CN108753653B - 一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，步骤如下：步骤一：用甲基营养型芽胞杆菌的菌液对待防治的作物进行灌根处理；步骤二：用武夷菌素的菌液对待防治的作用进行叶面喷雾；步骤三：重复步骤一至步骤二总计3‑4次。本发明的有益效果是：武夷菌素与芽胞杆菌二者对蔬菜真菌性病害均具有良好的防治效果，但二者在病害防治中的作用又各有侧重，二者结合，采用甲基营养型芽胞杆菌灌根、武夷菌素叶面喷雾的方式进行实施作业，更大程度地发挥二者对社会作物病害的防治作用，为保护地蔬菜作物的生产提供更为有效的配套施用方式。

Description

一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法
技术领域
本发明涉及微生物菌剂应用技术领域，更具体地说涉及一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法。
背景技术
黄瓜作为中国重要的蔬菜作物，在我国的栽培面积不断增加，是现代农业蔬菜生产中重要的支柱性产业之一。近年来，随着保护地温室大棚种植模式的推广，棚内高温高湿等特殊性气候条件导致黄瓜白粉病发生日趋严重。每年由于黄瓜白粉病造成的作物减产在10％左右，流行年份减产能达到20％左右。黄瓜白粉病是由子囊菌亚门单丝壳白粉菌引发的真菌性病害，发病初期，叶片表面产生圆点状白色粉斑，后病斑逐渐扩大为大片白粉区，边缘不规则，表面呈一层白粉，白粉下面叶片褪绿发黄。多年来，国内外对黄瓜白粉病的防治主要集中于化学防治，如三唑类化学药剂。虽然化学杀菌剂短时间能够有效防治该病害，但是长期使用不仅会造成土壤中农药残留、污染环境，而且会使病原菌产生抗药性和再猖獗，防治难度加大。除此之外，大量使用化学农药会抑制土壤中有益微生物，不利于绿色农业发展。
番茄作为我国的重要经济作物，在生产中具有重要的应用价值。近年来，随着保护地种植模式的推广，棚内高湿的环境导致番茄灰霉病的发生日趋严重。番茄灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄胞引起的真菌性病害，对番茄茎、叶、花、果等均可造成危害，病斑始见于叶片，由边缘向内发展并产生轮纹，病斑表面可见灰色霉层。病菌在20～30℃，相对湿度持续90％以上的状态下及易发生并能迅速传播扩散，对植株造成严重危害。病害发生常规年份，因番茄灰霉病造成的减产约20％-30％左右，发生严重年份能导致番茄减产60％以上，该病害已经成为保护地番茄生产的重要障碍。
目前，针对番茄灰霉病的防治主要依靠化学手段，但是长期使用化学农药不仅易导致病原菌产生耐药性、药剂的抗病性减弱，更对土壤、水流、空气等环境造成严重危害，产生一系列的社会和生态问题。近年来，随着国家“减肥减药”政策的提出，生物防治逐渐受到人们的重视，生物防治的防效也在应用中显现出来。
生物农药因其自身环境相容性好且不易产生抗药性等优势，在生产应用中的效果逐渐显现，受到人们的高度重视。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，更大程度地发挥生防产品对植物疾病的防治作用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，步骤如下：
步骤一：用甲基营养型芽胞杆菌的菌液对待防治的作物进行灌根处理；
步骤二：用武夷菌素的菌液对所述待防治的作用进行叶面喷雾；
步骤三：重复所述步骤一至所述步骤二总计3-4次。
进一步，所述步骤一中甲基营养型芽孢杆菌的菌体密度为107cfu/mL。
进一步，所述步骤二中武夷菌素的含量为30-50ppm。
进一步，所述步骤一、所述步骤二、所述步骤三之间的时间间隔为10-15d。
进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌的制备方法为：
第一步，将保存于30％甘油中的甲基营养型芽胞杆菌按2％浓度接种于50mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床活化24h，制成种子液；
第二步，将种子液以1％接种量接种于250mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床培养48h至菌体密度约109cfu/mL时停止培养，稀释300-500倍。
进一步，所述武夷菌素的制备方法为：
第一步，将武夷菌素产生菌接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液；
第二步，将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，用高效液相色谱法检测发酵液中武夷菌素含量；
第三步，将上述发酵液浓缩10倍，使得武夷菌素含量达10000ppm后加入起泡剂，稀释300-500倍使用。
进一步，所述第一步中所述YEME培养基的制备方法为：
首先，将葡萄糖10g、麦芽提取物3g、酵母粉3g、胰蛋白胨5g和蔗糖340g混合，然后加蒸馏水至1000mL，进行121℃高温灭菌30min。
进一步，所述第一步中所述发酵液培养基的制备方法为：将豆饼粉2g、(NH4)2SO40.4g、葡萄糖2g、玉米粉3g和CaCO3 0.3g混合，然后加蒸馏水至1000mL，进行121℃高温灭菌30min。
进一步，所述第二步中，所述发酵液中武夷菌素含量为1025-1055ppm。
如权利要求1-9所述的方法在防治黄瓜白粉病上的应用。
如权利要求1-9所述的方法在防治番茄灰霉病上的应用。
本发明的有益效果为：武夷菌素作为一类核苷类农用抗生素，能够有效防治蔬菜、果蔬及经济作物的真菌性病害，尤其是对蔬菜真菌性病害具有良好的防治效果，武夷菌素主要通过破坏菌丝体细胞膜结构，造成菌丝原生质体渗漏，菌丝体内液泡增多，芽管膨大缢缩，抑制分生胞子萌发来有效控制病原菌的发生；
枯草芽胞杆菌对多种植物病害具有良好的防治作用，且其自身能产生抗逆耐热的芽胞，利于生物制剂的生产，芽胞杆菌主要通过占领有效生态位及促进植株生活生长来抵抗病害；
武夷菌素与芽胞杆菌二者对蔬菜真菌性病害均具有良好的防治效果，但二者在病害防治中的作用又各有侧重，二者结合，采用甲基营养型芽胞杆菌灌根、武夷菌素叶面喷雾的方式进行实施作业：灌根后甲基营养型芽胞杆菌能够调动植株根系的有益微生物，提高菌株活力，以有益微生物提前占取生态位阻止白粉病病原菌侵入；武夷菌素喷施在叶片表面能够及时破坏白粉病病原菌菌丝体细胞膜结构，抑制分生胞子萌发，第一时间有效控制病原菌的发生，更大程度地发挥二者对黄瓜白粉病、番茄灰霉病的防治作用，为保护地黄瓜、番茄及其他蔬菜作物的生产提供更为有效的配套施用方式；
武夷菌素在田间的应用浓度在30-50ppm时，武夷菌素与芽胞杆菌田间应用不会产生拮抗作用，对植物进行黄瓜白粉病的防控最有效，防治效果达到98.46％；对番茄灰霉病的防控最有效，防治效果达到89.30％。
附图说明
图1是不同浓度武夷菌素对枯草芽胞杆菌平板对峙试验结果对比图；
图2是不同浓度武夷菌素对多粘芽胞杆菌平板对峙试验结果对比图；
图3是不同浓度武夷菌素对甲基营养型芽胞杆菌平板对峙试验结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例一：武夷菌素与芽胞杆菌平板对峙试验(平板拮抗作用试验)
本部分采用抑菌圈法测定不同浓度武夷菌素对枯草芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌以及甲基营养型芽胞杆菌的抑制作用。
(一)供试菌株
甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)：来自中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素研究组，分离自吉林省长白山地区；枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)：经美国拜沃有限公司提供的产品单胞分离及16s鉴定获得；多粘芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)：经绿陇生物技术有限公司提供的产品单胞分离及16s鉴定获得。
(二)武夷菌素及芽胞杆菌菌悬液制备及定量
武夷菌素发酵液的制备：将不吸水链霉菌CK-15(Streptomyces ahygroscopicusvar.wuyiensis)接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，继续在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液。其中：YEME培养基配方：葡萄糖10g，麦芽提取物3g，酵母粉3g，胰蛋白胨5g，蔗糖340g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。发酵液培养基配方：豆饼粉2g，(NH4)2SO4 0.4g，葡萄糖2g，玉米粉3g，CaCO3 0.3g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。
芽胞杆菌菌悬液制备：取100μL保存于甘油中的甲基营养型芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌以及多粘芽胞杆菌于50mL液体LB培养基中28℃恒温摇床培养24小时，分别得到三种芽胞杆菌的菌悬液，以备使用。LB培养基配方：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.0，121℃高温灭菌30min。
武夷菌素定量配置：将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，采用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中武夷菌素含量。HPLC分析条件如下：仪器型号：LC-1260；分析柱：填料直径为5μm耐酸(1<pH<12)和耐纯水的ZORBAX SB-AQ(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相：1.4g/L的TCA水溶液，流速：1.2mL/min，进样量：5μL，进样时间：25min，柱温：25℃，紫外：254nm。HPLC色谱图的峰面积即代表武夷菌素的含量。经检测，发酵液中武夷菌素含量为4055ppm。将发酵液加蒸馏水分别稀释至2000ppm，1500ppm，1000ppm，500ppm备用。
(三)武夷菌素与芽胞杆菌平板对峙试验
将制备好的LB培养基冷却至40℃左右，各取甲基营养型芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌以及多粘芽胞杆菌菌悬液100μL分别于3瓶LB液体培养基中，摇匀后倒平板，每板倒入20mL培养基。培养皿背面划十字交叉线，培养基凝固后用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿十字交叉线交点，牛津杯内径(6.0±0.1)㎜，外径(7.8±0.1)㎜，高(10.0±0.1)㎜。吸取250μL武夷菌素含量分别为2000ppm，1500ppm，1000ppm，500ppm的稀释发酵液于牛津杯中，每组三个重复，放置28℃恒温培养。注意操作过程中不要将菌悬液溢出牛津杯外。待平板生长2-3天芽胞杆菌全部长出后观察牛津杯周围是否有抑菌圈生成(图1-图3)，并对抑菌圈直径进行测量。测量方法采用十字测量法利用DIGITAL CALIPER电子数量游标卡尺进行测量，记录实验数据结果表1。
表1.不同浓度武夷菌素对三种芽胞杆菌抑菌圈平均直径(mm)
注：抑菌圈直径不包含牛津杯大小。
结论：由上述平板对峙试验可以发现，武夷菌素含量在500ppm时，无抑菌圈形成，说明上述三种芽胞杆菌与武夷菌素均未产生拮抗作用，当武夷菌素含量达到1000ppm时，武夷菌素与三种芽胞杆菌产生不同程度的抑制作用，其中武夷菌素对甲基营养型芽胞杆菌抑制作用最小。随着武夷菌素含量逐渐升高，其对芽胞杆菌的拮抗抑制作用也逐渐增加。其中，甲基营养型芽胞杆菌在武夷菌素各浓度中的抑制作用最小。据此得出，武夷菌素对芽胞杆菌的最低抑制浓度在500ppm到1000ppm之间，三种芽胞杆菌中甲基营养型芽胞杆菌与武夷菌素的相容性最好。
实施例二：武夷菌素对芽胞杆菌最低抑制浓度测定
在实施例一中发现，武夷菌素在500ppm对芽胞杆菌没有拮抗作用，当浓度升至1000ppm时，产生拮抗现象。为了明确武夷菌素对芽胞杆菌是最低抑制浓度，本研究将武夷菌素发酵液分别稀释至600ppm、700ppm、800ppm、900ppm及1000ppm，以备使用。采用上述平板对峙试验方法进行武夷菌素最低抑制浓度试验。
各取甲基营养型芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌以及多粘芽胞杆菌菌悬液100μL分别于3瓶LB液体培养基中，摇匀后倒平板，每板倒入20mL培养基。培养皿背面划十字交叉线，培养基凝固后用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿十字交叉线交点。吸取250μL武夷菌素含量分别为600ppm、700ppm、800ppm、900ppm及1000ppm的稀释发酵液于牛津杯中，每组三个重复，放置28℃恒温培养。待平板生长2-3天芽胞杆菌全部长出后观察牛津杯周围是否有抑菌圈生成，并对抑菌圈直径进行测量。测量方法采用十字测量法利用DIGITAL CALIPER电子数量游标卡尺进行测量，记录实验数据结果表2。
表2.不同浓度武夷菌素对三种芽胞杆菌抑菌圈平均直径(mm)
结论：平板对峙试验数据显示，武夷菌素在700ppm时无抑菌圈出现，即无拮抗作用，当浓度达到800ppm时，出现拮抗作用。之后，随着武夷菌素浓度的上升，拮抗作用逐渐增加。因此，武夷菌素对三种芽胞杆菌的最低抑制浓度为700ppm。在生产中，武夷菌素在田间的应用浓度一般为30-50ppm，因此武夷菌素与芽胞杆菌田间应用不会产生拮抗作用，且与甲基营养型芽胞杆菌相容性最好，后续武夷菌素与芽胞杆菌田间复合施用试验主要针对武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌。
实施例三：武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌复合施用防治保护地黄瓜白粉病
实施例一、二均显示武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌具有更好的相容性，本研究将武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌复合施用，研究其对白粉病的防效较二者单独施用的区别。
(一)药剂配制
武夷菌素制备：将武夷菌素产生菌接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，继续在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液。培养基具体配方同实施例一。将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，采用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中武夷菌素含量。HPLC条件同实施例一。经检测，发酵液中武夷菌素含量为1025ppm。将发酵液浓缩10倍，使得武夷菌素含量达10000ppm左右后加入起泡剂，装瓶待用。田间应用时一般稀释300-500倍使用，武夷菌素含量约为50ppm。
甲基营养型芽胞杆菌制备：将保存于30％甘油中的甲基营养型芽胞杆菌按2％浓度接种于50mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床活化24h，制成种子液；将种子液以1％接种量接种于250mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床培养48h至菌体密度约109cfu/mL时停止培养，稀释500倍使用，菌体密度约为107cfu/mL时防治效果达到最大值。
(二)实验条件
1.作物品种、繁育方式、试验对象及所用仪器
作物品种：冬美39；繁育方式：种子繁育；试验对象：黄瓜白粉病；使用仪器：ZWY-2102恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造)、医用冰箱(合肥美菱股份有限公司)、3WBO-16型电动喷雾器、电子游标卡尺、米尺、卷尺。
2.环境条件
试验于2016年8-11月在天津市静海区大邱庄众源蔬菜种植专业合作社进行，试验田土壤为砂质土，pH 8.0-8.3，于适宜的栽培时期进行黄瓜的育苗和定植，南北方向起垄栽培，垄宽80cm，垄沟70cm。播种地块地势及土壤肥力均一，正常田间管理，自然发病。
(三)实验方案
2016年8-11月在天津静海大邱庄设施蔬菜大棚进行黄瓜白粉病防治试验。试验共设3个生防菌处理、1个化学药剂硫磺对照和1个空白对照。3个生防菌处理包括武夷菌素、甲基营养型芽胞杆菌以及武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌复合施用，空白对照为清水(CK)。试验区共划分50垄，每个处理10垄，每垄面积40m2，株距0.4m，两处理组间设保护行。黄瓜于2016年8月11日进行繁育，幼苗繁育后于2016年9月11日定植入大棚。
实验组与对照组具体喷施方式如下：(1)实验组一：移栽10天后进行第1次喷施，先喷施武夷菌素300-500倍液(武夷菌素含量约为50ppm)，5天后喷施甲基营养型芽胞杆菌500倍液(菌体密度约为107cfu/mL)。之后每隔10天喷施1次，每次喷施武夷菌素与芽胞杆菌的建个时间为5天，武夷菌素使用在甲基营养型芽胞杆菌之前，共计喷施三次；(2)实验组二：移栽10天后进行第1次喷施，喷施武夷菌素300-500倍液(武夷菌素含量约为50ppm)。之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(3)实验组三：移栽10天后进行第1次喷施，喷施甲基营养型芽胞杆菌500倍液(菌体密度约为107cfu/mL)。之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(4)对照组一：移栽10天后进行第1次喷施，喷施硫磺。之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(5)对照组二：与实验组对应喷施清水。
试验地进行正常的农事操作管理，第3次喷施10天后调查棚内白粉病发生情况，每组处理从10垄植株中各前中后挑选10株，统计得到每组处理样本数为100株。统计样本各级病叶数，计算病情指数及预防效果。棚内白粉病为自然条件下发生。
(四)统计方法
白粉病分级标准参考《农药田间药效试验准则(一)》及相关资料，根据保护地黄瓜白粉病实际发生情况修改确定。
0级：无病班；1级：病斑面积占整个叶面积10％以下；3级：病斑面积占整个叶面积11％-20％；5级：病斑面积占整个叶面积21％-50％；7级：病斑面积占整个叶面积51％-80％；9级：病斑面积占整个叶面积80％以上。
(五)统计分析
采用SAS 9.1统计软件进行数据处理，Duncan氏新复极差法比较各处理间差异显著性。
实验处理组包括武夷菌素与芽胞杆菌复合喷施、单独施用武夷菌素、单独施用芽胞杆菌，对照组包括喷施硫磺以及喷施情随。对每个处理组及对照组抽取的100个样本进行病叶分级，统计计算病情指数及防病效果，具体数据见表3。
表3.不同药剂处理方式对黄瓜白粉病的防治效果
注：表中同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＝0.05水平差异显著。下同。
结论：研究发现，不同的药剂处理方式对黄瓜白粉病的防治效果不同。其中，武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌复合施用对黄瓜白粉病的防治效果最好，病情指数仅为0.98，防治效果达到97.67％。单独喷施武夷菌素对黄瓜白粉病的防效次之，防效达到92.46％。单独施用甲基营养型芽胞杆菌的黄瓜病情指数为6.57，防效为84.37％。硫磺对照组对黄瓜白粉病的防效最低，防效为84.37％。至此，研究发现，武夷菌素和甲基营养型芽胞杆菌对黄瓜白粉病有较高的针对性防效，二者组合使用，防治效果进一步提升达到97.67％，几乎能够完全控制住黄瓜白粉病的危害。因此，武夷菌素和甲基营养型芽胞杆菌在黄瓜白粉病的防治过程中可以复合施用，效果较单独施用提高明显。
实施例四：武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌混合立体施用技术
实施例三研究发现，武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌复合施用对黄瓜白粉病的防治效果优于单一施用。由于生防产品对植株的使用方式具有多样性，为了进一步何种组合施用方式能够更好达到防治病害的作用，该部分研究组合上述两种生防产品的多种施用方式，探寻针对黄瓜白粉病防效最好的药剂组合施用方式。
(一)药剂配制
武夷菌素发酵液的配制方式同实施例三，发酵得到武夷菌素含量1023ppm,将发酵液浓缩10倍，使得武夷菌素含量达10000ppm左右后加入起泡剂，装瓶待用。田间应用时一般稀释300-500倍使用，武夷菌素含量约为50ppm。
甲基营养型芽胞杆菌制备方式同实施例三，获得菌体密度达到109cfu/mL的菌液，田间应用时稀释500倍使用。
(二)实验条件
1.作物品种、繁育方式、试验对象及所用仪器
作物品种：冬美39；繁育方式：种子繁育；试验对象：黄瓜白粉病；使用仪器：ZWY-2102恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造)、医用冰箱(合肥美菱股份有限公司)、3WBO-16型电动喷雾器、电子游标卡尺、米尺、卷尺。
2.环境条件
试验于2017年8—11月在天津市静海区大邱庄众源蔬菜种植专业合作社进行，试验田土壤为砂质土，pH 8.0-8.3，于适宜的栽培时期进行黄瓜的育苗和定植，南北方向起垄栽培，垄宽80cm，垄沟70cm。播种地块地势及土壤肥力均一，正常田间管理，自然发病。
(三)实验方案
2017年8—11月在天津静海大邱庄设施蔬菜大棚进行黄瓜白粉病防治试验。试验共设4个处理组和1个对照组。处理组为武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌不同施用方式，对照组为清水空白对照。试验区共50垄，每个处理10垄，每垄面积40m2，株距0.4m，两处理组间设保护行。黄瓜于2016年8月6日进行繁育，幼苗繁育后于2016年9月6日定植入大棚。
实验组与对照组具体喷施方式如下：(1)实验组1：甲基营养型芽胞杆菌500倍液(107cfu/mL，下同)对黄瓜灌根处理，武夷菌素300-500倍液(武夷菌素含量约为50ppm，下同)对黄瓜进行叶面喷雾；(2)实验组2：武夷菌素300-500倍液对黄瓜灌根处理，甲基营养型芽胞杆菌500倍液对黄瓜进行叶面喷雾；(3)实验组3：武夷菌素300-500倍液以及甲基营养型芽胞杆菌500倍液均对黄瓜进行叶面喷雾；(4)实验组4：武夷菌素300-500倍液以及甲基营养型芽胞杆菌500倍液均对黄瓜进行灌根处理。
具体灌根及叶面喷雾时间、间隔及次数详见表4。
表4.武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌立体施用组合方式及施用时间
试验地进行正常的农事操作管理，最后一次叶面喷雾或灌根后10天调查棚内白粉病发生情况，每组处理从10垄植株中各前中后挑选10株，统计得到每组处理样本数为100株。统计样本各级病叶数，计算病情指数及预防效果。棚内白粉病为自然条件下发生。
黄瓜白粉病的分级标准、统计方法及数据分析方法同实施例三。实验结束后，对实验组及对照组黄瓜白粉病发生情况进行统计分析，结果见表5。
表5.武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌不同立体施用组合对黄瓜白粉病防治情况
注：实验组1-4和对照组具体施用方式按照表4进行。
结论：由上述实验结果发现，处理组一对黄瓜白粉病的防治效果最好，即采用甲基营养型芽胞杆菌灌根，采用武夷菌素叶面喷雾对黄瓜白粉病的防控最有效，防治效果达到98.46％，黄瓜白粉病几乎未发生，只有个别叶片有零星病斑。根据实验组1和组3比较发现，在武夷菌素均叶面喷雾时，甲基营养型芽胞杆菌灌根效果优于喷雾，且差异性显著；根据实验组1与组4比较，在甲基营养型芽胞杆菌均进行菌液灌根时，武夷菌素叶面喷雾效果优于灌根，差异性显著，且武夷菌素叶面喷雾与灌根的区别高于甲基营养型芽胞杆菌叶面喷雾和灌根效果差异。上述比较分析发现，甲基营养型芽胞杆菌较好的使用方式为灌根，推测灌根后甲基营养型芽胞杆菌能够调动植株根系的有益微生物，提高菌株活力，以有益微生物提前占取生态位阻止白粉病病原菌侵入；武夷菌素较好的使用方式为叶面喷雾，推测武夷菌素喷施在叶片表面能够及时破坏白粉病病原菌菌丝体细胞膜结构，抑制分生胞子萌发，第一时间有效控制病原菌的发生。
至此，研究发现武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌立体施用防治黄瓜白粉病较好的施用方式为甲基营养型芽胞杆菌(浓度约为107cfu/mL)灌根，武夷菌素(有效含量约为50ppm)叶面喷雾。
实施例五：武夷菌素单独施用对保护地番茄灰霉病防治试验
(一)供试菌株
不吸水链霉菌CK-15(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)：由中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室农用抗生素组从福建省武夷山地区筛选获得。
(二)药剂配制
武夷菌素制备：将不吸水链霉菌CK-15(Streptomyces ahygroscopicusvar.wuyiensis)接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，继续在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液。其中：YEME培养基配方：葡萄糖10g，麦芽提取物3g，酵母粉3g，胰蛋白胨5g，蔗糖340g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。发酵液培养基配方：豆饼粉2g，(NH4)2SO4 0.4g，葡萄糖2g，玉米粉3g，CaCO3 0.3g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。
武夷菌素定量配置：将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，采用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中武夷菌素含量。HPLC分析条件如下：仪器型号：LC-1260；分析柱：填料直径为5μm耐酸(1<pH<12)和耐纯水的ZORBAX SB-AQ(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相：1.4g/L的TCA水溶液，流速：1.2mL/min，进样量：5μL，进样时间：25min，柱温：25℃，紫外：254nm。HPLC色谱图的峰面积即代表武夷菌素的含量。经检测，发酵液中武夷菌素含量为1055ppm。将发酵液浓缩10倍，使得武夷菌素含量达10000ppm左右后加入起泡剂，装瓶待用。田间应用时稀释500倍使用。
(三)实验条件
1.作物品种、繁育方式、试验对象及所用仪器
作物品种：瑞粉907(瑞克斯旺)；繁育方式：种子繁育；试验对象：番茄灰霉病；使用仪器：ZWY-2102恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造)、医用冰箱(合肥美菱股份有限公司)、3WBO-16型电动喷雾器、电子游标卡尺、米尺、卷尺。
2.环境条件
试验于2016年7-12月在天津市静海区大邱庄众源蔬菜种植专业合作社进行，试验田土壤为砂质土，pH8.0-8.3，于适宜的栽培时期进行番茄的育苗和定植，南北方向起垄栽培，垄宽80cm，垄沟70cm。播种地块地势及土壤肥力均一，正常田间管理，自然发病。
(四)实验方案
2016年7—12月在天津静海大邱庄设施蔬菜大棚进行番茄灰霉病防治试验。试验共设2个处理和1个空白对照，其中处理组包括武夷菌素和硫磺，空白对照为清水(CK)。试验区共划分30垄，每个处理10垄，每垄面积40m2，株距0.4m，两处理组间设保护行。番茄于2016年7月7日进行繁育，幼苗繁育后于2016年8月7日定植入大棚。
处理组与对照组具体喷施方式如下：(1)处理组一：移栽10天后进行第1次喷施，喷施武夷菌素500倍液。之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(2)处理组二：移栽10天后进行第1次喷施，喷施硫磺，之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(3)对照组：与处理组对应喷施清水。
试验地进行正常的农事操作管理，番茄生长过程中单杆整枝，出现5个果枝时，进行打叉封顶。第3次喷施10天后调查棚内灰霉病发生情况，每组处理从10垄植株中各前中后挑选10株，统计得到每组处理样本数为100株。统计样本各级病叶数，计算病情指数及预防效果。棚内灰霉病为自然条件下发生。
(五)统计方法
灰霉病分级标准参考《农药田间药效试验准则(一)》及相关资料，根据保护地番茄灰霉病实际发生情况修改确定。
0级：无病班；1级：病斑面积占整个叶面积10％以下；3级：病斑面积占整个叶面积11％-20％；5级：病斑面积占整个叶面积21％-50％；7级：病斑面积占整个叶面积51％-80％；9级：病斑面积占整个叶面积80％以上。
(六)统计分析
采用SAS 9.1统计软件进行数据处理，Duncan氏新复极差法比较各处理间差异显著性。
对每个处理组及对照组抽取的100个样本进行病叶分级，统计计算病情指数及防病效果，具体数据见表6。
表6.武夷菌素对番茄灰霉病的防治效果
注：表中同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＝0.05水平差异显著。下同。
结论：研究发现，武夷菌素对番茄灰霉病具有良好的防治作用。实验结果表明，从番茄定植后喷施武夷菌素，其对番茄灰霉病的防治效果高达85.27％。相同条件下，喷施硫
磺对番茄灰霉病的防治效果为77.44％，防治效果显著低于武夷菌素500倍液。
实施例六：芽胞杆菌单独施用对番茄灰霉病田间防治试验
(一)供试菌株
甲基营养型芽胞杆菌NKG-1：由中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室农用抗生素组从吉林省长白山土壤中筛选获得，经本实验室鉴定为甲基营养型芽胞杆菌(B.methylotrophicus)，于2016年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC12055；
枯草芽胞杆菌：购自中保集团，为可湿性粉剂，有效成分含量为1000亿个/g，农药登记号为PD20150091。
(二)药剂配制
甲基营养型芽胞杆菌NKG-1制备及配置：将保存于30％甘油中的甲基营养型芽胞杆菌NKG-1按2％浓度接种于50mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床活化24h，制成种子液；将种子液以1％接种量接种于250mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床培养48h至菌体密度约109cfu/mL时停止培养，稀释300倍(菌体密度约为107cfu/mL)使用。LB培养基配方：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.0，121℃高温灭菌30min。
枯草芽胞杆菌配置：将枯草芽胞杆菌粉剂以每g溶于100L水的比例进行配置，配置后菌体密度为107cfu/mL，与甲基营养型芽胞杆菌NKG-1稀释300倍浓度相当。
(三)实验条件
1.作物品种、繁育方式、试验对象及所用仪器
作物品种：瑞粉907(瑞克斯旺)；繁育方式：种子繁育；试验对象：番茄灰霉病；使用仪器：ZWY-2102恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造)、医用冰箱(合肥美菱股份有限公司)、3WBO-16型电动喷雾器、电子游标卡尺、米尺、卷尺。
2.环境条件
试验于2016年7-12月在天津市静海区大邱庄众源蔬菜种植专业合作社进行，试验田土壤为砂质土，pH8.0-8.3，于适宜的栽培时期进行番茄的育苗和定植，南北方向起垄栽培，垄宽80cm，垄沟70cm。播种地块地势及土壤肥力均一，正常田间管理，自然发病。
(四)实验方案
2016年7-12月在天津静海大邱庄设施蔬菜大棚进行番茄灰霉病防治试验。试验共设2个处理和1个空白对照，其中处理组包括甲基营养型芽胞杆菌NKG-1和枯草芽胞杆菌，空白对照为清水(CK)。试验区共划分30垄，每个处理10垄，每垄面积40m2，株距0.4m，两处理组间设保护行。番茄于2016年7月5日进行繁育，幼苗繁育后于2016年8月5日定植入大棚。
处理组与对照组具体喷施方式如下：(1)处理组一：移栽10天后进行第1次喷施，喷施配置好的甲基营养型芽胞杆菌NKG-1菌液。之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(2)处理组二：移栽10天后进行第1次喷施，喷施配置好的枯草芽胞杆菌菌液，之后每隔15天喷施1次，共计喷施三次；(3)对照组：与处理组对应喷施清水。
试验地进行正常的农事操作管理，番茄生长过程中单杆整枝，出现5个果枝时，进行打叉封顶。番茄灰霉病的分级标准、统计方法及数据分析方法同实施例一。
第3次喷施10天后调查棚内灰霉病发生情况，每组处理从10垄植株中各前中后挑选10株，统计得到每组处理样本数为100株。统计样本各级病叶数，计算病情指数及预防效果，结果见表7。
表7.芽胞杆菌对番茄灰霉病的防治效果
结论：研究发现，甲基营养型芽胞杆菌NKG-1与枯草芽胞杆菌对番茄灰霉病均有显著防效。喷施甲基营养型芽胞杆菌NKG-1的番茄，灰霉病病情指数为8.31，甲基营养型芽胞杆菌NKG-1对番茄灰霉病的防效达81.07％。而喷施枯草芽胞杆菌的番茄，灰霉病病情指数为9.12，枯草芽胞杆菌对番茄灰霉病的防效达79.17％。二者相比，甲基营养型芽胞杆菌NKG-1对番茄灰霉病的防效优于枯草芽胞杆菌。
实施例三：武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌对番茄灰霉病的混合立体施用技术
在实施例一、二中发现，武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌对番茄灰霉病有十分良好的防效，这两种生物农药一种为生防菌的次级代谢产物，一种为生防菌自身，它们在防治番茄灰霉病过程中通过不同的作用方式来达到提高植株抗病性及杀灭病原菌的效果。因此，本部分研究希望探讨武夷菌素与芽胞杆菌联合施用对番茄灰霉病是否有更好的防治效果，并希望寻找一种合适的二者混合的立体施用技术。
(一)药剂配制
武夷菌素发酵液的配制方式同实施例一，将发酵液浓缩10倍，使得武夷菌素含量达10000ppm左右后加入起泡剂，装瓶待用。田间应用时一般稀释500倍使用。
甲基营养型芽胞杆菌NKG-1制备方式同实施例二，获得菌体密度达到109cfu/mL的菌液，田间应用时稀释300倍使用，菌体密度约为107cfu/mL。
(二)实验条件
1.作物品种、繁育方式、试验对象及所用仪器
作物品种：瑞粉907(瑞克斯旺)；繁育方式：种子繁育；试验对象：番茄灰霉病；使用仪器：ZWY-2102恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造)、医用冰箱(合肥美菱股份有限公司)、3WBO-16型电动喷雾器、电子游标卡尺、米尺、卷尺。
2.环境条件
试验于2017年7-12月在天津市静海区大邱庄众源蔬菜种植专业合作社进行，试验田土壤为砂质土，pH 8.0-8.3，于适宜的栽培时期进行番茄的育苗和定植，南北方向起垄栽培，垄宽80cm，垄沟70cm。播种地块地势及土壤肥力均一，正常田间管理，自然发病。
(三)实验方案
2017年7-11月在天津静海大邱庄设施蔬菜大棚进行番茄灰霉病防治试验。试验共设4个处理组和1个对照组。处理组为武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌NKG-1不同施用方式，对照组为清水空白对照。试验区共50垄，每个处理10垄，每垄面积40m2，株距0.4m，两处理组间设保护行。番茄于2017年7月10日进行繁育，幼苗繁育后于2017年8月10日定植入大棚。
实验组与对照组具体喷施方式如下：(1)实验组1：甲基营养型芽胞杆菌NKG-1 300倍液对番茄灌根处理，武夷菌素500倍液对番茄进行叶面喷雾；
(2)实验组2：武夷菌素500倍液对番茄灌根处理，甲基营养型芽胞杆菌300倍液对番茄进行叶面喷雾；
(3)实验组3：武夷菌素500倍液以及甲基营养型芽胞杆菌300倍液均对番茄进行叶面喷雾；
(4)实验组4：武夷菌素500倍液以及甲基营养型芽胞杆菌300倍液均对番茄进行灌根处理。
具体灌根及叶面喷雾时间、间隔及次数详见表8。
表8.武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌NKG-1立体施用组合方式及施用时间
试验地进行正常的农事操作管理，最后一次叶面喷雾或灌根后10天调查棚内灰霉病发生情况，每组处理从10垄植株中各前中后挑选10株，统计得到每组处理样本数为100株。统计样本各级病叶数，计算病情指数及预防效果。棚内灰霉病为自然条件下发生。
番茄灰霉病的分级标准、统计方法及数据分析方法同实施例一。实验结束后，对实验组及对照组番茄灰霉病发生情况进行统计分析，结果见表9。
表9.武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌NKG-1不同立体施用组合对番茄灰霉病防治情况
注：实验组1-4和对照组具体施用方式按照表4进行。
结论：由上述实验结果发现，处理组一对番茄灰霉病的防治效果最好，即采用甲基营养型芽胞杆菌NKG-1灌根、武夷菌素叶面喷雾对番茄灰霉病的防控最有效，防治效果达到89.30％，该施用方式下，番茄灰霉病发生十分轻微。根据实验组1和组3比较发现，在武夷菌素均叶面喷雾时，甲基营养型芽胞杆菌NKG-1灌根效果优于喷雾，且差异性显著；根据实验组1与组4比较，在甲基营养型芽胞杆菌NKG-1进行菌液灌根时，武夷菌素叶面喷雾效果优于灌根，差异性显著，且武夷菌素叶面喷雾与灌根的区别高于甲基营养型芽胞杆菌NKG-1叶面喷雾和灌根效果差异。因此，通过上述比较分析发现，甲基营养型芽胞杆菌NKG-1较好的施用方式为灌根，武夷菌素较好的施用方式为叶面喷雾。推测灌根后甲基营养型芽胞杆菌NKG-1能够调动植株根系的有益微生物，提高菌株活力，以有益微生物提前占取生态位阻止灰霉病病原菌侵入，而武夷菌素喷施在叶片表面能够及时破坏白粉病病原菌菌丝体细胞膜结构，抑制分生胞子萌发，第一时间有效控制病原菌的发生。
至此，研究发现武夷菌素与甲基营养型芽胞杆菌NKG-1立体施用防治番茄灰霉病较好的施用方式为300倍的甲基营养型芽胞杆菌灌根，500倍的武夷菌素叶面喷雾，且施用时应以预防为主，在植株定植后即开始施用。
以上对本发明的多个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，其特征在于：步骤如下：
步骤一：用甲基营养型芽孢杆菌的菌液对待防治的作物进行灌根处理；
步骤二：用武夷菌素的菌液对所述待防治的作用进行叶面喷雾；
步骤三：重复所述步骤一至所述步骤二总计3-4次；
所述步骤一中甲基营养型芽孢杆菌的菌体密度为107cfu/mL，
所述步骤二中武夷菌素的含量为50ppm，
所述步骤一、所述步骤二、所述步骤三之间的时间间隔为10d。
2.根据权利要求1所述的防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，其特征在于：所述甲基营养型芽孢杆菌的制备方法为：
第一步，将保存于30％甘油中的甲基营养型芽孢杆菌按2％浓度接种于50mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床活化24h，制成种子液；
第二步，将种子液以1％接种量接种于250mL LB液体培养基中，置于28℃、220r/min摇床培养48h至菌体密度109cfu/mL时停止培养，稀释300-500倍。
3.根据权利要求1所述的防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，其特征在于：所述武夷菌素的制备方法为：
第一步，将武夷菌素产生菌接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液；
第二步，将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，用高效液相色谱法检测发酵液中武夷菌素含量；
第三步，将上述发酵液浓缩10倍，使得武夷菌素含量达10000ppm后加入起泡剂，稀释300-500倍使用。
4.根据权利要求3所述的防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，其特征在于：所述第一步中所述YEME培养基的制备方法为：
首先，将葡萄糖10g、麦芽提取物3g、酵母粉3g、胰蛋白胨5g和蔗糖340g混合，然后加蒸馏水至1000mL，进行121℃高温灭菌30min。
5.根据权利要求3所述的防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，其特征在于：所述第一步中所述发酵液培养基的制备方法为：将豆饼粉2g、(NH4)2SO4 0.4g、葡萄糖2g、玉米粉3g和CaCO3 0.3g混合，然后加蒸馏水至1000mL，进行121℃高温灭菌30min。
6.根据权利要求3所述的防治植物病害的微生物制剂喷施的方法，其特征在于：所述第二步中，所述发酵液中武夷菌素含量为1025-1055ppm。
7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的方法在防治黄瓜白粉病上的应用。
8.如权利要求1-6中任一权利要求所述的方法在防治番茄灰霉病上的应用。
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