CN100545258C - 武夷菌素高产菌株f64及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesanhygroscopicus var.wuyiensis)的诱变菌株F64 CGMCC No.1967。在常规培养条件下用本发明的菌株来制备一种新型生物农药-武夷菌素，其发酵液效价可以达到5000u/ml以上。本发明还进一步优化了该菌株的发酵培养方法。利用优化的培养方法，特别是新的培养基配方发酵生产武夷菌素，其发酵液效价可以达到6000～6500u/ml，比利用现有的技术和出发菌种制备武夷菌素缩短发酵生产时间5～10小时，发酵液的效价提高150～200%，产量提高100%，节约成本20～30%，防病效果提高15～20%。

Description

武夷菌素高产菌株F64及发酵方法

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株，具体地说是一种不吸水链霉菌武夷变种的高产菌株(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64，本发明还涉及利用该菌株发酵生产生物农药-武夷菌素的方法。

背景技术

生物农药是21世纪农药产业发展的新方向，其中抗生素类杀菌剂是生物农药产业化发展最快的产品之一。武夷菌素是中国农业科学院研制的具有防病增产效果的生物农药产品，其来源于不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)产生的一种抗生素(微生物学报，24：401-402，1984)，主要用于防治农作物真菌病害，具有高效、广谱、低毒、环境安全的特点，因此，在生态农业和绿色食品生产中具有广阔的应用前景。武夷菌素的生产是利用培养武夷菌素产生菌，通过生物深层发酵产生的微生物的次生代谢产物。工厂化发酵生产过程中所使用产生菌产素能力的高低以及培养基配方的优劣是决定抗生素生产成本、防效的关键因素。因此，通过遗传育种技术选育高产生产菌株、优化发酵培养基的营养成分以及营养成分的配比，对于降低武夷菌素的生产成本、能耗，提高防治农作物病害的效果，加快我国自主研发的农用抗生素产业化发展具有重要意义。

目前，武夷菌素产品的生产方法为二级生物发酵，生产上使用的产生菌生物效价约为2500-3000ug/ml，发酵培养时间为120小时。近几年，随着生产菌株传代增加，菌株退化严重，目前效价只有1800-2000ug/ml，培养时间也明显增加，同时，由于用原来的培养基配方生产武夷菌素发酵液中含糖过多，后处理的成本增加。耗能、费时。过高生产成本的严重影响武夷菌素的产业化生产。

研究武夷菌素杀菌剂的高产、高效的生产方法，对于提高我国的农用抗生素自行开发、创制的能力和水平，提高具有自主知识产权的新微生物农药产业化程度，不仅直接为农业生产提供新生物农药品种，而且为开发微生物农药产品提供基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种生产生物农药-武夷菌素的高产菌株(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64。该菌株已于2007年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1967。

本发明的另一个目的在于提供利用该菌株生产武夷菌素的发酵培养发法。

本发明以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)BO-10(韦日清等，微生物学报24：401-402，1984)为出发菌株，通过物理、化学和高能离子注入的诱变技术改进武夷菌素生产菌株，通过室内生物测定的方法筛选该菌种的高产突变菌株并确定菌株产素的稳定性，得到不吸水链霉菌武夷变种的高产菌株F64(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis F64)(保藏号为CGMCC1967)。该菌株在合成培养基上孢子丝呈十分紧密的长螺旋形，一般为5-12圈，孢子为椭圆或卵圆形，大小均匀，表面带细刺。在深层发酵条件下，菌丝生长呈网状；在高氏合成一号琼脂、察氏琼脂等培养基上培养，气生菌丝由灰白变为象灰、褐色；基内菌丝体为淡黄、麦秸黄或浅黄，并由淡黄、微黄色的可溶性色素产生。生理特性：水解淀粉，液化明胶块，纤维素上不生长，不产生硫化氢；利用D-木糖、D-葡萄糖、鼠李糖、棉子糖、甘露糖等，不利用L-阿拉伯糖。功能特性：对革兰氏阳性、阴性细菌，酵母菌及真菌有抑制作用，如枯草杆菌(Escherichia coli)，稻瘟病菌(Piricularia oryzae)，棉花枯萎病菌(Verticillium dahliae)等病原真菌。

本发明以F64为发酵生产菌株，以利用部分因子设计法(FractionalFactorial Design，FFD)对武夷菌素发酵生产培养基配方中营养因子包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆饼粉、氯化钙、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠共10种营养成分的主效应进行考察，筛选影响武夷菌素效价的关键因子；根据JMP软件中的响应面设计模块程序，采用2因素5水平(共13组实验)的中心组合设计法(CentralComposite Design，CCD)对关键因子进行优化。根据实验所得数据进行二次多项式的回归拟和，预测武夷菌素产量的最大值及其所对应的关键因子的浓度。以多元二次方程所预测的最佳培养基为发酵培养基并进行多组发酵实验，确定优化的武夷菌素培养基配方。

通过上述方法获得的优化培养配方为：玉米粉15-25mg/ml，黄豆饼粉20-35mg/ml，葡萄糖20-35mg/ml，氯化铵1-5mg/ml，碳酸钙1-5mg/ml，硫酸镁0.1-0.5mg/ml，硫酸亚铁0.1-0.5mg/ml，氯化钠0.1-0.5mg/ml，磷酸氢二钾0.1-0.5mg/ml。更优选为：玉米粉20mg/ml，黄豆饼粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化铵3mg/ml，碳酸钙3mg/ml，硫酸镁0.2mg/ml，硫酸亚铁0.2mg/ml，氯化钠0.2mg/ml，磷酸氢二钾0.2mg/ml。与传统的发酵培养基配方相比，主要营养成份减少，增加了微量元素成份，总的成本降低。

发酵条件为：转速150～200rpm，温度25～35℃，罐压0.01～0.15MPa，通气量1∶0.5～1，发酵时间50～100小时，发酵50～108小时。优选为：转速180rpm，温度28℃，罐压0.10MPa，通气量1∶0.9，发酵时间78小时。

武夷菌素生物检测方法：以深红酵母AS2.282(Rhodotorula rubra)为检测菌，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基：20％土豆汁，2％葡萄糖，0.8％琼脂)为检测培养基(中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)编：菌种目录，第三版，中国农业科技出版社，1997年)，采用管碟法检测武夷菌素的生物活性。

本发明中的所述的通气量是指每分钟通过单位体积发酵液的气体的量，即每分钟

本发明提供的武夷菌素高产菌株F64，采用常规培养基和培养条件下，效价可达5000u/ml；通过优选的发酵方法，其效价可达6500u/ml。本发明的武夷菌素发酵生产技术，可以用于生物农药武夷菌素的工厂化生产，采用该方法生产武夷菌素杀菌剂发酵液浓缩倍数2-3倍，可达效价10000-11000u/mL。在相同发酵罐和发酵条件下，比原有方法产品产量提高40-50％，节约成本20-30％，防病效果提高15-20％。综上所述，本发明提供了一种高产、节本、增效的武夷菌素杀菌剂发酵生产技术，对于实现我国自主创新生物农药产业化发展，扩大使用范围，促进农业可持续发展有着主要意义。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 培养基配方

配方1 玉米粉20mg/ml，黄豆饼粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化铵3mg/ml，碳酸钙3mg/ml，硫酸镁0.2mg/ml，硫酸亚铁0.2mg/ml，氯化钠0.2mg/ml，磷酸氢二钾0.2mg/ml；

配方2 玉米粉15mg/ml，黄豆饼粉35mg/ml，葡萄糖35mg/ml，氯化铵1mg/ml，碳酸钙1mg/ml，硫酸镁0.5mg/ml，硫酸亚铁0.5mg/ml，氯化钠0.1mg/ml，磷酸氢二钾0.5mg/ml；

配方3 玉米粉25mg/ml，黄豆饼粉20mg/ml，葡萄糖20mg/ml，氯化铵5mg/ml，碳酸钙5mg/ml，硫酸镁0.1mg/ml，硫酸亚铁0.1mg/ml，氯化钠0.5mg/ml，磷酸氢二钾0.1mg/ml。

实施例2 摇床发酵生产方法

在含有玉米粉20mg/ml，黄豆饼粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化铵3mg/ml，碳酸钙3mg/ml，硫酸镁0.2mg/ml，硫酸亚铁0.2mg/ml，氯化钠0.2mg/ml，磷酸氢二钾0.2mg/ml的培养基中接种F64，28℃摇床震荡培养，转速为180rpm/分钟，时间为72小时。发酵液过滤后去除菌丝体，采用生物效价检测法测定效价达到6500u/ml。浓缩2倍效价可达或超过有效成份为1％的武夷菌素产品质量标准(10000u/ml)，该浓缩液可直接作为杀菌机使用。

实施例3 发酵罐发酵生产方法

取F64菌株活化后，经一级种子培养32小时，按照10％(v/v)的接种量转接到发酵培养基，在发酵罐中扩大培养40-50小时。

发酵培养基为：玉米粉20mg/ml，黄豆饼粉32mg/ml，葡萄糖27.2mg/ml，氯化铵3mg/ml，碳酸钙3mg/ml，硫酸镁0.2mg/ml，硫酸亚铁0.2mg/ml，氯化钠0.2mg/ml，磷酸氢二钾0.2mg/ml。

发酵条件为：温度30℃，转速200rpm，通气量1∶0.9，罐压0.10MPa。发酵78小时。发酵液过滤后去除菌丝体，采用管碟法测定效价。

结果：效价达到6500u/ml，浓缩2倍效价可达10000u/ml的浓缩液即可作为杀菌机使用。

实施例4 武夷菌素有效成分的分离纯化及理化性质

收集发酵培养物，用0.5～1％草酸酸化到pH2.5，搅拌后静置过夜，过滤；滤液经颗粒活性炭柱脱色，活性碳流出液用732#阳离子树脂柱(河北新河新光化工有限公司)吸附，先用水洗脱，再用0.5mol/L氨水洗脱，当流出液pH大于7.0后开始接收，浓缩接收液至小体积(30～50ml)；再过中性氧化铝柱脱色，先用水洗脱，再用3％氨水洗脱，收集活性高的流出液浓缩至干；干粉用少量水溶解，上LH-20凝胶柱(北京慧德易科技有限公司)，用蒸馏水洗脱，收集活性高的流出液浓缩至干，即得武夷菌素粗品。武夷菌素粗品经Sephadex-G-25柱层析(上海君创生物科技有限公司)，水洗脱，经HPLC检测后将主要成分含量在75％以上部分合并，冷冻干燥后再经HPLC半制备柱进行制备，制备后可得到只含武夷菌素A和武夷菌素B的精制品，其中主要成分武夷菌素A的含量可达到86％左右，武夷菌素B的含量为13％左右。采用多种方法分离，武夷菌素A和武夷菌素B的含量之比始终保持在7∶1。武夷菌素的理化性质：武夷菌素精制品的冷干物为微黄色粉末，易吸潮，熔点239℃(碳化)，极易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮、氯仿、吡啶等有机溶剂。

实施例5 武夷菌素田间用药的制备

收集实施例2的发酵培养物，过滤，滤液经减压浓缩2-3倍，浓缩温度60℃，得到的武夷菌素含量为10000-12000u/ml浓缩液即可用于田间蔬菜、果树和粮食作物真菌病害的防治。

实施例6 武夷菌素的田间应用

武夷菌素防治蔬菜白粉病：黄瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)是黄瓜主要病害之一，一般造成减产10～20％，严重的达50％以上。取实施例5的浓缩液稀释200-400倍喷雾防治黄瓜白粉病，每亩喷200斤水，防治效果为91.46％，同时使用的化学农药粉锈宁稀释500倍，防治效果96.36％(黄仲生、杨玉茹，生物防治通报1(4)：47，1985)。

武夷菌素防治番茄叶霉病：番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)是保护地番茄主要病害之一。取实施例5的武夷菌素浓缩液分别稀释200倍、250倍、300倍防治番茄叶霉病，每亩喷200斤水，防治效果分别为86.93％、83.07％、54.21％，使用的对照农药为75％代森锰锌300倍稀释液，防效效果64.41％。

武夷菌素防治茶树病：茶树云纹叶枯病(Guignardia camelliae)和轮斑病(Pestalotia guepini)是茶树上发生最普遍，危害最严重的病害之一，一般茶园茶树发病率58.4％和15.5％。取实施例5的武夷菌素浓缩液分别稀释600倍喷施两次，间隔14天，对云纹叶枯病、轮斑病的防治效果分别为78.60％、84.00％。

武夷菌素防治棉花枯萎病：棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.vasinfectum)是棉花生产中最严重的病害，被称为棉花的癌症。在我国所有棉区均有发生，常常导致棉花绝产和绝收。取实施例5的武夷菌素浓缩液分别稀释200倍浸种24小时，同时采用稀释500倍液喷施两次，间隔14天，对棉花枯萎病的防治效果为61.83-67.97％，以50％多菌灵胶悬剂进行相同处理为对照，防病效果为2.28％，几乎无效。

Claims (10)

1、一种武夷菌素高产菌株，其分类命名为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces anhygroscopicus var.wuyiensis)F64，保藏编号为CGMCC No.1967。

2、权利要求1所述的菌株在制备生物农药-武夷菌素中的应用。

3、一种用于培养权利要求1所述菌株的发酵培养基，其特征在于每毫升培养基中含有：玉米粉15～25mg，黄豆饼粉20～35mg，葡萄糖20～35mg，氯化铵1～5mg，碳酸钙1～5mg，硫酸镁0.1～0.5mg，硫酸亚铁0.1～0.5mg，氯化钠0.1～0.5mg，磷酸氢二钾0.1～0.5mg。

4、如权利要求3所述的培养基，其特征在于每毫升培养基中含有：玉米粉20mg，黄豆饼粉32mg，葡萄糖27.2mg，氯化铵3mg，碳酸钙3mg，硫酸镁0.2mg，硫酸亚铁0.2mg，氯化钠0.2mg，磷酸氢二钾0.2mg。

5、一种深层发酵法制备生物农药-武夷菌素发酵液的方法，其特征在于，发酵条件为：转速150～200rpm，温度25～35℃，罐压0.01～0.15MPa，通气量1∶0.5～1，发酵时间50～100小时，接种量为5-20％；发酵所用的培养基为权利要求3或4所述的培养基；发酵所用的菌株为权利要求1所述的菌株。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养条件为：转速180rpm，温度28℃，罐压0.10MPa，通气量1∶0.9，发酵72小时，接种量为10％。

7、根据权利要求5或6所述的方法得到的生物农药武夷菌素发酵液。

8、将权利要求7所述生物农药武夷菌素发酵液浓缩得到的浓缩液。

9、权利要求7所述的发酵液在农作物真菌病害防治中的应用。

10、权利要求8所述的浓缩液在农作物真菌病害防治中的应用。