CN102559791A - 一种生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产γ-氨基丁酸的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：(一)用蛋白酶处理豆浆，得到酶解豆浆；(二)将CGMCC编号为1.557的植物乳杆菌接种至发酵培养基，20-50℃静置培养30-60h，得到γ-氨基丁酸；发酵培养基的制备方法如下：取葡萄糖10-40g、蛋白胨10-40g、谷氨酸钠10-40g和盐酸吡哆醛0.001-0.004g，用所述酶解豆浆溶解并定容至1L。本发明提供的方法中，创造性的采用酶解豆浆作为发酵培养基的溶剂(同时提供氮源)，可以大幅度的提高γ-氨基丁酸产量。本发明为为γ-氨基丁酸的工业化发酵生产奠定了理论基础，也为进一步探讨γ-氨基丁酸与大豆多肽种类和含量之间的关系奠定了研究基础，具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非组成蛋白质的氨基酸，广泛存在于原核生物和真核生物中，是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中的重要抑制性神经递质，具有很高的生理活性。2009年卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品，γ-氨基丁酸开始进入食品消费时代。
目前γ-氨基丁酸的生产方法主要有化学合成法和生物合成法两大类。但由于化学合成法成本较高、得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至有毒溶剂，故化学合成法生产的γ-氨基丁酸不能用于食品中，也不能视为一种天然食品添加剂。而采用采用生物合成法生产γ-氨基丁酸转化率高、操作性强、安全可靠，受到人们的普遍关注。
生物合成法又包括合成法和发酵法两类，其中发酵法的应用较为广泛。在早期的研究中，发酵法生产γ-氨基丁酸以大肠杆菌为生产菌，发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、矿物质等。在发酵过程中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，再分离纯化得到GABA制品。但是，若要进行食品开发，使用大肠杆菌无疑存在安全性方面的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产γ-氨基丁酸的方法。
本发明提供的生产γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：
(一)用蛋白酶处理豆浆，得到酶解豆浆；
(二)将植物乳杆菌接种至发酵培养基，20-50℃(如20-40℃或40-50℃)静置培养30-60h(如30-40h或40-60h)，得到γ-氨基丁酸；所述植物乳杆菌的CGMCC编号为1.557；所述发酵培养基的制备方法如下：取葡萄糖10-40g(如10-20g或20-40g)、蛋白胨10-40g(如10-20g或20-40g)、谷氨酸钠10-40g(如10-20g或20-40g)和盐酸吡哆醛0.001-0.004g(如0.001-0.002g或0.002-0.004g)，用所述酶解豆浆溶解并定容至1L。
所述发酵培养基的pH值为2.0-7.0(如2.0-6.0或6.0-7.0)。
所述用蛋白酶处理豆浆的方法具体可为如下(1)至(15)中的任意一种：
(1)将0.1-1.0g(如0.1-0.5g或0.5-1.0g)复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为5.0-9.0(如5.0-7.0或7.0-9.0)，30-50℃(如30-40℃或40-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(2)将0.1-1.0g(如0.1-0.5g或0.5-1.0g)碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为7.0-12.0(如7.0-10.0或10.0-12.0)，50-55℃(如50-52℃或52-55℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(3)将0.1-1.0g(如0.1-0.5g或0.5-1.0g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为5.0-9.0(如5.0-7.0或7.0-9.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；
(4)将0.3-0.6g(如0.3-0.5g或0.5-0.6g)复合蛋白酶和0.2-0.5g(如0.2-0.4g或0.4-0.5g)碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，30-50℃(如30-40℃或40-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(5)将0.3-0.6g(如0.3-0.5g或0.5-0.6g)中性蛋白酶和0.3-0.6g(如0.3-0.5g或0.5-0.6g)复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；
(6)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为7.0-9.0(如7.0-8.0或8.0-9.0)，45-55℃(如45-50℃或50-55℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0(如3.0-3.5或3.5-4.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(7)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0(如3.0-3.5或3.5-4.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(8)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，35-45℃(如35-40℃或40-45℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0(如3.0-3.5或3.5-4.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(9)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，45-55℃(如45-50℃或50-55℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0(如7.0-8.0或8.0-9.0)，45-55℃(如45-50℃或50-55℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(10)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，35-45℃(如35-40℃或40-45℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0(如7.0-8.0或8.0-9.0)，50-60℃(如50-55℃或55-60℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(11)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)复合蛋白酶，调节pH值为7.0-8.0(如7.0-7.5或7.5-8.0)，35-45℃(如35-40℃或40-45℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(12)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0(如7.0-8.0或8.0-9.0)，45-55℃(如45-50℃或50-55℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0(如3.0-3.5或3.5-4.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(13)将0.4-0.6g(如0.4-0.5g或0.5-0.6g)复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，35-45℃(如35-40℃或40-45℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0(如7.0-8.0或8.0-9.0)，45-55℃(如45-50℃或50-55℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0(如3.0-3.5或3.5-4.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(14)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；然后加入0.4-0.6g(如0.4-0.5g或0.5-0.6g)复合蛋白酶，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，35-45℃(如35-40℃或40-45℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0(如3.0-3.5或3.5-4.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；
(15)将0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，40-50℃(如40-45℃或45-50℃)水浴中孵育4-6h(如4-5h或5-6h)；然后加入0.4-0.6g(如0.4-0.5g或0.5-0.6g)复合蛋白酶，调节pH值为6.0-8.0(如6.0-7.0或7.0-8.0)，35-45℃(如35-40℃或40-45℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)；然后加入0.2-0.5g(如0.2-0.3g或0.3-0.5g)碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0(如7.0-8.0或8.0-9.0)，45-55℃(如45-50℃或50-55℃)水浴中孵育3-5h(如3-4h或4-5h)。
所述豆浆可为黄豆豆浆。
所述豆浆的制备方法如下：将1质量份干黄豆与5-15质量份(如5-10质量份或10-15质量份)水混合，然后依次进行研磨、煮沸和过滤豆渣，得到豆浆。所述制备可采用全自动豆浆机进行。
所述植物乳杆菌接种至所述发酵培养基的初始时刻，所述植物乳杆菌的浓度为1×105-7.5×105cfu/ml(如1×105-5×105cfu/ml或5×105-7.5×105cfu/ml)。
所述植物乳杆菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。
所述种子液的制备方法具体如下：将所述植物乳杆菌接种至种子培养基，20-40℃(如20-30℃或30-40℃)静置培养20-50h(如20-30h或30-50h)，获得种子液。
所述种子培养基的制备方法具体如下：取蛋白胨5-20g(如5-10g或10-20g)、牛肉膏5-20g(如5-10g或10-20g)、酵母粉1-10g(如1-5g或5-10g)、葡萄糖10-30g(如10-20g或20-30g)、乙酸钠1-10g(如1-5g或5-10g)、柠檬酸二铵1-5g(如1-2.5g或2.5-5g)、K2HPO4 1-5g(如1-2g或2-5g)、MgSO4·7H2O 0.1-1g(如0.1-0.5g或0.5-1g)、MnSO4·4H2O 0.1-1g(如0.1-0.5g或0.5-1g)和Tween80 0.1-5ml(如0.1-2ml或2-5ml)，用水(如蒸馏水)溶解并定容至1L。
所述种子培养基的pH值为2.0-7.0(如2.0-6.0或6.0-7.0)。
所述种子液的接种量为4％-30％(如4％-20％或20％-30％)。本专利中的接种量特制种子液与发酵培养基的体积比。
本发明中的酶解豆浆是用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和复合蛋白酶按不同水平单独、两两或三三连续或同时处理豆浆得到的。大豆中蛋白质含量丰富、氨基酸组成全面，而采用蛋白酶水解大豆蛋白得到的大豆多肽其营养学方面的价值更优于蛋白质和游离的氨基酸。采用蛋白酶水解大豆蛋白后的大豆多肽等物质作为微生物生长代谢的培养基之一，除了能够提供丰富的氮源、些许碳源和生长因子，促进目标产物生产之外，生产成本也会有大幅度的降低，从而使工业化生产进一步实现或完善。
本发明提供了一种利用CGMCC编号为1.557植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)发酵生产γ-氨基丁酸的方法。本发明提供的方法中，创造性的采用酶解豆浆作为发酵培养基的溶剂(同时提供氮源)，可以大幅度的提高γ-氨基丁酸产量。本发明为为γ-氨基丁酸的工业化发酵生产奠定了理论基础，也为进一步探讨γ-氨基丁酸与大豆多肽种类和含量之间的关系奠定了研究基础，具有重大价值。
附图说明
图1为峰面积与γ-氨基丁酸浓度(g/L)的标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中均采用0.1mol/L NaOH水溶液或0.1mol/L HCl水溶液调节pH。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：CGMCC编号为1.557。
复合蛋白酶(20000U/g)：丹麦诺维信公司；pH7、45℃下1min内降解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量为1U。
中性蛋白酶(50000U/g)：山东安克生物工程有限公司；pH7、45℃下1min内降解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量为1U。
酸性蛋白酶(50000U/g)：山东安克生物工程有限公司；pH3.5、40℃下1min内降解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量为1U。
碱性蛋白酶(100000U/g)：山东安克生物工程有限公司；pH10、45℃下1min内降解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量为1U。
检测待测溶液中γ-氨基丁酸含量的方法为HPLC检测法，具体参数如下：
仪器：Agilent 1200；
色谱柱：Hypersil ODS C18(150mm*4.0mm，5μm)及相应的保护柱；
检测器：紫外；波长：338nm。
进样量：20μL；
洗脱液：由流动相A与流动相B组成，流动相A与流动相B的体积比80％∶20％；流动相A：20mmol/L醋酸钠缓冲液(取醋酸钠2.72g，三乙胺200μL，加超纯水至1L，pH值为7.3)，0.22μm滤膜过滤，脱气；流动相B：乙腈；
流速：1ml/min；
柱温：40℃；
衍生试剂：OPA 20mg，加β-巯基乙醇20μL、乙腈5ml混匀即可；
硼酸缓冲液：硼酸24.7g，加超纯水1L，调pH值至10.4；
检测过程：取硼酸缓冲液100μL，衍生试剂20μL，待测溶液20μL，缓和均匀后室温反应5min后上样于色谱柱，然后用洗脱液洗脱。
采用γ-氨基丁酸标准品(购自上海沪宇生物科技有限公司，产品编号：A0158)作为参照，HPLC图谱中γ-氨基丁酸标准品的峰值位置对应的保留时间为5.612min。峰面积与γ-氨基丁酸浓度(g/L)的标准曲线见图1，对应的函数为y＝7591.9x-40.665，在0g/L-1g/L范围内，峰面积和γ-氨基丁酸浓度有很好的线性关系(R2＝0.9994)，能用于γ-氨基丁酸的定量分析。
实施例1、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、将1质量份干黄豆与5质量份水混合，然后依次进行研磨、煮沸和过滤豆渣，得到豆浆。
2、将0.1g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至5.0，30℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
种子培养基(pH2.0)：取蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母粉1g、葡萄糖10g、乙酸钠1g、柠檬酸二铵1g、K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.1g、MnSO4·4H2O 0.1g和Tween80 0.1ml，用蒸馏水溶解并定容至1L。
发酵培养基(pH2.0)：取葡萄糖10g、蛋白胨10g、谷氨酸钠10g和盐酸吡哆醛0.001g，用步骤一制备的酶解豆浆溶解并定容至1L。
对照培养基(pH2.0)：取葡萄糖10g、蛋白胨10g、谷氨酸钠10g和盐酸吡哆醛0.001g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
三、γ-氨基丁酸的生产
1、将活化后的植物乳杆菌接种到种子培养基，20℃静置培养20h，获得种子液。
2、将4体积份种子液接种至100体积份发酵培养基(或对照培养基)，即接种量为4％体积比，得到初始发酵体系，初始发酵体系中植物乳杆菌的浓度为1×105cfu/ml；将初始发酵体系20℃静置培养30h，获得终止发酵体系。
3、将终止发酵体系4000rpm离心10min(离心半径为13.5cm)，收集上清液，将上清液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，得到无细胞滤液。
4、将无细胞滤液作为待测溶液，采用HPLC法测定γ-氨基丁酸含量。采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为18.75g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了17.2％。
实施例2、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、将1质量份干黄豆与15质量份水混合，然后依次进行研磨、煮沸和过滤豆渣，得到豆浆。
2、将1.0g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至9.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
种子培养基(pH7.0)：取蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母粉10g、葡萄糖30g、乙酸钠10g、柠檬酸二铵5g、K2HPO4 5g、MgSO4·7H2O 1g、MnSO4·4H2O 1g和Tween80 5ml，用蒸馏水溶解并定容至1L。
发酵培养基(pH7.0)：取葡萄糖40g、蛋白胨40g、谷氨酸钠40g和盐酸吡哆醛0.004g，用步骤一制备的酶解豆浆溶解并定容至1L。
对照培养基(pH7.0)：取葡萄糖40g、蛋白胨40g、谷氨酸钠40g和盐酸吡哆醛0.004g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
三、γ-氨基丁酸的生产
1、将活化后的植物乳杆菌接种到种子培养基，40℃静置培养50h，获得种子液。
2、将30体积份种子液接种至100体积份发酵培养基(或对照培养基)，即接种量为30％体积比，得到初始发酵体系，初始发酵体系中植物乳杆菌的浓度为7.5×105cfu/ml；将初始发酵体系50℃静置培养60h，获得终止发酵体系。
3、将终止发酵体系4000rpm离心10min(离心半径为13.5cm)，收集上清液，将上清液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，得到无细胞滤液。
4、将无细胞滤液作为待测溶液，采用HPLC法测定γ-氨基丁酸含量。采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为25.20g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了57.5％。
实施例3、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、将1质量份干黄豆与10质量份水混合，然后依次进行研磨、煮沸和过滤豆渣，得到豆浆。
2、将0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
种子培养基(pH6.0)：取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2.5g、K2HPO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4·4H2O 0.5g和Tween802ml，用蒸馏水溶解并定容至1L。
发酵培养基(pH6.0)：取葡萄糖20g、蛋白胨20g、谷氨酸钠20g和盐酸吡哆醛0.002g，用步骤一制备的酶解豆浆溶解并定容至1L。
对照培养基(pH6.0)：取葡萄糖20g、蛋白胨20g、谷氨酸钠20g和盐酸吡哆醛0.002g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
三、γ-氨基丁酸的生产
1、将活化后的植物乳杆菌接种到种子培养基，30℃静置培养30h，获得种子液。
2、将20体积份种子液接种至100体积份发酵培养基(或对照培养基)，即接种量为20％体积比，得到初始发酵体系，初始发酵体系中植物乳杆菌的浓度为5×105cfu/ml；将初始发酵体系40℃静置培养40h，获得终止发酵体系。
3、将终止发酵体系4000rpm离心10min(离心半径为13.5cm)，收集上清液，将上清液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，得到无细胞滤液。
4、将无细胞滤液作为待测溶液，采用HPLC法测定γ-氨基丁酸含量。采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.65g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了41.6％。
实施例4、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.1g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，50℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.10g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了38.1％。
实施例5、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将1.0g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至12.0，55℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为26.50g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了65.6％。
实施例6、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.5g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至10.0，52℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.10g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了50.6％。
实施例7、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.1g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至5.0，40℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为19.05g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了19.1％。
实施例8、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将1.0g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至9.0，50℃水浴中孵育6h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.74g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了42.1％。
实施例9、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.76g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了29.8％。
实施例10、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.3g复合蛋白酶和0.2g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，30℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为21.22g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了32.6％。
实施例11、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.6g复合蛋白酶和0.5g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为23.65g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了47.8％。
实施例12、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.5g复合蛋白酶和0.4g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.38g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了39.9％。
实施例13、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶和0.3g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，40℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为19.78g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了23.6％。
实施例14、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.6g中性蛋白酶和0.6g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育6h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.10g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了38.1％。
实施例15、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶和0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.86g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了30.4％。
实施例16、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g酸性蛋白酶，调节pH值至3.0，40℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.90g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了43.1％。
实施例17、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至9.0，55℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g酸性蛋白酶，调节pH值至4.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为25.35g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了58.4％。
实施例18、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g酸性蛋白酶，调节pH值至3.5，45℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.05g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了50.3％。
实施例19、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.2g酸性蛋白酶，调节pH值至3.0，40℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.36g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了27.3％。
实施例20、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育6h；然后加入0.5g酸性蛋白酶，调节pH值至4.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.79g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了42.4％。
实施例21、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.3g酸性蛋白酶，调节pH值至3.5，45℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为21.10g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了31.9％。
实施例22、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，35℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g酸性蛋白酶，调节pH值至3.0，40℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.50g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了28.1％。
实施例23、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g酸性蛋白酶，调节pH值至4.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.06g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了50.4％。
实施例24、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g酸性蛋白酶，调节pH值至3.5，45℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.80g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了42.5％。
实施例25、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，45℃水浴中孵育4h；然后加入0.2g碱性蛋白酶，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为19.60g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了22.5％。
实施例26、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，55℃水浴中孵育6h；然后加入0.5g碱性蛋白酶，调节pH值至9.0，55℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为23.05g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了44.1％。
实施例27、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，50℃水浴中孵育5h；然后加入0.3g碱性蛋白酶，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为21.45g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了34.1％。
实施例28、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，35℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g碱性蛋白酶，调节pH值至7.0，50℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为17.85g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了11.6％。
实施例29、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g碱性蛋白酶，调节pH值至9.0，60℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.50g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了28.1％。
实施例30、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g碱性蛋白酶，调节pH值至8.0，55℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为18.85g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了17.8％。
实施例31、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.2g复合蛋白酶，调节pH值至7.0，35℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为21.30g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了33.1％。
实施例32、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育6h；然后加入0.5g复合蛋白酶，调节pH值至8.0，45℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.45g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了52.8％。
实施例33、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.3g复合蛋白酶，调节pH值至7.5，40℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.60g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了41.3％。
实施例34、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.2g碱性蛋白酶，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g酸性蛋白酶，调节pH值至3.0，40℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为23.00g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了43.8％。
实施例35、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育6h；然后加入0.5g碱性蛋白酶，调节pH值至9.0，55℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g酸性蛋白酶，调节pH值至4.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为25.15g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了57.2％。
实施例36、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.3g碱性蛋白酶，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g酸性蛋白酶，调节pH值至3.5，45℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.20g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了51.25％。
实施例37、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.4g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，35℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g碱性蛋白酶，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g酸性蛋白酶，调节pH值至3.0，40℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.50g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了28.1％。
实施例38、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.6g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g碱性蛋白酶，调节pH值至9.0，55℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g酸性蛋白酶，调节pH值至4.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.30g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了51.9％。
实施例39、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g碱性蛋白酶，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g酸性蛋白酶，调节pH值至3.5，45℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.55g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了40.9％。
实施例40、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.4g复合蛋白酶，调节pH值至6.0，35℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g酸性蛋白酶，调节pH值至3.0，40℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为21.10g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了31.9％。
实施例41、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育6h；然后加入0.6g复合蛋白酶，调节pH值至8.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g酸性蛋白酶，调节pH值至4.0，50℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为26.45g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了65.3％。
实施例42、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g复合蛋白酶，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g酸性蛋白酶，调节pH值至3.5，45℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为24.09g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了50.6％。
实施例43、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将0.2g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至6.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.4g复合蛋白酶，调节pH值至6.0，35℃水浴中孵育3h；然后加入0.2g碱性蛋白酶，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育3h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例1的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例1的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为20.59g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了28.7％。
实施例44、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例2的步骤一的1。
2、将0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育6h；然后加入0.6g复合蛋白酶，调节pH值至8.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g碱性蛋白酶，调节pH值至9.0，55℃水浴中孵育5h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例2的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例2的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为25.80g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了61.3％。
实施例45、生产γ-氨基丁酸
一、酶解豆浆的制备
1、同实施例3的步骤一的1。
2、将0.3g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值至7.0，45℃水浴中孵育5h；然后加入0.5g复合蛋白酶，调节pH值至7.0，40℃水浴中孵育4h；然后加入0.3g碱性蛋白酶，调节pH值至8.0，50℃水浴中孵育4h，得到酶解豆浆。
二、培养基的制备
同实施例3的步骤二。
三、γ-氨基丁酸的生产
同实施例3的步骤三。
采用发酵培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量为22.60g/L，比采用对照培养基得到的无细胞滤液中γ-氨基丁酸的含量提高了41.3％。
Claims (4)
1.一种生产γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：
(一)用蛋白酶处理豆浆，得到酶解豆浆；
(二)将植物乳杆菌接种至发酵培养基，20-50℃静置培养30-60h，得到γ-氨基丁酸；所述植物乳杆菌的CGMCC编号为1.557；所述发酵培养基的制备方法如下：取葡萄糖10-40g、蛋白胨10-40g、谷氨酸钠10-40g和盐酸吡哆醛0.001-0.004g，用所述酶解豆浆溶解并定容至1L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的pH值为2.0-7.0。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用蛋白酶处理豆浆的方法为如下(1)至(15)中的任意一种：
(1)将0.1-1.0g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为5.0-9.0，30-50℃水浴中孵育3-5h；
(2)将0.1-1.0g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为7.0-12.0，50-55℃水浴中孵育3-5h；
(3)将0.1-1.0g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为5.0-9.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；
(4)将0.3-0.6g复合蛋白酶和0.2-0.5g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，30-50℃水浴中孵育3-5h；
(5)将0.3-0.6g中性蛋白酶和0.3-0.6g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；
(6)将0.2-0.5g碱性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为7.0-9.0，45-55℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0，40-50℃水浴中孵育3-5h；
(7)将0.2-0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；然后加入0.2-0.5g酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0，40-50℃水浴中孵育3-5h；
(8)将0.2-0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，35-45℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0，40-50℃水浴中孵育3-5h；
(9)将0.2-0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，45-55℃水浴中孵育4-6h；然后加入0.2-0.5g碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0，45-55℃水浴中孵育3-5h；
(10)将0.2-0.5g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，35-45℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0，50-60℃水浴中孵育3-5h；
(11)将0.2-0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；然后加入0.2-0.5g复合蛋白酶，调节pH值为7.0-8.0，35-45℃水浴中孵育3-5h；
(12)将0.2-0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；然后加入0.2-0.5g碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0，45-55℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0，40-50℃水浴中孵育3-5h；
(13)将0.4-0.6g复合蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，35-45℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0，45-55℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0，40-50℃水浴中孵育3-5h；
(14)将0.2-0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；然后加入0.4-0.6g复合蛋白酶，调节pH值为6.0-8.0，35-45℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g酸性蛋白酶，调节pH值为3.0-4.0，40-50℃水浴中孵育3-5h；
(15)将0.2-0.5g中性蛋白酶加入100ml豆浆中，调节pH值为6.0-8.0，40-50℃水浴中孵育4-6h；然后加入0.4-0.6g复合蛋白酶，调节pH值为6.0-8.0，35-45℃水浴中孵育3-5h；然后加入0.2-0.5g碱性蛋白酶，调节pH值为7.0-9.0，45-55℃水浴中孵育3-5h。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述植物乳杆菌接种至所述发酵培养基的初始时刻，所述植物乳杆菌的浓度为1×105-7.5×105cfu/ml。
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