DE60009723T2 - Verfahren zur abtrennung von lactonhaltigen verbindungen mit hohem molekulargewicht - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung analoger Lacton-haltiger Verbindungen mit hohem Molekulargewicht, genauer ein Verfahren zur Trennung Lactonhaltiger Verbindungen von hohem Molekulargewicht mit verschiedenen Seitenketten durch Verwendung eines nichtionischen Adsorptionsharzes und/oder basischen aktiven Aluminiumoxids.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Es ist bekannt, zur Trennung von cis-Trans-Isomeren einer ungesättigten aliphatischen Säure mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen Silberionen zu verwenden (J. Chromatography, 149(1978)417-). Jedoch war es schwierig, analoge Verbindungen, welche sich in ihrer Molekularstruktur geringfügig und teilweise unterscheiden, mittels üblicher Arbeitsweisen zu trennen, weil sie die gleiche oder fast die gleiche Anzahl von Kohlenstoffatomen aufweisen und in ihren physikalischen Eigenschaften wie Löslichkeit und Affinität zu Lösungsmitteln untereinander ähnlich sind.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zur effektiven Trennung analoger Verbindungen aufzufinden, die sich in ihren physikalischen Eigenschaften ähneln, ohne dass deren chemische Struktur verändert wird. Unerwarteterweise haben sie ein Verfahren zur Trennung Lacton-haltiger Verbindungen von hohem Molekulargewicht mit verschiedenen Seitenketten durch Verwendung eines nichtionischen Adsorptionsharzes und/oder basischen Aluminiumoxids und eines geeigneten Elutionsmittels aufgefunden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Abtrennung einer Lacton-haltigen Verbindung zur Verfügung, bei dem ein Gemisch einer Lacton-haltigen Verbindung mit einer chemischen Basisstruktur 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-cyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon und mindestens einer von einer (C2–C6) Alkenylgruppe und einer (C1–C6) Alkoxygruppe als Seitenkette und ihrer/ihren analogen Verbindungen) entweder einem oder beiden Schritten in beliebiger Reihenfolge von Schritt (A) Adsorption der Mischung an einem nichtionischen Adsorptionsharz und Eluieren mit einem wässrigen Lösungsmittel, welches Silberionen enthält und Schritt (B) Adsorption der Mischung an basischem aktivem Aluminiumoxid und Eluieren mit einem organischen Lösungsmittel unterworfen wird, zur Abtrennung einer jeden der Verbindungen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die beiden Schritte (A) und (B) bevorzugt zur Abtrennung einer Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht, die als ihre Seitenketten beide, eine Niederalkenylgruppe und eine Niederalkoxygruppe enthält, von ihrer/ihren analogen Verbindungen) ausgeführt. Jeder der Schritte (A) und (B) kann zuerst ausgeführt werden, üblicherweise kann bevorzugt Schritt (A) zuerst ausgeführt werden.
  • Schritt (A) wird vorzugsweise ausgeführt, um eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht, die als ihre Seitenkette eine Niederalkenylgruppe aufweist, von ihrer/ihren analogen Verbindungen) abzutrennen.
  • Schritt (B) wird vorzugsweise ausgeführt, um eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht, die als ihre Seitenkette eine Niederalkoxygruppe aufweist, von ihrer/ihren analogen Verbindungen) abzutrennen.
  • Die Lacton-haltigen Verbindungen von hohem Molekulargewicht, auf die das Trennverfahren der vorliegenden Erfindung angewendet wird, sind Verbindungen mit einer Basisstruktur 1,14-Dihydroxy-l2-[2-(4-hydroxy-cyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-l8-en-2,3,10,16-tetraon (hierin nachfolgend als „Verbindung Z" bezeichnet)(welche Tacrolimus ist, wenn die 17. Position mit einer Allylgruppe und die 3. Position von Cyclohexyl im 4-Hydroxy-cyclohexylrest mit einer Methoxygruppe substituiert ist und Ascomycin, wenn die 17. Position mit einer Ethylgruppe und die 3. Position von Cyclohexyl im 4-Hydroxy-cyclohexylrest mit einer Methoxygruppe substituiert ist).
  • Die Niederalkenylgruppen als Seitenkette in den Lacton-haltigen Verbindungen von hohem Molekulargewicht können geradkettige oder verzweigtkettige Alkenylgruppen mit 2–6 Kohlenstoffatomen, wie Vinyl, Propenyl (Allyl oder 1-Propenyl), Butenyl, Isobutenyl, Pentenyl und Hexenyl sein, von denen Vinyl und Propenyl bevorzugt sind.
  • Die Niederalkoxygruppen als Seitenkette in den Lacton-haltigen Verbindungen von hohem Molekulargewicht können geradkettige oder verzweigtkettige Alkoxygruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, wie Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, sek-Butoxy, tert-Butoxy, Pentyloxy, Isopentiloxy und Hexyloxy sein, von denen jene mit 1–4 Kohlenstoffatomen, wie Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy und Ähnliche bevorzugt sind.
  • Insbesondere ist die Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht, die mit dem Verfahren der Erfindung abzutrennen ist und welche mindestens eine Niederalkenylgruppe und eine Niederalkoxygruppe als Seitenkette hat, bevorzugt eine solche, enthaltend die Verbindung Z, als – ihre chemische Basisstruktur, in der die Niederalkenylgruppe eine Propenylgruppe und die Niederalkonygruppe eine Methoxygruppe ist, eine solche enthaltend die Verbindung Z als ihre chemische Basisstruktur, in der die Niederalkenylgruppe eine Propenylgruppe oder eine solche, enthaltend die Verbindung Z als ihre chemische Basisstruktur, in der die Niederalkonygruppe eine Methoxygruppe ist.
  • Mit zu der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht analogen Ver bindungen, auf die das Trennverfahren der vorliegenden Erfindung angewendet wird, sind Verbindungen gemeint, die die gleiche oder eine im Wesentlichen gleiche chemische Basisstruktur, wie die vorstehend beschriebene Lacton-haltige Verbindung haben, jedoch unterschiedliche Substituenten als ihre Seitenketten haben. Zum Beispiel können Verbindungen, die zu einer solchen mit einer Niederalkenylgruppe als Seitenketten analog sind, jene mit derselben chemischen Basisstruktur sein, jedoch mit einer Niederalkylgruppe, einer Niederalkoxygruppe, einer Hydroxygrupe oder Ähnliche, anstatt der Niederalkenylgruppe an derselben Position. Derartige analoge Verbindungen schließen diejenigen ein, die in anderen Teilen eine etwas abweichende Basisstruktur als die vorstehend erwähnte Substitutionsstelle aufweisen, jedoch als Ganzes ähnliche Eigenschaften zeigen.
  • Besonders bevorzugte Verbindungen, die zu der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkenylgruppe als Seitenkette, analog sind, können diejenigen sein mit einer Niederalkylgruppe anstelle einer Niederalkenylgruppe, Verbindungen die analog sind zu einer mit einer Niederalkoxygruppe als ihre Seitenkette, können diejenigen mit einer Hydroxygruppe anstelle der Niederalkoxygruppe sein, und Verbindungen, die analog sind zu der Lacton- haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkenylgruppe und einer Niederalkoxygruppe als ihre verschiedenen Seitenketten, können diejenigen sein mit einer Niederalkylgruppe anstelle einer Niederalkenylgruppe und/oder einer Hydroxygruppe anstelle der Niederalkoxygruppe.
  • Die Niederalkylgruppe als Seitenkette in der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht kann geradkettig oder verzweigtkettig sein. Von den Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl sind diejenigen mit 1– Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl bevorzugt.
  • Die Adsorption der Mischung enthaltend die Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer Niederalkenylgruppe und einer Niederalkoxygruppe als ihre Seitenkette(n) und deren analoge Verbindungen) an dem nichtionischen Adsorptionsharz oder am basischen aktiven Aluminiumoxid und das Eluieren der Zielverbindung vom Adsorbens gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf folgende Weise ausgeführt werden.
  • Zum Beispiel in dem Fall, dass die Mischung der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer von der Niederalkenylgruppe und der Niederalkoxygruppe als deren Seitenkette und deren analoge Verbindungen) durch Fermentation erhalten wird, hängt der Weg auf dem die Mischung dem Trennungsverfahren zugeführt wird, davon ab, ob diese Verbindungen außerhalb der Bakterien, d. h. extrazellulär oder innerhalb der Bakterien, d. h. intrazellulär produziert worden sind. Wenn sie extrazellulär hergestellt sind, wird das Fermentationsgemisch dem Trennungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen. Wenn die Verbindungen intrazellulär hergestellt sind, werden die Bakterien mit einem geeigneten Lösungsmittel behandelt und das erhaltene flüssige Extraktgemisch dann dem Trennungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen. Das flüssige Gemisch der Fermentation oder das flüssige Extraktgemisch können so wie sie sind oder nach Konzentration in eine mit einem Adsorbens gefüllte Säule oder Ähnliches gefüllt werden. Alternativ kann das flüssige Fermentationsgemisch oder das flüssige Extraktgemisch bis zur Trockene konzentriert werden und dann der Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden, um eine Lösung zu ergeben, welche dann in eine Säule oder Ähnliches eingefüllt wird.
  • Wenn das Gemisch der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer von der Niederalkenyigruppe und der Niederalkoxygruppe als deren Seitenkette und deren analoge Verbindungen) durch Synthese erhalten wird, kann die Reaktionsflüssigkeit oder die Extraktflüssigkeit so wie sie sind oder nach Einengung in eine mit einem Adsorbens gefüllte Säule oder Ähnliches gegossen werden. Alternativ kann die Reaktionsflüssigkeit oder die Extraktflüssigkeit bis zur Trockne konzentriert werden und dann der Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden, um eine Lösung zu ergeben, welche dann in die Säule oder Ähnliches eingefüllt wird.
  • Die in dem Gemisch enthaltene Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer von der Niederalkenylgruppe und der Niederalkoxygruppe als ihre Seitenketten und deren analoge Verbindungen) werden entsprechend ihrer Affinität zum Adsorbens und Elutionsmittel selektiv eluiert und das die gewünschte Verbindung enthaltende vereinigte Eluat wird zur Trockene konzentriert. Auf diese Weise wird die gewünschte Verbindung von hohem Molekulargewicht abgetrennt.
  • Das als Adsorbens verwendete nichtionische Harz kann ein Polyethylenharz mit einer durch die folgende Formel wiedergegebenen Partialstruktur sein:
    Figure 00050001
    worin R ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom ist. Bevorzugt verwendet werden insbesondere Diaion®HP20, Diaion®HP20SS, Sepabeads®SP207 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, Japan) und Ähnliche. Zum Beispiel ist es im vorliegenden Fall, wo die chemische Basisstruktur der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht der Verbindung Z entspricht, bevorzugt Diaion®HP20SS zu verwenden.
  • Zum Eluieren der an dem nichtionischen Adsorptionsharz adsorbierten, Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht wird ein Silberionen enthaltendes wässriges Lösungsmittel verwendet. Für das in der Silberionen enthaltenden wässrigen Lösung enthaltene Silbersalz werden vorzugsweise Silbernitrat, Silberperchlorat oder Ähnliche verwendet, die in Wasser als Silberionen vorliegen, von welchen im vorliegenden Fall, bei dem die chemische Basisstruktur der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht der Verbindung Z entspricht, Silbernitrat bevorzugt wird. Die Konzentration der Silberionen schwankt abhängig von der Natur der abzutrennenden Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht, sie kann jedoch im Allgemeinen 0,059 bis 1,18 mol/L, vorzugsweise 0,12 bis 0,59 mol/L, mehr bevorzugt 0,18 bis 0,47 mol/L, am meisten bevorzugt 0,24 bis 0,35 mol/L betragen, bezogen auf Ag+.
  • Als wässriges Medium für das Silberionen enthaltende wässrige Lösungsmittel können wässriges Aceton, ein wässriger Alkohol (z. B. Methanol und Ethanol), wässriges Acetonitril und Ähnliche Beispiele sein. Im vorliegenden Fall, bei dem die chemische Basisstruktur der Lactonhaltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht der Verbindung Z entspricht, kann zum Beispiel bevorzugt wässriges Aceton verwendet werden.
  • Das als Adsorbens benutzte basische aktive Aluminiumoxid kann in dem vorliegenden Fall, bei dem die chemische Basisstruktur der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht zum Beispiel der Verbindung Z entspricht, vorzugsweise AC12 (Handelsname, hergestellt von der Sumitomo Chemical Company Limited, Japan) sein.
  • Zum Eluieren der am basischen aktiven Aluminiumoxid adsorbierten Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht wird ein organisches Lösungsmittel verwendet. Das als Elutionsmittel verwendete organische Lösungsmittel kann ein konventionelles sein, wie Essigsäureethylester, Aceton, Dichlormethan, ein Gemisch von Chloroform und Methanol, ein Gemisch von Essigsäureethylester und n-Hexan. Beispielsweise kann in dem Fall, dass die chemische Basisstruktur der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht der Verbindung Z entspricht, vorzugsweise Essigsäureethylester verwendet werden.
  • Der Typ des Elutionsmittels und falls ein Lösungsmittelgemisch als Elutionsmittel verwendet wird, dessen Mischungsverhältnis, werden vorzugsweise der Natur der zu trennenden Lactonhaltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht entsprechend, durch eine vorangehende Analyse, wie Dünnschichtchromatographie (TLC) oder Ähnliches, ausgewählt.
  • Die Menge des Adsorbens ist vorzugsweise 50 mal größer als das Gewicht der Lactonhaltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht im Fall, dass das Adsorbens ein nichtionisches Adsorptionsharz ist und vorzugsweise 70mal größer als das Gewicht der Lactonhaitigen Verbindungen von hohem Molekulargewicht im Fall, dass das Adsorbens ein basisches aktives Aluminiumoxid ist.
  • Die Fließgeschwindigkeit SV des eluierenden Lösungsmittels schwankt abhängig von der Teilchengröße des Adsorbens und kann im Fall des nichtionischen Adsorptionsharzes gewöhnlich 3 bis 5 ml/min, im Fall des basisch aktiven Aluminiumoxids gewöhnlich etwa 3 bis 5 ml/min betragen.
  • Die Fraktion(en), die die Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer von der Niederalkylengruppe und mindestens einer von der Niederalkoxygruppe als deren Seitenkette(n) enthalten, können mit einem Detektor für den Ultraviolettsichtbaren Bereich oder einem Differential- Brechungsindex Detektor oder mittels TLC nach Erhalten mehrerer Fraktionen entdeckt werden. Die die gewünschte Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wodurch die gewünschte Substanz gereinigt ist.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung ein Abtrennungsverfahren für eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer von einer Niederalkenylgruppe und einer Niederalkoxygruppe als deren Seitenkette ist, ist es weiter möglich, eine nach Abtrennung der Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht zurückbleibende analoge Verbindung von den anderen analogen Verbindungen abzutrennen. Zum Beispiel wird eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkoxygruppe als deren Seitenkette aus einem Gemisch abgetrennt, das die Lactonhaltige Verbindung von hohem Molekulargewicht und eine analoge Verbindung enthält, die im Wesentlichen die gleiche chemische Basisstruktur und eine Hydroxygruppe als deren Seitenkette aufweist, wonach dann das Verfahren zur Abtrennung der analogen Verbindung durch Eluieren unter Verwendung eines Lösungsmittels mit verschiedener Polarität erneut angewendet werden kann.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 ist eine grafische Darstellung, welche die Trennung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Diaion®HP20SS und einem wässrigen Aceton als Elutionsmittel zeigt.
  • 2 ist eine grafische Darstellung, welche die Trennung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Diaion®HP20SS und Silbernitrat enthaltendem wässrigem Aceton (0,294 mol/L) als Elutionsmittel zeigt.
  • BESTE ARBEITSWEISE BEI DER AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele im Detail erklärt, was zur Veranschaulichung der Erfindung dient.
  • Herstellungsbeispiel 1
  • Herstellung eines Gemisches umfassend eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer Niederalkenylgruppe und einer Niederalkoxygruppe als seine Seitenketten und seine analoge Verbindung durch Fermentation.
  • Ein Kulturmedium (100 ml) enthaltend 1% Maisstärke, 1% Glycerin, 0,5% Glucose, 1% Baumwollsamenmehl, 0,5% getrocknete Hefe, 0,5% Mais-Einweichflüssigkeit und 0,2 Calciumcarbonat wurde auf pH 6,5 eingestellt, in acht 500 ml Erlenmeyerkolben hineingeschüttet und 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Mit einer Impföse voll einer Schrägkultur von Streptomyces Tsukubaensis Nr. 9993 (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-927 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter dem Budapest Abkommen) wurde das Medium in jedem der Kolben angeimpft und 72 Stunden bei 30°C auf einem rotierenden Schüttelgerät kultiviert. Diese Kulturbrühe wurde als Impfkultur überführt in 160 l desselben Mediums, welches in einem 200 l Glasfermenter enthalten war, 30 Minuten bei 120°C vorsterilisiert war und zu welchem 0,05% Adekanol (Entschäumungsmittel, Handelsmarke, hergestellt von Asahi Denka Co., Japan) und 0,05 Silicon (hergestellt von Shinetsu Chemical Co., Japan) zugesetzt worden war. Dies wurde 48 Stunden bei 30°C unter Rühren bei 200 UpM und Belüftung mit 160 l/min kultiviert. Mit dieser Kulturbrühe (30 L) wurden 3000 L eines Produktionsmediums vom pH 6,8, 30 Minuten bei 120°C vorsterilisiert, enthaltend 3% lösliche Stärke, 0,8% Weizenkeime, 0,4% getrocknete Hefe, 0,6 Mais-Einweichflüssigkeit, 0,1% Calciumcarbonat, 0,05% Adekanol® und 0,05% Silicon in einem 4000 L Tank angeimpft und 168 Stunden bei 25°C unter Rühren bei 140 UpM und Belüftung mit 1500 L/min fermentiert.
  • Die so erhaltene Kulturbrühe wurde unter Verwendung von 50 kg Diatomeenerde filtriert. Die Mycelkuchen wurden mit 1000 L Aceton extrahiert, um 1000 L Extrakt zu ergeben. Der Acetonextrakt der Mycelkuchen und das Filtrat (2700 L) wurden vereinigt, um eine rohe Probe zu ergeben.
  • Beispiel 1
  • Abtrennung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Diaion®HP20SS als nichtionisches Adsorptionsharz und eines Silbernitrat enthaltenden Elutionsmittels Ein Gemisch (200 mg) aus Tacrolimus, Ascomycin und 17-Propyl-1,14-dihydroxy-l2-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon(hierin nachfolgend als "Verbindung A" bezeichnet) in 50% wässrigem Aceton wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Diaion®HP20SS (20 ml) unterworfen, so dass die in dem Gemisch enthaltenden Substanzen adsorbiert wurden. Danach wurden Tacrolimus, Ascomycin und Verbindung A bei Raumtemperatur unter Verwendung von 50% (v/v) wässrigem Aceton, enthaltend Silbernitrat (0,294 mol/L) und 60% (v/v) wässrigem Aceton als Elutionsmittel bei einer Beladung mit 9,5 g/L-R bezogen auf Tacrolimus eluiert. In der gleichen Weise wurde ein Kontrolltest durchgeführt unter Verwendung von wässrigem Aceton als Elutionsmittel, welches kein Silbernitrat enthielt. Die Ergebnisse sind in 1 und 2 gezeigt.
  • Beispiel 2
  • Abtrennung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Diaion®HP20SS als nichtionisches Adsorptionsharz und eines Silbernitrat-Elutionsmittels
  • Die im Herstellungsbeispiel 1 erhaltene rohe Probe (300 ml) wurde unter Verwendung von Diaion®HP20SS (20 ml) der Säulenchromatographie unterworfen, so dass die enthaltenen Substanzen adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 40% wässrigem Aceton (100 ml) gewaschen. Danach wurde ein Gemisch aus Tacrolimus und 17-Allyl-1,14-dihydroxy-l2-[2-(3,4-dihydroxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon(hierin nachfolgend als "Verbindung B" bezeichnet) bei Raumtemperatur unter Verwendung von 50% (v/v) wässrigem Aceton als Elutionsmittel, enthaltend Silbernitrat (0,294 mol/L) eluiert. Nachfolgend wurde das Gemisch aus Ascomycin und Verbindung A unter denselben Bedingungen unter Verwendung von 60 (v/v) wässrigem Aceton getrennt eluiert.
  • Die Menge jeder Verbindung, enthalten in den so erhaltenen getrennten Fraktionen, wurde mittels HPLC Analyse gemessen (mobile Phase: Acetonitril/10% wässrige Lösung aus Polyoxyethylen-Laurylalkoholether (Nakalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan)/Wasser = 40/10/50; Säule: TOSOH TSK-Gel ODS-80Tm (5 μm, 4,6 ϕ × 150 mm); Temperatur: 75°C; Erfassungswellenlänge: 210 nm; Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min; eingespritzte Menge: 20 μL). Die Ergebnisse der Trennung des Gemisches aus Tacrolimus und Verbindung B, Ascomycin und Verbindung A sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Figure 00090001
  • *errechnet aus dem Peak-Flächenverhältnis bezogen auf das Gemisch aus Tacrolimus und Verbindung B
  • Wie aus Tabelle 1 klar zu ersehen ist, wurden Tacrolimus, Verbindung B, Ascomycin und Verbindung A nicht mit der Durchgangsflüssigkeit (Fraktion 1) oder mit der Waschflüssigkeit (Fraktion 2) eluiert. Sie waren durch das Harz vollständig absorbiert. Durch Elution mit der Silbernitratlösung (Fraktion 3) wurden Tacrolimus und Verbindung B annähernd zu 100% gesammelt und die Elution der Verbindung A lag unter der Nachweisgrenze. In der mit 60% wässrigem Aceton ausgetragenen Fraktion (Fraktion 4) wurden Ascomycin und Verbindung A annähernd zu 100% selektiv gesammelt.
  • Zusammengefasst konnten durch Adsorbieren des Gemisches Lacton-haltiger Verbindungen von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkenylgruppe als ihre Seitenkette (Tacrolimus und Verbindung B) und ihre analogen Verbindungen (Ascomycin und Verbindung A) an ein nichtionisches Adsorptionsharz und Eluieren mit einem Silberionen enthaltenden wässrigen Lösungsmittel die Lacton-haltigen Verbindungen von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkenylgruppe als ihre Seitenkette getrennt werden.
  • Weiterhin zeigen die vorstehenden Ergebnisse, dass die Lacton-haltigen Verbindungen von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkylgruppe als ihre Seitenkette (Ascomycin und Verbindung A) ebenso getrennt wurden.
  • Beispiel 3
  • Abtrennung mittels Säulenchromatographie unter Verwendung eines basischen aktiven Aluminiumoxids AC12
  • Die das Gemisch aus Tacrolimus und Verbindung B enthaltenden Fraktionen, erhalten in Beispiel 2, wurden eingeengt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde unter Verwendung eines basischen aktiven Aluminiumoxids AC12 (20 ml) zusammen mit Essigsäureethylester gefüllt, der Säulenchromatographie unterworfen. Die Elution wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung von Essigsäureethylester (400 ml) als Elutionsmittel ausgeführt und es wurden getrennte Fraktionen (20 ml × 1 und 200 ml × 2) erhalten.
  • Die Menge jeder Verbindung, enthalten in den so erhaltenen getrennten Fraktionen wurde mittels HPLC Analyse in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Die Ergebnisse der Trennung von Tacrolimus und Verbindung B sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Figure 00100001
  • Wie aus Tabelle 2 klar zu ersehen ist, konnte durch Adsorbieren des Gemisches einer Lacton-haltigen Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkoxygruppe als ihre Seitenkette und ihre analoge Verbindung (Verbindung B) an das basische aktive Aluminiumoxid und Eluieren mit einem organischen Lösungsmittel die Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkoxygruppe als ihre Seitenkette getrennt werden.
  • Weiter zeigen die vorstehenden Ergebnisse, dass die Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Hydroxygruppe als ihre Seitenkette (Verbindung B) ebenso getrennt wurde.
  • Tacrolimus, welches eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit einer Niederalkenylgruppe und einer Niederalkoxygruppe als ihre Seitenketten ist, wurde durch Ausführen der Beispiele 2 und 3 abgetrennt, d. h., durch Ausführen der Stufe der Adsorption an ein nichtionisches Adsorptionsharz und Eluieren mit dem Silberion enthaltenden wässrigen Lösungsmittel und der Stufe der Adsorption an ein basisches aktives Aluminiumoxid und Eluieren mit einem organischen Lösungsmittel in dieser Reihenfolge oder in umgekehrter Reihenfolge mit der das Gemisch aus Tacrolimus und ihrer analogen Verbindung enthaltenden Lösung.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Der vorliegenden Erfindung entsprechend kann eine Lacton-haltige Verbindung von hohem Molekulargewicht mit mindestens einer von einer Niederalkenylgruppe und einer Niederalkoxygruppe als ihre Seitenkette(n) von analogen Verbindungen) mit unerwartet hoher Wirksamkeit getrennt werden durch Ausführung entweder einer oder beider Stufen, einer Stufe der Adsorption an ein nichtionisches Adsorptionsharz und Eluieren mit einem Silberion enthaltenden wässrigen Lösungsmittel und einer Stufe der Adsorption an ein basisch aktives Aluminiumoxid und Eluieren mit einem organischen Lösungsmittel.

Claims (14)

  1. Verfahren zur Abtrennung einer Lacton-haltigen Verbindung, umfassend Durchführung von mindestens einem oder beiden Schritten in der beliebigen Reihenfolge von Schritt (A) Adsorption der Mischung auf einem nicht-ionischen Adsorptionsharz und Eluieren mit einem wässrigen Lösungsmittel, welches Silberionen enthält, und Schritt (B) Adsorption der Mischung auf basischem aktiven Aluminiumoxid und Eluieren mit einem organischen Lösungsmittel, mit einer Mischung aus einer Lacton-haltigen Verbindung mit einer chemischen Basisstruktur 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-cyclohexyl)-1 -methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]octacos-18-ene-2,3,10,16-tetraone und mindestens einer von einer (C2–C6) Alkenylgruppe und einer (C1–C6) Alkoxygruppe als Seitenkette und ihrer/ihren analogen Verbindungen) zur Abtrennung jeder der Verbindungen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Lacton-haltige Verbindung sowohl eine (C2–C6) Alkenylgruppe als auch eine (C1–C6) Alkoxygruppe als Seitenketten aufweist und durch Durchführung der Schritte (A) und (B) in dieser Reihenfolge oder in umgekehrter Reihenfolge abgetrennt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Lacton-haltige Verbindung eine (C2–C6) Alkenylgruppe als Seitenkette aufweist und durch Durchführung von Schritt (A) abgetrennt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Lacton-haltige Verbindung eine (C1–C6) Alkoxygruppe als Seitenkette aufweist und durch Durchführung von Schritt (B) abgetrennt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die (C2–C6) Alkenylgruppe als Seitenkette eine Propenylgruppe ist und die (C1–C6) Alkoxygruppe als Seitenkette eine Methoxygruppe ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die (C2–C6) Alkenylgruppe als Seitenkette eine Propenylgruppe ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die (C1–C6) Alkoxygruppe als Seitenkette eine Methoxygruppe ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das nicht-ionische Adsorptionsharz eine Partialstruktur aufweist, die durch die Formel;
    Figure 00130001
    dargestellt wird, wobei R ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das nicht-ionische Adsorptionsharz Diaion® HP20, Diaion® HP20SS oder Sepabeads® SP207 ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 4, 5, 6, 7 und 9, wobei das basische aktive Aluminiumoxid AC 1 2 ist,
  11. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die analoge Verbindung eine Lacton-haltige Verbindung ist, die als Seitenketten eine (C1–C6) Alkylgruppe und eine Hydroxygruppe jeweils anstelle der (C2–C6) Alkenylgruppe und der (C1–C6) Alkoxygruppe aufweist.
  12. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die analoge Verbindung eine Lacton-haltige Verbindung ist, die als Seitenkette eine (C1–C6) Alkylgruppe anstelle der (C2–C6) Alkenylgruppe aufweist.
  13. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die analoge Verbindung eine Lacton-haltige Verbindung ist, die als Seitenkette eine Hydroxygruppe anstelle der (C1–C6) Alkoxygruppe aufweist.
  14. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Propenylgruppe Allyl ist.
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