KR101202379B1

KR101202379B1 - 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법

Info

Publication number: KR101202379B1
Application number: KR1020100138568A
Authority: KR
Inventors: 김창호; 정용진; 권득문; 이광섭
Original assignee: (주)에이치앤에이치바이온
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2012-11-16
Also published as: KR20120076840A

Abstract

본 발명은 고순도 라파마이신의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세히 설명하면 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주를 배양하고 그 균체를 회수하여 아세톤으로 추출한 후, 결정화방법을 이용하여 크로마토그라피 공정에 부담을 주는 고분자 검(gum) 성분을 미리 제거하고, HP-20 및 CG161M 흡착수지를 이용하여 차례로 크로마토그래피를 실시하여 불순물을 제거한 다음, 에테르 용액으로 용매 교체하여 라파마이신 결정을 수득함으로써, 고가의 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하지 않고서도 저렴하고 간편한 공정으로 고순도의 라파마이신을 수득할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법{A process for preparing high purity rapamycin by using multi-step crystallizing method}

일반적으로 면역억제제란 항원의 자극에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 억제하거나 저하시킬 목적으로 사용되는 여러 가지 약리학적 물질을 의미한다. 따라서 장기이식 기술의 발달은 필연적으로 면역억제제 시장을 크게 증가시킨다. 실제로 장기이식과 관련된 면역학의 역사는 불과 40여년 밖에 되지 않지만, 의학분야 가운데서 가장 빠른 시일내에 고도의 발전을 가져온 분야 중의 하나라고 할 수 있으며, 현재에도 계속적인 연구와 발전이 거듭되고 있다.

또한 면역억제제는 장기이식 분야 이외에 루프스나 천식, 당뇨병 등 자가 면역질환의 치료분야에도 점차 사용이 증가되고 있다. 현재 면역억제제시장을 장악하고 있는 3대 면역억제제는 사이크로스포린에이(Cyclosporin A)와 타크로리무스(Tacrolimus), 그리고 마이코페놀레익 엑시드(Mycophenolic Acid)를 이용하여 합성되는 마이코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate mofetil)이다. 2003년 전 세계 면역억제제의 시장은 약 30억 달러, 그리고 국내에서는 약 300억 원 정도의 시장을 형성하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 가운데 사이크로스포린 에이, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸이 전체 시장의 80% 이상을 점유하고 있다. 라파마이신(Rapamycin)은 상기 세계 3대 면역억제제의 차순위를 차지하고 있는 제품으로서, 국내에서는 희귀성 의약품으로 분류되어 있다.

다음 화학식 1로 표시되는 라파마이신은 시롤리무스(Sirolimus)라고도 알려져 있으며, 1975년 아이어스트(Ayerst)사가 이스터섬의 흙에서 발견된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)를 이용하여 처음으로 생산하였고, 그 후 미국의 와이어스(WYETH)사가 라파뮨(Rapamune: 1mg/ml solution, oral tablet 1mg, 2mg/Tab.)이라는 상표명으로 발매하였다.

상기 라파뮨은 기존의 사이크로스포린에이(Cyclosporin A)나 타크로리무스(Tacrolimus)가 약효를 발휘하지 못하는 환자들에게 주로 사용되고 있으며, 특히 장기 이식 초기 강력한 면역억제 작용이 필요한 경우에 효과적으로 사용되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상대적으로 기존의 면역억제제에 비하여 독성이 높아 장기적으로 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서 라파마이신 보다 독성이 낮고 약효가 우수한 새로운 유도체에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 예컨대 에버로리무스(Everolimus), 조타로리무스(Zotarolimus) 등이 라파마이신을 원료로 사용하여 개발된 유도체들이다.

종래에도 미국특허 제5,508,398호 및 제5,616,595호 등에서 라파마이신을 생산하는 방법이 소개되어 있으나, 이러한 방법들은 전체적인 공정이 매우 복잡하고, 최종 수득물의 순도도 높지 않아서 개선의 여지가 남아 있었다.

최근 국내에 공개된 바이오콘 리미티드사의 특허공개 제10-2009-0080110호(공개일자; 2009년07월23일)에는 총 불순물 함량이 1.2% 미만인 순수 형태의 라파마이신을 회수 및 정제하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법에서는 고가 장비인 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography)를 사용해야 하기 때문에 제조원가가 높고, 이를 산업적으로 활용하기는 곤란한 문제가 있었다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 고가의 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하지 않고서도 저렴하고 간편한 공정으로 산업적으로 이용가능한 고순도의 라파마이신을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 기술적 과제는 결정화 방법을 이용하여 크로마토그라피 공정에 부담을 주는 고분자 검(gum) 성분을 미리 제거하고, 동시에 특징적인 흡착수지를 이용하여 반복적인 크로마토그라피 공정을 실시함으로써 달성하게 되었다.

본 발명에 따른 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법은, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 균주를 배양하여 균체를 회수하고, 상기 균체에 아세톤을 투입하여 라파마이신 함유 아세톤 추출액을 얻는 배양 및 추출단계와; 상기 아세톤 추출액을 농축하고 8~12℃의 온도에서 10~24시간 교반하여 고분자 검(gum) 성분을 석출, 제거한 후, HP-20 흡착수지로 크로마토그래피를 실시하여 불순물을 제거하는 1차 정제단계와; 상기 1차 정제단계에서 얻어진 생성물을 농축하고 8~12℃의 온도에서 10~24시간 교반하여 잔여 검 성분을 석출, 제거한 후, CG161M 흡착수지로 크로마토그래피를 실시하여 잔여 불순물을 제거하는 2차 정제단계와; 상기 2차 정제단계에서 얻어진 생성물을 농축하여 수불용성 슬러지(Sludge)를 얻고, 상기 슬러지를 에테르 용액에 용해시킨 후 다시 농축하여 라파마이신 결정을 얻는 결정화 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 라파마이신의 제조방법은 고가의 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하지 않고서도 저렴하고 간편한 공정으로 고순도의 라파마이신을 고효율로 수득할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 라파마이신의 정제방법은 배양 및 추출 단계와, 1차 및 2차 정제 단계와, 결정화 단계로 분류할 수 있다. 본 발명은 각 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

A. 배양 및 추출 단계

온도와 pH를 자동으로 조절하면서 산소를 공급할 수 있는 발효조를 이용하여 파라마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)를 배양하고, 원심분리기 또는 균체여과기를 이용하여 상기 균체를 분리, 회수한다. 이어 회수된 균체에다 균체 부피에 대하여 아세톤을 투입하고, 2~3시간 정도 충분히 교반하여 균체에 포함되어 있는 라파마이신을 추출한다.

이때, 아세톤의 투입량에 따라 라파마이신의 회수율이 달라지는데, 만일 아세톤의 투입량이 균체 부피의 1배량 미만이면 라파마이신의 회수율이 너무 저조하여 최종 목적물의 수율이 낮아지는 문제가 있고, 반대로 4배량을 초과하면 아세톤의 사용량 증가에 비해 회수율 증가가 미미하여 효율적이지 못하다. 실험 결과, 2~4배량 이상의 아세톤을 사용할 경우 95~96% 정도의 라파마이신이 회수되므로 아세톤의 사용량은 균체 부피의 2~4배량을 사용하는 것이 가장 효율적이다.

B. 1차 정제 단계

상기 배양 및 추출 단계에서 얻어진 아세톤 추출액에서 균체나 고형배지와 같이 비용해성 물질들을 제거하여 투명한 라파마이신 함유 아세톤 용액을 얻는다. 이어, 감압증발설비를 이용하여 상기 라파마이신 함유 아세톤 용액에서 아세톤을 증발시킨다. 이때, 투명하던 용액이 뿌옇게 변하기 시작하면 라파마이신 결정이 생기기 시작하는 것이므로 바로 농축을 멈춘다. 이렇게 하면 라파마이신의 농도가 20 g/L 이상으로 농축된다.

이렇게 하여 얻어진 농축 아세톤 용액을 온도가 8~12℃인 냉장실에 넣고, 서서히 교반하면서 10~24시간 정도 정체시키면 고분자 물질인 검(Gum) 성분이 석출된다. 이때 라파마이신의 결정이 석출되지 않도록 주의한다. 상기 검 성분은 장차 크로마토그라피의 운영에 나쁜 영향을 주기 때문에 따로 분리하여 제거한다.

다음은 상기 농축 아세톤 용액을 HP-20(일본 미쓰비시 케미칼) 흡착수지가 충전된 크로마토그라피 컬럼에 통과시킨다. 상기 HP-20 수지는 1L당 15~20g의 라파마이신을 흡착한다. 그리고, 먼저 50% 아세톤 용액으로 상기 HP-20 수지를 세척하여 불순물과 색소성분을 분리 제거하고, 이어서 70% 아세톤 용액을 사용하여 상기 HP-20 수지에서 라파마이신을 용출시킨다. 이렇게 하면, 상기 50% 아세톤 용액은 상기 HP-20 수지에서 불순물과 색소성분만 분리시키고, 70% 아세톤 용액은 정제된 라파마이신만 분리시킨다.

C. 2차 정제 단계

상기 1차 정제단계에서 얻어진 생성물, 즉 라파마이신 함유 아세톤 용액에서 다시 아세톤을 증발시켜 라파마이신의 농도가 20 g/L 이상으로 농축된 아세톤 용액을 얻는다. 그리고, 상기 농축 아세톤 용액을 온도가 8~12℃로 유지되는 냉장실에서 서서히 교반하면서 10~24시간 동안 정체시키면서 잔여 검 성분이 석출된다. 상기 검 성분은 따로 분리하여 제거한다.

이렇게 얻어진 라파마이신 함유 아세톤 농축액을 CG161M(미국 로멘하스사 제품) 흡착수지가 충전된 크로마토그라피 컬럼에 통과시킨다. 상기 CG161M수지는 1L당 25~30g의 라파마이신을 흡착한다. 그리고, 먼저 50% 아세톤 용액으로 상기 흡착수지를 세척하여 색소 및 불순물을 제거하고, 이어 60% 아세톤 용액을 사용하여 상기 CG161M 수지에 흡착되어 있는 라파마이신을 용출시킨다.

D. 결정화 단계

상기 2차 정제단계에서 얻어진 생성물, 즉 라파마이신 함유 아세톤 용액을 감압 농축하여 아세톤을 완전히 증발시키면 수불용성 라파마이신 슬러지(Sludge)가 얻어진다. 상기 슬러지를 에테르(Ether) 용매에 투입하여 라파마이신을 완전히 용해하여 라파마이신 함유 에테르 용액을 얻고, 분액 깔데기를 이용하여 용액에 존재하는 물을 완전히 제거한다.

이어 예컨대 감압증발기를 이용하여 상기 라파마이신 함유 에테르 용액에서 에테르를 증발시키되, 투입된 에테르(Ether)의 90%를 증발시켜 제한다. 그리고, 이렇게 하여 얻어진 에테르 농축액을 4℃의 저온실에서 서서히 교반하면서 12시간 동안 결정화 하면, 본 발명의 목적물인 라파마이신 결정이 얻어진다. 상기 라파마이신 결정을 상온 진공건조기에서 건조하면 분말상태의 고순도 라파마이신이 수득된다.

상기와 같은 본 발명의 라파마이신 정제 방법에 따라서 제조되는 라파마이신 분말은 라파마이신 B의 함량이 95.5% 이상, 라파마이신 A의 함량이 1.0~1.5%, 라파마이신 C의 함량이 2.2~3.0% 인 고순도 라파마이신인 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 국한되는 것은 아니다.

균체로부터 라파마이신의 회수

온도와 pH를 자동으로 조절하면서 산소를 공급할 수 있는 50L 발효조에서 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 균주를 배양하여 32.0L의 배양액을 얻고, 원심분리기를 이용하여 균체를 회수하였다. 상기 발효액에 함유되어 있는 라파마이신 농도는 520mg/L로서, 전체 생산된 라파마이신의 양은 16.64g 이였다. 이때, 원심분리를 한 상등액에는 라파마이신이 존재하지 않았고, 회수된 균체의 부피는 8.2L 이었다.

상기 균체를 2L씩(라파마이신 4.06 g 함유) 4개의 배치(Batch)로 분리하고, 각 배치에다 아세톤 2L(균체와 동일량), 4L(2배량), 6L(3배량) 및 8L(4배량)을 투입하여 균체로부터 생산된 라파마이신을 추출하였다.

다음 표 1에서 보는 바와 같이, 아세톤의 사용량에 따라 라파마이신의 회수율이 달라졌으며, 2 ~ 4배량의 아세톤을 사용할 경우, 95% 이상의 라파마이신이 회수되었다.

아세톤 투입량	1배량(2L)	2배량(2L)	3배량(6L)	4배량(8L)
라파마이신 회수량(g)	3.10	3.86	3.89	3.91
회수율 (%)	76.5	95.1	95.8	96.2

검 성분 제거를 위한 석출조건 최적화 실험

감압농축기를 이용하여 상기 공정에서 얻어진 라파마이신 함유 아세톤 추출액을 농축하되, 라파마이신 결정이 생기기 직전까지 감압 농축하여 라파마이신의 농도가 20.5 g/L 인 농축액을 얻었다.

상기 농축액에서 장차 크로마토그라피의 운영에 나쁜 영향을 주는 고분자 물질인 검(Gum)성분을 제거하기 위하여 5℃, 8℃, 12℃, 16℃, 20℃에서 각각 검 석출 실험을 실시하였다. 즉, 각 온도별 항온조에서 상기 농축액을 각각 12시간 동안 서서히 교반하면서 검 석출 작업을 수행하였다.

그 결과, 다음 표 2에서 보는 바와 같이 5℃에서는 라파마이신과 검성분이 동시에 결정이 만들어져 검 성분만 효과적으로 제거하는 것이 불가능 하였다. 8℃, 12℃에서는 라파마이신의 결정이 거의 이루어지지 않았으며, 검 성분이 잘 석출되었다. 하지만 16℃ 이상에서는 검 성분의 석출과 라파마이신의 결정이 동시에 이루어지지 않았다. 따라서 상기 농축액에서 검 성분을 효과적으로 제거하기 위한 온도조건은 8~12℃ 임을 확인하였다.

결정화 온도	5℃	8℃	12℃	16℃	20℃
검 성분	석출	석출	석출	무석출	무석출
라파마이신	결정	무결정	무결정	무결정	무결정

HP -20 흡착수지를 이용한 색소 및 불순물 제거

HP-20(일본 미쓰비시 케미칼사 제품) 흡착수지로 충전된 크로마토그라피 컬럼에다 상기 공정에 따라 얻어진 검 성분이 제거된 라파마이신 함유 아세톤 용액을 통과시켜 라파마이신을 상기 수지에 흡착시켰다. 이때, 상기 HP-20 수지는 1L당 15~20g의 라파마이신을 흡착시키는 것으로 확인되었다.

이어 50% 아세톤 용액을 이용하여 HP-20 수지를 세척하여 색소와 불순물을 제거하였다. 이때 사용된 50% 아세톤의 양은 HP-20 수지 양의 2배 량이 사용되었다. 다음으로 상기 HP-20 수지와 동일량의 70% 아세톤 용액을 사용하여 수지에 흡착된 라파마이신을 완전히 분리하였다.

검 성분을 제거하기 위한 2차 석출작업

상기 공정에서 얻어진 라파마이신 함유 아세톤 용액을 다시 감압 농축하여 아세톤을 증발시켰다. 그리고, 상기 실시예 2의 결과에 따라 8~12℃의 저온에서 약 18시간 동안 교반한 후, 그 과정에서 생성된 검 성분은 원심분리 또는 필터를 이용하여 완전히 제거하였다.

CG161M 수지를 이용한 고순도 라파마이신 정제

CG161M(미국 로멘하스사 제품) 흡착수지로 충전된 크로마토그라피 컬럼에다 상기 공정에서 얻어진 라파마이신 함유 아세톤 용액을 통과시켜서 라파마이신을 상기 수지에 흡착시켰다. 이때, 상기 CG161M 수지에는 1L당 25~30g의 라파마이신이 흡착되는 것으로 확인되었다.

이어 50% 아세톤 용액을 이용하여 상기 상기 CG161M 수지를 세척하여 색소 및 불순물을 제거하였다. 이때 사용된 50% 아세톤의 양은 상기 CG161M 흡착수지의 2배량을 사용하였다. 다음으로 60% 아세톤 용액을 사용하여 상기 CG161M 수지에 흡착되어 있는 라파마이신을 완전히 분리하였다.

라파마이신 결정화 및 그 분말의 수득

상기 공정에서 얻어진 라파마이신 함유 아세톤 용액을 다시 감압 농축하여 아세톤을 완전히 증발시킨 후, 수불용성 결정 형태로 존재하는 라파마이신 슬러지를 얻었다. 상기 라파마이신 슬러지에 에테르를 주입하여 라파마이신을 용해시킨 후, 분액 깔때기를 이용하여 물을 완전히 제거하였다.

이어 감압 증발장치를 사용하여 상기 에테르 용액 중에서 에테르 투입량의 90%를 증발시킨 후, 서서히 교반하면서 온도가 4℃인 저온실에서 12시간 동안 결정화를 실시하였다. 이렇게 하여 얻어진 라파마이신 결정을 여과기로 여과하고, 감압 상온건조기를 이용하여 에테르를 제거하여 라파마이신 분말을 얻었다.

상기 라파마이신 분말을 아세톤에 용해하여 HPLC 분석을 실시한 결과, 라파마이신 B의 함량이 95.5% 이상, 라파마이신 A의 함량이 1.0~1.5%, 라파마이신 C의 함량이 2.2~3.0% 인 고순도 라파마이신인 것으로 확인되었다.

Claims

스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 균주를 배양하여 균체를 회수하고, 상기 균체에 대하여 2~4배량의 아세톤을 투입하여 라파마이신 함유 아세톤 추출액을 얻는 배양 및 추출단계와;
상기 아세톤 추출액을 농축하고 8~12℃의 온도에서 10~24시간 교반하여 고분자 검(gum) 성분을 석출, 제거한 후, HP-20 흡착수지로 크로마토그래피를 실시하여 불순물을 제거하는 1차 정제단계와;
상기 1차 정제단계에서 얻어진 생성물을 농축하고 8~12℃의 온도에서 10~24시간 교반하여 잔여 검 성분을 석출, 제거한 후, CG161M 흡착수지로 크로마토그래피를 실시하여 잔여 불순물을 제거하는 2차 정제단계와;
상기 2차 정제단계에서 얻어진 생성물을 농축하여 수불용성 슬러지(Sludge)를 얻고, 상기 슬러지를 에테르 용액에 용해시킨 후 다시 농축하여 라파마이신 결정을 얻는 결정화 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 1차 정제단계에서 HP-20 흡착수지로 크로마토그래피를 실시하여 불순물을 제거하는 방법은, 먼저 50% 아세톤 용액으로 상기 HP-20 흡착수지를 세척하여 불순물을 제거하고, 이어 70% 아세톤 용액으로 라파마이신을 용출시키는 것을 특징으로 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 2차 정제단계에서 CG161M 흡착수지로 크로마토그래피를 실시하여 잔여 불순물을 제거하는 방법은, 먼저 50% 아세톤 용액으로 상기 CG161M 흡착수지를 세척하여 잔여 불순물을 제거하고, 이어 60% 아세톤 용액으로 라파마이신을 용출시키는 것을 특징으로 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 결정화 단계에서 에테르 용액을 농축하여 라파마이신 결정을 얻는 방법은, 에테르 투입량의 90%를 증발시킨 후 4℃의 온도에서 서서히 교반하면서 12시간 동안 결정화 시키는 것을 특징으로 하는 다단계 결정화 방법을 이용한 고순도 라파마이신의 제조방법.