DE3122499A1

DE3122499A1 - Neue derivate von ml-236b, verfahren zu ihrer herstellung und diese derivate enthaltende arzneimittelzubereitungen

Info

Publication number: DE3122499A1
Application number: DE19813122499
Authority: DE
Inventors: Minoru Dr. Chiba Tanaka; Akira Dr. Tokyo Terahara
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1980-06-06
Filing date: 1981-06-05
Publication date: 1981-12-24
Also published as: DK247081A; US4448979A; CA1150170A; NL960028I1; US4410629A; ATA256781A; GB2077264B; BE889150A; SE453389B; FI71168B; GB2077264A; IE51270B1; AT374495B; NL191738C; AU7137681A; FR2483912A1; NL960028I2; FI71168C; MX7065E; NL8102737A

Description

BESCHREIBUNG:

Die Erfindung betrifft eine Reihe neuer Derivate der an sich bekannten Verbindung ML-236B, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen, welche diese Verbindungen als Wirkstoffe enthalten.

Die Verbindung ML-236B, welche die nachgestehende chemische Strukturformel besitzt:

ist in der US-PS 3 983 140 beschrieben* Sie wurde aus den Stoffwechselprodukten von Mikroorganismen des Genus Penicillium, insbesondere Penicillium citrinum, einer Blauschimmel-Spezies, isoliert und in gereinigter Form erhalten. Es hat sich gezeigt, daß diese Verbindung die Biosynthese von Cholesterin durch Enzyme oder Zellkulturen, die von Versuchstieren abgetrennt wurden, inhibiert, indem sie mit dem geschwindigkeitsbegrenzenden, bei der. Biosynthese

130052/Ö8SQ

des Cholesterins aktiven Enzym, nämlich 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase konkurriert und infolgedessen den Serum-Cholesterinspiegel von Tieren drastisch vermin-: dert (Journal of Antibiotics, 2§_, 1346 (1976)). Eine Anzahl von Verbindungen mit strukturellem Zusammenhang mit ML-236B wurden ebenfalls aufgefunden und haben sich als befähigt zur Inhibierung der Biosynthese des Cholesterins erwiesen.

Erfindungsgemäß wird nun eine Reihe von neuen Verbindungen zur Verfügung gestellt, die durch enzymatische Hydroxylierung von ML-236B oder dessen Derivaten hergestellt werden können, und die eine Fähigkeit zur Inhibierung der Biosynthese von Cholesterin besitzen, die mindestens mit der von ML-236B selbst vergleichbar ist und diese in einigen Fällen wesentlich überschreitet.

Gegenstand der -Erfindung sind somit Hydroxycarbonsäuren der Formel (I)

(I)

worin R eine Gruppe der Formel

130062/0869

oder

bedeutet, sowie unter Ringschluß gebildete Lactone und Salze und Ester dieser Verbindungen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), deren durch Ringschluß gebildete Lactone, sowie deren Salze oder Ester, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ML-236B oder ML-236B-carbonsäure oder deren Salze oder Ester der enzymatischen Hydroxylierung unterwirft.

ML-236B-carbonsäure entspricht folgender Formel .

Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Arzneimittel/ die sich zur Behandlung der Hypercholesteraemie eignen, die dadurch gekennzeichnet sind/ daß sie als Wirkstoff eine oder mehr Verbindungen der vorstehend definierten Formel I oder die entsprechenden durch Ringschluß gebildeten Lactone, Salze oder Ester, soweit diese Derivate pharmazeutisch verträglich sind, enthalten.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher erläutert.·

Eine Klasse der erfindungsgemäßen Verbindungen sind Verbindungen der Formel (II)

130Q52/08S9

R¹OOC

(ΙΠ

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Cj-Cg-Alkylgruppe bedeutet ,

pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, falls R ein Wasserstoff atom darstellt und das entsprechende Lacton der Formel (III)

(HU

130052/0069

3122A99^;

Im Hinblick auf die Anzahl von asyitmetrischen Kohlenstoffatomen in diesen Verbindungen sind zahlreiche geometrische Isomere möglich. Unter diesen sind folgende Isomere am wichtigsten:

Verbindungen der Formel (IV):

R¹OOD

(IVJ

worin R die vorstehend gegebene Definition hat, und pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, wenn

1
R ein Wasserstoffatom bedeutet, und das entsprechende Lacton der Formel (V)

(V)

HO 130052/0869

31224S9

sowie Verbindungen der Formel (VI)

R¹OOC

(VI]

in der R die vorstehend gegebene Definition hat, sowie pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, wenn R ein Wasserstoffatom bedeutet, und das entsprechende Lacton der Formel (VII)

(VII)

130062/Oddf

3122495

Die Hydroxycarbonsäure der Formel (IV), in der R ein Wasserstoffatom bedeutet, wird in dieser Beschreibung und den Patentansprüchen auch abgekürzt als M-4 bezeichnet und Derivate dieser Säure, insbesondere ihre Salze und Ester,werden als Derivate von M-4 bezeichnet, während das entsprechende Lacton der Formel (V) als M-4-Lacton bezeichnet wird.

In entsprechender Weise wird die Hydroxycarbonsäure der Formel (VI), in der R ein Wasserstoffatom bedeutet, als M-4' benannt und Derivate dieser Säure werden als Derivate von M-4¹ bezeichnet, während das entsprechende Lacton der Formel (VII) als M-4¹-Lacton bezeichnet wird.

Eine weitere bevorzugte Klasse von Verbindungen gemäß der Erfindung sind Verbindungen der Formel (VIII)

R¹OOC

(VIIIJ

worin R die vorstehend gegebene Definition hat, sowie pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet und das entsprechende Lacton der Formel (IX)

13Ö0B2/O

3122493

(IX)

Darüber hinaus ist eine Vielfalt von geometrischen Isomeren dieser Verbindungen möglich, deren wichtigste nachstehend angegeben sind:

Verbindungen der Formel (X):

R¹OOC

(X)

130063/0001

3122439!

worin R die vorstehend gegebene Definition hat, und pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, in der R ein Wasserstoffatom darstellt und das entsprechende Lacton der Formel (XI)

(XI 1

und Verbindungen der Formel (XII)

(XII)

in der R die vorstehend gegebene Definition hat, und pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet, sowie das entsprechende Lacton der Formel (XIII):

110052/0339

312249?

("XIII)

Die Säure der Formel (X) wird in dieser Beschreibung und den Patentansprüchen kurz als IsoM-4 bezeichnet, und ihre Derivate, wie Salze und Ester, werden als Derivate von IsoM-4 bezeichnet, während das entsprechende Lacton der Formel (XI) als IsoM-4-Lacton benannt wird. Die Säure der Formel (XII), worin R ein Wasserstoffatorn bedeutet, wird kurz als IsoM-4' und ihre Derivate werden als Derivate von IsoM-4¹ bezeichnet, während das entsprechende Lacton der Formel (XIII) als IsoM-4'-Lacton abgekürzt wird.

Unter den Estern der Hydroxycarbonsäuren der Formel (I) werden die (C₁-C₁.) -Alkylester bevorzugt. Diese Alkylgruppen können geradekettige oder verzweigte Gruppen sein und umfassen beispielsweise Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl- und Isobutylgruppen, wobei die Methylgruppe speziell bevorzugt wird.

Die Hydroxycarbonsäuren bilden auch Salze mit zahlreichen Kationen, insbesondere Metallen und bevorzugt Alkalimetallen, wie Natrium oder Kalium. D'ie Natriumsalze werden am

stärksten bevorzugt.

Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen sind die am
stärksten bevorzugten Verbindungen M-4-Lacton, M-4-Natriumsalz, iJM-4-Methylester,IscM-4^/-Lac±on, IsoM-4'-Natriumsalz und IsoM-4'-Methylester, woüei M-4-Natriumsalz
besonders.bevorzugt wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch enzyma-

tische Hydroxylierung von ML-236B oder dessen Derivaten, ^:

speziell von ML-236B-carbonsäure oder einem Salz oder

Ester von ML-236B-Carbonsäufe hergestellt werden. i

Diese enzymatische Hydroxylierung kann als Teil des
Metabolismus von ML-236B oder eines Derivats davon in
Säugetieren durchgeführt werden, beispielsweise durch
Verabreichung von ML-236B an ein geeignetes Tier, Gewinnen des Stoff Wechselprodukts, beispielsweise Urin, , ■"* und anschließende Abtrennung der gewünschten Verbindung
bzw. Verbindungen gemäß der Erfindung aus dem Urin.
Gemäß einer Alternativmethode kann anstelle des leben- '; den Tiers die Leber oder ein enzymhaltiger Extrakt aus
der Leber verwendet werden.

Verfahren unter Anwendung des tierischen Metabolismus !

oder tierischer Produkte besitzen jedoch relativ nie- ;

dere Produktionsleistung und sind schwierig in repr-odu- ., _;

zierbarer Weise durchzuführen. Es wird daher bevorzugt, e

Mikroorganismen oder enzymhaltige Extrakte aus Mikro- '

Organismen einzusetzen. ^!

Das erfindurigsgemäße Verfahren wird demnach vorzugsweise \

!§0052/0869

unter Verwendung eines Mikroorganismus durchgeführt, der befähigt ist, ML-236B oder dessen Derivate in eine erfindungsgemäße Verbindung überzuführen oder unter Verwendung eines enzymhaltigen Extrakts aus einem solchen Mikroorganismus. Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind Mikroorganismen der folgenden Genera: Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Circinella,· Actinomucor, Gongronella, Phycomyces, Martierella, Pycnoporus, Rhizoctonia, Absidia, Cunninghamella, Syncephalastrum und Streptomyces. Speziell die nachstehendes Spezies werden bevorzugt:

Absidia coeruiea Cunninghameiia echinulata Syncephalostrum racemosum Streptomyces roseochromogenus Mucor hiemal is f. hiemal is Mucor baciTliformis Mucor circineTToides f, circineiioides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorphosporus Mucor fragil is
Mucor genevensis Mucor gTobosus

Mucor circineTToides J^ griseo-cyanus Mucor heterosporus Mucor spinescens Rhizopus chinensis Rhizopus circinans

3122493

Rhizopus arrhizus Zygorynchus moeiTen CircineiTa muscae Circinelia rigida C i reinen a um&eiiata Actinonmcor eiegans Phycomyces biakesieeanus Martierena isabeTHna Gongronen a butTeri Pycnoporus coccineus Rhizoctonia soTani SyncephaTastrum nigricans Absidia gTauca var. paradoxa

Unter den Stämmen der vorstehend genannten Spezies werden die nachstehenden besonders bevorzugt :

Absidia coeruiea IFO-4423 CunninghameTTa echinulata IFO-4445 CunninghameTia echinulata IFQ-4444 Cunninghamena echinuTata ATCC-9244 SyncephaTastrum racemosum IFO-4814 SyncephaTastrum racemosυm IFO-4828 Streptomycgs roseochromogenus NRRL-1233 Streptomyces roseoehrömogenus IFO-3363 Streptomyces roseochromogenus IFO-3411

3122411

; Mucor hiemal is f. hiemal is IFO-5834 Mucor hiemal Is f. hiemal is IFO-5303

Mucor hiemal is f^ hiemalis IFO-8567 Mucor hiemalis jF^ hiemalis IFO-8449 Mucor hiemalis j\ hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f^ hiemalis IFO-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis' CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f^ hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f^ hiemal is CBS-IlQ.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-4554

' Mucor circinelloides JF₁ circinelloides IFO-5775 Hucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 ^ Mucor dimorphosporus IFO-4556

^Wucor fragilis CBS-236.35 \ Mucor genevensis IFO-4585 Mucor globosus NRRL 12474 Mucor circfnelloides f. griseo-cyanus IFO-4563

: Mucor heterosporus NRRL-3154

j Mucor spinescens IAM-6071

- 38 - -..^:—' ■-■"-■ ' " j

3122493;

Rhizopus chinensis IFO-4772 Rhizopus circinans ATCC-1225 Rhizopus arrhizus ATCC-11145 Zygorynchus rnoel 1 eri lFO-4833 CircineTia muscae IFO-4457 Cireinen a rigfda NRRL-2341 Ci reinen a umbeliata NRRL-1713 Circineiia umbeTiata IFO-4452 Circineiia umbeTiata IFO-5842 Phycomyces biakesieeanus NRRL-12475 Martierella isabeiiina IFO-6739 Gongronen a butieri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia soTani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 SyncephaTastrum nigricans NRRL-12479 SyncephaTastruin nigricans NRRL-12480 Absidia g1a.uca var. paradoxa IFO-4431 Actinomucor eTegans ATCC-6476

130052/0869

3122439

Die vorstehend aufgezählten Mikroorganismen sind von den internationalen Hinterlegungsstellen, deren Abkürzungen zusammen mit den Hinterlegungsnummern angegeben sind, erhältlich. Dabei haben die genannten Abkürzungen (Codes) die nachstehende Bedeutung :

IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan NRRL = Agricultural Research Culture Collection, Illinois, USA CBS = Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Netherlands IAM = Institute of Applied Microbiology, Tokyo, Japan ATCC = American Type Culture Collection, Maryland, USA

Unter den vorstehend angegebenen Spezies werden die folgenden besonders bevorzugt :

Absidia coeruiea

Cunninghameiia echinulata ,

Syncephaiastrum racemosum

Mucor hi email's Jf₁ hiemal is

Mucor baciTlifornris

Mucor eircineiToides Jf₁ circineiioides

Mucor hiemaiis -F₁ corticolus

Mucor dimorphosporus

Mucor fragil is Mucor genevensis

Mucor globosus

Mucor circinelioides Jf₁ griseo-eyanus

Mucor heterosporus

- 40 - ·

31224931

Mucor splnescens

Pycnoporus coccineus Rhizoctonia sol am' Syncephalastrum nigricans

■wobei die.nachstehenden besonders bevorzugte Stämme dieser Spezies darstellen :

Absidia coeruiea IFO-4423 Cunninghameija echinuiata IFO-4445 CünninghameTia echinuTata IFO-4444 Cunm'nghamelia echinuiata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 SyncephaTastrum racemosum IFO-4828 Mucor hiemails J^ hiemaiis IFO-5834 Mucor hiemaiis f^ hiemaiis IFO-5303 Mucor hiemails f^ hiemal is IFO-8567 Mucor hiemaHs f^ hiemal is IFO-8449 Mucor hiemal is _f^ hiemal is IFO-8448 Mucor hiemails f^ hiemal is IFO-8565 Mucor hiemaiis fj_ hiemal is CBS-117.08 Mucor hiemaTis f. hiemaiis CBS-109.19 Mucor hiemaTis f. hiemal is CBS-200.28 Mucor hiemaTis f. hiemal is CBS-242.35 Mucor hiemaTis f. hiemaiis CBS-IlO.19 Mucor hiemal is f^ hiemaiis CBS-20'l.65 Mucor bacilTiformis NRRL-2346 Mucor eireinenoides f^ eircineTToides IFO-4554

1)0662/0668

Mucor circineTloides f^ circineTloides IFO-5775 Mucor hiemal is j\_ ^orti^colU^ HRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556 Mucor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585 Mucor giobosus NRRL 12474 Mucor eireinenoides f\_ griseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 SyncephaTastrum nigricans NRRL-12480

Zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (IV) und (V) und ihrer Salze werden die nachstehenden Spezies bevorzugt :

Mucor hiemalis j\ hiemalis tducor circineTloides f^ circinelTofdes

Mucor fragiTis ..' ■ .

Hucor genevensis Mucor circineTloides f. griseo-cyanus Pycnoporus coccineus

Rhizoctonia so!ani.

130Ö&2/Olli

Zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (VI) und (VIII;) und ihrer Salze werden die Spezies Syncephalastrum nigricaris und Syncephalastrum racemosum besonders bevorzugt.

Zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (VIII) und (Ι2ί) und ihrer Salze werden die Spezies Absidia coerulea und Cunninghamella echinulata bevorzugt.

Unter allen vorstehend aufgeführten Spezies wird Mucor hiemalis f. hiemalis besonders bevorzugt, da dieser Mikroorganismus befähigt ist, ML-236B und seine Derivate in einer Umwandlungsrate von 90 % oder sogar mehr in die gewünschten Verbindungen der Formel (I) überzuführen.

Die Umwandlung von ML-236B oder dessen Derivaten in Ver- < bindungen der Formel (I) kann erreicht werden, indem ML-236B oder ein Derivat dieser Verbindung mit den in Form von vollständigen Zellen vorliegenden Mikroorganismen oder in ; manchen Fällen einem zellfreien Extrakt aus dem Mikroorganismus in Kontakt gehalten wird. Die Form der gebildeten Ver-^ bindung hängt von den Kulturbedingungen und der Form des verwendeten Mikroorganismus ab. Wenn beispielsweise die vollständigen Mikroorganismenzellen in Gegenwart von ML-236B oder dessen Derivaten gezüchtet werden, wird in Abhängig- ] keit von den Kulturbedingungen, insbesondere dem pH-Wert, als Produkt die Carbonsäure, das Lacton oder das Alkalimetallsalz gebildet. Wenn andererseits ML-236B oder ein. Derivat davon einfach mit einem verbliebenen Zeilsystem oder mit .einem zellfreien Extrakt in Berührung gehalten wird, so wird die erfindungsgemäße Verbindung in Form eines Alkaliitietallsalzes erhalten. t

Das Fortschreiten der Umwandlungsreaktion kann bestimmt · werden, indem während des Verlaufs der Reaktion Proben \ aus dem Reaktionsgemisch entnommen werden, um den Umwandlungsgrad zu bestimmen. So kann beispielsweise das Vorliegen

130Ö52/OII9

. 3122498

von M-4-Lacton durch Flüssigphasenchromatographie nachgewiesen werden, wobei als Träger Micro Bonda Pac C₁₈ (hergestellt von Waters Co., USA) und als Lösungsmittel 62 %iges (Volumen/Volumen) wässriges Methanol in einer Rate von 1 ml/ min angewendet wird.Beim Nachweis unter Ausnutzung seiner Ultraviolettabsorption bei 237 nm ergibt M-4 einen Peak bei einer Retentionszeit von 10 Minuten, was für den Nachweis ausgenutzt werden kann. Ähnliche Methoden sind zum Nachweis der anderen erfindungsgemäßen Verbindungen zugänglich.

Wenn die Mikroorganismen in Gegenwart von ML-236B oder
eines Derivats davon zur Erzeugung der erfindungsgemäßen
Verbindungen gezüchtet werden, werden die Kulturbedingungen und Kulturmedien unter Berücksichtigung des speziellen zu züchtenden Mikroorganismus gewählt. Da die Mikroorganismenspezies, die zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren bestimmt sind, gut bekannte Mikroorganismen darstellen, sind auch die Kulturbedingungen und Kulturmedien zur Anwendung für diese Mikroorganismen gut bekannt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit Hilfe üblicher Methoden aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, beispielsweise durch Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen
(falls erforderlich) und anschließende Behandlung des verbleibenden Gemisches mit jeder beliebigen Kombination aus Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie oder
Hqchleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Die verschiedenen erfindungsgemäßen Verbindungen können, falls zwei oder mehrere gemeinsam hergestellt werden, im Verlauf eines oder mehrerer dieser chromatographischen Reinigungsstufen voneinander
getrennt werden.

Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Verbindungen kann in
einigen Fällen auch eine Verbindung hergestellt werden, die von der Anmelderin als M-3 bezeichnet wurde und die unter

130062/0669

dem Namen 3',5'-Dihydroxy- (dihydro-ML-236B) bekannt ist. ', Diese Verbindung ist in der deutschen Patentanmeldung · P 31 16 066.2 mit dem Titel :"Hydronaphthalinderivate, j

ihre Herstellung und Verwendung" beschrieben. Auch diese ij Verbindung kann in gleicher Weise abgetrennt werden. |

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen
in Konzentrationen, die den im Fall von ML-236B und gewissen anderen ähnlichen bekannten Verbindungen erforderlichen Konzentrationen entsprechen oder in manchen Fällen in be- * deutend geringeren Konzentrationen eine 50 %ige Inhibieruncf der Biosynthese von Cholesterin verursachen. Die inhibiereride Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen, angegeben alä Konzentration in ug/ml, die zu einer 50 %igen Inhibierung
der Biosynthese von Cholesterin erforderlich ist (gemessen ■ nach der Methode, die in "The Journal of Biological
Chemistry, 234, 2835 (1959)" beschrieben ist), ist ; wie folgt : ,

M-4-Methylester	0,001
M-4-Natriumsalz	0,0008
M-4-Lacton	0,016
IsoM-4'-Methylester	0,007
IsoM-4'-Lactön	0,013
M-4'	0,019
M-4'-Natriumsalz	0,00049
ML-236B	0,01

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht.

130052/086*

3122493

Beispiel 1

'20 500 ml-Sakaguchikolben, von denen jeder 100 ml eines Mediums der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung enthielt, wurden mit Sporen von Absidia coerulea IFO 4423 inokuliert. Die Kolben wurden einer Schüttelkultur bei 26°C mit 120 Ausschlägen pro Minute während 2 Tagen unterworfen. Am Ende dieser Dauer wurde das Natriumsalz von ML-236B zu jedem der Kolben bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % (Gewicht/Volumen) zugefügt. Die Züchtung wurde bei 26⁰C und 120 Ausschlägen pro Minute (Apm) weitere 5 Tage durchgeführt.

Das Medium hatte folgende Zusammensetzung (in Gewicht/Volum-%)

Glucose . 2,0 %

K₂HPO₄ , 0,15 %

MgSO₄.7H₂O 0,15 %

NH₄NO₃ 0,1 %

Pepton 0,1 %

·. Maisquellflüssigkeit 0,2 %

- Hefeextrakt 0,1 %

* ZnSO₄.7H₂O 0,001 %

I Leitungswasser Rest auf 100- %

s (eingestellt auf pH 7,0)

I . ■ '

i Nach Beendigung der Züchtung wurde die Reaktionsflüssigkeit

I filtriert und der pH-Wert des Filtrats wurde mit Trifluor-

\ essigsäure auf 3 eingestellt. Das gebildete Gemisch wurde mit 3 1 1-Anteilen Äthylacetat extrahiert, wobei Extrakte

^e; mit einem Gehalt an M-4 erhalten wurde. Diese Verbindung

I zeigt einen Rf-Wert von 0,45 in der Dünnsehichtchromatogra-

;; phie (TLC) (Platte : Merck Silicagel Art 5715; Lösungsmit-

I tel : Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumen-

130.082/006·

3122439;

i verhältnis 50 : 50 : 3). Die kombinierten Extrakte wurden mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen und -' dann wurde eine katalytische Menge an Trifluoressigsäure zur Lactonisierung zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde ^:' dann mit einer 1 %igen (Gewicht/Volumen) wässrigen Lösung ' von Natriumbicarbonat gewaschen,, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde der präparativen Flüssig·» keitschromatographie unterworfen, unter Anwendung von System 500 mit Hilfe einer Prep -PAK-SOO/Cjg-Hülse, herge-> stellt von Waters Assciates (Prep PAK ist ein Warenzeichen}. Nach Reinigung mit einem System aus 55 %igem (Volumen/Volumen) wässrigem Methanol wurden 50,1 mg M-4-Lacton erhalten,

M-4-Lacton hat folgende physikalische Eigenschaften. ;

1) Kernmagnetisches Resonanz Spektrum : '■ Das NMR-Spektrum, das bei 60 MHz in Deuterochloroform \ unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard ! gemessen wurde, ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichungen ; gezeigt.

2) ültraviolett-Absorptionsspektrum (Lösung in Methanol) ]

X_1113xHm : 230; 236,7; 244,6. ;

3) Infrarot-Absorptionsspektrum (flüssiger Film)0 cm I₁

3400, 2950, 1725

4) Dünnschichtchromatographie :
TLC-Platte : Merck Silicagel Art 5717;

Lösungsmittel : Benzol, Aceton, Essigsäure (Volumenverhältnis 50 : 50 : 3);

Rf-Wert : 0,62
Beispiel 2

48 mg M-4-Lacton wurden unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Cunninghamella echinulata IFO 4445 hergestellt.

156062/0-66·

Beispiel 3

30 mg M-4-Lacton wurden unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Streptomyces roseochromogenus NRRL 1233 hergestellt.

Beispiel 4

5 mg M-4-Lacton wurden unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Syncephalastrum racemosum IFO 4814 hergestellt.

Beispiel 5

6 mg M-4-Lacton wurden unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Syncephalastrum racemosum IPO 4828 hergestellt.

Beispiel 6

20 500 ml-Sakaguchikolben, die jeweils 100 ml eines Mediums der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung enthielten, wurden mit Sporen von Absidia coerulea IFO 4423 angeimpft. Die Kolben wurden während 2 Tagen einer Schüttelkultur mit 120 Ausschlägen pro Minute (120 ApM) bei 26°C unterworfen. Nach Beendigung dieser Dauer wurde das Natriumsalz von ML-236B bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % (Gewicht/Volumen) zu jedem der Kolben gegeben. Die Züchtung wurde dann bei 120 ApM und 26°C weitere 5 Tage fortgesetzt.

Das verwendete Medium hatte folgende Zusammensetzung (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen) :

130052/0δ6β

3122439

Glucose	2,0 %
K₂HPO₄	0,15 %
MgSO₄.7H₂O	0,15 %
NH₄NO₃	0,1 %
Pepton	0,1 %
Maisquellflüssigkeit	0,2 %
Hefeextrakt	0,1 %
ZnSO₄.7H₂O	0,001 %
Le i tung swa s s er	Ergänzung auf 100

(eingestellt auf pH 7;Q)

Nach Beendigung 'der Züchtung wurde die Reaktionsflüssigkeit filtriert und der pH-Wert des Filtrats wurde mit Trifluoressigsäure auf 3 eingestellt. Das erhaltene Gemisch wurde mit 3 1 1-Anteilen von Äthylacetat extrahiert, wobei Extrakte mit einem Gehalt an IsoM-4' erhalten wurden.; Diese Verbindung hat in der Dünnschichtchromatographie (Platte : Merck Silicagel Art 5715; Lösungsmittel : ein Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumverhältnis 50 : 50 : 3) einen Rf-Wert von 0,45. Der Extrakt wurde mit ^ einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann wurde eine ätherische Lösung von Diazomethan zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten stehengelassen und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Lobar-Kolonne (Merck Si 60, Größe A) aufgegeben und gereinigt, wobei als Lösungsmittelsystem ein Gemisch aus Benzol und Sthylacetat im Volumverhältnis 1 : 1 verwendet wurde. Auf diese Weise wurden 200 mg einer IsoM-4'-Methylester-Fraktion erhalten, Diese Fraktion wurde weiterhin an einer Lobar-Kolonne (Merck RP-8, Größe A) unter Verwendung einer 35 %igen (Volumen/Volumen) wässrigen Lösung von Acetonitril als Elutionsmittel gereinigt, wobei 78 mg reiner IsoM-4'-Methylester erhalten wurden, der folgende Eigenschaften zeigte :

1) Kernmagnetisches Resonanzspektrum :

Das NMR-Spektrum, das bei 100 MHz in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard gemessen wurde, ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.

2) MassenSpektrum :

Die Messung erfolgte (nach der Silylierung mit N,O-Bis-(triraethylsilyl)-trifluoracetamid) mit Hilfe eines Massenspektrometers Typ D-300 der Nippon Elektronics. M/e : 654 (M⁺), 552, 462, 372, 272, 233, 231

3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Lösung in Methanol)

λ nm : 229, 234,8, 244,5
max

4) Infrarot-Absorptionsspektrum (flüssiger Film) : Wie in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.

5) Dünnschichtchromatographie :
TLC-Platte : Merck Silicagel Art 5715; Lösungsmittel : Benzol und Aceton im Volumverhältnis

1 : Ii
Rf-Wert : 0,88

Nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise, jedoch durch Ersetzen von Diazomethan durch ein anderes geeignetes Diazoalkan ist es möglich, andere Ester von IsoM-4' herzustellen.

Beispiel 7

Die in Beispiel 6 beschriebene Verfahrensweise wurde bis einschließlich der Extraktion mit Äthylacetat unter Bildung von IsoM-4' enthaltenden Extrakten wiederholt. Die kombinierten Extrakte wurden mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann zur Trockene eingedampft, wobei das Lacton als Produkt erhalten

wurde. Der erhaltene Rückstand wurde auf eine Lobar- \ Kolonne (Merck Si 60, Größe A) aufgegeben und unter Ver- ' wendung eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat im ⁵ Volumverhältnis 1 : 1 als Losungsmittelsystem gereinigt. I Dabei wurden 198 g IsoM-4'-Lacton erhalten. Dieses Produkt» wurde unter Anwendung einer Lobar-Kolonne (Merck RP-8, Größe A) und Elution mit 35 %igem (Volumen/Volumen) wässrigem Acetonitril weiter gereinigt, wobei 82 mg reines

IsoM-4-Lacton mit folgenden Eigenschaften erhalten wurden i

1) Kernmagnetisches ResonanzSpektrum :

Das bei 100 MHz in Deuterochloroform und unter Anwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard gemessene NMR-Spektrum ist in Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.

2) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Lösung in Methanol) λ nm : 229, 234,8, 244, 5 :

ITl ciX _f>

3) Infrarot-Absorptionsspektrum (flüssiger Film) :

Wie in Fig. 5 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.

Beispiel 8 '

63 mg IsoM-4'-Lacton wurden unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 7, jedoch unter Verwendung von Cunninghamella echinulata IFO 4445 hergestellt.

Beispiel 9 ;

24 mg IsoM-4'-Lacton wurden mit Hilfe der in Beispiel 7 be-: schriebenen Verfahrensweise hergestellt, als Mikroorganis- ' mus wurde jedoch Syncephalastrum racemosum IFO 4814 verwendet .

13ÖÖ52/08S9

Beispiel 10

35 mg IsoM-4'-Lacton wurden nach der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 7, jedoch unter Verwendung von Syncephalosporum racemosum IFO 4828 hergestellt.

Beispiel 11

12 mg IsoM-4'-Lacton wurden nach der in Beispiel 7 beschrie benen Verfahrensweise hergestellt, wobei jedoch Streptomyces roseochromogenus NRRL 1233 als Mikroorganismus eingesetzt wurde.

Beispiel 12

vonIsoM-4'-Natriumsalz

In einer kleinen Menge Aceton wurden 10 mg IsoM-4'-Lacton gelöst. Zu der Lösung wurde eine äquivalente Menge an Natriumhydroxid gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang stehengelassen. Der pH-Wert des resultierenden Gemisches wurde mit 0,1 η Chlorwasserstoffsäure auf einen Wert von 8,0 eingestellt. Das Aceton wurde dann abdestilliert und der Rückstand wurde auf eine XAD-20-Kolonne (etwa 20 ml) aufgegeben. Die Kolonne wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und dann mit 50 ml 50 %igem (Volumen/Volumen) wässrigem Aceton gewaschen. Das Aceton wurde erneut abdestilliert und der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei 6 mg IsoM-4'-Natriumsalz mit den nachstehenden charakteristischen Daten erhalten wurden :

1) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Lösung in Methanol)

^ nm : 229 (Schulter), 235, 245 (Schulter) max

2) Infrarot-Absorption'sspektrum (KBr) \) cm : 3400, 2850, 1710, 1580

1 3 0 Ö 5 2 / 01S §

3) Dünnschichtchromatographie :

TLC-Platte : Merck Silicagel Art 5715? Lösungsmittel : Gemisch aus Benzol, Aceton und Essig säure (Volumverhältnis 50 : 50 : 3); Rf-Wert : 0,45

Beispiel 13

20 SOOml-Sakaguchi-Kolben, die jeweils 100 ml eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 '. enthielten, wurden mit Sporen von Absidia coerulea IFO 4423 inokuliert. Die Kolben wurden 2 Tage lang einer Schüttelkultur bei 26°C mit 120 Ausschlägen pro Minute ^: unterworfen. Dann wurde das Natriumsalz von ML-236B jedem · der Kolben bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,05 % (Gewicht/Volumen) zugefügt. Die Züchtung wurde dann' weitere 5 Tage bei 26⁰C mit 120 A.p.M. fortgesetzt. j

Nach Beendigung der Züchtung wurde die Reaktionsflüssigkeit filtriert und das Filtrat mit Trifluoressigsäure ; auf pH 3 eingestellt. Das erhaltene Gemisch wurde mit drei 1 1-Anteilen Äthylacetat extrahiert, wobei Extrakte gebildet wurden, die M-3, M-4 und IsoM-4' enthielten. Die beiden Substanzen M-4 und IsoM-4' zeigen in der Dünnschichtchromatographie (Platte : Merck Silicagel Art 5715; ■ Lösungsmittel : Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumenverhältnis 50 : 50 : 3) einen Rf-Wert von 0,45. ; Die kombinierten Extrakte wurden mit gesättigter wässriger ; Natriumchloridlösung gewaschen, wonach eine ätherische Lösung von Diazomethan zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten stehengelassen und dann unter vermindertem : Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Lobar-Kolonne (Merck Si 60, Größe A) aufgegeben und

die Reinigung erfolgte unter Anwendung eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat im Volumenverhältnis 1:1. Auf diese Weise wurden eine Fraktion, die IsoM-4'-Methylester enthielt und eine Fraktion, die M-4-Methylester enthielt, abgetrennt. Dabei wurden 185,3 mg der letzteren aktiven Fraktion erhalten, aus der 20 mg reiner M-4-Methylester als farbloses öl durch Reinigung an einer Lobar-Kolonne (Merck RP-8, Größe A) unter Elution mit 35 %igem (Volumen/Volumen) wässrigem Acetonitril erhalten wurden.

M-4-Methylester zeigt folgende charakterische Daten :

1) Kernmagnetisches ResonanzSpektrum : ιϊ
\ Die Messung erfolgte bei 200 MHz in Deuterochloroform

\- unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard.

: 4ppm :

[ 0,88 (3H, Triplett, J = 7,3 Hz);

0,89 (3H, Duplett, J = 6,5 Hz);
1,12 (3H, Duplett, J = 6,8 Hz);
1,1 - 1,7 (10H, Multiplett);
2,34 (1H, Sextuplett, J = 7Hz);

2.3 - 2,5 (2H, Multiplett);
2,49 (2H, Duplett, J = 6,4 Hz);
2,58 (1H, Multiplett);

3,72 (3H, Singulett);

3,78 (1H, Multiplett);

4,25 (TH, Quintuplett, J = 7 Hz);

4.4 (1H, Multiplett);
5,42 (1H, Multiplett);
5,56 (1H, Multiplett);

5,90 (1H, doppeltes Duplett, J = 9,8 und 5,6 Hz); ■ 5,99 (1H, Duplett, J = 9,8 Hz). } ■

2) Massenspektruin :

Die Messung erfolgte tnach der Sylilierungniit Ν,Ο-Bis-(trimethylsilyl) -trif luoracetamid) unter Anwendung eines Massen+- spektrometers Typ D-300 der Nippon Electronics. ^:

M/e : 654 (M⁺), 552, 462, 372, 290, 272, 233, 231

3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Lösung in Äthanol) _; ^- _a nm : 230; 237,3; 246,4

ϊίΙαΧ.

4) Infrarot-Absorptionsspektrum (flüssiger Film) 0 cm" :
3400, 2950, 1730 I

5) Dünnschichtchromatographie :

TLC-Platte : Merck Silicagel Art 5715; .

Lösungsmittel : Benzol und Aceton (Volumverhältnis 1 : 1) j Rf-Wert : 0,88

Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahrens- \ '"""* weise, wobei jedoch Diazomethan durch ein anderes geeignetes Diazoalkan ersetzt wird, ist es möglich, andere Ester von
M-4 herzustellen.

Beispiel 14

Herstellun2_der_Natriumsalze_von_M-4_und_IsoM-4^

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde
bis einschließlich der Filtration der Reaktionsflüssigkeit
wiederholt, jedoch mit der Abänderung, daß Na„HPO. anstelle von KjHPO. verwendet wurde. Das Filtrat wurde dann an einer HP-20-Kolonne (hergestellt von Mitsubishi Chemical
Industries) adsorbiert. Nach dem Waschen der Kolonne mit
Wasser wurden Fraktionen, die M-4-Natriumsalz, IsoM-4'- \ Natriumsalz und M-3-Natriumsalz enthielten, mit 50 %igem

52/0819

(VoI/VoI) wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gefriergetrocknet, wobei 830 ml eines gefriergetrockneten Produkts erhalten wurde, welches dann durch wiederholte Bochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (Kolonne : Mikro Bondapak C₁₈? 40 %iges (Vol/Vol) Methanol, 1 ml/min) gereinigt wurde, wobei 32 mg M-4-Natriumsalz und 280 mg IsoM-4'-Natriumsalz erhalten wurden.

Die Eigenschaften des IsoM-4'-Natriumsalzes waren identisch mit denen des Produkts gemäß Beispiel 12. Die charakteristischen Daten des M-4-Natriumsalzes sind nachstehend angegeben :

1) Kernmagnetisches Resonanzspektrum : Die Messung erfolgte bei 200 MHz in Deuteromethanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard.

ό ppm :

0,91 (3H, Triplett, J = 7,5 Hz); 0,92 (3H, Duplett, J = 7 Hz); 1,12 (3H, Duplett, J = 7 Hz);

1.1 - 1,8 (1OH, Multiplett);

2,25 (1H, doppeltes Duplett, J = 15 und 7,6 Hz); 2,34 (1H, doppeltes Duplett, J = 15 und 5,5 Hz);

2.2 - 2,4 (3H, Multiplett); 2,48 (1H, Multiplett); 3,68 (1H, Multiplett); 4,07 (1H. Multiplett);

: 4,28 (1H, Multiplett);

\ 5,36 (1H, Multiplett); '

13ÖÖ52/0

5,48 (IH, doppeltes Duplett, J = 3 und 2 Hz);
5,88 (TH, doppeltes Duplett, J = 9,6 und 5,3 Hz);
5,98 (1H, Duplett, J = 9,8 Hz).

2) ultraviolett-Absorptionsspektrum (Lösung in Methanol) ■

λ/ nm : 230,0; 237,2; 245,0 ■

max 5

3) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) \) cm : ;

3400, 2900, 1725, 1580 „ ^:

4) Dünnschichtchromatographie : . : TLC-Platte : Merck Silicagel Art 5715; ? Lösungsmittel : Benzol, Aceton und Essigsäure (Volumver- ί

hältnis 50 : 50 : 3); !

Rf-W6rt : 0,45 j

Beispiel 15 i

Unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in '· Beispiel 13, jedoch mit Hilfe von Cunninghamella echinulatä IFO 4445, wurden 18 mg M-4-Methylester hergestellt.

•ι Beispiel 16

33 mg M-4-Methylester wurden unter Anwendung der gleichen
Verfahrensweise wie in Beispiel 13, jedoch unter Verwendung von Streptomyces roseochromogenus NRRL 1233 hergestellt. ;

Beispiel 17 ' .,

12 mg M-4-Methylester wurden unter Anwendung der gleichen
Verfahrensweise wie in Beispiel 13, jedoch unter Verwendung! von Syncephalastrum racernosum IFO 4814 hergestellt.

Beispiel 18

16 mg M-4-Methylester wurden unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 13, jedoch unter Verwendung von Syncephalastrum raceinosuin IFO 48 28 als Mikroorganismus hergestellt.

Beispiel 19

An fünf männliche Beagles mit einem Durchschnittsgewicht von 10 kg wurde ML-236B in einer Dosis von 200 mg/kg/Tag verabreicht und der Urin der Hunde wurde 3 Tage lang gesammelt. 3 1 des gesammelten Urins wurden durch eine 500 ml-XAD-2-Kolonne geleitet und diese mit 500 ml 50 %igem (Vol/Vol) wässrigem Aceton eluiert. Nach dem Abdestillieren des Acetons unter vermindertem Druck wurde der pH-Wert der verbleibenden Flüssigkeit durch Zusatz von Trifluoressigsäure auf 3 eingestellt. Das Gemisch wurde dann 3 mal mit jeweils 1 1 Äthylacetat extrahiert, wobei M-4 erhalten wurde. Diese Verbindung zeigt bei der Dünnschichtchromatographie (TLC-Platte : Silicagel Art 5715 der Merck und Co., Inc. ί Lösungsmittel : Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure, Volumverhältnis 50 : 50 : 3) einen Rf-Wert von 0,45. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und nach der Zugabe einer ätherischen Lösung von Diazomethan 30 Minuten lang stehengelassen. Er wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml einer 55 %igen (Vol/Vol) wässrigen Methanollösung gelöst und durch einen Kolonnenchromatograph (Produkt der Merck und Co., Inc. RP-8, Größe B) geleitet. Nach dem Durchleiten von 200 ml einer 55 %igen (Vol/Vol) wässrigen Methanollösung wurde die Kolonne mit einer 60 %igen (Vol/Vol) wässrigen Methanollösung eluiert. Die ersten 240 ml des Eluats wurden verworfen und die nächsten 120 ml wurden aufgefangen. Diese Fraktion

- 58 -

wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde ] in 2,5 ml einer 65 %igen (Vol/Vol) wässrigen Methanollösung gelöst und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie^; (JASCO-Trirotar, Kolonne : μ-Bondapak C_1R) gereinigt. ! Der Anteil, der den vierten Peak zeigte, wurde abgetrennt S und das Lösungsmittel wurde abdestilliert, wobei M-4- ; Methylester als farbloses öl mit den in Beispiel 13 ge- · zeigten Eigenschaften erhalten wurde. Es wurden 4 mg des
gewünschten Produkts erhalten.

Beispiel 20

In diesem Beispiel wurde homogenisierte Kaninchenleber
angewendet, um M-4 aus ML-236B zu erhalten.

(a) Enzymlösung '

Drei Volumteile einer 1,15 % (Gew/Vol) Kaliumchlorid und
10 mM Phosphat enthaltenden Pufferlösung (pH 7,4) wurden ; zu einem Volumteil Kaninchenleber gegeben und das Gemisch
wurde homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wurde dann 20 Minuten bei 9000 G zentrifugiert und die überstehende
Fraktion wurde als Enzymlösung entnommen.

(b) Lösung des Cofaktors

Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat .

(Beta-Typ)in der reduzierten Form
(NADPH) 3 mg ,

MgCl₂-Lösung (508 mg/10 ml) 0,1 ml

1,15 % (Gew/Vol) KCl-Lösung 0,3 ml .·

i 0,2 m Phosphatpufferlösung (pH 7,4) 0,6 ml ;

Die vorstehenden Substanzen wurden bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml vermischt, um die Cofaktor-Lösung zu erhalten..

(c) Reaktionslösung . -

80 μΐ der vorstehend beschriebenen Enzymlösung, 20 μΐ der vorstehend erhaltenen Cofaktor-Lösung und 2 μΐ einer methanolischen Lösung von ML-236B wurden vermischt, so daß eine Endkonzentration an ML-23 6B von 1 mM erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde 30 Minuten bei 37⁰C geschüttelt. M-4 wurde in dem Reaktionsgeinisch gebildet und wurde durch Dünnschichtchromatographie (unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 19) identifiziert.

Beispiel 21

2 mg M-4-Methylester wurden in 1 ml einer 0,1 η wässrigen Lösung von Natriumchlorid gelöst und eine Stunde lang bei 30⁰C hydrolysiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 1 ml Chloroform gewaschen und die erhaltene wässrige Phase wurde mit 0,1 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 8 eingestellt und dann durch eine XAD-2-Kolonne (etwa 5 ml) geleitet. Die Kolonne wurde mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen und das gewünschte Produkt wurde mit 15 ml 50 %igem (Vol/Vol) wässrigem Aceton eluiert. Das Aceton wurde aus dem Eluat abdestilliert. Durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde bestätigt, daß der Rückstand einen einzigen Peak ergab (Retensionszeit 13 Minuten, Elution mit 40 %igem (VoI/ VoI) wässrigem Methanol mit 1 ml/min). Der' Rückstand wurde dann gefriergetrocknet, wobei 0,8 mg M-4-Na-Salz erhalten wurde, das die gleichen Eigenschaften wie das Produkt des Beispiels 14 zeigte.

Beispiel 22

20 SOOml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml eines

130052/0069

Mediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthielten, wurden jeweils mit Sporen von Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 inokuliert. Das Inokulum wurde einer Schüttelkultur bei 26⁰C und 220 Ausschlägen pro Minuten unterworfen. Nach 4 Tagen wurde ML-236B bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % (Gew/Vol) zugefügt und die Züchtung erfolgte bei 26°C und 220 A.p.M. während weiterer 6 Tage.

Das Medium hatte folgende Zusammensetzung (Prozentangaben in Gew/Vol) :

Glucose 1,0%

Pepton 0,2 %

Fleischextrakt 0,1 %

Hefeextrakt 0,1%

Maisguellflussigkeit 0,3 %

Leitungswasser Ergänzung auf 100 %

(pH nicht eingestellt).

Nach Beendigung der Züchtung wurde das Filtrat mit Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Das Gemisch wurde dann 3 mal mit jeweils 100 ml Äthylacetat extrahiert. Dabei wurde eine M-4 enthaltende Fraktion er- ' halten. M-4 zeigt einen Rf-Wert von 0,45 bei der Dünnschichtchromatographie (Platte : Merck Silicagel Art 5715; Lösungsmittel : Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumverhältnis 50 : 50 : 3). Die Umwandlungsrate betrug 90 %. Dieser Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen, wonach eine ätherische Lösung von Diazomethan zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten stehengelassen und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der : Rückstand wurde auf eine Lobar-Kolonne aufgegeben (Merck Si 60, Größe A) und mit einem Gemisch aus Benzol und Äthyl— acetat im Volumverhältnis 1 : 1 gereinigt. Auf diese Weise

130Ö52/0Ö69

wurden etwa 600 mg M-4-Methylester erhalten, der die gleichen Eigenschaften wie das Produkt des Beispiels 13 hatte.

Beispiel 23

M-4-Lacton

Die in Beispiel 22 beschriebene Verfahrensweise wurde bis zu und einschließlich der Stufe der Wäsche der drei Äthylacetatextrakte mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid wiederholt. Die gebildete Lösung wurde dann zur Trockene eingedampft, wobei das Lacton als Produkt erhalten wurde. Das Produkt wurde aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei etwa 560 mg (56 %) M-4-Lacton erhalten wurden, das die gleichen Eigenschaften wie das Produkt des Beispiels 1 zeigte.

Beispiel 24

Die in Beispiel 22 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt, wobei 1,9 1 des Filtrats aus der Umwandlungsreaktion erhalten wurden. Das Filtrat wurde 3 mal mit jeweils 1 1 Äthylacetat extrahiert, wobei M-4 enthaltende Fraktionen gebildet wurden. Diese Fraktionen wurden unmittelbar in eine 5 %ige (Gew/Vol) wässrige Lösung von Natriumbicarbonat überführt, wobei eine Fraktion gebildet wurde, die das M-4-Natriumsalz enthielt. Die M-4-Natriumsalz enthaltende Fraktion wurde mit 2 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und an einer HP-20-Kolonne (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries) adsorbiert. Durch Waschen mit Wasser und Elution mit 50 %igem (Vol/Vol) wässrigem Aceton wurde eine das M-4-Natriumsalz enthaltende Fraktion erhalten, aus der dann 570 mg (52 %.)

1-30052/0668

eines gefriergetrockneten Produkts hergestellt wurden, das die in Beispiel 1 Eigenschaften zeigte.

Beispiel 25

das die in Beispiel 14 beschriebenen charakteristischen ]

Die in Beispiel 22 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt, mit der Abänderung, daß die nachstehend angegebenen Mikroorganismen verwendet wurden. Die Umwandlung in M-4 ist durch die daneben angezeigten Abkürzungen angegeben : -

Mikroorganismus Umwandlung in M-4

Macor hiemalis f.- hiemalis Ι3ΓΟ-53Ο3 Mucor hiemalis f- hiemalis ΙΪΌ-8567 Mucor hiemalis ΐ^· hiemalis ΙΙΌ-8449 +4

Macor hiemalis f.. hiemalis ΓΕΌ-8448 +4- | _

Hacor hiemalis f. hiemalis ΙΙΌ-8565 Hacor hiemalis f. hiemalis CBS-II7.O8 Hacor hiemalis f. hiemalis CBS-1Q9-19 Macor hiemalis f. hiemalis CBS-20Q.28

Macor hiemalis. f - hiemalis CBS-242.33 - -

Miicor hiemalis f,- hiemalis CBS-IIO.I9 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 +4

Mucor "bacilliformis HKRL-234-6 Mucor circinelloides f- circinelloides

Mucor circinelloides f_- circinelloides^ Ι5Ό-5775

Muc or hiemalis f> corticolus NKRL-124-73 Mucor dimorpiiosporus ΓΕΌ-4-556 Mucor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IEO-4^8^ Mucor gloijosus HEffiIr-12474 Hue ο r circinelloide s ϊ_· griseo-cyanus

Muc or hetero sporus KERL-3154-Mucor spine s c ens ΙΑΜ-6Ο7Ί Mucor chinensis ΙΪΌ-4-772 Ehizopus circinans ATCC-1225 Bhizopus arrhizus ATCC-1114-5 Zygorynchus moelleri ΙϊΌ-4β33 Circinella muscae IEO-4457 Circinella ripjida mCRL-23^1 Gircine 11a umT3ellata NERL-I713 Circinella umbellata Circinella umbellata = IFO-584-2■ Actinomucor elevans ATCC-54-76 Phycomyces ~blakesleeanus UERL-124-75 Spuren Spuren +1

+1

Spuren

Spuren +1 +1

Spuren

+1

Spuren Spuren Spuren +1 +1 +1 +1

Spuren +1. +1 +1 +1 Spuren

Martierella isabellina IFO-6739 Spuren Gongronella frutleri ISO-8080 +1

Pycnoporus coccineus IiERL-124-76 +3 Rhizoctonia solani EERL-12477 +2

Die Abkürzungen, welche die Umwandlung in M-4 angeben, haben folgende Bedeutung :

Spuren = 0,5 % oder weniger

+1 = 0,5 - 5 %

+2 = 5,0 - 10,0 %

+3 = 10,0-30,0%

+4 = 70,0 - 90,0 %

Beispiel 26

Hers tellunc[_von_IsoM-4' -Lacton

20 500 ml-Sakaguchi-Kolben, die jeweils 100 ml eines Mediums der in Beispiel 22 beschriebenen Zusammensetzung enthielten, wurden mit Sporen von Circinella muscae IFO-4457 inokuliert. Das Inokulum wurde einer Schüttelkultur bei 26⁰C mit 120 A.p.M. unterworfen- Nach 4 Tagen wurde ML-236B bis zu einer Endkon-* zentration von 0,05 % (Gew/Vol) zugefügt und die Züchtung wurde weitere 6 Tage bei 26°C und 120 A.p.M. vorgenommen.

Nach Beendigung der Züchtung wurde das Reaktionsgemisch der Umwandlung filtriert und das Filtrat wurde mit Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. Das Gemisch wurde dann 3 mal jeweils mit 1 1 Äthylacetat extrahiert, wobei eine IsoM-4' enthaltende Fraktion erhalten wurde. Dieser Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von

130052/08β§

Natriumchlorid gewaschen und dann zur Trockene eingedampft. Auf diese Weise wurde ein Lacton als Produkt gebildet. Der Rückstand wurde auf eine Lobar-Kolonne (Merck Si 60, Größe A) aufgegeben und mit einem Äthylacetat-System gereinigt, wobei 12 mg IsoM-4'-Lacton mit den in Beispiel 7 beschriebenen Eigenschaften erhalten wurden.

Beispiel 27

20 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml eines Mediums der nachstehend gezeigten Zusammensetzung enthielten, wurden jeweils mit Sporen von Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 angeimpft. Das Inokulum wurde dann einer Schüttelkultur bei 26°C und 220 A.p.M. unterworfen. Nach 3 Tagen wurde ML-236B bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % (Gew/Vol) zugesetzt und die Züchtung erfolgte bei 26°C und 220 A.p.M.

Das verwendete Medium hatte folgende Zusammensetzung (Prozentangaben in Gew/Vol) :

Glucose 1 %

Pepton 0,2 %

Fleischextrakt 0,1 %

Hefeextrakt 0,1 %

Maisquellflüssigkeit 0,3 %

(pH nicht eingestellt)

Nach Beendigung der Züchtung wurde das durch die Umwandlung erhaltene Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wurde mit Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Das Gemisch wurde dann 3 mal mit jeweils 1 1 Äthylacetat extrahiert, wobei eine M-4' enthaltende Fraktion gebildet

130052/0069

wurde, die in der Dünnschichtchromatographie (Platte : Merck Silicagel Art 5715; Lösungsmittel : Gemisch aus Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumverhältnis 50 : 50 :3) einen Rf-Wert von 0,46 zeigte. Dieser Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Zugabe einer katalytischen Menge Trifluoressigsäure lactonisiert. Das gebildete Gemisch wurde dann mit einer 5 %igen (Gew/Vol) wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei etwa 180 mg M-4'-Lacton erhalten wurden, das folgende physikalische Eigenschaften zeigte :

1) Kernmagnetisches Resonanzspektrum :

Gemessen in Deuterochloroform bei 100 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard.

6 ppm :

6,01 (1H, Duplett);

5,90 (1H, Quadruplett);

5,75 (1H, Multiplett);

5,50 (1H, Multiplett);

4,60 (1H, Multiplett);

4,25 (1H, Multiplett).

2) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol) /t nm :

max

230, 237, 245

3) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) \) cm" :

3500, 1720

4) Massenspektrum :

M/e : 406(M⁺) , 304,' 286

5) Optische Drehung :

[a]p⁵ = +310,9° (c = 0,66, Methanol)

136052/0863

Schmelzpunkt :	⁰C	67,	95 %;	H:	8	,43 %
141 - 143	;	68,	05 %;	H:	8	,37 %
Elementaranalyse	: C:
Berechnet	: C:
Gefunden

8) Dünnschichtchromatographie :

TLC-Platte : Merck Silicagel Art 5715 Lösungsmittel : Benzol/Aceton (Volumverhältnis 1:1) Rf-Wert : 0,64

Beispiel 28

Unter Nacharbeitung im wesentlichen des gleichen Züchtungsverfahrens wie in Beispiel 27 wurde ein Umwandlungsreaktionsgemisch hergestellt.

Nach Beendigung der Züchtung wurde das durch die Umwandlung erhaltene Reaktionsgemisch filtriert und der pH-Wert des Filtrats wurde mit Trifluoressigsäure auf einen Wert von 3 eingestellt. Das Filtrat wurde dann 3 mal mit jeweils 1 1 Äthylacetat extrahiert, wobei eine M-4' enthaltende Fraktion gebildet wurde, die mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und unmittelbar danach in eine 5 %ige (Gew/Vol) wässrige Lösung von Natriumbicarbonat gegeben wurde. Auf diese Weise wurde eine das M-4'-Natriumsalz enthaltende Fraktion gebildet. Die so erhaltene wässrige Schicht wurde mit 0,1 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 8,0 eingestellt und an einer Diaion HP 20-Harz-Kolonne (Produkt der Mitsubishi Chemical Industries) adsorbiert. Die Elution erfolgte mit 50 %igem (Vol/Vol) wässrigem Aceton. Das Aceton wurde abdestilliert und der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei 1,41 g M-4'-Natriumsalz mit den nachstehenden physikalischen Eigenschaften erhalten wurden :

110052/0$$$

1) Kernmagnetisches Resonanzspektrum :

Gemessen in Deuterochloroform bei 60 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard.

6 ppm :

6,00 (1H, Duplett) ;

5,95 (1H, Quadruplett);

5,70 (1H_r breites Singulett);

5,50 (1H, breites Singulett).

2) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol)^, nm :

max

230, 238, 246

3) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) \? cm :

3400, 2900, 1680

Beispiel 29

Unter Nacharbeitung im wesentlichen des gleichen Züchtungsverfahrens wie in Beispiel 27 wurde ein Umwandlungsreaktionsgemisch erhalten.

Nach Beendigung der Züchtung wurde das Umwandlungsgemisch filtriert und das Filtrat mit Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Es wurde dann 3 mal mit jeweils 1 1 Äthylacetat extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, wonach eine ätherische Lösung von Diazomethan zugesetzt wurde. Das gebildete Gemisch wurde 3 0 Minuten stehengelassen und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde unter Verwendung einer Lobar-Kolonne (Merck RP-8, Größe A) und unter Anwendung eines Gemisches aus Benzol und Aceton im Volumverhältnis 1 : 1 als

130052/0869

Entwicklungslösungsmittel gereinigt. Auf diese Weise wurden 150 mg M-4'-Methylester als farblose ölige Substanz erhalten, welche die nachstehenden Eigenschaften zeigte :

1) Kernmagnetisches Resonanzspektrum :

Gemessen in Deuterochloroform bei 6 0 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard.

öppm :

6,01 (1H, Duplett);

5,90 (1H, Quadruplett);

5,75 (1H_; breites Singulett);

5,50 (1H, breites Singulett);

3,7 0 (3H, Singulett).

2) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol)/,. nm :

max

230, 238, 246

3) Infrarot-Absorptionsspektrum (flüssiger Film)$ cm :

3400, 1730

4) Massenanalyse :

Die Messung erfolgte nach der Silylierung mit N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid unter Anwendung eines Massenspektrometers Typ D-300 der Nippon Electronics. M/e : 654 (M⁺)

130052/0889

DF.A-13 57?

100 9Oj 80 70 60 50 40 30 20 10

Fig

4000 2600 1800 1400 1000

3600 2000 1600 1200

800

400

cm

-ι

Fig

PPM

130052/0869

Claims

Ptir.MANWÄLTE _." "*.."

SCHIFF v.FÜNER STREHL SC H ÜBE L-H O PF EBBINGHAUS FINCK

MARIAHILFPLATZ 2 Λ 3, MÖNCHEN 9O
POSTADRESSE: POSTFACH 96Ο16Ο, D-8OOO MÖNCHEN 95

ALSO PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUBOPEiN PATENT OFFICE

KARL LUDWIS SCHIFF (1S)€iJ - 197S)

DIPI.. OHEM. DB. AUEXiNnER «.FÜNER

DIPL ING. PI£TER STREHL

PIPL-CHEM DR. URSlJl A iiCHÜBP L- HOPF

DIPL. ING. DIETER EBIältJSHAUS

DR- INK. DIETER FINCK

TEl E.FON (Οβθ) 4Β5Ο64

TELEX 5-03665 AURO D

TELHGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN

SANKYO COMPANY LIMITED DEA-13 579

5. Juni 1981

Neue Derivate von ML-236B, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Derivate enthaltende Arzneimittelzubereitungen

PATENTANSPRÜCHE

1.) Verbindungen der Formel (I) :

HOOC-

(IJ

1300S2/0&69

in der R für eine Gruppe der nachstehenden Formeln steht

sowie die durch Ringschluß gebildeten Lactone und Salze und Ester dieser Verbindungen.

2. Verbindungen gemäß Anspruch 1 der Formel (II)

130052/0868

R¹OOC

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Cj-C^-Alkylgruppe bedeutet, sowie pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet.

3. Verbindungen nach Anspruch 2, worin R ein Wasserstoff atom bedeutet.

4. Verbindungen nach Anspruch 2, worin R eine C₁-C₅-Alkylgruppe bedeutet.

5. Verbindungen nach Anspruch 2, worin R eine Methylgruppe bedeutet.

6. Verbindungen nach Anspruch 2 in Form der Alkalimetallsalze.

1300S2/0869

7. Verbindungen nach Anspruch 6 in Form des Natriumsalzes.

8. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel (III)

(IiIJ

9. Verbindungen nach Anspruch 2 der in Formel (IV) gezeigten sterischen Konfiguration :

R¹OOC

(IV]

worin R die in Anspruch 2 gegebene Definition hat, sowie deren pharmazeutisch geeignete Salze.

10. Verbindungen nach Anspruch 9, worin R ein Wasserstoff atom bedeutet.

11. Verbindungen nach Anspruch 9, worin R eine C.

Alky!gruppe bedeutet.

12. Verbindungen nach Anspruch 9, worin R eine Methylgruppe bedeutet.

13. Verbindungen nach Anspruch 9 in Form der Alkalimetallsalze.

14. Verbindungen nach Anspruch 13 in Form des Natriumsalzes.

15. Verbindung nach Anspruch 8 mit der in Formel (V)
gezeigten sterischen Konfiguration :

.130062/0069

(V)

16. Verbindungen nach Anspruch 2 mit der in Formel (VI) gezeigten sterischen Konfiguration :

R¹OOC

(VI]

1
worin R die in Anspruch 2 gegebene Definition hat, sowie deren pharmazeutisch geeignete Salze.

17. Verbindungen nach Anspruch 16, worin R ein Wasser-

.1 % β ö S 2 / ο § θ 9

stoffatom bedeutet.

18. Verbindungen nach Anspruch 16, worin R eine C₁-C₁--Alkylgruppe bedeutet.

19. Verbindungen nach Anspruch 16, worin R eine Methylgruppe bedeutet.

20. Verbindungen nach Anspruch 16 in Form der Alkalimetallsalze.

21. Verbindungen nach Anspruch 20 in Form des Natriumsalzes.

22. Verbindung nach Anspruch 8 mit der in Formel (VII) gezeigten sterischen Konfiguration :

(VIIJ

23. Verbindungen nach Anspruch 1 der Formel (VIII)

(VIIIJ

worin R ein Wasserstoff atom oder eine bedeutet, sowie pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, in der R ein Wasserstoffatom darstellt.

24. Verbindungen nach Anspruch 23, worin R ein Wasserstoff atom bedeutet.

25. Verbindungen nach Anspruch 23, worin R eine C₁-C₅-Alkylgruppe bedeutet.

26. Verbindungen nach Anspruch 23, worin R eine Methylgruppe bedeutet.

27. Verbindungen nach Anspruch 23 in Form der Alkalimetallsalze.

28„ Verbindungen nach Anspruch 27 in Form des Natriumsalzes.

29. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel (IX) :

(IXl

30. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) :

ID"

in der R für eine Gruppe der Formel

120052/0853

- τι -

steht,

sowie die durch Ringschluß gebildeten Lactone und Salze und Ester dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat eine der Substanzen ML-236B, ML-236B-carbonsäure oder deren Salz oder Ester enzymatisch hydroxyliert.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydroxylierung mit Hilfe eines Mikroorganismus, der aus Mikroorganismen der Genera Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Circinella, Actinomucor, Gongronella, Phycomyces, Martierella, Pycnoporus, Rhizoctonia, Absidia, Cunninghamella, Syncephaiastrum und Streptomyces ausgewählt ist oder mit Hilfe eines zellfreien enzymhaltigen Extrakts aus diesen Mikroorganismen durchführt.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet , daß man einen der folgenden Mikroorganismen verwendet :

Absidia coeruiea Cunninghatneiia echinulata SyncephaTastrum racemosum Streptomyces roseochromogenus

130062/066B

Mucor hiemails f. hiemaiis

Mucor bacilliformis

Mucor eircineiTofdes f. circineTloides

Mucor hiemal is f. corticoius

Mucor dimorphosporus

Mucor fragil is

Mucor genevensis

Mucor giobosus

Mucor circineiioides f^ griseo-cyanus

Mucor heterosporus

Mucor spinescens :

Rhizopus chinensis

Rhizopus circinans

Rhizopus arrhizus

Zygorynchus moeTTeri

Cireinen a muscae

CircineiTa rigida

C i reinen a umbeiiata

Actinomucor eiegans

Phycomyces biakesTeeanus

Martiereila isabeTTina ■ -..·

Gongroneila butleri

Pycnoporus coccineus

Rhizoctonia soiani

SyncephaTastrum nigricans

Absidia glauca var. paradoxa

130052/Οθβδ

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man einen der folgenden Mikroorganismen verwendet :

Absidia coeruiea IFO-4423 CunninghameiTa echinuTata IFO-4445 Cunninghamena echinulata IFO-4444 Cunninghameiia echinulata ATCC-9244 Syncephaiastrum racemosum IFO-4814 Syncephaiastrum raceroosum IFO-4828 Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233 Streptomyces roseochromogenus IFO-3363 Streptomyces roseochromogenus IFO-3411

Mucor hiemaTis f. hiemal is IFO-5834

Mucor hiemal is f^ hiemal is IFO-5303

Mucor hiemal is f. hiemaTis IFO-8567

Mucor hiemal is f^ hiemaiis IFO-8449

Hucor hiemal is f^ hiemal is IFO-8448 Mucor hiemal is _f^ hiemal is ' IFO-8565

Mucor hiemal is f. hiemal Is CBS-117.08

Mucor hiemal is f^_ hiemaiis CBS-109.19

Mucor hiemaiis f. hiemal is CBS-200.28

Mucor hiemaTis U_ hiemal is CBS-242.35

Mucor hiemalis f. hiemaiis CBS-IlO.19

Mucor hiemal is f. hiemal is CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circineTloides Jf₁ circineTloides IFO-4554 Mucor c i reinen ο i des f^ circineTloides IFO-5775 Mucor hi email's f± corticoius NRRL-12473

Mucor dimorphosporus IFO-4556

Mucor fragilis CBS-236.35

Mucor genevensis IFO-4585

Mucor giobosus NRRL-12474

Mucor circineTloides fj_ griseo-cyanus IFO-4563

Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Rhizopus chinensis IFO-4772 Rhizopus circinans ATCC-1225 Rhizopus arrhizus ATCC-11145 Zygorynchus moeiieri IFO-4833 Circineiia muscae IFO-4457 Cireinen a rigida NRRL-2341 Cireinen a umbeTlata NRRL-1713 Cireinen a umbeiiata IFO-4452 Circinena urnbeiiata IFO-5842

Phycomyces bTakesieeanus NRRL-12475 MartiereTia isabeiiina IFO-6739 Gongronen a butieri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477

130052/OSS9

- 15 -

SyncephaT astrurn nigricans NRRL-12478
Syncephaiastrum nigricans NRRL-12479
SyncephaTastrum nigricans NRRL-12480
Absi dia giauca var. paradoxa IFO-4431
Actinomucor elegans ATCC-6476

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Reaktionsgemisch eine Verbindung aus der Gruppe M-4, M-4', IsoM-4, IsoM-4', ein Salz, einen Ester oder ein Lacton von M-4, M-4', IsoM-4 oder IsoM-4' oder ein Gemisch solcher Verbindungen abtrennt.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester ein C -C₅-Alkylester ist.

36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester ein Methylester ist.

37. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet , daß das Salz ein Alkalimetallsalz ist.

38. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Natriumsalz ist.

39. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus aus der nachstehenden Gruppe von Mikroorganismen verwendet wird:

Ab sidla coeruiea

Cunninghameiia echinulata Syncephaiastrum racemosum Mucor hiemal is fj_ hiemal is

Mucor baciTIiformis

Mucor circineTIoides f. circineiioides

Mucor hiemal is f. corticolus

Mucor dimorphosporus

Mucor fragil is

Mucor genevensis

Mucor giobosus

Mucor circineTloides J\_ griseo-cyanus

Mucor heterosporus

Mucor spinescens

Pycnoporus coccineus

Rhizoctonia soiani

SyncephaTastrum nigricans

40. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch g e k e η η zeichnet, daß ein Mikroorganismus aus der folgenden Gruppe verwendet wird:

1300S2/0SI8

Ab si dia coerulea IFO-4423 Cunninghamella echinulata IFO-4445 Cunninghamen_a echinulata IFO-4444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Mucor hiemalis j\_ hiemal is IFO-5834 Mucor hiemal is f\_ hiemal is IFO-5303 Mucor hiemal is f^ hiemal is IFO-8567 Mucor hiemal is fj_ hiemal is IFO-8449 Mucor hiemal is f^ hiemal is IFO-8448 Mucor hiemal is f^ hiemal is IFO-8565 Mucor hiemal is f. hiemal is CBS-117.08 Mucor hiemal is f. hiemal is CBS-109.19 Mucor hiemal is f. hiemal is CBS-200.28 Mucor hiemal is f. hiemal is CBS-242.35 Mucor hiemal is f. hiemal is CBS-IlO.19 Mucor hiemal is jv hiemal is CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelioides ^ circinelloides IFO-4554 Mucor circinelloides £^ circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556 Mucor fragil is CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585

130062/OftdQ

Mucor giobosus NRRL-12474 Mucor circineTloides f_^ griseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia soiani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum m'gn'cans NRRL-12479 and Syncephalastrum nigricans NRRL-12480.

41. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus aus der nachstehenden Gruppe von Mikroorganismen verwendet:

Mucor hiemaiis f^ hiemal is Mucor circineTloides J\_ circineTloides

Mucor fragil is

Mucor genevensis

Mucor circineTloides _f^ griseo-cyanus Pycnoporus coccineus and

Rhizoctonia sol am*.

42. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus aus der Gruppe Syncephalastrum nigricans

und Syncephalastrum racemosum verwendet und Verbindungen der Formel (VI)

R¹OOC

(VI)

worin R^ ein Wasserstoff atom oder eine Cj -C₅-Al]Cy lgruppe bedeutet, pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, worin R¹ ein Wasserstoffatom darstellt oder eine Verbindung der Formel (VII)

0,

(VII)

herstellt.

130ÖS2/0ÖS9

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Wasserstoffatom bedeutet.

44. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch g e k e η η

Ί~°5

1
zeichnet , daß R eine C₁-C_l--Alkylgruppe bedeutet.

45. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch g e k e η η -

ι
zeichnet,, daß R eine Methylgruppe bedeutet.

46. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet , daß das Salz ein Alkalimetallsalz ist.

47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Natriumsalz ist.

48. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus aus der Gruppe Absidia coerulea und Cunninghamella echinulata verwendet wird und eine Verbindung aus der Gruppe der Verbindungen der Formel (VIII)

130052/08S9

R¹OOC

(VIII)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Cj-Cg-Alkylgruppe bedeutet, pharmazeutisch geeignete Salze der Säure, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet, und Verbindungen der Formel (IX)

0, ^ JH

(IX)

hergestellt wird.

130062/Οβββ

49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet , daß R ein Wasserstoffatom bedeutet.

50. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch g e k e η η zeichnet , daß R eine Cj-C^-Alkylgruppe bedeutet.

51. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch g e k e η η -

1
zeichnet , daß R eine Methylgruppe bedeutet.

52. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet , daß das Salz ein Alkalimetallsalz ist.

53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Natriumsalz ist.

54. Arzneimittel mit Wirksamkeit zur Inhibierung der
Biosynthese von Cholesterin, enthaltend einen Wirkstoff
sowie gegebenenfalls übliche Arzneimittelzusätze bzw.
Trägersubstanzen, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff eine Verbindung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 29 enthält.

13ÖÖS2/OÖS9