CN1856500A - 纯化大环内酯类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

提供一种纯化大环内酯尤其是他克莫司的方法，所述方法包括将大环内酯装到吸附树脂床上，并用合适洗脱剂如水和四氢呋喃的组合洗脱。

Description

纯化大环内酯类化合物的方法

本发明涉及通过使用吸附树脂的分离方法纯化大环内酯类化合物尤其是他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司或吡美莫司的方法。

                        相关申请

本申请要求2003年7月24日提交的美国临时申请顺序号60/490,070和2004年1月26日提交的美国临时申请顺序号60/539,363的权益，这些申请的所有内容通过引用结合到本文中。

                        发明背景

大环内酯类化合物为具有一种或多种脱氧糖作为取代基的多元内酯环化合物。红霉素、阿奇霉素和克拉霉素为有抑菌和/或杀菌活性的大环内酯类化合物。

他克莫司(FK 506)也为大环内酯抗生素，也为免疫抑制剂。他克莫司比环孢菌素更有效，据报道它对T-淋巴细胞有选择性抑制作用。

吡美莫司为大环内酰胺并为子囊霉素衍生物，据报道它抑制T细胞和肥大细胞生成促炎细胞因子。默克索引(The Merck Index)1331(Maryadele J.O′Neil等编辑，第13版，2001)。据报道吡美莫司用作免疫抑制剂。同上。

另一种大环内酯类化合物西罗莫司据报道为免疫抑制剂。在移植后给予西罗莫司与环孢菌素和皮质类固醇以避免移植排斥。Martindale(马丁代尔药典)：The Complete Drug Reference 568(Sean C.Sweetman编辑，Pharmaceutical Press 33版，2002)。

依维莫司为西罗莫司衍生物，据报道为用于器官移植的免疫抑制剂。马丁代尔药典，539。

尽管已知一些合成路线，但大环内酯类化合物一般经发酵获得。所得大环内酯类化合物一般包含几种杂质，这些杂质可用各种方法检测，如高效液相色谱法(HPLC)。药用化合物中存在杂质是不合需要的，许多管辖机构(如美国的食品药品管理局)的卫生当局已制定关于药物中杂质可接受水平的准则。不言而喻，任何药物需要降低杂质水平的商业实用方法。

发明概述

在一方面，本发明涉及一种从大环内酯尤其是他克莫司、子囊霉素、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和吡美莫司中分离杂质(即降低其中的杂质水平)的方法。该方法包括以下步骤：制备大环内酯装料(loading charge)；将装料装到湿吸附树脂床上；用洗脱剂洗脱树脂床，该洗脱剂包含THF或乙腈、水和任选的其他有机溶剂；收集洗脱液的主要组分(中心组分)，从主要组分中分离杂质减少的大环内酯。

在另一方面，本发明涉及通过上述方法制备的大环内酯类化合物，尤其是他克莫司、子囊霉素、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和吡美莫司。

                    发明详述

本文使用的术语环境温度指约0℃至约40℃的温度，优选约10℃至约35℃。

本文使用的术语减压指压力小于约760mm Hg。

本文使用的术语反溶剂指在环境温度下通常为液体，大环内酯在其中最多有少量溶解的物质。

本文使用的术语“杂质”涉及保留时间不同于所需大环内酯的任何化合物。例如可通过下文描述的HPLC方法测量不同的保留时间。

本文使用的术语RRT 0.95和RRT 1.25分别指在HPLC分析中，子囊霉素和二氢他克莫司(它们为他克莫司的杂质)的相对保留时间(相对于他克莫司)为约0.95和1.25，如下文所描述。

本文使用的与混合物或液体组合有关的术语体积百分比或％体积指体积分数，用下式计算(以A类物质为例)：

％体积_A＝Wt_A×ρ_A/(Wt_A×ρ_A+Wt_B×ρ_B)

其中：

Wt_A和Wt_B分别为A和B类物质的重量(克)，且

ρ_A和ρ_B分别为A和B类物质的密度(g/ml)。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离大环内酯类化合物中杂质(即降低其中杂质水平)的层析方法。通过将大环内酯装到吸附树脂床上并用洗脱剂洗脱实现分离(降低杂质)，该洗脱剂包含THF或乙腈、水和任选的其他有机溶剂。实施本发明优选的大环内酯类化合物包括他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司和吡美莫司。当他克莫司为大环内酯时，减少的杂质至少包括子囊霉素和二氢他克莫司，用下文描述的HPLC定量。当子囊霉素为大环内酯时，减少的杂质至少包括他克莫司。使用的大环内酯可来自任何来源。

在实施本发明中，用洗脱剂洗脱负载大环内酯装料的吸附树脂床，得到洗脱液，从而实现减少(分离)杂质。本领域熟知用于实施本发明的吸附树脂，且优选交联、非离子苯乙烯-二乙烯基苯材料，但可进行化学修饰。也已知丙烯酸型吸附树脂。吸附树脂有大量孔结构，其表面可吸附-然后解吸-各种化学物质。吸附和解吸受环境如所用溶剂的影响。在极性溶剂(如水)的存在下，吸附树脂表现为疏水行为。当使用非极性溶剂(如烃)时，吸附树脂可表现一些极性行为。一般吸附树脂有大网络结构，并有至少约300m²/g的表面面积。

用于实施本发明的吸附树脂包括得自Rohm和Haas的AmberliteXAD树脂(多孔性芳族聚合物微球树脂)；XAD 4、XAD 7HP、XAD 16HP、XAD 761和XAD 1180，在此仅提及一些。也有用的有得自Mitsubishi(三菱)的Diaion吸附树脂；HP10、HP 20、HP 21、HP 30、HP 40、HP 50、SP 800、SP 825、SP 850、SP 875、SP 205、SP 206、SP 207、HP1MG和HP2MG，在此仅提及一些。用于实施本发明的优选吸附树脂的实例为AmberliteXAD 1180。Amberlite XAD 1180为大网络交联芳族聚合物，它为非离子型疏水性交联聚合物，其吸附性能源自它专利的大网络结构(包含连续聚合物相和连续孔相)、高表面面积和其表面的芳族性质。表面面积为500m²/g或更高。孔隙率为0.60ml/ml或更高。PDS 0205A-Jan.98-1/2的产品数据一览表给出该树脂的其他信息。

在本发明方法的第一步中，将大环内酯的装料装到吸附树脂床上。装料可以大环内酯的有机溶剂溶液提供，所用有机溶剂混有反溶剂。

或者，在装到吸附树脂床前，将大环内酯装料吸附(沉积)至吸附树脂的负荷部分(loading portion)。将大环内酯的任选含水有机溶剂溶液与部分吸附树脂和反溶剂混合。该吸附树脂可与用于制备床的树脂相同，或可为不同吸附树脂。吸附树脂的负荷部分可为床体积的约33％至约50％。然后将负荷部分并置在湿吸附树脂床以提供负载装料的床。

优选用于制备溶液(装料通过其装载或沉积)的有机溶剂选自四氢呋喃(THF)、丙酮乙腈(ACN)、甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、酯(如乙酸乙酯)和偶极非质子溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)。最优选有机溶剂为THF、丙酮或CAN。当大环内酯为他克莫司时，THF和ACN为优选溶剂。优选反溶剂为水或直链或支链烷烃或环烷烃，如己烷、庚烷或环己烷。加入反溶剂降低大环内酯在溶液中的溶解度，并且被认为促进样品吸附至吸附树脂的负荷部分。缓缓加入反溶剂以避免大的浓度梯度，该梯度可导致大环内酯部分大量沉淀，这可导致淤塞和堵塞。优选溶剂：反溶剂比为40％或更小。

可以在配有搅拌器的任何便利容器(如搅拌釜反应器)中混合大环内酯溶液、吸附树脂的负荷部分和反溶剂。

在一个具体实施方案中，吸附树脂的负荷部分包含在柱中，并与在再循环系统中流经柱的大环内酯溶液接触。逐渐将反溶剂引入流经和环绕吸附树脂负荷部分的溶液流，由此大环内酯样品逐渐被吸附至吸附树脂的负荷部分上。

作为实例，当大环内酯为他克莫司时，溶液可为约100g/L，且反溶剂体积可为溶液体积的至少约五倍。吸附树脂负荷部分的总体积可约等于溶液体积。熟练技术人员会知道通过常规试验优化比例，以获得大环内酯吸附至吸附树脂的负荷部分上。

可通过检测留在溶液中的大环内酯浓度监控吸附，基本上完全吸附后，将装料从剩余溶液中分离。分离可经过滤完成。当使用再循环柱方法制备装料时，将柱从再循环系统中简单分离。

在该实施方案的下一步中，将已装载大环内酯的负荷部分并置到制备好的湿吸附树脂床。将该床置于合适容器中。优选将床置于柱中，优选循环截面。为了制备床，将需要量的吸附树脂用水或水和溶剂(如THF或ACN)的混合物调成浆。当床直径较大时，最好采用水-溶剂组合。然后将浆料转移至所需容器中，优选圆柱例如用于柱层析。除去水(或水-溶剂组合)，剩下湿吸附树脂床。熟练技术人员和常规类似人员熟知层析柱的制备和装柱实践，且这些熟知的实践容易适用于本发明的实施。

负荷部分可简单地以层形式并置于湿吸附树脂床上。当在再循环系统中制备装料时，可通过建立的流体流通的任何方式将含装料的容器连接至含有湿吸附树脂床的容器。

大环内酯(如他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司或吡美莫司)和杂质的分离可降低大环内酯中的杂质水平，该分离通过以下方法实现：让洗脱剂流经装料，随后流经与之并置的吸附树脂床，并随之进入流体流通中。

洗脱剂包括水和有机溶剂如THF或ACN。尤其当他克莫司为大环内酯时，优选的洗脱剂基本上为THF和水混合物，有约20％体积至约50％体积THF，最优选有约31％体积至约40％体积THF。当有机溶剂如甲醇、乙腈、丙酮或正丁醇与THF-水洗脱剂一起使用时，THF含量小于38％体积，优选约4％至约38％体积之间。另一种优选洗脱剂为乙腈和水混合物，有约30％体积至约70％体积乙腈，最优选约40％体积至约65％体积乙腈。当洗脱剂为乙腈和水的混合物时，1份洗脱剂也可包含约0.0005至约0.003份无机酸。优选无机酸为磷酸。

洗脱剂洗脱通过负荷部分和与之并置的吸附树脂床，其速度取决于床的总截面积(按垂直于洗脱剂流测量)。优选流速(相对于截面积)小于约25cm/h，优选小于约15cm/h。低洗脱速度延长时间，但提高分离效率。用于提高分离效率的优选洗脱速度为约90mL/小时。

以一个或多个组分收集从吸附树脂床流出的洗脱剂(即洗脱液)，如技术人员使用分离方法如层析一样常见，这取决于在固定相(如固定床)上优先保留的化学物质。可向洗脱液中加入无机酸如磷酸。

用一定量洗脱剂洗脱床后，优选将该床置于与第二个床的流体通路中，以便第一个床的洗脱液洗脱通过第二个床。洗脱第一个和第二个床后，第二个床可以并优选与第一个床分离(即中断流体流通)，洗脱通过单独的第二个床继续。洗脱剂为THF和水混合物，有约33％体积至35％体积THF，且优选的洗脱剂

任选其他柱可连接至该系统。

组分的浓度和成分可由任何便利的方法检测。大环内酯中杂质，尤其是他克莫司中的子囊霉素和二氢他克莫司可用下文描述的HPLC方法进行检测和定量。

此外，根据柱负荷和洗脱剂组成及流速，收集洗脱液主组分(中心组分)，以溶液中最初存在的大环内酯计，该主组分包含大于约60％重量，优选在约60％重量至约90％重量之间。当他克莫司为大环内酯且THF-水(31-40％体积THF)为洗脱剂时，收集主组分，最后分离的产品有约0.1％面积或更少(由下面描述的HPLC测定)的杂质RRT 0.95。

如果需要，通过任何常规方法(如萃取、冷冻干燥、蒸发、加反溶剂)，大环内酯可分离杂质并因此具有从洗脱液中分离的低水平杂质。水、烷烃和环烷烃可作为有用的反溶剂提及。分离方法可组合使用。例如反溶剂可与浓洗脱剂组合。

优选的分离方法包括于70℃或更低温度，优选在60℃或更低温度，优选在760mm Hg压力下浓缩主组分至其初始体积的约50％，从而得到结晶产物。浓缩前，优选每升洗脱剂中加入约1至约10mL酸以稳定大环内酯。

浓缩的主组分任选于环境温度维持一段保持时间。当采用保持时间时，优选保持时间为约1-4天。通过任何常规方法如过滤(重力或真空)回收杂质减少的大环内酯结晶。

根据本发明方法，通过将回收的产物经历几种其他处理可获得进一步减少杂质。

由本发明方法完成的大环内酯中杂质的减少可用下文描述的HPLC方法监控。

在另一个实施方案中，大环内酯为他克莫司，且至少降低杂质子囊霉素和二氢他克莫司的水平。其他杂质的水平也降低。该方法包括下列步骤：制备他克莫司的装料，该装料包含他克莫司溶液和或无吸附树脂的负荷部分，尤其是大网络树脂如AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20；将装料装到湿吸附树脂上，尤其是AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20，吸附树脂可包含在容器尤其是柱中；用洗脱剂洗脱负荷部分和吸附树脂，该洗脱剂为四氢呋喃(THF)和水的混合物，约20％体积至约50％体积THF，尤其为约31％体积至约40％体积THF，或为乙腈(ACN)和水的混合物，约30％体积至约70％体积乙腈，且最特别是约40％体积至约65％体积乙腈；至少收集洗脱液的主组分(中心组分)，该组分包含大于约60％、优选在约60％至约90％之间的初始他克莫司(取决于初始纯度)；任选通过例如浓缩主组分从主组分中分离杂质减少的他克莫司，如在酸存在下减压浓缩，并任选回收所得产物。

在另一个实施方案中，本发明提供根据上述方法制备的他克莫司。

在还另一个实施方案中，大环内酯为子囊霉素，且至少降低杂质他克莫司的水平。其他杂质水平也降低。该方法包括下列步骤：制备子囊霉素的装料，该装料包含子囊霉素溶液和或无吸附树脂的负荷部分，尤其是大网络树脂如AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20；将装料装到湿吸附树脂尤其是AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20上，吸附树脂可包含在容器尤其是柱中；用洗脱剂洗脱负荷部分和吸附树脂，该洗脱剂为四氢呋喃(THF)和水的混合物，约20％体积至约50％体积THF，尤其为约31％体积至约40％体积THF，或为乙腈(ACN)和水的混合物，约30％体积至约70％体积乙腈且最特别是约40％体积至约65％体积乙腈；至少收集洗脱液的主组分(中心组分)，该组分包含大于约60％、优选在约60％至约90％之间的初始子囊霉素(取决于初始的纯度)；任选通过例如浓缩主组分从主组分中分离杂质减少的子囊霉素，例如在酸存在下减压浓缩，并任选回收所得产物。

在另一个实施方案中，本发明提供根据上述方法制备的子囊霉素。

在还另一个实施方案中，大环内酯为西罗莫司。从西罗莫司分离杂质的方法包括下列步骤：制备西罗莫司的装料，该装料包含西罗莫司溶液和或无吸附树脂的负荷部分，尤其是大网络树脂如AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20；将装料装到湿吸附树脂尤其是AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20上，吸附树脂可包含在容器尤其是柱中；用洗脱剂洗脱负荷部分和吸附树脂，该洗脱剂为四氢呋喃(THF)和水的混合物，约20％体积至约50％体积THF，尤其为约31％体积至约40％体积THF，或为乙腈(ACN)和水的混合物，约30％体积至约70％体积乙腈且最特别是约40％体积至约65％体积乙腈；至少收集洗脱液的主组分(中心组分)，该组分包含大于约60％、优选在约60％至约90％之间的初始西罗莫司(取决于初始的纯度)；任选通过例如浓缩主组分从主组分中分离杂质减少的西罗莫司，如在酸的存在下减压浓缩，并任选回收所得产物。

在另一个实施方案中，本发明提供根据上述方法制备的西罗莫司。

在还另一个实施方案中，大环内酯为依维莫司。从依维莫司分离杂质的方法包括下列步骤：制备依维莫司的装料，该装料包含依维莫司溶液和或无吸附树脂的负荷部分，尤其是大网络树脂如AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20；将装料装到湿吸附树脂尤其是AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20上，吸附树脂可包含在容器尤其是柱中；用洗脱剂洗脱负荷部分和吸附树脂，该洗脱剂为四氢呋喃(THF)和水的混合物，约20％体积至约50％体积THF，尤其为约31％体积至约40％体积THF，或为乙腈(ACN)和水的混合物，约30％体积至约70％体积乙腈且最特别是约40％体积至约65％体积乙腈；至少收集洗脱液的主组分(中心组分)，该组分包含大于约60％、优选在约60％至约90％之间的初始依维莫司(取决于初始的纯度)；任选通过例如浓缩主组分从主组分中分离杂质减少的依维莫司，如在酸存在下减压浓缩，并任选回收所得产物。

在另一个实施方案中，本发明提供根据上述方法制备的依维莫司。

在还另一个实施方案中，大环内酯为吡美莫司。从吡美莫司分离杂质的方法包括下列步骤：制备吡美莫司的装料，该装料包含吡美莫司溶液和或无吸附树脂的负荷部分，尤其是大网络树脂如AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20；将装料装到湿吸附树脂尤其是AmberliteXAD 1180和Diaion HP 20上，吸附树脂可存在于容器尤其是柱中；用洗脱剂洗脱负荷部分和吸附树脂，该洗脱剂为四氢呋喃(THF)和水的混合物，约20％体积至约50％体积THF，尤其为约31％体积至约40％体积THF，或为乙腈(ACN)和水的混合物，约30％体积至约70％体积乙腈且最特别是约40％体积至约65％体积乙腈；至少收集洗脱液的主组分(中心组分)，该组分包含大于约60％、优选在约60％至约90％之间的初始吡美莫司(取决于初始的纯度)；任选通过例如浓缩主组分从主组分中分离杂质减少的吡美莫司，如在酸的存在下减压浓缩，并任选回收所得产物。

在另一个实施方案中，本发明提供根据上述方法制备的吡美莫司。

                 色谱条件：

柱：ZORBAX SB-C18  75×4.6mm；3.5μm

预柱：SymmetryShield RP183.9×20mm；5μm

洗脱剂：A：量取200ml乙腈置于2000mL容量瓶中，然后用蒸馏水稀释至2000mL总体积，然后加入100μ150％乙酸。

B：向2000ml乙腈加入100μl 50％乙酸。

梯度表

时间(min)	洗脱剂“A”(w/w％)	洗脱剂“B”(w/w％)	流速(ml/min)
				0	60	40	2.3
15	55	45	2.3
				25	30	70	1.8
25，1	60	40	1.8
				27	60	40	1.8

流速：2.3ml/min

检测波长：210nm

注射体积：20μl

样品溶剂：乙腈

柱温：60℃

分析时间：27min

他克莫司的保留时间：约14min

杂质子囊霉素(RRT 0.95)和二氢他克莫司(RRT 1.25)的保留时间相对于他克莫司，并以相对于色谱图中所有峰面积的面积百分比表示。

杂质他克莫司的保留时间(RRT 1.00)相对于子囊霉素，并以相对于色谱图中所有峰面积的面积百分比表示。

本发明方法可用下列非限定性实施例举例说明。

实施例1：

面积百分比指用上文所述方法所得的HPLC色谱图的面积百分比。

以下方法于28℃-32℃进行。

柱(45cm直径)中制备吸附树脂(AmberliteXAD 1180)床：用水：THF装柱(约100L湿吸附树脂)。

一边搅拌一边将水(86L)缓缓加至他克莫司(1227g)的乙腈(10L)溶液中，其中吸附树脂(AmberliteXAD 1180；9L)搅拌下悬浮。使用的他克莫司包含约2.6％面积、RRT 0.95和约2.9％面积、RRT 1.25。当加完水后，过滤，收集吸附树脂装料。

将收集的装料以层形式装到(并置)湿吸附树脂床顶部。

首先用由THF/水(33％体积THF)组成的约1800L第一洗脱剂洗脱柱。然后用由THF/水(40％体积THF)组成的第二洗脱剂洗脱柱。洗脱速度为约11-13L/hr(6.9-8.2cm/hr)。收集含约820g他克莫司(67％产率)的主组分约460L。也收集含约190g他克莫司的前组分约80L。

将主组分(460L)与85％磷酸(460mL)混合并减压浓缩至约230L体积。浓缩液于环境温度下保持一天。(注意，在接下来的实验中尝试更长的保持时间。所得结晶比这里所得结晶更容易过滤)。用己烷洗涤结晶并于40℃干燥。

从主组分分离的产物有约0.1％面积、RRT 0.95和约1.7％面积、RRT 1.25。

从前组分分离的产物有约3％面积、RRT 0.95和约0.3％面积、RRT1.25。

实施例2：

重复实施例1的通用方法以研究洗脱剂组成和流速的影响。

通过这些实验，我们可确定降低洗脱流速增加层析的分离效率。增加洗脱流速降低层析的效率。25cm/cm².小时流速(代替6.9-8.2cm/cm².小时)导致效率显著降低，但可收集到实施例1中描述质量的主组分。

还确定34％体积THF(代替33％体积)的第一洗脱剂增加层析的产率。产率为69％。主组分的杂质RRT：0.95水平为0.10％面积。

当使用有31％体积THF的洗脱剂时，增加他克莫司的洗脱时间。发现提及的洗脱剂浓度(31％、33％、34％、40％体积四氢呋喃)可用于他克莫司的洗脱，而不必增加溶剂浓度。

这些另外的实验也确定水：四氢呋喃：溶剂的洗脱剂混合物也有效。用于水：四氢呋喃：溶剂洗脱剂的供试溶剂为甲醇、乙腈、丙酮、正丙醇和正丁醇。在所有情况中得到合适的质量。

实施例3

面积百分比指由上文描述的方法所得的HPLC色谱图的面积百分比。

于20℃-25℃进行以下操作。

柱(3.2cm直径)中制备吸附树脂(Diaion SP207)床：用水装柱(约550mL湿吸附树脂)。

将他克莫司(7.2g)溶于乙腈(30mL)和水(20mL)的混合物中。他克莫司包含约2.6％面积、RRT 0.95(子囊霉素)和约2.9％面积、RRT 1.25(二氢他克莫司)。

将他克莫司溶液以层形式装到湿吸附树脂床顶部。

用由乙腈/水/磷酸(600∶400∶1)组成的约8L洗脱剂洗脱柱。洗脱速度为90mL/小时。

合并组分32-45。合并的组分包含1.9g他克莫司。合并组分的杂质含量为约2.9％面积、RRT 0.95(子囊霉素)和约1.2％面积、RRT1.25(二氢他克莫司)。

描述的纯化方法适用于减少二氢他克莫司。优选洗脱剂中乙腈含量为约30％-70％，优选约40％-65％。

使用无机酸防止他克莫司在层析期间分解。优选无机酸为磷酸。优选磷酸含量为1份洗脱剂约0.0005-0.003份酸。

描述的纯化方法增加实施例1和2所述方法的效率。

实施例4

根据实施例1制备层析用的两根柱。层析前，按照以下方法将含3000g活性物质的他克莫司吸附至吸附树脂XAD 1180上。将他克莫司溶于15L丙酮中。向该溶液中加入吸附树脂(33L)，并一边持续搅拌一边向溶液/树脂混合物中缓缓加入90L水。将吸附树脂的装料以层形式装到(并置)第一根柱中所含吸附树脂顶部。

第一根柱用四氢呋喃：水混合物(34％体积THF)洗脱。洗脱速度为15L/小时。收集组分，每组分20L。每组分体积为20L。洗脱第35个组分后，将第二根柱串联(流体连接)至第一根柱，洗脱继续在串联柱上进行。

洗脱第95个组分后，断开第一根柱，洗脱仅在第二根柱上继续进行。合并纯化的合适组分。

减压蒸发除去合并组分中的大部分THF。用乙酸乙酯萃取浓缩液，分离各相。减压浓缩分离的乙酸乙酯相(约1份他克莫司和1份乙酸乙酯)。向浓缩的乙酸乙酯萃取液中缓缓加入环己烷和水。于0-30℃从混合物中回收沉淀他克莫司。过滤结晶并干燥。

起始物质包含约0.5％面积子囊霉素(RRT 0.95)和约1.3％二氢他克莫司(RRT 1.25)。所得结晶包含小于0.1％面积的子囊霉素和约0.4％面积二氢他克莫司。

实施例5

将他克莫司溶于水：四氢呋喃(67体积：33体积)混合物中。得到的溶剂浓度为约30g/升。将溶液经过吸附树脂XAD 1180上。吸附树脂吸附了他克莫司。

吸附后，按实施例1连续洗脱他克莫司。

实施例6

将他克莫司溶于水：四氢呋喃(67体积：33体积)混合物中。得到的溶剂浓度为约30g/升。将溶液经过吸附树脂HP20。吸附树脂吸附他克莫司。

吸附后，按实施例1连续洗脱他克莫司。

实施例7

以下方法于28℃-32℃进行。

柱(45cm直径)中制备吸附树脂(AmberliteXAD 1180)床，用水：THF装柱(约100L湿吸附树脂)。

一边搅拌一边将水(86L)缓缓加至子囊霉素(1227g)的乙腈(10L)溶液中，其中吸附树脂(AmberliteXAD 1180；9L)搅拌下悬浮。使用的子囊霉素包含RRT 1.00(他克莫司)。当加完水后，过滤，收集吸附树脂装料。

将收集的装料以层形式装到(并置)湿吸附树脂床顶部。

首先用由THF/水(33％体积THF)组成的约1800L第一洗脱剂洗脱柱。然后用由THF/水(40％体积THF)组成的第二洗脱剂洗脱柱。洗脱速度为约11-13L/hr(6.9-8.2cm/hr)。收集含子囊霉素的主组分约460L。也收集含子囊霉素的前组分约80L。

将主组分(460L)与85％磷酸(460mL)混合并减压浓缩至约230L体积。浓缩液于环境温度下保持一天。用己烷洗涤结晶并于40℃干燥。

实施8

根据实施例1制备层析用的两根柱。

层析前，按照以下方法将含子囊霉素的3000g活性物质吸附至吸附树脂XAD 1180上。将子囊霉素溶于15L丙酮中。向该溶液中加入吸附树脂(33L)，并一边持续搅拌一边向溶液/树脂混合物中缓缓加入90L水。将吸附树脂的装料以层形式装到(并置)第一根柱中所含吸附树脂顶部。

第一根柱用四氢呋喃：水混合物(34％体积THF)洗脱。洗脱速度为15L/小时。收集组分，每组分20L。每组分体积为20L。洗脱第35个组分后，将第二根柱串联(流体连接)至第一根柱，洗脱继续在串联柱上进行。

洗脱第95个组分后，断开第一根柱，洗脱仅在第二根柱上继续进行。合并纯化的合适组分。

减压蒸发除去合并组分中的大部分THF。用乙酸乙酯萃取浓缩液，分离各相。减压浓缩分离的乙酸乙酯相(约1份子囊霉素和1份乙酸乙酯)。向浓缩的乙酸乙酯萃取液中缓缓加入环己烷和水。于0-30℃从混合物中回收沉淀子囊霉素。过滤结晶并干燥。

实施例9

以下方法于28℃-32℃进行。

柱(45cm直径)中制备吸附树脂(AmberliteXAD 1180)床，用水：THF装柱(约100L湿吸附树脂)。

一边搅拌一边将水(86L)缓慢加入至西罗莫司(1227g)的乙腈(10L)溶液中，其中吸附树脂(AmberliteXAD 1180；9L)搅拌下悬浮。使用的西罗莫司包含杂质。当加完水后，过滤，收集吸附树脂装料。

将收集的装料以层形式装到(并置)湿吸附树脂床顶部。

首先用由THF/水(33％体积THF)组成的约1800L第一洗脱剂洗脱柱。然后用由THF/水(40％体积THF)组成的第二洗脱剂洗脱柱。洗脱速度为约11-13L/hr(6.9-8.2cm/hr)。收集含西罗莫司的主组分约460L。也收集含西罗莫司的前组分约80L。

将主组分(460L)与85％磷酸(460mL)混合并减压浓缩至约230L体积。浓缩液于环境温度下保持一天。用己烷洗涤结晶并于40℃干燥。

实施例10

根据实施例1制备层析用的两根柱。

层析前，按照以下方法将含西罗莫司的3000g活性物质吸附至吸附树脂XAD 1180上。将西罗莫司溶于15L丙酮中。向该溶液中加入吸附树脂(33L)，并一边持续搅拌一边向溶液/树脂混合物中缓缓加入90L水。将吸附树脂的装料以层形式装到(并置)第一根柱中所含的吸附树脂顶部。

第一根柱用四氢呋喃：水混合物(34％体积THF)洗脱。洗脱速度为15L/小时。收集组分，每组分20L。每组分体积为20L。洗脱第35个组分后，将第二根柱串联(流体连接)至第一根柱，洗脱继续在串联柱上进行。

洗脱第95个组分后，断开第一根柱，洗脱仅在第二根柱上继续进行。合并纯化的合适组分。

减压蒸发除去合并组分中的大部分THF。用乙酸乙酯萃取浓缩液，分离各相。减压浓缩分离的乙酸乙酯相(约1份西罗莫司和1份乙酸乙酯)。向浓缩的乙酸乙酯萃取液中缓缓加入环己烷和水。于0-30℃从混合物中回收沉淀西罗莫司。过滤结晶并干燥。

实施例11

以下方法于28℃-32℃进行。

柱(45cm直径)中制备吸附树脂(AmberliteXAD 1180)床，用水：THF装柱(约100L湿吸附树脂)。

一边搅拌一边将水(86L)加入至依维莫司(1227g)的乙腈(10L)溶液中，其中吸附树脂(AmberliteXAD 1180；9L)搅拌下悬浮。使用的依维莫司包含杂质。当加完水后，过滤，收集吸附树脂装料。

将收集的装料以层形式装到(并置)湿吸附树脂床顶部。

首先用由THF/水(33％体积THF)组成的约1800L第一洗脱剂洗脱柱。然后用由THF/水(40％体积THF)组成的第二洗脱剂洗脱柱。洗脱速度为约11-13L/hr(6.9-8.2cm/hr)。收集含依维莫司的主组分约460L。也收集含依维莫司的前组分约80L。

将主组分(460L)与85％磷酸(460mL)混合并减压浓缩至约230L体积。浓缩液于环境温度下保持一天。用己烷洗涤结晶并于40℃干燥。

实施例12

根据实施例1制备层析用的两根柱。

层析前，按照以下方法将含依维莫司的3000g活性物质吸附至吸附树脂XAD 1180上。将依维莫司溶于15L丙酮中。向该溶液中加入吸附树脂(33L)，并一边持续搅拌一边向溶液/树脂混合物中缓缓加入90L水。将吸附树脂的装料以层形式装到(并置)第一根柱中所含的吸附树脂顶部。

第一根柱用四氢呋喃：水混合物(34％体积THF)洗脱。洗脱速度为15L/小时。收集组分，每组分20L。每组分体积为20L。洗脱第35个组分后，将第二根柱串联(流体连接)至第一根柱，洗脱在串联柱上继续进行。

洗脱第95个组分后，断开第一根柱，洗脱仅在第二根柱上继续进行。合并纯化的合适组分。

减压蒸发除去合并组分中的大部分THF。用乙酸乙酯萃取浓缩液，分离各相。减压浓缩分离的乙酸乙酯相(约1份依维莫司和1份乙酸乙酯)。向浓缩的乙酸乙酯萃取液中缓缓加入环己烷和水。于0-30℃从混合物中回收沉淀依维莫司。过滤结晶并干燥。

实施例13

以下方法于28℃-32℃进行。

柱(45cm直径)中制备吸附树脂(AmberliteXAD 1180)床，用水：THF装柱(约100L湿吸附树脂)。

一边搅拌一边将水(86L)缓缓加入至吡美莫司(1227g)的乙腈(10L)溶液中，其中吸附树脂(AmberliteXAD 1180；9L)搅拌下悬浮。使用的吡美莫司包含杂质。当加完水后，过滤，收集吸附树脂装料。

将收集的装料以层形式装到(并置)湿吸附树脂床顶部。

首先用由THF/水(33％体积THF)组成的约1800L第一洗脱剂洗脱柱。然后用由THF/水(40％体积THF)组成的第二洗脱剂洗脱柱。洗脱速度为约11-13L/hr(6.9-8.2cm/hr)。收集含吡美莫司的主组分约460L。也收集含吡美莫司的前组分约80L。

将主组分(460L)与85％磷酸(460mL)混合并减压浓缩至约230L体积。浓缩液于环境温度下保持一天。用己烷洗涤结晶并于40℃干燥。

实施例14

根据实施例1制备层析用的两根柱。

层析前，按照以下方法将含吡美莫司的3000g活性物质吸附至吸附树脂XAD 1180上。将吡美莫司溶于15L丙酮中。向该溶液中加入吸附树脂(33L)，并一边持续搅拌一边向溶液/树脂混合物中缓缓加入90L水。将吸附树脂的装料以层形式装到(并置)第一根柱中所含的吸附树脂顶部。

第一根柱用四氢呋喃：水混合物(34％体积THF)洗脱。洗脱速度为15L/小时。收集组分，每组分20L。每组分体积为20L。洗脱第35个组分后，将第二根柱串联(流体连接)至第一根柱，洗脱在串联柱上继续进行。

洗脱第95个组分后，断开第一根柱，洗脱仅在第二根柱上继续进行。合并纯化的合适组分。

减压蒸发除去合并组分中的大部分THF。用乙酸乙酯萃取浓缩液，分离各相。减压浓缩分离的乙酸乙酯相(约1份吡美莫司和1份乙酸乙酯)。向浓缩的乙酸乙酯萃取液中缓缓加入环己烷和水。于0-30℃从混合物中回收沉淀吡美莫司。过滤结晶并干燥。

Claims (48)

1.一种分离大环内酯中杂质的方法，所述方法包括下列步骤：

a)提供大环内酯装料，该大环内酯有初始水平的杂质，

b)将该装料装到吸附树脂床上，

c)用洗脱剂洗脱该负载的吸附树脂床得到洗脱液，该洗脱剂包含水和选自四氢呋喃和乙腈的有机溶剂，和

d)收集至少一个包含该大环内酯的洗脱液组分。

2.权利要求1的方法，其中所述大环内酯装料还含有吸附树脂的负荷部分。

3.权利要求2的方法，其中在a步骤中所述装料从其有机溶剂的溶液中沉积于所述负荷部分上，所述步骤包括将该溶液与反溶剂混合。

4.权利要求3的方法，其中所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、酯和偶极非质子溶剂。

5.权利要求4的方法，其中所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮和乙腈。

6.权利要求3的方法，其中所述反溶剂选自水、直链或支链烷烃或环烷烃。

7.权利要求6的方法，其中所述反溶剂为水。

8.权利要求3的方法，其中混合的溶液与混合的反溶剂比率为40％或更小。

9.权利要求1-8中任一项的方法，所述方法还包括从至少一个组分中分离所述大环内酯的步骤，其中所述大环内酯中杂质的最终水平低于杂质的初始水平。

10.权利要求9的方法，其中所述分离包括浓缩至少一个组分的步骤，该步骤于减压、约70℃或以下的温度下进行。

11.权利要求10的方法，其中温度为约60℃或以下。

12.权利要求10的方法，其中压力为约760mmHg。

13.权利要求10的方法，所述方法还包括浓缩前将至少一个组分与无机酸混合的步骤。

14.权利要求13的方法，其中所述无机酸为磷酸。

15.权利要求13的方法，其中所述酸的量为每升洗脱剂1至约10mL。

1 6.权利要求9的方法，其中所述分离包括将反溶剂与至少一个洗脱液组分混合的步骤。

17.权利要求16的方法，其中在混合前，减压浓缩所述至少一个洗脱液组分。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述吸附树脂为大网络树脂。

19.权利要求18的方法，其中所述大网络树脂选自AmberliteXAD树脂和Diaion吸附树脂。

20.权利要求19的方法，其中所述大网络树脂为AmberliteXAD 1180。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述吸附树脂床在柱中。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述至少一个组分收集的洗脱液体积包含约60％至约90％重量的最初存在于所述装料中的大环内酯。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述洗脱剂流速小于约25cm/h。

24.权利要求23的方法，其中所述洗脱剂流速小于约15cm/h。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述大环内酯选自他克莫司、子囊霉素、西罗莫司、依维莫司和吡美莫司。

26.权利要求25的方法，其中所述大环内酯为他克莫司。

27.权利要求26的方法，其中所述洗脱剂包含含有约20％体积至约50％体积四氢呋喃的四氢呋喃和水混合物。

28.权利要求27的方法，其中所述洗脱剂含有约31％体积至约40％体积四氢呋喃。

29.权利要求28的方法，其中所述洗脱剂含有约33％体积至约35％体积四氢呋喃。

30.权利要求26的方法，其中所述洗脱剂包含含有约30％体积至约70％体积乙腈的乙腈和水混合物。

31.权利要求30的方法，其中所述洗脱剂含有约40％体积至约65％体积乙腈。

32.权利要求1-31中任一项的方法，其中每1体积份所述洗脱剂包含最高达约0.003体积份无机酸。

33.权利要求32的方法，其中所述无机酸为磷酸。

34.权利要求25的方法，其中所述大环内酯为子囊霉素。

35.权利要求25的方法，其中所述大环内酯为西罗莫司。

36.权利要求25的方法，其中所述大环内酯为依维莫司。

37.权利要求25的方法，其中所述大环内酯为吡美莫司。

38.权利要求2-37中任一项的方法，其中所述装料被装到再循环系统中吸附树脂的负荷部分上。

39.权利要求1的方法，其中至少一个另外的吸附树脂床连接至步骤b的吸附树脂床。

40.权利要求39的方法，其中在其他系列洗脱剂组分后断开步骤b的树脂床。

41.一种分离他克莫司中杂质子囊霉素和二氢他克莫司的方法，所述方法包括步骤：

a)提供吸附树脂负荷部分上的他克莫司装料，该他克莫司装料含有初始水平的杂质子囊霉素和二氢他克莫司，该吸附树脂为大网络树脂，

b)将负载他克莫司装料的负荷部分并置于吸附树脂床，

c)用洗脱剂洗脱该负荷部分和与之并置的床得到洗脱液，该洗脱剂包含水和选自四氢呋喃和乙腈的有机溶剂，

d)收集至少一个洗脱液组分，和

e)从至少一个组分中分离含有最终水平的杂质子囊霉素和二氢他克莫司的他克莫司，其中杂质子囊霉素和二氢他克莫司的最终水平低于这些杂质的初始水平。

42.权利要求41的方法，其中所述洗脱剂包含含有约20％体积至约50％体积四氢呋喃的四氢呋喃和水混合物。

43.权利要求42的方法，其中所述洗脱剂包含含有约31％体积至约40％体积四氢呋喃的四氢呋喃和水混合物。

44.权利要求43的方法，其中所述混合物含有约33％体积至约35％体积四氢呋喃。

45.权利要求41的方法，其中所述洗脱剂包含含有约30％体积至约70％体积乙腈的乙腈和水混合物。

46.权利要求45的方法，其中所述洗脱剂含有约40％体积至约65％体积乙腈。

47.权利要求41的方法，其中每体积份所述洗脱剂还包含最高达约0.003体积份无机酸。

48.权利要求47的方法，其中所述无机酸为磷酸。