺失SSIIIa赋予了增加的直链淀粉表型，其中非常长的链(玉米中DP＞50或水稻中DP＞30)的比例降低，并且胶化温度轻度降低(Jane等人，《谷物化学》(Cereal Chem).76：629-637，1999；Fujita等人，2007(同上))。拟南芥突变体，SSIV缺陷型，表现出在质体中具有更少的、更大的淀粉颗粒并且针对SSIV蛋白假设了在启动淀粉颗粒形成中的作用(Roldan等人，《植物期刊》(Plant J).49：492-504，2007)。
大麦SSIIa突变体显示具有高直链淀粉表型，由于淀粉生物合成的降低，该表型具有降低的淀粉含量以及降低的种子重量。在用叠氮化钠诱变大麦品种‘Himalaya’的籽粒之后，得到突变大麦系M292和M342，它们对于编码SSIIa的基因中的无效突变是纯合的。最初地基于皱缩籽粒表型从诱变群体的子代籽粒中选择突变种子。通过其改变的淀粉特征、降低的SSIIa蛋白水平以及活性，并且遗传地通过在编码SSIIa的基因的蛋白编码区中存在早熟终止密码子下对突变体品系进行进一步表征(Morell等人，2003b(同上)，通过引用将其以全部内容结合在此)。这导致在胚乳中SSIIa蛋白的丢失。然而，当大麦植物生长在大田中时，SSIIa突变籽粒还显著地降低了淀粉含量并且这与产量的中等减少相关联。当仍然保持高直链淀粉表型时，产量是否可以提高或如何提高是未知的。
因此，对于具有改进的农学性能的高直链淀粉大麦存在着一种需要。
发明概述
贯穿本说明书，除非上下文另外需要，词语“包括”(″comprise″)、或其改变如“包括“(comprises)或”包括“(″comprising″)应当理解为意指包括一个所陈述的要素或整体、或多个要素或整体的组，但不排除任何其他一个要素或整体、或多个要素或整体的组。
如在此使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数方面，除非在上下文中另外明确指出。因此，例如，提及一个“突变”包括一个单个的突变，以及两个或多个突变；提及一种“试剂”包括一种试剂以及两种或多种试剂；等等。
通过序列标识号(SEQ ID NO：)来引用核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO：数字地相应于序列标识号<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)、等。表8中提供了序列标识号的汇总。在权利要求书之后提供了一个序列表。
在此以斜体字的形式表示基因和其他遗传物质(例如，mRNA、核酸构建体等)而它们的蛋白质表达产物以非斜体字的形式来表示。因此，例如淀粉合成酶II(SSII)多肽是SSII核酸序列的表达产物。
在表8中进一步说明的序列表中提供了SSIIa分子的核酸和氨基酸序列的代表性实例。
在说明书的结尾处收集了本说明书中被作者引用的出版物的文献目录详细资料。
本说明书中提及的任何在先公开文件(或从其中所获得的信息)或者提及的任何已知的事物不是并且不应当被理解为这样一种承认或准许或任何形式的建议，即该在先公开文件(或从其中获得的信息)或已知的事物形成了在本说明书所涉及的研究领域内的公知常识的一部分。
在此所述的每个实施方案有待经必要的变更而应用于每个实施方案的任何一个上，除非另外明确说明。
在一个实施方案中，本发明提供了包括低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％(w/w)淀粉含量的大麦籽粒。通过至少这两个特征来表征该籽粒、来自它的产品以及获得、鉴定或使用这种籽粒的方法。具体地说，“淀粉含量”是整粒的淀粉含量，因为例如精加工籽粒的“淀粉含量”将是更高的。在一些实施方案中，该大麦籽粒包括至少43％(w/w)、至少45％(w/w)、至少47％(w/w)、至少50％(w/w)的淀粉含量，或包括41％-65％(w/w)的淀粉含量。
在一个相关实施方案中，籽粒包括作为籽粒中总淀粉比例的至少50％或至少60％的直链淀粉含量。进一步地，在一些实施方案中，籽粒包括5％-9％(w/w)或大于9％(w/w)的β-葡聚糖含量。
在另一个实施方案中，籽粒包括3％-11％(w/w)或4％-11％的果聚糖含量。合宜地，该果聚糖包括从大约3至大约12的聚合度。
在一个进一步相关的实施方案中，籽粒包括在编码具有SSIIa活性的多肽的内源基因中的一个突变，其中该突变降低了大麦植物中编码SSIIa的基因的表达或导致具有降低水平或活性的SSIIa的表达。在一个说明性实施方案中，提供了对于sex6-292等位基因是纯合的一种植物或籽粒。在一些实施方案中，通过一种外源核酸分子降低了SSIIa的水平，该外源核酸分子下调了大麦植物中编码SSIIa的基因的表达。在此，在一些实施方案中，该外源核酸分子包括下调内源SSII表达的一个基因沉默嵌合基因、一个反义序列、核酶、共抑制物、dsRNA分子、发夹RNA分子或微小RNA。
在一个优选实施方案中，本发明提供了进一步包括一种降低了amo1基因的活性的遗传变异的大麦籽粒。合宜地，如在此进一步说明的，amo1基因的活性相对于未修饰的对照而降低，如相对于品种Himalaya的大麦籽粒而降低。在一个说明性的实施方案中，该遗传变异包括amo1基因中的一个突变。在一个另外的实例中，该植物或来自其中的籽粒对于amo1-AC38等位基因是纯合的(Schondelmaier等人，《植物育种》(Plant Breeding)，109：274-281，1992，通过引用以其全部内容结合在此)。在一个实施方案中，该大麦籽粒包括amo1基因的一个突变以及降低活性的除了SSIIa之外的淀粉合成酶，优选降低水平的GBSS，更优选降低水平的GBSSI。这种籽粒还可以包括增加水平的赖氨酸(＞4g/每100g的蛋白质)。可以通过将大麦品种Prowashonupana和包含amo1突变基因座的大麦如高直链淀粉冰川(High Amylose Glacier.)杂交而得到这样的籽粒。
这种籽粒可以是任何有用的形式，例如但不限于整粒或裂开的、研磨的、精制的、碾磨的、磨成粗粒的、辊压的或珍珠状的籽粒。
本发明涉及能够产生在此所述的籽粒的大麦植物并且还涉及从这种籽粒生产的大麦粗面粉或面粉。
在一些实施方案中，本发明提供了包括至少41％(w/w)淀粉含量的大麦籽粒，其中这种籽粒包括一种突变SSIIa以及一种突变amo1基因。在一些实施方案中，SSIIa突变是sex6-292等位基因。在一些实施方案中，获得或生产了包括功能SSIIa突变(如sex6-292突变以及amo1突变)缺失的籽粒，并且将其加工以生产食物或饮料产品。
在另一个方面，本发明提供了一种生产食物或饮料产品的方法，其中该方法包括：(i)获得或产生如在此所述的大麦籽粒；(ii)加工这种籽粒以生产该产品。该产品可以合宜地选自下组，该组由以下各项组成：粗面粉、面粉、淀粉、麸皮、β-葡聚糖、果聚糖、一种非淀粉多糖、以及裂开的、研磨的、精制的、碾磨的、磨成粗粒的、辊压的或珍珠状的籽粒。可以直接使用加工的大麦籽粒，或在另一个实施方案中，将加工的颗粒与一种或多种其他成分混合来制造该食物或饮料产品。在某个实施方案中，这些方法进一步包括(iii)评定在大麦籽粒或来自它的产品中的淀粉的水平或类型、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖类、膳食纤维、或抗性淀粉。
在一些实施方案中，该食物或饮料产品是一种籽粒、面粉、早餐谷物、饼干、松饼、穆兹利棒、面条、一种甜味剂、一种低热量添加剂、一种增量剂、一种膳食纤维、一种调质剂、一种防腐剂、一种益生菌剂、或类似物或这些物质的任一组合。该食物产品可以是一种挤出的食品例如挤出的早餐谷物或小吃，或一种薄片的或辊压的产品。该食品可以是一种食物成分，例如一种烘焙成分或烘焙混合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产一种大麦植物或能够生产具有降低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％淀粉含量的籽粒的一种方法，其中该方法包括：(i)将一种相对于对照植物在植物体内下调内源淀粉合成酶IIa(SSIIa)的水平或活性的试剂、或在该植物中编码SSIIa的内源基因中的一个突变引入所述植物中，以及(ii)选出生产这种籽粒的大麦植物。在一些实施方案中，这些方法进一步包括将降低amo1基因活性的一种遗传变异引入到该植物中。这些试剂合宜地包括下调内源SSII基因表达的一种核酸分子，如一种基因沉默嵌合基因、一种反义序列、核酶、共抑制物、dsRNA分子、发夹RNA或下调内源SSII表达的其他外源核酸分子。
在一些实施方案中，这些方法进一步包括评定大麦籽粒或来自它的产品中的淀粉的水平、活性和/或类型、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖类、膳食纤维、或抗性淀粉。在一些实施方案中，这些方法包括用一种或多种遗传标记对植物进行分析。在一些实施方案中，相对于对照植物或引入该试剂或突变之前的植物，该SSIIa蛋白的降低水平或活性小于25％、小于10％、小于5％、或基本上缺乏。
在一些实施方案中，本发明提供了一种生产所述大麦籽粒的方法，包括种植大麦植物并且收获籽粒的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了在此披露的植物或籽粒或粗面粉或面粉，当使用或用于生产一种产品时用于提高所述产品中的抗性淀粉、膳食纤维、水溶性碳水化合物、β-葡聚糖、果聚糖或非淀粉碳水化合物的水平或降低所述产品的血糖生成指数(GI)。例如从本发明的植物、籽粒、粗面粉中分离的果聚糖、淀粉、或β-葡聚糖用于食物中作为甜味剂、低热量添加剂、增量剂、膳食纤维、调质剂、防腐剂、益生菌剂或类似物或这些物质的任一组合。因此，在一些实施方案中，从本发明的植物、籽粒、粗面粉或面粉中分离的籽粒、面粉、粗面粉、淀粉、β-葡聚糖或果聚糖用于生产食品以增加所述食品中的抗性淀粉、膳食纤维、水溶性碳水化合物、β-葡聚糖、果聚糖的水平或降低所述食品的血糖生成指数(GI)。在一些实施方案中，增加了直链淀粉、β-葡聚糖以及果聚糖(并且优选抗性淀粉)的水平。因此，本发明考虑了一种包括基于干重至少10％水平的食物成分的食品，其中该食物成分是如在此说明的包括至少41％(w/w)淀粉的所述大麦籽粒或从其中获得的粗面粉或面粉，其中该粗面粉或面粉包括降低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％(w/w)的淀粉构建体。在一些实施方案中，该粗面粉或面粉包含基于重量的3％至11％的果聚糖(w/w)或4％至11％(w/w)的果聚糖。
在一些其他的实施方案中，该粗面粉或面粉包括5％-9％(w/w)，或大于9％(w/w)的β-果聚糖含量。在其他实施方案中，该粗面粉或面粉包括作为该粗面粉或面粉中的总淀粉比例的50％或60％的直链淀粉。
在一个说明性的实施方案中，大麦包括sex6-292等位基因。
在另一个说明性的实施方案中，该产品是选自下组，该组由以下各项组成：面包、小面包、早餐谷物、蛋糕、饼干、糕点、薄脆饼干、松饼、比萨饼、牛角包、圈饼、椒盐脆饼、意大利面制品、面条、烘焙成分、烘焙混合物、汤、调味汁、增稠剂、糖果、玉米饼、格兰诺拉棒、小吃以及其他含淀粉的商品。该产品可以是一种饮料，如高能量饮料或思慕雪(smoothie)。
在另一个实施方案中，本发明提供了从如在此所述的植物或籽粒分离的籽粒或面粉在生产食品中用来增加该食品中的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉中一项或两项或更多项的水平的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定多种大麦籽粒的方法，这种大麦籽粒具有提高水平的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维、抗性淀粉中的一项或多项。在一些实施方案中，这些方法包括(i)获得大麦籽粒，这些大麦籽粒通过合成或代谢在淀粉方面发生了改变，以及(ii)确定在这种籽粒中的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖类、膳食纤维、或抗性淀粉中的一项或两项或更多项的量。在另外的实施方案中，该方法包括(iii)将(ii)中的水平与通过合成或代谢在淀粉方面未发生改变的野生型籽粒或亲本或其他对照植物的籽粒中的水平进行比较。在又另外的实施方案中，该方法包括，如果在(ii)中的水平在改变的颗粒中增加了，则选择这种籽粒。在一些实施方案中，这些方法包括在步骤(i)之前进行诱变或植物细胞转化。在优选的实施方案中，该大麦籽粒包括amo1基因中的一个突变以及降低活性的淀粉合成酶(该淀粉合成酶可以是SSIIa、SSIIIa或GBSS)，例如一个降低水平的GBSSI。可以通过使大麦突变体M292或包括sex6-292等位基因的其他大麦或品种Prowashonupana与包含amo1突变基因座的大麦如高直链淀粉冰川(High AmyloseGlacier)杂交而获得这样的籽粒。
在另一个方面，本发明提供了一种确定谷物粒(例如大麦籽粒)中的淀粉的量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉水平的方法，包括以下步骤：获得根据本发明的包含至少41％(w/w)淀粉的籽粒，对籽粒进行加工从而提取淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉，并且测量提取的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维、或抗性淀粉的量从而确定籽粒中的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉的量。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备食物或饮料的方法，包括将大麦籽粒或通过本发明披露的方法从中获得的产品与另一种食物或饮料成分混合。因此，这种方法包括(i)获得或生产包括降低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％(w/w)淀粉含量的大麦籽粒；以及(ii)加工这种籽粒以生产该产品。该产品可以合宜地选自下组，该组由以下各项组成：粗面粉、面粉、淀粉、麸皮、β-葡聚糖、果聚糖、一种非淀粉多糖、以及裂开的、研磨的、精制的、碾磨的、磨成粗粒的、辊压的或珍珠状的籽粒。该方法进一步包括将该产品与另一种食物或饮料产品或它们的前体混合。
本发明进一步提供了一种用于提供淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉以改善哺乳动物中的一个或多个健康指标的方法，其中该方法包括向该哺乳动物施用包括大麦籽粒、来自其中的粗面粉或面粉一种组合物或包含降低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％(w/w)淀粉含量的从其中获得的一种食物或饮料或如在此所述的食品。在一些实施方案中，这种籽粒、面粉、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉是处于食品、饮料或药物组合物的形式。在一些实施方案中，这种籽粒或面粉是处于果聚糖产品的形式。在一些实施方案中，该一个或多个健康指标是：有益肠细菌的数量增加、异常隐窝病灶的数量减少、矿物质吸收的增加、胰岛素水平的降低、血糖生成指数的降低、血糖生成负荷的降低、血糖的降低、血压的降低、体重的降低、血胆固醇水平的降低、HDL胆固醇水平的升高、骨密度的增加、钙水平的增加、更频繁的肠运动、或血清心血管谱(cardiovascular profile)的改善。
在一个相关的实施方案中，本发明提供了一种用于改善与受试者体内低水平的膳食淀粉、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉相关联的病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括口服地向该受试者施用如在此所述的籽粒或包括从中获得的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉的加工的产品(持续一段时间，并且在足以改善一个或多个症状的条件下)。
在该方法的一些实施方案中，该病症是选自下组，该组由以下各项组成：糖尿病、肥胖症、心脏病、高血压、便秘、骨质疏松症以及癌症。
可以从本发明的方法或组合物中获益的任何受试者都包括在内。术语“受试者”包括但不限于；人类和非人类灵长动物、家畜动物(如牛、猪或鸡)，或幼小动物(如小牛或小猪)、伴侣动物(如狗或猫)、马、实验室试验动物、捕获的野生动物、爬行动物和两栖动物、鱼、以及鸟类。受试者，无论是否是人类或非人类生物，可以称为病人、个体、受试者、动物、宿主或受体。在一个具体实施方案中，该受试者是人。
上面的概述不是并且不应当被以任何方式视为本发明所有实施方案的详尽叙述。
附图说明
图1是种子的一个照相显示，显示了种子的形态。所使用的系是野生型品系(HH21和HH61)、amo1突变体(HH17和HH30)、SSIIa突变体(HH35和HH50)、源于在Himalaya292与HAG之间的BC3F6群体的SSIIa-amo1双重突变体(HH4和HH88)。还使用了两个亲本系以及两个对照系。
图2是一个条形图，展示了四种基因型(野生型、SSIIa-amo1、ssIIa-amo1以及ssIIa-amo1)的作为种子干重百分比的淀粉含量。
表格的简要说明
表1提供了大麦粗面粉的RS含量以及GI水平
表2提供了使用100％大麦粗面粉生产的面包的RS含量以及GI水平。
表3提供了基因型对用30％或100％大麦粉生产的面包的RS含量的影响的统计分析。
表4提供了用30％大麦粉生产的面包的RS含量以及GI水平
表5提供了基因型对用100％大麦粉生产的面包的RS含量(mgRS/g淀粉)的影响的统计分析。
表6提供了基因型对用30％大麦粉生产的面包的RS含量(mgRS/g淀粉)影响的统计分析。
表7提供了基因型对用30％或100％大麦粉生产的10g面包的GI水平的影响的统计分析。
表8提供了在此提供的SEQ ID NO的一个说明。
表9提供了一个氨基酸亚分类。
表10提供了示例性的氨基酸置换。
详细说明
本发明是基于这样的出人意料的发现，即SSIIa突变体大麦的农艺学优点、尤其是高直链淀粉和果聚糖的农艺学优点可以在包含SSIIa基因方面的功能突变缺失以及降低amo1基因活性的遗传变异的品种中进一步增强。具体地，如图2中所示，相比于单一的SSIIa突变体，双重大麦突变体显示出淀粉水平的提高。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了包括降低水平或活性的SIIa蛋白以及至少41％(w/w)淀粉含量的大麦籽粒。在一个相关的实施方案中，这种籽粒包括作为籽粒中的总淀粉比例的至少50％或至少60％的直链淀粉含量。进一步地，在一些实施方案中，这种籽粒包括5％-9％(w/w)或大于9％(w/w)的β-葡聚糖含量。在另一个实施方案中，这种籽粒包括3％-11％(w/w)或4％-11％的果聚糖含量。在另一个实施方案中，籽粒中的赖氨酸含量是至少4g/100g蛋白质。
淀粉仅包括糖苷残基(glucosidic residue)，并且被发现为两种类型的分子，直链淀粉和支链淀粉，可以基于分子大小或其他特性将它们区别开。直链淀粉分子是由α-1，4连接的糖苷单元组成的基本上是直链的聚合物，而支链淀粉是用α-1，6糖苷键连接α-1，4连接的糖苷单元的多个直链的高度分支的分子。支链淀粉是由尺寸范围在数万至数十万之间的葡萄糖单元的大分子构成的，具有大约5％的α-1，6分支。另一方面直链淀粉由尺寸范围在数百至数千之间的糖苷残基的分子组成，具有小于1％的分支(关于综述参见Buléon等人，《生物大分子国际期刊》(International Journal of BiologicalMacromolecules)，23：85-112，1998)。野生型谷物淀粉典型地包含20％至30％的直链淀粉而剩余部分是支链淀粉。
在高等植物的胚乳中淀粉的合成是通过一组酶来实现的，这些酶催化四个关键步骤。首先，ADP葡萄糖焦磷酸化酶通过从G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖而活化淀粉的单体前体。其次，通过淀粉合成酶将该活化的糖基供体(ADP-葡萄糖)，转移到预先存在的α1-4连接的非还原端上。第三，淀粉分支酶通过切割α-1，4连接的葡聚糖的一个区域之后将切割的链转移到受体链上形成一个新的α-1，6连接从而引入多个分支点。淀粉分支酶是可以将α-1，6连接引入α-葡聚糖中的唯一的酶，并且因此在形成支链淀粉中起重要作用。最后，淀粉脱支酶将一些分支连接去除，虽然它们起作用的机理还不清楚。
虽然清楚的是至少这四种活性对于高等植物中的常规淀粉颗粒合成是需要的，在高等植物的胚乳中发现了这四种活性的每一种的多种同种型，并且基于突变分析或通过使用转基因途径改变基因表达水平已经提出了针对单独的同种型的特定作用。在谷物胚乳中，在谷物胚乳中发现了四类淀粉合成酶：一个唯一定位在淀粉颗粒之内的同种型、对于直链淀粉合成是重要的颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)、在颗粒和可溶部分之间分配的两种形式(SSI，Li等人，《植物生理学》(Plant Physiology)，120：1147-1155，1999a，SSII，Li等人，《理论及应用遗传学》(Theoretical and Applied Genetics)，98：1208-1216，1999b)、以及第四形式，它完全定位在可溶部分中，SSIII (Cao等人，《生物化学与生物物理集刊》(Archives ofBiochemistry and Biophysics )，373：135-146，2000；Li等人，1999b(同上)；Li等人，2000(同上))。在SSII和SSIII中的突变已经显示改变了支链淀粉的结构(Gao等人，《植物细胞》(Plant Cell)，10：399-412，1998；Craig等人，《植物细胞》(Plant Cell)10：413-426，1998)。还未说明限定SSI活性的作用的突变。
三种形式的分支酶表达于谷物胚乳中：分支酶I(SBEI)、分支酶IIa(SBEIIa)以及分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman和Boyer，《生物化学与遗传学》(Biochemical Genetics)，20：483-492，1982；Boyer以及Preiss，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)，61：321-334，1978；Mizuno等人，《生物化学期刊》(Journal of Biochemistry)，112：643-651，1992；Sun等人，《新植物学家》(The New Phytologist)，137：215-215，1997)。SBE序列的比对显示了在核苷酸和氨基酸水平两者上高度的序列相似性并且允许分型为SBEI、SBEIIa和SBEIIb类别。
两种类型的脱支酶存在于高等植物体内，并且基于它们的底物特异性进行了定义：异淀粉酶型脱支酶以及支链淀粉酶型脱支酶(Myers等人，《植物生理学》(Plant Physiology)，122：989-997，2000)。在玉米和水稻中的Sugary-1突变与两种脱支酶的缺陷相关(James等人，《植物细胞》(Plant Cell)，7：417-429，1995；Kubo等人，《植物生理学》(Plant Physiology)，121：399-409，1999)，然而将致病突变作图到与异淀粉酶型脱支酶基因相同的位置上。
一种大麦的突变型，称为M292或M342，已经显示具有升高的直链淀粉表型以及降低的支链淀粉表型。已经猜想这种表型对人体健康有益(Morell等人，《植物期刊》(Plant J).34：173-185，2003b；Topping等人，《淀粉/淀粉糖》(Starch/
Figure BDA0000146528690000161
)55：539-545，2003；Bird等人，《营养学期刊》(J.Nutr).134：831-835，2004a；Bird等人，《英国营养学期刊》(Br.J.Nutr).92：607-615，2004b )。它是由位于大麦染色体7H上的淀粉合成酶IIa基因(SSIIa)中的突变引起的(如国际专利申请PCT/AU01/01452(公开号WO02/37955)所述，其披露的内容通过引用结合在此)。
大麦sex6突变是由于淀粉合成酶IIa(SSIIa)基因中存在终止密码子所致。该终止密码子导致转录本的翻译过早终止。在这个突变体的胚乳中不能检出SSIIa蛋白(Morell等人2003(同上))。失去SSIIa活性导致支链淀粉合成降低80％，并且剩余的支链淀粉聚合物总体上具有改变的链长度分布，并且结果改变了直链淀粉：支链淀粉比率，这样使得颗粒的淀粉包含约70％的直链淀粉。
在一些实施方案中，本发明通过增加籽粒中的淀粉以及非淀粉成分的产量而提供了大麦植物利用的改进。这些改变可能限于籽粒或可替代地这种改变可以遍及植物而在它的不同组织和部分中。如在此使用的，“改变了”或“改变的”是指植物或籽粒中的变化，它可以是以下各项的增加或降低：量、活性、生产率、失活速率、分解速率、启动延迟、早启动、添加或去除物质、突变、或这些的任何组合，只要存在着降低水平或活性的淀粉合成酶II。这些术语包括感兴趣的基因或蛋白质的功能水平的增加或降低。“功能水平”应当理解为是指活化蛋白的水平。功能水平是存在于宿主细胞中的蛋白质的实际水平与蛋白质的比活性的结合。因此，功能水平可以例如通过增加或降低宿主细胞中的实际蛋白浓度而改变，这可以通过改变编码该蛋白质的基因的表达而容易地实现。还可以通过调节蛋白质的比活性来改变该功能水平。比活性的这种增加或降低可以通过表达具有更高或更低比活性的变异体蛋白，或通过用编码这样的变异体的等位基因替换编码相关蛋白的内源基因来实现。比活性的增加或降低还可以通过改变效应分子的表达来实现。在某些实施方案中，这样选择适当的编码序列的表达水平或酶的活性或量，使得它比参考表达水平高至少大约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少80％、或甚至至少大约100％、至少200％、至少500％、或至少1000％，或比参考表达水平低至少大约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，或降低到不可检出的水平。
区别所需要的SSII水平或活性方面的降低的另一种方法是通过对改性植物或来自它的籽粒中的不同形式果聚糖的增加水平或增加量进行定量。
如在此使用的，术语“修饰的”、“改变的”、“增加的”、“增加了”、“减少了”、“减少的”、“抑制的”、“突变体”或类似术语被认为是相对术语，即与野生型或未改变的或对照状态相比较。在一些实施方案中，野生型植物是一种适当的“对照植物”，然而在多种情况下这种对照植物必须由熟练人员使用本领域的他们的普通技术来确定。
“蛋白质水平”是指具体蛋白质(例如SSII)的量，它可以通过本领域已知的任何手段(例如像蛋白印迹分析或其他免疫手段)来测量。
“酶活性水平”是指在酶测定法中所测量的具体酶的量。
“SSIIa蛋白活性”是指在酶测定法中所测量的具体酶的量。
应当理解的是，如果产生或多或少的活性蛋白质，在突变体中酶的活性水平可以改变，但是蛋白质本身的表达水平(量)不变。相反地，蛋白质的量可以改变，但是活性(每单位蛋白质)保持相同。量和活性两者降低也是可能的，例如像当编码该酶的基因的表达在转录或转录后降低时。在某些实施方案中，与未修饰大麦籽粒中的蛋白质或活性水平相比较，SSII的蛋白质或活性水平的降低是至少40％、或至少60％，或至少75％、至少90％或至少95％。蛋白质或酶活性或基因表达水平的降低可以出现在叶、种子或籽粒发育中的任何阶段，尤其是在日间期间当光合作用正在发生时，或者在籽粒灌浆阶段期间当正在发育的胚乳中合成淀粉时，或者在通向成熟的籽粒发育的所有阶段。如在此使用的术语“野生型”具有通常的它在遗传学领域中的含义，并且包括如在此所传授的未被修饰的大麦、栽培品种或基因型。在此说明了一些优选的“野生型”大麦品种，例如像栽培品种Himalaya。
修饰的表型可以通过SSIIa基因的表达的部分或完全抑制来实现。在水解的和未水解的籽粒以及它们的部分上进行本领域熟知的技术如SDS-PAGE和免疫印迹来鉴定在其中淀粉形成酶已经发生改变的植物或籽粒。这些方法包括通过在此所述的方法，并且进一步通过多种方法，例如像微阵列分析、电泳、色谱法(包括纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、气-液色谱法以及高效液相色谱法)技术对植物进行分析。典型地通过将分离曲线与已知身份的标准品进行比较、或通过多种分析技术(如质谱法以及核磁共振光谱学)对分离的组分进行鉴定。例如，可以参考实例9，Robinson，《高等植物的有机组分》(The Organic Constituents of Higher Plants)，Cordus出版社，North Amherst，美国，1980；Adams等人，《分析生物化学》(Anal.Biochem)，266：77-84，1999；Veronese等人，《酶与微生物技术》(Enz.Microbial Tech)，24：263-269，1999；Hendrix等人，《昆虫生理学期刊》(J.Insect Physiol)，47：423-432，2001；Thompson等人，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Res.)，331：149-161，2001；以及在此引用的参考文件。可以使用本领域普通技术人员已知的标准实验方案测定碳水化合物。
可以通过将一个或多个遗传变异引入大麦植物中来实现SSIIa水平或活性的改变。即这些遗传变异直接或间接导致生长或发育期间酶活性或植物部分水平的改变并且因此导致在此所述的酶、淀粉和果聚糖修饰。这种遗传变异可以是一种异源多核苷酸，例如通过转化或诱变将它引入植物或祖细胞中。随后可以通过杂交(如植物育种领域中已知的)将该遗传变异引入到不同的遗传背景中。在一些实施方案中，相对于相应的对照植物，SSIIa的水平或功能活性被下调到小于大约80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于15％，并且适当地小于大约10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的水平，从而实现淀粉或非淀粉组分水平的提高，优选在籽粒的淀粉含量中的直链淀粉比例的提高。在一个优选实施方案中，升高的水平是对照的至少两倍。优选地，在这个实施方案中，这种降低导致非淀粉多糖，如果聚糖水平的显著增加，该果聚糖水平通常相对于在相同环境条件下生长的相应的对照植物增加至少大约50％或55％并且更具体地是至少大约60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。所需要的降低的SSIIa水平或活性的量可能取决于多种其他因素，如植物种类或品系的环境因素。然而，所考虑的是在这样的事件中所需要的任何优化可以使用常规方法来实现，包括在此所述的那些。
可以例如使用驱动下调SSIIa的异源多核苷酸表达的组成型启动子实现在遍及整个植物的组织中的SSIIa水平的降低。优选地，这可以使用组织特异性或发育调节性启动子在库组织中，更优选地在发育的胚乳中来实现。如在此使用的，“库细胞”和“库组织”是指包括有机碳净流入的细胞、组织或器官，该有机碳以与固定二氧化碳不同的一种形式进入细胞中(即以糖或其他碳水化合物形式)。在植物中，库组织包括具有通过除了直接固定二氧化碳之外的手段通过其他光合细胞固定的或另外地从周围培养基或环境中获得的有机碳净流入的所有非光合组织、以及光合组织。
基因
在一些实施方案中，本发明涉及基因活性的改变以及嵌合基因的构造和用途。如在此使用的，术语“基因”包括任何脱氧核糖核苷酸序列，该序列包括蛋白编码区或在细胞中转录但未翻译的区域，以及相关的非编码区和调节区。这样的相关区域典型地位于该编码区或转录区的附近在5′和3′端两者上距离每一端大约2kb的距离。在这一点上，该基因可以包括多种控制信号，如启动子、增强子、与给定的基因自然结合的终止和/或多腺苷酸化信号、或异源控制信号(在这种情况下该基因被称为“嵌合基因”)。定位在编码区5′并且存在于mRNA上的序列称为5′非翻译序列。定位在编码区3′或下游并且存在于mRNA上的序列称为3′非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式两者。
如在此使用的“淀粉合成酶II基因”“SSII”或类似物是指在大麦中编码淀粉合成酶II(SSII)的核苷酸序列，本领域普通技术人员可以容易地将它与其他淀粉合成酶或其他蛋白质区分开。在一个优选的实施方案中，大麦SSII基因是指一种核酸分子，该核酸分子是存在于大麦中或从其中分离或从其中衍生的，它包括具有与SEQ IDNO：1中所示的cDNA序列至少80％一致性的一个序列的核苷酸。在一个优选的实施方案中，SSII基因是一个SSIIa基因，或者SSII蛋白是一个SSIIa蛋白，它们中每一个可以应用于在此所述的发明的任何一个方面或所有方面中。来自M292的SSIIa基因cDNA的核苷酸序列展示在SEQ ID NO：9中。
包含转录区的基因的基因组形式或克隆可能被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码区中断。如在此使用的“内含子”是基因的一个区段，它被转录为初级RNA转录本的一部分，但是在成熟mRNA分子中是不存在的。从核或初级转录本中去除或“剪接掉”内含子；因此内含子信使RNA(mRNA)中是不存在的。内含子可以包含多种调控元件，如增强子。如在此使用的“外显子”是指相应于存在于成熟mRNA或成熟RNA分子(在该RNA分子不被翻译的情况下)中的RNA序列的DNA区域。在翻译过程中mRNA起作用以指定氨基酸的序列或顺序成为一个新生多肽。术语“基因”包括编码在此所述的本发明的全部或部分蛋白质的合成分子或融合分子以及与上述任何一项互补的核苷酸序列。可以将基因引入适当的载体中用于染色体外维持在细胞中或用于整合到宿主基因组中。
如在此使用的，“嵌合基因‘是指在其天然位置不是天然基因的任何基因。典型地，嵌合基因包括在自然界中不是一起发现的调控序列或转录序列或蛋白编码序列。因此，嵌合基因可以包括从不不同来源得到的调控序列和编码序列，以及从相同来源得到的调控序列和编码序列，但是以不同于自然界中发现的方式排列。在此使用术语“内源”是指这样一种物质，该物质在与研究的植物相同的发育阶段通常存在于或产生在一个未修饰的植物中。“内源基因”是指在生物体的基因组中的其天然位置的一种天然基因。如在此使用的，“重组体核酸分子”是指这样一种核酸分子，该分子是通过重组DNA技术构建或修饰的。术语“外来多核苷酸”或“外源多核苷酸”或“异源多核苷酸”以及类似物是指通过实验操作引入到细胞基因组中的任何核酸。这些包括在该细胞中发现的基因序列，只要所引入的基因相对于天然发生的基因包含某种修饰即可(例如，突变，选择标记基因的存在，等)。外来或外源基因可以是插入非天然生物体中的基因、被引入到天然宿主体内的新位置的天然基因、或嵌合基因。“转基因”是通过转化步骤引入到基因组中的一种基因。术语“遗传修饰的”包括通过转化或转导将基因引入到细胞中，突变细胞中的基因，以及改变或调控在细胞或生物体(这些措施已经针对它们完成)或它们的子代中的基因的调节。
多核苷酸
包括说明书、表格以及序列表的本发明涉及不同的多核苷酸。如在此使用的，“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”表示一种核苷酸聚合物，它可以是DNA或RNA或它们的一种组合，并且包括mRNA、cRNA、cDNA、tRNA、siRNA、shRNA以及hpRNA。它可以是细胞起源、基因组起源或合成起源(例如在自动合成仪上制造)的DNA或RNA，并且可以与碳水化合物、脂类、蛋白质或其他物质结合，标记有荧光或其他基团、或附连到固体载体上以执行在此定义的具体活性，或包括自然界中未曾发现的一种或多种修饰的核苷酸，对于本领域普通技术人员而言是熟知的。该聚合物可以是单链的，基本上双链的或部分双链的。部分双链RNA分钟的一个实例是一种发夹RNA(hpRNA)、短发夹RNA(shRNA)或自身互补的RNA，它们包括通过核苷酸序列与它的互补序列之间的碱基配对而形成的一个双链柄以及共价地连接该核苷酸序列以及它的互补序列的一个环序列。如在此使用的碱基配对是指核苷酸之间的标准碱基配对，包括G∶U碱基对。“互补”是指两个多核苷酸能够沿着它们长度的一部分，或沿着一个或两个链的全长进行碱基配对(杂交)。“杂交多核苷酸”表示该多核苷酸实际上与它的互补序列进行碱基配对。术语“多核苷酸”在此与术语“核酸”可互换地使用。
对于“分离的”表示物质是基本上或实质上不含有通常以它的天然状态伴随的组分的。如在此使用的，“分离的多核苷酸”或“分离的核酸分子”表示一种多核苷酸，该多核苷酸至少部分地分离自(优选基本上或实质上不含有)与它以其天然形式相结合或连接的那些相同类型的多核苷酸序列。例如，“分离的多核苷酸”包括已经从多个序列中纯化或分离的一种多核苷酸，这些序列以一种天然发生的状态位于它的侧翼，例如已经从序列中移出的一个DNA片段，这些序列通常位于该片段的附近。优选地，这种分离的多核苷酸也是至少90％不含有其他组分，例如蛋白质类、碳水化合物类、脂类等。如在此使用的，术语“重组多核苷酸”是指通过处理核酸成为通常未发现于自然界的形式在体外形成的一种多核苷酸。例如，该重组多核苷酸可以是处于表达载体的形式。通常，这类表达载体包括可操作地连接到核苷酸序列上的转录和翻译的调控核酸。
本发明提及寡核苷酸的用途。如在此使用的，“寡核苷酸”是长度高达50个核苷酸的多核苷酸。它们可以是RNA、DNA或两者之一的组合或衍生物。寡核苷酸典型地是10至30个核苷酸的较短的单链分子，通常是15至25个核苷酸长度。当在扩增反应中用作探针或用作引物时，这样的寡核苷酸的最小尺寸是在靶核酸分子上在寡核苷酸与互补序列之间形成稳定的杂交体所需要的尺寸。优选地，这些寡核苷酸长度是至少15个核苷酸，更优选至少18个核苷酸，更优选至少19个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，甚至更优选至少25个核苷酸。
用作探针的多核苷酸典型地与可检出标记如放射性同位素、半抗原、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子结合。本发明的寡核苷酸在检测SSII或与感兴趣的性状连锁的其他基因的等位基因的方法中是有用的，例如变性淀粉或果聚糖水平。这类方法例如使用核酸杂交并且在多种情况下包括通过适当的聚合酶进行寡核苷酸引物延伸(如用于PCR中)。
本发明的寡核苷酸的变异体包括在此定义的特异性寡核苷酸分子的不同尺寸的、和/或能够例如与其接近的谷物基因组杂交的分子。例如，这些变异体可以包括另外的核苷酸(例如，1、2、3、4或更多)、或更少的核苷酸，只要它们仍然与靶区域杂交即可。此外，可以置换几个核苷酸而对寡核苷酸杂交到靶区域上的能力没有负面影响。此外，可以容易地设计这些变异体，它们在附近(例如在50个核苷酸之内)与植物基因组的区域杂交(其中在此定义的特异性寡核苷酸杂交)。探针、寡核苷酸等是基于在此所述的序列或其校正形式或其变异体或来自其他谷类植物的功能类似物。
术语“多核苷酸变异体”以及“变异体”等是指显示出与参考核苷酸序列的实质性序列一致性的多核苷酸或它们的互补形式。这些术语还包括这样的多核苷酸，它们与参考多核苷酸通过至少一个核苷酸的添加、缺失或置换而区分。因此，术语“多核苷酸变异体”和“变异体”包括其中一个或多个核苷酸已经被添加或缺失、或用不同的核苷酸替换的多核苷酸。在这点上，本领域很好理解的是，可以对参考多核苷酸进行某些改变(包括突变、添加、缺失以及置换)，由此该改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物功能或活性。因此，这些术语包括编码展示出酶活性或其他调节活性的多肽的多核苷酸、或者能够用作选择探针或其他杂交试剂的多核苷酸。具体地，这包括多种多核苷酸，这些多核苷酸编码相同的多肽或氨基酸序列但是它们通过冗余遗传密码而在核苷酸序列方面不同。术语“多核苷酸变异体”和“变异体”还包括天然发生的等位基因变异体。
对于“相应于”或“符合于”表示(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或大部分基本上一致的或互补的核苷酸序列或者(b)将与一个氨基酸序列一致的氨基酸序列编码成肽或蛋白质的一种多核苷酸。这个用语还将具有与参考肽或蛋白质的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列的肽或多肽包括在它的范围之内。用于描述在两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”、“实质性一致”以及“一致”，并且是相对于最小数量的核苷酸或氨基酸残基或在整个长度上而定义的。术语“序列一致性“和”一致性“在此可以互换地使用，用来参考在比较窗口上基于核苷酸-对-核苷酸或基于氨基酸-对-氨基酸的序列一致性的程度。因此，“序列一致性百分比”是通过以下步骤计算的：在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定一致的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U)或一致的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)出现在两个序列中的位置的数量，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数量(即窗口尺寸)，并且将该结果乘以100以产生序列一致性百分比。
多核苷酸的％一致性是通过GAP(Needleman和Wunsch，《分子生物学期刊》(J.Mol.Biol).48：443-453，197)分析(GCG程序)、使用空位产生罚分＝5，以及空位延伸罚分＝0.3来确定的。除非另外说明，查询序列的长度是至少45个核苷酸，并且这种GAP分析在至少45个核苷酸的区域内比对了这两个序列。优选地，该查询序列的长度是至少150个核苷酸，并且这种GAP分析在至少150个核苷酸的区域内比对了这两个序列。更优选地，该查询序列的长度为至少300个核苷酸，并且这种GAP分析在每种情况下在至少300个核苷酸、或至少400个、至少500个或至少600个核苷酸的区域内比对了这两个序列。还参考了BLAST程序家族，例如像Altschul等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res).25：3389，1997所披露的。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人，《现代分子生物学实验技术》(″Current Protocols in Molecular Biology″)，John Wiley & Sons公司，1994-1998，第15章第19.3节中找到。
当这类序列具有至少80％序列一致性时(具体地是至少85％，更具体地是至少90％，尤其是至少95％，更加尤其地是完全一致)，这些核苷酸或氨基酸序列被指示为“实质上相似的”。应当清楚的是，当RNA序列被描述成实质上相似于、相应于DNA序列，或与其具有一定程度的序列一致性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
对于定义的多核苷酸而言，应当理解的是高于以上所提供的那些的％一致性的数值将涵盖优选的实施方案。因此，当可应用时，根据最小％一致性数值，优选的是该多核苷酸包括与有关指定的SEQ ID NO(如SEQ ID NO：1或3至6)具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％、以及甚至更优选至少99.9％一致性的多核苷酸序列。
优选地，编码具有SSII活性的多肽的本发明的多核苷酸长度大于800、优选大于900、并且甚至更优选大于1,000或2000个核苷酸。
当与天然发生的分子比较时，本发明的多核苷酸可以具有一个或多个突变，这些突变是核苷酸残基的缺失、插入、或置换。这些突变体可以是天然发生的(即，从天然来源分离的)或合成的(例如，通过在核酸上进行定点诱变)。
本发明提及杂交条件的严紧性，以定义两种多核苷酸的互补性程度。如在此使用的“严紧性”是指在杂交和洗涤过程中温度和离子强度条件、以及某些有机溶剂的存在或缺乏。严紧性越高，在靶核苷酸序列与标记的核苷酸序列(探针)之间的互补性程度就越高。“严紧条件”是指温度和离子条件，在这些条件下仅仅具有高频率的互补碱基的核苷酸序列将杂交。如在此使用的，术语“在低严紧度、中等严紧度、高严紧度、或非常高严紧度条件下杂交”说明了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可以在Ausubel等人编著的《现代分子生物学实验方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，纽约，6.3.1-6.3.6.，1989中在找到。在这篇参考文献中描述了水性和非水性方法并且可以使用两者之一。在此提及的具体的杂交条件如下：1)低严紧度杂交条件是在45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，之后在50℃-55℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤两次；2)中等严紧度杂交条件是在45℃下在6X SSC中杂交，之后在60℃下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高度严紧的杂交条件是在45℃下在6X SSC中杂交，之后在65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及4)非常高严紧度的杂交条件是在65℃下在0.5M磷酸钠缓冲液、7％SDS中杂交，之后在65℃下用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。
多肽类
术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换地使用。如在此使用的术语“蛋白质类”和“多肽类”还包括如在此所述的本发明多肽的多种变异体、突变体、修饰物、类似物和/或衍生物。如在此使用的，“基本上纯的多肽”是指一种已经从脂类、核酸、其他多肽、以及其他分子(该多肽以其天然状态与它们结合)分离出来的多肽。优选地，这种基本上纯的多肽是至少90％减免了与该多肽自然结合的其他组分。对于“重组多肽”表示使用重组技术，即通过在细胞中(优选在植物细胞中并且更优选地在谷物植物细胞中)表达重组多核苷酸而制造的一种多肽。
在序列表中展示了具有SSII活性的说明性的多肽并且描述于表8中。因此，本发明在不受限制下提出了具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的SSII多肽的修饰，以及它们的天然发生变异体、校正形式以及如在此所述的变异体(如具有大约80％序列一致性的变异体)。
对于定义的多肽而言，应当理解的是，高于以上所提供的那些的％一致性的数值将涵盖优选的实施方案。因此，当可应用时，根据最小％一致性数值，优选的是该多肽包括与有关指定的SEQ IDNO.2具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少9.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％、以及甚至更优选至少99.9％一致性的氨基酸序列。
多肽相对于另一种多肽的％一致性可以通过GAP(Needleman和Wunsch，1970(同上))分析(GCG程序)，使用空位产生罚分＝5、以及空位延伸罚分＝0.3来确定。查询序列的长度是至少15个氨基酸，并且该GAP分析在至少15个氨基酸的区域内比对了这两个序列。更优选地，该查询序列的长度是至少50个氨基酸，并且该GAP分析在至少50个氨基酸的区域内比对了这两个序列。更优选地，该查询序列的长度是至少100个氨基酸，并且该GAP分析在至少100个氨基酸的区域内比对了这两个序列。甚至更优选地，该查询序列的长度是至少250个氨基酸，并且该GAP分析在至少250个氨基酸的区域内比对了这两个序列。
如在此使用的多肽的“生物活性”片段是小于全长的本发明多肽的一部分，该片段仍然保持所定义的全长多肽的活性。在一个特别优选的实施方案中，该生物活性片段能够合成淀粉，以产生具有DP为至少15的直链淀粉链。生物活性片段可以是任何大小只要它们保持所定义的活性即可，但是优选至少200或至少250个氨基酸残基长度。
本发明的这些多肽的氨基酸序列突变体可以通过将适当的核苷酸变化引入到本发明的一种核酸中、或通过体外合成所希望的多肽来制备。此类突变体包括例如该氨基酸序列中的残基的缺失、插入或置换。可以进行缺失、插入和置换的组合来取得最终的构建体，条件是这种最终的肽产物具有令人希望的特性。
可以使用在本领域中已知的任何技术来制备这些突变(改变的)肽。例如，可以使本发明的多核苷酸经受体外诱变。这类体外诱变技术包括将该多核苷酸亚克隆到一个适当的载体中，将该载体转化到“增变”株中(如大肠杆菌XL-1红(E.coli XL-1red)(Stratagene))并且使转化的细菌繁殖适当数量的世代。在另一个实例中，使本发明的多核苷酸经受DNA改组技术(如概括地由Harayama，《生物技术趋势》(Trends Biotechnol).16：76-82，1998所述)。这些DNA改组技术可以包括与本发明的那些相关的基因，如来自除了小麦或大麦之外植物种类的SSII基因、和/或包括来自编码类似蛋白的同一植物的不同的基因，如小麦或大麦淀粉合成酶I或III基因。使用在此所述的技术可以容易地筛选源于突变/改变的DNA的产物，以确定它们是否具有例如淀粉合成酶活性。
在设计氨基酸序列突变体中，该突变位点的定位以及该突变的性质将取决于有待修饰的一种或多种特征。可以逐个地或连续地修饰突变位点，例如通过(1)首先用保守氨基酸选择进行置换，然后用更多基团选择进行置换，这取决于所达到的结果，(2)删除该目标残基，或(3)邻近该定位的位点将其他残基插入。
氨基酸序列缺失的范围通常是在大约1至15个残基、更优选大约1至10个残基、并且典型地大约1至5个连续残基。
置换突变体是在该多肽分子中将至少一个氨基酸去除，并且在其位置上插入一种不同的残基。用于置换型诱变的最感兴趣的位点包括被鉴定为活性位点的位点。感兴趣的其他位点是在其中从不同菌株或种类获得的具体残基是一致的位点的那些。这些位置对于生物活性可能是重要的。这些位点，特别是落在至少3个其他相同的一致保守位点的序列中的那些位点，优选地以一种相对保守的方式被置换。这样的保守性置换示于表10中的“示例性置换”的标题下。
可以按照许多方式制备本发明的多肽，包括产生和回收天然多肽、产生和回收重组多肽、以及化学合成这些多肽。在一个实施方案中，本发明的一种分离的多肽是通过培养一种能够在有效产生该多肽的条件下表达该多肽的细胞并且回收该多肽而产生的。优选的培养细胞是一种本发明的重组细胞。有效的培养条件包括但不限于：允许多肽产生的有效介质、生物反应器、温度、pH和氧条件。一种有效介质指其中培养一种细胞以产生本发明的一种多肽的任何介质。这样的介质典型地包括一种水性介质，该介质含有可同化的碳源、氮源和磷源，以及适当的盐类、矿物质、金属和其他营养素，如维生素类。可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘、以及培养皿中培养本发明的细胞。培养可以在适合于一种重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这样的培养条件在本领域的普通技术人员的专业技能范围之内。
本发明涉及可操作地连接或连锁的多种元件。“可操作地连接”或“可操作地连锁”以及类似短语是指处于功能关系的多个多核苷酸元件的连接。典型地，可操作地连接的核酸序列是连续连接的，并且当对于连接两个蛋白编码区必要时，是邻接的并且在阅读框内。当RNA聚合成酶将这两个编码序列转录成一个单一RNA时，编码序列被“可操作地连接”到另一个编码序列上，如果翻译的话该单一RNA然后被翻译成具有从这两个编码序列中获得的氨基酸的一个的单一多肽。这些编码序列不必是彼此邻近的，只要表达的序列最后被加工以产生所希望的蛋白质即可。
如在此使用的，术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”或“顺式调控区”或“调控区”或类似术语应当被理解为表示当适当地定位并且相对于可表达的基因序列进行连接时，它们能够至少部分地调节该基因序列的表达的任何核苷酸序列。本领域的普通技术人员应当清楚的是，顺式调控区能够在转录或转录后水平上活化、沉默、增强、抑制或另外地改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的某些实施方案中，该顺式作用序列是增强或刺激可表达的基因序列的表达的一种激活序列。
将一种启动子或增强子元件“可操作地连接”到一个可转录的多核苷酸上表示将该可转录的多核苷酸(例如，编码蛋白质的多核苷酸或其他转录本)置于启动子的调节控制之下，然后它控制该多核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选将一个启动子或其变异体定位在离开该可转录的多核苷酸的转录起始位点的一个距离处，它大致地与该启动子与该蛋白质编码区之间的距离相同，它以其天然设置进行控制，即从中获得启动子的基因。如本领域已知的，可以适应在这个距离中的某种改变而没有功能缺失。类似地，调控序列元件(例如，操纵基因、增强子等)相对于有待置于其控制之下的可转录多核苷酸的优选定位是通过该元件在其天然设置中的定位来限定的(即从中获得它的基因)。
如在此使用的“启动子”或“启动子序列”是指基因的一个区域，通常是RNA编码区的上游(5′)，它控制在感兴趣的细胞中的转录启动和水平。“启动子”包括经典的基因组基因的转录调控序列，包括TATA盒和CCAAT盒序列，以及响应于发育和/或环境刺激、或另外的以组织特异性或细胞类型特异性的方式改变基因表达的调控元件(即上游活化序列、增强子以及沉默子)。启动子通常地但不是必然地(例如，一些PolIII启动子)定位在结构基因的上游，它调节其表达。此外，包括启动子的调控元件通常定位在基因转录起始位点的2kb之内。启动子可以包括另外的定位在距离起始位点更远处的特异性调控元件，以进一步增强在细胞中的表达、和/或改变它可操作地连接到其上的结构基因表达的时限或可诱导性。
“组成型启动子”是指指导可操作连接的转录的序列在植物的许多或所有组织中表达的启动子。如在此所述的术语组成型不必然指示基因以相同水平表达于所有细胞类型中，但是该基因表达于广泛的细胞类型中(虽然通常可以检测出在水平方面的一定改变)。如在此使用的“选择性表达”是指几乎唯一地在该植物的特定器官(例如像胚乳、胚、叶、果实、块茎、或根)中的表达。在一个实施方案中，启动子表达于所有光合组织中，该组织可以相应于植物的所有地上部分，例如涉及表达光合作用所需的基因的启动子，如1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基启动子。该术语还可以是指在一个器官中在特定发育阶段(例如在胚胎发生早期或晚期或成熟的不同阶段)的表达；或者是指通过某些环境条件或处理可诱导的表达。因此选择性表达可以与组成型表达相反，组成型表达是指在植物所经历的大多数或所有条件下在植物的许多或所有组织中的表达。
选择性表达还可以导致基因表达产物在特定植物组织、器官或发育阶段中的区室化。可以通过将用于运输到所需要的细胞区室的适当信号包含在基因产物的结构中、或者在半自主性细胞器(质体和线粒体)的情况下通过将具有适当的调控序列的转基因直接结合到细胞器基因组中来实现在特定亚细胞位置(例如胚乳、胞质溶胶、液泡、或质外体空间)中的区室化。
“组织特异性启动子”或“器官特异性启动子”是相对于植物中许多其他组织或器官，优选地大多数(如果不是全部的话)其他组织或器官，优先表达于一种组织或器官中的启动子。典型地，该启动子以比在其他组织或器官中高10倍的水平表达于特定组织或器官中。一个说明性的组织特异性启动子是用于高分子量(HMW)麦谷蛋白基因Bx17的启动子，该基因优先地表达于谷类植物的发育胚乳中。另外的胚乳特异性启动子包括高分子量麦谷蛋白启动子、小麦SSI启动子、以及小麦BEII启动子。可以从在发育籽粒中编码淀粉生物合成酶或储藏蛋白的基因中容易地获得其他胚乳特异性启动子。
本发明所考虑的启动子对于有待转化的宿主植物而言可以是天然的或可以从可替代来源获得，其中该区域在该宿主植物体内是功能性的。其他来源包括农杆菌T-DNA基因，例如用于生物合成胭脂碱、章鱼碱(octapine)、甘露碱的基因的启动子，或其他冠瘿碱启动子；来自植物的启动子，例如泛素启动子，例如来自玉米ubi-1基因的Ubi启动子(Christensen等人，(1996)(参见例如，美国专利号4,962,028))或肌动蛋白启动子；组织特异性启动子(参见，例如，授予Conkling等人的美国专利号5,459,252；授予先进科技公司(Advanced Technologies)的WO91/13992)；来自病毒的启动子(包括宿主特异性病毒)，或部分地或完全地合成的启动子。在单子叶和双子叶植物中起作用的多种启动子是本领域中已知的(参见，例如Greve，《分子和应用遗传学期刊》(J.Mol.Appl.Genet)，1：499-511，1983；Salomon等人，EMBOJ.，3：141-146，1984；Garfinkel等人，《细胞》(Cell)，27：143-153，1983；Barker等人，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol)，2：235-350，1983)，包括从植物以及病毒中分离的多种启动子，例如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S，19S)。许多组织特异性启动子区域是已知的。在某些组织中或在某些生长条件下优先提供转录的其他转录起始区包括来自编码冠瘿碱(napin)、种子ACP、玉米素以及其他种子储藏蛋白的基因的那些。果实特异性启动子也是已知的，一种这样的启动子是由Deikman等人，EMBOJ.，2：3315-3320，1998以及DellaPenna等人，《植物细胞》(Plant Cell)，1：53-63，1989所述的E8启动子。由Medberry等人，《植物细胞》(Plant Cell)，4：185-192，1992；Medberry等人，《植物期刊》(PlantJ)，3：619-626，1993，Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(第2版)，冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约，1989(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.).ColdSpring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，1989)，以及McPherson等人(美国专利号5,164,316)披露了用于评定启动子活性的非限制性方法。
可替代地或另外地，该启动子可以是一种可诱导的启动子或一种发育调控性启动子，它能够驱动引入的多核苷酸在植物的适当发育阶段表达。可以使用的其他顺式作用序列包括转录和/或翻译的增强子。增强子区域是本领域普通技术人员熟知的，并且可以包括一个ATG翻译起始密码子以及邻近的序列。该起始密码子必须是与该编码序列的阅读框(与外来或外源多核苷酸相关)同相的，以确保整个序列的翻译。这些翻译控制信号以及起始密码子可以是不同来源的(天然的以及合成的两者)。翻译起始区可以从转录起始区的来源，或从外来或外源多核苷酸提供。该序列还可以从选择为驱动转录的启动子来源得到并且可以被特异性地修饰以增加mRNA的翻译。
本发明的核酸构建体典型地包括从大约50至1,000个核苷酸碱基对的一个3′非翻译序列(它可以包括一个转录终止序列)。3′非翻译序列可以包括一个转录终止信号，该信号可以包括或可以不包括一个多腺苷酸化信号以及能够影响RNA加工的任何其他调控信号。多腺苷酸化信号的特征在于影响多腺苷酸束添加到mRNA前体的3′端上。通常通过与典型形式5′AATAAA-3′的同源性的存在来识别出多腺苷酸化信号，虽然改变不是不常见的。不包括多腺苷酸化信号的转录终止序列包括用于PolI或PolIII RNA聚合酶的终止子，它们包括四个或更多个胸苷的一个循环。适当的3′非翻译序列的实例是包含来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)基因的多腺苷酸化信号的3′转录的非翻译区(Bevan等人，《核酸研究》(Nucl.AcidRes.)，11：369，1983)以及来自根癌农杆菌的章鱼碱合成酶基因的T7转录本的终止子。可替代地，可以从植物基因中得到适当的3′非翻译序列，例如来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因、大豆储藏蛋白基因以及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基的3′端，虽然也可以使用本领域普通技术人员已知的其他3′元件。可替代地，可以例如像由An，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，153：292，1987(通过引用将它结合在此)所述从头获得3′非翻译调控序列。
因为插入在转录起始位点与编码序列的起点之间的DNA序列(即未翻译的5′前导序列(5′UTR))可能影响基因表达，人们还可以使用一种特定的前导序列。适当的前导序列包括那些序列，这些序列包括被选择用来指导外来或外源DNA序列的最佳表达的序列。例如，这样的前导序列包括一个优选的一致序列，该序列可能增加或保持mRNA稳定性并且防止翻译的不适当启动(例如像Joshi，《核酸研究》(Nucl.Acid Res).15：6643，1987所述)。
另外地，可以使用靶向序列将由外来或外源多核苷酸编码的酶靶向到一个细胞内区室中，例如靶向到叶绿体中、植物细胞内或靶向到细胞外环境中。例如，可以将编码转运或信号肽序列的核酸序列可操作地连接到编码本发明选择的酶的一个序列上，使得当翻译时该转运或信号肽能够将该酶转运到特定细胞内或细胞外目标上，并且然后可以任选地翻译后去除。这些转运或信号肽通过促进蛋白质通过细胞内膜(例如内质网、液泡、小泡、质体、线粒体膜和质膜)转运而起作用。例如，该靶向序列可以将所希望的蛋白质引导到一个特定细胞器中，如液泡或质体(例如，叶绿体)，而不是引导到胞质溶胶中。因此，本发明的核酸构建体可以进一步包括可操作地连接在启动子区与外来或外源多核苷酸之间的编码质体转运肽的核酸序列。
载体
本发明包括用于基因构建体的处理或转移的载体的用途。对于“载体”表示可以将一种核苷酸序列插入或克隆到其中的一种核酸分子，优选例如从质粒、噬菌体、或植物病毒中得到的一种DNA分子。优选地，载体包括一个或多个独特的限制性核酸内切酶切位点，并且能够在定义的宿主细胞(包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织)中自主地复制，或能够与所定义的宿主的基因组相整合使得可以复制克隆序列。因此，该载体可以是一种自主复制载体，即作为一种染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体复制，例如一种直链的或闭合的环形质粒、一种染色体外元件、一种小染色体、或一种人工染色体。该载体可以包含用于确保自身复制的任何手段。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当将它引入一种细胞时该载体整合到该受体细胞的基因组中并且与它已经整合入其中的一个或多个染色体一起复制。载体系统可以包括一个单个的载体或质粒，两个或更多个载体或质粒，这些载体或质粒一起包含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA，或一个转座子。载体的选择典型地将取决于载体与该载体将被引入其中的细胞的相容性。载体还可以包括一个选择标记，例如一个抗生素抗性基因、一个除草剂抗性基因或可以用于选择适当的转化体的其他基因。这类基因的实例是本领域普通技术人员所熟知的。
可以将本发明的核酸构建体引入载体(例如质粒)中。质粒载体典型地包括另外的核酸序列，这些核酸序列提供了在原核和真核细胞中的表达盒的容易的选择、扩增、以及转化，例如pUC-衍生的载体、pSK-衍生的载体、pGEM-衍生的载体、pSP-衍生的载体、或pBS-衍生的载体。另外的核酸序列包括用于提供载体的自主复制的复制起点、选择标记基因(优选编码抗生素或除草剂抗性)、用于将所编码的核酸序列或基因插入核酸构建体中而提供多位点的独特的多克隆位点、以及增强原核和真核(尤其是植物)细胞转化的序列。
对于“标记基因”表示这样的基因，该基因向表达该标记基因的细胞赋予独特的表型，并且因此允许这类转化的细胞与不具有这种标记的细胞区分开。选择标记基因赋予了人们可以基于对选择剂(例如、除草剂、抗生素、辐射、热、或对未转化细胞的其他处理损伤)的抗性用于“选择”的一个性状。筛选标记基因(或报告基因)赋予了人们可以通过观察或测试即通过“筛选”进行鉴定的一个性状(例如，β-葡萄糖醛酸酶、萤虫素酶、GFP或在未转化细胞中不存在的其他酶活性)。该标记基因和感兴趣的核苷酸序列并不必须是连接的。
为了促进转化体的鉴定，该核酸构建体令人希望地包括一个可选择的或可筛选的标记基因(如，或除了外来或外源多核苷酸以外)。实际的标记选择不是决定性的，只要它与选择的植物细胞相结合起作用(即有选择性)即可。标记基因与感兴趣的外来或外源多核苷酸不是必须连接的，因为未连接的基因(例如像在美国专利号4,399,216中所述)的共转化也是植物转化中的一种有效方法。
细菌选择标记的实例是赋予抗生素抗性的标记，如氨苄西林、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性。用于选择植物转化体的示例性的选择标记包括但不限于：hyg基因(它编码潮霉素B抗性)、赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418等的抗性的新霉素磷酸转移酶(npt)基因(像例如Potrykus等人，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet).199：183，1985所述)、赋予对谷胱甘肽衍生的除草剂的抗性的来自大鼠肝的谷胱甘肽S转移酶基因(例如像EP-A 256223中所述)、当过表达时赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因(例如像WO87/05327中所述)、赋予对选择剂草胺膦的抗性的来自产绿色链霉菌的乙酰转移酶基因(例如像EP-A 275957中所述)、赋予对N-膦酰甲基甘氨酸的耐受性的编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因(例如像Hinchee等人，《生物技术》(Biotech).6：915，1988所述)、赋予对双丙氨磷的抗性的bar基因(例如像WO91/02071中所述)、腈水解酶基因，例如赋予对溴苯腈的抗性的来自克雷伯菌臭鼻亚种的bxn(Stalker等人，《科学》(Science)，242：419，1988)、赋予对甲氨喋呤的抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等人，《生物化学期刊》(J.Biol.Chem).263：12500，1988)、突变体乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮、硫酰脲或其他ALS抑制性化学物的抗性(EP-A-154204)、赋予对5-甲基色氨酸的抗性的突变型邻氨基苯甲酸合成酶基因、或赋予对除草剂的抗性的茅草枯脱卤酶基因。
优选的筛选标记包括但不限于：编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的uidA基因(针对该酶的不同的显色底物是已知的)、编码一种酶的β-半乳糖苷酶基因(针对该酶的多种显色底物是已知的)、可以用于钙敏感型生物发光检测的水母发光蛋白基因(Prasher等人，《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Comm).126：1259-68，1985)、绿色荧光蛋白基因(Niedz等人，《植物细胞报告》(Plant Cell Reports)，14：403，1995)、允许生物发光检测的萤虫素酶(luc)基因(Ow等人，《科学》(Science)，234：856，1986)、以及本领域已知的其他物质。如本说明书中使用的，对于“报告分子”表示这样一种分子，该分子通过其化学性质提供了一种分析上可识别的信号，该信号有助于通过参考蛋白产物来确定启动子活性。
改变基因表达的方法
在大麦植物发育胚乳中的蛋白质(例如涉及淀粉合成的酶)的水平可以通过增加在植物细胞中的编码该蛋白质的核苷酸序列的表达水平、或降低在该植物中的编码该蛋白质的基因的表达水平来调节，从而导致籽粒中的果聚糖积累的改变。可以通过改变每个细胞的拷贝数，例如通过引入合成的包括该编码序列以及一个转录控制元件的基因构建体来调节基因表达的水平，该转录控制元件可操作地连接到其上并且在该细胞中起作用。可以选择并且筛选那些由于在转基因整合位点附近的内源序列的影响而具有转基因表达的有利水平和/或特异性的多个转化体。一个转基因表达的有利水平和模式是导致果聚糖水平的实质性增加的水平和模式。这可以通过简单测试来自转化体的籽粒而检测。可替代地，可以针对具有改变果聚糖积累的个体品系筛选一群诱变籽粒或一群来自育种计划的植物。
可以通过将引入到植物细胞中的“基因沉默的嵌合基因”的引入和转录来实现基因表达的降低。可以将基因沉默的嵌合基因稳定地引入到植物细胞基因组中，优选地核基因组中，或可以将它短暂地引入到例如一个病毒载体上。如在此使用的，“基因沉默作用”是指降低靶核酸在植物细胞中的表达，这可以通过引入一种沉默RNA来实现。这种减少可能是由于转录(包括通过染色质重塑的甲基化)或RNA分子的转录后修饰(包括通过RNA降解)或两者的减少所致。基因沉默包括消除靶核酸或基因的表达以及在程度或持续时间方面的部分效应。在沉默RNA存在下靶核酸的表达水平低于其不存在的情况下是充分的。表达水平可以降低至少大约40％、或至少大约50％、或至少大约60％、或至少大约70％、或至少大约80％、或至少大约90％、或至少大约95％、或至少大约99％。该靶核酸可以是一种涉及淀粉合成或代谢(例如淀粉降解)的基因，但是还可以包括任何其他内源基因、转基因或外源基因(如在引入转基因时在植物细胞中可能不存在的病毒基因)。
反义RNA分子
可以使用反义技术来降低根据本发明的基因表达。术语“反义RNA”应当理解为表示这样一种RNA分子，该分子与特异性mRNA分子的至少一部分互补并且能够降低编码该mRNA的基因的表达。这种降低典型地以序列依赖性方式发生并且被认为是通过干扰转录后事件(如mRNA从细胞核转运到细胞质中)、mRNA稳定性或抑制翻译而发生的。反义方法的使用是本领域熟知的(参见例如，Hartmann和Endres，《反义方法手册》(Manual of AntisenseMethodology)，Kluwer，1999)。反义技术在植物中的用途已经由Bourque，《植物科学》(Plant Sci).105：125-149，1995以及Senior，《生物技术与遗传工程学评论》(Biotech.Genet.Engin.Revs.)15：79-119，1998进行了综述。Bourque，于1995年(同上)列出了作为基因失活的方法如何将反义序列用于植物系统中的大量实例。她还陈述的是，达到任何酶活性的100％抑制可能是不必要的，因为部分抑制将更可能导致系统中的可测量的变化。Senior于1998年(同上)陈述，反义方法现在是用于操纵基因表达的一个非常成熟的技术。
如在此使用的，术语“在生理条件下杂交的反义多核苷酸”表示在正常条件下在细胞中该多核苷酸(它完全地或部分地是单链的)至少能够与有待抑制的基因的RNA产物一起形成一个双链多核苷酸，典型地是编码一种蛋白质(如在此提供的那些)的mRNA。反义分子可以包括相应于结构基因的序列或对基因表达或剪接事件进行控制的序列。例如，该反义序列可以相应于靶向基因的编码区，或5′-非翻译区(UTR)或3′-UTR或这些的组合。它可以部分地与内含子序列互补(在转录期间或之后可以将这些内含子剪接掉)，但是优选地仅与靶基因的外显子序列互补。鉴于UTR通常较大的趋异，靶向这些区域提供了更大的基因抑制特异性。
反义序列的长度应当是至少19个连续核苷酸，优选至少25或30或50个核苷酸，并且更优选至少100、200、500、或1000个核苷酸，至有待抑制基因的全长的最大值。可以使用与整个基因转录本互补的全长序列。这个长度最优选地是100至2000个核苷酸。该反义序列与靶向转录本的一致性程度应当是至少90％，并且更优选95％至100％。反义RNA分子当然可以包括无关序列，这些无关序列可以起作用以稳定该分子。
可以通过将一个启动子序列以“反义”方向连接到靶基因的区域上而容易地制造表达反义RNA的基因构建体，如在此使用的“反义”方向是指相对于在植物细胞中的靶基因中的序列的转录和翻译(如果它发生的话)方向的相反方向。因此，本发明还提供了一种核酸分子，如一种编码本发明的反义RNA的嵌合DNA，包括含有这种核酸分子的细胞、组织、器官、植物、籽粒等。
核酶
如在此使用的，术语“核酶”是指一种RNA分子，该分子特异性地识别特殊的底物RNA并且催化它的裂解。典型地，该核酶包含一个核苷酸区域，这些核苷酸与靶RNA的一个区域互补，使得在生理条件下(例如在该核酶在其中起作用的细胞中)该核糖核苷酸酶能够特异性地与靶RNA以及在此称为“催化结构域”的一个酶区域杂交。在本发明中特别有用的这些类型的核酶是锤头状核酶(Haseloff和Gerlach，《自然》(Nature)334：585-591，1988；Perriman等人，《基因》(Gene)，113：157-163，1992)以及发夹结构核酶(Shippy等人，《分子生物技术》(Mol.Biotech).12：117-129，1999)。编码这些核酶的DNA可以使用本领域熟知的方法来合成并且可以结合到基因构建体或表达载体中，用于在感兴趣的细胞中表达。因此，本发明还提供了一种核酸分子，如一种编码本发明的核酶的嵌合DNA，包括含有这种核酸分子的细胞、组织、器官、植物、籽粒等。典型地，将编码核酶的DNA插入在该细胞中起作用的一个启动子和一个转录终止信号控制下的一个表达盒中。通过针对核酶切割位点(它们包括三核苷酸序列GUA、GUU和GUC)扫描靶分子可以鉴定任何潜在的RNA靶之内的特异性核酶切割位点。一旦鉴定，可以针对预测的结构特征(如可能使寡核苷酸序列更不适合的二级结构)来评估相应于靶基因5′和3′切割位点区域的在大约5个核糖核苷酸与20个核糖核苷酸之间的短RNA序列。当应用时，这些核酶可以是选自下组，该组由以下各项组成：锤头状核酶、发夹结构核酶、斧头状核酶、蝾螈卫星核酶、四膜虫核酶、以及RNAse P核酶，并且基于靶基因的序列按照本领域已知方法来设计(例如，参见美国专利号5,741,679)。还可以使用核糖核酸酶保护测定法通过测试它们的与互补寡核苷酸杂交的可接近性来评估候选靶的适合性。
当使用在此所述的反义多核苷酸时，本发明的核酶在“生理条件”下(即在细胞内的那些条件，尤其是在植物细胞如小麦或大麦细胞内的那些条件)应当能够与靶核酸分子(例如编码被提供为SEQID NO：2的多肽的mRNA)杂交。
RNA干扰/双链RNA
如在此使用的，“人工引入的dsRNA分子”是指dsRNA分子的引入可以例如通过从编码这种dsRNA分子的嵌合体基因转录而内源地发生，然而它不是指单链RNA分子在真核细胞或植物细胞内部转化成dsRNA。RNA干扰(RNAi)对于特异性地降低基因表达或抑制特定蛋白的产生是特别有用的。虽然不希望被理论限制，Waterhouse等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.A cad. Sci.U.S.A).95：13959-13964，1998已经提供了该机理的一种模型，通过该机理可以使用dsRNA来降低蛋白质的产生。这种技术依赖于包含一种序列的dsRNA分子的存在，该序列实质上与感兴趣的基因或其一部分的mRNA是一致的。合宜地，可以在重组载体或宿主细胞中从单启动子产生dsRNA，其中将正义和反义序列转录以产生一种发夹RNA，其中该正义和反义序列杂交从而形成dsRNA区，其中间插序列或间隔区形成一个环结构，从而使得该发夹RNA包括一个茎-环结构。针对本发明设计和生产适当的dsRNA分子是在本领域普通技术人员的能力范围内的，具体地考虑Waterhouse等人，1998(同上)，Smith等人，《自然》(Nature)，407：319-320，2000、WO99/53050、WO99/49029、以及WO01/34815。因此，本发明还提供了一种核酸分子，如编码一种双链RNA(如本发明的发夹RNA)的一种嵌合DNA，包括含有这种核酸分子的细胞、组织、器官、植物、籽粒等。
在一个实例中，引入了一种DNA，该DNA指导与有待失活的靶基因具有同源性的一种或多种至少部分双链RNA产物的合成。因此该DNA包括正义和反义序列两者，当转录成RNA时这些序列可以杂交形成双链的RNA区域。在一个优选的实施方案中，该正义和反义序列被包括内含子的一个间隔区分隔，当转录成RNA时，该内含子被剪接掉。这种安排已经显示导致较高的基因沉默效率(Smith等人，2000(同上))。该双链区域可以包括从一个或两个DNA区域转录的一种或两种RNA分子。该dsRNA可以分类为具有长的正义和反义区域的长hpRNA，这些区域可以在很大程度上是互补的，但不必是完全互补的(典型地形成大于大约100bp，优选范围在200bp至1000bp之间的碱基配对区域)。hpRNA还可以是较小的，具有范围从大约30bp至大约50bp，或从30bp到大约100bp大小的双链部分(参见WO04/073390，通过引用结合在此)。双链RNA区域的存在被认为触发了来自内源植物系统的应答，该植物系统将该双链RNA加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸，并且这些寡核苷酸还用于来自靶植物基因的同源RNA转录本的序列特异性切割，从而有效地降低或消除该靶基因的活性。
杂交的正义和反义序列的长度应当各自是至少19个连续核苷酸，优选至少27或30或50个核苷酸，并且更优选至少100、200、或500个核苷酸，直到相应于整个基因转录本的全长序列。这些长度最优选地是100至2000个核苷酸。这些正义和反义序列与目标转录本的一致性程度应当是至少85％、优选至少90％、并且更优选95％至100％。序列越长，针对全序列一致性所要求的严紧度越低。RNA分子当然可以包括无关序列，这些无关序列可以起作用以稳定该分子。该RNA分子可以是在靶向不同目标RNA的不同序列之间的一种杂交体，这允许一种以上的靶基因的表达降低，或它可以是相应于相关靶基因家族(如一个多基因家族)的一种序列。用于dsRNA中的序列优选地相应于靶基因的外显子序列并且可以对应于5′和/或3′未翻译的序列或蛋白质编码序列或它们的任何组合。
如果在靶向破坏的细胞谱系中得到的dsRNA对于基因产物是特异性的，用于表达形成dsRNA构建体的启动子可以是任何类型的启动子。可替代地，该启动子可以是谱系特异性的，因为它仅表达于特定发育谱系的细胞中。当观察到某一同源重叠时(其中基因表达于非靶向细胞谱系中)，这可能是有利的。还可以通过外部控制的因子、或通过细胞内环境因子来诱导该启动子。典型地，在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的控制下表达该RNA分子。后者的实例包括tRNA或snRNA启动子。
其他的沉默RNA可以是包括至少20个连续核苷酸的“未多腺苷酸化的RNA”，这些连续核苷酸与靶基因的RNA转录本的核苷酸序列的互补序列具有至少95％序列一致性，如WO01/12824或US6,423,885中所述(这两个文件都通过引用结合在此)。又另一种类型的沉默RNA是WO03/076619中(通过引用结合在此)所述的RNA分子，包括至少20个连续核苷酸，这些连续核苷酸与靶核酸的序列或其互补序列具有至少95％序列一致性，并且进一步包括主要是双链的区域(如WO03/076619中所述)。
微小RNA调节是RNA沉默途径的一个特定分支，它朝向基因调节演化，从常规的RNAi/PTGS发散。微小RNA是一种特定类别的小RNA，它们被编码成基因样的元件，这些元件组织成特征性部分倒位重复序列。当转录时，微小RNA基因产生部分碱基配对的茎-环前体RNA，随后可以从该前体RNA来加工这些微小RNA。微小RNA典型地是大约21个核苷酸长度。将释放的miRNA结合到包含特定亚群的产生序列特异性基因阻遏的Argonaute蛋白的RISC样复合体中(参见，例如，Millar和Waterhouse，《功能整合基因组》(FunctIntegr Genomics)，5：129-135，2005；Pasquinelli等人，《遗传与发育新见》(Curr Opin Genet Develop)15：200-205，2005；Almeida和Allshire，《细胞生物学趋势》(Trends Cell Biol).15：251-258，2005，通过引用结合在此)。
共抑制
可以用于特异性降低基因表达的另一种分子生物学方法是共抑制。共抑制的机理还没有完全了解，但是认为它涉及转录后基因沉默(PTGS)并且在此方面可能非常类似于多个反义抑制的实例。它涉及将一个基因或其一个片段的额外拷贝以相对于其表达启动子的“正义方向”引入到植物体内，如在此使用的它是指相对于在靶基因中的序列与该序列的转录和翻译(如果它发生的话)相同的方向。正义片段的大小(它相应于靶基因区域)以及它与靶基因的同源性程度如同上述反义序列。在一些情况下，基因序列的额外拷贝干扰靶植物基因的表达。用于实现共抑制途径的方法参考专利说明书WO97/20936以及欧洲专利说明书0465572。该反义、共抑制或双链RNA分子还可以包括主要是双链的RNA区域，优选地包括一种核定位信号(如WO03/076619中所述)。
任何用于降低基因表达的这些技术可以用来协调地降低多基因的活性。例如，可以通过靶向这些基因共有的一个区域而将一个RNA分子靶向到一个相关基因家族上。可替代地，可以通过将多个区域包括在一个RNA分子中而靶向无关基因，每个区域靶向不同的基因。这可以通过使在单一启动子的控制下的多个区域融合而容易地完成。
将核酸引入植物细胞/转化的方法
可以采用多种技术将核酸分子引入到植物宿主细胞中，这对于本领域普通技术人员而言是熟知的。术语“转化”表示通过引入一种外来或外源核酸来改变生物体(例如细菌或植物)的基因型。用“转化体”表示这样改变的生物体。如在此使用的术语“转基因的”是指基因修饰的植物，其中通过引入的外来或外源基因或序列的整合、或稳定维持在可复制的非整合形式而添加到或修饰内源基因组。对于“转基因”表示被引入到植物基因组中的一个外来或外源基因或序列。该核酸分子可以被稳定地整合到植物的基因组中，或可以将它作为一个染色体外元件进行复制。对于“基因组”表示细胞、植物或植物部分的全部遗传互补序列，并且包括染色体DNA、质体DNA、线粒体DNA以及染色体外的DNA分子。如在此相对于植物材料使用的术语“再生”表示从一个植物细胞、一组植物细胞、一个植物部分(例如像从一个胚、盾片、原生质体、愈伤组织、或其他组织)生长出完整的分化植物，但不包括从种子生长出植物。
可以通过它转化某种植物种类的效率以及用特定选择方法实践本发明的人员的经验和偏好来确定转化技术的具体选择。对于普通技术人员而言应当清楚的是，用于将核酸构建体引入植物细胞中的转化系统的具体选择对于本发明并不重要或限制本发明，其条件是它实现可接受水平的核酸转移。由Birch，《植物生理学和植物分子生物学年鉴》(Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol).48：297-326，1997提供了针对植物改进的实际转化实施系统的指导。
可以使用根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的T-DNA进行外来或外源多核苷酸的引入和表达(参见例如Umbeck，美国专利号5,004,863，以及国际申请PCT/US93/02480)。可以使用包含Ti质粒的根癌农杆菌将本发明的构建体引入植物细胞中。在使用根癌农杆菌培养物作为转化载体中，最有利地是使用农杆菌的非致瘤菌株作为载体，这样转化组织的正常非致瘤分化是可能的。优选的是农杆菌包含一个二元Ti质粒系统。这样一种二元系统包括(1)一个第一Ti质粒，该质粒具有对于将转化DNA(T-DNA)引入到植物中重要的一个毒力区，以及(2)一个嵌合质粒。该嵌合质粒包含位于有待转移的核酸的侧翼的野生型Ti质粒的T-DNA区域的至少一个边界区。二元Ti质粒系统已经显示出对于转化植物细胞是有效的(如例如由De Framond，《生物技术》(Biotechnology)，1：262，1983以及Hoekema等人，《自然》(Nature)，303：179，1983所述)。这种二元系统是特别优选的因为它不需要整合到农杆菌中的Ti质粒中。
涉及使用农杆菌的方法包括但不限于：(a)将农杆菌与培养分离的原生质体共培养；(b)用农杆菌转化植物细胞或组织；(c)用农杆菌转化种子、尖端或分生组织，或(d)接种到植物中(例如由Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194，1993所述的花序浸渍法)或接种大小麦中(如WO00/63398中所述，通过引用结合在此)。这种方法是基于农杆菌细胞悬浮液的渗透。可替代地，可以使用农杆菌的根诱导(Ri)质粒作为载体来引入嵌合构建体。
通过引入外源核酸而将遗传变异引入到植物体内用于转化谷物植物(如小麦和大麦)以及从原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法是本领域熟知的，参见例如Wan和Lemaux，《植物生理学》(Plant Physiol).104：37-48，1994，Tingay等人，《植物期刊》(PlantJ).11：1369-1376，1997、加拿大专利申请号2,092,588、澳大利亚专利申请号61781/94、澳大利亚专利号667939、美国专利号6,100,447、国际专利申请PCT/US97/10621、美国专利号5,589,617、美国专利号6,541,257。优选地，通过根癌农杆菌介导的转化方法来产生转基因植物。可以将携带所希望的核酸构建体的载体引入到组织培养植物或外植体的可再生谷物细胞中。优选地这些可再生细胞是来自未成熟胚盾片、成熟胚、从这些中衍生的愈伤组织、或分生组织。未成熟胚优选地是来自开花期之后大约10至15天的花序的那些。
还可以通过电穿孔(像例如由Fromm等人，《美国国家科学院院报》(Proc.Nail.Acad.Sci.U.S.A).82：5824，1985以及Shimamoto等人，《自然》(Naiure)，338：274-276，1989所述)将该基因构建体引入植物细胞中。以这种技术，在包含相关核酸序列的载体或核酸存在下将植物原生质体电穿孔。高场强度电脉冲可逆地透过膜，允许这些核酸的引入。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂并且形成植物愈伤组织。
将核酸构建体引入植物细胞中的另一种方法是通过小粒子(也称为粒子轰击或微粒轰击)高速弹道侵彻，其中有待引入的核酸包含在小珠粒或粒子的基质内或在它们的表面上(像例如由Klein等人，《自然》(Naiure)，327：70，1987所述)。
可替代地，可以通过使用机械或化学手段接触植物细胞而将该核酸构建体引入到植物细胞中。例如，可以通过通过使用微量移液器显微注射直接将核酸机械转移到植物细胞中。可替代地，可以通过使用聚乙二醇而将核酸引入植物细胞中，该聚乙二醇与该细胞吸收的遗传物质形成一种沉淀复合物。
诱变
在诱变之后可以产生和鉴定本发明的植物。这可以提供一种非转基因的植物，在某些市场中它是令人希望的。
这些突变体可以是天然发生的(即，从天然来源分离的)或者是合成的(例如，通过在核酸上进行诱变)或诱导的。通常，可以使祖植物细胞、组织、种子或植物经受诱变从而产生单个或多个突变，如核苷酸置换、缺失、添加和/或密码子修饰。在本申请的背景下，“诱导的突变”是一种人工诱导的遗传变异，它可能是化学的、辐射的或基于生物的诱变，例如转座子或T-DNA插入的结果。优选的突变是无效突变，如无义突变、移码突变、插入突变或将基因完全失活的剪接位点变异体。核苷酸插入衍生物包括5′和3′末端融合以及单个或多个核苷酸的序列内插入。插入核苷酸序列的变异体是其中一个或多个核苷酸被引入到该核苷酸序列中的那些，它们可以通过随机插入适当筛选的生成的产物而获得。缺失变异体的特征在于从该序列中去除一个或多个核苷酸。优选地，一个突变体基因相对于野生型基因仅具有核苷酸序列的一个单个插入或缺失。置换的核苷酸变异体是其中该序列中至少一个核苷酸被去除并且在其位置上插入一个不同的核苷酸的那些。相对于野生型基因，优选的被突变基因中的置换所影响的核苷酸的数量是最多10个核苷酸，更优选最多9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、或2个、或仅一个核苷酸。这样的置换可以是“沉默的”，即该置换不改变由密码子定义的氨基酸。可替代地，设计了多种保守置换用来将一个氨基酸改变成另一个类似作用的氨基酸。典型的保守置换是根据表10中“示例性置换”制造的那些。
如在此使用的术语“突变”不包括不影响基因活性的沉默核苷酸置换，并且因此仅包括影响基因活性的基因序列中的改变。术语“多态性”是指核苷酸序列中的任何改变，包括这样的沉默核苷酸置换。
在一个优选的实施方案中，该植物包括在这个基因中的至少一部分SSII基因的缺失、或移码或剪接位点改变。
在另一个优选的实施方案中，该植物包括在amo1基因(如本领域已知的AC38等位基因)中的一个突变。
可以通过本领域熟知的化学或辐射手段(例如EMS或叠氮化钠(Zwar和Chandler，《植物学》(Planta)197：39-48，1995)处理种子，或γ辐射)来实现诱变。
化学诱变倾向于有利于核苷酸置换而不是缺失。已知重离子束(HIB)是一种有效的用于突变育种的技术以生产新的植物栽培品种，参见例如Hayashi等人，“离子束辐射在水稻中对突变诱导的影响”(Effects of ion beam irradiation onmutation induction in rice)“回旋加速器及应用”(Cyclotrons and Their Applications)2007，第十八次国际会议(Eighteenth International Conference)237-239，2007以及Kazama等人，《植物生物技术》(Plant Biotechnology)25：113-117，2008。离子束辐射具有两个物理因数，剂量(gy)和LET(线性能量传递，keV/um)，用于确定DNA损伤的数量以及DNA缺失的大小的生物效应，并且这些可以根据所希望的诱变程度来调节。HIB产生了一个集合的突变体，它们中的许多包括缺失，可以就在特定SSIIa或Amo1基因方面的突变而筛选它们。所鉴定的突变体可以与作为轮回亲本的未突变小麦植物回交以便排除并且因此降低诱变基因组中的未连锁突变的影响。
在生产位点特异性突变体中有用的生物学试剂包括多种酶，这些酶包括在刺激内源修复机制的DNA中的双链断裂。这些包括内切核酸酶、锌指核酸酶、转座酶以及位点特异性重组酶。锌指核酸酶(ZFN)例如促进基因组中的位点特异性切割，这允许内源或其他末端连接修复机制，以引入缺失或插入来修复缺口。锌指核酸酶技术在Le Provost等人，《生物技术趋势》(Trends in Biotechnology)28(3)：134-141，2009中进行了综述，还参见Durai等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)33(18)：5978-5990，2005以及Liu等人，《生物技术与生物工程》(Biotechnology and Bioengineering)，106：97-105，2010。
通过筛选诱变的植物或种子来实现突变体的分离。例如，可以通过PCR或基于异源双链体的测定针对叶或籽粒淀粉中的低SSIIa活性、SSIIa或amo1基因的突变，或通过ELISA针对SSII蛋白的丢失来筛选诱变大麦植物种群。在多倍体植物中，优选地在已经缺乏一种或两种SSII活性的基因型中(例如在三个基因组之中的两个上的SSII基因中已经突变的小麦植物中)进行筛选，从而找到完全缺乏功能活性的突变体。可替代地，可以使用多种技术(如“tilling”)在用试剂(如EMS)诱变的种群中鉴定该突变(Slade和Knauf，《转基因研究》(Transgenic Res)14：109-115，2005)。然后可以通过使该突变体与具有希望的遗传背景的植物杂交并且进行适当数量的回交以删除最初不希望的亲本背景而将这样的突变引入到令人希望的遗传背景中。
可以直接地通过诱变或间接地通过使两个亲本植物(其中一个包含所引入的突变)杂交而已经将这种突变引入到植物体内。修饰的植物(例如谷物植物)可以是转基因的或非转基因的。使用诱变，可以产生缺乏感兴趣的功能的非转基因植物。本发明还涉及由植物产生的籽粒或其他植物部分以及可以用来产生具有所希望的特征的植物的任何植物繁殖材料(例如培养的组织或细胞)。本发明清楚地涉及产生或鉴定这类植物或由这类植物产生的籽粒的方法。
可以使用称作TILLING(定向诱导局部基因组突变技术(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))的方法来生产本发明的植物。在第一步中，引入突变，通过用化学诱变剂或辐射来处理细胞、种子、花粉、或其他植物部分而将例如新的单碱基对变化引入到植物种群中，并且然后将植物推进到其中突变可以稳定遗传的一个世代。提取DNA、并且存储来自该种群的所有成员的种子，以产生随着时间的过去可以反复可得的资源。
为了TILLING测定，设计了PCR引物用来特异性地扩增感兴趣的一个单基因目标。如果目标是基因家族的一个成员或多倍体基因组的一部分，特异性是特别重要的。然后，使用染料标记的引物从收集的多个个体的DNA中扩增PCR产物。将这些PCR产物变性并且再退火以允许形成错配碱基对。错配或异源双链体代表天然发生的单核苷酸多态性(SNP)(即来自该种群的数个植物可能带有相同的多态性)以及诱导的SNP(即，仅少量个体植物有可能展示该突变)两者。在异源双链体形成之后，识别并且切割错配DNA的内切核酸酶(如CelI)的使用是在TILLING群体中发现新SNP的关键。
使用这种方法，可以筛选数千个植物来鉴定基因组的任何基因或特定区域中具有单碱基变化以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。在任何情况下被测定的基因组片段的大小范围可以是从0.3kb至1.6kb。在8倍汇集时，1.4kb片段(当由于噪音SNP检测存在问题时，扣减片段的末端)以及96泳道/每测定(这种组合允许每个单测定筛选基因组DNA的高达一百万个碱基对)使TILLING成为一种高通量技术。在Slade和Knauf，2005(同上)，以及Henikoff等人，《植物生理学》(Plant Physiol)135：630-636，2004中进一步说明了TILLING，通过引用将它们结合在此。
除了允许有效的缺失突变以外，高通量TILLING技术对于天然多态性的检测是理想的。因此，通过与一个已知序列进行异源双链化来探询一个未知的同源DNA显示了多态位点的数量和位置。鉴定了核苷酸变化以及小插入和缺失两者(包括至少一些重复数量的多态性)。这已经被称为Ecotilling(Comai等人，《植物期刊》(PlantJ)37：778-786，2004)。
通过它在几个核苷酸内的大致位置来记录每个SNP。因此，可以基于它的移动性将每个单体型归档。可以在较小的不断努力下使用用于错配剪切测定的相同的扩增DNA的等分部分获得序列数据。针对一个单反应通过它与多态性的邻近来选择左侧或右侧测序引物。Sequencher软件执行多重比对并且发现碱基变化，在每种情况下证实凝胶带。
与完全测序相比较可以更廉价地进行Ecotilling，目前这种方法用于大多数SNP发现。可以筛选含有阵列的生态DNA的平板而不是来自诱变植物的DNA库。因为检测是在具有几乎碱基对分辨率的凝胶上，并且这些背景模式是均匀的横过泳道，可以匹配具有相同大小的条带，因此在一个单步骤中发现SNP并且对其基因分型。以此方式，SNP的最终测序是简单且有效的，通过以下事实更是如此，即用于筛选的相同PCR产物的等分部分可以经受DNA测序。
遗传连锁
如在此使用的，术语“遗传连锁”是指在染色体上一个标记位点和一个第二位点足够接近使得它们可以在超过50％减数分裂中一起被遗传(例如不是随机地)。这个定义包括这种情况，其中该标记位点和第二位点形成同一个基因的一部分。此外，这个定义包括这种情况，其中该标记位点包括负责感兴趣的性状的一种多态性(换言之该标记位点直接“连锁”到该表型上)。因此，在每世代的这些位点之间(厘摩(cM))所观察到的重组百分比将小于50。在本发明的具体实施方案中，遗传连锁位点可以是在染色体上分开45、35、25、15、10、5、4、3、2、或1更少cM。优选地，这些标记是分开小于5cM或2cM，并且优选地是分开大约0cM。
如在此使用的，“其他遗传标记”可以是连锁到谷物植物(如小麦或大麦)的所希望的性状上的任何分子。这类标记是本领域普通技术人员熟知的并且包括连锁到决定性状(例如抗病性、产率、植物形态、籽粒品质、其他潜在性状(例如籽粒颜色、种子中的赤霉酸含量、植物高度、面粉颜色等))的基因上的分子标记。
当在经典育种计划中与轮回亲本回交时，标记辅助选择是一种相当公认的选择所需要的杂合植物的方法。在每个回交世代中的植物种群对于在回交群体中通常以1∶1比率存在的感兴趣的基因将是杂合的，并且可以使用这种分子标记来区分该基因的两个等位基因。通过从例如嫩枝中提取DNA并且用特异性标记针对渗入的令人希望的性状进行测试，进行用于进一步回交的植物的早期选择，同时将能量和资源集中到更少的植物上。
可以将本领域已知的能够检测SSII或其他基因的等位基因的任何一种分子生物学技术用于本发明的方法中。这类方法包括但不限于：使用核酸扩增、核酸测序、核酸与适当标记的探针杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、异源双链分析(HET)、化学切割分析(CCM)、催化核酸切割或它们的组合(参见，例如，Lemieux，《现代基因组学》(Current Genomics)，1：301-311，2000；Langridge等人，《澳大利亚农业研究期刊》(AustJAgric Res)52：1043-1077，2001)。本发明还包括分子标志物技术用于检测提供与改变的果聚糖累积的(例如)SSII基因的等位基因连接的多态性的用途。这类方法包括检测或分析限制性片段长度多态性(RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLP)以及微卫星(简单序列重复，SSR)多态性。通过本领域熟知的方法(如集群分离分析(Bulked Segregant Analysis)，如由Langridge等人，2001(同上)综述)可以容易地获得紧密连锁的标记。
“聚合酶链式反应”(“PCR”)是这样一种反应，其中目标多核苷酸的复制拷贝是使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”、以及聚合反应催化剂(如DNA聚合酶，并且典型地是一种热稳定聚合酶)来制造的。用于PCR的方法是本领域已知的并且例如传授在“PCR”(McPherson和Moller(著)，BIOS科学出版社有限公司(BIOS Scientific Publishers Ltd)，牛津，2000)中。可以针对从表达SSII基因的植物细胞中分离的逆转录mRNA获得的cDNA或针对从植物分离的基因组DNA进行PCR。
引物是能够以序列特异性方式与靶序列杂交并且在PCR过程中延伸的一种寡核苷酸序列。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是包括引物和靶序列的新合成的拷贝的延伸产物。多重PCR系统含有多组引物，这些引物导致一种以上扩增子的同时产生。可以使引物与靶序列完全匹配或者它们可以含有内部错配碱基，这可能导致在特异性靶序列中引入限制性核酸内切酶或催化核酸识别/切割位点。这些引物还可以含有另外的序列和/或含有修饰的或标记的核苷酸，以促进扩增子的捕获或检测。进行DNA热变性的反复循环，将引物退火到它们的互补序列上并且用聚合酶延伸这些退火的引物导致靶序列的指数式扩增。术语靶或靶序列或模板是指被扩增的核酸序列。
用于核苷酸序列的直接测序的方法是本领域普通技术人员熟知的并且可以在例如Ausubel等人(同上)和Sambrook等人(同上)中找到。可以通过任何适当的方法(例如，双脱氧序列测定、化学序列测定或它们的变体)进行序列测定。直接序列测定具有确定具体序列的任何碱基对中的变化的优点。
植物
如在此作为一个名词使用的术语“植物”是指整个植物，但当用作形容词时是指存在于植物中的、从中获得的、从中衍生的、或与其相关的任何物质，例如像植物器官(例如，叶、茎、根、花)、单细胞(例如，花粉)、种子、植物细胞等。小植株以及从中出现根和嫩枝的发芽种子也包括在“植物”的含义之内。如在此使用的术语“植物部分”是指一个或多个植物组织或器官，它们是从一个植物获得的并且它包括该植物的基因组DNA。植物部分包括营养性结构(例如叶、茎)、根、花的器官/结构、种子(包括胚、胚乳、以及种皮)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、细胞以及它们的子代。如在此使用的术语“植物细胞”是指从植物或在植物中获得的细胞，并且包括原生质体或源于植物的其他细胞、产生配子的细胞、以及再生成为整个植物的细胞。植物细胞可以是培养物中的细胞。对于“植物组织”表示在植物中或从植物(“外植体”)获得的分化组织或从未成熟或成熟胚、种子、根、嫩枝、果实、花粉、瘤组织(例如冠瘿)获得的未分化组织以及培养物中的植物细胞的各种形式的集合体(如愈伤组织)。种子中或来自种子的示例性的植物组织是胚乳、盾片、糊粉层以及胚。因此本发明包括植物和植物部分以及包括这些的产品，尤其是包含果聚糖的籽粒。
如在此使用的，术语“籽粒”是指植物的成熟种子，例如典型地是在大田中商业化地收获的成熟种子。因此，该术语包括收获的种子以及在植物上准备收获的种子。成熟的谷物籽粒(如小麦或大麦)通常具有至少大约18％至20％的含水量。
如在此使用的“转基因植物”是指一种含有在相同种类、品种或栽培品种的野生型植物中未发现的基因构建体的植物。也就是说，这些转基因植物(转化的植物)含有在转化之前它们不含有的遗传物质(一种转基因)。该转基因可以包括从植物细胞、或另一种植物细胞、或非植物来源、或合成序列获得的或从中衍生的基因序列。典型地，通过人的操作(例如像通过转化，但是可以使用如本领域的技术人员所公认的任何方法)将该转基因引入到植物体内。优选地将该遗传物质稳定地结合到植物的基因组中。所引入的遗传物质可以包括在同一种类中天然发生的但是处于重排顺序或处于不同的元件排列的序列，例如一种反义序列。在此将含有这类序列的植物包括在“转基因植物”中。“非转基因植物”是没有通过重组DNA技术通过引入遗传物质进行遗传修饰的一种植物。在一个优选的实施方案中，这些转基因植物对于已经引入的各个和每个基因(转基因)是纯合的从而使得它们的子代不分离所希望的表型。
如在此使用的，术语“相应的非转基因植物”是指一种相对于该转基因植物是同基因的但是不具有感兴趣的转基因的植物。优选地，相应的非转基因植物是具有与感兴趣的转基因植物的祖先相同的栽培品种或品种、或缺乏构建体的同胞植物系(通常称为“分离子”)、或具有转化有“空载体”构建体的相同栽培品种或品种的植物，并且可以是非转基因植物。如在此使用的“野生型”是指没有根据本发明进行修饰的一种细胞、组织或植物。野生型细胞、组织或植物可以用作对照，以将外源核酸的表达水平或性状修饰的程度和性质与如在此所述的修饰细胞、组织或植物相比较。
如在本发明的上下文中定义的转基因植物包括已经使用重组技术进行遗传修饰的植物的子代，其中该子代包括感兴趣的转基因。可以通过初级转基因植物的自体受精或通过使这类植物与相同种类的另一个植物进行杂交而获得这样的子代。这通常可以用于在所希望的植物或植物器官中调节至少一种在此定义的蛋白质/酶的产生。这些转基因植物部分包括包含该转基因的所述植物的所有部分和细胞，例如像培养的组织、愈伤组织以及原生质体。
可以使用数种方法中的任何一种来确定转化的植物中的转基因的存在。例如，可以使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增对于转化的植物而言是独特的序列，通过凝胶电泳或其他方法来检测扩增的产物。可以使用常规方法从植物中提DNA，并且使用引物进行PCR反应以扩增一种特异性DNA，它的存在将使转化植物与未转化植物区分开。例如，可以根据读入构建体中的转化载体设计将扩增一个DNA区域的引物，并且根据感兴趣的基因设计反向引物。如果该植物已经成功转化，则这些引物将仅扩增一个片段。一种用于证实阳性转化体的替代方法是本领域熟知的DNA印迹杂交。还可以通过它们的表型(例如通过选择标记基因的存在赋予的表型，或通过植物籽粒的果聚糖含量的改变赋予的表型，或相关表型例如淀粉合成酶活性的改变)从未转化或野生型植物中鉴定(即区分)出转化植物。
如在此使用的，“发芽”是指在吸胀之后从种皮中出现根尖。“发芽率”是在指种群中在吸胀之后在例如7或10天的时间期间内已经发芽的种子的百分比。可以经过数天评估种子的群体来确定随时间的发芽百分比。就本发明的种子而言，如在此使用的，术语“基本上相同的发芽率”表示转基因种子的发芽率是同基因的野生型种子的至少90％。
如在此使用的，术语“大麦”是指大麦属的任何种类，包括它们的祖先，以及它们的通过与其他种类杂交所产生的子代。优选地是该植物属于商业化培养的大麦属，例如像大麦的一个株系或栽培品种或品种，或适合于籽粒的商业生产。
食物生产
在另一个方面，本发明提供了大麦植物以及籽粒，以及从中获得的产品，这对于食物或饲料生产是有用的，该籽粒相比于相应的SSIIa突变体籽粒具有增加水平的淀粉，并且相比于相应的野生型籽粒具有增加水平的非淀粉组分。优选地，在发育过程中，从中获得籽粒的植物在胚乳中具有降低水平的SSIIa活性。本发明的植物用于食物生产并且具体地用于商业食物生产。这样的食物生产可以包括制造面粉、生面团或可以是商业食品生产的一种成分的其他产品。在所希望的用于食物生产的一个实施方案中，该植物的种子或籽粒相对于野生型植物具有增加的果聚糖含量。该籽粒可以具有一定活性水平的降解酶类，具体地是一种或多种淀粉酶，如α-淀粉酶或β-淀粉酶，通过降低籽粒中的编码这种降解酶的基因的表达的转基因或一个引入的突变的存在而将其降低。来自这种籽粒的面粉或生面团具有用于烘焙或其他食物生产的令人希望的特性。
该植物的令人希望的遗传背景可以包括农业产量以及其他特征等考虑事项。这类特征可以包括它是否希望具有冬季或春季类型、农业性能、抗病性、以及非生物胁迫抗性。其他品种可以适合用于其他生长区域。优选地是，在至少一些生长区域中本发明的植物品种提供不小于相应野生型品种的80％的产量，更优选不小于85％并且甚至更优选不小于90％。可以在控制的大田试验中容易地测量该产量。
在另外的实施方案中，该籽粒的淀粉含量是至少大约42％、至少大约43％、至少大约45％、至少大约47％、至少大约50％、或至少大约55％(w/w)、高达65％、并且更优选相对于野生型不减少。商业生长的野生型大麦籽粒通常具有55％-65％范围内的淀粉含量，在某种程度上取决于所生长的栽培品种。可替代地，本发明的种子或籽粒具有相对于来自野生型植物的籽粒至少90％的淀粉含量，并且优选至少95％。其他令人希望的特征包括磨碎该籽粒的能力，具体地是籽粒硬度。可能使植物具有更高价值的另一个方面是来自该籽粒的果聚糖或淀粉提取的程度(提取率越高就越有用)或蛋白质含量、直链淀粉与支链淀粉的比率、或其他非淀粉多糖(如β-葡聚糖，它还提供这些籽粒产品的膳食纤维含量)的含量。籽粒的形状也是另一个可能影响植物商业有用性的特征，因此籽粒的形状可能对研磨的容易性具有影响或者该籽粒具有藉之可以磨碎的性状。
使用标准方法易于从本发明的籽粒中分离淀粉，例如Schulman和Kammiovirta，《淀粉》(Starch)，43：387-389，1991的方法。在工业规模上，可以使用湿式研磨或干式研磨。淀粉粒度在淀粉加工工业中是重要的，其中将较大的A颗粒与较小的B颗粒分离。
食品
本发明还包括用多种产物(优选地包括增加的抗性淀粉、膳食纤维、直链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、或从本发明的植物或籽粒获得的其他组分的那些)所制造的食品、饮料或药物制剂。这样的食物生产可以包括制造加工过的籽粒、粗面粉、面粉、生面团或可以作为商业食品生产的一种成分的其他产品。含有抗性淀粉、膳食纤维、直链淀粉、β-葡聚糖或果聚糖的本发明的籽粒或从中得到的产品可以用于人类消费的多种食物应用中。如在此使用的，“人类”是指智人。这种籽粒可以容易地用于食品加工过程，并且因此本发明包括磨碎的、研磨的、磨成粗粒的、珍珠状的或辊压的籽粒或从加工的或完整的本发明的植物的籽粒获得的产品，包括面粉。然后这些产品可以用于多种食品中，例如含淀粉的食品类，例如早餐谷物、面包、蛋糕、饼干以及类似物或食物添加剂(如增稠剂或粘合剂)或用来制作饮料、面条、意大利面制品或速食汤类。具体地该颗粒或从本发明颗粒衍生的产品希望用于早餐谷物中或作为挤出产品。可以将淀粉或其他组分结合到脂或油制品(例如人造黄油或起酥油)、色拉调味汁、蛋制品(例如蛋黄酱)、奶制品(例如冰淇淋、酸奶或乳酪)、谷物制品(例如小麦粉)、果汁、其他食物或食物材料中，或可以将淀粉或其他组分加工成饮料或食物，如面包、蛋糕、饼干、早餐谷物、意大利面制品、面条或调味汁。果聚糖还用作低热量增甜产品。
就面包而言，包括果聚糖(可以是处于面粉或粗面粉的形式)的成分可以替代10％(w/w)或更多的未改变的面粉或粗面粉，优选地替代至少30％并且甚至更优选地至少50％未改变的面粉或粗面粉。因此，该配方可以是例如面粉70份、高果聚糖淀粉30份、脂肪2份、盐2份、改良剂1份、酵母2.5份。可以通过快速生面团技术(rapid dough technique)或本领域的技术人员已知的其他技术来生产面包。
可替代地，可以将本发明的产品结合到基于含淀粉的意大利面制品产品中。用于意大利面制品组合物中的本发明果聚糖的量可以在基于含淀粉物质的总重量5％-20％(w/w)的范围内，更具体地在10％至20％的范围内。本领域的技术人员可以容易地选择适当的其他的含淀粉物质。还可以将其他物质添加到组合物(例如蛋粉或蛋液(蛋黄、蛋清、或两者))或高蛋白物质(例如乳蛋白或鱼蛋白)中。还可以添加维生素类、矿物质类、钙盐类、氨基酸类、缓冲剂类(例如磷酸氢二钠)、调味品、胶质、面筋或单硬脂酸甘油酯。
可食用的本发明的植物的其他部分可以用作用于人类消费的食物或用作动物食用的饲料。例如，叶、茎、或提取物或包括来自这些中的任何一项的本发明的细胞的那些的部分可以用于人类或动物消费。本发明的植物和它的多个部分的增加的抗性淀粉、膳食纤维、直链淀粉、β-葡聚糖或果聚糖含量可以提供将这些物质用作动物饲料的优点，例如像作为猪、牛、马、家禽(例如鸡)以及其他动物的饲料。
方法
本发明的产品或化合物可以配制成按照常规药物配制技术制备的药物组合物。参见例如，于1990年美国宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司出版的《雷明顿药物科学》(1990)，第18版，(Remington′sPharmaceutical Sciences，18thEd.，Mack Publishing，Company，Easton，PA，U.S.A.1990)。这种组合物可以含有活性剂或药学上可接受的衍生物活性剂。除了这些活性物质之一外，这些组合物可以包括一种药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域熟知的其他物质。这类物质应当是无毒的并且不应干扰活性成分的效力。载体可以采用广泛多样的形式，这取决于所希望施用的制剂的形式。
对于口服施用而言，可以将这些化合物配制成固体或液体制剂，如胶囊剂、丸剂、片剂、锭剂、散剂、悬浮液或乳液。在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何一种平常的药用介质，例如像，在口服液体制剂的情况下(例如像悬浮液类、酏剂类以及溶液类)的水、乙二醇类、油类、醇类、调味剂类、防腐剂类、着色剂类、悬浮剂类、以及类似物；或在口服固体制剂的情况下(例如像散剂、胶囊剂以及片剂)的多种载体，如淀粉类、糖类、稀释剂类、造粒剂类、润滑剂类、粘合剂类、崩解剂类以及类似物。因为片剂以及胶囊容易给药，所以它们代表了最具优势的口服剂量单位形式，在这种情况下显然采用固体药用载体。如果希望的话，可通过标准技术对片剂包被糖衣或肠溶包衣。
优选地以治疗有效数量施用该活性剂。所施用的实际量以及给药的速率和时程将取决于所治疗的病症的性质和严重性。治疗处方(例如对剂量、时限等的决定)是在全科医师或专家的职责范围内的并且典型地考虑了有待治疗的失调、个体病人的状况、递送部位、给药方法以及医师已知的其他因素。技术和实验方案的实例可以在《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(同上)中找到。
食品或饮料或药用制剂可以进行包装以备销售或处于散装形式。本发明还提供了制备本发明的食物、饮料或药用制剂的方法以及用于制备这类食物或饮料的配方或说明书。这些方法可以包括以下步骤：收获植物或植物部分、使籽粒与其他植物部分分离、压碎、提取、研磨、蒸煮、罐装、包装或本领域已知的其他加工步骤。这些方法或配方或说明书可以包括以下步骤：加工本发明的植物产物和/或将它与其他食物成分混合，如将该混合物或该产物加热或烘焙到例如至少100℃。该方法可以包括包装产品的步骤从而使它准备好用于销售。
工业用途
可以使用植物产品，优选地籽粒来生产工业产品，例如像乙醇。
通过下面非限制性实例对本发明进行进一步说明。
实例1：说明性的材料和方法
植物材料
所使用的大麦(Hordeum vulgare)系是来自以亲代品种Himalaya292(M292(SEQ ID NO：9至11)，Morell等人。2003b(同上))(这些亲代品种包含在此指定为sex6-292等位基因的SSIIa突变)与品种高直链淀粉冰川(High Amylose Glacier(HAG，也称为AC38))之间的杂交开始的一个回交群体。适当的亲代品种是本领域可得到的。HAG品种，例如(高直链淀粉冰川(High AmyloseGlacier，也称为AC38))是可以从CSIRO或从新南威尔士州塔姆沃斯市的澳大利亚冬季谷物收藏所(Australian Winter CerealsCollection，Tamworth，NSW)得到的。通过标准方法在温室中进行这些大麦植物的杂交。从Himalaya292(雄性)至HAG(雌性)通过3次回交、以及然后的三代单子传法(SSD)而产生了该回交群体。来自第三代回交的种子命名为BC3F1并且来自第三代SSD的种子命名为BC3F4。为了增加各系种子的数量，培养了另外的2或3代。这些被指定为BC3F6或BC3F7代并且用于本项研究。
在2005年在另外的自然条件下将七十个BC3F6大麦系以盆栽的方式种植在堪培拉的CSIRO植物工厂中。为了证实选择的种子构成以及参数，在2007年将根据种子重量、直链淀粉含量以及SSIIa和amo1突变的存在选择的BC3F7大麦系的一个亚群种植在使用自然光并且在18℃(夜间)和24℃(日间)温度下的位于堪培拉的CSIRO植物工厂的温室中，或者种植在澳大利亚新南威尔士州扬科市的大田中。
在芒首次通过包含封闭穗的剑叶的顶部而出现之后的2天在开花期对这些大麦穗进行标记。在开花期之后(DPA)20天收获形成的种子并且在去除胚之后，将形成的胚乳挤出通过切面并且储存在-80℃下。
以商业的方式或从澳大利亚新南威尔士州塔姆沃思市澳大利亚冬季谷物收藏所(Australian Winter Cereals Collection，Tamworth，NSW，Australia)获得如在此所述的其他品种。
通过PCR扩增对BC3F6种群进行基因分型
收集来自该回交群体BC3F6代的嫩麦叶并且进行冷冻干燥(纽约斯通里奇公司冷冻机FTS系统(freezer FTS systems，Stone Ridge，New York))。根据供应商的说明书(Q-BIOgene)使用快速DNAR试剂盒来分离基因组DNA。
为了SSIIa突变的基因分型，使用在核苷酸1616处起始的引物SSIIaF(5′-CCTGGAACACTTCAGACTGTACG-3′(SEQ ID NO：3))以及在SSIIa cDNA(基因登录号：AY133249)的核苷酸2044处起始的SSIIaR(5′-AGCATCACCAGCTGCACGTCCT-3′(SEQ ID NO：4))对横跨Himalaya292的核苷酸1829处的SSIIa突变位点的一个451bp产物进行PCR扩增(如Morell等人2003b(同上)所述)(也参见SEQ ID NO：9)。当amo1突变位于染色体1H上的68.0cM处并且紧密连锁到也位于68.0cM处的amo1基因座上时，使用微卫星PCR标记EBmac0501对它进行检测。使用引物HHac0501F(5′CACGACGTTGTAAAACGACACTTAAGTGCCATGCAAAG    3′(SEQ  ID  NO：5)以及HHac0501R(5′AGGGACAAAAATGGCTAAG 3′(SEQ ID NO：6))(GrainGenesDatabase)对来自amo1基因座的PCR片段进行扩增。
对于每个20μl的PCR反应物，使用50ng基因组DNA、1.5mMMgCl2、每种dNTP 0.125mM、10pmol引物、0.5M甘氨酸甜菜碱、1μl DMSO以及1.5U的Hotstar Taq聚合酶(QIAGEN)。使用杂交PCR表达机(HYBAID PCR Express machine)(综合科技公司(Intergrated Sciences))进行PCR反应，95℃1个循环持续5分钟，94℃35个循环持续45秒，58℃持续30秒，并且在72℃持续1分钟，72℃1个循环持续10分钟并且在25℃1个循环持续1分钟。在37℃下使用限制性核酸内切酶MaIV将用于检测SSIIa突变的PCR产物消化过夜。在2％琼脂糖凝胶上将消化的(对于SSIIa突变)的和未消化的(对于amo1突变)PCR片段两者分离并且在GelRed(Biotium)染色之后用凝胶记录仪(gel documentary)(UVitec)进行可视化。
为了来自Himalaya292x HAG之间的回交大麦种群的大麦系的基因分型，如上所述使用引物SSIIaF和SSIIaR检测来自亲本品系Himalaya292的SSIIa突变，并且使用微卫星标记EBmac0501检测来自亲本品系HAG的amo1基因座。对于SSIIa突变而言，在用NlaIV消化该PCR产物之后进行凝胶电泳，三种类型的PCR片段谱是清楚的，这区分出突变型和野生型SSIIa等位基因。347bp的一个单个的DNA片段表明突变SSIIa基因的存在，一个单个的236bpDNA片段表明野生型SSIIa基因的存在，并且347bp和236bp片段两者的存在表明杂合基因型品系。对于来自HAG的amo1突变而言，EBmac0501微卫星标记也给出了三种PCR片段谱。检测来自amo1突变体的一个167bp片段，检测来自野生型品系的一个141bp片段，并且在杂合品系中检测出167bp和141bp片段两者。
籽粒特征
在成熟期从植物中收获籽粒。除非另外指明，通过重复3次称量100颗种子来确定平均种子重量。还针对在新南威尔士州扬科市BC3F7大田生长材料重复3次以500个种子的平均种子重量的形式确定了所选品系的种子重量。使用牛津4000NMR磁体(Oxford 4000NMR Magnet)(牛津分析仪器有限公司(Oxford analytical instrumentsLimited))通过标准核磁共振(NMR)法测量了籽粒的种子含水量。使用RACI谷类化学官方测试法12-01(RACI Cereal ChemistryOfficial testing method 12-01)使用单核表征系统4100(Single-KernelCharacterization system 4100)(62707美国伊利诺伊州斯普林菲尔德市波通仪器公司(Perten Instruments Inc.Springfield，IL 62707USA))测量了籽粒的质地。种子丰满度分成三个类别：皱缩、半丰满以及丰满。
大麦种子横截面的显微镜检查以及扫描电子显微镜检查
通过用剃须刀片切割断面产生了大麦种子的中间部分的大约1mm厚的横切片，并且进行照相。它们还用金颗粒进行包被并且用在15KV下操作的JSM-6400扫描电子显微镜(SEM)进行检查。
籽粒的研磨
使用旋风磨机(Cyclotec 1093，Tecator，瑞典)将籽粒研磨成粗面粉，该粗面粉将会通过0.5mm的筛子。然后将该粗面粉用于下面的分析。
β-葡聚糖和戊聚糖分析
针对三个重复样品的每一个使用20mg的粗面粉如Megazyme法(AACC32.23)所述测定β-葡聚糖含量。针对三个重复样品的每一个使用20mg的粗面粉使用来自Bell(1985)的方法测量戊聚糖含量。
淀粉提取
通过蛋白酶提取法(Morrison等人，《谷物科学期刊》(J CerealSci)，2：257-271，1984)从粗面粉中分离出淀粉，之后进行水洗并且去除残油。然后用丙酮对淀粉进行洗涤并且在室温下风干(Konik-Rose等人，2007(同上))。
总淀粉分析
针对三个重复样品的每一个使用20mg的粗面粉如Megazyme法(AACC76.13)中所述测定籽粒的总淀粉含量。
淀粉构成和特征的分析
如下通过琼脂糖CL-2B凝胶过滤(凝胶过滤法)来确定籽粒的淀粉中的直链淀粉和支链淀粉含量、或直链淀粉对支链淀粉的比率。将大约10mg的总淀粉溶于3.0ml的1M NaOH中并且基于分子量通过色谱法在Sepharose CL-2B柱上分级分离(Regina等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)，103：3546-3551，2006)。根据供应商的说明书使用淀粉测定试剂盒(Starch Assay Kit)(西格玛(Sigma))测量来自该柱的各馏分中的淀粉量。计算出支链淀粉(第一峰，较高分子量)以及直链淀粉(第二峰，较低分子量)的总量并且确定比率或含量。
可替代地，使用具有如Konik-Rose等人，2007(同上)所述的一些修改的小规模(2mg淀粉)碘吸附法(Morrison和Laignelet，《谷物科学期刊》(JCereal Sci)，1：9-20，1983)测量直链淀粉含量。
链长度分布
在这些淀粉样品脱支之后，使用具有氩激光诱导荧光(LIF)检测的P/ACE5510毛细管电泳系统(澳大利亚新南威尔士州贝克曼库尔特公司)通过O′Shea等人，《碳水化合物研究》(CarbohydrRes)，307：1-12，1998的方法测量支链淀粉链长度分布。通过从来自同基因非修饰对照的淀粉的归一化分布中减去修饰淀粉的归一化链长度分布而产生摩尔差异曲线。
可以使用Pyris 1差示扫描量热仪(美国康涅狄格州诺沃克市珀金埃尔默公司)测量淀粉样品的胶化温度曲线。可以使用如Batey等人，《淀粉》(Starch)48：338-344，1997所报告的条件在快速粘度分析仪(Rapid-Visco-Analyser)(悉尼沃里伍德新港口科学合伙有限公司RVA(RVA，Newport Scientific Pty Ltd，Warriewood，Sydney))上测量淀粉溶液的粘度。可以测量的参数包括峰值粘度(最大热浆粘度)、保持强度、最终粘度以及糊化温度。可以如下使用快速粘度分析仪(Rapid Visco Analyser)测量糊化特性。将淀粉(3.0g)添加到在DSC盘中的蒸馏水(25.0ml)中并且RVA运行曲线是：在50℃下2分钟，加热6分钟至95℃，保持在95℃下持续4分钟，冷却4分钟至50℃，保持在50℃下持续4分钟。所测量的参数是：在95℃下的峰值粘度、在95℃保持时间结束时的保持强度、衰减值＝峰值粘度-保持强度、在50℃保持期结束时的最终粘度、回生值＝最终粘度-保持强度。可以使用针对视窗版本2.2(Windows version 2.2)的软件Thermocline(澳大利亚新南威尔士州新港口科技合伙有效公司(Newport Scientific Pty Ltd，NSWAustralia))来收集和分析数据。
根据Konik-Ros等人，《淀粉-淀粉糖》(Starch-
Figure BDA0000146528690000681
)，53：14-20，2001的方法可以确定面粉或淀粉的溶胀体积。通过在限定温度下(例如90℃)在将面粉或淀粉样品混合到水中并且随后收集凝胶化的物质之前和之后对样品进行称重来测量吸水量。
淀粉颗粒形态、双折射以及粒度大小分布
通过SEM(JSM-6400)以及带有偏振光的光学显微镜对颗粒形态进行检查。如所述(Yamamori等人，2000(同上))检查淀粉颗粒的形状和双折射。使用激光衍射粒度分析仪(英国莫尔文，莫尔文仪器公司Mastersizer 2000(Mastersizer 2000，Malvern Instruments，Malvern，England))来确定淀粉浆的粒度大小分布(按体积计)。使用7μm的截止直径来确定小B型淀粉颗粒的百分比。
脂类分析
可以使用英国牛津分析仪器有限公司的牛津4000NMR磁体(Oxford 4000NMR Magnet)通过NMR来测定总脂含量。对于每个样品，在38.8℃下将1g的种子干燥64小时。然后使用NMR测量干燥的种子并且与从cv.Himalaya或M292籽粒中提取的纯大麦油对照进行比较。
蛋白质含量、脂类含量、水分含量以及灰分含量
使用具有自动氮和碳分析仪制备系统的Europa 20-20同位素比率质谱仪(Europa 20-20isotope ratio mass spectrometer)使用质谱法(Mass Spectrometer Method)通过测量氮含量来确定蛋白质含量。使用三至8mg的大麦粗面粉。使用6.25的氮到蛋白质的转换因子来计算大麦种子中的蛋白质含量(Mosse 1990)。使用AOAC 983.23方法、AACC方法44-19以及AACC方法08-01测量脂类含量、水分含量以及灰分含量。
总膳食纤维测定
使用Prosky等人(1985；AOAC 985.29)的重量法来确定粗面粉的总膳食纤维(TDF)。对一式两份样品进行测定。
非淀粉多糖的测定
通过Theander等人，(国际分析化学家协会期刊)(J AOAC Int)78：1030-1044，1995的气相色谱步骤的修改测量总的中性非淀粉多糖(NSP)。该修改涉及用1M硫酸水解2小时，之后离心去除不溶性NSP，并且对可溶性NSP使用2M三氟乙酸对上清液进行进一步水解。
抗性淀粉的测定
使用一种体外方法来确定抗性淀粉(RS)含量。该方法具有两个部分：首先，在模拟的生理条件下将各样品中的淀粉水解；其次，通过洗涤将副产物去除，并且在将该样品均质化并且干燥之后测定残留的淀粉。在消化处理结束时定量的淀粉表示样品的抗性淀粉含量。典型地，将三份样品的粗面粉连同适当的标准品一起与人工唾液混合并且在生理pH和温度下将得到的团块与胰酶和胃酶一起孵育。使用常规的酶技术以及分光光度法来确定消化物中残留淀粉的量，并且将样品的抗性淀粉含量表示为样品重量或总淀粉含量的百分比。
在第1天，将代表高达500mg碳水化合物样品量称量到一个125mL锥形瓶中。通将121mg的NaHCO3和157mg的KCl溶解到大约90mL纯水中，添加159μL的1M CaCl2.6H2O溶液和41μL的0.49M MgCl2.6H2O，用0.32M HCl将pH调节到7至7.1，并且将体积调节到100mL来制备碳酸盐缓冲液。将该缓冲液保存在4℃下持续达五天。制备每mL碳酸盐缓冲液含有250单位α-淀粉酶(来自猪胰腺的西格玛A-3176型VI-B(Sigma A-3176Type VI-B fromporcine pancreas))的人工唾液溶液。将大致等于食物重量的量的人工唾液溶液加入到该烧瓶中。在加入唾液之后大约15至20秒，将5mL的在HCl中的胃蛋白酶溶液(0.02M HCl中的1mg/mL胃蛋白酶(西格玛(Sigma))，pH2.0，使用当天配制)加入到各烧瓶中。淀粉酶以及然后胃蛋白酶的混合模拟人类咀嚼该样品(在吞咽它之前)。在37℃下在85rpm摇动下将该混合物孵育30分钟。然后用5mL的0.02M NaOH将该混合物中和。将25mL的乙酸盐缓冲液(0.2M，pH6)和5mL的含有2mg/mL胰酶(西格玛(Sigma)，猪胰腺，4x USP活性)以及28U来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶(AMG，西格玛(Sigma))的在乙酸缓冲液中的胰酶混合物(pH6)加入各烧瓶中。用铝箔将各烧瓶加盖并且在37℃下在设定85rpm往复式水浴中孵育16小时。
第2天，将各烧瓶的内容物定量地转移到一个50mL聚丙烯管中并且在室温下在2000xg下离心10分钟。将上清液弃去并且用20mL的水将各沉淀洗涤三次，用每次洗涤液柔和地涡旋该管以分散该沉淀，之后进行离心。针对游离葡萄糖的缺乏用葡萄糖Trinder试剂(Glucose Trinder reagent)对50uL的最后水洗液进行测试。然后将各沉淀再悬浮于大约6mL纯化水中并且使用S25N-8G分散工具用Ultra Turrax TP18/10均质化三次持续10秒钟。将这些内容物定量地转移到一个25mL容量瓶中并且补充至规定体积。使这些内容物充分混合并且返回到该聚丙烯管中。将各悬浮液的5mL样品转移到一个25mL培养管中并且立即带壳冷冻在液氮中，然后冷冻干燥。
第3天，使用Megazyme总淀粉法试剂盒(Megazyme Total StarchProcedure kit)中提供的试剂测量每个样品中的总淀粉。准备淀粉标准品(普通玉米淀粉，西格玛S-5296(Regular Maize Starch，SigmaS-5296))以及测定试剂空白样。用0.4mL的80％乙醇来湿润样品、对照以及空白试剂以帮助分散，之后进行涡旋。立即加入2mL的DMSO并且通过涡旋将溶液混合。将这些管放在沸水浴中持续5分钟，并且立即加入在MOPS缓冲液(pH7，含有5mM CaCl2以及0.02％叠氮化钠)中的3mL的耐热α-淀粉酶(100U/ml)。在3分钟间隔的涡旋混合下在沸水浴中将这些溶液进一步孵育12分钟。然后将这些管放在50℃水浴中并且加入4mL的乙酸钠缓冲液(200mM、pH 4.5、含有0.02％叠氮化钠)以及0.1mL的淀粉葡萄糖苷酶(300U/ml)。在10分钟间隔的柔和混合下在50℃下将这些混合物孵育30分钟。在容量瓶中将体积补充至25mL并且充分混合。在2000x g下将这些等分部分离心10分钟。使用1.0mL的葡萄糖Trinder试剂(Glucose Trinder reagent)并且在室温下在黑暗中将这些管孵育至少18分钟并且至多45分钟之后测量在505nm处的吸光度以确定在50μL的上清液中的葡萄糖的量。
水溶性碳水化合物含量的定量
按照具有如下修改的Lunn和Hatch，《植物学》(Planta)197：385-391，1995的方法从粗面粉中提取出总水溶性碳水化合物(WSC)。在此将粗面粉定义为通过研磨成熟籽粒而获得的产物，无需随后的分级分离(例如筛分)来去除麸皮。因此，粗面粉含有籽粒中的所有组分。
在沸水浴中用10ml的80％乙醇(v/v)将大麦粗面粉(100mg)萃取三次持续10分钟。将来自每次萃取的上清液汇集、冷冻干燥并且再悬浮于2ml milliQ水中。使用如所述的(Campbell等人，《食品科学与农业期刊》(J Sci FoodAgric)79：232-236，1999；Ruuska等人，《功能植物生物学》(Funct Plant Biol)33：799-809，2006)比色微孔板酶测定法测量蔗糖、葡萄糖、以及果糖的量。还通过如Ruuska等人，2006(同上)所述的高效阴离子交换色谱法(HPAEC)对糖类、麦芽糖以及低聚果糖(果聚糖)进行分析。这两种方法导致了可比较的数值。
为了确定麦芽糖水平，基本上如纽约科学院出版的Colowick和Kaplan编著的《酶学方法》p.149，1955，Bernfeld，“淀粉酶α和β”(Bernfeld，Amylases aplpha and beta.In：Colowick and Kaplan(eds)，Methods in enzymology，Academic，NY，p.149，1955)所述测定从大麦粗面粉中提取的总糖，如下使用麦芽糖标准溶液用于比较。将总糖稀释10至100倍。将麦芽糖标准品(10管)制备成0.3至5微摩尔/ml.将1ml的每种麦芽糖稀释液(在总糖或麦芽糖稀释液中)与1ml的二硝基水杨酸显色剂混合。然后在100℃下将糖溶液孵育5分钟，然后冷却至室温。将10ml试剂级水加入每个管中并且充分混合。使用分光光度计在A540下对样品进行测量。如上所述还通过HPAEC测定麦芽糖。
酶测定
可以通过提取蛋白质对样品(例如谷物的发育胚乳)中的总淀粉合成酶活性进行测量并且通过Libessart等人，《植物细胞》(PlantCell).7(8)：1117-1127，1995或Cao等人，《植物生理学》(PlantPhysiol)120(1)：205-16，1999中所述的方法进行测定。这些测定使用14C标记的ADPG底物并且测量单体与淀粉聚合物中的结合。如下可以通过凝胶电泳来分离提取物中的淀粉合成酶的单独的同种型并且在凝胶中(酶谱)进行测定。可以使用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、5mM EDTA、20％甘油、10μM Pefabloc以及0.05mM二硫苏糖醇(DTT)来制备来自样品(如发育种子)的提取物。在缓冲液中将种子研磨成浆料或将样品均质化之后，在4℃下在14,000g下将混合物离心15分钟并且将上清液抽出。可以使用考马斯蛋白试剂(Coomassie Protein Reagent)或其他标准手段测量上清液中的蛋白质浓度。如果这些蛋白质提取物将在天然凝胶上运行，则可以将提取物保存在-80℃下。对于变性凝胶电泳而言，将100μl的提取物与SDS和β-巯基乙醇混合并且在沸水中将混合物孵育4分钟以使蛋白质变性。在使用覆盖有4.5％聚丙烯酰胺积层胶的8％聚丙烯酰胺分离胶的标准变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。在电泳之后，可以通过将这些凝胶浸泡在40mM Tris-HCl缓冲液中持续最少2小时，每30分钟更换缓冲液并且每次缓冲液更换使用至少100mL的缓冲液，使蛋白质复性。对于非变性凝胶而言，省去使用SDS和β-巯基乙醇的变性步骤并且从凝胶中省去SDS。可以使用包括Tris-甘氨酸(25mM Tris，0.19M甘氨酸)、0.133M硫酸铵、10mM MgCl2、670μg/mL BSA以及1mM ADPG底物的淀粉合成酶测定缓冲液来检测淀粉合成酶带，之后用2％KI、0.2％I2碘溶液进行染色以检测该淀粉产物。
作为替代方案，可以使用特异性抗体(ELISA)来检测样品中的淀粉合成酶或其他淀粉生物合成酶。
基因型与种子组分或淀粉特性之间关系的统计分析
使用Genstat版本9进行统计分析。针对种子重量、总淀粉含量、淀粉酶含量、β-葡聚糖含量、糖含量、淀粉颗粒尺寸以及支链淀粉链长度分布进行方差分析从而获得最小显著性差异(LSD，P＜0.05)，考虑为基因型之间的变异。
实例2：植物基因型分型
通过从一个sex6-292供体品系(Himalaya292)进入一个amo1-AC38轮回亲本进行三次回交生成针对在SSIIa和amo1基因座处存在或缺乏突变而分离的多个品系的一个集合。从BC3F2系进行三代单子传代以便产生充分固定的基因型，以研究sex6和amo1基因座单独地或联合地对淀粉合成以及籽粒构成的相对影响。使用针对SSIIa基因中的致病突变标记对BC3F6品系中的sex6基因座进行基因分型(Morell等人，2003b(同上))，同时使用紧密连锁的微卫星标记EBmac0501作为amo1-38状态的替代标记(如在实例1中所述)。
在基因分型的70个BC3F6品系中，14个系对于sex6-292和amo1-AC38等位基因(sex6-292/amo1-AC38)两者是纯合的，并且因此被考虑为SSIIa-amo1双重突变体，17个系对于sex6-292和野生型amo1-等位基因(sex6-292/amo1-wt)是纯合的，并且因此指示为SSIIa单突变体，10个系对于野生型sex6和突变体amo1-AC38等位基因(sex6-wt/amo1-AC38)是纯合的，并且因此指示为amo1单突变体，同时15个系对于sex6和amo1(sex6-wt/amo1-wt)两者是野生型的并且指示为野生型。剩余的系对于sex6突变(7个系)或者对于EBmac0501标记是杂合的。
还使用SSIIIa基因的DNA标记(它具有在HAG与Himalaya292亲本品系(实例3)之间的多态性)对这56个纯合系进行基因分型。这个分析显示26个系中存在来自HAG的SSIIIa基因并且在30个系中存在来自Himalaya292的SSIIIa基因。在用EBmac0501和SSIIIa基因标记进行基因分型的这56个系中，5个系显示出重组基因型。当对包括种子丰满度以及淀粉含量的基因型以及表型进行关联时，用EBmac0501基因分型的4个系以及用SSIIIa基因标记进行基因分型的1个系给出重组表型。这表明这些标记与提供淀粉表型的amo1基因座之间存在某种重组，并且还表明amo1基因和SSIIIa基因是遗传分离的(即使在大麦中紧密连锁)。
这些亲代品种在有壳或无壳表型方面也是不同的-HAG是一种有壳的大麦品种而Himalaya292是无壳的。针对这个特征分离SSIIa-amo1双重突变体，并且因此它们可以分成两个小组-有壳或无壳。因此，将如上述区分的这四种基因型的大麦系分成五组，即：野生型品系、SSIIa单突变体、amo1单突变体、无壳双重突变体以及有壳双重突变体。使用这五个组的每一个中的四个系进行淀粉颗粒分布、WSC、CE以及种子形态的分析。使用来自每个基因型的一个系进行胚乳结构和淀粉颗粒形态的分析。如下使用11个野生型品系、9个amo1突变体系、13个SSIIa突变体系、4个无壳双重突变体系、以及6个有壳双重突变体系进行籽粒构成、直链淀粉含量以及种子重量的分析。
种子重量
针对来自BC3F6种群的纯合系测量平均种子重量(100个种子重量的平均值)。平均种子重量是对于11个野生型品系为52.7±5.0mg，对于9个amo1系为52.8±2.8mg，对于13个SSIIa突变体品系为38.7±2.5mg，以及对于6个有壳双重突变体品系为47.6±4.5mg和对于4个无壳双重突变体系为44.7±1.0mg。amo1突变体品系和野生型品系的种子重量之间不存在统计显著性差异(P＜0.05)，表明amo1突变不影响种子重量。然而，这些SSIIa单突变体和双突变体(有壳和无壳)的每一种与这三种对应的其他基因型的每一种之间存在统计显著性差异(P＜0.05)。针对2007年单独的温室和大田试验系中的BC3F7种群还获得在4种基因型的种子重量方面类似的观察结果。令人惊讶的和出人意料的结果是，通过与amo1突变相结合部分地抵消了由于存在SSIIa突变所引起的种子重量降低(已知是由于在缺乏SSIIa活性下支链淀粉合成减少所引起的)。
种子形态
通过立体显微镜在背侧和皱侧两者上对来自针对每种基因型的四个代表系的完整种子进行检查。SSIIa单突变体品系产生了皱缩种子而野生型和arno1单突变体品系产生了丰满的良好填充的种子。观察到这些双重突变体种子(有壳和无壳两者)具有一个中间表型，它比SSIIa突变体种子更丰满，但是不如arno1和野生型种子良好地填充。这些观察与种子重量一致。
为了进一步说明来自这些基因型的种子丰满度的性质，对横过最大直径的种子中间部分的横切面进行检查(图1)。来自野生型和amo1突变体系的横截切显示完全填充的胚乳而SSIIa突变体品系显示在胚乳填充密度方面具有显著减少的不完全填充(皱缩)的种子。SSIIa-amo1双重突变体系显示一种中间表型，其中胚乳比SSIIa突变体胚乳更多地填充而仍然少于野生型或amo1突变体品系的填充。
为了更高放大倍数的检查，通过扫描电子显微镜(SEM)对来自所有基因型的大麦种子的横切面进行检查。在背侧切片的表面上，野生型大麦籽粒显示具有多个分化的亚糊粉细胞层的大约20-25μmx20-25μm尺寸的正方形糊粉细胞，并且胚乳充满了具有大约210μmx130μm尺寸的清楚的细胞边界的扁圆细胞。对于sex6-wt/amo1-AC38突变体而言，糊粉细胞在形状上是矩形的，具有大致20-25μmx10-15μm的尺寸。亚糊粉细胞是清楚地分化的，并且胚乳含有具有清楚细胞边界的扁平细胞，与来自野生型品系的那些相比较该边界更长且更窄，具有大致230μmx30μm的尺寸。sex6-292/amo1-wt野生型显示出不规则矩形形状的45-50μmx5-10μm尺寸的糊粉细胞，亚糊粉细胞未清楚地分化，并且胚乳含有90-95μmx25-30μm尺寸的不规则细胞。对于sex6-292/amo1-AC38双重突变体基因型而言，糊粉细胞是接近正方形形状的并且尺寸大约是20μmx20μm，亚糊粉细胞是如此差地分化的以至它们不能被识别，胚乳含有具有大致110μmx90μm尺寸的具有清楚边界的扁圆细胞。
总淀粉含量
如实例1中所述针对BC3F6种子对于四种基因型测量总淀粉含量。对于野生型品系的淀粉含量平均为64.3％±2.4％，对于amo1突变体品系为57.2％±2.8％，对于SSIIa突变体品系为34.9％±4.0％，对于无壳双重突变体品系为50.8％±2.8％，并且对于有壳双重突变体品系为47.6％±2.3％(图2)。与野生型品系相比较，amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体以及SSIIa突变体品系对应地含有7.1％、13.5％、16.7％以及29.4％的更少的总淀粉。在这五个组中这些数值具有统计差异(P＜0.05)，除了针对无壳和有壳组的数值不具有统计差异之外。对于来自2007年在分开的温室和大田试验的BC3F7籽粒，也获得了这五个组的种子重量之间的一致性关系(P＜0.05)。这些数据表明与SSIIa单突变体种子相比较，针对SSIIa-amo1双重突变体种子所观察到的种子重量增加是由于淀粉含量增加。
直链淀粉含量
针对来自这四个基因型的所有品系测量了直链淀粉含量。对于野生型品系而言直链淀粉含量的范围为32.0％±3.2％，对于amo1突变体为49.5％±2.7％，对于SSIIa突变体品系为57.6％±10.0％，对于无壳双重突变体为62.2％±4.1％并且对于有壳双重突变体为59.8％±2.3％。统计分析显示，与来自amo1突变体和野生型品系的那些相比较，SSIIa突变体品系和双重突变体品系种子中包含显著更高的直链淀粉含量，然而SSIIa突变体和双重突变体的直链淀粉含量不是显著不同的(P＜0.05)，表明SSIIa突变增加了籽粒的总淀粉中的直链淀粉的比例，但是添加amo1突变并不进一步显著增加直链淀粉的比例。在基因型之间的直链淀粉含量方面的这些差异与2007年培养的BC3F7品系中的情况一致。
淀粉链长度分布
为了检查基因型对淀粉链长度分布的影响，从来自BC3F6杂交群的每个组的四个品系中分离出淀粉并且通过荧光基团辅助碳水化合物电泳(FACE)进行分析。将链的百分比汇集到包括DP 6-8、DP 9-14、DP 15-24、DP 35-34、DP 35-44、以及DP＞45的库中。在针对SSIIa突变体、无壳双重突变体以及有壳双重突变体的库之间不存在统计显著性差异(P＜0.05)。然而，与含有突变体SSIIa等位基因的组相比较，在含有野生型SSIIa等位基因的组之间存在较大差异(P＜0.05)。具有SSIIa突变体等位基因的这些基因型包含增加比例的DP 6-8链，具有大于10％的这种尺寸的链，并且还有增加比例的DP 9-14链。它们还展示出减少比例的DP 15-24链。这些野生型品系具有小于5％DP 6-8链长度。amo1突变体含有统计显著减少量的DP 9-14以及增加量的DP 15-24。
淀粉颗粒尺寸分布
为了研究sex6和amo1基因型对胚乳淀粉中的淀粉颗粒尺寸的影响，针对从BC3F6回交群体的每个组中选择的四个品系检查了淀粉颗粒尺寸分布。这些结果显示在野生型、amo1突变体、SSIIa突变体、无壳双重突变体以及有壳双重突变体中的B淀粉颗粒(定义为＜7μm直径)含量对应地是各品系中的总淀粉的20.2％±6.4％、30.7％±3.6％、17.5％±1.8％、19.7％±3.6％以及18.3％±7.2％。与来自其他四个组的种子相比较，amo1突变体种子含有显著更多的B淀粉颗粒。
还评估了直径大于10μm(A淀粉颗粒)的分布峰的平均粒度。A淀粉颗粒的平均尺寸是对于野生型品系为18.9％±0.5μm，对于amo1突变体为10.9％±0.3μm、对于SSIIa突变体为16.4％±2.6μm，对于无壳双重突变体为18.7％±0μm，并且对于有壳双重突变体为17.5％±0.6μm。统计分析显示，与来自其他四个大麦组的每一个的种子相比较，amo1突变体种子含有显著更小的A淀粉颗粒(P＜0.05)。在野生型、SSIIa突变体、无壳双重突变体以及有壳双重突变体的种子中的A颗粒之间不存在统计显著性差异(P＜0.05)。
淀粉颗粒形态
将来自这五个组的多个品系中的纯化大麦淀粉用碘染色，并且在常规光学显微镜下检查。与它们直链淀粉含量一致，在用碘染色之后，来自所有基因型的淀粉颗粒产生了紫色。在偏振光显微镜下，来自野生型种子以及amo1种子的大于90％的淀粉颗粒显示出结晶淀粉颗粒的“马耳他十字”双折射特征。然而，来自SSIIa突变体或双重突变体种子的小于10％的淀粉颗粒展示出这种双折射。
当在SEM下观察时，来自野生型品系的籽粒展示出常规的球形淀粉颗粒，而amo1突变体基因型产生较小的球形A淀粉颗粒，这与从上述分析得到的结果匹配。来自SSIIa和双重突变体种子的淀粉显示出显著更小的变形淀粉颗粒。在产生变形淀粉颗粒的这两种突变体中，SSIIa突变体品系产生管状的长形A颗粒(26μmx12μm)而无壳双重突变体种子展示出A颗粒的更显著的管状伸长(28μmx21μm)。
在大麦种子的横截面中，检查了胚乳基质中的淀粉颗粒的位置。野生型品系含有围绕多个小B淀粉颗粒的多个扁平球形淀粉A颗粒，而amo1突变体品系含有围绕较小B淀粉颗粒的多个松散填充的淀粉颗粒。对于SSIIa突变体种子而言在横截面中不能清楚地识别淀粉颗粒。无壳双重突变体品系含有紧密填充在胚乳细胞中的多个豆状的淀粉A颗粒。
β-葡聚糖含量
针对来自BC3F6群体的所有品系测量了β-葡聚糖含量。β-葡聚糖含量对于野生型品系为6.0％±0.5％(范围从5.3％至7.0％)、对于amo1突变体品系为8.2％±0.5％(范围从7.6％至8.4％)、对于SSIIa突变体为7.6％±1.4％(范围从5.9％至11.3％)、对于无壳双重突变体为7.1％±0.4％并且对于有壳双重突变体为6.5％±0.8％(范围从5.5％至7.7％)。统计分析显示，与来自野生型品系以及有壳双重突变体品系的种子相比较，amo1突变体、SSIIa突变体以及无壳双重突变体种子包含显著更多的β-葡聚糖(P＜0.05)，但是对应地在amo1突变体、SSIIa突变体以及无壳双重突变体之间，或在野生型以及有壳双重突变体种子之间在β-葡聚糖含量方面不存在统计显著性差异。
针对从在温室或大田条件下生长的五个组中选择的这些F7品系的统计分析显示，对于每个试验，来自amo1突变体品系的种子比来自双重突变体品系的种子含有更多的β-葡聚糖。在SSIIa突变体或双重突变体种子之间在β-葡聚糖含量方面不存在显著性差异。
戊聚糖含量
对来自这五个组的多个品系测量了戊聚糖含量。对于野生型品系戊聚糖含量为4.9％±0.6％、对于amo1突变体品系为4.9％±1.1％、对于SSIIa突变体为7.3％±1.4％、对于无壳双重突变体为5.0％±0.3％并且对于有壳双重突变体为6.5％±1.0％。统计分析显示，与来自野生型品系、amo1突变体以及无壳双重突变体品系相比较，SSIIa突变体品系和有壳双重突变体显著包含更多的戊聚糖(P＜0.05)，但是对应地在SSIIa突变体品系和有壳双重突变体之间或者在野生型品系、amo1突变体以及无壳双重突变体之间在戊聚糖含量方面不存在显著性差异。
灰分含量
对这五个组的种子测量了灰分含量。对于野生型种子灰分含量为2.5％±0.1％、对于amo1突变体种子为2.6％±0.2％、对于SSIIa突变体种子为3.1％±0.3％、对于无壳双重突变体种子为2.1％±0.1％并且对于有壳双重突变体种子为2.7％±0.1％。与野生型、amo1突变体或有壳双重突变体种子相比较，SSIIa突变体种子包含显著更多的灰分，并且无壳双重突变体种子包含显著更少的灰分，但是对应地在野生型品系、amo1突变体品系以及有壳双重突变体之间在灰分含量方面不存在显著性差异。
水溶性碳水化合物
为了确定这些突变单独地或结合地对大麦种子中的水溶性碳水化合物含量的影响，分析了来自各组的四个品系。与野生型种子中的水溶性碳水化合物构成相比较，amo1种子不含显著不同水平的总WSC、游离葡萄糖、蔗糖或麦芽糖、或果聚糖。然而，SSIIa突变体和双重突变体种子含有显著更大的量的这些碳水化合物的每一种(P＜0.05)。这些SSIIa单突变体的种子含有显著更多的果糖、蔗糖以及总WSC。
蛋白质含量
测量了这五个组的种子中的蛋白质含量。对于野生型种子蛋白质含量为10.3％±0.8％、对于amo1突变体种子为10.4％±1.1％、对于SSIIa突变体种子为12.6％±0.9％、对于无壳双重突变体种子为14.6％±0.6％并且对于有壳双重突变体种子为13.8±1.4％。与SSIIa突变体种子、野生型种子或amo1突变体种子相比较，无壳和有壳双重突变体种子两者都包含显著更多的蛋白质，但是在无壳与有壳双重突变体种子之间或在amo1突变体与野生型种子之间在蛋白质含量方面不存在显著性差异。
脂类含量
对这五个组的种子测量了脂类含量。对于野生型种子总脂含量为2.9％±0.2％、对于amo1突变体种子为3.5％±0.3％、对于SSIIa突变体种子为6.4％±0.9％、对于无壳双重突变体种子为4.9％±0.3％并且对于有壳双重突变体种子为5.0％±0.3％。与无壳和有壳双重突变体种子、野生型种子以及amo1突变体种子相比较，SSIIa突变体种子包含显著更多的脂类，但是在无壳与有壳双重突变体种子之间或者在amo1突变体与野生型种子之间不存在显著性差异。
讨论
当前研究的目的是检查在sex6和amo1基因座处的隐性突变之间的相互作用。这些突变的每一个都导致直链淀粉表型相对于野生型升高，其中直链淀粉含量典型地是在SSIIa突变体种子的淀粉中为60％-70％并且在amo1-AC38种子中为35％-45％。针对sex6(sex6-wt和sex6-292)以及amo1(amo1-wt和amo1-AC38)基因座确定4种可能的基因型是本项研究的一个重要方面。使用基于淀粉合成酶IIa基因中的致病突变的一种标记能够毫无疑义地区分Sex6基因座的突变体和野生型等位基因。在amo1基因座处的突变的确切性质仍然不清楚，因此使用一种紧密连锁标记(Bmac0501，一致性图谱位置58.0cM)测定含有amo1基因座的染色体区域的存在。
当前研究的一个目的是检查这些突变的结合对直链淀粉含量的影响。这些数据显示，与仅仅带有SSIIa突变体基因座的品系相比较，当将SSIIa突变体和amo1-AC38基因座结合时在直链淀粉比例方面不存在统计显著性差异。然而，SSIIa和amo1-AC38突变的结合对于淀粉合成以及籽粒重量的确具有出人意料的影响，与单独SSIIa突变体相比较，淀粉含量和种子重量增加了。
大麦SSIIa突变体含有具有高百分比直链淀粉的淀粉。这些数据显示，基于每颗籽粒，SSIIa突变体籽粒平均仅含有野生型籽粒的淀粉的40％。因此SSIIa突变体种子的高直链淀粉表型是由于支链淀粉优先降低，与仅降低25％的直链淀粉相比较，支链淀粉降低了75％。在SSIIa-amo1双重突变体颗粒的情况下，与野生型相比较也存在支链淀粉合成降低(降低31％)，但是每个种子的直链淀粉含量增加了(增加37％)。这些结果是吸引人的，表明amo1基因产物不但参与支链淀粉合成而且抑制了直链淀粉合成。
淀粉合成酶III基因在拟南芥中的瞬时淀粉合成中的作用的先前研究使Zhang等人，《植物生理学》(Plant Physiol)138：663-674，2005得出结论，即淀粉合成酶III是叶中的淀粉合成的一种负调节物。在水稻中，两种淀粉合成酶III基因(SSIIIa和SSIIIb)是已知的。在这些基因中，SSIIIa在淀粉合成期间表达于胚乳中，而SSIIIb早期表达于胚乳发育过程中，但不是在籽粒灌浆后期的高活性淀粉合成期间(Ohdan等人，《实验植物期刊》(J Exp Bo)56：3229-3244，2005)。水稻中的SSIIIa突变并不降低淀粉含量，然而在直链淀粉含量方面存在着从大约15％至20％的增加，表明发生了支链淀粉合成的减少以及伴随的直链淀粉合成的增加(Fujita等人，2007(同上))。与这个观察一致的是GBSSI和SSI活性的增加(Fujita等人，2007(同上))。Li等人，2000(同上)将SSIII基因(现在指定为SSIIIa)定位到小麦染色体1的短臂上(一个与大麦中amo1基因座的位置不一致的位置)。因此SSIIIa基因是针对在amo1基因座处断裂的因果基因的一个候选基因。然而，实验证明SSIIIa蛋白表达于amo1突变体中并且具有淀粉合成酶活性，并且证明在SSIIIa与amo1基因之间存在着重组事件，表明它们是不同的基因。
amo1突变体等位基因对淀粉链长度分布的影响是微弱的。在野生型背景中，amo1突变体等位基因的存在引起短链长度(DP 9-14)的轻度减少以及DP 15-24馏分的增加。在SSIIa突变体背景中，amo1突变体等位基因对链长度分布的影响是可忽略的。相反地，SSIIa突变体等位基因对支链淀粉结构以及因此对链长度分布具有较大影响，从而增加了短链(DP 6-8和DP 9-14)的比例并且减少了具有DP15-25的链。
SSIIa和amo1突变体等位基因的结合提供了一种出人意料的表型，其中与仅含有SSIIa突变体等位基因的品系的特性相比较，淀粉含量和种子重量部分地恢复了。
实例3：连锁到大麦amo1基因座上的遗传标记
已经将amo1突变基因座作图在大麦染色体1H上的大致56.5cM处(大麦-BinMap 2005，籽粒基因数据库(GrainGene database))。为了测试紧密连锁到amo1等位基因上的遗传标记，对定位在大麦染色体1H上56.00cM与64.60cM之间的11个SSR(简单序列重复(Simple Sequence Repea))标记((Ramsay等人，《遗传学》(Genetics)156(4)：1997-2005，2000)进行选择并且测试，用于扩增来自两个亲本品系(高直链淀粉冰川(Amylose Glacier(HAG))和Himalaya292)的PCR产物。这些SSR标记是EBmac0405、Bmag0105、Bmac0063、HVM20F、EBmac0560a、EBmac0501、Bmac0044、Bmac0032、Bmag0113、Bmag0211、以及Bmag0350。根据籽粒基因数据库(GrainGenes Database)中列出的序列来合成用于这些SSR标记的引物。
对于每个PCR反应(20μl)，使用50ng基因组DNA、1.5mMMgCl2、每种dNTP 0.125mM、10pmol引物、0.5M甘氨酸甜菜碱、1μl DMSO以及1.5U Hotstar Taq聚合酶(QIAGEN，澳大利亚)。用于扩增SSR标记的PCR条件是：95℃的1个循环持续4分钟，94℃的15个循环持续30秒，从65℃至50℃以每个循环降低1℃持续30秒，并且72℃持续1分钟20秒，94℃的30个循环持续15秒，50℃持续15秒，以及72℃持续45秒，以及25℃的1个循环持续1分钟。这些PCR产物是通过在2％琼脂糖凝胶上进行电泳来分离的，并且在GelRed(Biotium)染色之后用凝胶记录仪器(UVitec)可视化。
当测试这11个SSR标记时，对于来自HAG和Himalaya292亲本植物的DNA，11个中的2个标记，即位于64.6cM处的Bmac0032以及位于58.0cM处的EBmac0501，产生了不同大小的PCR产物。即，这些标记显示了在这两个亲本品种之间的多态性。对于Bmac0032和EBmac0501标记，扩增产物的大小对应地是对于HAG为175bp和189bp片段，并且对于Himalaya292为230bp和150bp。然后使用这两种SSR标记对70个BC3F6品系进行基因分型。用Bmac0032标记进行基因分型的所有品系产生了与HAG相同大小的片段，这表明在Bmac0032与amo1基因座之间所有这些品系已经重新组合并且SSR标记Bmac0032未与amo1基因座紧密连锁。相反地，在用EBmac0501标记进行基因分型的这70个BC3F6品系中，56个对于这些片段谱中的一个或另一个是纯合的。在这56个纯合系中，25个展示了来自HAG的EBmac0501标记，并且31个展示了来自Himalaya292的EBmac0501标记。这些结果表明EBmac0501标记与amo1基因座不具有高遗传重组频率。因此，SSR标记EBmac0501对于amo1-AC38基因座是一种紧密连锁的微卫星标记。
基于大麦SSIIIa基因的标记
据认为amo1基因座可能在大麦的SSIIIa基因附近。为了检验这种可能性并且为了开发基于大麦中的SSIIIa基因的一种DNA标记，首先从这两个亲本品种分离出SSIIIa基因的多个部分。使用基于小麦SSIIIa基因组DNA序列的引物，使用来自HAG和Himalaya292的DNA来扩增PCR片段(Li等人，2000(同上))。将定位在外显子7中的寡核苷酸引物SSIIIaF(5′-GGAGGTCTCGGGGATGT-3′(SEQ ID NO：7))和定位在小麦SSIIIa基因的外显子8中的SSIIIaR(5′-GCTCCAGGAAGTAAACGGTCAGG-3′(SEQ ID NO：8))用于一种464bp产物的PCR扩增。对于每个PCR反应(20μl)，使用50ng基因组DNA、1.5mM MgCl2、每种dNTP 0.125mM、10pmol引物、0.5M甘氨酸甜菜碱、1μl DMSO以及1.5U Hotstar Taq聚合酶。使用以下条件进行PCR反应：95℃的1个循环持续5分钟、94℃的35个循环持续45秒、58℃持续30秒、并且72℃持续1分钟、72℃的1个循环持续10分钟以及25℃的1个循环持续1分钟。在每次扩增中产生一个464bp片段。根据来自USB公司的实验方案用0.5单位的虾碱性磷酸酶(USB公司，美国)、2.5单位的外切核酸酶I以及1xPCR缓冲液(QIAGEN，澳大利亚)处理PCR片段，并且使用具有如制造厂商所述的染料终止物的自动ABI系统进行序列测定。
这些464bp片段具有序列差异，这在一个片段中提供了一个NlaIV限制酶切位点，而在另一个片段中没有。因此，用这种酶处理这些PCR产物，之后在2％琼脂糖凝胶上进行电泳提供了一种合宜的方式，以便从这两种亲本品种中区分这些SSIIIa基因。仅产生这种464bp DNA片段表明存在来自Himalaya292的SSIIIa基因，并且产生303bp和161bp DNA片段两者表明存在来自HAG的SSIIIa基因。
实例4：用于SSIIa-amo1双重突变体的大田试验
当在大田中生长时，为了评估SSIIa-amo1双重突变体的产率性能，于2008年将3个无壳双重突变体品系、2个有壳双重突变体品系、4个无壳SSIIa突变体、1个有壳SSIIa突变体品系、1个无壳野生型大麦品系(栽培品种托伦斯(Torrens))、2个有壳野生型大麦品系(栽培品种Tantangara、Sloop)种植在澳大利亚新南威尔士州的纳兰德拉和莫里(Narrandera and Moree，NSW，Australia)。在有灌溉和无灌溉(旱地)两种条件下使这些大麦品系的每一个都生长在这两个位置处。在每种条件下在两个位置处以随机方式将每个品系种植在两个小区。将大麦种子(120g)播种到每小区中(19m2)。
测量于2008年12月收获每个小区之后所得到的籽粒的重量。在纳兰德拉，在灌溉条件下，每小区的双重突变体、SSIIa突变体以及无壳野生型品系对应地产生2.23±0.16kg、1.14±0.57kg以及1.65±0.79kg的籽粒。在旱地条件下，每小区的双重突变体、SSIIa突变体以及无壳野生型品系对应地产生0.55±0.34kg、0.11±0.12kg以及0.41±0.16kg的籽粒。在莫里，在灌溉条件下，每小区的双重突变体、SSIIa突变体以及无壳野生型品系对应地产生1.62±0.72kg、0.54±0.40kg以及2.11±0.08kg的籽粒。在旱地条件下，双重突变体、SSIIa突变体以及无壳野生型品系对应地产生0.88±0.33kg、0.38±0.27kg以及1.14±0.34kg的大麦籽粒。
因此，在有灌溉的和无灌溉两种条件下，在两个位置处，无壳双重突变体和无壳野生型品系产生类似产量的籽粒，这显著地大于来自无壳SSIIa突变体的产量。
有壳大麦品系的籽粒产量
在纳兰德拉，在灌溉下，每块地双重突变体、SSIIa突变体以及有壳野生型品系对应地产生2.77±0.37kg、2.09±0.76kg以及4.39±2.59kg的颗粒。在旱地条件下，双重突变体、SSIIa突变体以及有壳野生型品系对应地产生0.60±0.06kg、0.35±0.14kg以及0.59±0.46kg的颗粒。
在莫尔，在灌溉下，每块地双重突变体、SSIIa突变体以及有壳野生型品系对应地产生2.15±0.81kg、1.24±0.12kg以及2.73±0.96kg的颗粒。在旱地条件下，每块地双重突变体、SSIIa突变体以及有壳野生型品系对应地产生1.19±0.40kg、0.76±0.60kg以及2.13±0.23kg的颗粒。
因此，在有灌溉和无灌溉两种条件下，在两个位置处，有壳野生型品系比有壳双重突变体以及有壳SSIIa突变体品系产生更多的籽粒，并且有壳双重突变体产生比有壳SSIIa突变体更多的籽粒。
实例5.食品的生产
从2008年在澳大利亚新南威尔士州扬科市大田中生长的十一个大麦品系中收获籽粒，并且研磨以产生面粉。这些品系是3个无壳双重突变体、2个有壳双重突变体、3个SSIIa突变体(包括Himalaya292)、2个野生型(栽培品种Tantangara和Himalaya)以及1个amo1突变体(HAG)。使用Quadrumat Jnr.磨机(澳大利亚新南威尔士州悉尼Cyrulla仪器公司Brabender Quadrumat Jnr.磨机(Brabender Quadrumat Jnr.Mill，Cyrulla′s Instruments，Sydney，NSWAustralia))将从这些品系中收获的籽粒研磨从而产生面粉，然后将该面粉过筛至300μm的直径。在Quadrumat研磨之前不使用润麦方案。
针对11个大麦品系的每一个烘焙两种类型的小型(10g)面包。为了这些测试目的，烘焙了多个小型长条面包，但是本方法可以容易地放大到商业数量。一种类型的面包是用100％大麦粉作为成分制成的(如上所述进行研磨)，而另一种类型的面包是用30％面粉和70％商品小麦粉的共混物作为面粉成分而制成的。将面粉(13.02g)和其他成分混合成生面团，在35-g揉混仪中使面团形成时间达到峰值。在每种情况下，基于13.02g面粉所使用的配方是：面粉100％、盐2％、干酵母1.5％、植物油2％、以及改良剂1.5％。水添加水平是基于微Z臂水吸收数值的，针对该全配方调节这些数值。在40℃以及85％室内湿度下在两阶段醒发步骤中进行成型和装盘。在190℃下在Rotel烘箱中进行烘焙14分钟。
在烘焙之后，将10g的长条面包保存在-80℃(对于100％大麦面包批次)持续三周或持续1周(对于30％大麦面包批次)，并且然后如实例1中所述分析RS含量、以及GI水平。对于RS含量而言，这种体外法确定了抗性淀粉含量。来自10g面包长条的一式两份的样品连同适当的标准品一起与人工唾液混合，并且在生理pH和温度下将得到的团块与胰酶和胃酶一起孵育。使用常规的酶技术以及分光光度计技术来确定消化物中的残留淀粉的量，并且将样品中的抗性淀粉含量表示为样品重量的百分比。
为了确定GI水平，使用了一种体外法。
大麦粗面粉的RS含量
首先确定来自这些大麦基因型组的每一个所研磨的粗面粉的RS含量和GI水平。对于amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体、SSIIa突变体以及野生型粗面粉，RS含量对应地是0.9％、3.5％±0.3％、3.4％±0.1％、1.9％以及0.5％±0.1％(表1)。出人意料的是，无壳和有壳双重突变体粗面粉两者都对应地比amo1突变体、SSIIa突变体以及野生型粗面粉含有高约3.5、2.3以及10倍的RS含量。重要的是，来自无壳和有壳双重突变体两者的粗面粉比来自SSIIa突变体的粗面粉含有显著更多的RS。在无壳双重突变体与有壳双重突变体粗面粉之间或者在amo1突变体与野生型粗面粉之间在RS含量方面不存在统计显著性差异。虽然来自5个大麦组的粗面粉之间的GI水平不同，但是不存在统计显著性差异。
含有100％大麦粉的面包的RS含量
确定了含有100％大麦粉的面包的RS含量并且在表2中给出。这些分析结果显示，对于amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体、SSIIa突变体以及野生型籽粒，由100％大麦粗面粉作为面粉成分制成的面包中的RS含量是2.2％±0.3％、5.5％±0.1％、5.6％±0.3％、2.1％±0.4％以及0.8％±0.3％(表3)。统计分析表明，由来自无壳双重突变体大麦和有壳双重突变体大麦两者的粗面粉制成的面包比来自SSIIa突变体、amo1突变体以及常规的大麦品系产生显著更高的RS含量(表3)。来自含有100％的无壳和有壳双重突变体的面粉的面包在RS含量方面不存在显著性差异。来自无壳和有壳双重突变体的面包比由SSIIa突变体、amo1突变体以及常规大麦制成的面包对应地产生高2.5倍、2.5倍以及6.7倍的RS含量(表3)。
含有30％大麦粉的面包的RS含量
确定了含有30％大麦粉的面包的RS含量并且在表4中给出。由amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体、SSIIa突变体以及野生型粗面粉制成的面包的RS含量对应地是1.9％±0.3％、3.1％±0.2％、3.0％±0.1％、2.0％±0.3％、0.9％±0.1％(表3)。与来自SSIIa突变体、amo1突变体以及常规大麦籽粒的面包相比较，来自无壳双突变体大麦和有壳双突变体大麦两者的面包产生显著更高的RS含量(表3)。在含有30％的无壳与有壳双重突变体的面粉的面包之间在RS含量方面不存在显著性差异。来自无壳和有壳双重突变体的面包比来自SSIIa突变体、amo1突变体以及常规大麦品系的面包对应地产生高1.6倍、1.6倍以及3.3倍的RS含量(表3)。
以mg RS/每克淀粉的形式计算出RS含量，以分析由这些双重突变体制成的面包中的RS增加的性质。分析这些数据以观察RS含量的增加是否是由于总淀粉增加或由于淀粉结构的变化所致。这些结果显示，用100％的来自amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体、SSIIa突变体以及野生型颗粒的大麦粉生产的面包具有41.7、105.1±2.8、106.9±3.3、75.0±8.1以及16.3±4.5mg RS(每克面包淀粉)(图4.6)。无壳双重突变体和有壳双重突变体面包两者都比来自amo1突变体、SSIIa突变体以及野生型籽粒的面包产生高约2.5倍、1.4倍以及6.5倍的RS。这个统计分析显示，虽然来自所有4个大麦组的面包比来自野生型品系的面包含有更多的RS，与来自amo1突变体、SSIIa突变体的面包相比较，来自两个双重突变体的面包的RS含量(mg RS/g淀粉)是统计上显著更高的(P＜0.05)。与来自amo1突变体的面包相比较，来自SSIIa突变体颗粒的面包含有统计上显著更多的RS。
100％大麦面包的GI水平
确定了含有100％的来自所有大麦品系的大麦粉的面包的GI水平并且在表2中给出。来自amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体、SSIIa突变体以及野生型颗粒的面包的GI水平对应地是68.5±2.1、63.5±4.5、60.8±4.1、63.9±10.3、80.3±2.9(表7)。统计分析表明，来自无壳和有壳两种双重突变体、以及SSIIa突变体的籽粒的面包比来自amo1突变体以及常规大麦品系产生显著更低的GI值(表7)。对于含有100％的无壳和有壳双重突变体、以及SSIIa突变体籽粒的面粉的面包的GI值而言，不存在显著性差异。来自无壳和有壳双重突变体、以及SSIIa突变体籽粒的面包对应地产生大约80％的来自amo1突变体以及常规大麦品系的GI水平(表7)。
30％大麦面包的GI水平
确定了含有30％的来自所有大麦品系的大麦粉的面包的GI水平并且在表4中给出。来自amo1突变体、无壳双重突变体、有壳双重突变体、SSIIa突变体以及野生型品系的面包的GI水平对应地是84.5±3.5、83.2±2.1、83.5±0.8、82.3±3.9、87.8±4.5(表7)。由这5个大麦组制成的面包的GI值不具有统计显著性差异。
结论
与来自amo1突变体、SSIIa突变体以及野生型籽粒的粗面粉相比较，来自无壳双突变体大麦和有壳双突变体大麦两者的粗面粉含有显著更高的RS含量。来自这两个双重突变体的粗面粉比来自amo1突变体、SSIIa突变体以及野生型品系的粗面粉含有高约3.5倍、1.8倍以及7.0倍的RS含量。在类似模式中，与由SSIIa突变体、amo1突变体、以及野生型大麦制成的面包相比较，由双重突变体大麦籽粒制成的面包含有显著地更高的RS含量。当观察每克淀粉RS含量增加时，RS含量的增加不仅是由于高直链淀粉的量的增加，而且是由于淀粉结构的变化所致。
与来自amo1突变体以及野生型的籽粒两者相比较，来自双重突变体以及SSIIa突变体籽粒两者的面包产生显著更低的GI值。当用100％大麦粉制造面包时，含有SSIIa-amo1双重突变体籽粒以及SSIIa突变体籽粒的面包的GI值比包含amo1突变体以及野生型籽粒的面包大约低7％以及20％。
实例6：果聚糖的大规模生产
由于具有大约10％果聚糖，SSIIa和amo1中的大麦籽粒突变体可以用于分离和纯化果聚糖以及其他产品，如高直链淀粉以及β-葡聚糖。相对于现有的果聚糖生产方法(例如涉及从菊苣中提取菊糖)，来自易于在大面积农业中生产的籽粒的这类生产将是具有成本效益的。
通过将籽粒研磨成粗面粉并且然后从面粉中将包括果聚糖的总糖提取到水中，可以实现果聚糖的大规模提取。这可以在环境温度下进行并且然后将混合物离心或过滤。然后将上清液加热到大约80℃并且离心以去除蛋白质，然后进行干燥。可替代地，可以使用80％乙醇来提取面粉，随后使用水/氯仿混合物进行相分离，并且将含有糖类以及果聚糖的水相干燥，然后再溶解在水中。可以通过添加α-糖苷酶酶法去除任一种方法制备的提取物中的蔗糖，并且然后通过凝胶过滤去除己糖类(单糖)从而产生具有不同尺寸的果聚糖馏分。这可以产生具有至少80％果聚糖的果聚糖富集馏分。
表1：
大麦粗面粉的RS含量以及GI水平
Figure BDA0000146528690000921
L.S.D.：它是最小显著性差异；大于它的差异是显著的(P＜0.05)。
a、b和c：基于LSD，具有相同字母的平均值是不具有显著性差异的，并且具有不同字母的平均值是具有显著性差异的，处于显著性差异(P＜0.05)。
表2：
使用100％大麦粗面粉生产的面包的RS含量以及GI水平
  样品ID   基因型   品系名称   RS含量(g/100g)   GI水平
  ZL2.9.1   amo1突变体   HAG   2.39   70
  ZL2.9.1   amo1突变体   HAG   2.01   67
  10.1   无壳双重突变体   HHF7_29   5.46   57
  10.1   无壳双重突变体   HHF7_29   5.6   62
6.1   无壳双重突变体 HHF7_4 5.53 66
6.1   无壳双重突变体 HHF7_4 5.32 61
2.1   无壳双重突变体 HHF7_7 5.61 70
2.1   无壳双重突变体 HHF7_7 5.65 65
  11.1   有壳双重突变体   HHF7_88   5.76   66
  11.1   有壳双重突变体   HHF7_88   5.96   62
  1.1   有壳双重突变体   HHF7_122   5.29   57
  1.1   有壳双重突变体   HHF7_122   5.2   58
  ZL1.8.1   SSIIa突变体   871   1.96   49
  ZL1.8.1   SSIIa突变体   871   2.08   53
  ZL1.1.1   SSIIa突变体   Himalaya292   1.49   57
  ZL1.1.1   SSIIa突变体   Himalaya292   1.58   60
  4.1   SSIIa突变体   HHF7_50   2.22   74
  4.1   SSIIa突变体   HHF7_50   2.26   74
  3.1   野生型   Himalaya   0.65   82
  3.1   野生型   Himalaya   0.52   82
  9.1   野生型   Tantangara   1.04   76
  9.1   野生型   Tantangara   1.05   81
表3：
基因型对用30％或100％大麦粉生产的面包的RS含量的影响的统计分析
Figure BDA0000146528690000941
注释：
RS含量30％：含有30％大麦粉的面包的RS含量。
RS含量100％：含有100％大麦粉的面包的RS含量。
L.S.D.：它是最小显著想差异；大于它的差异是显著的(P＜0.05)。
a、b和c：基于LSD，具有相同字母的平均值是不具有显著性差异的并且具有不同字母的平均值是具有显著性差异的，处于显著性差异(P＜0.05)。
表4：
使用30％大麦粉生产的面包的RS含量以及GI水平
  样品ID   基因型   品系名称   RS(g/100g)   GI水平
  ZL1.4.1   amo1突变体   HAG   2.15   82
  ZL1.4.1   amo1突变体   HAG   1.72   87
  ZL1.5.1   无壳双重突变体   HHF7_29   3.01   83
  ZL1.5.1   无壳双重突变体   HHF7_29   3.07   82
  ZL2.7.1   无壳双重突变体   HHF7_4   3.03   83
  ZL2.7.1   无壳双重突变体   HHF7_4   3.27   83
  ZL2.6.1   无壳双重突变体   HHF7_7   3.15   84
  ZL2.6.1   无壳双重突变体   HHF7_7   3.03   84
  ZL1.3.1   有壳双重突变体   HHF7_88   3.04   83
  ZL1.3.1   有壳双重突变体   HHF7_88   3.09   86
  ZL1.10.1   有壳双重突变体   HHF7_122   3.01   81
  ZL1.10.1   有壳双重突变体   HHF7_122   2.71   84
  ZL2.1.1   SSIIa突变体   871   1.87   77
  ZL2.1.1   SSIIa突变体   871   1.82   81
  ZL2.3.1   SSIIa突变体  Himalaya292   1.7   80
  ZL2.3.1   SSIIa突变体  Himalaya292   1.87   82
  ZL2.2.1   SSIIa突变体   HHF7_50   2.15   86
  ZL2.2.1   SSIIa突变体   HHF7_50   1.69   84
  ZL1.2.1   野生型   Himalaya   0.96   93
  ZL1.2.1   野生型   Himalaya   1.02   94
  ZL2.8.1   野生型   Tantangara   0.84   83
  ZL2.8.1   野生型   Tantangara   0.89   85
表5：
基因型对用100％大麦粉生产的面包的RS含量(mg RS/g淀粉)的影响的统计分析
表6：
基因型对用30％大麦粉生产的面包的RS含量(mg RS/g淀粉)的影响的统计分析
表7
基因型对用30％或100％大麦粉生产的10g面包的GI水平的影响的统计分析
  基因型   样品数量   GI水平100％SD   GI水平30％SD
  amo1突变体   2   68.5a    2.1   84.5a    3.5
  无壳双重突变体   6   63.5b    4.5   83.2a    2.1
  有壳双重突变体   4   60.8b    4.1   83.5a    0.8
  SSIIa突变体   6   63.9b    10.3   82.3a    3.9
  野生型   4   80.3a    2.9   87.8a    4.5
  L.S.D.(P＜0.05)   12.1   5.8
GI水平30％：含有30％大麦粉的面包的GI水平。
GI水平100％：含有100％大麦粉的面包的GI水平。
L.S.D.：它是最小显著性差异；大于它的差异是显著的(P＜0.05)。
a和b：基于LSD，具有相同字母的平均值是不具有显著性差异的，并且具有不同字母的平均值是具有显著性差异的，处于显著性差异(P＜0.05)。
表8：
序列标识符的汇总
表9：
氨基酸子分类
Figure BDA0000146528690000982
表10：
示例性的优选的氨基酸置换
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Claims (50)

1.包括低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％(w/w)淀粉含量的大麦籽粒。
2.如权利要求1所述的大麦籽粒，包括至少43％(w/w)、至少45％(w/w)、至少47％(w/w)、至少50％(w/w)的淀粉含量，或包括41％-65％(w/w)的淀粉含量。
3.如权利要求1或2所述的籽粒，包括作为籽粒中的总淀粉比例的至少50％的直链淀粉含量。
4.如权利要求3所述的籽粒，包括作为籽粒中的总淀粉比例的至少60％的直链淀粉含量。
5.根据权利要求1至4的任何一项所述的籽粒，包括5％-9％(w/w)或大于9％(w/w)的β-葡聚糖含量。
6.根据权利要求1至5的任何一项所述的籽粒，包括3％-11％(w/w)或4％-11％(w/w)的果聚糖含量。
7.如权利要求6所述的籽粒，其中该果聚糖包括从大约3至大约12的聚合度。
8.如权利要求1至7的任何一项所述的籽粒，包括在编码具有SSIIa活性的多肽的内源基因中的一个突变，其中该突变降低了大麦植物中编码SSIIa的基因的表达或导致具有降低水平或活性的SSIIa的表达。
9.如权利要求8所述的籽粒，对于sex6-292等位基因而言它是纯合的。
10.如权利要求1至7的任何一项所述的籽粒，其中通过一个外源核酸分子来降低SSIIa的水平，该外源核酸分子在大麦植物体中下调了编码SSIIa的基因的表达。
11.如权利要求10所述的籽粒，其中该外源核酸分子包括一个下调内源SSIIa表达的基因沉默嵌合基因、一个反义序列、核酶、共抑制物、dsRNA分子、发夹RNA分子或微小RNA。
12.根据权利要求1至11的任何一项所述的籽粒，其中该籽粒进一步包括一个遗传变异，该遗传变异降低了amo1基因的活性。
13.如权利要求12所述的籽粒，其中该遗传变异包括amo1基因中的一个突变。
14.根据权利要求1至13的任何一项所述的籽粒，对于该amo1-AC38等位基因而言它是纯合的。
15.如权利要求1至14的任何一项所述的籽粒，它是整粒或裂开的、研磨的、精制的、碾磨的、磨成粗粒的、辊压的或珍珠状的籽粒。
16.一种大麦植物，它能够产生根据权利要求1至15的任何一项所述的籽粒。
17.大麦粗面粉或面粉，它是从根据权利要求1至15的任何一项所述的籽粒生产的。
18.一种生产食物或饮料产品的方法，其中该方法包括：
(i)获得或产生根据权利要求1至15的任何一项所述的大麦籽粒，以及
(ii)加工这种籽粒以产生该产品。
19.如权利要求18所述的方法，其中该产品是选自下组，该组由以下各项组成：粗面粉、面粉、淀粉、麸皮、β-葡聚糖、果聚糖、一种非淀粉多糖、以及裂开的、研磨的、精制的、碾磨的、磨成粗粒的、辊压的或珍珠状的籽粒。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中将加工的大麦籽粒与一种或多种其他成分混合以制造该食物或饮料产品。
21.根据权利要求18至20的任何一项所述的方法，进一步包括：
(iii)评定在大麦籽粒或来自它的产品中的淀粉的水平或类型、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖类、膳食纤维、以及抗性淀粉。
22.如权利要求18至21的任何一项所述的方法，其中该食物或饮料产品是一种籽粒、面粉、早餐谷物、饼干、松饼、穆兹利棒、面条、一种甜味剂、一种低热量添加剂、一种增量剂、一种膳食纤维、一种调质剂、一种防腐剂、一种益生菌剂、或类似物或这些物质的任一组合。
23.一种生产大麦植物的方法，该大麦植物能够产生具有低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％的淀粉含量的籽粒，其中该方法包括：(i)将一种相对于对照植物在植物体内下调内源淀粉合成酶IIa(SSIIa)的水平或活性的试剂、或在该植物中编码SSIIa的内源基因中的一个突变引入所述植物中，以及(ii)选出产生所述籽粒以及降低amo1基因活性的一种遗传变异的大麦植物。
24.如权利要求23所述的方法，包括将降低amo1基因活性的一种遗传变异引入该植物体内。
25.如权利要求23所述的方法，其中该试剂包括下调内源SSIIa基因表达的一种核酸分子。
26.如权利要求25所述的方法，其中该核酸分子包括一种下调内源SSII表达的基因沉默嵌合基因、一种反义序列、核酶、共抑制物、dsRNA分子、发夹RNA或其他外源核酸分子。
27.根据权利要求23至26的任何一项所述的方法，其中该方法进一步包括评定在大麦籽粒或来自它的产品中的淀粉的水平、活性和/或类型、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖类、膳食纤维、或抗性淀粉，或用一种或多种遗传标志对该植物进行分析。
28.如权利要求23至27的任何一项所述的方法，其中相对于对照植物或引入该试剂或突变之前的植物，该SSIIa蛋白的降低水平或活性小于25％、小于10％、小于5％、或基本上缺乏。
29.一种生产如权利要求1至15所述的大麦籽粒的方法，包括种植一种大麦植物以及收获籽粒的步骤。
30.如权利要求1至17的任何一项所述的植物或籽粒或粗面粉或面粉，当使用或用于生产一种产品时用于提高所述产品中的抗性淀粉、膳食纤维、水溶性碳水化合物、β-葡聚糖、果聚糖或非淀粉碳水化合物的水平或降低所述产品的血糖生成指数(GI)。
31.从权利要求1至17的任何一项所述的植物、籽粒、粗面粉或面粉中分离的淀粉、β-葡聚糖或果聚糖在食物中作为甜味剂、低热量添加剂、增量剂、膳食纤维、调质剂、防腐剂、益生菌剂或类似物或这些物质的任一组合的用途。
32.从权利要求1至17的任何一项的植物、籽粒、粗面粉或面粉中分离的籽粒、面粉、粗面粉、淀粉、β-葡聚糖或果聚糖在食品生产中增加所述食品中的抗性淀粉、膳食纤维、水溶性碳水化合物、β-葡聚糖、果聚糖的水平或降低所述食品的血糖生成指数(GI)的用途。
33.如权利要求32所述的用途，其中增加了直链淀粉、β-葡聚糖以及果聚糖的水平。
34.一种包括基于干重至少10％水平食物成分的食品，其中该食物成分是如权利要求1至15的任何一项所述的一种大麦籽粒或从中获得的粗面粉或面粉，其中该粗面粉或面粉包括降低水平或活性的SSIIa蛋白以及至少41％(w/w)的淀粉含量。
35.如权利要求34所述的食品，其中该粗面粉或面粉包含基于重量3％至11％的果聚糖(w/w)或4％至11％(w/w)的果聚糖。
36.如权利要求34或35所述的食品，其中该粗面粉或面粉包括5％至9％(w/w)、或大于9％(w/w)的β-葡聚糖含量。
37.如权利要求34至36的任何一项所述的食品，其中该粗面粉或面粉包括作为该粗面粉或面粉中的总淀粉比例50％或60％的直链淀粉。
38.如权利要求34至37的任何一项所述的食品，其中该产品是选自下组，该组由以下各项组成：面包、小面包、早餐谷物、蛋糕、饼干、糕点、薄脆饼干、松饼、比萨饼、牛角包、圈饼、椒盐脆饼、意大利面制品、面条、烘焙成分、烘焙混合物、汤、调味汁、增稠剂、糖果、以及其他含淀粉的商品。
39.如权利要求34至38的任何一项所述的产品，其中该大麦包括sex6-292等位基因。
40.从如权利要求1至17的任何一项所述的植物或籽粒中分离的籽粒或面粉在生产食品中增加该食品中的淀粉水平、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉的用途。
41.一种鉴定多种大麦籽粒的方法，该大麦籽粒具有增加水平的直链淀粉、以及淀粉、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉中的一项或多项：
(i)通过合成或分解代谢获得在淀粉方面发生改变的大麦籽粒，
(ii)确定这种籽粒中的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖类、膳食纤维或抗性淀粉的量，
(iii)将(ii)中的水平与对照籽粒或亲本籽粒中的水平进行比较；以及
(iv)如果在改变的颗粒中淀粉、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉中一项或多项水平增加，则选择该颗粒。
42.如权利要求41所述的方法，在步骤(i)之前进一步包括诱变或植物细胞转化。
43.一种确定大麦籽粒中的果聚糖的量的方法，包括以下步骤：获得根据权利要求1至17的任何一项所述的籽粒，加工这种籽粒从而提取出果聚糖，并且测量提取的果聚糖的量从而确定这种籽粒中的果聚糖的量。
44.一种用于制备食物或饮料的方法，包括将如权利要求1至15的任何一项所述的大麦籽粒或如权利要求17所述的大麦粗面粉或面粉与另一种食物或饮料成分混合。
45.一种用于提供淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉用来改善哺乳动物体内的一个或多个健康指标的方法，其中该方法包括向该哺乳动物施用包括根据权利要求1至17的任何一项所述的大麦籽粒、粗面粉或面粉的一种组合物或根据权利要求34至39的任何一项所述的食品。
46.如权利要求45所述的方法，其中该籽粒、面粉、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉是处于食品、饮料或药物组合物的形式。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中该一个或多个健康指标是：有益肠细菌的数量增加、异常隐窝病灶的数量减少、矿物质吸收的增加、胰岛素水平的降低、血糖生成指数的降低、血糖生成负荷的降低、血糖的降低、血压的降低、体重的降低、血胆固醇水平的降低、HDL胆固醇水平的升高、骨密度的增加、钙水平的增加、更频繁的肠运动、或血清心血管谱的改善。
48.一种用于改善与受试者体内低水平的膳食淀粉、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉相关联病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括口服地向该受试者施用根据权利要求1至17的任何一项所述的籽粒或包括从中获得的该淀粉、淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉、β-葡聚糖、果聚糖、非淀粉多糖、膳食纤维或抗性淀粉的一种加工产品，持续一段时间，并且在足以改善一个或多个症状的条件下。
49.如权利要求48所述的方法，其中该病症是选自下组，该组由以下各项组成：糖尿病、肥胖症、心脏病、高血压、便秘、骨质疏松症以及癌症。
50.如权利要求48所述的方法，其中该受试者是人类。
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