KR101022067B1 - 고순도 타크로리무스의 회수방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타 면역억제제보다 활성이 높고 독성이 적은 타크로리무스를 생산하는 균주의 분리 및 대량 생산을 위한 회수방법에 관한 것이다. 이 방법은 타크로리무스를 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하여 얻어진 발효 배양액을 극성용매로 추출 및 여과하는 공정; 여액을 1차 정제 수지인 비이온성 흡착수지에 흡착시키고 용리하여 수득하는 공정; 1차 정제 농축액을 비수용성 극성용매로 추출,농축하여 알칼리화시킨 비극성용매로 석출하는 공정; 석출물을 용해하여 2차 정제수지인 플래시 컬럼에 흡착시키고, 은염이 포함된 수용성 용매로 용리하여 농축하는 공정; 2차 정제농축액을 비수용성 극성용매로 추출 및 농축하고, 탈색 및 은염을 제거하기 위하여 활성탄을 사용하는 공정; 및 극성용매로 결정화하는 공정으로 이루어진다. 상기 단계적 공정들을 포함한 본 발명은 고순도의 타크로리무스를 대량 생산할 수 있게 하였다.
타크로리무스

Description

고순도 타크로리무스의 회수방법{PROCESS FOR RECOVERING TACROLIMUS WITH HIGH PURITY}
본 발명은 타크로리무스 생산 균주의 발효액으로부터 고순도의 타크로리무스를 고수율로 회수하는 방법에 관한 것이다.
17-알릴-1,14-디하이드록시-12-[2-(4-하이드록시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥시-4-아자트리시클로[22.3.1.0.4.9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온의 화학명으로 나타내어지는 타크로리무스는 면역억제 활성, 항균 활성과 같은 약리학적 활성을 갖고 있으며, 기관 또는 조직 이식에 대한 저항성, 이식편대숙주질환, 자가면역 질환, 감염성 질환 등의 치료 및 예방에 유용한 약물로 알려져 있다. 한편 타크로리무스는 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 유기용매에는 잘 녹으나 물에는 잘 녹지 않는 수난용성 약물로 알려져 있다.
타크로리무스는 다른 면역억제제보다 활성이 높고 독성이 적기 때문에, 의약품으로서 가치가 높은 화합물이다. 따라서, 당업계에서는 상기 타크로리무스를 고순도 및 고수율로 회수하는 방법에 관해 많이 연구되어 왔다.
구체적으로, US 4894366에는 실리카겔을 반복적으로 사용하여 타크로리무스를 회수하는 방법이 개시되어 있으나, 츠쿠바마이신 B나 아스코마이신이 타크로리무스로부터 충분히 제거되지 않아 의약품으로서 그의 유용성이 만족스럽지 못한 문제점이 있었다.
이를 개선하기 위한 방법으로, KR 7013989에는 은이온을 이용한 이온크로마토그래피를 수행하여 아스코마이신과 타크로리무스를 분리해내는 보다 진보된 기술이 사용되었다. 그러나, 이 방법 또한 아스코마이신이 타크로리무스보다 먼저 용출되면서 완전히 분리되지 않거나, 대량 정제시 수율이 낮아지는 결과가 나타났다.
WO 2006/031664에도 츠쿠바마이신 B나 아스코마이신을 타크로리무스와 분리하기 위하여 은이온을 흡착시킨 실리카겔을 이용한 정제 방법이 제시되었는데, 이 또한 츠쿠바마이신 B나 아스코마이신이 타크로리무스에 앞서서 용출되어, 타크로리무스의 순도나 수율이 낮아지는 약점은 피할 수가 없었다.
US 2003/168409에는 흡착수지에 흡착된 타크로리무스를 은염이 함유된 용매로 선별 용출하고, 알루미나 컬럼을 사용하여 염을 제거하는 기술을 개발하여 다른 정제 기술보다 진보된 결과를 얻었으나, 아스코마이신과 츠쿠바마이신이 소량 남아있어 규격에 적합한 타크로리무스로 회수하기 어려웠다.
또한, WO 2006/048145은 질산은이 포함된 용매 용리액으로 역상수지인 C18 에 흡착된 타크로리무스를 정제하고, 재결정하여 고순도의 타크로리무스를 회수하는 방법에 관한 것이나, 실제 상기 방법을 실험해 본 결과, 최종 공정에 아스코마이신이 잔류하고, 수지의 변색과 파쇄가 많이 일어나는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래 발명의 문제점을 해결하고자 많은 연구를 시행한 결과, 종래기술의 비경제적이고 비효율적인 타크로리무스의 정제시 문제점들을 개선할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기 기술한 종래 특허에서 나타난 단점들을 극복하면서 대량생산이 가능한 타크로리무스를 고수율 및 고순도로 회수하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 타크로리무스를 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하여 얻어진 발효 배양액을 극성용매로 추출 및 여과하는 공정; 여액을 1차 정제 수지인 비이온성 흡착수지에 흡착시키고 용리하여 수득하는 공정; 1차 정제 농축액을 비수용성 극성용매로 추출,농축하여 알칼리화시킨 비극성용매로 석출하는 공정; 석출물을 용해하여 2차 정제수지인 플래시 컬럼에 흡착시키고, 은염이 포함된 수용성 용매로 용리하여 농축하는 공정; 2차 정제농축액을 비수용성 극성용매로 추출 및 농축하고, 탈색 및 은염을 제거하기 위하여 활성탄을 사용하는 공정; 및 극성용매로 결정화하는 공정으로 이루어진 고순도의 타크로리무스의 회수 방법을 제공한다.
구체적으로, 본원 발명의 타크로리무스를 생산하는 균주로는 스트렙토마이세스 속의 균주라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 스트렙토마이세스속 변이균주 RY-0585를 사용할 수 있다.
스트렙토마이세스속 균주의 배양을 위해 통상적인 배지를 이용할 수 있다. 배지의 종류를 한정하는 것은 아니나, 바람직학게 용성 전분 80g/L, 글리세롤 10g/L, 육즙펩톤 5g/L, 효모엑스 20g/L, 콩펩톤 20g/L, 탄산칼슘 2g/L, 황산암모늄 1g/L, 황화철 0.05g/L, 소포제 0.5g/L을 물에 용해하여 사용할 수 있다. 상기 배지에서 용성 전분 대신 산화 전분을 사용할 수 있고, 소포제는 Konion GE304(polyoxyalkylene alkyl ether 혼합물)의 사용이 바람직하다.
이후 5N 가성소다를 이용하여 pH를 6.0 내지 6.3으로 조절한 후, 121℃에서, 30분간 멸균한 배지에 무균적으로 종균을 접종하고, 내압 0.1 내지 0.3kg/cm2을 유지시키면서, 96시간동안 통기량은 0.5에서 1.0VVM으로 올려주고, 교반속도는 80에서 120rpm으로 올려주어, 26℃에서 144 내지 168시간 배양하여 발효배양액을 수득할 수 있다. 상기 배양은 역가를 측정하면서 종료하므로, 배양 시간은 144 내지 168시간 내에서 다를 수 있다.
상기 수득된 발효 배양액을 극성용매로 추출 및 여과하는 공정은 발효배양액에 극성용매를 동일한 용량으로 첨가하여 추출, 여과하여 정제하거나 또는 균사체덩어리만 따로 분리하여 극성용매로 추출한 후, 여액과 합하여 정제하는 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 상기 수득한 발효배양액 1,250L에 동일한 부피의 극성용매 아세톤을 넣고 상온에서 100rpm의 속도로 1시간 교반한 다음, 필터프레스로 여과하거나, 또는 발효배양액 1,250L에 3% g/v의 규조토를 넣고 필터프레스로 여과한 후, 균사체 덩어리를 2 내지 5배(w/v)의 비율로 아세톤에 넣고 상온조건하에서 100rpm의 속도로 30분 내지 2시간 교반 후, 누체필터로 여과한 후, 아세톤추출액과 발효배양액 여액을 혼합할 수 있다. 본원 발명의 발효배양액을 추출하는 극성용매로는 메탄올, 아세톤 또는 에탄올 등을 들 수 있다.
상기에서 수득한 여액을 1차 정제 수지인 비이온성 흡착수지에 흡착시키고, 30 내지 40% 아세톤으로 세척한 후, 50 내지 80% 아세톤으로 용리, 분획할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 1차 정제용 수지는 스티렌과 디비닐 벤젠의 공중합체의 다공성 흡착제로, 그의 겉보기 밀도가 약 650 내지 900 g/L이고, 비표면적이 550 내지 900 ㎡/g이며, 세공용적이 약 1.1 내지 1.8 ㎖/g이며, 진비중이 1.01 내지 1.18 g/㎖인 것을 들 수 있으며, 이와 같은 특성을 갖는 시판품으로서는 미쯔비시카가쿠사의 SP825, HP2MG, HP20, 롬앤하스사의 CG161, CG300, 또는 미쯔비시카가쿠사의 SP20SS 등을 들 수 있다.
타크로리무스가 포함된 분획을 회수하여 10 내지 20배 감압농축하고 동일한 양의 비수용성 극성용매로 처리하여 타크로리무스를 추출하고, 상기 추출액을 감압농축하여 조 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻을 수 있다. 본 발명의 비수용성 극성용매는 클로로포름 또는 에틸아세테이트 등을 들 수 있다.
상기 수득된 조 타크로리무스를 알칼리화시킨 비극성 용매로 석출시킬 수 있다. 여기서 알칼리화시킨 비극성 용매는 톨루엔 또는 헥산에 트리에틸아민수용액을 1:2의 비율로 혼합시킨 용액을 들 수 있다. 즉, 조 타크로리무스 250g에 헥산 6리터와 0.1N 트리에틸아민수용액 12리터를 첨가하고, 상온에서 1시간 100rpm 교반 후, 0 내지 5℃ 온도하에서 48시간 교반한 후, 왓트만 여과지로 여과하여 석출물을 수득할 수 있다.
상기에서 수득된 석출물을 35 내지 45% 아세톤 용액으로 용해하고, 2차 정제용 수지인 플래시 컬럼에 흡착시킬 수 있다. 본 발명에 사용되는 2차 정제 수지인 플래시 컬럼은 SP825, HP2MG, HP20, CG161, CG300, 또는 SP20SS 등을 들 수 있다.
이후 35 내지 45% 아세톤 용액으로 세척하고, 5% 질산은이 용해된 46 내지 55% 아세톤용액으로 용리, 분획할 수 있다. 타크로리무스가 포함된 분획을 모아 10 내지 20배 감압 농축하고, 동일한 양의 비수용성 극성용매로 처리하여 타크로리무스를 2회 추출하고, 감압 농축하여 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻을 수 있다. 본원 발명의 비수용성 극성 용매는 상기에서 말한 바와 같다. 본 발명에서 은염이 함유된 수용액은 5% 은염 농도로 농축 석출한 후 여과하면 재사용이 가능하다.
또한, 본원 발명에 사용되는 1차 정제 및 2차 정제의 용리액은 각각 독립적으로 은염을 포함하거나 포함하지 않는 용매로써 아세톤, 아세토니트릴, 이소프로판올, 메탄올 등을 들 수 있다.
상기에서 수득된 타크로리무스가 포함된 잔사에 포함된 은염과 색을 제거하기 위하여, 2배 양의 에틸아세테이트를 넣어 용해하고, 상온에서 30분 내지 2시간동안 활성탄을 처리할 수 있다. 활성탄을 여과, 제거하고, 여액은 감압 농축 후 건조하여 타크로리무스를 수득할 수 있다.
본 발명에서 은염 제거 및 탈색을 위한 활성탄은 리그나이트 코올의 스팀 활성화에 의해 생성된 산세적된 분말 활성탄인 노릿트(Norit)사의 GAC1240+, Darco 12-20LI, Darco S-51, Darco S-51HF, GAC1240+ 또는 Calporabin-6 등을 들 수 있다.
수득된 타크로리무스를 결정화함에 있어, 타크로리무스를 6배 부피의 33% 아세토니트릴 수용액에 용해하고, 0 내지 5℃에서 24 내지 48시간 교반하면서 결정화할 수 있다. 왓트만 여과지로 여과하여 1차 결정물을 수득하고, 이후 동일한 과정을 반복하여 2차 재결정물을 수득하거나, 또는 1차 재결정화된 타크로리무스를 10배 부피의 33% 아세토니트릴 수용액에 용해한 후, 동일 방법으로 재결정할 수 있다.
본 발명은 극성용매로 결정화하는 공정을 포함함으로써, 최종 수득되는 타크로리무스의 순도를 높일 수 있다.
본 발명의 타크로리무스 회수 방법은 고순도 및 고수율로 타크로리무스를 회수할 수 없었던 종전 방법들의 문제점을 해결하여 면역억제제로서 타크로리무스를 고순도 및 고수율로 경제적이며 효율적으로 대량 회수할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세한 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 스트렙토마이세스속 변이균주 RY -0585의 발효
실시예 (1-1)
스트렙토마이세스속 변이균주 RY-0585 배양을 위한 배지로 용성 전분 80g/L, 글리세롤 10g/L, 육즙펩톤 5g/L, 효모엑스 20g/L, 콩펩톤 20g/L, 탄산칼슘 2g/L, 황산암모늄 1g/L, 황화철 0.05g/L, Konion GE304(polyoxyalkylene alkyl ether 혼합물) 0.5g/L을 물에 용해하고, 5N 가성소다를 이용하여 pH를 6.2로 조절한 후, 121℃에서 30분간 멸균하였다. 멸균배지에 무균적으로 종균을 접종하고, 내압 0.2kg/cm2을 유지시키면서, 96시간동안 통기량은 0.5에서 1.0VVM으로 올려주고, 교반속도는 80에서 120rpm으로 올려주었다. 26℃에서 156시간 배양하였다.
실시예 (1-2)
스트렙토마이세스속 변이균주 RY-0585 배양을 위한 배지로 산화전분 80g/L, 글리세롤 10g/L, 육즙펩톤 5g/L, 콩펩톤 15g/L, 대두분 5g/L, 효모엑스 17g/L, 황산암모늄 1g/L, 탄산칼슘 1g/L, 황화철 0.05g/L, Konion GE304(polyoxyalkylene alkyl ether 혼합물), 0.5g/L을 물에 용해하고 5N 가성소다를 이용하여 pH를 6.2로 조절한 후 121℃, 30분간 멸균하였다. 멸균배지에 무균적으로 종균을 접종하고, 내압 0.2kg/cm2을 유지시키면서 96시간동안 통기량은 0.5에서 1.0VVM으로 올려주고, 교반속도는 80에서 120rpm으로 올려주었다. 26℃에서 156시간 배양하였다.
상기 실시예 (1-1) 및 (1-2)의 배지에서 스트렙토마이세스속 변이균주 RY-0585 를 배양한 결과를 표 1 에 나타내었다.


배지
부피
(L)		 순도 (%)
역가
(g/L)
Imp.1. Imp.2. Imp.3. T2 T1 FK520 FK506 T-B
실시예 1-1 2,500 99.1 0.04 0.01 0.04 0.04 0.10 0.66 0.02 0.15
실시예 1-2 2,500 99.1 0.03 0.01 0.06 0.03 0.05 0.71 0.02 0.20
(Imp.-불순물, T2-토토머 2, T1-토토머 1, FK520-아스코마이신, FK506-타크로리무스, T-B-츠쿠바마이신)
실시예 2. 발효배양액으로부터 타크로리무스의 추출
실시예 (2-1)
실시예 (1-2)에서 수득한 발효배양액 1,250L에 동일한 부피의 아세톤을 넣고 상온에서 100rpm의 속도로 1시간 교반한 다음, 필터프레스로 여과하였다.
실시예 (2-2)
실시예 (1-2)에서 수득한 발효배양액 1,250L에 3% g/v의 규조토를 넣고 필터프레스로 여과한 후, 균사체 덩어리는 3배(w/v)의 비율로 아세톤에 넣고 상온조건하에서 100rpm의 속도로 1시간 교반 후, 누체필터로 여과하였다. 이후 아세톤추출액과 발효배양액 여액을 혼합하였다.
상기 실시예 (2-1) 및 (2-2)의 발효배양액으로부터 타크로리무스를 추출한 결과를 표 2에 나타내었다.


배지		 순도 (%)
타크로리무스
(g)
HPLC caled.
Imp.1. Imp.2.

 Imp.3. T2 T1 FK520 FK506 T-B
실시예 2-1 99.1 0.03 0.01 0.03 0.03 0.10 0.70 0.02 90
실시예 2-2 99.0 0.03 0.01 0.04 0.03 0.05 0.76 0.02 100
실시예 3. 조 타크로리무스 수득
실시예 (3-1)
실시예 (2-2)에서 수득한 여액을 1차 정제용 수지인 HP2MG에 흡착시키고, 35% 아세톤으로 세척한 후, 65% 아세톤으로 용리, 분획하였다. 타크로리무스가 포함된 분획을 회수하여 15배 감압 농축하고, 동일한 부피의 에틸아세테이트를 처리하여 타크로리무스를 추출하였다. 추출액은 감압 농축하여 조 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻었다.
실시예 (3-2)
실시예 (2-2)에서 수득한 여액을 1차 정제용 수지인 SP825에 흡착시키고, 35% 아세톤으로 세척한 후, 65% 아세톤으로 용리, 분획하였다. 타크로리무스가 포함된 분획을 회수하여 15배 감압 농축하고, 동일한 부피의 에틸아세테이트를 처리하여 타크로리무스를 추출하였다. 추출액은 감압 농축하여 조 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻었다.
실시예 (3-3)
실시예 (3-1) 및 (3-2)로부터 수득된 조 타크로리무스 250g에 헥산 6리터와 0.1N 트리에틸아민수용액 12리터를 첨가하고, 상온에서 1시간 100rpm 교반 후, 5℃ 온도하에서 48시간 교반하였다. 왓트만 여과지로 여과하여 석출물을 수득하였다.
상기 실시예 (3-1), (3-2) 및 (3-3)에 따라 조 타크로리무스를 추출한 결과를 표 3에 나타내었다.


배지
부피
(L)		 순도 (%)
수율
(%)
Imp.1. Imp.2. Imp.3. T2 T1 FK520 FK506 T-B
실시예 3-1 2,500 20.72 11.30 1.78 1.87 0.81 3.21 55.66 3.65 81
실시예 3-2 2,500 12.14 21.00 1.12 2.01 2.02 7.30 47.63 4.78 76
실시예 3-3 4.47 0.84 0.88 0.86 0.24 3.07 86.17 3.47 90
실시예 4. 타크로리무스의 정제
실시예 (4-1)
실시예 (3-3)에서 수득된 석출물을 40% 아세톤 용액으로 용해하고, 2차 정제용 수지인 플래시 컬럼 SP20SS에 흡착시켰다. 40% 아세톤 용액으로 세척하고, 5% 질산은이 용해된 50% 아세톤용액으로 용리, 분획하였다. 타크로리무스가 포함된 분획을 모아 15배 감압 농축하고, 에틸아세테이트를 동일한 부피로 처리하여 타크로리무스를 추출하였다. 2회 추출하고 감압 농축하여 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻었다.
실시예 (4-2)
실시예 (3-3)에서 수득된 석출물을 40% 아세톤 용액으로 용해하고 2차 정제용 수지인 플래시 컬럼(CG161M)에 흡착시켰다. 40% 아세톤 용액으로 세척하고, 5% 질산은이 용해된 50% 아세톤용액으로 용리, 분획하였다. 타크로리무스가 포함된 분획을 모아 15배 감압 농축하고 에틸아세테이트를 동일한 부피로 처리하여 타크로리무스를 추출하였다. 2회 추출하고 감압 농축하여 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻었다.
실시예 (4-3)
실시예 (3-3)에서 수득된 석출물을 40% 아세톤 용액으로 용해하고 2차 정제용 수지인 플래시 컬럼(CG300M)에 흡착시켰다. 35 내지 45% 아세톤 용액으로 세척하고, 5% 질산은이 용해된 50%아세톤용액으로 용리, 분획하였다. 타크로리무스가 포함된 분획을 모아 15배 감압 농축하고 에틸아세테이트를 동일한 부피로 처리하여 타크로리무스를 추출하였다. 2회 추출하고 감압 농축하여 타크로리무스가 포함된 잔사를 얻었다.
실시예 5. 은염 제거 및 탈색
실시예 (4-1), (4-2) 및 (4-3)에서 수득된 타크로리무스가 포함된 잔사에 포함된 은염과 색을 제거하기 위하여 2배 부피의 에틸아세테이트를 넣어 용해하고, 상온에서 1시간동안 활성탄을 처리하였다. 활성탄을 여과, 제거하고 여액은 감압 농축, 건조하여 타크로리무스를 수득하였다.
실시예 (4-1), (4-2), (4-3) 및 (5)에 따라 타크로리무스를 정제한 결과를 표 4 에 나타내었다.


배지		 순도 (%)
수율
(%)
Imp.1. Imp.2. Imp.3. T2 T1 FK520 FK506 T-B
실시예 4-1 0.30 0.77 0.70 0.50 0.16 1.75 95.10 0.52 80
실시예 4-2 0.08 0.36 0.12 0.41 0.11 1.82 96.52 0.28 86
실시예 4-3 0.10 0.46 0.18 0.51 0.21 1.42 96.12 0.30 84
실시예 5 0.12 0.46 0.18 0.54 0.23 0.99 96.00 0.10 95
실시예 6. 타크로리무스의 결정화
실시예 (6-1)
1차 결정 - 실시예 5에서 수득된 타크로리무스를 6배 부피의 33% 아세토니트릴 수용액에 용해하고 5℃에서 36시간 교반하면서 결정화하였다. 왓트만 여과지로 여과하여 결정물을 수득하였다.
실시예 (6-2)
2차 재결정(1) - 1차 재결정물을 실시예 (6-1)과 같은 방법으로 재결정하였다.
실시예 (6-3)
2차 재결정(2) - 1차 재결정화된 타크로리무스를 10배 부피의 33% 아세토니트릴 수용액에 용해한 후, 실시예 (6-1)과 동일 방법으로 재결정하였다.
실시예 (6-1), (6-2), 및 (6-3)에 따라 타크로리무스를 결정한 결과를 표 5 에 나타내었다.


배지		 순도 (%)
수율
(%)
Imp.1. Imp.2. Imp.3. T2 T1 FK520 FK506 T-B
실시예 6-1 0.14 0.07 0.03 0.79 98.7 0.21 90
실시예 6-2 0.09 0.01 0.01 0.30 99.50 0.03 95
실시예 6-3 0.02 0.01 0.02 0.03 0.17 99.67 0.02 93
상기 실시예 6-3에서 수득한 타크로리무스 결정물을 HPLC로 분석한 결과를 도 1에 나타내었다.
이때, 검출기로 자외부흡광광도계(225nm)를 이용하고, 2개의 Supelcosil LC-Diol(5㎛, 4㎜×250㎜)칼럼을 세로로 연결하고, 시료액을 20㎕ 주입하고, 이동상은 n-헥산, 염화 n-부틸, 아세토니트릴부틸을 5:2:1로 함유하며, 타크로리무스의 유지 시간이 약 15분이 되도록 유속을 조정하고, 칼럼 온도는 25℃로 하였다.
상기 분석 결과를 나타낸 도 1를 보면, 아스코마이신을 비롯한 다른 불순물의 함량이 0.5%이하로 나타나 99.67%의 고순도 타크로리무스가 수득되었음을 알 수 있다.
도 1은 실시예 6-3 에서 수득한 타크로리무스 결정물을 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 도이다.

Claims (9)

  1. 타크로리무스를 생산하는 스트렙토마이세스 속의 균주를 배양하여 얻어진 발효 배양액을 메탄올, 아세톤 또는 에탄올로 추출 및 여과하는 공정; 여액을 1차 정제 수지인 비이온성 흡착수지에 흡착시키고 용리하여 수득하는 공정; 1차 정제 농축액을 클로로포름 또는 에틸아세테이트로 추출,농축하여 톨루엔 또는 헥산에 트리에틸아민수용액을 혼합시켜 알칼리화시킨 비극성용매로 석출하는 공정; 석출물을 용해하여 2차 정제수지인 플래시 컬럼에 흡착시키고, 은염이 포함된 수용성 용매로 용리하여 농축하는 공정; 2차 정제농축액을 비수용성 극성용매로 추출 및 농축하고, 탈색 및 은염을 제거하기 위하여 활성탄을 사용하는 공정; 및 극성용매로 결정화하는 공정으로 이루어진 타크로리무스 회수 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 발효 배양액을 메탄올, 아세톤 또는 에탄올로 추출 및 여과하는 공정은 발효배양액에 극성용매를 동일한 부피로 첨가하여 추출, 여과하여 정제하거나 또는 균사체 덩어리만 따로 분리하여 극성용매로 추출한 후, 여액과 합하여 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 알칼리화시킨 비극성 용매가 톨루엔 또는 헥산에 트리에틸아민수용액을 1:2의 비율로 혼합시킨 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 1차 및 2차 정제 수지가 각각 독립적으로 SP825, HP2MG, HP20, CG161, CG300 및 SP20SS 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 1차 및 2차 정제의 용리액은 각각 독립적으로 은염을 포함하거나 포함하지 않는 용매로써 아세톤, 아세토니트릴, 이소프로판올 및 메탄올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
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