JP2003530437A - Ａβ４２低下物質 - Google Patents

Ａβ４２低下物質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Aβ42レベルが選択的に減少し、Aβ38レベルが増加すると同時に、Aβ40レベルが不変である条件下で、哺乳動物にAβ42低下物質を投与することにより、アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または逆転させる方法を提供する。本発明は、Aβ42低下物質を開発して同定するための方法および材料を提供する。さらに、本発明は、アルツハイマー病の発生の危険性を高めるか、もしくはその進行を加速する物質を同定する方法を提供する。本発明はまた、Aβ42低下物質と抗酸化剤、Aβ42低下物質と非選択的セクレターゼ阻害剤、ならびに、Aβ 42低下物質とアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含む組成物を提供する。本発明はさらに、Aβ42低下物質、抗酸化剤、非選択的セクレターゼ阻害剤、および／またはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と一緒に、Aβ42低下物質、抗酸化剤、非選択的セクレターゼ阻害剤、およびアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の投与計画に関する説明書を含むキットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景）１．技術分野 本発明は、アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または逆転させるAβ42低
下物質の使用に関する。本発明はまた、アルツハイマー病の進行を予防、遅延、
または逆転させるために使用できるAβ42低下物質を同定するのに関係した方法
および材料、ならびに、（１）哺乳動物においてアルツハイマー病の発生の危険
性を高める物質、または（２）その進行を加速する物質を同定するのに関係した
方法および材料に関する。
【０００２】２．背景情報 アルツハイマー病（AD）は、年齢に関連する神経変性疾患である。ADの顕著な
病理学的特徴は、脳における神経原繊維変化および老人斑の存在である。アミロ
イドβポリペプチド（Aβ）は、アミロイド斑の主成分であり、アミロイド前駆
体タンパク質（APP）の改変プロセシングから誘導される。Aβは、主として、２
つの形態、すなわちAβ40およびAβ42から構成される。Aβ40が主要形態ではあ
るが、近年の研究結果から、Aβ42が病原形態であることが示されている。Aβ40 およびAβ42以外に、APPのプロセシングにより、Aβ39、Aβ38、Aβ37およびAβ34 のようなその他のAβ形態が産生される。
【０００３】 遺伝的素因が、集団におけるADの最大の原因であり、この疾病の症例の恐らく
50％以上の原因を占める（Blackerら（1998）Arch Neurol 55：294-6）。過去10
年の間に、表皮に関する研究から、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）治療、エ
ストロゲン置換療法、ならびに、抗酸化剤治療が、ADに有用な効果をもたらす可
能性が示されている。しかし、これらの治療方法に対する実験による支持は、間
接的である。しかも、無作為の臨床試験から、これまで試験が行われたいずれか
の薬物治療がADの進行を遅らせるという納得のゆく証拠は得られていない。ADの
発生に関与する基本経路または標的に影響を与える化合物の合理的開発が極めて
重要である。
【０００４】 （発明の概要） 本発明は、ADの進行を予防、遅延、または逆転させるAβ42低下物質の使用に
関する。本発明は、ADを治療するのに有用ないくつかの（全部ではない）NSAID
が、病原Aβ42形態のレベルを選択的に低下させることができ、Aβ40のレベルに
影響を与えず、しかもAβ38のように、Aβ40より小さいAβ形態のレベルを高め
るものであるという発見に基づく。さらに具体的には、本発明は、（１）Aβ42
へのAPPプロセシングを減少させることにより、もしくはAβ42異化作用を増加さ
せることにより、Aβ42のレベルを低下させることができ；（２）Aβ38へのAPP
プロセシングを増加させることにより、Aβ38のレベルを高めることができ；か
つ（３）COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方の阻害に比して、Aβ42低
下に対して増大した選択性を有する、NSAID、NSAID誘導体、およびNSAID類似体
などのAβ42低下物質を同定することに関係した方法および材料を提供する。さ
らに、本発明は、哺乳動物において、AD発生の危険性を高める物質、またはADの
進行を加速する物質の同定に関係した方法および材料を提供する。本発明はまた
、ADの進行を予防、遅延、または逆転させるのに用いることができる組成物およ
びキットを提供する。
【０００５】 一実施形態では、本発明は、Aβ42のレベルが低下し、Aβ38のレベルが増加し
、かつ、Aβ40のレベルが不変である条件下で、哺乳動物にAβ42低下物質を投与
することにより、ADの進行を予防、遅延、または逆転させる方法を提供する。A
β42低下物質はまた、Aβ34、Aβ36、Aβ37、およびAβ39のうち１種以上のレベ
ルを高めることもできる。
【０００６】 Aβ42低下物質は、NSAID、NSAID誘導体、NSAID類似体、もしくはAβ42のレベ
ルを低下させ、Aβ38のレベルを高め、かつ、Aβ40のレベルに何ら影響を与えな
い（すなわち、Aβ40のレベルに増減がない）どのような化合物でもよい。Aβ42 低下物質は、アリールプロピオン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、もしくはアミ
ノカルボン酸誘導体でよい。さらに具体的には、フルフェナム酸、メクロフェナ
ム酸、フェノプロフェン、カルプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、
およびフルルビプロフェンのようなNSAIDの構造的誘導体であってもよい。また
、Aβ42低下物質は、5-ニトロ-2-(3-フェニルプロピルアミノ)安息香酸の構造的
誘導体であってもよい。典型的には、Aβ42低下物質は、（１）COX-1、COX-2、
もしくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害する活性を欠失しているか、あるいは、（２
）COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害する活性より、Aβ42レベ
ルを低下させる効力が高いかの、いずれかである。
【０００７】 本発明のAβ42低下物質を用いて、ヒトなどの哺乳動物におけるADを治療する
ことができる。哺乳動物は、ADと診断されていないもの、もしくはADの遺伝的素
因をもたないものでもよい。
【０００８】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質を開発する方法を提供する。こ
の方法は、フェニル環上のカルボン酸基の位置を改変するか、あるいは、カルボ
ン酸基とは反対側のフェニル環上の置換基の位置もしくは種類を改変することに
より、NSAIDメクロフェナム酸またはフルフェナム酸の誘導体を生成することを
含んでなる。誘導体はまた、２つのフェニル環をつなぐ結合を改変するか、カル
ボン酸基をプロピオン酸もしくは別の置換基に改変するか、あるいは、これらの
改変のいずれかの組合せを実施することにより、生成することができる。次に、
誘導体を試験し、それが、Aβ42レベルを低下させると同時にAβ38レベルを高め
る能力を判定する。
【０００９】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質を開発する方法を提供する。こ
の方法は、NSAIDフェノプロフェン、フルルビプロフェン、もしくはカルプロフ
ェンの誘導体を生成することを含んでなる。誘導体は、フェニル環上のプロピオ
ン酸基の位置を改変するか、あるいは、プロピオン酸基とは反対側のフェニル環
上の置換基の位置もしくは種類を改変することにより、生成することができる。
誘導体はまた、２つのフェニル環をつなぐ結合を改変するか、酢酸基をカルボン
酸または別の置換基に改変するか、あるいは、これらの改変のいずれかの組合せ
を実施することにより、生成することができる。次に、誘導体を試験し、それが
、Aβ38レベルを高めると同時にAβ42レベルを低下させる能力を判定する。
【００１０】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質を開発する方法を提供する。こ
の方法は、カルボン酸基を別の置換基に改変するか、インドール窒素を別の置換
基に改変するか、あるいは、これらの改変のいずれかの組合せを実施することに
より、インドメタシンの誘導体を生成することを含んでなる。次に、誘導体を試
験し、それが、Aβ38レベルを高めると同時にAβ42レベルを低下させる能力を判
定する。
【００１１】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質を開発する方法を提供する。こ
の方法は、メチルチオール基、プロピオン酸基、もしくはフッ化物部分を別の置
換基に改変するか、あるいは、これらの改変のいずれかの組合せを実施すること
により、硫化スリンダクsulindac sulfide)を生成することからなる。次に、誘
導体を試験し、それが、Aβ38レベルを高めると同時にAβ42レベルを低下させる
能力を判定する。
【００１２】 別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または
逆転させるのに有用なAβ42低下物質を同定する方法を提供する。この方法は、A
PPプロセシングが生じる条件下で、APPおよびAPPプロセシング活性を有する生物
学的組成物を、候補Aβ42低下物質で処理することを含んでなる。アルツハイマ
ー病の進行を予防、遅延、または逆転させるのに有用なAβ42低下物質は、存在
すると、生物学的組成物におけるAβ42のレベルを低下させるものである。
【００１３】 別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または
逆転させるのに有用なAβ42低下物質を同定する方法を提供する。この方法は、A
β42異化作用が起こる条件下で、Aβ42およびAβ42異化活性を有する生物学的組
成物を、候補Aβ42低下物質で処理することを含んでなる。アルツハイマー病の
進行を予防、遅延、または逆転させるのに有用なAβ42低下物質は、存在すると
、生物学的組成物におけるAβ42のレベルを低下させるものである。
【００１４】 別の実施形態では、本発明は、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方を
阻害する活性よりも、Aβ42レベルを低下させる効力の方が高いAβ42低下物質を
同定する方法を提供する。この方法は、生物学的組成物におけるAβ42のレベル
を低下させる能力を有するものをスクリーニングすることにより、Aβ42低下物
質を同定することを含んでなる。Aβ42を低下させるためのAβ42低下物質のIC50
は、用量応答試験を実施することにより決定することができる。in vitro でのC
OX-1およびCOX-2不活性化アッセイを用いて、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCO
X-2の両方を阻害する能力を試験する。Aβ42低下のIC50を、COX-1、COX-2、もし
くはCOX-1およびCOX-2両方の阻害のIC50と比較する。COX-1、COX-2、もしくはCO
X-1およびCOX-2の両方を阻害する活性よりも、Aβ42レベルを低下させる効力が
高いAβ42低下物質は、Aβ42低下のIC50が、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1およ
びCOX-2両方の阻害のIC50の10倍より高いものである。COX-1、COX-2、もしくはC
OX-1およびCOX-2両方の阻害活性より高いAβ42低下効力は、動物へのAβ42低下
物質の投与により、有意なCOX関連の副作用が起こらないようにCOX-1、COX-2、
もしくはCOX-1およびCOX-2の両方を阻害せず、あるいは、最小限阻害するだけの
用量で、Aβ42レベルが低下することを証明することにより、確認することがで
きる。
【００１５】 別の実施形態では、本発明は、患者においてADの発生の危険性を高める物質、
またはその進行を加速する物質を同定する方法を提供する。この方法は、APPプ
ロセシングが起こる条件下で、APPおよびAPPプロセシング活性を有する生物学的
組成物を候補物質に暴露することを含んでなる。候補物質に暴露した生物学的組
成物中のAβ42のレベルを、候補物質に暴露しなかった生物学的組成物中のAβ42 レベルと比較する。候補物質に暴露しなかった生物学的組成物中のAβ42レベル
と比較して、候補物質に暴露した生物学的組成物中のAβ42レベルの増加が認め
られた場合、その候補物質は、ADの発生の危険性を高めるか、またはその進行を
加速する恐れがある。
【００１６】 別の実施形態では、本発明は、患者においてADの発生の危険性を高めるか、ま
たはその進行を加速する物質を同定する方法を提供する。この方法は、Aβ42異
化作用が起こる条件下で、Aβ42およびβ42異化活性を有する生物学的組成物を
候補物質に暴露することを含んでなる。候補物質に暴露した生物学的組成物中の
Aβ42のレベルを、候補物質に暴露しなかった生物学的組成物中のAβ42レベルと
比較する。候補物質に暴露しなかった生物学的組成物中のAβ42レベルと比較し
て、候補物質に暴露した生物学的組成物中のAβ42レベルの増加が認められた場
合、その候補物質は、ADの発生の危険性を高めるか、またはその進行を促進する
恐れがある。
【００１７】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質と抗酸化剤からなる組成物を提
供する。抗酸化剤は、限定するものではないが、ビタミンE、ビタミンC、クルク
ミン、およびギンコバイロバ(Gingko biloba)でよい。
【００１８】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質と非選択的セクレターゼ阻害剤
からなる組成物を提供する。
【００１９】 別の実施形態では、本発明は、Aβ42低下物質とアセチルコリンエステラーゼ
阻害剤からなる組成物を提供する。
【００２０】 別の実施形態では、本発明は、（１）Aβ42低下物質と抗酸化剤；（２）Aβ42 低下物質と非選択的セクレターゼ阻害剤；または（３）Aβ42低下物質とアセチ
ルコリンエステラーゼ阻害剤を含むキットを提供する。キットは、Aβ42低下物
質、抗酸化剤、セクレターゼ阻害剤および／またはアセチルコリンエステラーゼ
阻害剤の投与計画について指示する説明書を含むことができる。
【００２１】 別の実施形態では、本発明は、AD治療用薬剤の製造におけるAβ42低下物質の
使用を提供する。患者に投与すると、Aβ42低下物質を含む薬剤は、Aβ40レベル
に影響を与えることなく、Aβ42レベルを低下させるのに有効である。この薬剤
は、Aβ38レベルを高め、しかもAβ34、Aβ36、Aβ37、もしくはAβ39レベルを
高めることもできる。薬剤中のAβ42低下物質は、アリールプロピオン酸誘導体
、アリール酢酸誘導体、もしくはアミノカルボン酸誘導体でよい。さらに具体的
には、薬剤中のAβ42低下物質は、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、フェノ
プロフェン、カルプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェンおよびフルルビ
プロフェンからなる群より選択されるNSAIDの構造的誘導体でよい。Aβ42低下物
質はまた、5-ニトロ-2-(3-フェニルプロピルアミノ)安息香酸の構造的誘導体で
よい。薬剤中のAβ42低下物質は、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1およびCOX-2の
両方を阻害する活性が欠失していてもよい。薬剤中のAβ42低下物質は、COX-1、
COX-2、もしくはCOX-1およびCOX-2両方の阻害活性よりも、in vivoでAβ42レベ
ルを低下させる効力の方が高いものでよい。このような薬剤を用いて、ヒトなど
の哺乳動物におけるADを治療することができる。この薬剤は、ADと診断されてい
ない哺乳動物、あるいは、ADの遺伝的素因をもっていない哺乳動物に用いること
ができる。
【００２２】 本明細書で用いる「Aβ42低下物質」とは、NSAID、NSAID誘導体、NSAID類似体
、もしくは、（１）Aβ42レベルを低下させる能力を有し、（２）Aβ38レベルを
高め、しかも（３）Aβ40レベルに影響を与えないあらゆる化合物を意味する。A
β42低下物質はまた、Aβ34、Aβ36、Aβ37、もしくはAβ39のうちいずれか１種
のレベルを高めることもできる。Aβ42低下物質は、アリールプロピオン酸、ア
リール酢酸、もしくはアミノカルボン酸の誘導体でよい。Aβ42低下物質は、フ
ルフェナム酸、メクロフェナム酸、フェノプロフェン、カルプロフェン、イブプ
ロフェン、ケトプロフェンおよびフルルビプロフェンのようなNSAIDの誘導体で
よい。Aβ42低下物質は、（１）COX-1、COX-2、もしくはCOX-1およびCOX-2両方
の阻害活性が欠失している；または（２）COX-1、COX-2、もしくはCOX-1およびC
OX-2両方の阻害活性に対して、in vivoでAβ42レベルを低下させる効力がはるか
に高いものでよい。
【００２３】 本明細書で用いる「増加（する）」および「減少（する）」または「低下（す
る）」とは、再現可能かつ有意な量の変化を意味する。再現可能かつ有意な量の
変化は、標準的統計分析法による測定値の再現不可能なまたは有意でない実験変
動とは区別される。このような分析法として、対象のAβ形態のレベルに影響を
与えないことがわかっている対照薬剤について観察された変化との比較を行う分
析がある。有意な変化は、0.5、１、５、10、20、40、40％以上の増加または減
少など、どんな量でもよい。
【００２４】 別途記載のない限り、本明細書で用いる技術および科学用語はすべて、本発明
が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味とする。本発
明の実施または試験には、本明細書で記載されているものと類似もしくは同等の
方法および材料を用いることができるが、好適な方法および材料については以下
に説明する。本明細書に記載するあらゆる出版物、特許出願、特許、ならびに、
その他の参考文献は、参照により本明細書にその全文を組み入れるものとする。
コンフリクトの場合には、定義を含む本明細書に基づくものとする。さらに、材
料、方法および実施例は、例示のためであって、制限を意図するものではない。
【００２５】 本発明のその他の特徴および利点は、以下に示す詳細な説明、ならびに、特許
請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２６】 （詳細な説明） 本発明は、アルツハイマー病（AD）の進行を予防、遅延、または逆転させるA
β42低下物質の使用に関する。本発明は、ADを治療するのに有用ないくつかの（
全部ではない）NSAIDが、病原Aβ42形態のレベルを低下させ、しかも、Aβ38の
ようなAβ40より小さいAβ形態のレベルを高めることができるという発見に基づ
く。従って、本発明は、（１）Aβ42へのAPPプロセシングを減少させるか、もし
くはAβ42異化作用を増加させることにより、Aβ42のレベルを低下させることが
でき；（２）Aβ38へのAPPプロセシングを増加させることにより、Aβ38のレベ
ルを高めることができ；かつ、（３）COX-1、COX-2、もしくはCOX-1およびCOX-2
の両方の阻害に比して、Aβ42低下について増大した選択性を有する、NSAID、NS
AID誘導体、およびNSAID類似体などのAβ42低下物質を同定するのに関係した方
法および材料を提供する。さらに、本発明は、Aβ42へのAPPプロセシングを増加
することにより、もしくはAβ42異化作用を減少させることにより、哺乳動物に
おいて、ADの危険性を高めるか、またはADの進行を加速する恐れがある物質の同
定に関係した方法および材料を提供する。本発明はまた、ADの進行を予防、遅延
、または逆転させるのに用いることができる組成物およびキットを提供する。
【００２７】１．Aβ 42 低下物質 Aβ42低下物質としては、限定するものではないが、NSAID、NSAID誘導体、お
よびNSAID類似体が挙げられる。NSAIDは、FDAにより承認されたNSAIDでよい。NS
AID誘導体は、公知のNSAIDの官能基を修飾することにより生成された化合物であ
る。いったん修飾されると、誘導体は、親NSAIDの抗炎症特性を有していても、
消失していてもよい。NSAIDの構造類似体は、NSAIDと構造的に類似した化合物で
ある。類似体もまた、それらに対応する構造的に類似したNSAIDの抗炎症特性を
失っていてもよい。
【００２８】 NSAIDは、非ステロイド系の抗炎症剤であり、コルチコステロイドのような抗
炎症性を有するステロイド系薬物とは異なる。NSAIDは、その多くが有機酸であ
るが、典型的には、鎮痛（痛み止め）、抗炎症、および解熱作用（熱を下げる）
特性を有する。NSAIDの例として、例えば、サリチル酸（アスピリン）、イブプ
ロフェン（モトリン、アドビル）、ナプロキセン（ナプロシン）、スリンダク（
クリノリル）、ジクロフェナク（ボルタレン）、ピロキシカム（フェルデン）、
ケトプロフェン（オルディス）、ジフルニサル（ドロビド）、ナブメトン（レラ
フェン）、エトドラク（ロジン）、オキサプロジン（ダイプロ）、メクロフェナ
ム酸（メクロフェン）およびインドメタシン（インドシン）が挙げられる。NSAI
Dは、例えば、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、フルフェナム酸、メ
クロフェナム酸）；アリール酢酸誘導体（例えば、インドメタシン、スリンダク
）；およびアリールプロピオン酸誘導体（フェノプロフェン、イブプロフェン、
カルプロフェン）のようなクラスに分類することができる。
【００２９】 NSAIDは、多数の細胞作用を有する（Cronsteinら（1995）Annu Rev Pharmacol
Toxicol 35：449-62；Aminら（1999）Cell Mol Life Sci 56：305-12）が、多
くのものは、COX酵素の直接阻害を介して作用する。COX酵素は、膜結合リン脂質
からのアラキドン酸をプロスタグラジンに酸化する（Smithら（2000）Ann Rev B
iochem 69：145-82）。COX酵素の阻害、従って、プロスタグラジン合成の阻害は
、アスピリンおよびNSAIDの鎮痛および抗炎症性の基礎になっていると考えられ
る（Duboisら（1998）FASEB J 12：1063-73）。COXには２つのイソ型、すなわち
COX-1およびCOX-2がある。COX-1およびCOX-2は同じ反応を触媒するが、これらは
２つの異なる遺伝子に由来する。COX-1は、伝統的に構成型酵素またはハウスキ
ーピング酵素とみられているのに対し、COX-2は、炎症状態で発現する誘導型酵
素と考えられている。COX産物、主としてプロスタグラジンE2は、炎症の古典的
徴候をモジュレートする。別のCOX産物は、血小板凝集および血管収縮を促進す
るトロンボキサンA2である。COXはニューロンに発現するが、中枢神経系におけ
るその機能は不明である。
【００３０】 NSAIDの別の標的は、核ホルモン受容体のペロキシソーム増殖因子アクチベー
ター受容体（PPAR）ファミリーである。PPARファミリーは、少なくとも３つのサ
ブタイプ：PPARα、PPARδ、およびPPARγからなる（Cortonら（2000）Annu Rev
Pharmacol Toxicol 40：491-518を参照）。これらの受容体は、転写のリガンド
依存性アクチベーターとして機能すると考えられている。３つのPPARメンバーは
すべて、NSAIDによりモジュレートされるが、その内容はそれぞれ異なる。例え
ば、NSAIDは、PPARαおよびPPARγの活性を活性化するが、PPARδ活性は阻害す
る（Heら（1999）Cell 99：335-45参照）。PPARγ発現は、AD個体の脳で増加す
ること（Kitamuraら（1999）Biochem Biophys Res Commun 254：582-6）、なら
びに、PPARγアゴニストは、IL-1およびTNF-αなどのミクログリア細胞の前炎症
産物のAβ刺激分泌を阻止することがわかっている（Combsら（2000）J Neurosci
20：558-67参照）。ADにおけるNSAIDの有益な作用は、COX阻害ではなくまたはC
OX阻害に加えて、むしろPPARγに及ぼすそれらの活性により媒介されるのではな
いかと考えられてきた（Combsら（2000）J Neurosci 20：558-67）。しかし、ど
の下流遺伝子がPPARにより活性化されるのか、また、それらがAβ生産に関与し
ているのかどうかについてはわかっていない。
【００３１】 Aβ42低下物質は、次の３つの特性を有するものならどんな化合物でもよい：
（１）APPプロセシングを減少させるか、またはAβ42異化作用を増加させるかの
いずれかにより、Aβ42のレベルを低下させることができ；（２）Aβ40のレベル
に一切影響せず；かつ、（３）Aβ38を増加させることができる。これら３つの
特性は、本発明のAβ42低下物質を、COX阻害活性を有するその他の化合物、ある
いは、選択的にAβ42生産を低下させる化合物から区別するものである。これら
３つの特性は、集合的に、Alzheimer’s-Aβ42-NSAID（Aβ42-NSAID）フットプ
リントと称される。Aβ42-NSAIDフットプリントを有するほかに、本発明のAβ42 低下物質は、Aβ40より小さいAβ形態、例えば、Aβ34、Aβ36、Aβ37、およびA
β39のレベルをモジュレートすることができる。
【００３２】２．ADの治療に有用なAβ 42 低下物質の同定 Aβ42-NSAIDフットプリントを用いて、NSAID、NSAID誘導体、NSAID類似体、も
しくはその他の化合物の集団からAβ42低下物質を同定することができる。この
ような化合物は、市販されているあらゆる供給源から得ることができる。例えば
、NSAID、NSAID誘導体、およびNSAID類似体は、Sigma、Biomol、Cayman Chemica
l、ICN、あるいは、Chemnavigatorウェブサイトからのウェブより入手すること
ができる。新規のNSAID、新規のNSAID誘導体、および新規のNSAID類似体は、多
数の公表されたプロトコルに記載されている方法を用いて、化学的に合成するこ
とができる。NSAID、NSAID誘導体、およびNSAID類似体は、COX-1およびCOX-2の
ような既知の標的に対する能力を改変して、合成することも可能である。例えば
、Kalgutkarら（2000）PNAS 97：925-930は、インドメタシンおよびメクロフェ
ナム酸の誘導体を作製し、また、Baylyら（1999）Biorg and Med Chem Letters
9：307-312は、フルルビプロフェンの誘導体を作製している。実際に、COX-1お
よびCOX-2を非選択的に阻害するのではなく、COX-2を優先的に阻害するようにNS
AIDを操作する努力により、公知NSAIDの新規誘導体の合成を記載した多数の報告
書が公表されている（Dewitt（1999）Molecular Pharmacology 55：625-631を参
照）。
【００３３】 作製されたいくつかのNSAID誘導体またはNSAID類似体は、（１）Aβ42レベル
を低下させる能力が高まっていると同時に、（２）COXを阻害する能力が低下し
ていることが認識されている。誘導体および類似体は、抗炎症特性を消失してい
るため、もはやNSAIDとはみなすことはできないが、Aβ42低下物質には、このよ
うなNSAID誘導体またはNSAID類似体も含まれる。
【００３４】 Aβ42-NSAIDフットプリントを有するAβ42低下物質は、無細胞アッセイ、in v
itro細胞アッセイ、およびin vivo動物試験を用いて同定することができる。Aβ42 低下物質は、in vitro細胞培養試験もしくはin vivo動物試験またはヒト試験
用のいずれかの適したビヒクル中に溶解させることができる。ビヒクルは、投与
に際して化合物を溶解させることができる不活性の溶剤である。所与のAβ42低
下物質について、in vitro細胞培養試験またはin vivo動物試験に適したビヒク
ルは、ヒトの治療に用いるビヒクルと同じではないことが認識されている。細胞
培養または動物試験に適したビヒクルの例として、水、ジメチルスルホキシド、
エタノール、および酢酸エチルが挙げられる。
【００３５】 APPプロセシングを低下させるAβ42低下物質を同定するためには、APPプロセ
シング活性（すなわち、APPを様々なAβ形態（その１つがAβ42）にプロセシン
グする活性）を有する生物学的組成物をAPPと一緒に、APPプロセシングが起こる
条件下でインキュベートする。Aβ42異化作用を高めるAβ42低下物質を同定する
ためには、Aβ42異化活性を有する生物学的組成物をAβ42と一緒に、Aβ42異化
作用が起こる条件下でインキュベートする。生物学的組成物の性質に応じて、AP
PまたはAβ42基質を該生物学的組成物に添加してもよいし、あるいは、各々もし
くは両方が該生物学的組成物の成分であってもよい。APPプロセシングまたはAβ42 異化作用は、候補Aβ42低下物質の存在または不在下で行わせることができる
。候補Aβ42低下物質の存在または不在下で、APPプロセシングから産生したAβ4 2 のレベル、または異化反応後に残ったAβ42のレベルを測定し、比較する。ADを
治療するのに有用なAβ42低下物質は、Aβ42へのAPPプロセシングを低下させる
か、あるいは、Aβ42異化作用を増強してAβ38生産を増加させるか、のいずれか
により、Aβ42のレベルを低下させるものである。
【００３６】 APPプロセシングおよび／または異化活性を有する生物学的組成物は、無細胞
の生物学的サンプルでありうる。例えば、無細胞の生物学的サンプルは、精製さ
れた、もしくは部分的に精製された酵素調製物でよい。また、APPをAβ42にプロ
セシングすることができる細胞、またはAβ42を異化することができる細胞から
調製された細胞溶解物でもよい。細胞溶解物は、例えば、音波破砕または界面活
性剤を用いた溶解など、公知の方法を用いて調製することができる。酵素調製物
または細胞溶解物の場合には、APPプロセシング活性を有する生物学的組成物にA
PPを添加し、また、Aβ42異化活性を有する生物学的組成物にAβ42を添加するこ
とができる。
【００３７】 さらに、生物学的組成物は、APPプロセシング活性と、APPをコードする核酸ベ
クターとを有する哺乳動物細胞でありうる。あるいは、上記生物学的組成物は、
Aβ異化活性と、Aβ42をコードする遺伝子の核酸ベクターまたはウイルス核酸ベ
クターとを有する哺乳動物細胞でもよい。ベクターは、典型的には、自律複製分
子、複製はしないが、哺乳動物細胞に一時的にトランスフェクトされる分子、あ
るいは、細胞のゲノムに組み込まれるベクターである。一般的に、哺乳動物細胞
は、組織培養においてベクターコード化APPまたはAβ42の異種発現に用いること
ができる細胞である。例えば、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（
CHO）細胞、繊維芽細胞、もしくはヒト神経膠腫細胞でよい。哺乳動物細胞はま
た、APPを自然に産生し、それをAβ42にプロセシングするもの、あるいは、Aβ4 2 を自然に産生し、異化するものでもよい。
【００３８】 さらに、上記生物学的組成物は、Aβ42にプロセシングされるAPPの形態を過剰
発現するように操作したトランスジェニックマウスのような動物でありうる。あ
るいは、この動物は、Aβ42を過剰発現するように操作したトランスジェニック
マウスであってもよい。動物は、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびア
レチネズミのようなげっ歯類でよい。動物はまた、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、
およびヒト以外の霊長類、例えば、サルでもよい。
【００３９】 in vitro無細胞アッセイを実施するために、APPをAβ42にプロセシングするこ
とができる活性を有する無細胞生物学的サンプルを、APPが多様なAβ形態（Aβ4 2 を含む）にプロセシングされる条件下で、基質APPと一緒にインキュベートする
（Mclendonら（2000）FASEB 14：2383-2386参照）。あるいは、Aβ42を異化する
ことができる活性を有する無細胞生物学的サンプルを、Aβ42が異化される条件
下で、基質Aβ42と一緒にインキュベートする。候補Aβ42低下物質が、APPのAβ42 へのプロセシング、またはAβ42の異化に影響を与えるかどうかを調べるため
、２つの反応を比較する。１つの反応では、候補Aβ42低下物質をプロセシング
または異化反応に加えるのに対し、第２の反応では、候補Aβ42低下物質をプロ
セシングまたは異化反応に加えない。候補Aβ42低下物質を含む反応で生成され
た各種Aβ形態のレベルを、候補Aβ42低下物質を含まない反応で生成された各種
Aβ形態のレベルと比較する。
【００４０】 各種Aβ形態は、例えば、免疫沈降、ウェスタンハイブリダイゼーション、お
よびサンドイッチ型酵素免疫測定法（ELISA）など、標準的な抗体ベースのアッ
セイを用いて検出することができる。各種Aβ形態は、質量分析により検出する
こともできる；例えば、Wangら（1996）J Biol Chem 271：31894-902を参照。A
β種のレベルは、公知の方法を用いて定量化することができる。例えば、内部標
準や、標準物質の既知量を用いたアッセイを実施することにより作成される検量
線を用いることができる。
【００４１】 細胞ベースのin vitroアッセイを用いて、候補Aβ42低下物質がAPPのAβ42へ
のプロセシングに及ぼす作用、またはAβ42の異化に及ぼす作用を有するかどう
かを判定することができる。典型的には、細胞培養物を候補Aβ42低下物質で処
理する。次に、候補Aβ42低下物質で処理した培養物中のAβ42のレベルを非処理
培養物のAβ42のレベルと比較する。例えば、APP発現およびプロセシング、なら
びに、細胞上清へのAβ42の分泌を可能にする条件下で、APPを発現する哺乳動物
細胞をインキュベートする。この培養物におけるAβ42のレベルを、候補Aβ42低
下物質で処理してから同様にインキュベートした培養物中のAβ42のレベルと比
較する。あるいは、Aβ42を発現する哺乳動物を、Aβ42の異化が起こる条件下で
インキュベートする。この培養物におけるAβ42のレベルを、候補Aβ42低下物質
で処理してから同様にインキュベートした培養物中のAβ42のレベルと比較する
。
【００４２】 また、in vivo動物試験を用いて、ADの治療に有用なAβ42低下物質を同定する
ことができる。典型的には、動物を候補Aβ42低下物質で処理し、処理動物およ
び非処理動物間で、血漿、CSF、および／または脳中のAβ42レベルを比較する。
候補Aβ42低下物質は、多様な方法で動物に投与することができる。例えば、候
補Aβ42低下物質を好適なビヒクル中に溶解させ、薬剤点滴注入器を用いて、ま
たは注射により直接投与する。候補Aβ42低下物質を飲料水または飼料の成分と
して投与してもよい。血漿、脳脊髄液（CSF）および脳中のAβのレベルは、公知
の方法を用いて測定する。例えば、Aβ42のレベルは、内部標準もしくは検量線
と組み合わせたサンドイッチELISAまたは質量分析法を用いて測定することがで
きる。血漿およびCSFは、標準方法を用いて、動物から採取することができる。
例えば、血漿は、遠心分離により血液から得られ、CSFは標準方法を用いて単離
し、また脳組織は犠牲にした動物から採取することができる。
【００４３】 Aβ42低下物質は、in vitroまたはin vivo APPプロセシングもしくはAβ42異
化反応に存在すると、APPプロセシングにより生成される、もしくはAβ異化後に
残存するAβ42のレベルを低下させる。例えば、in vitro無細胞アッセイでは、A
β42低下物質の存在下でのAPPのプロセシング減少、またはAβ42の異化作用増加
のいずれかよって、Aβ42のレベルが低下する。in vitro細胞培養試験では、上
清に分泌されるAβ42のレベル低下は、APPのAβ42へのプロセシング減少、また
はAβ42の異化作用増加のいずれかに対するAβ42低下物質の作用によるものであ
る。同様に、動物試験では、血漿、CSFもしくは脳に検出することができるAβ42 のレベル低下は、APPのAβ42へのプロセシング減少、またはAβ42の異化作用増
加のいずれかに対するAβ42低下物質の作用によるものである。
【００４４】 Aβ42のレベルは、検出可能な量を低下させることができる。例えば、Aβ42低
下物質での処理により、Aβ42低下物質で処理しなかった場合と比較して、APPプ
ロセシングにより生成される、もしくはAβ異化後に残存するAβ42のレベルが0.
5、１、３、５、７、15、20、40、50または50％以上低下する。好ましくは、Aβ42 低下物質での処理により、Aβ42低下物質で処理しなかった場合と比較して、
生成されるAβ42のレベルが少なくとも20％低下する。さらに好ましくは、Aβ42 低下物質での処理により、Aβ42低下物質で処理しなかった場合と比較して、生
成されるAβ42のレベルが少なくとも40％低下する。
【００４５】 典型的には、Aβ42低下物質によるAβ42の減少は、Aβ38のレベル増加を伴な
う。対照的に、（１）無細胞アッセイにおけるAPPプロセシングもしくはAβ42異
化作用により生成されるAβ40のレベル、（２）細胞ベースのアッセイにおける
培養物上清へのAβ40分泌のレベル、あるいは（３）Aβ42低下物質で処理した動
物の血漿、CSFもしくは脳で検出されるAβ40のレベルに変化は認められない。
【００４６】 本発明のAβ42低下物質は、COX阻害活性が欠失している、または低下したCOX-
1、COX-2、もしくはCOX-1およびCOX-2両方の活性を有するものでもよい。COX阻
害活性は、公知の方法を用いて決定することができる。例えば、COX阻害活性は
、Kalgutkarら（2000）PNAS 97：925-930に記載された方法を用いて、決定する
ことができる。
【００４７】 Aβ42低下能力を有し、かつ改変されたCOX阻害活性を有するNSAID誘導体およ
びNSAID類似体を同定する方法が記載されている。アミノカルボン酸、アリール
酢酸およびアリールプロピオン酸のNSAID誘導体およびNSAID類似体は、培養細胞
および動物におけるAβ42を減少させ、Aβ38を増加する能力について試験するこ
とができる（本明細書に記載するように）。また、これらは、Kalgutkarら（200
0）PNAS 97：925-930に記載されているようなin vitroアッセイを用いて、COX-1
およびCOX-2を不活性化する能力について同時に試験することもできる。試験す
ることができるNSAIDスリンダク、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、インド
メタシン、カルプロフェン、フェノプロフェン、およびフルルビプロフェンの誘
導体には、下記のものが含まれる： （１）（ａ）フェニル環上のカルボン酸置換基の位置が改変されている、（ｂ
）カルボン酸置換基とは反対側のフェニル環上の置換基の位置または種類が改変
されている、（ｃ）２つのフェニル環をつなぐ結合が改変されている、（ｄ）カ
ルボン酸置換基が、プロピオン酸またはその他の誘導体に改変されている、ある
いは、（ｅ）これら改変のいずれかの組合せを有する、メクロフェナム酸および
フルフェナム酸； （２）（ａ）フェニル環上のプロピオン酸置換基の位置が改変されている、（
ｂ）プロピオン酸置換基とは反対側のフェニル環上の置換基の位置または種類が
改変されている、（ｃ）２つのフェニル環をつなぐ結合が改変されている、（ｄ
）酢酸置換基が、カルボン酸またはその他の誘導体に改変されている、あるいは
、（ｅ）これら改変のいずれかの組合せを有する、フェノプロフェン、フルルビ
プロフェン、およびカルプロフェン誘導体； （３）（ａ）インドメタシン上のカルボン酸置換基が別の置換基に改変されて
いる、（ｂ）インドール窒素上の置換基が置換されている、あるいは、（ｃ）こ
れら２つの組合せを有する、インドメタシン誘導体； （４）（ａ）硫化スリンダクのメチルチオ誘導体が別の置換基に改変されてい
る、（ｂ）プロピオン酸誘導体が別の置換基に置換されている、（ｃ）フッ化物
が別の誘導体に改変されている、あるいは、（ｅ）これら改変のいずれかの組合
せを有する、硫化スリンダク。
【００４８】 さらに、Aβ42低下能力を有するNSAIDの構造類似体は、市販されている化合物
のファーマコフォア検索（Perolaら、（2000）J. Med Chem. 43：401-408）、も
しくはその他、コンピューターを用いた構造比較プログラムにより同定されるが
、これらは、Aβ42低下活性、Aβ38を増加する能力、ならびに、前述したように
COX阻害について試験することができる。
【００４９】３．Aβ 42 低下物質による治療を必要とする哺乳動物の同定 ADの臨床学的症状としては、例えば、進行性見当識障害、記憶喪失、および失
語症が挙げられ；最終的には、無能力、言語喪失、および無動が起こる。ADの病
理学的徴候としては、例えば、神経原繊維変化、老人斑、およびアミロイド血管
障害の存在が挙げられる。ADの進行を予防するとは、ADの臨床学的症状および／
または病理学的徴候の開始もしくはそれ以上の進行を予防することを意味すると
解釈される。例えば、ADの臨床学的症状または病理学的徴候を有していない個体
は、臨床学的症状または病理学的徴候の進行を予防することができる。さらに、
軽症のADを患う個体は、それより重症のAD形態を発生するのを予防することがで
きる。ADの進行を遅延させるとは、AD関連症状および／または病理学的徴候の開
始時点を遅らせること、あるいは、臨床学的症状および病理学的徴候の進行速度
により決定されるADの進行速度を遅くすることを意味すると解釈される。ADの進
行を逆転させるとは、AD症状の重症度を軽減する、すなわち、個体のAD症状を重
症から、より軽症へと変化させることを意味すると解釈される。その際、軽症へ
の変化は、臨床学的症状または病理学的徴候の減少により示される。
【００５０】 個体は、AD発症を回避する予防手段としてAβ42低下物質の摂取を選択するこ
とができる。例えば、ADに対する遺伝的素因を有する個体がAβ42低下物質を摂
取することにより、AD発症を予防もしくは遅延させることができる。遺伝的素因
は、公知の方法に基づいて判定することができる。例えば、個体にADの家族歴が
ある場合、その個体は、ADに対する遺伝的素因を有するとみなすことができる。
また、ADに対する遺伝的素因には、APP遺伝子、プレセニリン-1またはプレセニ
リン-2遺伝子、もしくはアポリポタンパクE遺伝子などの特定の遺伝子における
点突然変異が含まれる。このような突然変異は、早発家族性AD（FAD）、AD発症
の高い危険性、あるいは、低年齢でのAD発症の素因を個体にもたらす（Cotranら
（1999）Robbins Pathologic Basis of Disease、第６版、W.B. Saunders Compa
nyの1332ページ、表30-2；および米国特許第5,455,169号を参照）。さらに、AD
の臨床学的症状がある、またはADと診断された個体は、Aβ42低下物質を摂取す
ることにより、ADのそれ以上の進行を予防もしくは遅延させ、また、該疾患の病
状を逆転させることができる。
【００５１】 AD診断は、あらゆる公知の方法を用いて実施することができる。典型的には、
臨床および病理学的評価を組み合わせて、ADを診断する。例えば、ADの進行また
は重症度は、Mohsら（1996）Int Psychogeriatr 8：195-203に記載されているミ
ニ精神状態検査（Mini Mental State Examination）（MMSE）；Galaskoら（1997
）Alzheimer Dis Assoc Disord, 11 suppl 2：S33-9に記載されているアルツハ
イマー病評価スケール−認識要素（ADAS-cog）；McKhannら（1984）Neurology 3
4：939-944に記載されているアルツハイマー病共同研究−日常生活動作スケール
（ADCS-ADL）； および、Folsteinら（1975）J Psychiatr Res 12：189-198に記
載されているNINCDS-ADRDA基準を用いて、判定することができる。さらに、脳の
様々な領域について評価し、老人斑や神経原繊維変化の頻度の推定を可能にする
方法を用いることができる。これらの方法は、Braakら（1991）Acta Neuropatho
l 82：239-259；Khachaturian（1985）Arch Neuro 42：1097-1105；Mirraら（19
91）Neurology 41：479-486；ならびに、Mirraら（1993）Arch Pathol Lab Med
117：132-144に記載されている。
【００５２】４．Aβ 42 低下物質による哺乳動物の治療 Aβ42低下物質は、いずれかの標準的方法を用いて、あらゆる標準的形態で投
与することができる。例えば、Aβ42低下物質は、経口投与される錠剤またはカ
プセルの形態でよい。Aβ42低下物質はまた、経口的に、もしくは注射により投
与することができる液体の形態をしていてもよい。Aβ42低下物質はまた、座薬
の形態をしていてもよい。さらに、Aβ42低下物質は、皮膚に塗布することがで
きるクリーム、ゲルおよびフォームの形態、あるいは、吸入剤の形態でもよい。
【００５３】 Aβ42低下物質は、血漿、CSFまたは脳中のAβ42のレベルを低下させるのに十
分な任意の用量で投与することができる。これより少ない用量を数年にわたり投
与することにより、ADの進行を予防および／または遅延させることも可能である
。また、これより多い用量を投与して、ADの進行を逆転させることもできる。特
定のAβ42低下物質の効果および毒性に応じて、Aβ42低下物質を0.1〜50mg／kg
／日の用量で用いることができる。
【００５４】５．組成物およびキット 本発明はまた、ADの進行を予防、遅延、または逆転させるのに有効なAβ42低
下物質と抗酸化剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。Aβ42のレベルを低
下させる能力を有する本発明のAβ42低下物質は、あらゆる抗酸化剤と組み合わ
せることができる。抗酸化剤は、ビタミン、例えば、ビタミンE、ビタミンCまた
はクルクミンでよい。抗酸化剤はまた、ギンコバイロバ(Ginkgo biloba)でもよ
い。その他の医薬組成物は、Aβ42低下物質と非選択的セクレターゼ阻害剤また
はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含んでいてもよい。
【００５５】 医薬組成物は、あらゆる形態、例えば、錠剤、カプセル、液体、クリーム、ゲ
ル、または座薬の形態をしていてよく、好適な医薬担体を含むことができる。さ
らに、本発明は、Aβ42低下物質および抗酸化剤からなる医薬組成物、ならびに
、効果的な使用のための投与方法を指示する説明書を含むキットを提供する。
【００５６】 以下の実施例に、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、請求
項に記載した本発明の範囲を制限するものではない。
【００５７】 （実施例）実施例１−細胞培養物、薬物処理、および細胞毒性分析 10％ウシ胎児血清と100 U/mLペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technol
ogies Inc.、ドイツ）を補充した標準的細胞培養培地中で細胞培養物を維持した
。細胞培養物は、下記のものから構成された：APP751をコードする遺伝子を含む
ベクターからヒトAPP751を発現したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；A
PP751および突然変異体PS-1（M146L）をコードする遺伝子を含むベクターからヒ
トAPP751およびヒト突然変異体PS-1（M146L）の両方を発現したCHO細胞；突然変
異体APP751（V717F）をコードする遺伝子を含むベクターからヒト突然変異体APP
751（V717F）を発現したCHO細胞； APP695をコードする遺伝子を含むベクターか
らヒトAPP695を発現したヒト神経膠腫細胞HS683；APP695をコードする遺伝子を
含むベクターからヒトAPP695を発現したHEK293細胞；ならびに、 COX-1およびCO
X-2二重ノックアウトマウス由来の（自然に不死化した）胚性繊維芽細胞。
【００５８】 NSAIDである硫化スリンダク（50 mM、Biomol、PA、米国）、スリンダクスルホ
ン（50 mM、Biomol、PA、米国）、ナプロキセン（100 mM、Cayman Chemical、MI
、米国）、および、アスピリン（2.5 M、ICN Biomedicals、CA、米国）をビヒク
ルDMSO中に溶解させた。インドメタシン（50 mM、Biomol、PA、米国）と(S)-イ
ブプロフェン（250 mM、Biomol、PA、米国）をエタノール中に溶解させた。そこ
からセレコキシブおよびロフェコキシブカプセルを取得し、酢酸エチル中に溶解
させた。Aβ分泌、APPプロセシング、およびノッチ(notch)切断の分析のため、
細胞を血清含有培地中で培養し、特定のNSAIDで一晩前処理した。翌日、培地を
取り替え、培養物を同じNSAIDでさらに24時間処理した。
【００５９】 標準的MTT-アッセイ（臭化3-(4,5-ジメチル-2-チアゾール-2-イル)-2,5-ジフ
ェニル-2H-テトラゾリウム）もしくは[3H]-チミジン取込みアッセイを用いて、C
HOまたはHS683細胞におけるNSAID毒性を試験した。細胞毒性試験のために、濃度
が100μM以下の硫化スリンダク、200μM以下のインドメタシン、および１mM以下
のイブプロフェンで細胞を処理した。
【００６０】実施例２−抗体 使用した抗体には、下記が含まれる：5A3および1G7、すなわち、APPの残基380
〜665間の非重複エピトープを認識する２つのモノクローナル抗体；CT15、すな
わち、APPのC末端15アミノ酸残基を認識するポリクローナル抗体；26D6、すなわ
ち、Aβ配列のアミノ酸残基１〜12を認識するモノクローナル抗体；9E10、すな
わち、mycエピトープ配列を認識するモノクローナル抗体；抗COX-2抗体、すなわ
ち、COX-2を認識するモノクローナル抗体；ならびに、M-20、すなわち、COX-1を
認識するポリクローナル抗体。抗体5A3、1G7、CT15および26D6は、Kooら（1996
）J Cell Sci 109:991-8；Sisodiaら（1993）J Neurosci 13:3136-42；および、
Luら（2000）Nat Med 6：397-404により記載されている。モノクローナル抗体9E
10は、Calbiochem-Novobiochem（CA、米国）から購入した。モノクローナル抗CO
X-2抗体は、BD Transduction Laboratories（CA、米国）から購入した。ポリク
ローナル抗体M-20は、Santa Cruz Biotechnology（CA、米国）から購入した。
【００６１】実施例３−ELISA Murphyら（2000）J Biol Chem 275:26277-84に記載されているサンドイッチ型
酵素免疫測定法（ELISA）によりAβを検出した。NSAID処理の後、培養物上清を
回収し、遠心分離により細胞屑を除去した。完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（
Roche Molecular Biochemicals, IN、米国）を培地に添加し、目的特異的（end-
specific）AβELISAを用いて、Aβ40およびAβ42レベルを定量した。すべての測
定を２回繰り返して実施した。
【００６２】実施例４−COX-1／COX-2二重ノックアウトマウス由来の胚性繊維芽細胞のアデノ ウイルス感染 APP695をコードする遺伝子を含むアデノウイルスは、Yuanら（1999）J Neuros
ci Methods 88：45-54に記載されている。COX-1／COX-2二重ノックアウトマウス
由来の一次繊維芽細胞を、細胞１個当たり100プラーク形成単位（PFU）のウイル
スベクターに感染させた。感染は、無血清培地中で２時間にわたり実施した。培
地を取り替え、実施例１に記載したように、細胞をNSAIDで処理した。
【００６３】実施例５−APPおよびノッチプロセシングの分析 抗体CT-15を用いたウェスタンブロット分析により、ホロ−APPおよびAPP C末
端断片（CTF）の発現を検定した。5A3／IG7抗体の混合物を用いたウェスタンブ
ロッティングにより、APP分泌を検定した。150μCi[35S]メチオニンでCHO細胞を
パルス標識した後、最大４時間の低温チェイス工程を実施することにより、APP
ターンオーバーを検定した。細胞溶解物を抗体CT-15で免疫沈降し、SDS-PAGEに
付した後、蛍光体イメージング(phosphor imaging)により分析した。
【００６４】 Kooら（1996）J Cell Sci 109：991-8に記載されているように、APP表面発現
および内在化を測定した。結合培地（DMEM、0.2％BSA、20 mM HEPES[pH 7.4]中
のCHO細胞の集密層に、約３〜６μCi／μgのヨウ素化抗体IG7を添加し、37℃で3
0分インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷上で急速に冷却して
から、氷冷結合培地の添加により、反応を停止させた。非結合抗体を除去するた
め、冷却した細胞を、氷冷ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Life Technologies In
c.）で複数回洗浄した。氷冷PBS（pH 2）で5分洗浄することにより、細胞表面AP
Pに結合した抗体を脱離させた。これにより、酸不安定性APP抗体プールが形成さ
れた。細胞を0.2 M NaOH中に溶解させた。この溶解物は酸耐性APP抗体プールを
含んでいた。酸不安定性APP抗体総数および酸耐性APP抗体総数をγカウンティン
グにより計数した。酸不安定性APP抗体総数に対する酸耐性APP抗体総数の比は、
細胞表面APPプールに対する内在化物の尺度であった。
【００６５】 ２つのノッチ−コードベクター構築物をノッチプロセシングを検定するのに用
いた。これらは、myc標識NH2-末端切断型ノッチ-1ポリペプチド（ノッチΔEMV）
を発現する構築物と、ノッチ細胞内細胞質ドメイン（NICD）だけを発現する構築
物であった（Kopanら（1996）Proc Natl Acad Sci USA 93：1683-8）。myc標識N
H2-末端切断型ノッチ-1ポリペプチドを発現する構築物において、開始コドン、
すなわち、位置1726のメチオニンをバリンに突然変異させることにより、翻訳開
始を排除した。
【００６６】実施例６−質量分析法 Wangら（1996）J Biol Chem 271：31894-902に記載されている免疫沈降／質量
分析法を用いて、Aβペプチドの分泌を分析した。簡潔に述べると、１mLの量の
培養物上清を、モノクローナル抗体４G8（Senetek、CA、米国）を用いた免疫沈
降に付した。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（MALDI-TOF
）質量分析計を用いて、Aβペプチドの分子量および濃度を測定した。培養物上
清中の個々のAβ種の濃度を比較するために、合成Aβ12-28ペプチド（Sigma、MO
、米国）を内部標準としての上清サンプルに添加し、相対ピーク高さを計算した
。
【００６７】実施例７−ビシン／尿素Aβウェスタンブロット分析 Wiltfangら（1997）Electrophoresis 18：527-32に記載されているように、ビ
シン／尿素Aβウェスタンブロット分析を実施した。１mLの量の培養物上清を、
モノクローナル抗体26D6を用いた免疫沈降に付した。免疫沈降物をサンプルバッ
ファーと混合した後、95℃で５分間加熱した。溶出液サンプルをビシン／尿素ゲ
ル上で分離した後、ニトロセルロース膜に転移し、抗体26D6でプローブした。標
準Aβ1-40、Aβ1-42およびAβ1-38ペプチド（Sigma、MO、米国）を用いて、Aβ
種を同定した。
【００６８】実施例８−非選択的COX阻害剤硫化スリンダクで処理した細胞は、Aβ 42 分泌レベ ルの低下を示した 細胞培養物を、NSAID硫化スリンダクで、その濃度を増加しながら処理した。E
LISAを用いて、培養物上清中のAβ40およびAβ42のレベルを分析した。図１は、
APP751およびPS-1突然変異体M146Lを発現する硫化スリンダク処理CHO細胞培養物
のAβ42／Aβ40比を比較するグラフである。Aβ42／Aβ40比および合計Aβレベ
ル（すなわち、Aβ40およびAβ42値の合計）を、DMSO処理細胞から得られた値に
標準化した。示した結果は、全く同一に実施した２または３回の実験の平均値で
ある。40〜60μMの硫化スリンダクで処理したCHO細胞培養物は、Aβ42／Aβ40比
が50％低下しているのがわかった。合計Aβレベルに有意な低下は認められなか
った。従って、APPおよび突然変異体PS-1を発現するCHO細胞のNSAID硫化スリン
ダクによる処理により、用量依存的にAβ42分泌を選択的に低下させることによ
って、Aβ42／Aβ40比が低下した。これは、野生型APP751を発現したCHO細胞お
よび突然変異体APP V717Fを発現した細胞で確認された（データは示していない
）。潜在的な細胞タイプ特異的作用を排除するため、硫化スリンダク処理に応答
するAβ分泌を、APP695を発現したヒト神経膠腫細胞系HS683で検定した。図２は
、DMSOで処理したAPP695発現HS683細胞におけるAβ42／Aβ40比と、様々な濃度
の硫化スリンダクで処理した細胞における比を比較するグラフである。認められ
たAβ42分泌の用量依存的低下は、CHO細胞が提示したものと類似していた。硫化
スリンダクは、腎HEK293細胞、ならびに、一次マウス胚性繊維芽細胞におけるA
β42分泌も低下させた（データは示していない）。細胞毒性は100μM以下の濃度
の硫化スリンダクでは認められなかった（データは示していない）。
【００６９】実施例９−イブプロフェンおよびインドメタシンなどの他の非選択的COX阻害剤
で処理した細胞は、Aβ 42 分泌レベルの低下を示した 細胞培養物を、NSAIDイブプロフェンおよびインドメタシンで、その濃度を増
加しながら処理した。実施例３に記載したのと同様に、ELISAを用いて、培養物
上清中のAβ40およびAβ42のレベルを分析した。図３および４は、イブプロフェ
ンおよびインドメタシンの濃度を変えながら、それぞれで処理した際の、APP751
およびPS-1突然変異体M146Lを発現するCHOについて観察されたAβ42／Aβ40比を
比較するグラフである。Aβ42／Aβ40比および合計Aβレベルは、エタノール処
理細胞から得られた値に標準化した。示した結果は、全く同一に実施した２また
は３回の実験の平均値である。Aβ42分泌の選択的低下によるAβ42／Aβ40比の
用量依存性低下が、イブプロフェンおよびインドメタシンの両方で認められた。
イブプロフェン濃度が200〜300μM、またインドメタシン濃度が25〜50μMで、A
β42／Aβ40比の50％低下が達成された。イブプロフェン濃度は500μMまで（図
３参照）、またインドメタシン濃度は100μMまで（図４参照）、合計Aβレベル
は有意に影響されなかった。イブプロフェンは濃度１mMまで、またインドメタシ
ンは濃度200μMまでで処理されたCHO細胞に細胞毒性は認められなかった（デー
タは示していない）。
【００７０】実施例10−Aβ 42 分泌の低下は、COX阻害活性またはすべてのNSAIDに関連するわ
けではない Aβ42分泌に対するスリンダクスルホンの影響を検定した。スリンダクスルホ
ンは、プロドラッグスリンダクの酸化生成物である。硫化スリンダクと同様に、
スリンダクスルホンは、in vitroにおいてヒト癌細胞系の増殖を阻害し、アポト
ーシスを誘導する（Piazzaら（1995）Cancer Res 55：3110-6を参照）。硫化ス
リンダクとは対照的に、スリンダクスルホンは、COXに対する阻害作用が一切な
い。スリンダクスルホンの濃度を増加させながら細胞培養物を処理した。ELISA
を用いて、培養物上清中のAβ40およびAβ42のレベルを分析した。APP 751を発
現するCHO細胞をスリンダクスルホンで処理した場合には、濃度が400μMまでの
スリンダクスルホンでは、Aβ42／Aβ40比に変化は認められなかった（データは
示していない）。非COX阻害剤であるスリンダクスルホンではAβ42分泌を低下さ
せることができないことから、NSAIDによるAβ42分泌の選択的阻害におけるCOX
阻害の重要な機械的役割が考えられる。
【００７１】 Aβ42分泌の低下が、全NSAIDに共通の作用であるか否かを判定するために、臨
床的に有用な他のNSAIDを検定した。ナプロキセンは、スリンダクに類似した阻
害プロフィールと、イブプロフェンに類似した構造を有する非選択的COX阻害剤
である（Cryerら（1998）Am J Med 104：413-21を参照）。細胞培養物をナプロ
キセンとアスピリンの濃度を増加しながら処理した。ELISAを用いて、培養物上
清中のAβ40およびAβ42のレベルを分析した。DMSO処理培養物から得られた値に
、Aβ42／Aβ40比および合計Aβレベルを標準化した。全く同一に実施した２ま
たは３回の実験の平均値を図５にまとめて示す。APP 751を発現するCHO細胞をナ
プロキセンで処理した場合、濃度400μMまでは、Aβ42／Aβ40比に変化は認めら
れず、合計Aβレベルにも影響を与えなかった（図５参照）。同様に、細胞培養
物を濃度３mMまでのアスピリンで処理した場合にも、Aβ42分泌に低下は認めら
れなかった（データは示していない）。COX2の２つの選択的阻害剤、セレコキシ
ブとロフェコキシブも試験し、Aβ42分泌を低下するかどうかを判定した。セレ
コキシブとロフェコキシブは、溶剤抽出および再結晶化を用いて、カプセルから
調製した。NMRおよび質量分析法を用いて、NSAIDを確認した。セレコキシブの濃
度を変えながら、APP 751を発現するCHO細胞を処理した。図６は、酢酸エチルま
たは様々な濃度のセレコキシブで処理した細胞におけるAβ42／Aβ40比および合
計Aβレベルを比較する棒グラフである。これらの結果から、20μMセレコキシブ
による処理は、Aβ42／Aβ40比に２倍の増加を誘導することがわかった。Aβ42
／Aβ40比における増加は、ヒト神経膠腫細胞を試験した際にも認められた（デ
ータは示していない）。濃度が20μMのロフェコキシブで処理した細胞には、Aβ42 ／Aβ40比の増加は認められなかった（データは示していない）。ジクロフェ
ナクおよびNS-398、すなわち、COX-2に対して優先的活性を有する２つの別のNSA
IDは、Aβ42／Aβ40比または合計Aβレベルに影響を与えなかった。表１は、試
験した選択的および非選択的COX阻害剤と、それらの試験結果をまとめて示す。A
β42分泌の低下は、すべてのNSAIDに関連しているわけではなかった。（注：こ
れらの実験で使用したピークNSAID濃度は、in vitro細胞系アッセイでCOX-1およ
びCOX-2活性の完全阻害に要求されるものより高かった）。
【００７２】
【表１】
【００７３】 NSAIDが、COX阻害およびプロスタグラジン合成低下を介してAβ42分泌を低下
したのではないことを確認するため、COX-1およびCOX-2活性を欠失した細胞を硫
化スリンダクで処理した後、Aβ42／Aβ40比を検定した。Zhangら（1999）J Exp
Med 190：451-59に記載されたCOX-1／COX-2二重ノックアウトマウスに由来する
一次繊維芽細胞を、APP695をコードするアデノウイルスベクターに感染させた（
Yuanら（1999）J Neurosci Methods 88：45-54を参照）。APP695を発現するアデ
ノウイルスベクターに感染した繊維芽細胞を、硫化スリンダクの濃度を増加しな
がら処理した。ELISAを用いて、繊維芽細胞培養物上清中のAβ形態のレベルを定
量し、得られた結果を図７にまとめて示す（Aβ42／Aβ40比および合計Aβレベ
ルを、DMSO処理細胞から得られた値に標準化した。示した結果は、全く同一に実
施した２または３回の実験の平均値である）。硫化スリンダクは、CHOおよびHS6
83神経膠腫細胞で認められたものと同様に、繊維芽細胞のAβ42分泌およびAβ42 ／Aβ40比を低下させた。従って、Aβ42の選択的低下は、COX阻害により媒介さ
れているのではない。
【００７４】実施例11−αおよびβセクレターゼによるAPPプロセシング、APPターンオーバー 、およびノッチ膜内切断は、硫化スリンダクに影響されない これまでのところ、NSAIDは、Aβ42分泌を選択的に低下させることにより、A
β42／Aβ40比を変えることが報告されている唯一の化合物群である。APPプロセ
シングおよびノッチ膜内切断がNSAIDで処理された細胞において影響を受けるか
どうかを判定するために、以下の実験を実施した。
【００７５】 APP751を発現するCHO細胞培養物を、硫化スリンダクの濃度を増加しながら処
理した。細胞溶解物を調製し、４〜12％勾配ゲル電気泳動と、ポリクローナル抗
体CT15を用いたウェスタンブロッティングとにより、定常APPレベルを検定した
。ウェスタンブロット分析を実施したところ、DMSOで処理した細胞に認められた
レベルと比較して、60μMまたは80μM硫化スリンダク処理に応答するAPPレベル
の変化およびCTFレベルの増加のいずれも認められなかった。公表されているγ
セクレターゼ阻害剤とは違って、硫化スリンダクは、APP CTFの検出可能な蓄積
を誘導しなかった。従って、βセクレターゼ切断は、硫化スリンダクにより有意
に影響されなかった。
【００７６】 ウェスタンブロット分析を実施して、5A3/IG7モノクローナル抗体を用いて、
培養物上清中の可溶性APP（sAPP）を検出したところ、その結果から、硫化スリ
ンダクの濃度増加に応答する、APPエクトドメイン（すなわち、sAPP）の分泌に
有意な変化は示さないことがわかった。従って、αセクレターゼ切断は、硫化ス
リンダクにより有意に影響されなかった。
【００７７】 硫化スリンダクの存在下でのAPPターンオーバーを（１）35S-メチオニンによ
るCHO細胞のパルス標識および（２）APP半減期の測定により検定した。すべての
値は、パルス標識の終了時に得られたシグナルに標準化した。DMSOで処理した細
胞のAPP半減期を、25または125μMの硫化スリンダクで処理した細胞のAPP半減期
と比較したところ、25または125μMの硫化スリンダクによる処理後のAPP半減期
は、DMSOによる処理後のAPP半減期と類似していた。従って、APPターンオーバー
は、硫化スリンダクの存在下で有意に影響されなかった。
【００７８】 細胞表面からのAPPの内在化後に、エンドサイトーシス経路中にAβの有意な画
分が生成および放出される（Kooら（1994）J Biol Chem 269：17386-9）。エン
ドサイトーシス経路に硫化スリンダクが及ぼす影響は、Kooら（1996）J Cell Sc
i 109：991-8に記載されているAPP内在化アッセイで検定した。APP内在化は、内
在化APPに対する細胞表面APPの比として表した。DMSOで処理した培養物のAPP内
在化を、60または80μMの硫化スリンダクで処理した培養物のAPP内在化と比較し
たところ、内在化APPに対する細胞表面APPの比は、DMSO単独で処理した細胞と比
較して、硫化スリンダクで処理した細胞において変化しなかった。従って、APP
内在化は、硫化スリンダク処理の後も不変であることがわかった。
【００７９】 ノッチ膜内切断およびNICDの形成を腎HEK293細胞中で分析した。構成的に切断
されたノッチ変異体をコードするmyc標識ノッチΔEMV構築物を、HEK293細胞中に
一過性にトランスフェクトした。細胞培養物を125μMの硫化スリンダクで36時間
処理した。次に、これらを35S-メチオニンで30分間パルス標識した後、２時間チ
ェイスした。細胞溶解物を調製し、これをモノクローナル抗体9E10による免疫沈
降に付した。免疫沈降したタンパク質をSDS-PAGEおよび蛍光体イメージング分析
に付した。DMSOで処理した細胞の溶解物から免疫沈降したNICDの量を、硫化スリ
ンダクで処理した細胞溶解物から免疫沈降した量と比較したところ、その結果か
ら、硫化スリンダクによる処理は、ノッチ切断およびNICDの形成のいずれも損な
わないことがわかった（NICDドメインだけをコードする構築物でトランスフェク
トした細胞を用いて、切断断片の同定を行った）。同様に、500μMのイブプロフ
ェンまたは150μMのインドメタシンによる処理は、APP-CTFの蓄積もしくはノッ
チ切断の阻害を引き起こさなかった（データは示していない）。全体として、以
上の結果から、NSAID処理により、APPプロセシングまたはγセクレターゼ活性が
有意に摂動されないことが明らかになった。しかし、これは、NSAIDに対する作
用機構としてのγセクレターゼ活性のモジュレーションを排除するものではなか
った。Aβ42分泌の選択的低下は、前述したアッセイでは検出不可能と考えられ
るγセクレターゼ活性のわずかな変化にしか表れないからである。
【００８０】実施例12−Aβ 42 分泌の低下は、Aβ 1-38 種の用量依存的増加を伴なった 硫化スリンダクで処理した細胞が分泌したAβ種を調べるため、免疫沈降およ
び質量分析法による分析を実施した。図８は、DMSOによる処理後または100μM硫
化スリンダクによる処理後に、APP751発現CHO細胞が分泌したAβ種の２つの典型
的質量スペクトルを示す。75〜100μMの硫化スリンダクによる処理後に、Aβ42
分泌の大きな低下が認められた。しかし、Aβ40のレベルは、あまり影響を受け
なかった。Aβ1-42、Aβ1-39、Aβ1-38、およびAβ1-37などの様々なAβ種を定
量した。図９は、75または100μMの硫化スリンダクでの、Aβ1-40に対するこれ
らの各種の比、すなわち、Aβ1-x／Aβ1-40比を比較する棒グラフである。この
棒グラフを作成するのに、測定は２回行った。Aβ42／Aβ40比の低下には、Aβ1 -38 ／Aβ1-40比の２倍の増加が伴なった。Aβ1-38のレベル増加は、用量依存性
であった。その他のAβペプチドレベルは、DMSOまたは硫化スリンダクで処理し
た細胞間で一貫した変化はなかった。
【００８１】 Aβ1-38分泌の同時増加を伴なうAβ42分泌の低下を示す質量分析法による結果
を、免疫沈降により確認した。APP751および突然変異体PS-1を発現するCHO細胞
の培養物上清からAβポリペプチドを免疫沈降させた。個々のAβ種を分離するこ
とができるSDS-尿素ゲルシステム上で、免疫沈降物を分離した（Wiltfangら（19
97）Electrophoresis 18：527-32を参照）。標準的Aβ1-38、Aβ1-40およびAβ1 -42 ペプチドなどを用いて、様々なAβ種を同定した。DMSOで処理したCHO細胞に
おけるAβ38、Aβ40およびAβ42レベルの変化を、60または80μMの硫化スリンダ
クで処理した細胞における変化と比較したところ、Aβ42に対応する免疫反応性
バンドの強度に低下が認められた。この低下は、Aβ1-38に対応する免疫反応性
バンドの強度における同等の増加に匹敵するものであった。
【００８２】 ２つの潜在的機構が、この前例のない、NSAID処理後Aβ産生の変化を説明しう
る。硫化スリンダクは、γセクレターゼ活性をAβ1-38産生へとシフトすること
により、Aβ42分泌を低下すると思われる。あるいは、硫化スリンダクは、Aβ42 をAβ1-38のような短いAβ種へと変換する新しいタンパク質分解活性を刺激する
こともできる。
【００８３】 Kooら（1994）J Biol Chem 269：17386-9およびその他は、エンドサイトーシ
ス経路におけるAPPプロセシングが、培養物上清中へのAβ40およびAβ42両方の
産生および放出を引き起こすと報告している。エンドサイトーシスシグナルを欠
失したAPP突然変異体におけるAβ42の細胞内プールを調べるため、細胞質テール
中に、43アミノ酸を欠失した内在化欠損APPポリペプチドを発現するCHO細胞を用
いた（Perezら（1999）J Biol Chem 274：18851-6）。野生型APPを発現する細胞
と、突然変異体APPを発現する細胞とにおける細胞性および分泌されたAβ42およ
びAβ40のレベルを、ELISAを用いて比較した。結果から、細胞質テールがない場
合には、突然変異体APPを発現する細胞が分泌したAβ40およびAβ42のレベルは
、野生型APPを発現する細胞と比較して低かった。その上、細胞質テールがない
と、細胞性Aβ40レベルは低下したのに対し、細胞性Aβ42レベルは低下しなかっ
た。
【００８４】実施例13−Tg2576トランスジェニックマウスのNSAID処理 NSAIDを適当なビヒクル中に溶解させた。ビヒクルの例として、ジメチルスル
ホキシド（DMSO）、エタノール、および酢酸エチルが挙げられる。NSAID溶液をK
ool-Aidと混合した後、薬剤点滴器を用いて、経口投与した。３日間、同じ用量
を４時間毎に投与し、１日当たり合計50mg/kgを投与した。最後の投与から２時
間後、動物を犠牲にし、ELISAを用いてSDS可溶性Aβ40およびAβ42を分析した。
【００８５】実施例14−イブプロフェンによる動物の処理は、Aβ 42 のレベルを低下させる マウスの急性イブプロフェン処理により、Aβ42のレベルが低下するかどうか
を判定するため、「スエーデン（Swedish）」突然変異（APP695NL）を含むAPP69
5を発現する生後３ヶ月のTg2576マウスを用いた。生後３ヶ月のマウスは、脳に
高レベルの可溶性Aβを有するが、Aβ沈着はない（Hsiaoら（1996）Science 274
：99-102）。実施例13と同様に、ナプロキセン、イブプロフェン、またはメクロ
フェナム酸をマウスに投与した。イブプロフェンで処理したマウス（ｎ＝12）を
、非処理マウス（ｎ＝11）、ナプロキセン（ｎ＝７）、またはメクロフェナム酸
（ｎ＝４）でそれぞれ処理したマウスと比較した。ELISAを用いて、SDS可溶性A
β40およびAβ42の脳内レベルを測定した。表２は、対照グループ、ならびに、
ナプロキセン、イブプロフェンおよびメクロフェナム酸でそれぞれ処理したグル
ープについて測定されたAβ40およびAβ42レベルをまとめて示す。イブプロフェ
ンまたはメクロフェナム酸での３日間の処理により、脳中のAβ42レベルは約30
％低下したが、Aβ40レベルには変化は認められなかった（図10参照）。ナプロ
キセン処理マウスにはAβ42レベルに低下は認められなかった。これらのデータ
は、細胞培養物試験におけるAβ42低下の急速な開始と一致しており、細胞培養
物試験がin vivo効果を予想できることを示した。さらに、これらのデータから
、イブプロフェン処理で、脳中のAβ42／Aβ40比を低下することにより、アミロ
イド関連疾患を予防できることが示された。
【００８６】
【表２】
【００８７】実施例15−NSAID、NSAID誘導体、およびNSAID類似体 Aβ42レベルを低下する能力についてスクリーニングされるNSAIDには、下記の
ものが含まれる：Aβ42レベルを低下する効力が最も高いFDA承認のNSAID、NSAID
誘導体、およびNSAID類似体、最も効力が高いNSAIDの新しく合成された誘導体お
よび類似体、ならびに、COX経路以外の経路を標的とすることがわかっているNSA
ID。FDA承認のNSAIDとしては、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク
、アスピリン、インドメタシン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケト
ロラクが挙げられる。最も効力が高いNSAIDの誘導体として、イブプロフェンお
よびフェノプロフェンなどのアリールプロピオン酸誘導体、ならびに、メクロフ
ェナム酸系列およびフルフェナム酸などのアントラニル酸誘導体（アミノカルボ
ン酸誘導体とも呼ばれる）。（両系列のNSAIDは共に、ジフェニルケトンまたは
ジフェニルエーテルいずれかの類似したコア構造を有する）。Aβ42レベルを低
下する能力についてスクリーニングされるその他の誘導体または類似体として、
下記のものを挙げることができる：フルフェナム酸、インドメタシン、およびメ
クロフェナム酸誘導体および類似体（図11およびKalgutkarら（2000）J of Med
Chem 43：2860-70を参照）。新しく合成されたNSAID誘導体および類似体には、
新規のビフェニルアミン（図12）およびジフェニルケトンがある。COX以外の経
路を標的とするNSAIDの例としては、LOX阻害剤が挙げられる。
【００８８】 Aβ42レベルを低下させる強い能力を有するNSAID、NSAID誘導体もしくはNSAID
類似体のセットが得られたら、ファーマコホア（pharmacophore）検索を実施し
て、該セットのものと構造的に類似した他のNSAIDを同定する。多数の候補が同
定された場合には、EUDOCとして知られるコンピューターベース分子ドッキング
アルゴリズムを用いて、構造的に類似したNSAIDを二次構造スクリーニングに付
す。二次構造スクリーニングでは、結晶構造およびCOX-1／COX-2結合ポケットを
用いて、Aβ42レベルを低下させる強い能力を有するが、COX-1またはCOX-2には
結合しないものと構造的に類似したNSAIDからなるサブセットを同定する。COXに
結合すると推定されるNSAIDと、COXに結合しないと推定されるものを対照として
用いる。
【００８９】 NSAID、NSAID誘導体もしくはNSAID類似体は、市販のものを入手できるが、化
学的に合成することも可能である。in vitro COX-1およびCOX-2アッセイを用い
て、COX活性に対して未知の作用を有する新規NSAID、NSAID誘導体もしくはNSAID
類似体を試験することにより、COX活性に対する影響があるかどうかを決定する
。Oxford biochemicalsから市販されているキットをCOX阻害アッセイに用いる。
【００９０】実施例16−β42レベルの選択的低下を検出するための最適スクリーニング間隔の 決定 Aβ42レベルの選択的低下を検定するための最適処理間隔を決定するために、C
HO-APP695NL, I, his細胞培養物をビヒクルで、あるいは、イブプロフェンまた
はメクロフェナム酸で、６、12または24時間処理した。ELISAを用いて、各時点
における培養物上清中のAβ40およびAβ42レベルを測定した。図13は、細胞をメ
クロフェナム酸で処理すると、Aβ42の選択的低下が検出可能であることを示す
棒グラフである。同様の結果がイブプロフェンについても認められた（データは
示していない）。
【００９１】実施例17−一次in vitroスクリーニング 一次スクリーニングでは、APPを発現したCHO細胞系（CHO-APP695NI, I, his）
によるAβ42分泌にNSAIDが及ぼす影響を検定した。重複細胞培養物を（a）ビヒ
クル、（b）10 μMのNSAID、または（c）100μMのNSAIDで処理した。
【００９２】 Aβ40およびAβ42レベルを測定するために、24ウェルプレートの単一ウェル中
で生育させた細胞から得た６時間培養物上清を目的特異的（end-specific）Aβ4 0 およびAβ42ELISA（Suzukiら（1994）Sci 264：336-1340）で用いた。NSAIDで
処理した培養物のAβ40およびAβ42レベルを、ビヒクル単独で処理した培養物の
レベルと比較した。濃度が100μMのイブプロフェンと、10μMのメクロフェナム
酸を陽性対照として用いた。表３に示す結果から、いくつかのNSAIDは選択的にA
β42レベルを低下させるが、試験した濃度では、NSAIDの多くはそうでないこと
がわかった。ビヒクル処理細胞に対して、NSAID処理細胞で認められたAβレベル
の20％変化を基準にしてNSAIDを分類した。データは、10％の精度分散を示した
ため、20％変化に基づいて分類を実施した。分類を20％変化に基づいて実施した
ところ、スクリーニングに付したすべてのNSAIDは、２つを除いて、反復試験に
より、同じカテゴリーに分類された。２つのNSAIDは、太字で示したが、それら
の結果により、再スクリーニング時にそれらのカテゴリー分類が変更され、分類
は、３度目の試験により決定された。最初に、Aβ42を選択的に低下させること
が明らかになったNSAIDは、このスクリーニングでもAβ42を低下させたため、こ
れらの結果から、実施例８〜10に記載したデータが確認された。新しく合成され
たビフェニルアミンのうち、メクロフェナム酸、メフェナム酸、およびフルフェ
ナム酸がAβ42レベルを選択的に低下させたが、トルフェナム酸は低下させなか
った。Aβ42レベルの選択的低下、またはAβ40およびAβ42レベル両方の低下を
引き起こしたNSAIDを二次スクリーニングに付した。
【００９３】
【表３】
【００９４】実施例18−二次および三次in vitro NSAIDスクリーニング 二次スクリーニングでは、CHO細胞培養物を１nM〜１mMのNSAIDで処理した拡大
用量応答試験を実施した。用量応答試験を用いて、Aβレベルの最大低下時のIC5 0 値を評価すると同時に、有毒作用を有するNSAIDを同定した。二次スクリーニン
グは、細胞培養物でAβ42レベルを低下させるFDA承認の全NSAIDについて実施し
た。
【００９５】 三次スクリーニングでは、Aβ42レベルを選択的に低下させるFDA承認の全NSAI
Dおよび新規NSAIDについて、APPを発現したヒトH4神経膠腫細胞系におけるAβ生
産、sAPP生産、および毒性を検定した。各NSAIDの３つの用量について試験する
。第１は、Aβ42レベルの最大低下を引き起こすことが予想される用量である。
第２の用量は、最大低下の50％のAβ42レベルを低下させるもので、第３用量は
、最大値の10〜20％のAβ42レベルを低下させるものである。三次スクリーニン
グは、二次スクリーニングにより同定された最も効力の高いNSAIDについて実施
した。
【００９６】 MTSアッセイ（実施例１参照）および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセ
イ（Promega Corp、Madison、WI）を用いて、NSAID毒性を測定した。
【００９７】実施例19−in vivo活性を有する NSAIDを同定するための急性単一用量試験 細胞培養物試験でSDS可溶性Aβ42レベルを選択的に低下させるNSAIDが脳Aβ42 レベルも低下させるかどうかを決定するため、Tg2576マウスを用いたin vivo試
験を実施する。
【００９８】 急性試験には、いずれかの性のマウスを用いる。ただし、各実験グループは、
同じ性のマウスを用いて実施する。Tg2576脳Aβレベルの変動性に関する過去の
測定値に基づく能力計算値（power calculation）から、１試験グループにつき
５匹のマウスのうちの“ｎ”は、ｐ＜0.05で、20％以上の差を検出する80％の可
能性を与えることがわかった。これらの計算値は、ウォルトマンニンで処理し、
かつAβ42免疫したTg2576マウスを用いた実験により支持されるものである。こ
れらの実験では、３〜４匹のマウスのグループ間でも、Aβレベルに有意な変化
が認められた（Haugabookら（2000）Faseb J）。ほとんどの試験では、１実験グ
ループは５匹のマウスからなるが、場合によっては、死亡または疾患による損失
を補うため、追加のマウスを用いた。また、往々にして有用な結果を得るのに必
要なマウスの数が未知であるため、追加マウスの使用により、行動に関する試験
などの補助試験の検出力（power）も高める。
【００９９】 実施例13に記載したように、NSAIDを用意し、生後3ヶ月のTg2576マウスに投与
する。in vivoでは活性のないNSAIDの多数の試験を回避するために、初めに高い
用量のNSAIDを用いる。４から８時間毎にNSAIDを投与する。正確な用量および用
量計画をLD50値、半減期、およびin vitro用量応答試験から決定する。一般に、
非毒性の最大用量、典型的には、NSAIDのLD50値の1/10〜1/5までの範囲を用いる
。所定のNSAIDのLD50値およびその他の薬物速度論的データが未知の場合には、
最も近い構造類似体のデータから、これらの値を推定する。
【０１００】 毒性をモニタリングするために、試験前および後のマウスの体重を比較する。
加えて、各処理グループからの１匹を肝機能試験（LFT）に付し、そこで、２つ
の肝酵素、すなわちSGOTおよびSGPTの血液レベルを測定する。SGOTおよびSGPTは
、肝毒性の高感度マーカーである。さらに、血液尿素窒素（BUN）レベルが示す
腎機能を測定する。肝および腎機能のための試験は、これらの試験を専門とする
会社、Anilitics（Gaithersburg、MD）により実施される。高い用量で毒性作用
を有するNSAIDは、より低用量での効果および毒性の欠如が確認されない限り、
長期試験には使用しない。
【０１０１】 ３日間の投与計画後、マウスを犠牲にし、血漿、脳、およびCSF中のAβレベル
を測定し、また、血漿中のNSAIDレベルを測定して、毒性の徴候についてマウス
を調べる。複数回用量応答試験で、SDS可溶性Aβ42レベルを20〜30％以上選択的
に低下させるNSAIDを検定する。
【０１０２】実施例20−動物およびヒトのin vivo長期試験に有用な用量を確認するための複
数回用量試験 実施例19に示したものと同じ投与方式を用いて、高用量でin vivoにおいてAβ42 レベルを低下させるNSAIDを高用量、中用量、および低用量で、３匹のマウス
からなるグループに投与する。高用量は、実施例19の単一用量スクリーニングで
用いた量であり、また、中および低用量は、実施例18に記載したin vitro用量応
答試験からの推論により決定する。in vitroでイブプロフェンよりも効力の高い
NSAID（すなわち、Aβ42レベルの最大低下に必要なID50値を有するもの、その際
、ID50値は、μMの中心値より小さい）を広範な用量について検定した。例えば
、ID50値の1/50〜1/10を示す用量を複数回用量分析に用いる。イブプロフェンと
類似したin vitro ID50値を有するNSAIDを、上記より狭い範囲で試験する。例え
ば、ID50値の1/10〜1/3を示す用量を複数回用量分析に用いる。Aβの分析は、単
一用量試験について記載したのと同様に実施する。in vivoでのAβ42レベル低下
と相関する血漿NSAIDレベルを確認するため、参照文献64に記載されているHPLC
法をそれぞれの特定のNSAIDについて改変して用いて、試験した各用量について
血漿NSAIDレベルを測定した。これらの複数回用量試験における血漿NSAIDレベル
に関するデータを、長期動物試験（その際、NSAIDを飼料中に投与する）と、そ
れに続くヒト試験の両方で基準値として用いる。
【０１０３】実施例21−in vivoでのCOX活性に対するNSAIDの影響 用いたNSAIDの濃度が、抗炎症作用を媒介するのに十分であるかどうかを決定
するために、新規のNSAIDをin vivoでのCOX阻害活性および抗炎症活性について
検定した。この試験のために、Kalgutkarら（2000）J of Med Chem 43：2860-70
に記載されているカラゲナン誘導性足水腫アッセイをマウスに施した後、犠牲に
した。Aβ42レベルを低下させないNSAIDについては、長期試験で投与したものと
同等のレベルのNSAIDで処理したマウスに対しアッセイを実施する。
【０１０４】実施例22−長期予防および治療実験に用いるNSAID 動物モデルにおけるアミロイド沈着に対するNSAIDの影響が、Aβ42蓄積の直接
阻害、または脳における炎症プロセスの減少、あるいは、その両方のいずれによ
るものなのかを決定するために、下記のNSAID群を長期にわたる予防および治療
試験で検定する。すなわち、Aβ42レベルを選択的に低下させるが、抗炎症特性
はないNSAID；Aβ42レベルを選択的に低下させ、かつ抗炎症特性を有するNSAID
；もしくはAβ42レベルにまったく影響を及ぼさないが、抗炎症特性は有するNSA
IDを、予防および治療実験の両方で検定する。イブプロフェンは、Aβ42レベル
を低下させ、しかも抗炎症特性を有することから、イブプロフェンを用いて、A
β沈着に対する間接的な炎症媒介作用と、Aβ42レベルの低下によって生じる直
接作用を検定する。Aβ42レベルの低下を起こさず、それぞれ、非選択的および
選択的COX阻害剤であるセレコキシブおよびナプロキセンを用いて、Aβ42非依存
性炎症媒介作用を検定する。予防および治療実験の両方で検定するNSAIDとして
、下記の３つの特性の１つを呈示するものが挙げられる：COX阻害に対するAβ42 低下の選択性、Aβ42の低下およびCOX-2選択性、もしくはin vivoでのAβ42低下
の高い効力のみ。
【０１０５】実施例23−予防および治療実験のための長期NSAID投与 マウスの長期投与は飼料を通じて達成する。所望濃度のNSAIDを含む飼料は、
市販のものを入手することができる。長期にわたる予防または治療試験の前に、
飼料を介した選択用量のNSAIDの好適な投与を以下の実験により確認する。最初
に、点滴注入器で投与する場合、急性試験でAβ42レベルを低下するのに有効なN
SAID濃度を選択する。この濃度は、Aβ42レベルの最大低下を起こすことができ
る最小用量に相当する。Aβ42レベルを低下させないNSAIDの場合には、抗炎症作
用を起こすのに十分な濃度を選択する。イブプロフェンの場合には、Aβ42レベ
ルを低下させる用量は、抗炎症作用を引き起こす用量でもある。選択した濃度の
NSAIDを含有する飼料を短期実験に用いて、点滴注入器でNSAIDを投与したマウス
と、飼料を介してNSAIDを投与したマウスとを比較する。点滴注入器でNSAIDを投
与したマウスと、飼料を介してNSAIDを投与したマウスについて、Aβ42レベルの
低下およびNSAIDのピーク血漿レベルを測定する。両グループにおいてAβ42レベ
ルの低下およびNSAIDのピーク血漿レベルが同等であれば、選択した量のNSAID投
与を、飼料を介して実施し、長期にわたる予防および治療実験を実施する。両グ
ループのAβ42レベルの低下およびNSAIDのピーク血漿レベルが同等でない場合に
は、飼料中のNSAIDの濃度を適切に変更し、両グループのAβ42レベルの低下およ
びNSAIDのピーク血漿レベルが同等になるようにする。
【０１０６】実施例24−NSAIDのピーク血漿レベルの決定 血漿中のイブプロフェン、フェノプロフェン、およびメクロフェナム酸レベル
の測定方法は、Canaparoら（2000）Biomedical Chromatography 14：219-26；お
よびKoupら（1990）Biopharmaceutics & Drug Disposition 11：1-15に記載され
ている。一般に、内部標準を血漿サンプルに添加する。サンプルを酸性化し、有
機溶剤抽出に付す。有機相を乾燥させ、少量に溶解させた後、C18カラムを用い
たHPLCに付す。NSAIDを添加した（spiked）非処理血漿を用いて、較正および正
規化を実施することにより、較正曲線を作成する。
【０１０７】実施例25−CSF収集 マウスをペントバルビタール（30〜50mg／kg）で麻酔した。頭蓋の頂点から背
中央まで切開を施し、頭蓋底部から第１頚椎までの筋肉組織を除去することによ
り、大槽（cisterna magna）を覆う髄膜を露出させる。動物を逆さにして、解剖
顕微鏡の下の狭い台の上に配置する。半透明の髄膜を穿刺しないよう注意しなが
ら、大槽上の組織を切除する。綿棒を用いて、周辺領域を丁寧に洗浄することに
より、残留する血液もしくはその他の間質液体を除去する。この時点で、CSFを
含む膨脹した大槽を容易に見ることができる。小脳、脳幹、および脊髄の他に、
広範な血管網も確認できる。顕微針とポリプロピレン微小孔ピペットを髄膜のす
ぐ上にならべる。下にある脈管構造を一切破壊しないように注意しながら、顕微
針を槽（cistern）にゆっくりと挿入する。CSFは、血圧、呼吸、および動物の配
置による正圧下にあるため、いったん顕微針を抜くと、針の穿刺部位からCSFが
流出し始める。このとき、顕微針をゆっくりと抜き出し、微小孔ピペットを用い
て、その区画中に存在するCSFを採取する。針を完全に抜き出したら、ピペット
を穿刺部位の奥に入れて、残っているCSFをすべて取り出す。一次採取は、通常
完了までに多くとも15秒かかる。槽は、２分以内に数μLのCSFを再充填する。２
回目の採取を実施して、正味収量を増加する。この手順の終了時に、空になった
槽は、CSFの除去のために虚脱する。最初の２分間はCSFを採取しない。単離した
CSFは、氷上の前冷却したポリプロピレン管に手早く移す。目視できる血液汚染
を含むのはサンプルの５％たらずであった。
【０１０８】実施例26−長期NSAID処理の生化学的、組織化学的、行動および毒性評価 マウスを犠牲にした後、大脳半球の一方を生化学的分析のために、また他方を
免疫組織化学的および組織化学的分析のために処理する。マウス脳中のAβ40、A
β42、および総Aβレベルを決定する。SDS可溶性およびSDS不溶性ギ酸可溶性画
分の両方を検定する。Kawarabayashiら（2001）J. Neur 21：372-381に記載され
ているELISA、およびSuzukiら（1994）Sci 264：1336-1340に記載されているBAN
50システムを用いる。Aβ40およびAβ42ポリクローナル捕獲抗体と、目的特異的
ポリクローナル抗体はいずれも入手可能である。免疫沈降−質量分析を用いて、
NSAID処理による様々なAβ種のレベル変化を検定する。犠牲にした時点で、血漿
およびCSF中のAβレベルを測定する。
【０１０９】 合計斑（plaque）負荷を検定するため、脳切片を抗Aβ抗体で染色する。すべ
てのAβ種に対する抗体ならびに目的特異的Aβ40およびAβ42抗体を用いる。チ
オフラビンで染色することにより、芯のある斑を検出する。Sigma ScanPro画像
分析ソフトウエア（Haugabookら（2000）Faseb Jを参照）に記載されているよう
に、斑数およびアミロイド負荷を算出する。斑の種類、ならびに、血管および実
質アミロイド沈着の範囲を検定する。
【０１１０】 生化学的および組織化学的技法により、炎症を検定する。免疫組織化学的染色
およびGFAP用のSDS-抽出物のウェスタンブロッティングを利用して、星状細胞腫
を検定した。Limら（2000）J Neurosci 20：5709-14に記載されているように、
抗ホスホチロシンの染色方法を用いて、小グリア細胞腫活性化を検定する。これ
に代わり、パン（pan）MHC抗体を用いて、あるいは、Frautschyら（1998）Am J
of Path 152：307-17に記載されているように、SMI-312 GSレクチンを用いて、
免疫染色する。SDS-抽出物のウェスタンブロット解析を用いて、α1ACTおよびAP
OEのような炎症マーカーを検定すると同時に、市販のELISAキットを用いて、IL-
1およびIL-6を検定する。
【０１１１】 ニューロン喪失およびtau症状を検定するため、脳の切片をヘマトキシロンお
よびエオシンを用いて染色する。明白な病的徴候およびニューロン喪失について
切片を検定する。立体解析用計数を用いて、顕著なニューロン喪失を定量する。
複数の抗リン酸化tau抗体による免疫組織化学的染色を用いて、Tau症状を評価す
る。
【０１１２】 行動試験のために、モーリスウォーターメーズ（Morris watermaze）の変法を
用いて、APPを過剰発現するマウスにおけるアミロイドーシスに関連する学習お
よび記憶障害を検出する（Chenら（2000）Nature 408：975-979）。試験は、完
全に平衡化され、年齢適合させたマウスグループ（１グループ当たり５〜６匹）
において実施し；光周期中に、試験遮断（traial block）を毎日同じ時点で実施
する。被験体は、毎日約15分の間隔を置いて、決まった順序で試験した。このよ
うな試験間隔により、高齢の動物にしばしば見られる低体温および疲労の影響を
最小限にする（Rickら（1996）J Gerontol A Biol Sci Med Sci 51：B253-60を
参照）。第１日の試験は、目視可能なプラットフォームへの泳動からなる。これ
により、動機付け、視力および泳動能力を評価する。一試験は、１列に並べた４
つの個別プラットフォーム位置の各々に対する固定出発位置から実施する。翌日
には、20以下の逃避潜在性（escape latency）を有する３回の連続試験の学習基
準（Chenら（2000）Nature 408：975-979）を用いて、毎日1０回以下の試験を実
施する。測定した依存性変数だけが、基準に到達するための試験（TTC）である
ため、精査試験は必要ない。動物が１プラットフォーム位置で基準に到達したら
、該動物を直ちに新しい位置に移す。５つのプラットフォーム位置が学習される
まで試験を継続する。この体系では、主として最後の２つのプラットフォーム位
置で、TTCにおける欠損が明らかとなる。これらのデータを神経病データと共に
用いることにより、マウスを評価する（Chenら（2000）Nature 408：975-979）
。
【０１１３】 試験第1日に、神経学的および感覚運動技能の評価を実施した後、1列に並べた
プラットフォーム試験を実施する。標準的な一連の試験を執行する。これは、（
a）自動化開放フィールドでの10分、（b）立直りおよび握り反射の試験、（c）
前足でワイヤから吊るされたとき、落下する潜在性、ならびに、（d）ロトロッ
ド（rotorod）性能から構成される。これらの試験により、ウォーターメーズ性
能に影響を与え得る、強さ、平衡、および運動／診査行動などの基本的機能をス
クリーニングする（Rickら（1996）J Gerontol A Biol Sci Med Sci 51：B253-6
0；Murphyら（1995）Neur Learn Mem 64：181-6；Bickfordら（1997）Neur Agin
g 18, 309-18；Cammisuliら（1997）Behav Brain Res 89：179-90；およびLewis
ら（2000）Nat Genet 25：402-5）。このようにして、強さ、平衡、および運動
／診査行動が、ウォーターメーズ性能に及ぼす影響であることを示す。
【０１１４】 急性試験と同様に、適した血漿マーカーをいくつかのNSAID処理マウスについ
て断続的に試験することにより、予防および治療実験の両方で肝および腎機能を
モニタリングする。マウスの体重を２週間毎にモニタリングし、２ヶ月〜３ヶ月
毎に全血球計算を実施する。死亡させた時点で、Kalgutkarら（2000）J of Med
Chem 43：2860-70に記載のように、解剖顕微鏡を用いて、潰瘍化の徴候について
消化管を調べる。
【０１１５】実施例27−Aβ沈着に対するNSAIDの影響の確認−長期予防実験 急性試験でAβ42レベルを選択的に低下させたNSAIDを予防実験において検定す
ることにより、これらのNSAIDがAβ沈着を予防することができるかどうかを確認
する。Aβ沈着がまだ起こっていなかったため、生後６ヶ月のTg2576マウスを予
防試験に用いる。この月齢のマウスのNSAID処理は、臨床学的疾患の徴候発生前
のヒトの治療に対応する。
【０１１６】 実験用に最適化した用量のNSAIDで、Tg2576マウスを３、６、および12ヶ月に
わたり処理する。各処理グループは、最少20匹から構成され、そのうちの５匹ず
つを上記３つの時点で各々検定する。残りの５匹は、長期にわたる投与中の疾患
または死亡の場合に備える。毎月３〜４匹のマウスを処理グループに加えること
により、20匹からなるグループを設定する。マウスを犠牲にした時点で、実験グ
ループの全マウスを犠牲にするまで、分析用に採取した組織を保存しておく。従
って、１実験グループからのマウスの全サンプルを同時に検定する。イブプロフ
ェン、ナプロキセン、および対照グループについては、実験グループ毎に27匹の
マウスを用いる。余剰のマウスを12ヶ月処理した後、行動パターンおよびその他
の病理学的パラメーターを調べる。
【０１１７】 予防実験には下記のNSAIDを使用する：Aβ42レベルを低下させ、抗炎症活性を
有し、かつ半減期が短いイブプロフェン；in vitroでAβ42レベルを低下させる
効力が強く、かつ抗炎症活性を有するメクロフェナム酸；Aβ42レベルを低下さ
せ、抗炎症活性を有し、かつ半減期が長いスリンダク；Aβ42レベルに一切影響
を与えないが、抗炎症活性と、COX-1およびCOX-2阻害活性とを有するナプロキセ
ン；抗炎症性COX-2選択性薬物であるセレコキシブ。さらに、Aβ42レベルを低下
させるが、COX-1またはCOX-2、あるいは、その両方に対する阻害作用を超える作
用の選択性を示す、その他のNSAIDもこの試験に含める。NSAIDでの処理の３、６
および12ヶ月後に、マウスの行動変化を分析し、次に、犠牲にしてから、実施例
26に記載したのと同様に、生化学的分析を実施する。
【０１１８】実施例28−NSAIDによるAβ沈着変化−長期治療試験 いったんAβが高レベルまで蓄積してから、Aβ沈着、Aβ沈着の影響、あるい
は、その両方を変更することができるかどうかを確認するため、急性試験でAβ4 2 レベルを選択的に低下させたNSAIDを治療試験で検定する。Aβ42レベルを低下
させるNSAIDによる処理の効果を、Aβ42レベルを低下させないNSAID、例えば非
選択的COX阻害剤であるナプロキセンと、選択的COX阻害剤であるセレコキシブ、
による処理の効果と比較する。実験用に最適化した用量のNSAIDで生後16ヶ月のT
g2576マウスを３または６ヶ月間処理する。生後16ヶ月のマウスは、脳中に大量
のAβを有しているため、ADの臨床的徴候を示すヒト患者に相当する。アミロイ
ド沈着、行動、AD様症状は、実施例26に記載したように検定する。処理グループ
毎に14匹のマウスを使用し、処理した少なくとも５匹のマウスと、５匹の対照マ
ウスとを比較する。
【０１１９】実施例29−統計分析 マン−ホイットニーおよびダネット試験を用いて、処理および非処理マウスグ
ループ間の比較を行う。多数の相関的比較を実施する。各実験について統計分析
で用いた変数および結果は次の通りである。in vitroスクリーニング実験につい
ては、変数として、倍地中のAβレベル、NSAID濃度、毒性、およびCOX阻害活性
が含まれ；また、一次結果として、Aβ42レベルの低下およびCOX阻害活性が含ま
れる。急性単一用量試験では、変数として、脳、血漿およびCSF中のAβレベル；
血漿および脳中のNSAID濃度；ならびに、NSAIDの用量が含まれる。急性単一用量
試験の一次結果として、脳Aβ42レベルおよび血漿NSAIDレベルの低下が、また、
二次結果として脳、CSFおよび血漿Aβレベルの相関が含まれる。長期試験では、
変数として、脳、血漿およびCSFにおけるAβレベル；血漿（さらに、可能であれ
ば、脳）中のNSAID濃度；NSAIDの用量；アミロイド負荷；炎症応答の範囲；行動
性能；および毒性が含まれる。長期試験の一次結果として、脳中のAβ42レベル
に対する作用が、また、二次結果としては、炎症応答、行動、毒性の評価、およ
び相関的分析が含まれる。
【０１２０】実施例30−NSAIDのアミロイド減少作用における臨床学的研究 前臨床試験で決定された最も有望なFDA承認NSAIDを、アミロイド減少作用につ
いて、健康な被験者と、軽度から中程度のアルツハイマー病（AD）である被験者
において検定する。これらの試験は、３グループ並行設計で実施し、各グループ
は12人の被験者から構成される。14日間、被験者をNSAIDまたは対応する偽薬（
プラセボ）で、NSAIDに応じて毎日数回処理する。試験NSAIDは、サンジエゴVAMC
薬局サービスまたは別の調剤薬局により購買およびカプセル封入したものである
。偽薬も同様にカプセル封入する。
【０１２１】 AD被験者は、次の基準に基づいて選択する。被験者は、国立神経伝達障害研究
所（National Institute of Neurologic Communicative Disorders）ならびに発
作−アルツハイマー病および関連障害協会（Stroke-Alzheimer’s Disease and
Related Disorders Association）（NINCDS-ADRDA）試験（McKhannら（1984）Ne
urology 34：939-944）によりADであろうと診断された、または小型精神状態検
査（Mini-Mental State Examination）（MMSE、Mohsら（1996）Int Psychogeria
tr 8：195-203）により決定された軽度から中程度の痴呆を有する、年齢60〜85
歳の男女から構成される。15〜25点までの範囲のMMSE点数が、軽度から中程度の
痴呆を示す。AD被験者には、投薬方法と、試験のための通院および手順とのコン
プライアンスを確実にすることができる介護者がついている。
【０１２２】 非痴呆の対照被験者は、年齢60〜80歳の男女から構成される。対照被験者には
、有意な認識もしくは機能的病状、または老人うつ病評価法（GDS）により決定
されるようなうつ病がなく、MMSE点数は、27〜30点の範囲にある。対照被験者は
、介護者を必要としない以外は、AD被験者と同じ一般的要件を有する。ADおよび
対照被験者の両方とも、概して良好な健康状態である、すなわち、被験者には、
重症の、または生命の危険を伴なう共存症がない。
【０１２３】 リウマチ様関節炎のような医学的に症状の重い炎症性共存症を有する被験者、
あるいは、過去に消化性潰瘍、胃腸出血、もしくはNSAIDの非耐性を有する者は
、試験から排除した。重症の腰椎変形、腰椎領域における敗血症、もしくは出血
障害などの腰椎穿刺に対する禁忌を有する者は、試験への参加から排除した。さ
らに、NSAID、プレドニソンなどの薬剤、または実験を妨害する可能性のあるシ
クロホスファミドのような免疫抑制薬剤を現在もしくは最近使用していた被験者
も排除する。「最近」とは、ベースライン通院（次のパラグラフを参照）を行な
う１ヶ月前までを意味する。AD用のアセチルコリンステラーゼ阻害剤（AChE-I）
治療を受けている被験者は、少なくとも４週間にわたり安定した用量を投与され
ていれば、排除しなかった。同様に、ビタミンE、ビタミンC、またはギンコバイ
ロバなどの抗酸化剤を摂取しているAD被験者は、少なくとも４週間にわたり安定
した用量を投与されていれば、排除しなかった。定期的にNSAIDまたはアスピリ
ンを使用する被験者は排除した。必要に応じて、14日間の実験中に、パラセタモ
ール（Tylenol）のような鎮痛剤を投与する。
【０１２４】 実験方法は、３回のクリニック通院から構成される。すなわち、初回のスクリ
ーニング通院、ベースライン通院、および14日後のフォローアップ通院である。
スクリーニング通院の際に、適格性を評価するのに必要な情報を取得すると共に
、MMSEを投与する。
【０１２５】 スクリーニング通院から２週間以内に行われるベースライン通院の際に、身体
検査と腰椎穿刺を実施する。APO-E遺伝子型判定のような研究室試験および血漿
調製のために、血液サンプルを採取する（実施例31を参照）。この時点で、被験
者、またはAD被験者の場合には介護者に、投与のタイミングおよび考えられる有
害な副作用に関する説明書と一緒に、14日分の試験NSAIDが与えられる（AD被験
者の場合、介護者は、毎回被験者を連れて通院することが求められ、試験NSAID
投与をモニタリングおよび監督する責任がある）。投薬の回数および考えられる
不都合な症候を記録するカレンダーが渡される。
【０１２６】 NSAID治療計画は、食事と一緒に毎日２〜３回カプセルの形態でNSAIDを摂取す
る14日間の治療からなる。高および低試験用量のNSAIDを用いる。イブプロフェ
ンについては、800 mgおよび400 mgの試験用量を用いる。800 mgの試験用量は、
２錠の400 mgイブプロフェン錠剤からなり、400 mgの試験用量は、１個の400 mg
イブプロフェンカプセルと、１個の偽薬カプセルからなる。スリンダクについて
は、200 mgの試験用量を毎日２回、計１日400 mg用いる。メクロフェナム酸につ
いては、毎日100 mgおよび400 mgの試験用量を用いる。NSAIDは、毎日プラスチ
ック製調剤器に事前にパックする。
【０１２７】 治療開始から12または14日後のフォローアップ通院の際に、生命徴候および試
験NSAIDの有害な副作用を評価する。余剰のNSAIDを回収し、計数する。さらに、
腰椎穿刺を実施し、研究室試験および血漿調製のために血液サンプルを採取する
。
【０１２８】 腰椎穿刺を実施し、血液サンプルを採取する通院は、Aβ40およびAβ42レベル
に影響する可能性のある食後または高脂血症血漿サンプルの取得を避けるため、
一晩断食した朝に予定する。表４に、血漿およびCSFサンプルから分析した生物
学的マーカーをまとめて示す。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】実施例31−血漿およびCSFの収集 血液サンプルを採取した後、15〜30分以内に血漿サンプルを調製する。使用す
るまで、血漿サンプルを−70℃で凍結する。少なくとも６mLのCSF、また可能で
あれば、10〜15 mLを各被験者から採取する。全細胞、タンパク質、およびグル
コース評価を実施する。サンプルを試験ID番号により識別するが、ELISAまたは
その他のアッセイを実施する技術者は、被験者または治療条件の内容について一
切知らされていない。
【０１３１】実施例32−具体的アッセイ ELISAを用いて、CSF中のAβ40およびAβ42レベルを測定する。確立された手順
（３）に従い、マイクロプレート上で２回反復で、サンプルのバッチを同時にア
ッセイする。Aβ42検出では、次の２つの抗体を用いる：（１）Aβの最初の５ア
ミノ酸以内のエピトープを認識するモノクローナル抗体を捕獲のために使用し、
（２）アミノ酸42で終わるAβを認識し、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合された目的特異的モノクローナル抗体を検出のために用いる。実施例６に記載
されているように、Aβ38のCSFレベルを質量分析法により測定する。較正用の内
部標準を用いたガスクロマトグラフィー／負の化学的イオン化質量分析法（Mont
ineら（1999）Neurology 52：562-565）により、CSFイソプロスタンを測定する
。MCSF、MCP-1、tauおよびP-tau181のCSFレベルを測定する。M-CSF（R&D Diagno
stics）およびMCP-1（Pharmingen、サンジエゴ）測定には、市販されているELIS
Aキットを用いる。CSF tauおよびP-tau 181は、Innogenetics, Inc.製のELISAキ
ットを用いて測定し、各種NSAIDの血漿レベルは、公表されている方法（Canapar
oら（2000）Biomed Chromatogr 14：219-26）に記載されたHPLC方法により測定
する。
【０１３２】実施例33−臨床データの分析 NSAID処理によるAβ42レベルの低下は、CSFおよび／または血漿におけるAβ42 レベルの減少として検出する。従って、NSAID処理を受けたAD被験者または高齢
の対照被験者が、CSFおよび／または血漿Aβ42レベルに連続的な減少を示すのに
対し、偽薬を投与された被験者は、CSFおよび／または血漿Aβ42レベルに連続的
減少は示さないことになる。
【０１３３】 ベースラインで被験者グループ間の比較可能性を評価するために、人口学的デ
ータ（例えば、年齢および性別）、痴呆の重症度（MMSE点数）、およびAPO-E e4
対立遺伝子頻度を、偽薬グループと、NSAID処理を受けたAD被験者または高齢の
対照被験者グループとの間で、比較する。連続的変数をANOVAにより比較し、カ
イ２乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を用いて、性別やAPO-E遺伝子型
などのカテゴリー変数の頻度を比較する。
【０１３４】 ベースラインサンプルからフォローアップサンプルまで、目的とする生物マー
カーのレベル変化を各被験者について算出する。記述統計学を用いて、ベースラ
インでの生物マーカーのレベルが正規分布しているかどうかを決定する。正規分
布であれば、ANOVAを用いて、各治療グループの平均変化を各偽薬グループと比
較する。正規分布でない場合には、データ変換を適用するか、ノンパラメトリッ
ク統計学を用いて、種々の被験者グループ間の生物マーカーレベルの変化を比較
する。
【０１３５】 Aβ42レベルの変化が、Aβ40およびAβ38レベルの変化を伴なうかどうかを確
認するために、ANOVAを用いて、偽薬グループ中のCSF Aβレベルを治療グループ
のレベルと比較する。小グリア細胞機能に関する生物マーカー（例えば、M-CSF
およびMCP-1）のレベル、脳中の酸化損傷（例えば、F-2イソプロスタン）、なら
びに、ニューロン変性（例えば、tauおよびP-tau 181）を偽薬またはNSAIDで治
療したグループ間で、治療の前および後に比較する。NSAIDでの治療後に生物マ
ーカーのレベルが変化する場合には、年齢、性別、APO-E遺伝子型および血漿NSA
IDレベルのような変数と関連させ、変化を検討する。散布図および適当な統計的
比較を用いる。
【０１３６】実施例34−統計的検出力計算（power calculation） 公表されたデータから、CSF Aβ42レベルが、繰返し行なった腰椎穿刺時に安
定したままであることがわかる。NSAIDで治療した被験者と、偽薬で治療した被
験者との間の差を検出する力は、ベースラインに対する治療後の生物マーカーレ
ベルの変化の大きさに応じて変動する。
【０１３７】 53人のAD患者グループにおけるCSF Aβ42レベルについて公表された経時的デ
ータ（Andreasenら（1999）Arch Neurol 56：673-80）では、ベースラインCSF A
β42レベル（平均値±SD）は、709±304 pg／mlで、フォローアップ（10ヵ月後
）CSF Aβ42レベルは、701±309 pg／mLであった。第１および第２CSF Aβ42レ
ベル間の相関は、Ｒ＝0.90であった。健康な被験者について、公表された入手可
能な経時的CSF Aβ42レベルデータはない。健全な被験者を含む２つの実験にお
いて、CSF Aβ42レベルの値は、1485±473 pg／mL（Galaskoら（1998）Arch Neu
rol 55：937-45）および1678±436 pg／mL（Andreasenら（1999）Arch Neurol 5
6：673-80）であった。
【０１３８】 検出力計算（power calculation）では、次の仮定を用いる：（１）Andreasen
ら（1999）Arch Neurol 56：673-80に記載されているように、時間が経過しても
レベルが安定していること、および（２）変化の変動が類似していること。標準
偏差は（（1-相関）*2*SD^2）の平方根として計算する。CSF Aβ42レベルについ
ては、前−後相関を0.8と仮定する。
【０１３９】 前−後平均CSF Aβレベルの変化が、偽薬グループでほぼゼロであると仮定す
ると、効果の程度（effect size）は、ベースラインでのAβ42の平均レベルに応
じて変わる。例えば、高齢の対照については、平均CSF Aβ42レベルが1485 pg／
mLである（Galaskoら（1998）Arch Neurol 55：937-45を参照）とすると、効果
の程度が0.25とは、治療による、平均に対しての371 pg／mLの増加または減少を
表している。
【０１４０】 検出力計算のために、次のことを仮定する：（１）アルファ＝0.05、（２）検
出力＝0.80、および（３）偽薬および治療を受けた同数の被験者を用いる２グル
ープ実験。効果の程度が0.25の力計算では、両グループの各々で、サンプルサイ
ズ（Ｎ）は11であることが求められる。効果の程度が0.2の場合には、、各グル
ープで、Ｎ＝16が求められる。
【０１４１】 各実験で、１グループにつき12人の被験者を用いて、効果の程度が0.25以上の
検出が可能である。前臨床実験では、数種のNSAID（イブプロフェンおよびメク
ロフェナム酸を含む）が、培養した細胞からの上清、ならびに、トランスジェニ
ックマウスの脳組織中のAβ42レベルを25％以上低下させた。イブプロフェンを
用いた長期トランスジェニックマウス実験では、脳中のAβレベルが、非処理の
ものと比べて、処理マウスでは約38％低いことが報告されている（Limら（2000
）J Neurosci 20：5709-14）。
【０１４２】 被験者間の、または繰返し行なわれる腰椎穿刺時のCSF Aβ42レベルの変動が
、これらの射影より高い場合には、サンプルサイズを再評価し、必要に応じてグ
ループサイズを修正する。AD患者におけるCSF Aβ42レベルに関する公表データ
を用いた同様の一連の計算から、12人の患者からなるグループが、25％の効果程
度を検出するのに十分であることが明らかである。
【０１４３】 公表された経時的CSFデータは、ADにおけるCSF tauに関して入手可能である。
Sunderlandら（1999）Biol Psychiatry 46：750-755は、29人のAD患者について
実験した。これら患者のベースラインCSF tau（平均値±SD）は548±355 pg／mL
で、12ヵ月後のフォローアップCSF tauは557±275 pg／mL、およびR-値は0.85で
あった。
【０１４４】 １グループにつき12人の患者を用いる決定は、Aβデータから導き出される。
やはり、治療しない場合に、CSF tauが安定しており、平均すると不変であると
仮定すると、ベースラインに対して少なくとも33％のCSF tauの減少についての
効果程度は、183 pg／mL tauである。
【０１４５】 （１）偽薬および治療を受ける同じ被験者数、（２）１グループにつきＮ＝12
であり、かつ（３）α＝0.05と仮定する、２グループ実験設計では、tauについ
て33％以上の効果程度を検出するのに、検出力は73％である。
【０１４６】 予備イブプロフェン試験により示されているように、安定したままである血漿
Aβレベルを除いて、その他の生物マーカーの経時的測定値の変動度はわかって
いない。健康な高齢の被験者と軽症のAD被験者におけるイブプロフェン試験を最
初に実施してから、すべての生物マーカーについてサンプルサイズを再評価した
後、必要な変更をその他のNSAID実験に組み込む。
【０１４７】実施例35−偽薬を対照とした、Aβ低下作用を有するNSAIDの試験 十分に許容される用量の偽薬、イブプロフェン、またはAβ低下作用を有する
別のFDA承認NSAIDで、48週間治療した60人のAD被験者を用いて、二重盲目ランダ
ム化偽薬対照試験を実施する。具体的なNSAIDおよび用量は、実施例30で得られ
た結果に基づいて選択した。
【０１４８】 被験者は、年齢が50〜90歳で、NINCDS-ADRDA試験が示すように、恐らくADであ
ろうという診断を受けた者である。被験者は、MMSEが15〜25の範囲にあり、全般
に良好な健康状態、すなわち、生命の危険を伴なうもしくは重い疾患がなく、か
つ、薬剤投与を監督し、かつ付帯情報を提供することができる介護者がついてい
る。その他のスクリーニング基準は実施例30に記載した通りである。
【０１４９】 最初に、スクリーニング通院で、適格性について被験者を審査する。MMSEおよ
び身体検査を実施する。通常の研究室試験のために血液サンプルを採取する。ブ
ロックランダム化を用いて、患者を偽薬もしくは活性治療グループに割り当てる
。割当てをベースラインMMSE点数に応じて決定することにより、偽薬および活性
治療の両グループで痴呆重症度が同等になるようにする。
【０１５０】 スクリーニング通院から２週間以内に予定されるベースライン通院の際に、生
命徴候を評価し、腰椎穿刺を実施し、APO-E遺伝子型判定および血漿調製のため
に血液サンプルを採取する（実施例31を参照）。Aβ40、 Aβ42、イソプロスタ
ン、tau、およびP-tauのCSFレベル、ならびに、Aβ40およびAβ42の血漿レベル
を測定する。さらに、アルツハイマー病評価法−認識試験（ADAS-cog、Galasko
ら（1997）Alzheimer Dis Assoc Disord 11；Suppl 2：S33-9参照）およびMMSE
を用いて認識について評価し、また、アルツハイマー病協同研究−日常生活動作
スケール（ADCS-ADL）（McKhannら（1984）Neurology 34：939-944を参照）を用
い、機能的能力を評価する。この時、被験者の介護者に、投与のタイミングおよ
び考えられる悪影響に関する説明書と一緒に、12週間分の試験NSAIDが与えられ
る。
【０１５１】 12週間後の通院で、生命徴候、便グアヤク（guaiac）、および有害な副作用を
評価する。未使用のNSAIDを計数する。24週間後の通院で、ベースライン通院の
ときと同じ評価手順を実施する。未使用のNSAIDを計数し、有害な事象について
質問する。36週間後の通院で、12週間後通院のときと同じ評価手順を実施するが
、48週間後通院では、ベースライン通院のときと同じ評価手順を実施する。未使
用のNSAIDを計数し、有害な事象について質問する。表５に、この実験における
各通院時に実施した検査をまとめて示す。
【０１５２】
【表５】 これに加え、４、８、16、および20週間後に、各被験者／介護者に電話で連絡
し、試験の継続、薬剤の使用、および有害な事象について質問する。
【０１５３】実施例36−偽薬を対照とした実験の統計分析 統計分析は、治療前および後の被験者の認識（ADAS-cog、MMSE）、機能（ADCS
-ADL）、および生物マーカーデータの比較を含んでなる。48週間にわたりNSAID
で治療した被験者は、偽薬で治療した被験者と比べて、認識および機能低下が少
ないことが予想される。また、NSAID治療は、CSFおよび恐らく血漿中の生物マー
カーインデックスの改善を伴なうと予想される。
【０１５４】 最後および最初のADAS-cogおよびADCS-ADL点数の差（Δ）を一次結果測定値と
呼ぶ。偽薬および治療グループの平均ΔをANOVAにより比較する。実験を完遂で
きなかった被験者についての調整のため、Last Observation Carried Forward（
LOCF）分析を実施する。
【０１５５】 データが正規でない場合には、ANOVAまたはノンパラメトリック試験（例えば
、Kruskal-Wallis）を用いて、Aβ42、tau、P-tau181、F-2-イソプロスタンのCS
Fレベルの変化、ならびに、Aβ40およびAβ42の血漿レベルの変化を、同様に結
果測定値として分析する。24週間後の生物マーカー測定値および臨床測定値の変
化の相関を、散布図および相関分析により調べる。
【０１５６】 （その他の実施形態） 本発明について、その詳細な説明とともに記載してきたが、以上の説明は例示
を目的とし、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲は、特許請求
の範囲によって定められる。その他の態様、利点および変更も本発明の特許請求
の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 DMSOまたは様々な濃度の硫化スリンダクで処理しておいた、APP751およびPS-1
突然変異体M146Lを発現するCHO細胞について測定したAβ42／Aβ40比および合計
Aβレベルをまとめて示した棒グラフである。
【図２】 DMSOまたは様々な濃度の硫化スリンダクで処理しておいた、APP695を発現する
ヒト神経膠腫細胞（HS683）について測定したAβ42／Aβ40比および合計Aβレベ
ルをまとめて示した棒グラフである。
【図３】 エタノールまたは様々な濃度のイブプロフェンで処理しておいた、APP751およ
びPS-1突然変異体M146Lを発現するCHO細胞について測定したAβ42／Aβ40比およ
び合計Aβレベルをまとめて示した棒グラフである。
【図４】 DMSOまたは様々な濃度のインドメタシンで処理しておいた、APP751およびPS-1
突然変異体M146Lを発現するCHO細胞について測定したAβ42／Aβ40比および合計
Aβレベルをまとめて示した棒グラフである。
【図５】 DMSOまたは様々な濃度のナプロキセンで処理しておいた、APP751を発現するCH
O細胞について測定したAβ42／Aβ40比および合計Aβレベルをまとめて示した棒
グラフである。
【図６】 酢酸エチルまたは様々な濃度のセレコキシブで処理しておいた、APP751を発現
するCHO細胞におけるAβ42／Aβ40比および合計Aβレベルを比較した棒グラフで
ある。
【図７】 DMSOまたは様々な濃度の硫化スリンダクで処理しておいた、APP695を発現する
一次繊維芽細胞（COX-1/COX-2二重ノックアウトマウス由来）について測定したA
β42／Aβ40比および合計Aβレベルをまとめて示した棒グラフである。
【図８】 DMSOまたは100μMの硫化スリンダクで処理した後、APP695を発現するCHO細胞
により分泌されたAβ種の２つの代表的質量スペクトルを示した図である。
【図９】 DMSOまたは硫化スリンダクで処理した細胞におけるAβ1-42、Aβ1-39、Aβ1-3 8 、およびAβ1-37とAβ1-40との比を示した棒グラフである。
【図１０】 短期NSAID処理後の、Tg2576マウスの脳中のAβ40およびAβ42レベルの分散ダ
イヤグラムである。
【図１１】 インドメタシンおよびメクロフェナム酸の構造、可能な側鎖修飾、ならびに、
COX-1およびCOX-2活性にこれらの修飾が及ぼす影響をまとめて示した図である。
【図１２】 新しく合成されたビフェニルアミン類の構造を示した図である。
【図１３】 メクロフェナム酸で処理したCHO APP695NL,I,his細胞培養物中のAβ42減少の
時間経過を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/216 Ａ６１Ｋ 31/216 31/405 31/405 Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 25/28 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/46 1/46 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/53 33/53 Ｄ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴルド，トッド，エリオット アメリカ合衆国 フロリダ州 32082，ポ ンテ ヴェラ ビーチ，ポンテ ヴェドラ ヴールバード 646ビー (72)発明者 ガラスコ，ダグラス，ロジャー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92116，サン ディエゴ，ミドルセックス ドライブ 4217 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 DA36 4B063 QA18 QQ95 QR12 QR77 4C084 AA17 NA14 ZA162 ZC022 4C086 AA01 AA02 BC14 MA01 MA04 MA09 MA10 NA14 ZA16 ZC02 4C206 AA01 AA02 AA03 DA23 DA24 DA25 FA33 KA01 MA01 MA04 MA14 NA14 ZA16 ZC02

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または逆転させる方
    法であって、 （ａ）アルツハイマー病の進行の予防、遅延、または逆転が必要な哺乳動物を
    識別し、 （ｂ）該哺乳動物に、Aβ42レベルが選択的に減少する条件下でAβ42低下物質
    を投与する、 ことを含んでなる、上記方法。
  2. 【請求項２】 Aβ38のレベルが増加する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 Aβ34、Aβ36、Aβ37、およびAβ39のうち１以上のレベルが
    増加する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 Aβ40のレベルが不変である、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 Aβ42低下物質が、アリールプロピオン酸誘導体、アリール
    酢酸誘導体、もしくはアミノカルボン酸誘導体である、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 Aβ42低下物質が、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、フ
    ェノプロフェン、カルプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェンおよびフル
    ルビプロフェンからなる群より選択されるNSAIDの構造誘導体である、請求項１
    に記載の方法。
  7. 【請求項７】 Aβ42低下物質が、5-ニトロ-2-(3-フェニルプロピルアミノ)
    安息香酸の構造誘導体である、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 Aβ42低下物質が、COX-1、COX-2、もしくは、COX-1とCOX-2
    の両方を阻害する活性を欠失している、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 Aβ42低下物質が、COX-1、COX-2、もしくは、COX-1とCOX-2
    の両方を阻害する活性よりも、Aβ42レベルを低下させる効力の方が高い、請求
    項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記哺乳動物がアルツハイマー病と診断されていない、請
    求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記哺乳動物に、アルツハイマー病の遺伝的素因がない、
    請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 Aβ42低下物質を開発する方法であって、 （ａ）NSAIDのフェニル環上のカルボン酸基の位置を改変するか、NSAIDのカル
    ボン酸基とは反対側のフェニル環上の置換基の位置または種類を改変するか、NS
    AIDの２つのフェニル環をつなぐ結合を改変するか、NSAIDのカルボン酸基をプロ
    ピオン酸もしくは別の置換基に改変するか、あるいは、これらの改変の任意の組
    合せを実施することにより、NSAIDメクロフェナム酸またはフルフェナム酸を誘
    導体化して、候補Aβ42低下物質を生成し、 （ｂ）次に、候補Aβ42低下物質を生物学的組成物と接触させた後に、候補Aβ42 低下物質が、該生物学的組成物中のAβ42およびAβ38のレベルに及ぼす作用を
    測定し、その際、Aβ42レベルの低下と同時にAβ38レベルの増加が認められれば
    、該候補Aβ42低下物質はAβ42低下物質である、 ことを含んでなる上記方法。
  14. 【請求項１４】 Aβ42低下物質を開発する方法であって、 （ａ）フェノプロフェン、フルルビプロフェンおよびカルプロフェンからなる
    群より選択されるNSAIDを提供し、 （ｂ）NSAIDのフェニル環上のプロピオン酸基の位置を改変するか、NSAIDのプ
    ロピオン酸基とは反対側のフェニル環上の置換基の位置または種類を改変するか
    、NSAIDの２つのフェニル環をつなぐ結合を改変するか、NSAIDの酢酸基をカルボ
    ン酸もしくは別の置換基に改変するか、あるいは、これらの改変の任意の組合せ
    を実施することにより、候補Aβ42低下物質を生成し、 （ｃ）次に、候補Aβ42低下物質を生物学的組成物と接触させた後、候補Aβ42 低下物質が、該生物学的組成物中のAβ42およびAβ38のレベルに及ぼす作用を測
    定し、その際、Aβ42レベルの低下と同時にAβ38レベルの増加が認められれば、
    該候補Aβ42低下物質は新規のAβ42低下物質である、 ことを含んでなる上記方法。
  15. 【請求項１５】 Aβ42低下物質を開発する方法であって、 （ａ）インドメタシンのカルボン酸基を別の置換基に改変するか、インドール
    窒素を別の置換基に改変するか、あるいは、これらの改変の任意の組合せを実施
    することにより、候補Aβ42低下物質を生成し、 （ｂ）次に、候補Aβ42低下物質を生物学的組成物と接触させた後、候補Aβ42 低下物質が、該生物学的組成物中のAβ42およびAβ38のレベルに及ぼす作用を測
    定し、その際、Aβ42レベルの低下と同時にAβ38レベルの増加が認められれば、
    該候補Aβ42低下物質は新規のAβ42低下物質である、 ことを含んでなる上記方法。
  16. 【請求項１６】 Aβ42低下物質を開発する方法であって、 （ａ）硫化スリンダクのメチルチオール基を別の置換基に改変するか、硫化ス
    リンダクのプロピオン酸基を別の置換基に改変するか、硫化スリンダクのフッ化
    物部分を別の置換基に改変するか、あるいは、これらの改変の任意の組合せを実
    施することにより、候補Aβ42低下物質を生成し、 （ｂ）次に、候補Aβ42低下物質を生物学的組成物と接触させた後、候補Aβ42 低下物質が、該生物学的組成物中のAβ42およびAβ38のレベルに及ぼす作用を測
    定し、その際、Aβ42レベルの低下と同時にAβ38レベルの増加が認められれば、
    該候補Aβ42低下物質は新規のAβ42低下物質である、 ことを含んでなる上記方法。
  17. 【請求項１７】 アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または逆転させる
    のに有用なAβ42低下物質を同定する方法であって、 （ａ）候補Aβ42低下物質を同定し、 （ｂ）APPプロセシング活性が生じる条件下で、候補Aβ42低下物質を、APPお
    よびAPPプロセシング活性を含む生物学的組成物と接触させ、 （ｃ）候補Aβ42低下物質と接触させた生物学的組成物中のAβ42のレベルを、
    候補Aβ42低下物質と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベルと比較
    し、 （ｄ）候補Aβ42低下物質と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベ
    ルと比較して、候補Aβ42低下物質と接触させた生物学的組成物中にAβ42レベル
    の低下が認められたら、この候補Aβ42低下物質を、アルツハイマー病の進行を
    予防、遅延、または逆転させるのに有用なAβ42低下物質として同定する、 ことを含んでなる上記方法。
  18. 【請求項１８】 アルツハイマー病の進行を予防、遅延、または逆転させる
    のに有用なAβ42低下物質を同定する方法であって、 （ａ）候補Aβ42低下物質を同定し、 （ｂ）Aβ42異化作用が起こる条件下で、候補Aβ42低下物質を、Aβ42およびA
    β42異化活性を含む生物学的組成物と接触させ、 （ｃ）候補Aβ42低下物質と接触させた生物学的組成物中のAβ42のレベルを、
    候補Aβ42低下物質と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベルと比較
    し、 （ｄ）候補Aβ42低下物質と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベ
    ルと比較して、候補Aβ42低下物質と接触させた生物学的組成物中にAβ42レベル
    の低下が認められたら、この候補Aβ42低下物質を、アルツハイマー病の進行を
    予防、遅延、または逆転させるのに有用なAβ42低下物質として同定する、 ことを含んでなる上記方法。
  19. 【請求項１９】 COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害する効
    力よりも、Aβ42レベルを低下させる効力の方が高い新規Aβ42低下物質を同定す
    る方法であって、 （ａ）生物学的組成物中のAβ42のレベルを低下させる能力についてスクリー
    ニングすることにより、Aβ42低下物質を同定し、 （ｂ）用量応答試験を実施することにより、Aβ42低下についての該Aβ42低下
    物質のIC50を決定し、 （ｃ）in vitroでのCOX-1およびCOX-2不活性化アッセイを用いて、該Aβ42低
    下物質が、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害するかどうかを判
    定し、 （ｄ）COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方の阻害についてのIC50と、
    Aβ42低下についてのIC50を比較し、その際、Aβ42低下のIC50が、COX-1、COX-2
    、もしくはCOX-1とCOX-2の両方の阻害のIC50の10倍より高い場合に、このAβ42
    低下物質は、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害する効力よりも
    、Aβ42レベルを低下させる効力の方が高いものであることを示す、 ことを含んでなる上記方法。
  20. 【請求項２０】 Aβ42低下物質の動物への投与が、Aβ42低下物質の投与時
    に有意な臨床的副作用を起こさないレベルに、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とC
    OX-2の両方を阻害しないかあるいは最小限阻害するだけの用量で、Aβ42レベル
    を減少させることを証明することにより、前記のより高い効力をさらに確認する
    、請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 生物学的組成物が酵素を含む、請求項13、14、15、16、17
    、18または19に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 生物学的組成物が哺乳動物細胞を含む、請求項13、14、15
    、16、17、18または19に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 生物学的組成物がトランスジェニック動物を含む、請求項
    13、14、15、16、17、18または19に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 Aβ40のレベルが不変である、請求項13、14、15、16、17
    、18または19に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 Aβ34、Aβ36、Aβ37、およびAβ39のうちいずれか１以上
    のレベルが増加する、請求項13、14、15、16、17、18または19に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 Aβ38のレベルが増加する、請求項17、18または19に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 候補Aβ42低下物質が、アリールプロピオン酸誘導体、ア
    リール酢酸誘導体、およびアミノカルボン酸誘導体からなる群より選択される、
    請求項17、18または19に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 候補Aβ42低下物質が、フルフェナム酸、メクロフェナム
    酸、フェノプロフェン、カルプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、お
    よびフルルビプロフェンからなる群より選択されるNSAIDの構造誘導体である、
    請求項17、18または19に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 候補Aβ42低下物質が、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCO
    X-2の両方を阻害する活性を欠失している、請求項13、14、15、16、17、または1
    8に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 候補Aβ42低下物質が、in vivo において、COX-1、COX-2
    、もしくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害する活性に比して、Aβ42を低下させる効
    力の方が高い、請求項13、14、15、16、17、または18に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 アルツハイマー病の発症の危険性を高める物質、または、
    その進行を加速する物質を同定する方法であって、 （ａ）候補物質を同定し、 （ｂ）APPプロセシング活性が生じる条件下で、該候補物質を、APPおよびAPP
    プロセシング活性を含む生物学的組成物と接触させ、 （ｃ）候補物質と接触させた生物学的組成物中のAβ42のレベルを、候補物質
    と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベルと比較し、 （ｄ）候補物質と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベルと比較
    して、候補物質と接触させた生物学的組成物中にAβ42のレベルの増加が認めら
    れたら、この候補物質を、アルツハイマー病の発症の危険性を高める物質、また
    は、その進行を加速する恐れがある物質として同定する、 ことを含んでなる上記方法。
  32. 【請求項３２】 アルツハイマー病の発症の危険性を高める物質、または、
    その進行を加速する物質を同定する方法であって、 （ａ）候補物質を同定し、 （ｂ）Aβ42異化作用が起こる条件下で、該候補物質を、Aβ42およびAβ42異
    化活性を含む生物学的組成物と接触させ、 （ｃ）候補物質と接触させた生物学的組成物中のAβ42のレベルを、候補物質
    と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベルと比較し、 （ｄ）候補物質と接触させなかった生物学的組成物中のAβ42のレベルと比較
    して、候補物質と接触させた生物学的組成物中にAβ42のレベルの増加が認めら
    れたら、この候補物質を、アルツハイマー病の発症の危険性を高める物質、また
    は、その進行を加速する恐れがある物質として同定する、 ことを含んでなる上記方法。
  33. 【請求項３３】 生物学的組成物が酵素を含む、請求項31または32に記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 生物学的組成物が哺乳動物細胞を含む、請求項31または32
    に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 生物学的組成物がトランスジェニック動物を含む、請求項
    31または32に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 Aβ42低下物質および抗酸化剤を含有する組成物。
  37. 【請求項３７】 抗酸化剤が、ビタミンE、ビタミンC、クルクミン、および
    ギンコバイロバ(Gingko biloba)からなる群より選択される、請求項36に記載の
    組成物。
  38. 【請求項３８】 Aβ42低下物質および非選択的セクレターゼ阻害剤を含有
    する組成物。
  39. 【請求項３９】 Aβ42低下物質およびアセチルコリンエステラーゼ阻害剤
    を含有する組成物。
  40. 【請求項４０】 Aβ42低下物質および抗酸化剤を含んでなるキット。
  41. 【請求項４１】 Aβ42低下物質および非選択的セクレターゼ阻害剤を含ん
    でなるキット。
  42. 【請求項４２】 Aβ42低下物質およびアセチルコリンエステラーゼ阻害剤
    を含んでなるキット。
  43. 【請求項４３】 前記キットが、前記抗酸化剤、セクレターゼ阻害剤、また
    はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と一緒にAβ42低下物質を使用するための
    投与計画を指示する説明書を含む、請求項40、41、または42に記載のキット。
  44. 【請求項４４】 アルツハイマー病の治療用薬剤の製造におけるAβ42低下
    物質の使用であって、該Aβ42低下物質の患者への投与が、Aβ42レベルを低下さ
    せるのに有効である、上記使用。
  45. 【請求項４５】 Aβ42低下物質がAβ38レベルを高めるのにさらに有効であ
    る、請求項44に記載の使用。
  46. 【請求項４６】 Aβ42低下物質がAβ34、Aβ36、Aβ37、もしくはAβ39レ
    ベルを高めるのにさらに有効である、請求項44に記載の使用。
  47. 【請求項４７】 Aβ40のレベルが不変である、請求項44に記載の使用。
  48. 【請求項４８】 上記Aβ42低下物質が、アリールプロピオン酸誘導体、ア
    リール酢酸誘導体、もしくはアミノカルボン酸誘導体である、請求項44に記載の
    使用。
  49. 【請求項４９】 Aβ42低下物質が、COX-1、COX-2、もしくはCOX-1とCOX-2
    の両方を阻害する活性を欠失している、請求項44に記載の使用。
  50. 【請求項５０】 Aβ42低下物質が、in vivo において、COX-1、COX-2、も
    しくはCOX-1とCOX-2の両方を阻害する活性に比して、Aβ42を低下させる効力の
    方が高い、請求項44に記載の使用。
  51. 【請求項５１】 アルツハイマー病が哺乳動物におけるものである、請求項
    44に記載の使用。
  52. 【請求項５２】 哺乳動物がヒトである、請求項44に記載の使用。
  53. 【請求項５３】 哺乳動物がアルツハイマー病と診断されていない、請求項
    44に記載の使用。
  54. 【請求項５４】 哺乳動物がアルツハイマー病の遺伝的素因をもっていない
    、請求項44に記載の使用。
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