DE2227739A1 - Neue antibakteriell wirksame substanzen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Neue antibakteriell wirksame substanzen und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
11 Heue antibakteriell wirksame Substanzen und Verfahren
zu ihrer Herstellung "
zu ihrer Herstellung "
Priorität: 12.Juni 1971, Grossbritannien, Nr. 27 653/71
Es ist seit Jahren bekannt, dass Pseudomonas fluorescens inhibierende
Stoffe liefert. Einen guten Überblick über die Arbeiten auf diesem Gebiet gibt das Buch "Antibiotics" von
H.W. Florey, E.B. Chain, IT.G. Heatley > M.A. Jennings,
A.G. Saunders, E.P. Abraham und M.E. Florey, Oxford University Press ,(1949)» Band I. Es ist nun gelungen, ein Gemisch inhibierender Substanzen zu isolieren und dieses Gemisch in drei
Komponenten aufzutrennen, von denen zwei in isomerer Form vorliegen.
H.W. Florey, E.B. Chain, IT.G. Heatley > M.A. Jennings,
A.G. Saunders, E.P. Abraham und M.E. Florey, Oxford University Press ,(1949)» Band I. Es ist nun gelungen, ein Gemisch inhibierender Substanzen zu isolieren und dieses Gemisch in drei
Komponenten aufzutrennen, von denen zwei in isomerer Form vorliegen.
Die Erfindung betrifft daher neue, aus Pseudomonas fluorescens gewinnbare antibakteriell wirksame Substanzen in praktisch neuer
Form oder in Form eines Gemisches von drei Verbindungen.
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Zwei dieser Verbindungen sind die Säure I (genannt "pseudcmornο
acid") iind deren Isomeres, v/elche ciie Formel I
aufv/eist, während die dritte Verbindung die Säure II ist (genannt
"pseudomonic acid I")» welche die Formel II
. CH. CH. CH. CH. CH2
GH.C02(CH2)8C0gH
Il
A ^^ \pH.CHo.C.
(H)
aufweist.
Der Methylester eines Isomeren der IOrmel I kann leicht kristallisiert
v/erden.
Die drei Verbindungen können einzeln isoliert werden. Die Erfindung
"betrifft daher auch die Säuren I und II in praktisch
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reiner Form sowie deren Salze und Ester.
Säure I lässt sich in Form ihres kristallinen Methylesters identifizieren und charakterisieren, der ein IR-Spektrurn wie in
Figur 1 und ein NMR-Protonenspektrum wie in Figur 2 auf v/eist.
Säure I basitzt antibakterielle Aktivität, die wahrscheinlich
mit der Anwesenheit der freien Carboxylgruppe zusammenhängt. Die Salze von Säure I sind daher aktiv, während die Methyl-
und p-Bromphenacylester weniger aktiv sind. Die Erfindung betrifft
somit auch die Salze von Säure I und anderer Derivate der freien Carboxylgruppe, die leicht hydrolisiert v/erden können,
wodurch man die Stammsäure I erhält.
Es wird angenommen, dass die Verbindung der Formel I in zwei
isomeren Formen mit eis- und trans-Konfiguration an der Doppelbindung
vorliegt,"und dass die in Form des kristallinen Methylesters in den Figuren 1 und 2 charakterisierte Säure I
das trans-Isomer ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der
Verbindungen der Formeln 1 und II in praktisch reiner Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Pseudomonas fluorescein
unter aeoroben Bedingungen auf oder in' einer Kulturbrühe
züchtet, die anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff· und Stickstoffquellen enthält, bis die Kulturbrühe mindestens
nachweisbare antibakteriell wirksame Substanzen aufweist, die' Kulturbrühe anschliessend mit einer Bariumionen liefernden Verbindung
versetzt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt,
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die Kulturbrühe mit einen organischen Lösungsmittel für die
in der Kulturbrühe gelösten aktiven Substanzen extrahiert, den organischen Extrakt mit Wasser bei einem pH-Wert von 7 bis 9
extrahiert, das Wasser bis zur Bildung eines festen Rückstandes eindampft und den Rückstand in aktive und im wesentlichen inaktive
Fraktionen auftrennt.
Die aktiven Fraktionen können kombiniert werden, wodurch man ein Gemisch der drei verschiedenen Säuren erhält.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird Pseudomonas fluorescens
nach herkömmlichen Methoden gezüchtet. Alle Stämme des Mikroorganismus liefern in geringerem oder höherem Masse die Säure
Ein besonders geeigneter, öffentlich zugänglicher Stamm ist jedoch Pseudomonas fluorescens NCIB 10 586 (NGIB = National
Collection of Industrial Bacteria .).
Die nächste Verfahrensstufe, nämlich der Zusatz einer Bariumionen
liefernden Verbindung zur Kulturbrühe, wird als die entscheidende Massnahme betrachtet, die die erfolgreiche Abtrennung
der aktiven Komponenten ermöglicht. Der grösste Teil der aktiven Kulturflüssigkeit wird in dieser Verfahrensstufe in
lösliche Bariumsalze überführt (was an sich überraschend ist, da die meisten Bariumsalze nicht in Wasser löslich sind), während
die inaktiven Komponenten als unlöslicher Niederschlag verbleiben.
Nach Entfernung des Niederschlags werden die aktiven Substanzen aus der wässrigen Lösung mit einem geeigneten Lösungsmittel
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extrahiert. Als Lösungsmittel eignet sich vor allem Isobutylmethylketon
(IBMK). Ebenfalls geeignet ist Äther mit einem 5prozentigen Gehalt an Äthanol sowie Chloroform, beide Lösungsmittel
sind aber nicht so wirksam wie IBMK.
Der organische Extrakt wird dann mit V/asser bei einem alkalischen
pH-Wert extrahiert, und die Salze der aktiven Substanzen werden durch Eindampfen des Wassers gewonnen. Falls erwünscht,
kann die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel und anschliessend mit Wasser bei alkalischem pH-Wert mehrmals wiederholt
werden, um so ein erfolgreiches Extrahieren der aktiven
Substanzen zu gewährleisten.
Die inaktiven Verunreinigungen werden aus dem Salzgemisch entweder
dadurch abgetrennt, dass man das .rohe Salzgemisch der Ionenaustauscher-Chromatographie unterwirft oder dadurch, dass
man das Salzgemisch verestert und das veresterte Gemisch der Kieselgel-Chromatographie unterwirft. Mr die Ionenaustauscher-Chromatographie
eignet sich eine Säule aus Polystyrolharz mit einem linearen Gradienten, wie er durch Eluieren mit 0,01 η
methylalkoholischem Ammoniak und mit 0,01 η wässrigem Ammoniak erhalten wird. Nach dieser Methode wird zunächst eine Reihe von
inaktiven Säuren mit niedrigem Molekulargewicht eluiert, anschliessend die aktiven Fraktionen (30- bis 60prozentige EIuierung).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
der Säure I in praktisch reiner Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine aktive Fraktion gemäss dem
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vorstehend beschriebenen Verfahren herstellt, diese Fraktion verestert und aus dem Gemisch von Estern der drei verschiedenen
Säuren den Ester der Säure I abtrennt und verseift.
Die Erfindung betrifft gleichermassen ein Verfahren zur Herstellung
der Säure II in praktisch reiner Form, das dadurch gekennzeichnet' ist, dass man eine aktive Fraktion verestert und
aus dem G-emisch von Estern der drei verschiedenen Säuren den Ester der Säure II abtrennt und verseift.
Zur Durchführung der Verfahren der zuletzt genannten Ausführungsformen
der Erfindung wird die aktive Fraktion z.B. in die Methylester umgewandelt, und das Estergemisch wird dann in
seine drei Komponenten aufgetrennt. Dies erfolgt durch Dünnschicht-Chromatographie
nach der herkömmlichen Methode, z.B. auf Kieselgel mit einem Gemisch von. Chloroform und Isopropanol
im Verhältnis 9 · 1 als laufmittel. Dadurch wird der Ester der
Säure II, der in geringer Menge vorliegt, abgetrennt. Der Methylester der Säure I kann aus dem verbleibenden Gemisch umkristallisiert
werden.
Die Art der Verseifung der einzelnen Komponenten hängt von dem betreffenden Eoter ab. Beim p-Bromphenacylester kann die Methode
von Sheehan et al., J. Org. Chem. 1964, Band 29, Seite 2006
angewandt werden (Behandlung mit Natriumthiophenoxid).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung :
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Beispiel 1
Isolierung von antibakteriell wirksamen Fraktionen
Pseudomonas fluorescens Stamm KGIB 10 586 wird submers "bei
3O0G in einem Kulturmedium gezüchtet, das 1 Prozent Maisquellwasser
und 0,5 Prozent Glukose in einem Lösungsgemisch "basischer
Salze enthält. Die Maximalausbeute an Antibiotikum wird
nach 24 Stunden erhalten", wobei alle nachweisbaren aktiven Substanzen in der Kulturflüssigkeit vorliegen. Nach Zusatz von 0,5
Prozent Bariumchlorid werden die Zellen und die ausgefällten inaktiven Substanzen abzentrifugiert. Die aktiven Substanzen ·
werden stufenweise durch Verteilung in 0,2 Volumenteile IBMK vom pH 4,5 in 0,8 Volumenteile Wasser vom pH 8,5 und in 0,25
Volumenteile IBMK vom pH 4,5 aufkonzentriert. Anschliessend
wird die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Nach weiterer Verteilung in Wasser vom pH 8,5 und Einstellung des
pH-Werts auf 7 bis 8-wird die wässrige Lösung gefriergetrocknet
. Man erhält ein Gemisch von Natriumsalzen, das bei O0G
mehrere Monate ohne Aktivitätsverlust gelagert werden kann.
In einem pH-Bereich von 4 bis 9 ist der Antibiotikumextrakt
bei 37°0 24 Stunden stabil, ausserhalb dieses Bereichs tritt ein rascher Aktivitätssenwund ein. Das Gemisch von Natriumsalzen
zeigt ein breites antibakterielles Spektrum gegen grampooitive
und gram-negative Bakterien, es weist eine geringe Toxizität auf und ist bakterlöstatisch gegenüber Stphylococcus
UC TC
aureus Stamm /6571 und Escherichia coli Stamm MRE 600'· . '
aureus Stamm /6571 und Escherichia coli Stamm MRE 600'· . '
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Das rohe Säuregemisch wird chromatographisch an einem Polystyrolharz
(Handelsprodukt) mit linearem Gradienten durch EIuieren mit 0,01 η methylalkoholischem Ammoniak und mit 0,01 η
wässirgem Ammoniak -gereinigt.
Zunächst wird eine Reihe von Säuren mit niedrigem Molekulargewicht
eluiert und anschliessend die Fraktionen, die die stärkste anti"bakterielle (biologische) Aktivität aufweisen (30- "bis
60prozentige Eluierung).
Werden die in Beispiel 1 erhaltenen "biologisch aktiven Fraktionen
mit Diazomethan in Äther methyliert, so zeigen sich bei der Dünnschicht-Chromatographie zwei Flecken. Es handelt sich
dabei um den Methylester der Säure I und deren Isomeres sowie, als in geringerer Menge vorliegende Komponente, um den Methylester
der Säure II in einem Gewichtsverhältnis von etwa 9 ί 1·
Der Methylester der Säure I und deren Isomeies(etwa 9 Gewicht 3-teile)
wird mit Hilfe von Schicht-Chromatographie an Kieselrgel
mit einem Gemisch von Chloroform und Isopropanol im Verhältnis 9 - 1 als Laufmittel vom Methylester der Säure II
(etwa 1 Gewichtsteil) abgetrennt. 50 Gewichtsprozent'des
Methylesters der Säure I und deren Isomeies werden aus dem Gemisch
durch Umkristallisieren aus Benzol/Petroläther gewonnen. Man erhält farblose Nadeln vom Fp. 76,5 bis 780C.
Die Elementaranalyse ergibt' die Formel Cp7H-^Oq.
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C, Prozent H, Prozent
C27H46°9
gefunden : berechnet:
62,8
63,0
63,0
8,9 9,0
Der Ester ist optisch aktiv (
= 9° (C 1,5 in Ghloroforr/J) .
Die Analyse des öligen p-Bromphenacylesters ergibt die Formel
C, Prozent H, Prozent
C54H49BrO10
gefunden : "berechnet:
58,1
.58,5
.58,5
6,9 7,0
Die Stamm-Monocarbonsäure, d.h. die Säure I, hat somit die
Formel Cp/-H,»Oq. Diese Annahme wird bewiesen durch das Massenspektrum
des Methylesters, in dem das Molekularion erwartungsgemäss
bei m/e 514 liegt. Das IR-Spektrum des Methylesters (Figur 1) zeigt : ^ ira-χ. (CCl4) 3440 (Hydroxyl), 1740 (Ester),
1715-und 1650 cm" ( 0(,ß-ungesättigter Ester). Das UV-Spektrum
(X max.(ÄtOH) 221,5 myu (L 13400) bestätigt die Anwesenheit der
ex1,ß-ungesättigten Esterbindung. Das NMR-Spektrum (Figur 2)
zeigt die Anwesenheit von zwei sekundären Methylgruppen (Υ 9,09; 8,81), einer olefinischen Methylgruppe (Y 6,40) sowie
eines olefinischen Protons (γ 4,32).
Durch Acetylieren des Methylesters mit einem Gemisch von Pyridin und Essigsäureanhydrid erhält man ein Triacetat,
(/33^520I2 , das bei katalytischer Hydrierung durch Absorption
von 1 Mol Wasserstoff ein Dihydro-Derivat, C55H54O12 ergibt. -
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Die Reduktion des Methylesters mit Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran ergibt 1,9~Dihydroxynonanoat vom Pp. 460C
(Bis-phenylcarbamatderivat vom Fp. 168 bis 169°C). Durch Behandeln
des p-Bromphenacylesters mit einem Gemisch von Kaliumpermanganat
und Natriumperjodat erhält man p-Bromphenacyl-9-hydroxynonanoat,
C17H23BrO., vom Fp. 77,5 bis 780C.
C, Prozent H, Prozent
gefunden: 55,1 6,4
berechnet: 55,0 6,2
Durch schwach basische Hydrolyse des Methylesters erhält man 9-Hydroxynonanoatmethylester, Ο^ΗρΟΟ^, in Form eines Öls. Die
Anwesenheit der 9-Hydroxynonanoat-Einheit in der Säure I wird auch durch das Massenspektrum des Methylesters bestätigt.
Die Massenmessung des Fragments bei m/e 127 ergibt 327,18059 (327,18059 ber. für C17H27Og), was einer Abspaltung der Seitenkette
-0(CHp )οΟΟρΟΗ·2 aus dem Molekularion entspricht.
Nachfolgend wird ein Überblick über weitere Beobachtungen gegeben,
die zur Aufstellung der Strukturformeln für die Säuren I und II führen.
a) Die Anwesenheit der Cg-Einheit in der Säure I wird durch die in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionen bestätigt.
Die folgenden Beobachtungen haben bewiesen, dass die
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g an den Molekülrest durch eine <x,ß-ungesättigte
Esterbindung gebunden ist, an die ausserdem eine -CEU-G-ruppe (chemische Verschiebung im ITMR-Spektrum des
Methylesters der Säure 1 und "bestimmter Derivate) gebunden
ist:
!Durch Behandeln eines durch eine Hydroxylgruppe geschützten
Derivats des Methylesters der Säure I mit a) Osmiumtetroxid in Pyridin, b) wässrigem Hatriummetabisulfat
und c) Natriumperjodat in wässrigem Äthanol erhält man eine Verbindung der IOrmel
OHC.CO2GH2(CH2)6GH2C02CH5
(gekennzeichnet durch Elementaranalyse, NMR- und IR-Spektren;
Semicarbazonderivat vom Fp. 164 bis 165,50C)
sowie ein Methylketonderivat des heterocyclischen Rings. Hiermit ist ebenfalls bewiesen, dass die -CH^-Gruppe am
- ß-Kohlenst off atom des c\', ß-unge satt igten Esters gebunden
ist.
bll) Bestätigung der Doppelbindung
Der Methylester der Säure I und deren Triacetatderivat
absorbieren bei katalytischer Hydrierung 1 Mol Wasserstoff, wodurch man die entsprechenden Dihydro-Derivate
erhält, die lediglich Endabsorption'im UV-Spektrum zeigen.
"bill) Stereochemie an der Doppelbindung
Dass die Doppelbindung als trans-Bindung vorliegt wird auö den in .der Literatur für chemische Verschiebungen
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(NMR-Spektrum)bei eis- und trans-CH^-G-ruppen, die an
Doppelbindungen dieser Art gebunden sind, angegebenen Werten abgeleitet.
c) Art der Funktionen im Molekülrest
c) Art der Funktionen im Molekülrest
a) Nachweis von Glykolgruppierunge'n
i) Der Methylester der Säure I bildet ein Acetonidderivat, das durch Elementaranalyse, NMR- sov/ie IR-
und UV-Spektren gekennzeichnet ist.
ii) Durch Behandeln des Methylesters der Säure I mit
Natriurnperjodat in wässrigem Äthanol erhält man als
einziges Produkt einen Dialdehyd. Damit liegt eine Grlykolgruppierung vor, und zwar in einem Ring.
iii) Diese Beobachtung wird bestätigt durch NMR-Doppelresonanzversuche
mit Triacetat- und [Pribenzoatderivaten.
b) Nachweis der Epoxidgruppe
I) Die Anwesenheit der Epoxidgruppe wird von chemischen
Verschiebungen in den NMR-Spektren der beiden gebundenen Protonen des Methylesters der Säure I und deren
Derivaten abgeleitet. Dies wird bestätigt durch NMH-Doppelresonanzversuche
und Versuche, welche die Spinnentkopplung und damit die Auflösung dicht beieinanderliegender
Maxiina in den NMR-Spektren ermöglichen.
OH
i
i
c) Die Teilstruktur CII3ClLCH-
CII3
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wird abgeleitet von chemischen Verschiebungen in den entsprechenden Protonen (MCR) des Acetonidderivats des
Methylesters der Säure I so\</ie des Oxidationsprodukts,
dem Acetoxidketonderivat des Methylesters der Saure I,
. O
das die Teilstruktur CH J#CH_ aufweist..
das die Teilstruktur CH J#CH_ aufweist..
ä) Die Struktur des Methylketons des heterocyclischen
Rings und damit die Struktur der Säure I, wie in der Formel I aufgezeigt, wird mit Hilfe von Spinnentkopplungs-
und Doppelresonanzversuchen in den NMR-Spektren der entsprechenden Methylketontriacetat- und -tribenzoatderivate
abgeleitet.
Säure II
Aus den Spektren des Methylesters der Säure II und deren Triaeetatderivat (Massenspektrum, UV-, NMR- und IR-Spektren)
lässt sich dessen enge Beziehung zum Methylester der Säure I ableiten, der eine zusätzliche Hydroxylgruppe aufweist.
Die in -der Formel II aufgezeigte Struktur wird mit Hilfe von
NMR-Doppelresonanzversuchen am Triacetatderivat des Methylketons
des heterocyclischen Ringes abgeleitet.
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Claims (14)
1. Neue, aus Pseudomonas fluorescent gewinnbare antibakteriell
wirksame Substanzen in praktisch reiner Form oder in Porin eines Gemisches der nachstehenden Formel I
OH
OH H° 1 f. CO2 (CH2)8C02H
OH H° 1 f. CO2 (CH2)8C02H
CH Np. CH2C
CH,CH.CH.CH.CH.CHO CH ~„ Ο
CH5
CD
auch als Isomeres, sowie der nachstehenden Formel II
HO I CH.C02(CH2)8C02H
Il
CH,. CH.CH. CH.Cft. CH2—
• CHp β C«GH-;
P OH
(II)
alle Verbindungen gegebenenfalls als Salze oder in Form ihrer Ester.
2) Methylester der Säure der Formel I .
3) p-Bromphenacylester der Säure der Formel I .
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4. Verfahren zur Herstellung'von antibakteriell wirksamen
Substanzen gemäss Anspruch 1, Formeln I und II ,
dadurch gekennzeichnet, dass man Pseudomonas fluorescens unter aeroben Bedingungen auf oder in einer Kulturbrühe
züchtet, die anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bis die Kulturbrühe mindestens nachweisbare bakteriell wirksame Substanzen aufweist, die Kulturbrühe ans chi ie s send mit einer
Bariumionen liefernden Verbindung versetzt und den sich
bildenden Medersenlag abtrennt, die Kulturbrühe mit einem organischen lösungsmittel für die in der Kulturbrühe gelösten aktiven Substanzen extrahiert, den organischen Extrakt mit V/asser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 extrahiert, das Wasser bis zur Bildung eines festen Rückstands eindampft und den Rückstand in aktive und im wesentlichen inaktive Fraktionen auftrennt.
Substanzen gemäss Anspruch 1, Formeln I und II ,
dadurch gekennzeichnet, dass man Pseudomonas fluorescens unter aeroben Bedingungen auf oder in einer Kulturbrühe
züchtet, die anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bis die Kulturbrühe mindestens nachweisbare bakteriell wirksame Substanzen aufweist, die Kulturbrühe ans chi ie s send mit einer
Bariumionen liefernden Verbindung versetzt und den sich
bildenden Medersenlag abtrennt, die Kulturbrühe mit einem organischen lösungsmittel für die in der Kulturbrühe gelösten aktiven Substanzen extrahiert, den organischen Extrakt mit V/asser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 extrahiert, das Wasser bis zur Bildung eines festen Rückstands eindampft und den Rückstand in aktive und im wesentlichen inaktive Fraktionen auftrennt.
5. Verfahren nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Pseudomonas fluorescens IiCIB 10 586 verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kulturbrühe mit Isobutylmethylketon extrahiert.
7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Substanzen aus dem Gemisch von aktiven ■
und inaktiven Salzen durch Ionenaustauscher-Chromatographie abtrennt.
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8. Verfahren nach Anspruch 4 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Substanzen aus dem Gemisch von aktiven
und inaktiven Salzen abtrennt, indem man das Salzgemisch verestert und das veresterte Gemisch der Kieselgel-Chromatographie
unterwirft.
9." Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
man ein Polystyrolharz verwendet und':mit 0,005 η "bis 0,05 η
methylalkoholischem Ammoniak sowie mit 0,005 η "bis 0,05 η
wässrigem Ammoniak eluiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass man mit 0,01 η methylalkoholischem bzw. 0,01 η wässrigem Ammoniak
eluiert.
11. Verfahren nach Anspruch 4 bis 10 zur Herstellung der Säure
der Formel I in praktisch reiner Form, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aktive Fraktion herstellt und verestert,
aus dem Gemisch·von Estern der drei verschiedenen Säuren
(2 Isomere der Formel I, eine Verbindung der Formel II) den Ester der Säure der Formel I abtrennt und verseift.
12. Verfahren nach Anspruch 4 bis 10 zur Herstellung der Säure der Formel II in praktisch reiner Form, dadurch gekennzeichnet,
dass man eine aktive Fraktion herstellt und verestert, aus dem Gemisch von Estern der drei verschiedenen Sauren
den Ester der Säure der Formel II abtrennt und verseift.
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13. Verfahren nach. Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass
man den Ester der Säure der Formel I von dem Estergemisch abtrennt, indem man a) die Ester der Säure der Formel I und
deren Isomeres vom Ester der Säure der Formel II mit ' Hilfe von Schicht-Chromatographie an Kieselgel abtrennt
und "b) den Ester der Säure der Formel I aus dem erhaltenen
ι Gemisch durch Umkristallisieren isoliert.
14. "Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
man den Ester der Säure der Formel II von dem Estergemisch ■ mit Hilfe von Kieselgel-Ghromatographie abtrennt.
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Leerseite
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---|---|---|---|
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