DE2227739C2 - Pseudomonsäuren, deren Natriumsalze und Methylester und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Pseudomonsäuren, deren Natriumsalze und Methylester und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number
DE2227739C2
DE2227739C2 DE2227739A DE2227739A DE2227739C2 DE 2227739 C2 DE2227739 C2 DE 2227739C2 DE 2227739 A DE2227739 A DE 2227739A DE 2227739 A DE2227739 A DE 2227739A DE 2227739 C2 DE2227739 C2 DE 2227739C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
acid
methyl ester
ester
mixture
acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2227739A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2227739A1 (de
Inventor
Kevin David Barrow
Graham London Mellows
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Original Assignee
BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB filed Critical BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Publication of DE2227739A1 publication Critical patent/DE2227739A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2227739C2 publication Critical patent/DE2227739C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D309/08—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/10—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

in der R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet und wobei die Doppelbindung in trans-Stellung steht, wenn R im Wasserstoffatom darstellt, und deren Natriumsalze und Methylester.
2. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 1 angegebenen Verbindungen der Formel I und von deren Natriumsalzen und Methylestern, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas fluorescens NCIB 10586 in herkömmlicher Weise unter aeroben Bedingungen auf oder in einer Kulturbrühe züchtet, die übliche anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, anschließend
a) die erhaltene Kulturbrühe mit einer Bariumionen liefernden Verbindung versetzt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt,
b) die Kulturbrühe mit Isobutylmethylketon extrahiert und den organischen Extrakt mit Wasser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 extrahiert,
c) den erhaltenen wäßrigen Extrakt abdampft, das zurückbleibende rohe Salzgemisch
d) entweder durch Ionenaustausch-Chromatographie in die Komponenten auftrennt oder gegebenenfalls in üblicher Weise mit Diazomethan in die Methylester überführt und das Estergemisch chromatographisch an Kieselgel mit einem Gemisch aus Chloroform und I&opropanol im Verhältnis 9 :! in die einzelnen Ester trennt und diese gegebenenfalls anschließend verseift und/oder in das Natriumsalz überführt.
Es ist seit Jahren bekannt, daß Pseudomonas fluorescens inhibierende Stoffe liefert. Einen guten Überblick über die Arbeiten auf diesem Gebiet gibt das Buch »Antibiotics« von H. W. Florey, E. B. Chain, N. G. Heatley, M. A. Jennings, A. G. Saunders, C. P. Abraham und M. E. Florey, Oxford University Press (1949), Band 1.
Es ist nun gelungen, ein Gemisch inhibierender Substanzen zu isolieren und dieses Gemisch in drei Komponenten aufzutrennen, von denen zwei in isomerer Form vorliegen.
Die Erfindung betrifft daher Pseudomonsäuren der allgemeinen Formel I
OH
CH
HO —CH
I /°\ I
H3C-CH-CH-CH-CH-CH2-C
I l\ ,
CH3 R CH2
HC-CO2-(CH2)J-CO2H
^CH-CH2-C-CH3 (D
in der R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet und wobei die Doppelbindung in trans-Stellung steht, wenn R ein Wasserstoffatom darstellt, und deren Natriumsalze und Methylester.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine gute antibakterielle Wirkung, die sowohl bei humanen wie auch Veterinären Krankheitserregern der Wirkung bekannter und im Handel erhältlicher antibakterieller Verbindungen überlegen ist. Vor dem Hintergrund der zunehmenden Bakterienresistenz kommt somit den erfindungsgemäßen Verbindungen besondere Bedeutung zu.
Die Pseudomonsäure der Formel I, in der R das Wasserstoffatom ist (im folgenden mit Säure I bezeichnet), läßt sich in Form ihres kristallinen Methylesters identifizieren und charakterisieren, der ein IR-Spektrum wie in Fig. 1 und ein NMR-Protonenspektrum wie in F i g. 2 aufweist.
Die freie Pseudomonsäure der Formel I, in der R das Wasserstoffatom ist, besitzt antibakterielle Aktivität, die wahrscheinlich mit der Anwesenheit der freien Carboxylgruppe zusammenhängt. Die Salze von Säure I sind daher aktiv, während der Methylester etwas weniger aktiv ist. Die Pseudomonsäure der Formel I, in der R die Hydroxylgruppe bedeutet, wird nachstehend auch als Säure II bezeichnet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, deren
Natriumsalze und Methylester, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man Pseudomonas fluorescens NCIB 10586 in herkömmlicher Weise unter aeroben Bedingungen auf oder in einer Kulturbrühe züchtet, die übliche anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, ar.schließend
a) die erhaltene Kulturbrühe mit einer Bariumionen liefernden Verbindung versetzt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt. ;o
b) die Kulturbrühe mit Isobutylmethylketon extrahier; und den organischen Extrakt mit Wasser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 extrahiert,
c) den erhaltenen wäßrigen Extrakt abdampft, das zurückbleibende rohe Salzgemisch
d) entweder durch lonenausiausch-Chromatographie in die Komponenten auftrennt oder gegebenenfalls in üblicher Weise mit Diazomethan in die Methylester überführt und das Estergemisch chromatographisch an Kicselgel mit einem Gemisch aus Chloroform und Isopropanol im Verhältnis 9:1 in die einzelnen Ester trennt und diese gegebenenfalls anschließend verseift und/oder in das Natriumsalz überführt.
25
Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht die erfolgreiche Abtrennung der aktiven Komponenten. Der größte Teil der aktiven Kultui flüssigkeit wird in dieser Verfahrensstufe in lösliche Bariumsalze überführt (was an sich überraschend ist. da die meisten Bariumsalze nicht in Wasser löslich sind), während die inaktiven Komponenten als unlöslicher Niederschlag zurückbleiben.
Nach Abtrennen des Niederschlags wird die Kulturbrühe in Stufe b) vorzugsweise bei einem pH-Wert von 4.5 mit Isobutylmethylketon (IBMK) extrahiert.
Der organische Extrakt wird dann mit Wasser bei einem pH-Wert von vorzugsweise 8,5 extrahiert. Falls erwünscht, kann die Extraktion mit Isobutylmethylketon und anschließend mit Wasser bei alkalischem pH-Wert mehrmals wiederholt werden.
Das nach Abdampfen des Wassers in Stufe c) erhaltene rohe Salzgemisch kann man der Ionenaustauscher-Chromatographie unterwerfen, vorzugsweise an einer Säule aus Polystyrolharz mit einem linearen Gradienten, wie er durch Eluieren mit 0,01 η Ammoniak in Methanol und mit 0,01 η wäßrigem Ammoniak erhalten wird. Nach dieser Methode wird zunächst eine Reihe von inaktiven Säuren mit niedrigem Molekulargewicht eluiert, anschließend erhält man die aktiven Fraktionen (30- bis 60prozentige Eluierung).
Zur weiteren Reinigung kann man das in Stufe c) erhaltene rohe Salzgemisch oder die nach der lonenaustausch-Chromatographie erhaltenen aktiven Fraktionen (Stufe d) gegebenenfalls z. B. in die Methylester umwandeln. Das Estergemisch wird dann durch Dünnschicht-Chromatographie auf Kieselgel mit einem Gemisch von Chloroform und Isopropanol im Verhältnis 9 :1 als Laufmittel aufgetrennt. Der Methylester der Pseudomonsäure der Formel ί, in der R eine Hydroxylgruppe ist (Säure II), liegt nur in geringer Menge vor und wird abgetrennt. Der Methylester der Säure I kann aus dem verbleibenden Gemisch umkristallisiert werden.
Zur Reinigung kann man aber auch den p-Bromphenacylester verwenden; die Art der Verseifung hängt dann von dem betreffenden Ester ab. Beim Bromphenylacylester kann die Methode von Sheehan et al, J. Org.
Chem. 1964. Band 29. Seite 2006. angewandt werden (Behandlung mit Natriumthiophenoxid).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1
Isolierung von antibakteriell wirksamen
Fraktionen
Pseudomonas fluorescens Stamm NCIB 10 586 wird submers bei 300C in einem Kulturmedium gezüchiu. das 1 Prozent Maisquellwasser und 0,5 Prozent Glukose in einem Lösungsgemisch basischer Salze enthält. Die Maximalausbeute an Antibiotikum wird nach 24 Stunden erhalten, wobei alle nachweisbaren aktiven Substanzen in der Kulturflüssigkeit vorliegen. Nach Zusatz von 0,5 Prozent Bariunichlorid werden die Zellen und die ausgefällten inaktiven Substanzen abzentrifugiert. Die aktiven Substanzen werden stufenweise durch Verteilung in 0.2 Volumenteile IBMK vom pH 4,5 in 0,8 Volumenteile Wasser vom pH 8,5 und in 0,25 Volumenteile IBMK vom pH 4,5 aufkonzentriert. Anschließend wird die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Nach weiterer Verteilung in Wasser vom pH 8,5 und Einstellung des pH-Wertes auf 7 bis 8 wird die wäßrige Lösung gefriergetrocknet. Man erhält ein Gemisch von Natriumsalzen, das bei 0'C mehrere Monate ohne Aktivitätsverlust gelagert werden kann.
In einem pH-Bereich von 4 bis 9 ist der Antibiotikumextrakt bei 37°C 24 Stunden stabil, außerhalb dieses Bereichs tritt ein rascher Aktivitätsschwund ein. Das Gemisch von Natriumsalzen zeigt ein breites antibakterielles Spektrum gegen gram-positive und gram-negative Bakterien, es weist eine geringe Toxi/.ität auf und ist bakteriostatisch gegenüber Stphylococcus aureus Stamm NCTC 6571 und Escherichia coli Stamm MRE 600.
Das rohe Säuregemisch wird chromatographisch an einem Polystyrolharz (Handelsprodukl) mit linearem Gradienten durch Eluieren mit 0.01 η Ammoniak in Methanol und mit 0,01 η wäßrigem Ammoniak gereinigt.
Zunächst wird eine Reihe von Säuren mit niedrigem Molekulargewicht eluiert und anschließend die Fraktionen, die die stärkste antibakterielle (biologische) Aktivität aufweisen (30- bis 60prozentige Eluierung).
Beispiel 2
Reinigung der Säuren I und Il
Werden die in Beispiel 1 erhaltenen biologisch aktiven Fraktionen mit Diazomethan in Äther methyliert, so zeigen sich bei der Dünnschicht-Chromatographie zwei Flecken. Es handelt sich dabei um den Methylester der Pseudomonsäure der Formel I, in der R ein Wasserstoffatom ist (Säure I) und als in geringerer Menge vorliegende Komponente, um den Methylester der Pseudomonsäure der Formel I, der R eine Hydroxylgruppe ist (Säure II), in einem Gewichtsverhältnis von etwa 9 : 1.
Der Methylester der Säure I (etwa 9 Gewichtsteile) wird mit Hilfe von Schicht-Chromatographie an Kieselgel mit einem Gemisch von Chloroform und Isopropanol im Verhältnis 9:1 als Laufmittel vom Methylester der Säure Il (etwa 1 Gewichtsteil) abgetrennt. 50 Gewichtsprozent des Methylesters der Säure 1 werden aus dem Gemisch durch Umkristallisieren aus Benzol/Petroläther gewonnen. Man erhält farblose Nadeln vom Fp. 76,5 bis 78°C.
Die Elementaranalyse ergibt die Formel Cv
gefunden:
berechnet:
C 62.8.
C63.0.
H 8,9%.
H 9.0%.
Der Ester ist optisch aktiv ([λ]" =9° (C 1.5 in Chloroform)).
Die Analyse des öligen p-Bromphenacylesters ergibt die Formel Ci4H
IO
gefunden:
berechnet:
C 58,1.
C 58.5.
H 6.9%.
H 7.0%.
Die Stamm-Monocarbonsäure. d. h. die Säure I. hat somit die Formel C>HuOa. Die Annahme wird bewiesen durch das Massenspektrum des Methylesters, in dem das Molekularion erwartungsgemäß bei /?j/e 514 liegt. Das IR-Spektrum des Methylesters (Fig. 1) zeigt : ν max. (CCI4) 3440 (Hydroxyl). 1740 (Ester). 1715 und 1650 cm ' (v^-ungesättigter Ester). Das UV-Spektrum (A max. (ÄtOH) 221.5 mit (t 13 400) bestätigt die Anwesenheit der ^-ungesättigten Esterbindung. Das NMR-Spektrum (Fig. 2) zeigt die Anwesenheit von zwei sekundären Methylgruppen (γ 9.09: 8.81). einer olefinischen Methylgruppc (ι·6.40) sowie eines olefinisehen Protons (}' 4.32).
Durch Acetylieren des Methylesters mit einem Gemisch von Pyridin und Essigsäureanhydrid erhält man ein Triacetat. CüH-^Ou, das bei katalytischer Hydrierung durch Absorption von 1 Mol Wasserstoff ein Dihydro-Derivat.CjiH^O^ergibt.
Die Reduktion des Methylesters mit Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran ergibt 1.9-Dihydroxynonanoat vom Fp. 46°C (Bis-phenylcarbamatderivat vom Fp. 168 bis 169°C). Durch Behandeln des p-Bromphenacylesters mit einem Gemsich von Kaliumpermanganat und Natriumperjodat erhält man p-Bromphenacyl-9-hydroxynonanoat. Ci7H2jBrO4, vom Fp. 77,5 bis 78°C.
C17H2)BrO4
gefunden: C 55.1, H 6,4%,
berechnet: C 55.0,
40
Durch schwach basische Hydrolyse des Methylesters erhält man 9-Hydroxynonanoatmethylester, C10H20O3, in Form eines Öls. Die Anwesenheit der 9-Hydroxynonanoat-Einheit in der Säure ! wird auch durch das Massenspektrum des Methylesters bestätigt Die Massenmessung des Fragments bei /n/e327 ergibt 327,18059 (327.18059 ber. für CnH2TOt,), was einer Abspaltung der Seitenkette -0(CH2)SCO2CH3 aus dem Molekularion entspricht.
Beispiel 3
Nachfolgend wird ein Oberblick über weitere Beobachtungen gegeben, die zur Aufstellung der Strukturformeln für die Säuren I und II führen.
a) Die Anwesenheit der Gj-Einheit in der Säure I wird durch die in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionen bestätigt
bl) Bindung der Gr Einheit an den Molekülrest
Die folgenden Beobachtungen haben bewiesen, daß die Cj-Einheit an den Molekülrest durch eine «^-ungesättigte Esterbindung gebunden ist, an die außerdem eine — CH3-Gruppe (chemische Verschiebung im NMR-Spektrum des Methylesters der Säure I und besimmter Derivate) gebunden ist:
Durch Behandeln eines durch cine I lydroxylgruppe geschützten Derivats des Methylesiers der Säure I mit a) Osmiumtetroxid in Pyridin. b) wäßrigem Natriummetabisulfat und c) Nairiumperjodai in wäßrigem Äthanol erhält man eine Verbindung der Formel
OHC · CO2CHo(CH:)„CI I2COOl,
(gekennzeichnet durch Elementaranalyse. NMR- und IR-Spektren: Scmicarbazondcrivat vom Fp. 164 bis 165,5 C) sowie ein Methvlkctonderivat des heterocyclischen Rings. Hiermit ist ebenfalls bewiesen, daß die -CHj-Gruppc am ^-Kohlenstoffatom des \,jiJ-ungesättigten Esters gebunden ist.
bll) Bestätigung der Doppelbindung ^
Der Methylester der Säure I und deren Triacetatderivat absorbieren bei katalytischer Hydrierung 1 Mol Wasserstoff, wodurch man die entsprechenden Dihydro-Derivatc erhält, die lediglich Endabsorption im UV-Spektrum zeigen.
blll)Stereochemie 2η der Doppelbindung
Daß die Doppelbindung als irans-Bindiing vorliegt wird aus den in der Literatur für chemische Verschiebungen (NMR-Spektrum) bei eis- und trans-CHi-Ciruppen. die an Doppelbindungen dieser Art gebunden sind, angegebenen Werten abgeleitet.
c) Art der Funktion im Molckülrest
a) Nachweis von Glykolgruppierungcn
i) Der Methylester der Säure I bildet ein Acctonidderivat. das durch Elemcntaranalyse. NMR- sowie IR- und UV-Spektren gekennzeichnet ist.
ii) Durch Behandeln des Methylesters der Säure I mit Natriumperjodat in wäßrigem Äthanol erhält man als einziges Produkt einen Dialdehyd. Damit liegt eine Glykolgruppierung vor. und zwar in einem Ring.
iii) Diese Beobachtung wird bestätigt durch NMR-Doppelresonanzversuchc mit Triacetat- und Tribenzoatderivaten.
b) Nachweis der Epoxidgruppc
I) Die Anwesenheit der Epoxidgruppe wird von chemischen Verschiebungen in den NMR-Spektren der beiden gebundenen Protonen des Methylesters der Säure I und deren Derivaten abgeleitet. Dies wird bestätigt durch NMR-Doppclresonan/-versuche und Versuche, welche die Spinnentkopplung und damit die Auflösung dicht beieinanderliegender Maxima in den NMR-Spektren ermöglichen.
c) Die Teilstruktur
OH
CH3CH-CH—
CH3
wird abgeleitet von chemischen Verschiebungen in den entsprechenden Protonen (NMR) des Acetonidderivats des Methylesters der Säure I sowie des Oxidationsprodukts, dem
Aceto\idketonderivat des Meihylesters der Säure I. das die Teilstmkuir
Il
CH3C CH-CH3
aufweist.
d) Die Struktur des Mcthylkclons des heterocyclischen Rings und damit die Struktur der Säure I, wie in der Frorme! I aufgezeigt, wird iviii Hilfe von Spinnen! kopp'ungs- und Doppelresonan/versuchen in den NMR-Spcktren der entsprechenden Methylkctontriaeetai- und -iribenzoatderivatc abgeleitet.
Säure Il
Aus den Spektren des Meihylesters der Saure Il und deren Triacetatderivat (Massenspektrum, UV-. NMR- und IR-Spcktren) läßt sich dessen enge Beziehung zum Melhylestcr der Säure I ableiten, der eine zusätzliche Hydroxylgruppe aufweist.
Die in der Formel I aufgezeigte Struktur, wobei R eine Hydroxylgruppe ist, wird mit Hilfe von NMR-Doppelresonanzversuchen am Triaeetalderivat des Methvl kctons des heterocyclischen Ringes abgeleitet.
Beispiel 4
Hydrolyse des p-Bromphenacylcsters der unreinen Pseudomonsäure
234 mg des p-Bromphenacylesters in 3 ml Dimethylformamid werden mit 230 mg Natriumthiophenoxid versetzt. Nach 30 min wird ein Überschuß an eisgekühltem Aceton zugegeben, das Reakti'Misgemisch wird 2 h bei OC stehengelassen. Das unreine Pseudonionsäurenatriumsalz wird abzentrifugiert. in Wasser gelöst, der pH-Wert wird mit verdünnter Salzsäure auf 4.5 eingestellt. Die freie Säure wird mit Äther, der 5% Äthanol enthält, extrahiert. Die Ätherphase wurd mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck auf 15 ml eingeengt. Man erhält die unreine freie Säure.
Veresterung der Säure
Die oben hergestellte unreine Säure wird mit einem Überschuß von Diazomethan in Äther versetzt. Nach 1 μ wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, das Produkt wird durch präparative Schichtchromatographie auf Kieselgel mit zweimaliger Entwicklung mit 3% Isopropanol in Chloroform gereinigt. Rr: 0,2 bis 0.25. Man erhält 180.3 mg des unreinen Pseudomonsäure-methylesters als Öl. vma, (CHCl3): 3440 (breit). 1735. 1710. 1220. 1155. 1050 cm-'.
λη,αχ (Äthanol): 220 nm({ = 1600).
r = 9.O9 3H, d (J = 7Hz): r = 8,81 3H, d (J=63 Hz): r=7,84,3Rd(J = I Hz)undr=4JZ IRbreitess.
Dieser Methylester ist gemäß, der Dünnschichtchromatographie, der UV-. IR- und NMR-Spektren mit dem unreinen Methylester identisch, der direkt aus dem sauren Extrakt der Fermentationskulturbrühe durch Behandeln mit Diazomethan in Äther hergestellt worden ist
I i c ι s ρ i c I '5
Bildung des Salzes
Die durch Reinigung an einer Polystyrolharz.-Säulc j (siehe Beispiel 1) hergestellte rohe Säure wird in Isobutylmethylketon gelöst und in Wasser extrahiert durch allmähliche Zugabe von verdünnter Natronlauge, bis der pH-Wert der wäßrigen Phase 7 erreicht. Die wäßrige Phase wird lyophilisiert; man erhält das H) Natriumsalz der unreinen Säure. Das Bariumsalz wird entsprechend hergestellt.
Beispiel 6
0,514 g (1 mMol) Pseudomonsäure-methylester werden in 50 ml trockenem Dimethylformamid und 250 ml 0,05 rn Phosphatpuffer, pH 7, gelöst und 18 h mit 12 g Bäckerhefe geschüttelt. Die Suspension wird dann zentrifugiert, der feste Rückstand wird mit Äthanol gewaschen und noch einmal zentrifugiert. Die Lösung und das Waschwasser werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Äthanol aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat und gesättigter Natriumchloridlösung aufgenommen, der pH-Wert wird durch Zugabe in In Salzsäure auf 3,0 eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem gelben Öl eingedampft. Ausbeute:
0,514 g. Nach der Behandlung mit trockenem Äther erhält man 0,332 g (66%) Pseudomonsäure als weißen Feststoff, Fp. 77 bis 78°C. der sowohl in der Dünnschicht- als auch in der Hochdruckflüssigchromatographie homogen ist.
40
45 C26H44O9:
berechnet:
gefunden:
C 62,38, H 8,86%,
C 62,62, H 8.70%.
[tx\f : -7.4° (c= 1 % in Chloroform)
Λ™, (Äthanol): 222 nm (ε = 14 500).
f,,)1M (KBr): 3470,1728,1720,1712.1650 cm-'.
0H(db-DMSO)5.61(lH.s,CH = C):2.06(3H.s.
C=C
CH3
1,04 (3H. d, J = 6.5 Hz. >CHCH3); 0.80 (3H, d. J =6.5 Hz.
> CHCH3).
Oc (db-DMSO): 174,3, 165,7, 116,6, 74,5, 69,4. 68.2, 67.7.
64,6, 62,9. 59,0. 54.6, 42,5, 41.8. 40.0. 33.6. 31.5. 28.5. 28.1.
25,4,24,4,20,0,18.5,11,6.
Beispiel 7
Reinigung der Pseudomonsäure, ihre Isolierung
und Charakterisierung als reines Natriumsalz
Das rohe Gemisch von Natriumsalzen, das das aus der Fermentationsbrühe isolierte Pseudomonsäure-natriumsalz (wie in Beispiel 1 beschrieben) enthält wird wie folgt gereinigt:
723 g Rohextrakt, der 52% Pseudomonsäure-natriumsalz enthält werden in 300 ml Wasser gelöst unter Rühren mit 300 ml Äthylacetat überschichtet und mit In Salzsäure auf pH 3,5 angesäuert Die Phasen werden getrennt die wäßrige Phase wird einmal mit 200 ml und einmal mit 100 ml Äthylacetat extrahiert Die vereinig-
ten Äthylacetatextrakte werden dreimal mit je 300 ml gesättigter Natriiiinchloridlösung gewaschen und unter vermindertem Druck ohne einzutrocknen bei einer Temperatur von 30"C oder darunter zu einem dunkelbraunen Öl eingedampft. Das Säurengemisch wird unter Rühren in 100 ml Wasser suspendiert und mit 0.880 ml wäßrigen Ammoniaks auf pH 8.0 versetzt. Die entstandene wäßrige Lösung der Ammoniumsalze wird in einer Glassäule mit einem inneren Durchmesser von 22,86 cm, die 5 kg frisch regeneriertes Polystyrolharz (Handelsprodukt) enthält, Chromatographien.
Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min während 38 h mit einem linearen Gradienten eluiert, der durch Zusetzen von 0,005n methanolischem Ammoniak zu 0.01 η wäßrigem Ammoniak hergestellt wird. Es werden 100-ml-Fraktionen gesammelt, die durch Hochdruckflüssigchromatographie kontrolliert werden. Die Fraktionen, die das Pseudomonsäure-ammoniumsalz in einer Reinheit über 85% enthalten, werden gesammelt, d. h. die Fraktionen, die nach einer Elution zwischen etwa 18 und 38 h erscheinen. Diese Fraktionen werden gesammelt, das Methanol wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 300C abgedampft.
Die Konzentration des Pseudomonsäure-ammoniumsalzes in der entstandenen wäßrigen Lösung wird durch Hochdruckflüssigchromatographie (oder durch Eindampfen einer Probe und Auswiegen der entstandenen reinen Pseudomonsäure) bestimmt. Ein Lösung von
OH
HO
2(1
1,1 val Natriumbicarbonat in 100 ml Wasser wird zugegeben. Die vereinigten Lösungen werden unter vermindertem Druck 2 h gerührt, um noch vorhandenes Ammoniak und Methanol zu entfernen und um die Lösung einzuengen. Zur Entfärbung werden 5 g Kohle zugegeben, die Lösung wird weitere 30 min gerührt und durch Diatomeenerde filtriert. Die Filtrate und das Waschwasser werden gefriergetrocknet. Das entstandene weiße Pulver wird über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck getrocknet.
Das hygroskopische gefriergetrocknete Pseudotnonsäurc-natriumsal/ wird in 100ml trockenem Äthanol gelöst und filtriert, um überschüssiges Natriumbicarbonat zu entfernen. Das Filtrat wird unter Rühren mit 4 Liter trockenem Äther versetzt. Der dabei ausfallende weiße Niederschlag von Pseudomonsäure-natriunisalz wird abliltriert. mit I Liter trockenem Äther gewaschen und im Hochvakuum über Phosphorpentoxid während 3 Tagen getrocknet. Man erhält 28.0 g reines Pseudomonsäure-natriumsalz als weißes Pulver, dessen Reinheit 84% beträgt, bestimmt durch Hochdruckflüssigchromatographie gegen eine reine Standardprobe von kristalliner Pseudomonsäure.
berechnet:
gefunden:
C 59.7,
C 59.2.
H 8.3,
H, 8.2.
Na 4.4%,
Na 4,3%.
- 18,5" (c = 1.0 in Wasser).
O C H2(C Hj)7C O2N a
^„,.„(Äthanol):(Äthanol): 223 nm (ε = 13 200).
V1111n (KBr-Scheibe): 1700 (breit). 1642, 1225, 1150 und 1055 cm-1.
on (D2O): 5.83 (IH. m, -CH=C<); 2,22 (3H, breites s.
-C(CH3) = C<):1.26(3H.d. J = 7 Hz,CH3-CH<) und 0,99(3H,d, J =6 HzXH3-CH):
Oc(D2O): 184,52
(C-1'). 169.33 (C-1). 159,20 (C-3), 118,50 (C-2), 75.72 (C-5), 70,86 (C-7. C-13), 69,95 (C-6). 66,25 (C-16), 65,96 (C-9'), 62,55 (C-11), 57,94 (C-10), 43,31 (C-12, C-4), 40,30 (C-8). 39,02 (C-2'). 32,48 (C-9), 30,40 und 29,98 (C-4', C-5'. C-6'). 29.53 (C-8'). 27.40 (C-7'). 26.92 (C-3r). 20.12 (C-14), 19.73 (C-15) und 12,53 (C-17).
Pharmakologische Versuche Antibakterielle Aktivität der Verbindungen der Formel I
Die Mindesthemmkonzentrationen werden durch Serienverdünnung in Nähragar, der 5% defibriniertes Pferdeblut enthält, in Petrischalen bestimmt Die Beimpfung wird mit einer Vorrichtung durchgeführi, die ein Inoculum von 0,001 ml einer über Nacht statistisch gewachsenen Nährbrühe-Kultur des Testorganismus (etwa 5XlO5 Zellen je Tropfen) abgibt Die Hemmung des Wachstums wird nach einer Inkubation über Nacht bei 37° C bestimmt
Die Mindesthemmwerte für Pseudomonsäure-natriumsalz (A), Pseudomonsäure-methylester (B) und Pseudomonsäure 1 -methylester (C) (Formel 1, R=OH) gegen 5 Organismen sind in Tabelle I zusammengestellt
Tabelle I Mindesthemmkonzentration (fig/ml) B C
Organismas A 125 250
>100 0,02 <l,0
E. coli JTI 0,12 0,02 <l,0
B. sabtQis 0,12 0,05 <l,0
S. aureus Oxford 0,25 0,01 <l,0
S. aureus Russell 0,12
ß-Haemolytische Strep. CNlO
b) Vergleich von Pseudomonsäure-natriumsalz (PSNa. Verbindung der Formel I, R = H) und verschiedener antibakterieller bekannter Verbindungen.
Angegeben ist die Mindesthemmkonzentration in > ug/ml.
I) Humane Krankheitserreger i) Streptococcus pyrogenes (Haut- und Weichteilinfektionen)
PSNa 0,05-0.5
Fucidin 12,5-50 ii) Haemophilus influenzae (Infektionen der Atemwege und Meningitis)
PSNa < 0.02-0,25
Ampicillin 0.25-0,5 iii) Bordetella pertussis (Keuchhusten)
PSNa s 0.02
PenicillinG 1.0-2,5 2) Veterinäre Krankheitserreger
i) Haemophilus spp (Infektionen der Atemwege bei Schweinen)
H-parahaemolyticus H. suis
PSNa
Tylosin		 0,312-0,625
40-80		 0,156-0,625
5,0
ii) Pasteurella spp
P. multoeida P. haemolytica
PSNa
Tylosin
Oxytetracyclin
0,02-0,07
10-20
0,156-0,625 0,04-0,625
20-80
0,312-0,625
iii) Treponema hyodysenteriae (Schwein-Dysentrie)
PSNa 2,5-5,0
Tylosin 5,0->80
Oxytetracyclin l,25->80
Virginiamycin 5-20
Carbadox 10->80
Dimetridazol 20->80
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentansprüche: L Pseudomonsäuren der allgemeinen Formel 1
    OH
    CH HC-CO2-(CHz)8-CO2H
    / \ Il
    OH η HO — CH CH-CH2-C-CH3 (D
    I /\ I
    H3C-CH—CH-CH-CH-CH2-C
    I i\ /
    CH3 R CH2
DE2227739A 1971-06-12 1972-06-07 Pseudomonsäuren, deren Natriumsalze und Methylester und Verfahren zu ihrer Herstellung Expired DE2227739C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB2765371A GB1395907A (en) 1971-06-12 1971-06-12 Antibiotics

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2227739A1 DE2227739A1 (de) 1973-01-04
DE2227739C2 true DE2227739C2 (de) 1982-07-29

Family

ID=10263082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2227739A Expired DE2227739C2 (de) 1971-06-12 1972-06-07 Pseudomonsäuren, deren Natriumsalze und Methylester und Verfahren zu ihrer Herstellung

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4289703A (de)
JP (2) JPS548753B1 (de)
BE (1) BE893376Q (de)
CH (1) CH584755A5 (de)
DE (1) DE2227739C2 (de)
GB (1) GB1395907A (de)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1565083A (en) * 1976-02-20 1980-04-16 Beecham Group Ltd Pseudomonic acid amides
GB1587058A (en) * 1976-06-15 1981-03-25 Beecham Group Ltd Oxiranylmethyltetrahydropyran derivatives
US4206224A (en) * 1976-10-23 1980-06-03 Beecham Group Limited Treatment of infections
GB1577730A (en) * 1976-10-23 1980-10-29 Beecham Group Ltd Treatment of infections with pseudomonicacid salts or esters thereof
CA1103264A (en) * 1977-09-30 1981-06-16 Norman H. Rogers Purification of pseudomonic acid
DE2860724D1 (en) * 1977-11-01 1981-08-27 Beecham Group Plc Pseudomonic acid c, pharmaceutically acceptable salts or esters thereof, processes for their preparation and pharmaceutical or veterinary compositions containing them
GB2009154B (en) * 1977-11-10 1982-06-23 Beecham Group Ltd Antibacterial compounds
IL56003A0 (en) * 1977-12-03 1979-01-31 Beecham Group Ltd Novel thiol esters of monic acid, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
EP0004412A1 (de) * 1978-01-21 1979-10-03 GKN Transmissions Limited Stufenlos regelbares Getriebe
CA1115699A (en) * 1978-05-20 1982-01-05 Alan D. Curzons Lithium pseudomonate and its preparation
DE3066424D1 (en) * 1979-11-10 1984-03-08 Beecham Group Plc Antibacterial derivatives of monic acid, processes for their preparation and compositions containing them
EP0042233A1 (de) * 1980-06-14 1981-12-23 Beecham Group Plc 13-Oxo-monsäure und ihre Salze und Ester, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Zubereitungen
US4436751A (en) * 1980-12-31 1984-03-13 Beecham Group Limited Nitrobenzyl monates antibacterial compounds
CA1196284A (en) * 1982-05-28 1985-11-05 Joshua Oduro-Yeboah Pharmaceutical formulations
GB8313035D0 (en) * 1983-05-12 1983-06-15 Beecham Group Plc Compound
GB8415579D0 (en) * 1984-06-19 1984-07-25 Beecham Group Plc Compounds
GB8530796D0 (en) * 1985-12-13 1986-01-22 Beecham Group Plc Pharmaceutical composition
US5594026A (en) * 1990-12-11 1997-01-14 Smithkline Beecham Group P.L.C. Polymorphs of crystalline mupirocin
GB9026873D0 (en) * 1990-12-11 1991-01-30 Beecham Group Plc Novel compounds
JP2003515311A (ja) 1999-02-03 2003-05-07 ビオガル ジョジセルジャール アール テー． 微生物学的方法によるシュードモン酸ａ抗生物質の調製方法
YU55501A (sh) 1999-02-03 2003-07-07 Biogal Gyogyszergyar Rt. Proces za izolaciju pseudomonične kiseline a iz kompleksa pseudomonične kiseline sadržanog u kulturnom bujonu
US7439045B2 (en) 2001-06-21 2008-10-21 TEVA Gyógyszergyár Zártkörúen Müködö Részvénytársaság pH controlled fermentation process for pseudomonic acid production
CN1625394A (zh) 2001-12-28 2005-06-08 拜奥盖尔药厂有限公司 结晶和无定形莫匹罗星钙的制备方法
ES2339682T3 (es) 2004-06-01 2010-05-24 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Procedimiento para la preparacion de la forma amorfa de un farmaco.
US7619102B2 (en) * 2005-02-21 2009-11-17 Axellia Pharmaceuticals Aps Purification of mupirocin
GB2441328A (en) * 2006-08-30 2008-03-05 Alpharma Aps A method for obtaining mupirocin calcium
EP4190780A4 (de) * 2020-08-25 2024-03-20 Hangzhou Zhongmeihuadong Pharmaceutical Co., Ltd. Verfahren zur extraktion von mupirocin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT

Also Published As

Publication number Publication date
DE2227739A1 (de) 1973-01-04
BE893376Q (fr) 1982-10-01
JPS5495796A (en) 1979-07-28
CH584755A5 (de) 1977-02-15
GB1395907A (en) 1975-05-29
JPS5638119B2 (de) 1981-09-04
US4289703A (en) 1981-09-15
JPS548753B1 (de) 1979-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2227739C2 (de) Pseudomonsäuren, deren Natriumsalze und Methylester und Verfahren zu ihrer Herstellung
CH637398A5 (de) Verfahren zur herstellung von maytansinoidverbindungen.
DE2521197C2 (de) 1-(2-Deoxy-&amp;beta;-D-erythro-pentofuranosyl)-5,6-dihydro-5-methyl-s-triazin-2,4(1H,3H)-dion und Derivate
DE2743654B2 (de) Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144-, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Glycoside enthaltende pharmazeutische Zubereitungen
DE2437160A1 (de) Neue pseudotrisaccharide und verfahren zu ihrer herstellung
DE2132445C2 (de) Ester der Antibiotika B5050 und Tetrahydro-B-5050 und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2849696A1 (de) Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-3
DE2149750A1 (de) Erythromycin-Derivate
DE2514185A1 (de) Halogenierte antibiotika und verfahren zu deren herstellung
DE2748530C3 (de) Fortimicin D und KE und deren Salze mit Säuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
CH620243A5 (de)
CH644121A5 (de) 9h-pyrido(3,4-b)indol-derivate.
DE2014277C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Acylderivaten des Antibiotikums T-2636 C
DE2746209C2 (de)
DE3041130C2 (de)
DE2208631C3 (de) N-Isobornyloxycarbonylcephalosporin C, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Cephalosporin C
DD140477A5 (de) Verfahren zur herstellung von a-40104-antibiotika und derivaten davon
DE102004005106A1 (de) Sorbifuranone, Sorbivineton, Sorbivinetol und Derivate dieser Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
DE4231289A1 (de) Neuer Naturstoff Cyclamenol und chemische Derivate
DE2261832C3 (de) 5-Dihydrocoriolin C und Verfahren zu seiner Gewinnung
DE2412890C3 (de) Purpuromycin-Verbindungen
DE2248793C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Macrolid-Antibiotika
AT301030B (de) Verfahren zur herstellung von neuen spiramycinderivaten
DE2637545A1 (de) Antibiotica bm123 und ihre herstellung
DE1618995A1 (de) Neue Antibiotika,Verfahren zu ihrer Herstellung auf biologischem Wege,Arzneipraeparate und Futtermittel,die diese Antibiotika enthalten

Legal Events

Date Code Title Description
OD Request for examination
D2 Grant after examination