CN101712686B - 一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的分离纯化方法。本发明将链霉菌发酵液用板框压滤得到菌体，用有机溶剂多次室温浸提菌体，得到浸提液，将浸提液浓缩后进行大孔树脂和硅胶柱层析，柱层析所得他克莫司用混合溶剂进行浓缩结晶，他克莫司的纯度达96.5％。该方法通用性强，易推广，可以进行工业化生产。

Description

一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的分离纯化方法。

背景技术

他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984年从土壤放线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2(IL-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较常用的环孢素(CsA)强100倍，因此大大降低了临床使用剂量和原治疗费用。近年来，作为肝、肾等移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。

此外用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢菌素治疗者低，尤其是该药品有较强的亲肝性。FK-506和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。

目前，他克莫司的主要生产方法是发酵。从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，主要是专利U.S.6,576,135，U.S.7,220,357，和WO/2006/031664，这些专利报道了用不同方法分离纯化他克莫司，但提取收率不是很高，导致工业化生产成本很高，产品的价格昂贵。

本发明的目的就是提供一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法。主要涉及有机溶剂浸提、大孔吸附树脂和硅胶层析、重结晶等技术从链霉菌(CGMCC No.2919)发酵液中分离纯化他克莫司的方法。

一般在他克莫司的初始分离阶段并不提倡使用如：硅胶、氧化铝及C18等为填料的柱层析。主要是因为样品成分复杂，杂质含量高，部分吸附性很强的杂质会造成填料的不可逆吸附，再生相当困难，导致填料报废，从成本上分析并不经济。C18柱价格昂贵，处理量相对较小，若直接分离他克莫司并不实际。但大孔树脂与硅胶、氧化铝等填料相比，其特点表现在：处理量大、再生容易、价格便宜。他克莫司具有多环结构，理论上易被带苯环的吸附剂吸附，而以苯乙烯-二乙烯苯为载体的大孔吸附树脂可成为他克莫司的良好吸附剂。

硅胶层析，是进一步分离纯化他克莫司的有效方法，层析的关键在于洗脱剂的选择，合适的洗脱溶剂可得到高纯度的产品，利于产物的结晶。本发明采用乙酸乙酯和正己烷、丙酮和正己烷等不同比例的混合溶剂做洗脱剂，能够很好的把他克莫司与其它杂质分开，并且洗脱剂的沸点很低，后序回收处理简单，适合工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法。该方法克服了他克莫司现有的提取技术的不足，提高了他克莫司的收率，从而提供一种能够工业化纯化的工艺。

本发明主要是先采用大孔吸附树脂除去大量的色素和其它一些杂质，然后用硅胶层析进一步分离纯化性质相近的物质。经过两步柱层析后，不仅他克莫司纯化收率大幅增加，而且纯度也相应的提高。

具体地，本发明所述的从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，主要包括如下步骤：

1)在发酵液中加入助滤剂进行搅拌，过滤收集菌体；

2)用有机溶剂浸提菌体，滤液减压浓缩得浓缩物；

3)步骤2)浓缩物进行大孔吸附树脂层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；

4)步骤3)浓缩物加入有机溶剂萃取，萃取液抽滤，减压浓缩至油状物；取样，HPLC检测，他克莫司纯度85％-90％，纯化回收率达75％-80％。

5)步骤4)油状物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；

6)步骤5)浓缩物经有机溶剂溶解，重结晶，即得产品；取样，HPLC检测，他克莫司纯度达95％以上，回收率达70％-75％。

优选地，步骤1)所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混合物；

优选地，步骤1)所述搅拌时间为15-30分钟；

优选地，步骤2)所述有机溶剂为甲醇、氯仿、乙酸丙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯、乙醇、正己烷、乙腈、丙酮或石油醚中的一种或多种的混合物溶剂；

优选地，步骤2)室温浸提菌体3-4次，每次浸提时间1-4小时；

优选地，步骤2)在减压条件下，浓缩回收有机溶剂，得到浓缩物；

优选地，步骤3)所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂X-5、D4020、HZ801、HZ803或HZ818；

优选地，步骤3)所述的洗脱剂为为以下任一溶液：20％-80％甲醇的水溶液；含有20％-75％丙酮的水溶液；含有25％-75％乙醇的水溶液；

优选地，步骤4)所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或氯仿；

优选地，步骤5)所述的硅胶为200～300目的层析硅胶；

优选地，步骤5)所述的洗脱剂为以下任一溶液：含35％-70％乙酸乙酯的正己烷混合液；含15％-50％丙酮的正己烷混合液；含15％-70％乙醇的正己烷混合液；含35％-70％乙酸乙酯的环己烷混合液；含15％-50％丙酮的环己烷混合液；含15％-70％乙醇的环己烷混合液；

优选地，步骤6)所述有机溶剂为乙酸乙酯；

优选地，步骤6)重结晶时在浓缩后的萃取液中缓慢加入正己烷或环己烷至有少量晶体析出，然后将溶液置于4℃继续析晶。

具体实施方式

实例使用的分析纯试剂有：甲醇、氯仿、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、环己烷(上海化学试剂有限公司生产)；色谱纯试剂有：甲醇、乙睛(进口分装)；高压液相色谱仪(LC-20AT)由日本岛津公司生产；大孔树脂X-5，D4020(南开化工厂生产)，HZ818(华东理工大学华昌聚合物有限公司生产)；层析硅胶(200-300目)、薄层层析硅胶HF254(青岛海洋化工集团公司生产)。

实例1

取链霉菌(CGMCC No.2919)菌株发酵液100L，其中发酵单位350mg/L(HPLC测定)，加入硅藻土适量，搅拌10分钟，经板框过滤得到菌体，加2倍体积甲醇浸提搅拌1小时，离心，菌丝体如上述方法再提取二次，得到甲醇提取液，减压浓缩，温度不高于45℃，至甲醇含量小于20％。按照50mL树脂(X-5)吸附1g他克莫司的比例，选择高径比为10∶1.5的玻璃层析柱，将20％甲醇提取液上柱，适当控制流速。

上样完毕后用含甲醇20％-80％的水溶液进行梯度洗脱，其中20％-50％溶液5倍柱体积，50％-80％溶液10倍柱体积，80％甲醇溶液5倍柱体积。在50％-80％甲醇的水溶液中，他克莫司洗脱下来，用HF254硅胶薄板层析检测，展开剂为氯仿∶乙醇＝20∶1，同时与他克莫司标准样对照，判断他克莫司的洗脱情况。

将含有他克莫司的收集液减压浓缩至无甲醇为止，加等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，抽滤，减压浓缩至油状物。用HPLC检测含有他克莫司28g，纯度为88.6％。将油状浓缩物(他克莫司)用少量乙酸乙酯溶解，进行硅胶层析，上样原则为少量多次，按照20g硅胶吸附1g他克莫司的比例，层析柱为高径比10∶1的玻璃柱，将乙酸乙酯溶解液上柱，适当控制流速。

上样完毕后用含乙酸乙酯35％-70％的正己烷溶液进行梯度洗脱，其中35％-45％乙酸乙酯溶液6倍柱体积，45％-70％乙酸乙酯溶液8倍柱体积，70％乙酸乙酯溶液5倍柱体积。他克莫司在含45％-70％乙酸乙酯的正己烷溶液梯度洗脱时洗脱下来，洗脱过程中用HF254硅胶薄板层析检测，展开剂为氯仿∶乙醇＝20∶1，同时与他克莫司标准样对照，判断他克莫司的洗脱情况。合并含有他克莫司纯度高的收集液，减压浓缩至油状物，乙酸乙酯溶解，加入正己烷，使得乙酸乙酯与正己烷的比例是25∶1(v/v)，4℃析晶，得到的他克莫司晶体21g，他克莫司纯度为95.1％。

实例2

取链霉菌(CGMCC No.2919)菌株发酵液100L，其中发酵单位320mg/L(HPLC测定)，加入珍珠岩适量，搅拌30分钟，经板框过滤得到菌体，加2倍体积丙酮浸提搅拌3小时，离心，菌丝体如上述再提取二次，得到丙酮提取液，减压浓缩，温度不高于45℃，至丙酮含量小于20％。按照50mL树脂(D4020)吸附1g他克莫司的比例，层析柱为高径比10∶1.5的玻璃柱，将20％丙酮提取液上柱，适当控制流速。

上样完毕后用含丙酮20％-75％的水溶液进行梯度洗脱，其中20％丙酮溶液5倍柱体积，20％-50％丙酮溶液10倍柱体积，50％-75％丙酮溶液5倍柱体积。他克莫司在50％-75％丙酮的洗脱液中洗脱下来。洗脱过程中用HF254硅胶薄板层析检测，展开剂为氯仿∶乙醇＝20∶1，同时与他克莫司标准样对照，判断他克莫司的洗脱情况。收集、合并含有他克莫司的洗脱液，减压浓缩至无丙酮为止，加等体积氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，抽滤，减压浓缩至油状物。含有他克莫司25.3g，纯度为85.3％。

将浓缩物用少量氯仿溶解，进行硅胶层析，上样原则为少量多次，按照20g硅胶吸附1g他克莫司的比例，选择高径比为10∶1的玻璃柱，将氯仿溶解液上柱，适当控制流速。上样完毕后用含乙酸乙酯35％-70％的环己烷溶液进行梯度洗脱，其中35％乙酸乙酯溶液6倍柱体积，35％-45％乙酸乙酯溶液8倍柱体积，45％-70％乙酸乙酯溶液5倍柱体积。他克莫司在45％-70％乙酸乙酯的环己烷溶液中洗脱下来。洗脱过程中用HF254硅胶薄板层析检测，展开剂为氯仿∶乙醇＝20∶1，同时与他克莫司标准样对照，判断他克莫司的洗脱情况。合并纯度较高的收集液，减压浓缩至油状物，乙酸乙酯溶解，加入正己烷，乙酸乙酯与正己烷的比例是25∶1(v/v)，4 ℃析晶，得到他克莫司晶体18.9g，他克莫司纯度为95.8％。

实例3

取链霉菌(CGMCC No.2919)菌株发酵液100L，其中发酵单位345mg/L(HPLC测定)，加入含珍珠岩硅藻土的助虑剂适量，搅拌20分钟，经板框过滤得到菌体，加2倍体积乙腈浸提搅拌4小时，离心，菌丝体如上述再提取二次，得到乙腈提取液，减压浓缩，温度不高于45℃，至乙腈含量小于20％。按照50mL树脂(HZ818)吸附1g他克莫司的比例，层析柱为高径比10∶1.5的玻璃柱，将20％乙腈提取液上柱，适当控制流速。

上样完毕后用含乙醇25％-75％的水溶液进行梯度洗脱，其中25％乙醇溶液5倍柱体积，25％-50％乙醇溶液10倍柱体积，50％-75％乙醇溶液5倍柱体积。他克莫司在50％-75％乙醇的洗脱液中洗脱下来。洗脱过程中用HF254硅胶薄板层析检测，展开剂为氯仿∶乙醇＝20∶1，同时与他克莫司标准样对照，判断他克莫司的洗脱情况。收集、合并含有他克莫司的洗脱液，减压浓缩至无乙醇为止，加等体积乙酸丁酯萃取3次，合并乙酸丁酯萃取液，抽滤，减压浓缩至油状物。含有他克莫司25.3g，纯度为85.3％。

将油状浓缩物(他克莫司)用少量乙酸丁酯溶解，进行硅胶层析，上样原则为少量多次，按照20g硅胶吸附1g他克莫司的比例，层析柱为高径比10∶1的玻璃柱，将乙酸丁酯溶解液上柱，适当控制流速。

上样完毕后用含丙酮15％-50％的环己烷溶液进行梯度洗脱，其中15％丙酮溶液6倍柱体积，15％-30％丙酮溶液8倍柱体积，30％-50％丙酮溶液5倍柱体积。他克莫司在含30％-50％丙酮的环己烷溶液梯度洗脱时洗脱下来，洗脱过程中用HF254硅胶薄板层析检测，展开剂为氯仿∶乙醇＝20∶1，同时与他克莫司标准样对照，判断他克莫司的洗脱情况。合并含有他克莫司纯度高的收集液，减压浓缩至油状物，乙酸乙酯溶解，加入环己烷，使得乙酸乙酯与环己烷的比例是25∶1(v/v)，4℃析晶，得到的他克莫司晶体18.7g，纯度为95.3％。

Claims (1)

1.一种从发酵液中分离纯化他克莫司的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在发酵液中加入助滤剂进行搅拌，过滤收集菌体； 

2）用有机溶剂浸提菌体，合并滤液减压浓缩得浓缩物；

3）步骤2）浓缩物进行大孔吸附树脂层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；

4）步骤3）浓缩物加入有机溶剂萃取，萃取液抽滤，减压浓缩至油状物；

5）步骤4）油状物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩；

6）步骤5）浓缩物经有机溶剂溶解，重结晶，即得产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述搅拌时间为15-30分钟。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述有机溶剂为甲醇、乙腈、丙酮。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）室温浸提菌体3-4次，每次浸提时间1-4小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）在减压条件下，浓缩回收有机溶剂，得到浓缩物。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂X-5、D4020、或HZ818。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的洗脱剂为以下任一溶液：20%-80%甲醇的水溶液；含有20%-75%丙酮的水溶液；含有25%-75%乙醇的水溶液。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或氯仿。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）所述的硅胶为200～300目的层析硅胶。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）所述的洗脱剂为以下任一溶液：含35%-70%乙酸乙酯的正己烷混合液；含35%-70%乙酸乙酯的环己烷混合液；含15%-50%丙酮的环己烷混合液。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）所述有机溶剂为乙酸乙酯。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）重结晶时在浓缩后的萃取液中缓慢加入正己烷或环己烷至有少量晶体析出，然后将溶液置于4℃继续析晶。