NL8102737A

NL8102737A - Ml-236b derivaten en hun bereiding.

Info

Publication number: NL8102737A
Application number: NL8102737A
Authority: NL
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1980-06-06
Filing date: 1981-06-05
Publication date: 1982-01-04
Also published as: DE3122499C2; AU549988B2; NL960028I2; DK247081A; MX7065E; DK149080C; IE811257L; FI71168C; US4410629A; ES502827A0; FI71168B; AU7137681A; NL191738C; BE889150A; DK149080B; US4346227A; FI811762L; NL960028I1; SE453389B; IT1144598B

Description

ï *

Korte aanduiding: ML-236B-derivaten en hun bereiding,

De uitvinding heeft betrekking op een aantal nieuwe derivaten van de bekende verbinding ML-2363, alsmede op een werk -wijze ter bereiding van deze derivaten, en op farmaceutische preparaten die deze derivaten bevatten.

5 De verbinding ML-236B, die de chemische struktuur met formule la van het formuleblad bezit, is beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.983.140 en is geïsoleerd en gezuiverd uit de metabolische produkten van microorganismen van het geslacht Penicillium , in het bijzonder Penicillium citrinum, een variëteit van de blauwe 10 schimmel. Men heeft aangetoond dat deze verbinding de biosynthese van cholesterol door enzymen of gekweekte cellen afkomstig van proefdieren remt door concurrentie met het snelheidsbeperkende enzym dat Mj-de-biosynthese van cholesterol werkzaam is, namelijk 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reductase, waardoor het serum-15 cholesterolgehalte in dieren aanzienlijk verlaagd wordt / Journal of Antibiotics, 29, 1346(1976)-7- Men heeft eveneens een aantal verbindingen ontdekt die structureel met ML-236B verwant zijn en die ook in staat zijn de biosynthese van cholesterol tegen te gaan.

Aanvraagster heeft nu een aantal nieuwe verbindingen gevonden, 20 die door enzymatische hydroxylering van ML-2368 of de derivaten daarvan bereid kunnen worden en in staat zijn de biosynthese van cholesterol tenminste evengoed als en in sommige gevallen beter dan ML-236B tegen te gaan.

De verbindingen volgens de onderhavige uitvinding zijn de 25 hydroxycarbonzuren met formule 1 van het formuleblad, waarin R de groep met formule lb of 1c voorstelt, alsmede de tot een ring gesloten lactonen, zouten en esters daarvan.

De uitvinding verschaft bovendien een werkwijze voor de bereiding van de verbinding met formule 1, of een tot een ring 30 gesloten lacton, zout of ester daarvan, door enzymatische hydroxylering van ML-2368 of ML-23óB-carbonzuur of een zout of ester daarvan.

8102737 ί ί% - 2 - ML-2368-carbonzuur beantwoordt aan formule ld van het formuleblad.

Een groep van de verbindingen volgens de onderhavige uitvinding bezit de formule 2 van het formuleblad, waarin een water-5 stofatoom of een alkylgroep met 1 tot 5 koolstofatomen voorstel!, de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin een waterstofatoom voorstelt, en het overeenkomstige lacton met formule 3 van het formuleblad.

In verband met het aantal asymetrische koolstofatomen in 10 deze verbindingen, zijn een aantal verschillende geometrische isomeren mogelijk , waarvan de volgenden de belangrijksten zijn.

De verbindingen met formule 4, waarin de hierbovengenoemde betekenis bezit, en de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin een waterstofatoom voorstelt en het overeenkomstige 15 lacton met formule 5 van het formuleblad alsmede de verbindingen met formule 6, waarin de hierbovengenoemde betekenis bezit, en de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin een waterstofatoom voorstelt, en het overeenkomstige lacton met formule 7.

Het hydroxycarbonzuur met formule 4, waarin een waterstof-20 atoom voorstelt, wordt hierna aangeduid met M-4, en de derivaten van dit zuur, in het bijzonder de zouten en esters, met derivaten van M-4, terwijl het overeenkomstige lacton met formule 5 aangeduid wordt met M-4-lacton. Op dezelfde v/ijze wordt het hydroxycarbonzuur met formule ó, waarin R.j een waterstofatoom voorstelt, aangeduid 25 met M-4' en de derivaten van dit zuur met derivaten van M-4', terwijl het overeenkomstige lacton met formule 7 M-4'-lacton genoemd wordt.

Een andere groep van verbindingen volgens de uitvinding die de voorkeur verdienen zijn de verbindingen met formule 8 van het formuleblad, waarin de hierbovengenoemde betekenis bezit, en de 30 farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin een waterstofatoom voorstel!, alsmede het overeenkomstige lacton met formule 9.

3102737 -3- 'r ^

Een aantal geometrische isomeren van deze verbindingen zijn eveneens mogelijk, waarvan de volgenden de belangrijkste zijn.

De verbindingen met formule 10, waarin R1 de hierbovengenoemde betekenis bezit, de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur 5 waarin een waterstofatoom voorstelt, alsmede het overeenkomstige lacton met formule 11, en de verbindinge met formule 12, waarin R^ de bovengenoemde betekenis bezit, de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin R^ een waterstofatoom voorstelt, alsmede het overeenkomstige lacton met formule 13.

10 Het zuur met formule 10 wordt hierna aangeduid met IsoM-4, terwijl de derivaten daarvan, bijvoorbeeld de zouten en esters, aangeduid worden met derivaten van IsoH-.4 en het overeenkomstige lacton met formule 11 IsoM-4-lacton genoemd wordt. Het zuur met formule 12, waarin een waterstofatoom voorstelt, wordt hierna 15 aangeduid met IsoM-4’, de derivaten daarvan met derivaten van

IsoM-41, terwijl het overeenkomstige lacton met formule 13 aangeduid wordt met IsoM-4'-lacton.

Van de esters van de hydroxycarbonzuren met formule 1 geeft men aan de alkylesters met 1 tot 5 koolstofatomen de voorkeur. Deze 20 alkylgroepen kunnen recht of vertakt zijn en bijvoorbeeld bestaan uit methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl of isobutyl, waarbij de methylgxoep de bijzondere voorkeur verdient.

De hydroxycarbonzuren vormen ook zouten met een aantal kationen, in het bijzonder metalen en vooral alkaiimetalen, zoals 25 natrium en kalium, waarvan de natriumzouten de voorkeur verdienen.

Tot de verbindingen der. uitvindingen die de voorkeur verdienen behoren M-4-lacton, M-4-natriumzout, M-4-methylest3x, IsoM-4'-lacton, IsoM-4'-natriumzout en IsoM-4'-methylestsr, waarbij aan het M-4-natriumzout in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven.

30 Men kan de verbindingen volgens de uitvinding bereiden door enzymatische hydroxylering van ML-236B of een derivaat daarvan, in het bijzonder het ML-23o3-carbonzuur of een zout of ester daarvan.

8102737 -4- r ί

Men kan de enzymatische hydroxylering uitvoeren als deel van het zoogdiermetabolisme van ML-2363, of een derivaat daarvan, bijvoorbeeld door ML-23ÓB aan een daarvoor geschikt dier toe te dienen, het metabolische produkt, bijvoorbeeld urine, te verzamelen 5 en de gewenste verbinding of verbindingen volgens de uitvinding uit de urine af te scheiden. Men kan ook lever of een enzym bevattend leverextract in plaats van levende dieren gebruiken. De werkwijze die van het dierlijke metabolisme of dierlijke producten gebruik maakt levert echter een naar verhouding lage opbrengst en 10 is moeilijker reproduceerbaar. Daarom wordt aan microorganismen of enzymbevattende extracten van microorganismen de voorkeur gegeven.

Men maakt du.s volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding bij voorkeur gebruik van een microorganisme, dat in staat is ML-236B, of een derivaat daarvan, in een verbinding volgens de 15 onderhavige uitvinding om te zetten, of van een enzymbevattend extract van een dergelijk microorganisme. Microorganismen die in het bijzonder de voorkeur verdienen zijn die van de volgende geslachten: Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Circineiia, Actinomucor,

Gongronelia,. Phycomyces, Martierella, Pycnoporus, Rhizoctonia, 20 Absidia, Cunninghcmella, Syncephalastrum en Streptomyces. Vooral de navolgende soorten verdienen de voorkeur:

Absidia coerulea Cunninghcmella echinulata 25 Syncephalastrum racemosum

Streptomyces roseochromoqenus Mucor hiemalis f. hiemolis Mucor bcoilliformis

Mucor circinelloides f. circinelloides 30 Mucor hiemalis f. corticolus Muc.-r: dimorphosporus Mucor fragilis Mucor genevensis 8102737

T 'L

-5-

Hucor globosus

Mucor circinelloides f. qriseo-cyanus Mu cor heterosporus Mucor splnescens 5 Rhizopus chinensis Rhizopus circinans Rhi sopus arrhizus Zyqorynchus moelleri Circinella muscae 10 Circinella riqida Circinella umbellata • Actinomucor elegans Phycomyces blakeslseanus Hartierella isabellina 15 Gongronella butleri Pyc“oporus coccineus Rhizoctonia solani Syncephalg,3trum nigricans Absidia qlauca var. paradoxa 20

Van de stammen van de bovengenoemde soorten verdienen vooral de volgende de voorkeur:

Absidia coerulea IFO-4423

Cunninghamella echinulata IFO-4445

Cunninqhamella echinulata IF0-4444 25 Cunninghamella echinulata ATCC-9244

Syncephclastrum racemosum IFO-4814

Syncephalastrum racemosum IF0-4828

Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233

Streptomyces roseochromogenus IFO-3363 oq Streptomyces roseochromogenus IF0-34I1

Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5834 8102737 τ "ί -6-

Hu cor hiemalis f. hiemalis IFö-5303

Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-85Ó7

Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8449

Hucor hiemalis f. hiemalis IFÖ-8848 5 Mucor hiemalis f. hiemalisIFO-8565

Hucor hiemalis f. hiemalis C3S-117.03

Mucor hiemalis f. hiemalis C8S-109.19

Hucor hiemalis f. hiemalisCBS--2Q0.28

Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242,35 10 Mucor hiemalis fhiemalis €85-110.19

Mucor hiemalis f. hiemalis CB5-201.65

Hucor bacilliformis NRRL-234Ó

Mucor circinelloides f. circinellolik-s IF0-4554

Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 15 Mucor hiemalis f. corticolus MRRL-12473

Mucor dimorphosporus IFO-4556

Mucor fraqilis C8S-236.35

Mucor aenevensis IFO-4585 ..... . -

Mucor globosus NRRL-12474 20 Mucor circinelloides f. qriseo-cyanus IF0-4563 Mucor heterosporus MRRL—3154-Mucor spinescens IAM-6071 Rhizopus chinensis IFO-4772 Rhizopus circinans ATCC-1225 25 Rhizopus arrhizus ATCC-1145 Zyqorynchus moelleri IFO-4833 Circinella muscae IFO-4457 Circinella riqida NRRL-2341 Circinella umbellata NRRL-1713 30 Circinella umbellata IF0-4452 Circinella umbellata IFö-5842 Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 81 0 2 7 3 7 X t - 7 -

Hartierella isabellina IFO- 6739 Gonqronella butleri IF0--S080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 5 Syncephalastrum nigricans NRRL-12473 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 Syncephalastrum nigricans NRRL-12480 Absidia glauca var. paradoxa IFC-4431 Actinomucor elega ns ATCC-6476 10 De bovengenoemde microorganismen zijn verkrijgbaar bij de

International Cultuurcollecties zoals aangegeven door de afkortingen, verbonden met hun depotnummers, die de volgende betekenis bezitten: IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan NRRL = Agricultural Research Culture Collection, Illinois, 15 U.S.A.

CBS - Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Nederland IAM = Institute of Applied Microbiology, Tokio, Japan ATCC = American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A.

Van de bovengenoemde soorten verdienen in het bijzonder de 20 volgende de voorkeur:

Absidia coerulea Cunninghamella echinulata Syncephalastrum racemosum Mucor hie-fialis f. hiemalis 25 Mucor bacilliformis

Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corti rolus Mucor dimor;?hosporus Mucor fragilis 30 Mucor genevensis Mucor globosus

Mucor circinelloides f. qriseo-cyanus 8102737 X x - 8 -

Mu cor heterosporus Mucor spinescens Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani 5 Syncephalastrum nigricans waarbij de volgende stammen in het bijzonder de voorkeur verdienen:

Absidia coerulea IFO-4423 Cunninqhamella echinulata IFO 4445 Cunninghamella echinulata IFO-4444 10 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 Syncephalas trum racemosum ÏF0-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-5834 Hucor hiemalis f. hiemalis IF0-5303 15 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis jpQ g^^

Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f hiemalis IF0-85Ó5 Mucor hiemalis f, hiemalis CBS-117.03 20 Mucor hiemalis f. hiemalis CSS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis C8S-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis C8S-242.35 Mucor hiemalis f, hiemalis CBS-110.,19 Mucor hiemalis f. hiemalis C35-201.65 25 Mucor basllliformis NRRL-2346

Mucor circinelloides f. circinelloides IFö-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 30 Mucor dimorrhosporus IF0-4556 Mucor fragilis CS5-23Ó.35 81 0 2 7 3 7 X i -9-

Mucor qenevensis IFO-4585 iMucor globosus f'RRL-i.2474 •M—»MM· <Mmm ! — .

Hucor circinelloidea f. qriseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 5 Hucor spinescens IAM-Ó071

Pycnoporus coccineus NRRL-1247Ó Rhizoctonia solani MRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 10 Syncephalastrum nigricans NRRL-12480

Voor de bereiding van de verbindingen met formules 4 en 5 alsmede hun zouten wordt aan de volgende groepen de voorkeur gegeven:

Hucor hlemalis f. hiemalis 15 Hucor circinelloides f. circinelloides Mucor rrΐ+c*i\5« s Mucor genevensls

Hucor circinelloides f. criseo-cyanus Pycnoporus coccineus 20 Rhizoctonia solani .

Voor de bereiding van de verbindingen met formules 6 en 3 alsmede hun zouten verdienen de soorten Syncephalastrum nigricans en Syncephalastrum racemosum de voorkeur.

Voor de bereiding van de verbindingen met formules 8 en 9 25 alsmede hun zouten verdienen de soorten Absidia coerulea en Cunninghamella echinulata de voorkeur.

Van alle bovengenoemde soorten wordt in het bijzonder aan Mucor hiemalis f, hiemalis de voorkeur gegeven omdat daarmee HL-2368 en de derivaten ervan in de gewenste verbindingen met 30 formule 1 kunnen worden omgezet met een opbrengst van 90% of nog hoger.

8102737 -10- r .. *

Men kan HL-2363 of de derivaten daarvan in verbindingen met formule 1 omzetten door het volledige celvormige microorganisme, of in sommige gevallen een celvrij extract van het microorganisme, met ML-2363 of een derivaat daarvan in aanraking brengen. De vorm 5 van de verkregen verbinding is afhankelijk van de kweekomstandig-heden en het gebruikte microorganisme. Als bijvoorbeeld een volledig celvormig microorganisme gekweekt wordt in aanwezigheid van ML-236B of een derivaat daarvan, zal het produkt het carbonzuur, het lacton of een alkalimetaalzout zijn, afhankelijk van de kweek-10 omstandigheden, in het bijzonder van de pH. Daar staat tegenover dat als ML-236B of een derivaat daarvan alleen in aanraking gebracht wordt met een rustend celvormig systeem of met een celvrij extract, men de verbinding volgens de uitvinding in de vorm van een alkcli-metaalzout verkrijgt.

15 Men kan het verloopt van de omzettingsreaktie bepalen door tijdens de reaktie monsters van het reaktiemengsel te trekken en de omzettingsgraad vast te stellen. Men kan bijvoorbeeld de aanwezigheid van het M-4-iacton vaststellen door vloeistofchromatografie met Micro bondapakt C^g (van Waters Co., U.S.A.) als drager en 20 1 ml/min. 62 vol./s -ige waterige methanol als oplosmiddel. Bij de bepaling met behulp van ultravioletabsorptie bij 237 nm levert M-4 een piek bij een retentietijd van 10 minuten, waarvan bij het onderzoek gebruik gemaakt kan worden. Soortgelijke methoden kunnen voor het vaststellen van de andere verbindingen volgens de uitvxn-25 ding worden toegepast.

Als de microorganismen in aanwezigheid van ML-2363 of een derivaat daarvan worden gekweekt ter bereiding van de verbindingen volgens de uitvinding, kiest men de kweekomstandigheden en het kweekmedium afhankelijk van het te kweken microorganisme. Omdat de 30 microorganismen die volgens de werkv/ijze van de onderhavige uitvinding gebruikt worden bekend zijn, zijn ook de kweekomstandigheden 8102737 τ *· -lien de kweekmedia voor deze microorganismen bekend.

Men kan de verbindingen der uitvinding op de bekende wijze uit het reaktiemengsel verwijderen, bijvoorbeeld door de cellen van de microorganismen (indien noodzakelijk) te filtreren en het over-5 blijvende mengsel aan één of andere combinatie van dunnelaagchroma-tografie, kolomchromatografie, of de veel werkzamere vloeistof-chromatografie te onderwerpen. Als twee of meer verbindingen volgens de uitvinding gelijktijdig bereid worden, kan. men voor de scheiding één of meer van deze chromatografische zuiveringsmethoden toepassen. 10 Behalve de verbindingen volgens de uitvinding kan in sommige gevallen ook een verbinding bereid worden die aangeduid wordt met M-3, en die in de gelijktijdig ingediende aanvrage met de titel "Hydronaftaleenderivaten, hun. bereiding en toepassing", aangeduid is met de naam 3',5'-dihydroxy(dihydro-ML-2365). De scheiding kan 15 op dezelfde wijze uitgevoerd worden.

Men heeft vastgesteld dat de verbindingen volgens de uitvinding de cholesterolbicsynthese met 50% verlagen bij concentraties die vergelijkbaar zijn met of in sommige gevallen aanzienlijk lager zijn dan de concentraties die voor ML-2363 en bepaalde andere over-20 eenkomstige bekende verbindingen nodig zijn. De remmende werking van de verbindingen volgens de uitvinding uitgedrukt in de concentratie in pg/ml die nodig is voor hst afremmen van de cholesterol-biosynthese met 50$ ^volgens de methode beschreven in Journal of Biological Chemistry , 234, 2335(1959)zijn als volgt: 25 M-4-methylester 0,001 i1-4-natriumzout 0,0008 M-4-lacton 0,016

IsoM-4*-methylester 0,QG7

IsoM-4'-lacton 0,013 30 M-4' 0,019 M-4'-natriumzout 0,00049 HL-2368 0,01 81 0 2 7 3 7

J

-12-

De uitvinding wordt acn de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

' VOORBEELD I Bereiding van H-4-lacton 5 Hen ent 20 Sakaguchi-kolven van 500 ml, die 100 ml van het medium met de hieronder beschreven samenstelling bevatten, met ^oren van Absidia coorulea IFö 4423. Hen onderwerpt de kolven bij 2ó°C met 120 sJegen per minuut gedurende 2 dagen aan een schud-cultuur. Na afloopt van deze tijd voegt men het natriumzout van 10 HL-2363 tot een concentratie van 0,05/* (gew./vol.) aan de kolven toe. De kweek wordt bij 26°C en 120 slagen per minuut nog 5 dagen voortgezet.

De samenstelling yan het medium is als volgt:

Glucose 2,0/o (gew./vol.) 15 K2HP04 0,15/

MgS04.7H20 0,15/ nh4no2 0,1/

Pepton 0,1/ "

Maisweekvloeistof 0,2/ " 20 Gistextract 0,1% " .

ZnS04.7H20 _ 0,001/

Leidingwater rest (ingesteid op pH 7,0).

Ma beëindiging van de kweek wordt de reactievloeistof 25 gefiltreerd en het filtraat met trifluorazijnzuur op pH 3 ingestsld.

Men extraheert het verkregen mengsel driemaal met 1 liter ethyl-acetaat onder vorming van M-4 bevattende extracten. Deze verbinding bozit een Rf-waarde van 0,45 bij dunneiaagchromatografie (TLC) (Plaat: Merck siiicagel Art. 5715, oplosmiddel: een mengsel van 30 benzeen, aceton en azijnzuur in de volumeverhouding 50:50:3). Hen 8102737 >' * -13- wast de samengevoegde extracten met een verzadigde oplossing van natriumchloride in water en voegt daarop voor de lactonvorming een katalytische hoeveelheid trifluorazijnzuur toe. Men wast het verkregen mengsel met l/b's (gew./vol.)oplossing van natriumbicarbo-5 naat in water, droogt boven watervrij natriumsulfaat en dampt onder verminderde druk in tot droog. Men onderwerpt het residu aan preparatieve vloeistofchromatografie, Systeem 500 met behulp van een Prep PAK-500/C^g-patroon van Waters Associates (Prep PAK is het handelsmerk). Zuivering met een waterig 55% (vol./vol.) methanol-10 systeem levert 50,1 mg M-4-lacton.

M-4-lacton bezit de volgende fysische eigenschappen.

1) Kernspinresonantiespectrum:

Het NMR-spectrum bij 60 MHz in deuterochloroform met tetramethyl-silaan als inwendige standaard is weergegeven in fig. 1 van de 15 tekening.

2) Ultraviolet cbsorptiespectrum (methanoloplossing)X nm: 230; 236,7; 244,6.

3) Infrarood absorptiespectrum (vloeistoffilm)cm 3400, 2950, 1725.

20 4) Dunnelaagchromatografie: TLC plaat: Merck silicagel Art.· 5715; - Oplosmiddel: benzeen-aceton-azijnzuur (volumeverhouding 50:50:3) Rf-waarde : 0,62.

VOORBEELD II

25 Men bereidt volgens de werkwijze van Voorbeeld I met behulp van Cunninqhamella echinulatie IF0 4445 48 mg M-4-lacton.

VOORBEELD III

Men bereidt volgens de werkwijze van Voorbeeld I met behulp van Streptomyces roseochromogenus NRRL 1233 30 mg M-4-lacton.

30 VOORBEELD IV

Men bereidt volgens de werkwijze van Voorbeeld I met behulp van Syncephalastrum racsmosum IFO 4814 5 mg M-4-lacton, 8102737 V *· -14-

VOORBEELD V

Men bereidt volgens de werkwijze van Voorbeeld I met behulp van Syncephalastrum racemosum IFö 4328 6 mg M-4-laeton .

VOORBEELD VI

5 Bereiding van IsoM-A'-methylester

Men ent 20 Sakaguchi-kolven van 500 ml, die 100 ml van het mediurr|net de hieronder aangegeven samenstelling bevatten, met sporen Absidia coerulea IF0 4423. Men onderwerpt de kolven bij 26°C met 120 slagen per minuut gedurende twee dagen aan een schudcultuur. Na 10 afloop hiervan voegt men aan de kolven het natriumzout van ML-236B toe tot een concentratie van 0,05/ (gew./vol.). De kweek wordt bij 26°C en 120 slagen per minuut nog 5 dagen voortgezet.

De samenstelling van het medium is als volgt:

Glucose 2,0/ (gew./vol.) 15 K2HPö4 0,1#

MgS04.7H20 0,15/ NH4N03 0,1/

Pepton 0,1/ 11

Maisweekvloeistof 0,2/ " 20 Gistextract 0,1/ ”

ZnSC.. 7'rLO . 0,001/ 4 Y.

Leidingwater rest " (ingesteld op pH 7,0).

Na beëindiging van de kweek wordt de reactievioeistof 25 gefiltreerd en het filtraat met trifluorazijnzuur op pH 3 ingesteld. Hen extraheert het verkregen mengsel driemaal met 1 liter ethyl-acetaat onder vorming van IsoM-4* bevattende extracten. Deze verbinding bezit een Rf-waarde van 0,45 bij dunnelaagchrcmatografie 30 (plaat: Merck silicagel Art. 5715; oplosmiddel: een mengsel van benzeen-aceton-azijnzuur in de volumeverhouding 50:50:3). Men wast het extract met een verzadigde oplossing van natriurnchloride 8102737 -15- < Ir in water en voegt daarna een oplossing van diazomethaan in ether toe. Men laat het mengsel 30 minuten staan en dampt vervolgens bij verminderde druk in tot droog. Men plaatst het residu in een Lobarkolom (rferck Si 60, size A) en zuivert met behulp van een 5 oplosmiddelsysteem bestaande uit een mengsel van benzeen en ethyl-acetaat in de volumaverhouding 1:1. Men verkrijgt 200 mg van een IsoM-4'-methylesterfraktie die men zuivert in een Lobarkolom (Merck RP-8, size A) met behulp van 35/b's (vol./vol.) waterige acetonetril als eluent en verkrijgt 78 mg zuivere IsoM-4'-methylester met de 10 volgende eigenschappen: 1) Kernspinresonantiespectrum:

Het NHR-spectrum gemeten bij 100 MHz in deuterochloroform met tetramethylsilaan als de inwendige standaard is weergegeven in fig.

2 van de tekening; 15 2) Massaspectrum:

Men meet (na silylering met M,Ö-bis-(tri-methylsilyl)tri-fluoraceet-amide) met een massaspectrometer, type D-200 van Nippon Electronics. M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 233, 231.

3) Ultraviolet absorptiespsctrum (methanoloplossing)X nm: 20 229; 234,8; 244,5.

4) Infrarood absorptiespectrum (vloeistoffilm): zoals weergegeven in fig. 3 van de tekening.

5) Dunnelaagchromatografie: TCL plaat: Merck silicagel Art 5715; 25 Oplosmiddel: benzeen, aceton (volume^-rhodding 1:1)?

Rf-wcarde : 0,88.

Volgens de boven beschreven werkwijze kan men door vervanging van diazomethaan door een ander geschikt diazoalkaan andere esters van ïs©M-4* bereiden.

30 81 0 2 7 3 7 -16- i *

VCORBEELD VII

Bereiding van IsoM-4'-lacton

Volgens de werkwijze van voorbeeld VI verkrijgt men tot en met de extractie met ethylacetaat IsoM-4' bevattende extracten. Men wast de samengevoegde extracten met een verzadigde op-5 lossing van natriumchloride in water en dampt in tot droog ter verkrijging van het lacton produkt. Het verkregen residu plaatst men in een Lobarkolom (Merck Si 60 Size A) en zuivert met een cp-losmiddelsysteem bestaande uit benzeen en ethylacetaat in de volumeverhouding 1:1, waardoor men 198 mg IsoM-4'-lacton ver-10 krijgt. Men zuivert dit produkt verder met een Lobarkolom (Merck RP-8 Size A) elueert met 35/ζ (vol/vol) waterige acetonnitril en verkrijgt 82 mg zuiver IsoM-4’-lacton met de volgende eigenschappen, 1) Kernspinresonantie spectrum.

15t (-jet NMR-spectrum bij 100 MHz in deut erochloroform met tetramethylsilaan als inwendige standaard is weergegeven in figuur 4 van de tekening.

2) Ultraviolet absorptiespectrum (methanoloplossing) 20 X max nm: 229, 234,8; 234,5.

3) Infrarood absorptiespectrum (vloeistoffilm).

Zie figuur 5 van de tekening.

VOORBEELD VIII

Men bereidt 63 mg IsoM-4'-lacton volgens de werkwijze 25 van voorbeeld VII met behulp van Cunninghamella echlnulata IFO 4445.

VOORBEELD IX

Men bereidt 24 mg IsoM-4-lacton volgens de werkwijze van voorbeeld VII met behulp van Svnceohalastrum rac-emosum IF0 30 4814.

VOORBEELD X

Men bereidt 35 mg IsoM-4-lacton volgens de werkwijze van voorbeeld VII met Synceohalastrum recsmosum IF0 4828, 8102737 1 * - 17-

VOORBEELD XI

Men bereidt 12 mg IsoM-4'-lacton volgens de werkwijze van voorbeeld VII met behulp van Streptomyces roseochromoqenus NRRL 1233.

VOORBEELD XII

5 Bereiding van het IsoM-4'-natriumzout

In een kleine hoeveelheid aceton lost men 10 mg IsoM-4'-lacton op. Men voegt aan deze oplossing een equivalente hoeveelheid natriumhydroxyde toe en laat het mengsel 1 uur staan. Men stelt de pH van het verkregen mengsel met 0, IN zoutzuur in 10 op 8,0, destilleert de aceton af en plaatst het residu in een XAD-20 kolom (ong. 20 ml). Men wast de kolom met gedestilleerd water en elueert vervolgens met 50 ml 50$ (vol/vol) waterige aceton. De aceton wordt opnieuw afgedestilleerd en het residu uit bevroren toestand gedroogd, waardoor men 6 mg IsoM-4’-natrium-15 zout met de volgende eigenschappen verkrijgt.

1) Ultraviolet absorptiespectrum (methanoloplossing) "X’max nm: 229 (schouder); 235, 245 (schouder), 2) Infrarood absorptiespectrum (KBr)S) cm : 3400, 2850, 1710, 1580.

2Ög 3) Dunnelaagchromatografie: TLC plaat : Merck silicagel Art 5716;

Oplosmiddel : benzeen, aceton, azijnzuur (volumeverhouding 50:50:3·) RF waarde : 0,45.

VOORBEELD XIII

25 Bereiding van de M-4-methylester

Men ent 20 Sakaguclikolven met een inhoud van 500 ml, die eik 100 ml van het in voorbeeld I beschreven medium bevatten, met sporen van Absidia coerulea IF0 4423. Men schudt de kolven 2 dagen bij 2ó°C met 120 slagen per minuut. Vervolgens voegt men aan de kol-30 ven het natriumzout van ML-236B toe tot een concentratie van 0,05% (gewicht/vol) en kweekt nog eens 5 dagen bij 2ó°C en slagen per minuut.

81 0 2 7 3 7 -18- «. J* Να beëindiging van de kweek filtreert men de reactie-vlaeistof en stelt het filtraat met trifluorazijnzuur in op pH 3, Men extraheert het verkregen mengsel 3x met 1 liter ethylacetaat waardoor men extracten krijgt die M-3, M-4 en IsoM-4' bevatten.

5 Zowel M-4 als IsoM-4’ bezitten een RF-waarde van 0,45 bij dunne laag-chromatografie (plaat: Merck silicagel Art 5715; oplosmiddel: een mengsel van benzeen, aceton en azijnzuur in de volumeverhou-ding 50:50:3). Men wast de samengevoegde extracten met een verzadigde oplossing van natriumchloride in water en voegt vervolgens 10 diazomethaan opgelost in ether toe. Men laat het mengsel 30 min. staan en dampt vervolgens onder verminderde druk in tot droog»

Door plaatsen van het residu in een Lobarkolom (Merck SióO, size A) en zuiveren met een mengsel van benzeen en ethylacetaat in de volumeverhouding 1:1 worden fracties afgescheiden die respektie-15 velijk de IsoM-4'-methylester en de M-4-methylester bevatten.

Men verkrijgt 185,3 mg van de laatstgenoemde werkzame fractie, waaruit men met behulp van een Lobarkolom (Merck. RP-8. size A) r in water, ' en elueren met 35% (vol/vol) acetonnitril/ 20 mg zuivere M-4-methylester verkrijgt in de vorm van een kleurloze olie.

20 M-4-methylester bezit de volgende eigenschappen: 1) Kernspinresonantiespectrum:

Bij 200 MHz in deuterochloroform met tetramethylsilaan als inwendige standaard.

& ppm: 25 0,88 (3H, triplet J = 7,3 Hz); 0,89 (3H, doublet, J = 6,5 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 6,8 Hz); 1,1 - 1,7 OCH, multiplet); 2,34 (1H, sextet, J = 7 Hz); 30 2,3 - 2,5 (2H, multiplet); 2,49 (2H, doublet, J = 6,4 Hz); 2,58 (1H, multiplet); 31 0 2 7 3 7 * fc - 19- 3,72 (3H, ancf^et); 3,78 (1H, multiplet); 4,25 (1H, quintet, J =7 Hz); 4,4 (1H, multiplet); 5 5,42 (1H, multiplet); 5,5δ (1H, multiplet); 5,90 (1H, dubbel doublet, J = 9,8 en 5,6 Hz); 5,99 (1H, doublet, J = 9,8 Hz).

2) Massaspectrum: 10 Na silylering met N,Ö-bis(trimethylsilyl)trifluar- aceetamide) bepaald met een massaspectrometer type D-3C0 van Nippon Electronics.

M/e : 654 (M+), 552, 462, 372, 290, -233 , 272, 231 3) Ultraviolet absorptiespectrum (ethanoloplossing) 15 ^max nm: 230,1; 237,3; 236,4.

4) Infrarood absorptie spectrum (vloeistoffilm)i)cm 3400, 2950, 1730.

5) Dunne laag chromatografie: 20 ILC-plaat : Merck silicagel Art 5715;

Oplosmiddel : benzeen en aceton (1:1 volumeverhouding); RF-waarde : 0,88

Volgens de hierboven beschreven werkwijze kan men door vervanging van diazomethaan door een ander geschikt diazol-25 alkaan andere esters van M-4 bereiden.

VOORBEELD XIV

Bereiding van de natriumzouten van M-4 en IsoM-41

Men gaat te werk volgens de werkwijze van voorbeeld I t/m de filtratie van de reactievloeistof waarbij men in plaats 30 van I^HPO^, Na2HP0^ gebruikt. Men absorbeert het filtraat in een HP-20 kolom (Mitsubishi Chemical Industries), wast de kolom met water en elueert de fracties die M-4, natriumzout, IsoM-4’-natriurn-zout en M-3-natriumzout bevatten met 50^ (vol/vol) waterige ace- 81 0 2 7 3 7 _ 20- ton, Men droogt de werkzame fracties uit bevroren toestand en verkrijgt 830 mg droog produkt dat men zuivert door het enige malen aan zeer werkzame vloeistofchromatografie te onderwerpen, (kolom: Micro bondapaj* C^g, 40^ (vol/vol) waterige methanol 1 ml/ 5 min), onder vorming van 32 mg H-4-ratriumzout en 280 mg IsoM-41-natriumzout.

De eigenschappen van het IsoM-4*-natriumzo0t zijn gelijk aan die van het produkt van voorbeeld XII en de eigenschappen van het M-4-natriumzout zijn als volgt: 10 1) Kernspinresonantiespectrum:

Bij 200 MHz in deuteromethanol met tetramethylsilaan als inwendige standaard, 5 ppm: 0,91 (3H, triplet, J = 7,5 Hz); 15 0,92 (3H, doublet, J i 7 Hz); 1,12 (3H, doublet, J = 7 Hz); 1,1 - 1,8 (1CH, multiplet); 2,25 (1H, dubbel doublet , J = 15 en 7,6 Hz); 2,34 (1H, dubbel doublet, J = 15 en 5,5 Hz); 20 2,2 - 2,4 (3H, multiplet); 2.48 (1H, multiplet); 3,68 (1H, multiplet); 4,07 (1H, multiplet); 4,28 (1H, multiplet)p 25 5,36 (1H, multiplet); 5.48 (1H, dubbel doublet, J = 3 en 2 Hz); 5,88 (1H, dubbel doublet, J = 9,6 en 5,3 Hz); 5,98 (1H, doublet, J = 9,8 Hz).

2) ultraviolet absorptiespectrum (methanolcplossing) 30 ^ max nm: 230,0; 237,2; 245,0, -1 3) Infrarooda-bsorptiespsctrum (KSr) γ) cm : 3400, 2900, 1725, 1580.

81 02 73 7 - 21 - 4 L- 4) Dunnelaagchromaiografie: TLC-plaat : Merck siiicagel Art 5715;

Oplosmiddel : benzeen, aceton en azijnzuur (50:50;3 volume); 5 RF-waarde : 0,45.

VOORBEELD XV

Men bereidt 18 mg M-4-methylesier volgens de werkwijze van voorbeeld XIII met behulp van Cunninghamella echinulata IFO 4445.

10 VOORBEELD XVI

Men bereidt 33 mg M-4-methylester volgens de werkwijze van voorbeeld XIII met behulp van Strgdromyces ros<fc'nromoqenus NRRL 1233.

VOORBEELD XVII

15 Men bereidt 12 mg M-4methvlestsr volgens de werkwijze van voorbeeld XIII met behulp van Syncephalastrum racemosum IFO 4814.

VOORBEELD XVIII

Men bereidt 16 mg M-4-methylester volgens de werkwijze 20 van voorbeeld XIII met behulp van Syncephalastrum racemosum IFO 4828.

VOORBEELD XIX

Bereiding van de H-4-methylester

Men dient aan vijf brakhonden (mannelijk, gemiddeld 25 gewicht van 10 kg) per dag 200 mg/kg ML-236B toe en verzamelt de urine gedurende 3 dagen, Men leidt 3 liter van de verzamelde urine door een 500 ml XAD-2 kolom, elueert met 500 ml 5G% (vol/ vol) waterige aceton en stelt, na afdestilleren van de aceton onder verminderde druk, de overblijvende vloeistof met trifluar-30 azijnzuur in op pH 3, Men extraheert het mengsel vervolgens 3x met 1 liter ethylacetaat, waardoor men M-4 krijgt. Deze verbinding bezit een FR-waarde van 0,45 bij dunne-laagchromatoarafie (TLC- 81 0 2 7 3 7 - 22 _ plaat: Silicagel Art 5715 van Merck & Co,, Ine.; oplosmiddel: mengsel van benzeen, aceton en azijnzuur in volumeverhouding 50: 50;3). Men wast het extract met een verzadigde oplossing van natriumchloride in water en laat na toevoeging van een oplossing 5 van diazomethaan in ether 30 minuten staan. Vervolgens dampt men onder verminderde druk in tot droog, lost het residu op in 10 ml 55$ (vol/vol) methanol in water en leidt door een chrcmatogra-fiekolom (Merck Co, Inc.; RP-3, B). Na doorleiden van 200 ml van een 55$ (vol/vol) waterige methanoloplossing elueert mefi met 10 een 60$ (vol/vol) waterige methanoloplossing, De eerste 240 ml van het eluaat worden weggeworpen en de volgende 120 ml verza-meld,‘.Deze fractie dampt men in tot droog en lost het residu op in 2,5 ml van een 65$ (vol/vol) oplossing van methanol in water en zuivert door zeer werkzame vloeistofchromatografie (JASC0-15 Trirotar, kolom-Bondapak C^g), Het deel met de vierde piek wordt gescheiden en het oplosmiddel afgedestilleerd, waardoor men 4 mg M-4-methylester verkrijgt in de vorm van een kleurloze olie met de in.voorbeeld XIII aangegeven eigenschappen, VOORBEELD XX 20 Bereiding van N-4

In dit voorbeeld wordt voor de bereiding van M-4 uit ML-236B gehomogeniseerde konijnenlever gebruikt.

(a) Enzymoolossinq

Aan één volume-eenheid konijnenlever voegt men 25 dri'é volume-eenheden van een 1,15$ (gew./vol) kaliumchloride-10mM fosfaat-(pH 7,4)-bufferoplossing toe en homogeniseert het mengsel. Men centrifugeert het gehomogeniseerde mengsel 20 minuten bij 9,000 G en gebruikt de bovenste fractie als enzymoplos-sing.

30 (b) Cofactoroplossing

Nicotinamide-adeninedinucleotidefosfaat (NADPH) van het betatype in gereduceerde vorm 3 mg McCJ-oplossing (508 ml/10 ml) 0,1 ml * 4* 8102737 ♦ - 23 - 1,15/^ (gew/vol)KCL-oplossing 0,3 ml 0,2 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,4) 0,6 ml

Men vermengt de bovengenoemde bestanddelen tot een cofactoroplossing met een totaal volume van 1 ml, 5 (c) Reactleoplossinq

Men mengt 80 1 van de bovengenoemde enzymoplos- sing, 20 1 van de bovengenoemde cofactoroplossing en 2 van een oplossing van ML-236 B in methanol tot een concentratie van ImM ML-2368, Men schudt de verkregen oplossing 30 min, bij 37°C, 10 In het reactiemengsel vormt zich M-4 dat men door TLC identificeert (dezelfde omstandigheden als in voorbeeld XIX).

VOORBEELD XXI

Bereidinq van M-4-natriumzout --------------------------------——- in

Men lost 2 mg M-4-methylester op 1 ml van een 0,1 15 N oplossing van natriurnehloride in water en hydrolyseert 1 uur bij 30°C. Men wast het mengsel met 1 ml chloroform, stelt de gevormde waterige fase met 0,1 N zoutzuur in op pH 8 en leidt door een XAD-2 kolom (ongeveer 5 ml). Men wast de kolom met 20 ml gedestilleerd water en elueert het gewenste produkt met 15 ml 50/= 20 (vol/vol) waterige aceton. Men destilleert de aceton uit het eluaat. Bij de zeer werkzame vloeistofchromatografie blijkt het residu een enkele piek te vertonen (retentietijd 13 minuten, elutie met 1 ml 40$ (vol/vol) waterige methanol per minuut). Men droogt het residu uit bevroren toestand en verkrijgt 0,8 mg van 25 het M-4-natriumzout met dezelfde eigenschappen als het produkt van voorbeeld XIV,

VOORBEELD XXII

Bereiding van de M-4-methylester

Men ent 20 Erlenmeyer kolven van 500 ml, die T00 30 ml van een medium met die hierna beschreven samenstelling bevatten, met sporen van Mucor f, hiemalis IFO-5834, Hen schudt het inoculum bij 26°C met 220 slagen per minuut. Na 4 dagen voegt men 8102737 - 24 -

* V

ML-236B toe tot een concentratie van 0,05%> (gew/vol) en kweekt nog 6 dagen bij 26°C en 220 slagen per minuut, De samenstelling van het medium is als volgt.

Glucose 1f0^ 5 Pepton 0,2%

Vleesextract 0,

Gistextract 0,1%

Maisweekvloeistof 0,3%

Leidingwater rest 10 (pH niet incesteld).

Nadat de kweek beëindigd is, wordt het filtraat met trifluorazijnzuur op pH 3 ingesteld en het mengsel vervolgens 3x met telkens 100 ml ethylacetaat geëxtraheerd. Men verkrijgt een fractie die M-4 bevat met een RF-waarde van 0,45 bij dunne laag chromatografie (plaat: Merck Silicagel Art 5715; oplosmiddel, 15 een mengsel van benzeen, cceton en azijnzuur in de volumeverhcu-ding 50:59:3), De omzetting bedraagt 90$, Dit extract wast men met een verzadigde oplossing van natriumchloride in water, waarna men diazomethaan opgelost in ether toevoegt. Men laat het verkregen mengsel 30 minuten staan en dampt onder verminderde druk in 20 tot droog. Men brengt het residu in een Lobarkolom (Merck SiéO, A) en zuivert met een mengsel van benzeen en ethylacetaat in de volumeverhouding 1:1, Men verkrijgt ongeveer 600 mg M-4-methyl-ester met dezelfde eigenschappen als Het produkt van voorbeeld XIII.

25 VOORBEELD XXIII

Bereiding van M-4-lacton

Men herhaalt de werkwijze van voorbeeld XXII tot en met het wassen van de drie ethylacetaatextracten met een verzadigde oplossing van natriumchloride in water. Men dampt de 30 verkregen oplossing in tot droog onder vorming van een lactcn-produkt. Dit produkt herkristalliseert men uit ethylacetaat 81 0 2 7 3 7

* V

-25 - waardoor men ongeveer 560 mg (56%) M-4-lacton verkrijgt met dezelfde eigenschappen als het produkt van voorbeeld I.

VOORBEELD XXIV

Bereiding van M-4-natriumzout 5 Onder toepassing van de werkwijze van voorbeeld XXII verkrijgt men 1,9 liter van het filtraat van de omzettings-reactie dat men 3x extraheert met ielkens 1 liter ethylacetaat waardoor men M-4 bevattende fracties verkrijgt. Door onmiddellijke toevoeging aan een 5% (gew/vol) oplossing van natriumbicarbonaat 10 in water verkrijgt men een M-4-natriumzout bevattende fractie.

Deze fractie stelt men met 2N zoutzuur in op pH 7 en adsorbeert op een HP-20 kolom (van Mitsubishi Chemical Industries). Men wast met water en elueert met 50% (vol/vol) waterige aceton waardoor een fractie ontstaat die het M-4-natriumzout bevat, waaruit men 15 570 mg (52%) uit bevroren toestand gedroogd produkt verkrijgt met de in voorbeeld XIV beschreven eigenschappen.

VOORBEELD XXV:

Bereiding van M-4·

Men past dezelfde werkwijze toe als in voorbeeld 20 XXII onder gebruikmaking van de volgende rnicroorganismen waarbij de omzetting in M-4 code is aangegsven:

Microrganisme: Omzetting in H-4

Mucor hiemolis j\ hiemalis IF0-5303 -f4

Mucor hiemalis _f. hiemalis IF0-8567 +4 25 Mucor hiemalis j;, hiemalis IF0-8449 +4

Mucor hiemalis _f, hiemalis IF0-8448 +4

Mucor"hiemalis f. hiemalis IF0-8565 +4

Mucor hiemalis j\ hiemalis CBS-117,08 +4

Mucor hiemalis jr* hiemalis CBS-109.19 +4 30 Mucor hiemalis fl hiemalis C8S-200.28 +4

Mucor hiemalis j[» hiemalis CSS-242.35 +4

Mucor hiemalis JF, hiemalis CBS-110,19 *f*4 8102737 * k- - 26 -

Mucor hiemolis f, hiemalis C8S-201.65 +4

Hueor bacilliformis NRRL-2346 sporen

Hucor circinelloidss . circinelloides IFO-4554 +1

Mucor circinelloides _F. circinelloides IFO-5775 +1 5 Hucor hiemalis j\ corticolus NRRL-12473 sporen

Hucor dimorphosporus IFO-4556 sporen

Hucor fraqilis CBS-236.35 +1

Hucor qenevensis IFO-4585 +1

Hucor qlobosus NRRL-12474 sporen 10 Mucor circinelloides , qriseo-cyqnus IF0-4563 +1

Hucor heterosporus NRRL-3154 sporen

Hucor spinescens IAH-6071 sporen

Mucor chinensis IFO-4772 sporen

Rhizopus circinans ATCC-1225 4*1 15 Rhizopus arrhizus ATCC-11145 +1

Zygorynchus moellerl IF0-.-4833 4-1

Circinella muscae IF0-4457 +1

Circinellq rlglda NRRL-2341 sporen

Circinella umbellata NRRL-1713 +1 20 Circinella umbellata IFO-4452 +1

Circinellq umbellata IF0-5842 +1

Actinomucor eleqans ATCC-6476 +1

Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 sporen

Hartierella isobelllna IF0-6739 sporen 25 Gonaronella butler! IF0-80S0 +1

Pycnooorus coccineus NRRL-12476 +3

Rhizoctonia solani NRRL-12477 +2

De codes die betrekking hebben op de omzetting in M-4 hebben de volgende betekenissen: 3Q sporen = 0,5# of minder +T = 0,5-5# +2 = 5,0 - 10,0# 8102737 * *» - 27 - +3 = 10,0 - 30,0% +4 = 70,0 - 90,0%

VOORBEELD XXVI

Bereiding van IscM-^'-lacton 5 Men ent 20 Sakaguchikolven van elk 500 ml, die 100 ml medium met de in.voorbeeld XXII gegeven samenstelling be-vatten^met sporen van Circinella muscae IFO-4457, Men schudt het inoculum bij 2ó°C en 120 slagen per minuut. Na 4 dagen voegt men ML-236B toe tot een concentratie van 0,05/ (gew/vol) en kweekt 10 nog eens 6 dagen bij 2ó°C en 120 slagen per minuut.

Na afloop van de kweek filtreert men het omgezette reactiemengsel en stelt het filtraat met trifluorazijnzuur in op pH 3, Vervolgens extraheert men het mengsel 3x met 1 liter ethyl-acetaat waardoor'men een IsoM-4’ bevattende fraktie verkrijgt.

15 Dit extract wast men met een verzadigde oplossing van natrium-chloride in water en dampt vervolgens in tot droog onder vorming van een lactonprodukt. Het residu plaatst men in een Laborkolom (Merck SióO, size .;A) en zuivert met een ethylacetaqtsysteem waardoor men 12 mg IscM-4’-lacton met de in voorbeeld VII beschre-20 ven eigenschappen verkrijgt.

VOORBEELD XXVII Bereiding van M-4T-lgcton,

Men ent 20 Erlenmeyer kolven van 500 ml, die ICO ml medium met de hierna gegeven samenstelling bevatten met sporen 25 van Syncephalaètrum nlgrirms NRRL-12478» Het inoculum wordt bij 2ó°C met 220 slagen per minuut geschud, waarna men na 3 dagen ML-236B tot een concentratie van 0,05/ (vol/gew) toevoegt en bij 2ó°C en 220 slagen per minuut kweekt. De samenstelling van het medium is als volgt: (percentages zijn gew/vol): 30 Glucose 1/ (gew/vol)

Pepton 0,2 % (gew/vol) 81 0 2 7 3 7 -23- VI ses extract .. 0,1^(gew/vol)

Gistextract 0,l$(gew/völ)

Maiskweekvloeistof 0,3$(gew/vol) (pH niet ingesteld) 5 Na beëindiging van de kweek wordt het omgezette reactiemengsel gefiltreerd en het filtraat: met trifluorazijnzuur op pH van 3 ingesteld,

Vervolgens wordt het mengsel 3x met één liter ethylacetaat geëxtraheerd onder vorming van een M-4' bevattende 10 fraktie met een RF-waarde van 0,46 bij dunne laag chromatografie (plaat: Merck silicagel Art 5715; oplosmiddel; een mengsel van benzeen, aceton en azijnzuur in de volumeverhouding 50:50:3).

Dit extract wast men met een verzadigde oplossing van natrium-chloride in water, droogt boven \'/atervrij natriumsulfaat en lacto-15 niseert door toevoeging van een katalytische hoeveelheid trifluorazi jnzuur. Men v/ast het verkregen mengsel met een 5^'s (gew/vol) oplossing van natriumbicarbonaat in water, droogt met watervrij natriumsulfaat en dampt in tot droog. Het residu kristalliseert mne uit ethylacetaat en men verkrijgt 1S0 mg M-4'lacton met de 20 volgende fysische eigenschappen: 1) Kernspinresonantiespectrum:

In deuterochloroform bij 100MHz, met tetramethyU

silaan als inwendige standaard, e ó ppm: 25 6,01 (1H, doublet)ê 5,90 (1H, quartet); 5,75 (1H, multip.let); 5,50 (1H, multiplet 4,60 (1H, multiplet); 30 4,25 (ΊΗ, multiplet).

2) Ultraviolet absorptiespectrum (methanol) Xmax nrp.

230, 237, 245, 81 0 2 7 3 7 t ζ -1 - 29- 3) . Infrarooddbsorptiespectrum (K3r) ^ cm : 3500, 1720.

4) Massaspectrum: M/e: 406(H+), 304, 286, 5 5) Optische rotatie: ( otf ) D = +310.9° (c = 0,66 methanol).

6) Smeltpunt: 141 - 143°C.

7) Elementair analyse: 10 Berekend : C, 67,95%; H, 8,43%

Gevonden : C, 68,05$; H, 8,37$.

8) Dunne laagchrcmatografie: TLC-plaat : Merck silicagel Art 5715.

Oplosmiddel : Benzeen - aceton (1:1 volume) 15 RF waarde : 0,64.

VOORBEELD XXVIII

Bereiding van het M-4’natriumzout

Volgens de kweekmethode van voorbeeld XXVII verkrijgt men een omgezet reactiemengsel. Na beëindiging ven de 20 kweek filtreert men het omgezette reactiemengsel en stelt het fiiiraat met trifluorazijnzuur in op pH 3, Vervolgens extraheert men 3x met 1 liter ethylacetaat onder vorming ven een M-4' bevattende fraktie, die men met een verzadigde oplossing van natrium-chloride in water wast en cnmiddelijk daarna in een 5$'s (gew/ 25 vol) oplossing van natriumbicarbonaat in water giet, waardoor een M-4'-natriumzout bevattende fraktie verkrijgt. De aldus vSÏ> kregen waterige laag wordt met 0,1 N zoutzuur op pH 8 ingestal.J en aan een Diaion HF 20 harskolom (van Mitsubishi Chemical Indus tries) geadsorbeerd» Vervolgens elueert men met een 50$’s (vol/ 30 vol) oplossing ven aceton in water, destilleert de aceton af =>η droogt het residu uit bevroren toestand, waarbij men 1,41 g K_4, natriumzout verkrijgt met de volgende fysische eigenschappen; 81 0 2 7 3 7 - 30 - t · 1) Kernspinresoncntiespectrum:

In de-uterochloroform bij 60 MHz mei tetrcmethyl-silaan als inwendige standaard, ppm: 5 6,00 (1H, doublet); 5,95 (1H, quartet); 5,70 (1H, breed singlet); 5,50 (1H, breed singlet); 2) Ultraviolet absorDtiespectrum (methanol) \ nm; 10 230, 238, 246.

„1 3) Infrarood cbsorptiespectrurn (KBr) V cm ; 3400, 2900, 1680,

VOORBEELD XXIX

Bereiding van de M-4*methylester 15 Volgens de kv/eekmethode van voorbeeld XXVII ver krijgt men een omgezet reaktiemengsel.

Nadat de kweek beëindigd is filtreet men het omgezette mengsel en stelt hét filtraat met trifluorazijnzuur in op pH 3. Vervolgens extraheert men 3x met 1 liter ethylacetaat.

20 M‘en wast de scmengevoegde extracten met een verzadigde oplossing van natriumchloride in water en voegt vervolgens diazomethaan opgelost in ether toe. Men laat het gevormde mengsel 30 min. staan en concentreert onder verminderde druk tot droog. Men zuivert het residu in een Lobarkolom (Merck RP-8, A) met een ont-25 v/ikkeloplosmiddel bestaande uit een mengsel van benzeen en aceton in de volumeverhouding 1:1. Men verkrijgt aldus 150 mg M-4lj methylester in de vorm van een kleurloze olieachtige stof met de volgende eigenschappen: 1) Kernspinresonantiespecirum: 30 In deuterochloroform bij 60 MHz met tetramet.hvl- silaan als inwendige standaard.

<F ppm: 81 0 2 7 3 7 ► t - 31 - 6,01 (1H,doublet ); 5,90 (1H, quartet); 5,75 (1H, breed singlet); 5,50 (1H, breed singlet); 5 3,70 (3H, singlet), 2) Ultraviolet absorbtiespectrunr, (methanol) Xmax nmj 230, 238, 246.

3) Infrarood absorptiespectrum (vloeistoffilm)’>) cm ; 3400, 1730.

10 4) Massa-analyse:

Na silylering met N,ö-bis (trimethylsilyl)tri-fluoraceetamide) meet men met een massaspectrometer, type D-300 van Nippon Electronics.

M/e: 654 (M+).

8 1 0 2 7 3 7

Claims

1. Verbindingen met formule 1 volgens het formuleblad, voorin R een groep met formule 1b ot 1c von Het formuieolad voor-ste.lt, alsmede Icctonen met gesloten ring en zouten en esters daarvan .

2. Verbindingen volgens conclusie 1, m e t het !< e n m e r k, dat de verbinding beantwoordt aan formule 2 van het formuleblad, waarin een waterstofatoom of een alkyigroep met 1 - δ koolstofatomen voorstelt, alsmede de farmaceutisch aanvaardbare zouten van net zuur waarin R.j een waterstofatoom voorstelt.

3. Verbindingen volgens conclusie 2, m e t het k e fi rn e r k, dat een waterstofatoom voorstelt.

4. Verbindingen volgens conclusie 2, m e t het k s fi rn e r k, dat een alkyigroep met 1-5 koolstofatomen voorsteit.

5. Verbindingen volgens conclusie 2, m e t het k e n- 15 merk, dat R^ een methylgroep voorstelt.

6. Verbindingen volgens conclusie 2, in de vorm van alkali metaaizouten. /. Verbindingen volgens conclusie ó in de vorm van het natriumzout.

3. Verbinding volgens conclusie 1, m e t het k e n- m e r k, dat de verbinding de formule 3 van het formuleblad bezit. °* Verbindingen volgens conclusie 2, m et he t k e n- m e r k, dat de configuratie aan for,mule 4 van het formuleblad be- 8102737 It. antwoordt, waarin ^ de in conclusie 2 genoemde betekenis bezit, alsmede de farmaceutische aanvaardbare zouten daarvan.

10. Verbindingen volgens conclusie 9, m e t het k e n- m e r k, dat een waterstofatoom voorstelt.

11. Verbindingen volgens conclusie 9, m e t het k e n- m e r k,. dat een alkylgroep met 1 - δ kooistofaiomen voorstelt.

12. Verbindingen volgens conclusie 9, m e i het ken merk, dat R.j een methylcroep voorstelt.

13. Verbindingen volgens conclusie 9 in de vorm van alka-10 limetaalzouten.

14. Verbindingen volgens conclusie 13 in de vorm het natriumzout.

15. Verbinding volgens conclusie 8, m e t het ken-m e r k, dat de configuratie aan formule 5 van het formuleblad be- 15 antwoordt.

14. Verbindingen volgens conclusie 2, m e t h e t k e n- m er k, dat de configuratie aan formule 6 van het formuleblad beantwoordt, waarin R, de in conclusie 2 cenoemde betekenis bezit, alsmede de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan. 20 "!7. Verbindingen volgens conclusie 16, net het k e n m e r k, dat R, een waterstofatoom voorstelt.

18. Verbindingen volgens conclusie 16, m e t het k e n- m e r k, dat RT ®en alkylgroep met 1 - o'koolstof at omen voorstelt. 81 0 2 7 3 7 T L' -34-

12. Verbindingen volgens conclusie 1ó, met het kenmerk, dat R^ een methylgroep voorstelt.

20. Verbindingen volgens conclusie 16 in de vorm van alkalimetaalzouten.

21. Verbindingen volgens conclusie 20 in de vorm van het natriumzout. 22. ’Verbinding volgens conclusie 2, m e t he t k e n~ merk, dat de configuratie aan formule 7 van het formuleblad beantwoordt.

23. Verbindingen volgens conclusie 1, m e t h e t k e n- m e r k, dat de verbinding beantwoordt aan formule ΰ van het formu leblad, waarin een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-5 koolstofatomen voorstelt, alsmede de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin een waterstofatoom voorstelt.

24. Verbindingen volgens conclusie 23, met het k e n m e r k, dat R^ een waterstofatoom voorstelt.

25. Verbindingen volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat een alkylgroep met 1 - 5 koolstofatomen voorstelt.

26. Verbindingen volgens conclusie 23, met het k e n m e r k, dat een methylgroep voorstelt,

27. Verbindingen volgens conclusie 23 in de vorm van alkalimetaalzouten. '3 < Ü 2 7 3 7 -35- f ί

28. Verbindingen volgens conclusie 27 in de vorm van Hei natriumzout.

29. Verbinding volgens conclusie 1, rn e t het k e n-m e r k, dat de verbinding beantwoordt aan formule 9 van het for- 5 muieblad.

30. Werkwijze voor de bereiding van een verbinding met formule 1 vari het formuleblad, waarin R een groep met formule 1b of 1c voorstelt of een lacton rnet gesloten ring, zout of ester daarvan, rn e t h e t . k e n m e r k, dat men een substraat besiccn- 10 de uit .HL-23ÓB of HL-236B-carbonzuur of een zout of ester daarvan enzymatisch hydroxyleert. •31. Werkwijze volgens conclusie 30, met ;h et ken merk, dat de enzymatische hydroxylatie wordt uitcevoerd door een micro-organisme behorende tot het geslacht Mucor, Rhizopus,

15 Zygorynchus, Circinella, Actinomucor, Gongroneila, Phycomyces, Martierelia, Pycnoporus, Rhizoctonia, Absidia, Cunninchcmelia, Syncephalastrum of Streptomyces of met een celvrij, enzym bevattend extract van deze micro-organismen.

32. Werkwijze volgens conclusie 31, m e t het k e n- 20 me r k, dat het micro-organisme gekozen wordt uit de groep van: Absidia coerulsa Cunninchamella echinulata Syncephalastrum racsmosum Strsotomvcss roseochromoaenus 25 nucor hlemalis f. hiemalis Hueor bacllllformis Mucor circlnelloldes f. circinelioxdes Mucor hlemalis f. corticolus 31 0 2 7 3 7 τ i ο < — OÖ — Mucor dimorphosporus Mucor frag11is Mijcor cenevens is Mucor clofaosus

5 Mucor circinelloides f. oriseo-cyanus Mucor heterosporus Mucor seinescens Rhizopus chinensis Rhizopus circinons 10 Rhizopus arrhlzus" Zyrorynchus moelleri Clrcinella musccs Circinella riaida ....... II ................. II Cl rein cl 3. a umbsllata 15 Actinomucor elegans Phycornycss blckesleecnus Hartierella isabellina Groncronella butleri Pvcnoporus cocclneus 20 Rh3.zociron.ic solani Syneeohalastrum nigricans Absidia olauca var. paradoxe CC. Werkwijze volgens conclusie 32, met h e t k e n- m e r k, cat het micro-organisms gekozen wordt uit c-e groep van:

25 Absldla coerulea IFO-442? Cunninchamella echinulatq ÏFO-4445 C u η η 1na h cms11a echinulatq ÏFö-4444 Cunninchamella echinulatq ATCC-9244 S’-'ncepha.lastrum rccemosum IFO-481 > 30 3-f n c e e h cl a s t rum rccemos-um IFO-4828 J1 0 2 7 3 7 1 w -37- Strsotomyces roseochromocenus N23L-12-33 Streotomyces roseochromocenus IFO~33v-2 3treptomycss ro sa och romoce nu s IFO—3'i-ll Mucor hiemalis f, hlsmal is IFG-5334 5 Mucor hiemalis f. hiemalis IFC-5303 Iticor hiemalis f. hismolls ÏFO-45-57 nuc-or niernaxis r, nramal-is iFO-u-y*? Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-3443 i ,ucor niemails τ. memalis 10 Muc-tt hiemalis f. hiamalis CBS-117.OC Muoor hiemclis f. hiemalis CDS-100.19 i'iucor hiemalis f. hiemalis CB3-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-IIO.V''

15 Mucor hiemalis f. hiemalis 035-201.45 Mucor bacilli form!s MR7L-2344 Mucor circins 11 oides F. cire1ne Holies IFO-455'ί-Mucor circine 11 oi4es f. circinellolc-ss IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus N22L-12473 20 Mucor dlmorohosoorus IF0-455Ó Mucor frerilis C3S-23S.35 Mucor aenevensis ÏF0-45S5 Mucor clobosus M72L-1847- Mucor Circinelloides f. rriseo-eyenus IF0-4563 .25 Mucor heterosoorus r'72L-315-Mucor solnescens IAH-6071 Ihlzouus chlnensis IFö-4772 a? crocus circ .mans /--.TC1225 -Thizocus arrhizus ATCC-11145 3-0 Zvcorynchus rnoalleri ÏF0—4-833 Circinella musccs ÏFO-4457 8102737 V * -38- Circineljg rio-icla NRRL-2341 Circlnella umbellata NRRL-1713 Clrclnella umbellata IFC-4452 Clrcinella umbellata IFö-5842 5 Phvcomvces blakesleeanus NRRL-12475 Hartlerella isabelllna IFO-6739 Goncronella butler! XF0-80G0 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonla solani NRRL-12477 10 Syncephalastrum nicricans NRRL-12473 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 Syncephalastrum nicricans NRRL-12480 Absldla alauca var. paradoxa IF0-4431 Actinomucor elecans ATCC-6476 15 34, Werkwijze volgens conclusie 33, rn et he t k e n- m e r k, dat men uit het reactiemengsel een verbinding afscheidt bestaande uit M-4, M-4", IsaM-4, ïso-4', een zout, ester of 1acton van M-4, M-4', IscH-4 of IscM-4’, of een mengsel daarvan.

23, Werkwijze volgens conclusie 34, met het k e n- pg m e r k, dat de ester een aikylester met 1 - 5 koolstofatomen is.

36. Werkwijze volgens conclusie 34, met het k e n- m e r k, dat de ester een msthyiester is.

37, Werkwijze volgens conclusie 34, met h e t k e n- m e r k, dat het zout een alkalimetaaizout is. pg 28. Werkwijze volgens conclusie 34, met het k e n- m e r k, dat het zout een natriumzout is. 8102737 J; y -39- 39. k/erkivijze volgens conclusie 31, m e t het k e fi rn e r k, dat het micro-organisme gekozen wordt uit de groep van: Absidia coerulsa CunninrhaiTiella echinulata 5 Syncephalastrum racemosum Mucor hiemalis f. hiemalis Hue or bacilli forrnis Hucor circlnelloldes f. circlnelloides Mucor hiemalis f, corticolus 10 Mucor cl 1 morohosporus Mucor fraailis Hucor genevensis Mucor globosus Hucor circinelloides f. griseo-cyanus 15 Mucor heterosporus Mucor splnescens Pysnoporus cocclneus Rhizoctonla solani Syncephalastrum nigricans

40. Merkwijze volgens conclusie 31, m e t h e t k e n~ merk, dat het micro-organisme gekozen wordt uit ca groep van: Absidia coerulea IFQ-4423 Cunninrhcmella echinulata IF0-4445 Cunnlnahame11a echinulata IFO-4444 25 Cunninehamella echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4314 Syncephalastrum racemosum ÏF0-4G28 Mucor hiemalis f. hiemalis ÏFO-5G34 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-53Ö3 30 Mucor hiemalis f. hiemalis IF0-3567 8102737 -40- i i Mucor hiemails f» hiemalls ÏF0-8449 Mucor hiemalis f, hismalis IF0-8443 Mucor hiemalls f. hiemalls IF0-8565 Mucor hlernalis f. hiemalis CBS-117.00 5 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hismalis f. hismalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis C33-110.19 Mucor hiemalls f. hiemalis CBS 201.65 10 Mucor bccllll formls NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IF0-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. cortlcolus NRRL-12473 Mucor dimorohosporus IF0-455Ó 15 Mucor 'Fraoills CBS-236.35 Mucor cenevensls IF0-4535 Mucor gloloosus NRRL-12474 Mucor circinelloides f. criseo-cyanus IF0-4563 Mucor heterosporus MRRL-3154 20 Mucor solnescens ÏAM-6071 Fycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonla solcnl NRRL-12477 Syncephalcstrum nigricans NRRL-12473 Syncephalasirum niaricans NRRL-12479 en 25 Syncephalastrum nigricans NRRL-12400.

41. Merkwijze volgens conclusie 31, m e t her k e n- m e r k, dat het micrö-orcanisme gekozen wordt uit de creep van: Mucor hismalis f, hiemalls Mucor circinelloides f, circinelloides 30 Mucor f recalls 81 0 2 7 3 7 * 1 -41- Hucor gsnevensis Nucor circineiloldss f. grlseo-cyanus Pvcnoporus coccineus en Rhizostonia solanl. 5 42. ’.'erkwijze volgens conclusie 31, m e t h e t ken merk, dat men een verbinding bereidt met formule 6 van het formuleblad, waarin een waterstofatoom of een alkylgroep met 1 - -koolstofatomen voorstelt, de farmaceutisch aanvaardbare zouten van het zuur waarin een waterstofatoom voorstelt, of een verbinding 10 met formule 7 van het formuleblad en het micro-organisms bestaat uit Syneeohalastrum nicrlccns of Synceohalastrum racemosum. 43, berkwiize volgens conclusie 1-2, met het k © n_ merk, dat 2^ een waterstofatoom voorstelt. 44. blsrkwijzs volgens conclusie 42, mot het k e n- 15. e r k, dat R, een alky.lcroep met 1 - 5 koolstofatomen voorstslt. volgens conclusie -v2 , m e * ^ 5 * 3 n~ merk, dat ^ een methylcroep voorstelt. • < ’ W-'w’’ 4 ze volcens conclusie 42, m s t het ken-, m e r k, c!ct het zout een clkaiimetaalzout is. nq ..yr !^Tkwi""3 volgens conclusie 46, m δ t het k e n- n e r k, dat het zout een natriumzout is. :·- !u„'.„h-9 volrens conclusie 21, P 9 - n 3 * l' s n~ v e r -*ct men een verb inkin'- bereidt met forP,!-i*s - vr,n *·9- worin 5, «n we.rstoft.tocm of sen d.Utylcro=-p *,t ] - 5 8102737 -42- V » koolstofatomen voorstelt, da farmaceutisch aanvaardbare routen van het zuur waarin a, sen waterstofatoom voorstelt of een verbinding met formula ? van het formuleblad, en het genoemde micro-arcanisme bestaat uit Abslala cosrulea of €uηninrhcms11a schinulata. 5 :·?. Werkwijze volgens conclusie -1-2, m e t het k e n- m e r k, dat 2 een waters to f atoom voorstelt.

50. Werkwijze volgens conclusie 40, met het ken- rn e r k, dct k, een alkylcroep met 1-5 koolstof atomen voorstelt,

51. Vlerkvdjze volgens conclusie 40, m et ha t k e n» 10 merk, dat een meihyicroep voorstelt.

52. Werkwijze volgens conclusie 40, met h e t k e n- m e r k, dct het zout een alkcdimetaalzout is,

52. Werkwijze volgens conclusie 52, met het k s n- n e r k, dat het zout een nctriumzout is. 81 0 2 7 3 7