CN108659076B - 一种从发酵液中分离武夷菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，包括以下步骤：1)将含有武夷菌素的发酵液去除其中的培养基固体残渣及菌体，得到上清液；2)利用草酸沉淀步骤1)得到的上清液中的杂质，之后离心，去除沉淀和杂质，得到溶液；3)将步骤2)得到的溶液采用大孔吸附树脂处理，收集流出液；4)将步骤3)收集的流出液通过凝胶层析处理，分别收集不同时间段流出的流出液；5)利用高效液相色谱法检测步骤4)收集的流出液，选择具有武夷菌素且无杂峰的流出液冻干，获得武夷菌素的粗品；6)用制备液相系统或半制备液相系统对5)冻干后的粗品进行制备、精制，获得高纯度武夷菌素。本发明具有提取率高、武夷菌素提取纯度高等优点。

Description

一种从发酵液中分离武夷菌素的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从发酵液中高效分离纯化武夷菌素的方法。

背景技术

武夷菌素是一种具有我国完全自主知识产权的低毒、高效、广谱、环保的新型农用抗生素，由不吸水链霉菌武夷变种发酵生产，是一种结构全新的水溶性的核苷类抗生素，其分子结构式为：

武夷菌素由中国农业科学院植物保护研究所自主研发，对蔬菜和果树等多种作物的真菌性病害具有明显的防治效果，在农业生产中得到了广泛的应用，创造了可观的经济、社会和生态效益。但是长期以来，由于武夷菌素是水溶性物质，极性很大，导致其分离提取困难，过去采用活性炭吸附、离子交换、氧化铝和凝胶LH-20层析等步骤，提取率很低，并且纯度也不高，只有70％左右，直接影响了其防病机理、化学结构修饰和改造、毒理、环境行为、防病抗病效用的提高等方面的研究，进而影响了武夷菌素的农药登记工作及其产业化。因此探索高效分离提取技术及建立新型提取工艺对于提高武夷菌素的工厂化生产水平，增强其市场竞争力，以及增强我国具有自主知识产权的生物农药创新能力具有现实的紧迫意义。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明的目的在于针对目前武夷菌素提取效率低，纯度低的问题，提出一种高效提取高纯度武夷菌素的方法，整个过程不使用有毒有害的化学有机试剂，具有提取率高、清洁、环保、简便、高效的特点，提取率较以有工艺大幅提高，纯度可以达到95％以上。同时由于武夷菌素是易溶于水的物质，极性大，本发明对于从发酵液里分离提取极性大的水溶性物质也具有重要的借鉴意义。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，包括以下步骤：

1)将含有武夷菌素的发酵液去除培养基固体残渣及菌体，得到上清液；

2)利用草酸沉淀步骤1)得到的上清液中的杂质，之后通过离心或过滤去除沉淀和杂质，得到溶液；

3)将步骤2)得到的溶液采用大孔吸附树脂处理，收集流出液；

4)将步骤3)收集的流出液通过凝胶层析处理，分别收集不同时间段流出的流出液；

5)利用高效液相色谱法检测步骤4)收集的流出液，选择具有武夷菌素且无杂峰的流出液冻干，获得武夷菌素的粗品。

本发明中，去除沉淀和杂质的方法可以为离心也可以为过滤，优选采用离心的方式去除沉淀和杂质，速度快且所需时间短。

本发明的有益效果为：

现有分离方法采用活性炭吸附除杂质，但是活性炭选择性较差，吸附能力太强，洗脱下来很困难，且易污染环境，该步骤造成武夷菌素大量损失。本发明采用大孔吸附树脂可以很好的克服上述问题，还具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，既能有效吸附色素等杂质，同时又不会吸附武夷菌素，将武夷菌素的损失降低到最小，从而提高武夷菌素的提取率。

现有方法采用离子交换、氧化铝层析，氨水洗脱的方法，步骤繁琐，分离效果欠佳。现有方法中ODS是以硅胶为基质键合的C18填料，同样适用于分离脂溶性、极性小的物质，不适合分离武夷菌素这样极性大的水溶性物质。

本发明创新性的采用大孔吸附树脂、凝胶层析处理、高效液相色谱法等方法，省去了离子交换、氧化铝层析，氨水洗脱、ODS等步骤，不仅保证了可以高效提取高纯度武夷菌素，而且整个过程不使用有毒有害的化学有机试剂，具有清洁、环保、简便、高效等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤2)中，大孔吸附树脂的型号为大孔吸附树脂HP20。

采用上述进一步方案的有益效果是：本发明采用大孔吸附树脂HP20，兼具吸附性和分子筛功能，利用分子间作用力，选择性好，既能有效吸附色素等杂质，同时又不会吸附武夷菌素，将武夷菌素的损失降低到最小。

进一步，在步骤5)获得武夷菌素的粗品之后，还包括以下步骤：利用制备液相法或半制备液相法对武夷菌素的粗品进行纯化。

采用上述进一步方案的有益效果是：通过纯化步骤，可以获得武夷菌素的纯品，本发明采用的方法具有武夷菌素纯度高、提取率高等优点。

进一步，对武夷菌素的粗品进行纯化的具体操作方法为：将步骤5)获得的武夷菌素的粗品用水复溶，采用半制备液相或制备液相系统进行制备，以除去组分中的杂质；液相条件为：CAPCELL PAK C18AQ色谱柱，色谱柱直径为10mm或20mm，色谱柱长度为250mm，色谱柱内填料的粒径为5μm，流速为2ml/min，检测波长254nm，进样量500μL至2ml，柱温25℃，流动相为质量分数为0.1％的三氟乙酸，在保留时间为15-16min处出现武夷菌素的峰，收集该峰，并冻干，即获得纯度大于95％的武夷菌素。

采用上述进一步方案的有益效果是：现有方法中用半制备液相精制武夷菌素采用的是YWG-Cl8的半制备柱子，不能采用纯水的流动相，武夷菌素的保留时间很短，很难将其中的水溶性的糖等杂质去掉。而本发明采用的是CAPCELL PAK C18AQ色谱柱，耐水性很好，流动相可以采用纯水，能有效增加武夷菌素的保留时间，从而很好地将其中的糖与武夷菌素分开，达到去除效果。

进一步，步骤4)中，通过凝胶层析处理的方法包括以下步骤：先采用凝胶Toyopearl HW-40C进行凝胶层析处理，再采用凝胶Toyopearl HW-40F进行凝胶层析处理。

采用上述进一步方案的有益效果是：现有方法中采用的葡聚糖凝胶G25适用于有机溶剂分离嗜脂性分子，不是很适合分离武夷菌素这种极性强的水溶性物质。本发明创新性地采用了凝胶Toyopearl HW-40C与Toyopearl HW-40F，二者是新型分子尺寸排阻凝胶树脂，具有亲水性，克服了通常凝胶压力低，流速慢的特点，适用于较大极性物质的分离，尤其是水溶性物质。

进一步，采用凝胶Toyopearl HW-40C进行凝胶层析处理的方法包括以下步骤：对凝胶Toyopearl HW-40C进行预处理，将步骤3)收集的流出液加入到装有凝胶ToyopearlHW-40C的凝胶层析柱中，液面高出凝胶Toyopearl HW-40C的上表面8-15cm，用水洗凝胶Toyopearl HW-40C，以5-6滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40C。待色素到凝胶层析柱底部，开始收集流出液，按照20-100ml/管收集流出液。

采用上述进一步方案的有益效果是：选择合适的参数有利于Toyopearl HW-40C的凝胶层析的处理效果。

进一步，采用凝胶Toyopearl HW-40F进行凝胶层析处理的方法包括以下步骤：对凝胶Toyopearl HW-40F进行预处理，将收集的流出液加入到装有凝胶Toyopearl HW-40F的凝胶层析柱，液面高出凝胶Toyopearl HW-40F的上表面8-15cm；用水洗凝胶Toyopearl HW-40F，以5-6滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40F，待色素到凝胶层析柱底部，开始收集流出液，按照20-100ml/管收集流出液。

采用上述进一步方案的有益效果是：选择合适的参数有利于保证Toyopearl HW-40F凝胶层析的效果。

进一步，步骤1)中，含有武夷菌素的发酵液的制备方法包括以下步骤：将不吸水链霉菌武夷变种CK15发酵60-72小时，收集发酵液。

采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述菌株发酵具有武夷菌素产量高等优点。

进一步，步骤2)中，利用草酸沉淀上清液中的杂质的方法包括以下步骤：加入草酸到上清液中，调PH至2.0-2.5，静置过夜。

采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述参数有利于让草酸与其中的钙离子充分结合，并使其中菌株代谢出来的蛋白质变性。

进一步，在步骤2)和步骤3)之间还包括利用高效液相分析以及武夷菌素的生物活性测定的步骤；和/或步骤3)和步骤4)之间还包括利用高效液相分析以及武夷菌素的生物活性测定的步骤；

利用高效液相分析的方法包括以下步骤：液相条件为YWG-Cl8色谱柱，色谱柱直径为4.6mm，色谱柱长度为250mm，色谱柱内填料的粒径为10μm)，流速为l ml/min，检测波长254nm，进样量20μL，柱温25℃，流动相为的三氯乙酸，三氯乙酸的浓度为1.4g/L，三氯乙酸的pH值为2.0；

武夷菌素的生物活性测定的方法包括以下步骤：在PDA培养基中加入深红酵母，混匀，倒平板，在平板上放置牛津杯，向牛津杯中加入200μL收集液，28℃培养箱静置培养2天，观察抑菌圈。

进一步，在步骤3)和步骤4)之间还包括将收集的流出液浓缩成膏状获得浓缩液的步骤，再将浓缩液用于步骤4)的凝胶层析处理；

或者步骤3)和步骤4)之间还包括将步骤3)收集的流出液冻干获得冻干粉，再将冻干粉复溶形成的溶液用于步骤4)的凝胶层析处理。

附图说明

图1为武夷菌素现有的工艺路线图；

图2为本发明分离武夷菌素的工艺路线图；

图3为草酸预处理发酵液的实验结果；

图4为分离组分的HPLC检测结果(保留时间为15.989min)；

图5为分离组分的分离组分的生物活性测定结果；

图6为武夷菌素的HPLC检测结果(保留时间为15.243min)；

图7为武夷菌素的生物活性测定结果；

图8为对比例1中武夷菌素的HPLC检测结果(保留时间为17.907min)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，可以包括以下具体步骤：

1、将不吸水链霉菌武夷变种CK15摇瓶发酵60-72小时，收集发酵液，然后将发酵液离心(9500rpm，15min)，去除其中的培养基固体残渣及菌体，取上清液；

2、加入草酸到上清液中，调PH至2.0-2.5，静置过夜；

3、将上清液离心(9500rpm，15mi n)，去除其中的蛋白质、多糖及草酸钙等沉淀物，取上清液，并进行HPLC分析和生物活性测定。液相条件为YWG-Cl8(4.6mm x 250mm，10μm)色谱柱，流速为l ml/min，检测波长254nm，进样量20μL，柱温25℃，流动相为的三氯乙酸(1.4g/L，pH 2.0)；

4、将上清液过大孔吸附树脂HP-20，去除其中的色素、蛋白质和多糖等杂质；

5、收集流出液，并进行HPLC分析和生物活性测定；

6、冻干，复溶后通过凝胶Toyopearl HW-40C进行分离；

7、对流出液HPLC分析和生物活性测定；

8、将其中杂质较少、活性较好的组分冻干，复溶，通过凝胶Toyopearl HW-40F进行分离；

9、收集流出液，并进行HPLC分析和生物活性测定；

10、将其中杂质较少、活性较好的组分采用CAPCELL PAK C18AQ色谱柱进行制备；

11、将制备出的组分冻干即得武夷菌素纯品。

本发明中，不吸水链霉菌武夷变种CK15，也可以称作不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15，记载于“王万群，武夷菌素生产菌CK-15细菌人工染色体(BAC)文库构建，2008.6.1”一文中。公众可以从中国农业科学院植物保护研究所获得，用于非商业目的的重复本发明实验。该菌株也记载于专利号为ZL201510140981.4的名称为“一株生物农药武夷菌素的高产菌株W-273及其应用”的发明专利中。

下面通过一些具体的实施例来进行介绍

实施例1

1、武夷菌素产生菌株的发酵培养

用手术刀将武夷菌素产生菌株——不吸水链霉菌武夷变种CK15从MS培养基上切取2cm²接种到装有200ml发酵培养基的三角瓶中，在28℃，220rpm摇床上震荡培养64h，共发酵30瓶。

MS培养基成分为：甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，琼脂粉20g/L。

发酵培养基成分为：玉米粉20g/L，黄豆粉25g/L，葡萄糖25g/L，碳酸钙4g/L。

2、武夷菌素的粗提

(1)发酵液的预处理：将30瓶发酵液常温离心(9500rpm，15min)，去除其中的培养基残渣及菌体，共收集到4.8L发酵液，经HPLC测定，效价为1100ppm；

(2)在发酵液中加入草酸，调PH至2.0～2.5，静置过夜，让草酸与其中的钙离子充分结合，并使其中菌株代谢出来的蛋白质变性；

(3)将发酵液常温离心(9500rpm，15min)，去除其中的草酸钙沉淀、蛋白质和部分多糖等杂质(实验结果见图3)，经HPLC测定，效价为1056ppm；

(4)大孔吸附树脂HP20的预处理：先采用0.5BV的乙醇浸泡树脂24h(1BV为1个树脂床体积；再采用2BV的乙醇以2BV/h流速通过树脂柱；然后用乙醇2BV/h的流速洗涤树脂至流出液不呈白色混浊(如果有)为止。再用水以同样流速洗净；最后在洁净的分离柱内，放入已去除外来杂质，体积恒定的大孔吸附树脂，用水或低比例有机溶剂平衡2BV后，即可上样使用。

(5)将离心后的发酵液以100-120滴/分钟的速度通过大孔吸附树脂HP20，收集流出液，流出液体积为5L；

(6)将收集液进行HLPC检测及生物活性测定。HPLC的方法为YWG-Cl8(4.6mm x250mm，10μm)色谱柱，流速为l.2ml/min，检测波长254nm，进样量20μL，柱温25℃，流动相为的三氯乙酸(1.4g/L，pH 2.0)，在保留时间为15-16min处出现武夷菌素的峰，测定效价为890ppm。生物活性的测定方法为：在PDA培养基中加入深红酵母，混匀，倒平板，在平板上放置牛津杯，向牛津杯中加入200μL收集液，28℃培养箱静置培养2天，观察抑菌圈，抑菌圈直径为32mm；

(7)将收集液用旋蒸仪旋蒸浓缩至膏状(48℃，-0.09MPa)，共获得75ml膏状物质；

(8)凝胶Toyopearl HW-40C的预处理：采用2BV的水以2BV/h流速通过凝胶，用水平衡2BV后，即可上样使用；

(9)将膏状浓缩物加入到凝胶层析柱，液面高出凝胶10cm左右。用水洗凝胶，以5-6滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40C。待色素到层析柱底部，开始收集流出液，按照20-30ml/管；

(10)将收集液按照上述方法进行HPLC(实验结果见图4)和生物活性检测(实验结果见图5)。把其中生物活性好的，保留时间15-16min处峰面积大的组分冻干；

(11)凝胶Toyopearl HW-40F的预处理：采用2BV的水以2BV/h流速通过凝胶，用水平衡2BV后，即可上样使用；

(12)将冻干的组分加50ml水复溶后加入到凝胶层析柱，液面高出凝胶10cm左右。用水洗凝胶，以5-6滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40F。待色素到层析柱底部，开始收集流出液，按照20-30ml/管；

(14)将收集液按照上述方法进行HPLC和生物活性检测。把其中生物活性好的，保留时间15-16min处峰面积大，并且杂峰少的组分冻干，即得到武夷菌素的粗品，重量为2.6g。

3、武夷菌素的纯化

(1)将冻干的组分用20ml水复溶，用Waters半制备液相系统e2695进行制备，以除去组分中的杂质。液相条件为：CAPCELL PAK C18AQ(10mm x 250mm，5μm)色谱柱，流速为2ml/mi n，检测波长254nm，进样量500μL，柱温25℃，流动相为0.1％的三氟乙酸，在保留时间为15-16min处出现武夷菌素的峰，收集该峰，并冻干，共获得纯度大于95％的武夷菌素，重量为87.8mg；

(2)将组分按照上述分析方法进行HPLC检测(实验结果见图6)和生物活性测定(实验结果见图7)。图6中可以看出保留时间在15-16min处出峰，且杂峰极少，说明获得纯度好的武夷菌素，从图7可以看出，武夷菌素具有明显的抑菌作用。

实施例2

1、武夷菌素产生菌株的发酵培养

(1)菌种培养：接种CK15到10个直径9cm的MS平板上，28℃培养7天，然后用50ml无菌水将孢子洗脱到200ml的三角瓶中；

MS培养基成分同实施例1。

(2)种子液培养：将上述孢子液接种到50L的发酵罐，内有30L培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.5，罐压0.1kg/cm²的条件下培养24h，得到种子液；

培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，蔗糖260g/L。

(3)发酵罐培养：将生长旺盛的的一级种子液转入到500L的发酵罐中，内有300L发酵培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.55，罐压0.12kg/cm²的条件下发酵60h，得到武夷菌素的发酵液。

发酵培养基成分同实施例1。

2、武夷菌素的粗提

(1)发酵液的预处理：将330L发酵液用200目的筛子过滤，去除其中的培养基残渣及菌体，收集到300L滤液,效价980ppm；

(2)在发酵液中加入草酸，调PH至2.0～2.5，静置过夜，让草酸与其中的钙离子充分结合，并使其中菌株代谢出来的蛋白质变性；

(3)将发酵液采用管式离心机常温离心(10000rpm，15min)，去除其中的草酸钙沉淀、蛋白质和部分多糖等杂质,测定效价为926ppm；

(4)对大孔吸附树脂HP20预处理，处理方法同实施例1，将离心后的发酵液用提取和蒸发机组浓缩到60L，然后以120-150滴/分钟的速度通过大孔吸附树脂HP20，收集流出液；

(6)将收集液进行HLPC检测及生物活性测定，方法同实施例1，测定效价为3560ppm；

(7)将收集液用旋蒸仪旋蒸浓缩至膏状，浓缩条件为48℃，-0.09Mpa，共获得4L膏状物质；在分离活性物质时，温度不能太高，太高易引起物质分解，也不能太低，否则浓缩效率低，一般要控制在40℃-50℃，优选的，采用48℃浓缩效果会更好；真空度越低，浓缩的越快，这个参数是一般真空泵能达到的较高的真空度；

(8)凝胶Toyopearl HW-40C的预处理方法同实施例1，将膏状浓缩物加入到预处理好的凝胶Toyopearl HW-40C层析柱，液面高出凝胶10cm左右。用水洗凝胶，以10-12滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40C。待色素到层析柱底部，开始用三角瓶收集流出液，按照80-100ml/瓶；

(9)将收集液按照上述实施例1的方法进行HPLC和生物活性检测。把其中生物活性好的，保留时间15-16min处峰面积大的组分冻干，共获得4612.6g干粉；

(10)凝胶Toyopearl HW-40F的预处理的方法同实施例1，将冻干的组分加4L水复溶后加入到凝胶Toyopearl HW-40F层析柱，液面高出凝胶10cm左右。用水洗凝胶，以10-12滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40F。待色素到层析柱底部，开始用三角瓶收集流出液，按照80-100ml/瓶；

(14)将收集液按照上述方法进行HPLC和生物活性检测。把其中生物活性好的，保留时间15-16min处峰面积大，并且杂峰少的组分冻干，得到146.7g武夷菌素的粗品。

3、武夷菌素的纯化

(1)将冻干的组分用水复溶，用Waters制备液相系统2535Q进行制备，以除去组分中的杂质。液相条件为：CAPCELL PAK C18AQ(20mm x 250mm，5μm)色谱柱，流速为4ml/min，检测波长254nm，进样量2ml，柱温25℃，流动相为0.1％的三氟乙酸，在保留时间为15-16min处出现武夷菌素的峰，收集该峰，并冻干，共获得5.2g武夷菌素；

(2)将组分按照上述分析方法进行HPLC检测,武夷菌素纯度大于95％。将其配成1000ppm，测定生物活性，抑菌圈直径为20.1mm。

HPLC检测和生物测定方法同实例1。

对比例

1、武夷菌素产生菌株的发酵培养

(1)菌种培养：接种CK15到10个直径9cm的MS平板上，28℃培养7天，然后用50ml无菌水将孢子洗脱到200ml的三角瓶中；

MS培养基成分同实例1.

(2)发酵罐培养：将上述孢子液转入到50L的发酵罐中，内有35L发酵培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.55，罐压0.12kg/cm²的条件下发酵72h，得到武夷菌素的发酵液。

发酵培养基成分同实例1。

2、武夷菌素的粗提

(1)发酵液的预处理：将35L发酵液常温离心(9500rpm，15min)，去除其中的培养基残渣及菌体，共收集到30L发酵液，经HPLC测定，效价为1076ppm；

(2)在发酵液中加入草酸，调PH至2.0至2.5，静置过夜，让草酸与其中的钙离子充分结合，并使其中菌株代谢出来的蛋白质变性；

(3)将发酵液常温离心(9500rpm，15min)，去除其中的草酸钙沉淀、蛋白质和部分多糖等杂质，测定效价为1023ppm；

(4)将离心后的发酵液以120-150滴/分钟的速度通过活性炭，收集流出液，收集到35L；

(5)将收集液进行HLPC检测，方法同实例1，测定效价为277ppm，72.9％的武夷菌素被吸附到活性炭上。用30％的丙酮洗脱，收集5L流出液，测定效价，仅为23.5ppm；用50％的丙酮洗脱，收集5L流出液，测定效价，仅为25.7ppm；用90％的丙酮洗脱，收集5L流出液，测定效价，仅为33.2ppm。表明用活性炭吸附武夷菌素，由于其吸附力太强，72.9％的武夷菌素被吸附到活性炭上，洗脱不下来，故只能用步骤(4)收集到的流出液继续进行后续分离；

(6)732阳离子交换树脂的预处理：采用2N的HCl以2BV/h流速通过树脂，洗1小时；然后用2N的NaOH以2BV/h流速通过树脂，洗一小时。最后用蒸馏水以2BV/h流速洗涤树脂至流出液澄清为止，即可上样使用。

(7)将收集液用旋蒸仪旋蒸浓缩至5L(48℃，-0.09MPa)；

(8)将浓缩后的发酵液以50-80滴/分钟的流速通过732阳离子交换树脂，用3L水洗脱后，开始用0.5N的氨水洗脱，当流出液PH大于7.0时开始收集流出液，收集5L，测定效价为1062ppm；

(9)将收集液通过中性氧化铝，用1L水洗脱后，再用3％的氨水洗脱，当有深棕色流出液流出时开始收集，一共收集3L，测定效价为1235ppm；

(10)将收集液浓缩至500ml，加入到LH-20凝胶中，用蒸馏水洗脱，控制流速18-23滴/分钟，收集流出液较深的部分，共收集到300ml，测定效价为1113ppm；

(11)将300ml收集液加入到葡聚糖凝胶G-25中，用蒸馏水洗脱，控制流速15-25滴/分钟，收集流出液较深的部分，共收集到230ml，测定效价为1327ppm；

(12)将230ml收集液加入到葡聚糖凝胶G-25中，用蒸馏水洗脱，控制流速15-25滴/分钟，收集流出液较深的部分，共收集到200ml，测定效价为1327ppm；

(13)将200ml收集液加入到ODS中，用蒸馏水洗脱，控制流速15-25滴/分钟，收集流出液较深的部分，共收集到180ml，测定效价为1115ppm；

(14)将收集液用冻干机冻干，获得3.6g武夷菌素粗品。

3、武夷菌素的纯化

(1)将冻干的组分用20ml水复溶，用Waters制备液相系统2535Q进行制备，以除去组分中的杂质。液相条件为：Waters，BONDAPAKTM C18(20mm×300mm，5μm)色谱柱，流速为3ml/min，检测波长254nm，进样量2ml，柱温25℃，流动相为0.03％的三氟乙酸，在保留时间为17min左右处出现武夷菌素的峰，收集该峰，并冻干，共获得126.7mg武夷菌素；

(2)将组分按照上述分析方法进行HPLC检测，还有一些杂峰(图8)，纯度大约70％。将其配成1000ppm，测定生物活性，抑菌圈直径为22.3mm。

HPLC检测和生物测定方法同实例1。

总结：由实施例1、实施例2和对比例的对比可以看出，在三次发酵液效价基本相同的情况下，用对比例的方法从30L发酵液里只能提取出126.7mg武夷菌素，并且纯度只有70％左右。用本发明的方法，从4.8L发酵液里能提取出87.8mg武夷菌素，提取效率提高至对比例的提取效率的4.33倍，并且纯度达到95％以上。从300L发酵液里能提取出5.2g武夷菌素，提取效率提高至对比例提取效率的4.11倍，并且纯度达到95％以上。

发明人在实施例2的基础上，将步骤1(3)的发酵时间调整为72小时，步骤2(8)和步骤2(10)均调整为按30-80ml/每瓶收集流出液，液面高出凝胶15cm；其他均与实施例2相同。经研究发现与实施例1和实施例2的结果类似，从300L发酵液里能提取出5.4g武夷菌素,提取效率提高至对比例提取效率的4.26倍，并且纯度达到95％以上，也具有提取率高、纯度高等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将含有武夷菌素的发酵液去除其中的培养基固体残渣及菌体，得到上清液；

2)利用草酸沉淀步骤1)得到的上清液中的杂质，之后离心或过滤，去除沉淀和杂质，得到溶液；

3)将步骤2)得到的溶液采用大孔吸附树脂处理，收集流出液；

4)将步骤3)收集的流出液通过凝胶层析处理，分别收集不同时间段流出的流出液；通过凝胶层析处理的方法包括以下步骤：先采用凝胶Toyopearl HW-40C进行凝胶层析处理，再采用凝胶Toyopearl HW-40F进行凝胶层析处理；

5)利用高效液相色谱法检测步骤4)收集的流出液，选择具有武夷菌素且无杂峰的流出液冻干，获得武夷菌素的粗品；

上述武夷菌素的分子结构式为：

2.根据权利要求1所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，在步骤5)获得武夷菌素的粗品之后，还包括以下步骤：利用制备液相法或半制备液相法对武夷菌素的粗品进行纯化。

3.根据权利要求2所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，对武夷菌素的粗品进行纯化的具体操作方法为：将步骤5)获得的武夷菌素的粗品用水复溶，采用半制备液相系统或制备液相系统进行制备，以除去组分中的杂质；液相条件为：CAPCELL PAKC18 AQ色谱柱，色谱柱直径为10mm或20mm，色谱柱长度为250mm，色谱柱内填料的粒径为5μm，流速为2-4ml/min，检测波长254nm，进样量500μL至2mL，柱温25℃，流动相为质量分数为0.1％三氟乙酸，在保留时间为15-16min处出现武夷菌素的峰，收集该峰，并冻干，即获得纯度大于95％的武夷菌素。

4.根据权利要求1-3任一项所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，采用凝胶Toyopearl HW-40C进行凝胶层析处理的方法包括以下步骤：对凝胶Toyopearl HW-40C进行预处理，将步骤3)收集的流出液加入到装有凝胶Toyopearl HW-40C的凝胶层析柱中，液面高出凝胶Toyopearl HW-40C的上表面8-15cm，用水洗凝胶Toyopearl HW-40C，以5-12滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40C， 待色素到凝胶层析柱底部，开始收集流出液，按照20-100ml/管收集流出液。

5.根据权利要求4所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，采用凝胶Toyopearl HW-40F进行凝胶层析处理的方法包括以下步骤：对凝胶Toyopearl HW-40F进行预处理，将收集的流出液加入到装有凝胶Toyopearl HW-40F的凝胶层析柱，液面高出凝胶Toyopearl HW-40F的上表面8-15cm；用水洗凝胶Toyopearl HW-40F，以5-12滴/分钟的速度通过凝胶Toyopearl HW-40F，待色素到凝胶层析柱底部，开始收集流出液，按照20-100ml/管收集流出液。

6.根据权利要求1-3任一项所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，步骤1)中，含有武夷菌素的发酵液的制备方法包括以下步骤：将不吸水链霉菌武夷变种CK15发酵60-72小时，收集发酵液。

7.根据权利要求1-3任一项所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，步骤2)中，利用草酸沉淀上清液中的杂质的方法包括以下步骤：加入草酸到上清液中，调pH至2.0-2.5，静置过夜。

8.根据权利要求1-3任一项所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)之间还包括利用高效液相分析以及武夷菌素的生物活性测定的步骤；和/或步骤3)和步骤4)之间还包括利用高效液相分析以及武夷菌素的生物活性测定的步骤；

利用高效液相分析的方法包括以下步骤：液相条件为YWG-Cl8色谱柱，色谱柱直径为4.6mm，色谱柱长度为250mm，色谱柱内填料的粒径为10μm，流速为lml/min，检测波长254nm，进样量20μL，柱温25℃，流动相为的三氯乙酸，三氯乙酸的浓度为1.4g/L，三氯乙酸的pH值为2.0；

武夷菌素的生物活性测定的方法包括以下步骤：在PDA培养基中加入深红酵母，混匀，倒平板，在平板上放置牛津杯，向牛津杯中加入200-250μL收集液，28℃培养箱静置培养2天，观察抑菌圈。

9.根据权利要求1-3任一项所述一种从发酵液中分离武夷菌素的方法，其特征在于，在步骤3)和步骤4)之间还包括将收集的流出液浓缩成膏状获得浓缩液的步骤，再将浓缩液用于步骤4)的凝胶层析处理；

或者步骤3)和步骤4)之间还包括将步骤3)收集的流出液冻干获得冻干粉，再将冻干粉复溶形成的溶液用于步骤4)的凝胶层析处理。

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