CN113261636A - 一种高产γ-氨基丁酸的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化工合成领域，具体涉及一种高产GABA的方法及其应用。具体技术方案为：将青稞材料加入含有谷氨酸钠、磷酸吡哆醛的反应体系，在25～45℃下反应8～20小时，获得富含GABA的营养水。本发明提供了一种全新且独特的富集、高产GABA的方法。以高海拔地区产的深色青稞为原料，控制青稞的脱皮率，将脱皮获得的麦麸在特定条件下进行GABA的富集，最终获得一种绿色、简便、成本低廉的GABA高效富集方法及产品。

Description

一种高产γ-氨基丁酸的方法及其应用

技术领域

本发明属于化工合成领域，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸的方法及其应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(全文简称为：GABA)是一种热稳定且高水溶性的功能性非蛋白质氨基酸。大量研究证明，GABA具有缓解抑郁症、提高认知能力、改善老年痴呆等神经性疾病的作用，还有抑制肿瘤细胞的增殖、改善脑血栓、调节心率失常、降低血糖等功效。作为一种新型功能性因子，GABA应用于功能食品或保健品的潜力巨大。

目前，GABA制备方法主要有化学合成法和生物合成法两大类。化学合成法副反应多、反应条件剧烈且有化学物质残留，不适用于食品工业。生物合成法又分为微生物转化法和植物富集法。微生物转化法主要使用乳酸菌、红曲霉、大肠杆菌等微生物，以谷氨酸或谷氨酸盐为底物，通过GAD脱羧转化合成GABA。但该方法实用性较差，需要同步协调微生物生长和GABA合成代谢，培养基成份复杂、操作严格繁琐，且生成的GABA需要进一步纯化才能用于食品生产。

植物富集法又分为两种，一种以大豆、水稻、大麦等谷物籽粒为原料，通过对浸泡和发芽等重要环节的温度、时间、溶液pH等条件进行优化，以促进GABA合成。然而此途径富集的GABA含量一般不高(＜0.3mg/g)、发芽时间长，且产品用途单一，难以满足多样化功能食品饮品的生产需求。另一种方式是以豆粕、胚芽、水果皮等农业副产物为原料，通过化学溶剂脱脂和蛋白酶处理以增加底物Glu的含量，再经内源GAD的作用转化为GABA。但这些方法增加了生产成本及酶解或脱脂化处理等环节，且对温度和反应缓冲液pH等条件有严格要求，大大降低了GABA合成生产的实用性和安全性。因此，上述植物富集方法存在操作步骤多、技术条件要求较高、食品安全性差等不同程度的局限性，难以有效用于商业化快速生产。

谷物籽粒包含胚芽、胚乳、糊粉层、种皮和果皮几大部分。其中，糊粉层、种皮和果皮作为籽粒外层，也称为麸皮。麸皮含量约占谷物籽粒重量的14.5％，富含蛋白质、膳食纤维、矿质元素、维生素、酚类物质等高值营养健康成份。然而，麸皮口感粗糙，会影响食物的感官品质，且在人体内难以消化。因此，谷物一般需经脱皮处理后制得商品米和面粉，再用于各种食品制作，加工副产物麸皮则主要用于饲料和肥料，附加值极低，且造成大量高值营养的浪费。

目前，以谷物麸皮为原材料富集GABA的方法存在富集率低等问题，难以满足规模化生产的需要。如何建立一种绿色、简便、成本低廉的GABA高效富集技术，进一步提高功能活性因子的含量与转化率，为功能食品和保健品生产提供充足的优质辅料或添加剂，是尚未解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产γ-氨基丁酸的方法及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种制备γ-氨基丁酸的方法，使用青稞材料制备获得。

优选的，所述青稞籽粒为黑色籽粒、紫色籽粒、蓝色籽粒品种中的任意一种。

优选的，所述青稞种植于1100米以上环境。

优选的，所述青稞种植于3650米以上环境。

优选的，所述青稞材料为青稞麦麸。

优选的，所述青稞麦麸来自脱皮率为4％～6％的青稞，具体为青稞的碾磨副产物。

优选的，包括如下步骤：将青稞材料加入含有谷氨酸钠、磷酸吡哆醛的反应体系，在25～45℃下反应8～20小时。

优选的，在35℃下反应12小时。

优选的，反应体系中谷氨酸钠浓度为3～10mmol/L。

优选的，反应体系中磷酸吡哆醛浓度为10～30μmol/L。

本发明具有以下有益效果：

青稞中GABA的含量优于普通大麦，且青稞中深色粒品种的GABA含量优于浅色粒品种。与此同时，发明人还首次发现：除温度、光照、水份等环境条件外，种植地海拔对青稞中的GABA含量影响明显，海拔高度可正向调控籽粒中GABA含量；另外，原料加工和合成工艺条件、青稞的脱皮率等对GABA的转化效率也有重要影响。

基于上述发现，本发明提供了一种全新且独特的富集、高产GABA的方法。以高海拔地区产的深色青稞为原料，控制青稞的脱皮率，将脱皮获得的麦麸在特定条件下进行GABA的富集，最终获得一种绿色、简便、安全、成本低廉的GABA高效富集方法及产品。

本方法采用青稞加工的副产物麦麸为主要原料，原材料成本低廉、来源广泛，且GABA的生成量和转化率较现有方法有大幅度提高；同时，该方法制备条件温和、安全无污染、操作简单。

本方法仅使用谷氨酸钠(味精的主要成份)和低浓度的磷酸吡哆醛(维生素B6的主要形式)两种对人体安全的外源添加物质，无需额外添加抑菌剂和pH调节剂等物质，且外源底物谷氨酸钠100％转化为GABA。直接获得的产物(营养水)富含GABA，口感好，属于天然绿色产品，可直接饮用，也可用于功能食品和保健品的生产配料，例如饮料、果酱、糕点等，还可以将营养水干燥制成粉末后，作为功能食品或保健品的添加剂，显著提高了麦麸的附加价值。

附图说明

图1为GABA标准曲线示意图；

图2为不同青稞品种在不同料液比下富集GABA结果示意图

图3为青稞品种ZJ5在不同反应温度下富集GABA结果示意图；

图4为青稞品种ZJ5在不同反应时间下富集GABA结果示意图；

图5为青稞品种ZJ5在不同磷酸吡哆醛浓度下富集GABA结果示意图；

图6为青稞品种ZJ5在不同谷氨酸钠浓度下富集GABA结果示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种高产GABA的方法。产GABA的材料来自青稞，优选来自青稞麦麸。青稞材料来自种植于海拔500米及以上环境，优选为1100米以上环境，更优选为种植于3650米环境。

利用青稞产GABA的方法为：将青稞粉碎后，过80目筛，加入反应液(例如蒸馏水)中，震荡培养。获得的反应上清液即为富含GABA的营养水。根据实际需要，将营养水干燥，或者利用相似相溶等原理将GABA进一步纯化、转移均可。

更优选的方案为，包括如下步骤：

1、采用常规的谷物脱皮机碾磨设备部分脱去青稞籽粒的皮层组织，获得包含有胚芽、糊粉层和少量淀粉的麦麸。将麦麸粉碎，过80目筛。优选脱皮率(麸皮出率)为4％～6％的麦麸，更优选脱皮率为4％的麦麸。其中，脱皮率＝(青稞麸皮质量/青稞总质量)×100％。

2、将麦麸加入含有谷氨酸钠、磷酸吡哆醛的反应体系，在25～45℃下反应8～20小时，优选为在35℃下反应12小时，转化合成GABA。反应体系中谷氨酸钠浓度为3～10mmol/L，优选为8mmol/L。反应体系中磷酸吡哆醛浓度为10～30μmol/L，优选为18μmol/L。

反应完成后，3800g离心处理15min，获得的上清液即为富含GABA的液体。可根据实际需要，对获得的液体进行高压蒸汽灭菌或煮沸灭菌等。灭菌处理对GABA浓度及活性无不良影响。获得的含有GABA的液体灭菌至符合食品级要求后，可作为饮料或保健食品直接食用，也可作为溶剂或添加剂添加制作食品、饲料等。还可根据需要进一步将液体干燥、提纯、浓缩，获得纯GABA，以作它用。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：品种对籽粒GABA的影响

1、本文实施例选取358份栽培大麦品种为研究材料，包含91份皮大麦品种和267份裸大麦品种(在青藏高原地区亦称为“青稞”，全文统一称“青稞”)，根据籽粒颜色，将供试青稞分为黄/白粒、蓝粒、紫粒和黑粒4种类型。所有供试材料在四川什邡(东经104°09'、北纬31°10'，海拔500米)种植。每一材料种植2行，行长1.5米，行距0.25米。供试材料按随机区组排列，3次重复。采用当地常规水肥及田间管理，于大麦完熟期收获种子。

2、GABA标准曲线绘制。主要参考Tojiro等的比色方法进行。具体为：称取10mgGABA标准品，加入10mL蒸馏水配制成1.0mg/mL GABA标准溶液。分别吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL和0.25mL标准溶液于10mL的带盖试管内，并分别加入蒸馏水1.00mL、0.95mL、0.90mL、0.85mL、0.80mL、0.75mL，使每管溶液最终体积达到1mL，从而得到不同浓度梯度的GABA标准溶液。向GABA标准溶液中依次加入0.2mol/L硼酸盐缓冲液(pH＝9.0)0.6mL、5％苯酚溶液2mL、7％次氯酸钠溶液1mL，摇匀后沸水浴加热5～10min，直到颜色变成蓝绿色。冰浴冷却至室温，最后加入60％的乙醇2mL摇匀静置。在波长645nm处测定溶液的吸光度。以吸光度为横坐标，GABA含量为纵坐标，绘制标准曲线，具体如图1所示。后续计算GABA含量时参照的标准曲线均为此。

3、将各品种完熟期收获的大麦籽粒于70℃烘干后粉碎，过400目筛，获得全麦面粉。分别准确称取各品种的面粉150mg置于2mL离心管中，加入1.5mL蒸馏水于MIX-25P迷你混合仪上震荡浸提4h。12000rpm离心5min，取1mL上清液于10mL的带塞试管内，按照步骤2的方法显色反应后，在645nm下测吸光值，通过标准曲线计算出样品GABA的含量。

结果显示，在相同种植和测试方式下，358份大麦材料的籽粒中，GABA含量变异幅度较大(变化范围为：0.062～1.076mg/g)，平均值为0.552±0.176，大部分材料GABA含量位于0.45～0.66mg/g。青稞平均GABA含量为0.574±0.173mg/g(变异幅度0.215～1.038mg/g)，皮大麦平均GABA含量为0.488±0.169mg/g(变异幅度0.062～1.014mg/g)，青稞的GABA含量极显著高于普通的皮大麦(p＜0.01)。在不同籽粒颜色的青稞品种之间，平均GABA含量高低顺序为紫粒＞黑粒＞蓝粒＞黄/白粒，其值分别为0.618±0.179，0.593±0.192，0.580±0.166，0.537±0.149mg/g，表明籽粒颜色越深GABA含量越高。

实施例二：种植地海拔对籽粒GABA的影响

进一步的，从实施例一供试青稞中选择46份浅粒色(黄/白粒)青稞和58份深粒色青稞(蓝粒、黑粒和籽粒)品种，继续在云南元谋(东经101°35′-102°06′、北纬25°23′-26°06′，海拔1100米)和西藏拉萨(东经91°06′，北纬29°36′，海拔3650米)二地种植。每一材料种植2行，行长1.5米，行距0.25米。供试材料按随机区组排列，3次重复。采用当地常规水肥及田间管理，于大麦完熟期收获种子，按实施例一的方法通过标准曲线计算出各样品GABA的含量。

结果显示：在地理位置相近但海拔差距极大的四川、云南和西藏3个种植地点，青稞浅粒色组平均GABA含量分别为0.496±0.133、0.765±0.191和0.907±0.259mg/g；深粒色组平均GABA含量分别为0.603±0.179，0.864±0.231和0.917±0.312mg/g。统计学分析表明，供试材料3个种植点的平均GABA含量随海拔高度增加明显提高，含量高低顺序为：西藏拉萨＞云南元谋＞四川什邡。其中，浅粒色组GABA含量在环境点间的变化幅度较大，相比之下深粒色组的变化较小，但在环境海拔高于1100米的云南和西藏两个环境点其GABA含量均显著高于四川种植点，表明环境海拔高度对青稞籽粒GABA含量有显著的正向作用。

品种ZJ5的GABA天然含量最高，在四川什邡种植时平均含量为1.029mg/g，在西藏拉萨种植时平均含量为1.076mg/g。本文所用包括ZJ5在内的358份均为申请人通过各种渠道收集获得，并保存于中国科学院成都生物研究所内，可联系028-82890337获得。

实施例三：制备方法对GABA合成的影响

根据实施例一、实施例二的结果，选择种植于西藏拉萨的环境稳定的青稞品种ZJ5(黑色粒)、N64(紫色粒)、N455(黑色粒)、N265(蓝粒)和N179(黄/白粒)，委托广汉市金鸡面粉加工厂，采用常规磨粉方法加工上述各品种后，获得各品种的青稞麦麸(即全文所称商品麦麸，脱皮率约为13％)，将各品种的商品麦麸进一步粉碎并过80目筛，进行如下实验。

1、料液比的单因素实验。分别按照80:1、100:1、120:1、140:1和160:1(g/L)的料液比，准确称量各品种麦麸粉，分别加入到250mL的三角瓶内，再分别加入100mL蒸馏水，在转速180rpm、30℃下培养8小时，3800g离心15min，取上清液1mL，按实施例一的方法测定各实验组上清液中GABA的浓度。进行3次重复。结果显示，利用供试品种麦麸转化合成的GABA生成量均随料液比增加而增加，西藏拉萨种植品种ZJ5的麦麸合成的GABA含量最高，其他品种表现均弱于ZJ5，结果如图2所示。在140:1的料液比时，ZJ5上清液中GABA的浓度为7.27mmol/L，N64上清液中GABA的浓度为6.18mmol/L，N455为6.48mmol/L,N265为5.69mmol/L,N179为5.39mmol/L。综合考虑到料液比过大会增加原料成本和导致搅拌困难，优选的料液比为140:1(g/L)。以下实验中，麦麸粉均来自种植于西藏拉萨的品种ZJ5。

2、反应温度的单因素实验。按照140:1(g/L)料液比，分别称取麦麸粉14g加入到250mL的三角瓶内，分别加入含有10mmol/L谷氨酸钠的100mL水溶液。分别在温度25、30、35、40、45℃，转速180rpm条件下培养12小时，3800g离心15min。取上清液1mL测定GABA的浓度，3次重复，结果如图3所示。结果显示，在相对较低的温度范围内，反应温度升高GABA浓度增加，高于35℃的反应温度时，GABA浓度开始下降。

3、反应时间的单因素实验。按照140:1(g/L)料液比，分别称取麦麸粉14g分别加入到100mL的三角瓶内，分别加入含有10mmol/L谷氨酸钠的水溶液，在转速180rpm，30℃条件下分别培养4、8、12、16、20小时，3800g离心15min，取上清液1mL测定GABA的浓度。3次重复，结果如图4所示。结果显示：4～8小时是GABA浓度缓慢增长的培养时间，8～12小时为GABA合成的快速增长期，12小时以后GABA合成趋于平稳，可能原因是反应体系中的谷氨酸或谷氨酸盐底物已被耗尽。

4、磷酸吡哆醛浓度的单因素实验。按照140:1(g/L)料液比，分别称取麦麸粉14g加入到250mL的三角瓶内，分别加入含有0、10、20、30μmol/L磷酸吡哆醛及10mmol/L谷氨酸钠的100mL水溶液。在转速180rpm，30℃条件下培养12小时，3800g离心15min，取上清液1mL测定GABA的浓度。3次重复，结果如图5所示。结果显示：在0～20μmol/L磷酸吡哆醛的浓度范围内，转化合成的GABA浓度持续升高，之后GABA浓度增加趋于平缓。

5、谷氨酸钠浓度的单因素实验。按照140:1(g/L)料液比，分别称取麦麸粉14g分别加入到250mL的三角瓶内，分别加入含有0、3、6、8、10mmol/L谷氨酸钠以及10μmol/L磷酸吡哆醛的100mL水溶液。在转速180rpm，30℃条件下培养8小时，3800g离心15min，取上清液1mL测定GABA的浓度。3次重复，结果如图6所示。实验表明，在0～8mmol/L的谷氨酸钠浓度范围内，转化合成的GABA浓度持续升高，之后GABA浓度开始下降。优选的谷氨酸钠浓度为8mmol/L。

6、根据单因素实验结果，固定料液比及谷氨酸钠浓度，采用三因素三水平试验设计的正交实验，考察反应时间(A)、反应温度(B)和磷酸吡哆醛浓度(C)对GABA生成量及转化率的影响。具体设计如表1所示。

表1三因素正交实验设计

为了准确计算GABA的转化率以进一步确定最佳的制备方法，试验设置实验组和对照组。实验组一共9组试验(实验组1～9)，每组试验3次重复。每个实验组均同时设置对照组，各对照组除未添加谷氨酸钠外，其余条件均同于实验组。具体步骤为：按照140:1(g/L)料液比，分别称取麦麸粉14g加入到250mL的三角瓶内，分别加入含有8mmol/L谷氨酸钠、不同磷酸吡哆醛浓度的100mL水溶液，在180rpm转速、不同温度、不同时间的反应条件下进行培养。3800g离心15min，取上清液1mL测定GABA的浓度，正交实验结果见表2，方差分析见表3。

其中，GABA转化率的测定方法为：在反应结束后，分别测定添加谷氨酸钠底物的处理组GABA浓度(A)，对应的未添加谷氨酸钠底物对照组GABA浓度(B)，转化率％＝(A-B)/添加谷氨酸钠浓度×100％。

表2正交实验结果

表3方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	显著性
						反应时间	1.384	2	0.692	769.148	0.001**
反应温度	0.881	2	0.44	489.37	0.002**
						磷酸吡哆醛浓度	0.36	2	0.18	200.259	0.005**
误差	0.002	2	0.001	/	/

方差分析结果显示,因素A、B、C，即反应时间、反应温度和磷酸吡哆醛浓度对GABA合成均有显著的影响，各因素影响的顺序为C＞B＞A。根据表2、3结果分析，实验组A₂B₁C₂、A₂B₂C₃和A₃B₁C₃的GABA转化率均达到100％，而组间GABA生成量有差异，综合考虑GABA的转化率及生成量，利用青稞麦麸转化合成GABA的最佳制备方法为A₂B₂C₃：即料液比140:1(g/L)，反应液含有8mmol/L谷氨酸钠和18μmol/L磷酸吡哆醛，反应温度35℃，转速180rpm条件下培养12小时。利用该方法获得的营养水GABA含量最高，且口感好，无细菌过度滋长产生的不良气味。

按A₂B₂C₃的方法再进行三次重复实验，GABA浓度分别为15.07mmol/L、15.13mmol/L、15.16mmol/L，平均含量为15.12mmol/L(即1.56mg/ml)；证明本发明提供的方法稳定可靠。GABA是热稳定氨基酸，将制备所得富含GABA的营养水在121℃、103kPa下高压蒸汽灭菌20min，可杀灭包括芽孢、分支杆菌、病毒、真菌在内的所有微生物，利于常温长期保存。灭菌前后营养水的GABA浓度无明显变化，表明营养水高温高压灭菌安全稳定。另外，在100℃水温下煮沸10min也能达到安全的灭菌效果。本领域技术人员可根据实际需要自行选择。

实施例四：麸皮分级对GABA合成的影响

青稞麸皮中GABA含量高于籽粒其它部位，当使用麸皮作为GABA富集底物时，青稞脱皮率的高低直接影响GABA的富集率。本实施例探讨青稞脱皮率(麸皮分级)与GABA产率的关系。

选取种植在西藏拉萨的青稞品种ZJ5进行本实施例。取6份质量为m的青稞倒入脱皮机，采用常规碾米工序。通过设定脱皮循环次数，实现分级脱皮，出料口收集并称量青稞麸皮m₁，计算脱皮率(％)＝(青稞麸皮质量m₁/青稞质量m)×100％。6组青稞的脱皮率如表4所示，同时设置脱皮率为0(完全没有脱皮)的青稞全麦作为对照组。

表4各组麸皮脱皮率对照表

组别	脱皮率％
		对照组	0
实验组1	4.23
		实验组2	6.43
实验组3	13.62
		实验组4	23.78
实验组5	30.44
		实验组6	34.27

将各组所得麸皮采用实施例三的A₂B₂C₃富集制备GABA，按照实施例一的方法测定各组上清液(即富含GABA的营养水)和对应青稞米中GABA的浓度和含量。结果如表5所示。

表5各组麸皮富集GABA结果对照表

可以看出，随着青稞脱皮率增加，麦麸富集获得的营养水GABA含量显著下降。当脱皮率＞23.78％时(组4及以后)，GABA含量趋于稳定。同样，随着脱皮率增加，对应的青稞米和原始麸皮GABA含量也不断降低，但在4.23～13.62％脱皮率范围内(组1～组3)差异不显著。进一步分析发现，相同工艺条件下，脱皮率＜6.43％的麦麸营养水中，GABA含量大于17mmol/L，显著高于该品种商品麦麸的GABA生成量(15.3mmol/L)。脱皮率13.62％的麦麸则与所述商品麦麸的GABA生成量相近。继续增加脱皮率获得的麸皮营养水GABA含量和米粒GABA含量下降幅度变化不大，表明籽粒麸皮已被完全除去。

因此，在前述最佳合成工艺条件下，4％～6％脱皮率范围内制得的麦麸富集的GABA最高，获得的营养水GABA含量最高可达19.57mmol/L(即2.017mg/mL)，相当于将麦麸中GABA的含量从1.62mg/g大幅度提高到14.41mg/g(实验组1)，且获得的营养水有麦香味，无细菌滋生产生的不良气味，青稞米也保持较好的食用口感和营养品质。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：使用青稞材料制备获得。

2.根据权利要求1所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述青稞籽粒为黑色籽粒、紫色籽粒、蓝色籽粒品种中的任意一种。

3.根据权利要求1所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述青稞种植于1100米以上环境。

4.根据权利要求3所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述青稞种植于3650米以上环境。

5.根据权利要求1～4任意一项所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述青稞材料为青稞麦麸。

6.根据权利要求5所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述青稞麦麸来自脱皮率为4％～6％的青稞。

7.根据权利要求1～4任意一项所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：将青稞材料加入含有谷氨酸钠、磷酸吡哆醛的反应体系，在25～45℃下反应8～20小时。

8.根据权利要求7所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：在35℃下反应12小时。

9.根据权利要求7所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：反应体系中谷氨酸钠浓度为3～10mmol/L。

10.根据权利要求7所述制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：反应体系中磷酸吡哆醛浓度为10～30μmol/L。

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