JP3925198B2 - ラクトン含有高分子量化合物の分離方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（技術分野）
この発明は、類似のラクトン含有高分子量化合物を分離する方法、より詳しくは、異なった側鎖を有するラクトン含有高分子量化合物を、非イオン性吸着樹脂および／または塩基性活性アルミナを用いて分離する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
従来、同じ数の炭素原子を有する不飽和脂肪酸のシス−トランス異性体を分離するのに銀イオンを用いることが知られていた（J. Chromatography, 149(1978) 417-）。ところが、分子構造の一部がわずかに異なる類似化合物は、同数またはほぼ同数の炭素原子を有しており、従って溶媒に対する溶解性や親和性のような物理的性質が互いに似ているため、通常の方法では分離することが困難であった。
【０００３】
（発明の開示）
本発明者らは、物理的性質が互いに類似した類似化合物を、その化学構造を変化させないで効率よく分離する方法を見出すため、鋭意検討した。意外にも、非イオン性吸着樹脂と適当な溶離液および／または塩基性活性アルミナと適当な溶離液を用いることにより、異なる側鎖を有するラクトン含有高分子量化合物を分離する方法を見出した。
【０００４】
本発明は、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物の混合物を、非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）および
塩基性活性アルミナへ吸着させて、有機溶媒で溶離する工程（Ｂ）
の両方の工程にいずれかの順序で付すか、または
上記の混合物を非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）に付して、上記化合物のそれぞれを分離することからなるラクトン含有高分子量化合物を分離する方法を提供する。
【０００５】
本発明によれば、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の両方を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物をその類似化合物から分離するためには、工程（Ａ）および（Ｂ）はいずれを先に行ってもよいが、通常、工程（Ａ）を先に行うのが好ましい。
【０００６】
工程（Ａ）は、低級アルケニル基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、その類似化合物から分離するために行うのが好ましい。
【０００７】
工程（Ｂ）は、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、その類似化合物から分離するために行うのが好ましい。
【０００８】
この発明の分離方法が適用されるラクトン含有高分子量化合物とは、分子内にラクトン環を１つ以上有し、約４００以上の分子量を有するものを意味する。それらは、単環式、二環式、三環式等の基本化学構造を有していてもよい。該基本化学構造を形成する原子の数は１２以上のものがより好ましい。そのような単環式化合物には、エリスロマイシン類、ロイコマイシン類、メチマイシン類等が含まれる。ラクトン環を有するそのような三環式化合物には、ＥＰ０１８４１６２号に示されるような三環式化合物；ＥＰ０４２７６８０号、ＥＰ０５３２０８８号またはＷＯ９３／０４６８０号に示されるようなヘテロ原子含有三環式化合物が含まれる。ラクトン環を有する好ましい三環式化合物は、１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ―シクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下「化合物Ｚ」という）（１７位がアリル基で置換され、３位がメトキシ基で置換されているときはタクロリムスであり、１７位がエチル基で置換され、３位がメトキシ基で置換されているときはアスコマイシンである）、ラパマイシン類等である。これらの化合物のうち、三環式化合物が好ましく、化合物Ｚがより好ましい。
【０００９】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としての低級アルケニル基は、ビニル、プロペニル（アリルまたは１−プロペニル）、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等のような２〜６の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルケニル基であってよく、これらの中ではビニルおよびプロペニルが好ましい。
【００１０】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としての低級アルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等のような１〜６の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルコキシ基であってよく、これらの中で好ましいのは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ等のような１〜４の炭素原子を有するものである。
【００１１】
とりわけ、本発明により分離される、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物は、低級アルケニル基がプロペニル基であり、低級アルコキシ基がメトキシ基であり、化合物Ｚをその基本化学構造として有するもの、低級アルケニル基がプロペニル基であり、化合物Ｚをその基本化学構造として有するもの、または低級アルコキシ基がメトキシ基であり、化合物Ｚをその基本化学構造として有するものが好ましい。
【００１２】
この発明の分離方法が適用されるラクトン含有高分子量化合物に類似化合物とは、上記のラクトン含有高分子量化合物と同一のまたは実質的に同一の基本化学構造を有するが、側鎖として異った置換基を有する化合物類を意味する。例えば、側鎖として低級アルケニル基を有するものの類似化合物は、同一の基本化学構造を有するが、同一部位に低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基等を有するものであってよい。そのような類似化合物には、上記の置換位置以外の部分で若干異なった基本化学構造を有するが、全体として類似の物性を示すものを含む。
【００１３】
側鎖として低級アルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物に類似の特に好ましい化合物は、低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基を有するものであり、側鎖として低級アルコキシ基を有するものに類似の化合物は、低級アルコキシ基の代わりにヒドロキシ基を有するものであり、そして、異なった側鎖として低級アルケニル基と低級アルコキシ基とを有するラクトン含有高分子量化合物に類似化合物は、低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基および／または低級アルコキシ基の代わりにヒドロキシ基を有するものであってよい。
【００１４】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としての低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等のような１〜６の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルキル基であってよく、これらの中でもメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどのような１〜４の炭素原子を有するものが好ましい。
【００１５】
この発明による、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物を含有する混合物の、非イオン性吸着樹脂または塩基性活性アルミナへの吸着、および吸着剤からの目的化合物の溶離は、以下のようにして行うことができる。
【００１６】
例えば、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物の混合物が発酵によって得られる場合、この混合物を分離方法に付す仕方は、該化合物類が菌体外、すなわち細胞外に産生されるか、菌体内、すなわち細胞内に産生されるかによる。それらが細胞外に産生される場合、発酵混合液をこの発明の分離方法に付す。化合物が細胞内に産生される場合、菌体を適当な溶媒で処理し、次いで得られる抽出混合液をこの発明の分離方法に付す。発酵混合液または抽出混合液は、そのままかあるいは濃縮後、吸着剤を充填したカラム等に注入することができる。その代わりに、発酵液または抽出液を濃縮乾固して残渣とし、次いでこの残渣を適当な溶媒に溶解して溶液とし、それをカラム等に注入することもできる。
【００１７】
また、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物の混合物が合成によって得られる場合には、その反応液または抽出液を、そのままかあるいは濃縮後に、吸着剤を充填したカラム等に注入することができる。その代わりに、反応液または抽出液を濃縮乾固して残渣とし、次いでこの残渣を適当な溶媒に溶解して溶液とし、それをカラム等に注入することができる。
【００１８】
混合物に含有される低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物は、吸着剤や溶離液に対するそれらの親和性により選択的に溶離され、所望の化合物を含有する溶出液を合わせて濃縮乾固する。そのようにして、所望のラクトン含有高分子量化合物が分離される。
【００１９】
吸着剤として使用される非イオン性吸着樹脂は、式：
【化２】
［式中、Ｒは水素またはハロゲン原子である］
で表される部分構造を有するポリエチレン樹脂であってよい。具体的には、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ、セパビーズ（登録商標）ＳＰ２０７（日本、三菱化学株式会社製）などを使用するのが好ましい。例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳを用いるのが通常好ましい。
【００２０】
非イオン性吸着樹脂に吸着されたラクトン含有高分子量化合物を溶離するのに、銀イオン含有水性溶媒が用いられる。銀イオン含有水性溶媒に含まれる銀塩としては、硝酸銀、過塩素酸銀等、水中において銀イオンで存在するものが好ましい。これらのうち、例えばラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、硝酸銀が好ましい。銀イオンの濃度は、分離されるラクトン含有高分子量化合物の性質によって異なるが、一般にＡｇ+として、０．０５９〜１．１８ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１２〜０．５９ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．１８〜０．４７ｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは０．２４〜０．３５ｍｏｌ／Ｌである。
【００２１】
銀イオン含有水性溶媒の水性媒体としては、アセトン水溶液、アルコール（例えばメタノールやエタノール）水溶液、アセトニトリル水溶液等が挙げられる。例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、アセトン水溶液を使用するのが好ましい。
【００２２】
吸着剤として使用される塩基性活性アルミナは、例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、ＡＣ１２（商標、日本、住友化学工業株式会社製）が好ましい。
【００２３】
塩基性活性アルミナに吸着されたラクトン含有高分子量化合物を溶離するのに有機溶媒を用いる。溶離液として用いられる有機溶媒は、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルムとメタノールの混液、酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混液等のような常用のものであってよい。例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、酢酸エチルを使用するのが好ましい。
【００２４】
溶離液の種類、および溶離液が混合溶媒である場合の混合比は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などのような予備的な分析を通して、分離されるラクトン含有高分子量化合物の性質に応じて選択するのが好ましい。
【００２５】
吸着剤の量は、吸着剤が非イオン性吸着樹脂である場合には、ラクトン含有高分子量化合物類の重量の５０倍が好ましく、吸着剤が塩基性活性アルミナである場合には、ラクトン含有高分子量化合物類の重量の７０倍が好ましい。
【００２６】
溶離溶媒の流速ＳＶは、吸着剤の粒度により変動し、非イオン性吸着樹脂の場合には通常、約３〜５ｍＬ／分であり、塩基性活性アルミナの場合には通常約３〜５ｍＬ／分である。
【００２７】
低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を含む画分は、紫外・可視検出器あるいは示差屈折率検出器により、あるいはいくつかのフラクションを分取した後のＴＬＣにより検出することができる。所望の物質を含むフラクションを合わせて、減圧下に濃縮乾固することにより、所望の物質が精製される。
【００２８】
本発明は、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物の分離方法であるが、ラクトン含有高分子量化合物を分離した後のその他の類似化合物から、残存する類似化合物をさらに分離することも可能である。例えば、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、そのラクトン含有高分子量化合物および、実質的に同一の基本化学構造を有し、側鎖としてヒドロキシ基を有する類似化合物を含む混合物から分離し、その後、異なる極性の溶媒を用いて溶離することにより、その類似化合物を分離するのに、本発明を再度適用してもよい。
【００２９】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、この発明を実施例により詳細に説明するが、実施例はこの発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
製造例１
低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖に有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物を含む混合物の発酵による調製
【００３０】
コーンスターチ（１％）、グリセリン（１％）、グルコース（０．５％）、綿実粉（１％）、乾燥酵母（０．５％）、コーン・スティープ・リカー（０．５％）および炭酸カルシウム（０．２％）を含む培地（１００ｍＬ）をｐＨ６．５に調整し、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ８個に注ぎ、１２０℃で３０分間滅菌した。ストレプトマイセス・ツクバエンシス第９９９３号（ブタペスト条約のもと、日本、産業技術総合研究所、生命工学工業技術研究所での寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−９２７）の斜面培養物の１白金耳を、各フラスコ中の培地に接種して、回転振とう器上、３０℃で７２時間培養した。予め１２０℃で３０分間滅菌しておいた２００Ｌのジャーファーメンター中の、アデカノール（消泡剤、商標、日本、旭電化工業株式会社製）（０．０５％）およびシリコーン（日本、信越化学工業株式会社製）（０．０５％）を加えた同じ培地（１６０Ｌ）に、この培養物を培養物として移した。これを、１６０Ｌ／分の通気下、２００ｒｐｍの攪拌下に、３０℃で４８時間培養した。この培養物（３０Ｌ）を、可溶性スターチ（３％）、小麦胚芽（０．８％）、乾燥イースト（０．４％）、コーン・スティープ・リカー（０．６％）、炭酸カルシウム（０．１％）、アデカノール（商標）（０．０５％）およびシリコーン（０．０５％）を含み、予め１２０℃で３０分間滅菌した、４，０００Ｌのタンク中の生産培地（ｐＨ６．８、３０００Ｌ）に接種し、１，５００Ｌ／分の通気下、１４０ｒｐｍの攪拌下に、２５℃で１６８時間培養した。
【００３１】
このようにして得られた培養ブロスをケイソウ土（５０ｋｇ）を用いてろ過した。菌糸体の塊をアセトン（１，０００Ｌ）で抽出して抽出液１，０００Ｌを得た。菌糸体からのアセトン抽出液とろ液（２，７００Ｌ）とを合わせて、粗試料を得た。
【００３２】
実施例１
非イオン性吸着樹脂としてのダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび硝酸銀含有溶離液を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
５０％アセトン水溶液中のタクロリムス、アスコマイシンおよび１７−プロピル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下、「化合物Ａ」という）の混合物（２００ｍｇ）を、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ（２０ｍＬ）を使用するカラムクロマトグラフィーに付して、混合物中に含まれる物質を吸着させた。次いで、溶離液として０．２９４ｍｏｌ／Ｌの硝酸銀を含有する５０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液および６０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液を用い、原料負荷量をタクロリムスとして９．５ｇ／Ｌ−Ｒとして、タクロリムス、アスコマイシンおよび化合物Ａを室温で溶離した。対照実験を、溶離液として硝酸銀を含まないアセトン水溶液を使用して、同様にして行った。その結果を図１および図２に示す。
【００３３】
実施例２
非イオン性吸着樹脂としてのダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび硝酸銀溶離液を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
【００３４】
製造例１で得られた粗試料（３００ｍＬ）をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ（２０ｍＬ）を使用するカラムクロマトグラフィーに付して、含有物質を吸着させた。そのカラムを４０％アセトン水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。その後、タクロリムスと１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（３，４−ジヒドロキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下、「化合物Ｂ」という）との混合物を、溶離液として硝酸銀（０．２９４ｍｏｌ／Ｌ）を含有する５０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液を用いて、室温で溶離した。続いて、同条件下で６０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液を用いて、アスコマイシンおよび化合物Ａを別々に溶離した。
【００３５】
こうして得られた分離画分に含まれる各化合物の量を、ＨＰＬＣ分析（移動相：アセトニトリル／ポリオキシエチレンラウリルアルコールエーテル（日本、京都、ナカライタスク社製）の１０％水溶液／水＝４０／１０／５０；カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｍ（５μｍ、４．６φ×１５０ｍｍ）；温度７５℃；検出波長：２１０ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／分；注入量：２０μＬ）で測定した。タクロリムスと化合物Ｂとの混合物、アスコマイシンおよび化合物Ａの分離結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１から明らかなように、タクロリムス、化合物Ｂ、アスコマイシンおよび化合物Ａはパス液（画分１）または洗浄液（画分２）中には溶離しなかった。それらは樹脂に完全に吸着された。硝酸銀溶液による溶離（画分３）によって、タクロリムスおよび化合物Ｂはほぼ１００％回収され、化合物Ａの溶離は検出限界以下であった。６０％アセトン水溶液による押出区（画分４）には、アスコマイシンおよび化合物Ａが選択的にほぼ１００％回収された。
【００３８】
すなわち、低級アルケニル基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物（タクロリムスおよび化合物Ｂ）ならびにそれらの類似化合物（アスコマイシンおよび化合物Ａ）の混合物を、非イオン性吸着樹脂に吸着させ、銀イオン含有水性溶媒で溶離することにより、低級アルケニル基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を分離することができた。
さらに、上記の結果は、側鎖として低級アルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物（アスコマイシンおよび化合物Ａ）も分離されることを示している。
【００３９】
実施例３
塩基性活性アルミナ、ＡＣ１２を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
【００４０】
実施例２で得られたタクロリムスと化合物Ｂとの混合物を含有する画分を濃縮し、酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後に濃縮乾固した。得られた残渣を、酢酸エチルで充填した塩基性活性アルミナＡＣ１２（２０ｍＬ）を使用するカラムクロマログラフィーに付した。室温下、溶離液として酢酸エチル（４００ｍＬ）を用いて溶離を行い、分離画分（２０ｍＬ×１および２００ｍＬ×２）を得た。
【００４１】
こうして得られた分離画分に含まれる各化合物の量を、実施例２と同様にしてＨＰＬＣ分析で測定した。タクロリムスと化合物Ｂとの分離結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２から明らかなように、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物（タクロリムス）とその類似化合物（化合物Ｂ）との混合物を、塩基性活性アルミナに吸着させ、有機溶媒で溶離することにより、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を分離することができた。
さらに、上記の結果は、側鎖としてヒドロキシ基を有するラクトン含有高分子量化合物（化合物Ｂ）も分離されたことを示している。
【００４４】
タクロリムスおよびその類似化合物の混合物を含有する溶液に、実施例２および３を行うことにより、すなわち、非イオン性吸着樹脂への吸着および銀イオン含有水性溶媒での溶離を行う工程と、塩基性活性アルミナへの吸着および有機溶媒での溶離を行う工程とを、この順序でまたは逆の順序で行うことにより、低級アルケニル基と低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物であるタクロリムスが分離された。
【００４５】
（産業上の利用の可能性）
本発明によれば、非イオン性吸着樹脂への吸着および銀イオン含有水性溶媒での溶離を行う工程と、塩基性活性アルミナへの吸着および有機溶媒での溶離を行う工程の両方を行うことにより、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、類似化合物から、予期できなかったほどに効率よく分離できた。
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび溶離液としてのアセトン水溶液を用いたカラムクロマトグラフィーによる分離を表わすチャートである。
【図２】 ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび溶離液としての硝酸銀含有アセトン水溶液（０．２９４ｍｏｌ／Ｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーによる分離を表わすチャートである。
（技術分野）
この発明は、類似のラクトン含有高分子量化合物を分離する方法、より詳しくは、異なった側鎖を有するラクトン含有高分子量化合物を、非イオン性吸着樹脂および／または塩基性活性アルミナを用いて分離する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
従来、同じ数の炭素原子を有する不飽和脂肪酸のシス−トランス異性体を分離するのに銀イオンを用いることが知られていた（J. Chromatography, 149(1978) 417-）。ところが、分子構造の一部がわずかに異なる類似化合物は、同数またはほぼ同数の炭素原子を有しており、従って溶媒に対する溶解性や親和性のような物理的性質が互いに似ているため、通常の方法では分離することが困難であった。
【０００３】
（発明の開示）
本発明者らは、物理的性質が互いに類似した類似化合物を、その化学構造を変化させないで効率よく分離する方法を見出すため、鋭意検討した。意外にも、非イオン性吸着樹脂と適当な溶離液および／または塩基性活性アルミナと適当な溶離液を用いることにより、異なる側鎖を有するラクトン含有高分子量化合物を分離する方法を見出した。
【０００４】
本発明は、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物の混合物を、非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）および
塩基性活性アルミナへ吸着させて、有機溶媒で溶離する工程（Ｂ）
の両方の工程にいずれかの順序で付すか、または
上記の混合物を非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）に付して、上記化合物のそれぞれを分離することからなるラクトン含有高分子量化合物を分離する方法を提供する。
【０００５】
本発明によれば、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の両方を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物をその類似化合物から分離するためには、工程（Ａ）および（Ｂ）はいずれを先に行ってもよいが、通常、工程（Ａ）を先に行うのが好ましい。
【０００６】
工程（Ａ）は、低級アルケニル基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、その類似化合物から分離するために行うのが好ましい。
【０００７】
工程（Ｂ）は、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、その類似化合物から分離するために行うのが好ましい。
【０００８】
この発明の分離方法が適用されるラクトン含有高分子量化合物とは、分子内にラクトン環を１つ以上有し、約４００以上の分子量を有するものを意味する。それらは、単環式、二環式、三環式等の基本化学構造を有していてもよい。該基本化学構造を形成する原子の数は１２以上のものがより好ましい。そのような単環式化合物には、エリスロマイシン類、ロイコマイシン類、メチマイシン類等が含まれる。ラクトン環を有するそのような三環式化合物には、ＥＰ０１８４１６２号に示されるような三環式化合物；ＥＰ０４２７６８０号、ＥＰ０５３２０８８号またはＷＯ９３／０４６８０号に示されるようなヘテロ原子含有三環式化合物が含まれる。ラクトン環を有する好ましい三環式化合物は、１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ―シクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下「化合物Ｚ」という）（１７位がアリル基で置換され、３位がメトキシ基で置換されているときはタクロリムスであり、１７位がエチル基で置換され、３位がメトキシ基で置換されているときはアスコマイシンである）、ラパマイシン類等である。これらの化合物のうち、三環式化合物が好ましく、化合物Ｚがより好ましい。
【０００９】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としての低級アルケニル基は、ビニル、プロペニル（アリルまたは１−プロペニル）、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等のような２〜６の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルケニル基であってよく、これらの中ではビニルおよびプロペニルが好ましい。
【００１０】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としての低級アルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等のような１〜６の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルコキシ基であってよく、これらの中で好ましいのは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ等のような１〜４の炭素原子を有するものである。
【００１１】
とりわけ、本発明により分離される、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物は、低級アルケニル基がプロペニル基であり、低級アルコキシ基がメトキシ基であり、化合物Ｚをその基本化学構造として有するもの、低級アルケニル基がプロペニル基であり、化合物Ｚをその基本化学構造として有するもの、または低級アルコキシ基がメトキシ基であり、化合物Ｚをその基本化学構造として有するものが好ましい。
【００１２】
この発明の分離方法が適用されるラクトン含有高分子量化合物に類似化合物とは、上記のラクトン含有高分子量化合物と同一のまたは実質的に同一の基本化学構造を有するが、側鎖として異った置換基を有する化合物類を意味する。例えば、側鎖として低級アルケニル基を有するものの類似化合物は、同一の基本化学構造を有するが、同一部位に低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基等を有するものであってよい。そのような類似化合物には、上記の置換位置以外の部分で若干異なった基本化学構造を有するが、全体として類似の物性を示すものを含む。
【００１３】
側鎖として低級アルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物に類似の特に好ましい化合物は、低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基を有するものであり、側鎖として低級アルコキシ基を有するものに類似の化合物は、低級アルコキシ基の代わりにヒドロキシ基を有するものであり、そして、異なった側鎖として低級アルケニル基と低級アルコキシ基とを有するラクトン含有高分子量化合物に類似化合物は、低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基および／または低級アルコキシ基の代わりにヒドロキシ基を有するものであってよい。
【００１４】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としての低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等のような１〜６の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルキル基であってよく、これらの中でもメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどのような１〜４の炭素原子を有するものが好ましい。
【００１５】
この発明による、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物を含有する混合物の、非イオン性吸着樹脂または塩基性活性アルミナへの吸着、および吸着剤からの目的化合物の溶離は、以下のようにして行うことができる。
【００１６】
例えば、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物の混合物が発酵によって得られる場合、この混合物を分離方法に付す仕方は、該化合物類が菌体外、すなわち細胞外に産生されるか、菌体内、すなわち細胞内に産生されるかによる。それらが細胞外に産生される場合、発酵混合液をこの発明の分離方法に付す。化合物が細胞内に産生される場合、菌体を適当な溶媒で処理し、次いで得られる抽出混合液をこの発明の分離方法に付す。発酵混合液または抽出混合液は、そのままかあるいは濃縮後、吸着剤を充填したカラム等に注入することができる。その代わりに、発酵液または抽出液を濃縮乾固して残渣とし、次いでこの残渣を適当な溶媒に溶解して溶液とし、それをカラム等に注入することもできる。
【００１７】
また、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物の混合物が合成によって得られる場合には、その反応液または抽出液を、そのままかあるいは濃縮後に、吸着剤を充填したカラム等に注入することができる。その代わりに、反応液または抽出液を濃縮乾固して残渣とし、次いでこの残渣を適当な溶媒に溶解して溶液とし、それをカラム等に注入することができる。
【００１８】
混合物に含有される低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物は、吸着剤や溶離液に対するそれらの親和性により選択的に溶離され、所望の化合物を含有する溶出液を合わせて濃縮乾固する。そのようにして、所望のラクトン含有高分子量化合物が分離される。
【００１９】
吸着剤として使用される非イオン性吸着樹脂は、式：
【化２】
で表される部分構造を有するポリエチレン樹脂であってよい。具体的には、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ、セパビーズ（登録商標）ＳＰ２０７（日本、三菱化学株式会社製）などを使用するのが好ましい。例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳを用いるのが通常好ましい。
【００２０】
非イオン性吸着樹脂に吸着されたラクトン含有高分子量化合物を溶離するのに、銀イオン含有水性溶媒が用いられる。銀イオン含有水性溶媒に含まれる銀塩としては、硝酸銀、過塩素酸銀等、水中において銀イオンで存在するものが好ましい。これらのうち、例えばラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、硝酸銀が好ましい。銀イオンの濃度は、分離されるラクトン含有高分子量化合物の性質によって異なるが、一般にＡｇ+として、０．０５９〜１．１８ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１２〜０．５９ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．１８〜０．４７ｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは０．２４〜０．３５ｍｏｌ／Ｌである。
【００２１】
銀イオン含有水性溶媒の水性媒体としては、アセトン水溶液、アルコール（例えばメタノールやエタノール）水溶液、アセトニトリル水溶液等が挙げられる。例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、アセトン水溶液を使用するのが好ましい。
【００２２】
吸着剤として使用される塩基性活性アルミナは、例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、ＡＣ１２（商標、日本、住友化学工業株式会社製）が好ましい。
【００２３】
塩基性活性アルミナに吸着されたラクトン含有高分子量化合物を溶離するのに有機溶媒を用いる。溶離液として用いられる有機溶媒は、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルムとメタノールの混液、酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混液等のような常用のものであってよい。例えば、ラクトン含有高分子量化合物の基本化学構造が化合物Ｚである場合には、酢酸エチルを使用するのが好ましい。
【００２４】
溶離液の種類、および溶離液が混合溶媒である場合の混合比は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などのような予備的な分析を通して、分離されるラクトン含有高分子量化合物の性質に応じて選択するのが好ましい。
【００２５】
吸着剤の量は、吸着剤が非イオン性吸着樹脂である場合には、ラクトン含有高分子量化合物類の重量の５０倍が好ましく、吸着剤が塩基性活性アルミナである場合には、ラクトン含有高分子量化合物類の重量の７０倍が好ましい。
【００２６】
溶離溶媒の流速ＳＶは、吸着剤の粒度により変動し、非イオン性吸着樹脂の場合には通常、約３〜５ｍＬ／分であり、塩基性活性アルミナの場合には通常約３〜５ｍＬ／分である。
【００２７】
低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を含む画分は、紫外・可視検出器あるいは示差屈折率検出器により、あるいはいくつかのフラクションを分取した後のＴＬＣにより検出することができる。所望の物質を含むフラクションを合わせて、減圧下に濃縮乾固することにより、所望の物質が精製される。
【００２８】
本発明は、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物の分離方法であるが、ラクトン含有高分子量化合物を分離した後のその他の類似化合物から、残存する類似化合物をさらに分離することも可能である。例えば、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、そのラクトン含有高分子量化合物および、実質的に同一の基本化学構造を有し、側鎖としてヒドロキシ基を有する類似化合物を含む混合物から分離し、その後、異なる極性の溶媒を用いて溶離することにより、その類似化合物を分離するのに、本発明を再度適用してもよい。
【００２９】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、この発明を実施例により詳細に説明するが、実施例はこの発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
製造例１
低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖に有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物を含む混合物の発酵による調製
【００３０】
コーンスターチ（１％）、グリセリン（１％）、グルコース（０．５％）、綿実粉（１％）、乾燥酵母（０．５％）、コーン・スティープ・リカー（０．５％）および炭酸カルシウム（０．２％）を含む培地（１００ｍＬ）をｐＨ６．５に調整し、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ８個に注ぎ、１２０℃で３０分間滅菌した。ストレプトマイセス・ツクバエンシス第９９９３号（ブタペスト条約のもと、日本、産業技術総合研究所、生命工学工業技術研究所での寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−９２７）の斜面培養物の１白金耳を、各フラスコ中の培地に接種して、回転振とう器上、３０℃で７２時間培養した。予め１２０℃で３０分間滅菌しておいた２００Ｌのジャーファーメンター中の、アデカノール（消泡剤、商標、日本、旭電化工業株式会社製）（０．０５％）およびシリコーン（日本、信越化学工業株式会社製）（０．０５％）を加えた同じ培地（１６０Ｌ）に、この培養物を培養物として移した。これを、１６０Ｌ／分の通気下、２００ｒｐｍの攪拌下に、３０℃で４８時間培養した。この培養物（３０Ｌ）を、可溶性スターチ（３％）、小麦胚芽（０．８％）、乾燥イースト（０．４％）、コーン・スティープ・リカー（０．６％）、炭酸カルシウム（０．１％）、アデカノール（商標）（０．０５％）およびシリコーン（０．０５％）を含み、予め１２０℃で３０分間滅菌した、４，０００Ｌのタンク中の生産培地（ｐＨ６．８、３０００Ｌ）に接種し、１，５００Ｌ／分の通気下、１４０ｒｐｍの攪拌下に、２５℃で１６８時間培養した。
【００３１】
このようにして得られた培養ブロスをケイソウ土（５０ｋｇ）を用いてろ過した。菌糸体の塊をアセトン（１，０００Ｌ）で抽出して抽出液１，０００Ｌを得た。菌糸体からのアセトン抽出液とろ液（２，７００Ｌ）とを合わせて、粗試料を得た。
【００３２】
実施例１
非イオン性吸着樹脂としてのダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび硝酸銀含有溶離液を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
５０％アセトン水溶液中のタクロリムス、アスコマイシンおよび１７−プロピル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下、「化合物Ａ」という）の混合物（２００ｍｇ）を、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ（２０ｍＬ）を使用するカラムクロマトグラフィーに付して、混合物中に含まれる物質を吸着させた。次いで、溶離液として０．２９４ｍｏｌ／Ｌの硝酸銀を含有する５０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液および６０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液を用い、原料負荷量をタクロリムスとして９．５ｇ／Ｌ−Ｒとして、タクロリムス、アスコマイシンおよび化合物Ａを室温で溶離した。対照実験を、溶離液として硝酸銀を含まないアセトン水溶液を使用して、同様にして行った。その結果を図１および図２に示す。
【００３３】
実施例２
非イオン性吸着樹脂としてのダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび硝酸銀溶離液を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
【００３４】
製造例１で得られた粗試料（３００ｍＬ）をダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ（２０ｍＬ）を使用するカラムクロマトグラフィーに付して、含有物質を吸着させた。そのカラムを４０％アセトン水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。その後、タクロリムスと１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（３，４−ジヒドロキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下、「化合物Ｂ」という）との混合物を、溶離液として硝酸銀（０．２９４ｍｏｌ／Ｌ）を含有する５０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液を用いて、室温で溶離した。続いて、同条件下で６０％（ｖ／ｖ）アセトン水溶液を用いて、アスコマイシンおよび化合物Ａを別々に溶離した。
【００３５】
こうして得られた分離画分に含まれる各化合物の量を、ＨＰＬＣ分析（移動相：アセトニトリル／ポリオキシエチレンラウリルアルコールエーテル（日本、京都、ナカライタスク社製）の１０％水溶液／水＝４０／１０／５０；カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｍ（５μｍ、４．６φ×１５０ｍｍ）；温度７５℃；検出波長：２１０ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／分；注入量：２０μＬ）で測定した。タクロリムスと化合物Ｂとの混合物、アスコマイシンおよび化合物Ａの分離結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
表１から明らかなように、タクロリムス、化合物Ｂ、アスコマイシンおよび化合物Ａはパス液（画分１）または洗浄液（画分２）中には溶離しなかった。それらは樹脂に完全に吸着された。硝酸銀溶液による溶離（画分３）によって、タクロリムスおよび化合物Ｂはほぼ１００％回収され、化合物Ａの溶離は検出限界以下であった。６０％アセトン水溶液による押出区（画分４）には、アスコマイシンおよび化合物Ａが選択的にほぼ１００％回収された。
【００３８】
すなわち、低級アルケニル基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物（タクロリムスおよび化合物Ｂ）ならびにそれらの類似化合物（アスコマイシンおよび化合物Ａ）の混合物を、非イオン性吸着樹脂に吸着させ、銀イオン含有水性溶媒で溶離することにより、低級アルケニル基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を分離することができた。
さらに、上記の結果は、側鎖として低級アルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物（アスコマイシンおよび化合物Ａ）も分離されることを示している。
【００３９】
実施例３
塩基性活性アルミナ、ＡＣ１２を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
【００４０】
実施例２で得られたタクロリムスと化合物Ｂとの混合物を含有する画分を濃縮し、酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後に濃縮乾固した。得られた残渣を、酢酸エチルで充填した塩基性活性アルミナＡＣ１２（２０ｍＬ）を使用するカラムクロマログラフィーに付した。室温下、溶離液として酢酸エチル（４００ｍＬ）を用いて溶離を行い、分離画分（２０ｍＬ×１および２００ｍＬ×２）を得た。
【００４１】
こうして得られた分離画分に含まれる各化合物の量を、実施例２と同様にしてＨＰＬＣ分析で測定した。タクロリムスと化合物Ｂとの分離結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
表２から明らかなように、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物（タクロリムス）とその類似化合物（化合物Ｂ）との混合物を、塩基性活性アルミナに吸着させ、有機溶媒で溶離することにより、低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を分離することができた。
さらに、上記の結果は、側鎖としてヒドロキシ基を有するラクトン含有高分子量化合物（化合物Ｂ）も分離されたことを示している。
【００４４】
タクロリムスおよびその類似化合物の混合物を含有する溶液に、実施例２および３を行うことにより、すなわち、非イオン性吸着樹脂への吸着および銀イオン含有水性溶媒での溶離を行う工程と、塩基性活性アルミナへの吸着および有機溶媒での溶離を行う工程とを、この順序でまたは逆の順序で行うことにより、低級アルケニル基と低級アルコキシ基を側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物であるタクロリムスが分離された。
【００４５】
（産業上の利用の可能性）
本発明によれば、非イオン性吸着樹脂への吸着および銀イオン含有水性溶媒での溶離を行う工程と、塩基性活性アルミナへの吸着および有機溶媒での溶離を行う工程の両方を行うことにより、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物を、類似化合物から、予期できなかったほどに効率よく分離できた。
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび溶離液としてのアセトン水溶液を用いたカラムクロマトグラフィーによる分離を表わすチャートである。
【図２】 ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳおよび溶離液としての硝酸銀含有アセトン水溶液（０．２９４ｍｏｌ／Ｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーによる分離を表わすチャートである。
Claims (10)
- 基本化学構造が１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンであり、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物との混合物を、
非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）および、その混合物を塩基性活性アルミナへ吸着させて、有機溶媒で溶離する工程（Ｂ）
の両方の工程にいずれかの順序で付すか、または、
上記の混合物を非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）に付して、
上記化合物のそれぞれを分離することからなるラクトン含有高分子量化合物の分離方法。 - ラクトン含有高分子量化合物が、その側鎖として低級アルケニル基と低級アルコキシ基の両方を有し、工程（Ａ）および（Ｂ）をこの順序で、または逆の順序で行うことにより分離される請求項１による方法。
- ラクトン含有高分子量化合物が、その側鎖として低級アルケニル基を有し、工程（Ａ）を行うことにより分離される請求項１による方法。
- 側鎖としての低級アルケニル基がプロペニル基であり、かつ側鎖としての低級アルコキシ基がメトキシ基である請求項２による方法。
- 側鎖としての低級アルケニル基がプロペニル基である請求項３による方法。
- 非イオン性吸着樹脂が、式：
- 類似化合物が、側鎖として、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の代わりに、低級アルキル基とヒドロキシ基をそれぞれ有するラクトン含有高分子量化合物である請求項２による方法。
- 類似化合物が、側鎖として、低級アルケニル基の代わりに低級アルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物である請求項３による方法。
- プロペニル基がアリル基である請求項４または５による方法。
- 基本化学構造が１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０4.9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンであり、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有するラクトン含有高分子量化合物とその類似化合物との混合物を、
非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）および、その混合物を塩基性活性アルミナへ吸着させて、有機溶媒で溶離する工程（Ｂ）
の両方の工程にいずれかの順序で付すか、または、
上記の混合物を非イオン性吸着樹脂へ吸着させて、銀イオン含有水性溶媒で溶離する工程（Ａ）に付して、
上記化合物のそれぞれを分離して、低級アルケニル基と低級アルコキシ基の少なくとも一つを側鎖として有する上記のラクトン含有高分子量化合物を得ることを特徴とする、ラクトン含有高分子量化合物の製造方法。
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