WO2014097978A1 - アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物 - Google Patents

アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a compound for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein accumulates.
  • a ⁇ aminoid ⁇ protein
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ is produced by two-stage proteolysis of amyloid ⁇ precursor protein (APP) in neurons. Initial cleavage at extracellular sites near the membrane is catalyzed by ⁇ -secretase, producing a secreted N-terminal ectodomain (sAPP ⁇ ) and a transmembrane C-terminal fragment (APP-CTF ⁇ or APP-C99) .
  • APP amyloid ⁇ precursor protein
  • in-membrane aspartyl protease ⁇ -secretase (macromolecular complex consisting of the following four core components: presenilin, nicastrin, anterior pharynxectivedefective-1 (APH-1), presenilincerenhancer-2 ( PEN-2)) degrades APP-C99 into A ⁇ and APP intracellular domain (AICD) (see FIG. 4).
  • APH-1 anterior pharynxectivedefective-1
  • PEN-2 presenilincerenhancer-2
  • AICD APP intracellular domain
  • Patent Document 1 reports a biomarker of Alzheimer's disease.
  • the invention relates to a method for qualifying Alzheimer's disease state in a subject, the method comprising: (a) measuring at least one biomarker in a biological sample derived from the subject. Wherein the at least one biomarker is selected from saposin D (I), saposin D (II), saposin D (III) and FAM3C (I); and (b) measuring the results of Alzheimer A step of associating with a disease state.
  • Patent Document 1 only describes the use of four types of proteins as biomarkers for Alzheimer's disease, and does not describe other uses.
  • the present invention is for treatment and / or prevention of a disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated, including a protein that reduces A ⁇ production but does not inhibit Notch cleavage, or a vector into which a polynucleotide encoding the protein is inserted.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition.
  • An object of the present invention is to provide a method for screening a compound that decreases A ⁇ production but increases the expression level of a protein that does not inhibit Notch cleavage.
  • An object of the present invention is to provide a screening method for a compound having activity similar to a protein that reduces A ⁇ production but does not inhibit Notch cleavage.
  • ILEI interleukin-like
  • epithelial-mesenchymal (transition) inducer also known as family -with sequence -similarity -3, member -C-(FAM3C)
  • ILEI is a secreted protein.
  • a recombinant ILEI protein produced by cultured animal cells acts from the outside of the cells, so that A ⁇ production in cultured cells is dose-dependent. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention has been completed on the basis of these findings, and has been completed.
  • the present invention provides the following pharmaceutical composition, screening method and treatment and / or prevention method.
  • composition (I) A pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein accumulates abnormally, comprising a vector into which a polynucleotide encoding ILEI or ILEI is inserted. (I-2) The pharmaceutical composition according to (I-1), wherein the disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated is Alzheimer's disease. (I-3) Use of ILEI or a vector into which ILEI-encoding polynucleotide is inserted in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of diseases in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated.
  • Screening method 1 A method for screening a compound for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein accumulates abnormally, comprising the following steps: (1) contacting a candidate compound with a cell expressing ILEI; and (2) A step of selecting a compound that increases the expression level of ILEI as compared to the case where no candidate compound is present.
  • II-2 The screening method according to (II-1), wherein the disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated is Alzheimer's disease.
  • (III) Screening method 2 (III-1) A method for screening a compound for treating and / or preventing a disease having an activity similar to ILEI and abnormally accumulating amyloid ⁇ protein, comprising the following steps: (1) contacting a candidate compound with a cell producing amyloid ⁇ protein; and (2) Select a compound that does not inhibit Notch cleavage, reduces amyloid ⁇ protein production, and reduces APP-CTF (amyloid- ⁇ precursor protein C-terminal fragment) compared to the case where no candidate compound is present Process.
  • IV Treatment and / or prevention method
  • IV-1 A method for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein accumulates abnormally, comprising administering a vector into which a polynucleotide encoding ILEI or ILEI is inserted.
  • IV-2) The treatment and / or prevention method according to (IV-1), wherein the disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated is Alzheimer's disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention acts from the outside of a cell and has an excellent effect of not inhibiting Notch cleavage while reducing A ⁇ production of the cell by selectively reducing APP-C99. Therefore, it is possible to prevent and treat the progression of a disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated (particularly Alzheimer's disease), and to avoid the side effects observed with the administration of a ⁇ -secretase inhibitor.
  • examples of diseases in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated include Alzheimer's disease and Down's syndrome.
  • ILEI The present inventors screened proteins that bind to the ⁇ -secretase complex and identified ILEI as one of them. And from the analysis used in cultured cells, the ILEI (i) reduces A ⁇ production, (ii) binds to ⁇ -secretase complex, but does not affect its activity, (iii) A ⁇ production It has been found that the intracellular level of the intermediate product APP-C99 is decreased, (iv) Notch cleavage is not inhibited, (v) brain A ⁇ is decreased when forcedly expressed in mice by a transgenic technique.
  • ILEI is a secreted protein identified by database search for a cytokine-like structure having a 4-helix bundle structure, and is well preserved evolutionarily. ILEI is released from the membrane of secretory vesicles after translation, by cleaving the signal sequence of the full-length precursor protein.
  • ILEI means a protein unless otherwise specified.
  • amino acid sequence of ILEI the one described in SEQ ID NO: 1 can be mentioned (GenBank Accession No. NP_055703). Positions 1 to 24 of SEQ ID NO: 1 are signal peptides, and the mature protein is a protein consisting of the amino acid sequence of positions 25 to 227 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2).
  • ILEI includes both full-length proteins and mature proteins.
  • ILEI is a variant of the protein represented by SEQ ID NO: 1 or 2 as long as it has a biological activity equivalent to that of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. May be.
  • mutants examples include 1 or 2 or more, for example, 1 to 50, 1 to 25, 1 to 12, 1 to 9, 1 to 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • a protein having an amino acid sequence substituted, deleted or added examples include 1 or 2 or more, for example, 1 to 50, 1 to 25, 1 to 12, 1 to 9, 1 to 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • ILEI can reduce A ⁇ production of cells by selectively reducing APP-C99, and has a very specific biological activity that has not been reported so far as not inhibiting Notch cleavage. ILEI can also act from outside the cell.
  • compositions for the treatment and / or prevention of a disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated, comprising ILEI or a vector into which a polynucleotide encoding ILEI is inserted.
  • ILEI it is desirable to use a mature protein without a signal sequence.
  • ILEI can be produced according to a known protein production method.
  • ILEI can be produced by obtaining a gene using information on a known gene sequence and preparing a transformant.
  • the produced ILEI can be purified by affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydroxyapatite column chromatography, ammonium sulfate salt folding method, or the like.
  • a polynucleotide encoding a secretory ILEI having a signal sequence can suppress A ⁇ production by acting from outside the cell.
  • a polynucleotide encoding ILEI can be produced according to a known polynucleotide production method, for example, a primer that can chemically synthesize a polynucleotide based on sequence information of the ILEI gene or amplify the ILEI gene And can be produced by PCR using complementary DNA (cDNA) as a template.
  • the vector include adenovirus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, adeno-associated virus vectors and the like. Administration of the vector may be either in vivo or ex vivo.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered to mammals including humans.
  • Administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be local or systemic. There is no restriction
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutically acceptable form suitable for administration to humans and includes a physiologically acceptable additive.
  • a composition may contain a pharmaceutically acceptable diluent, buffer, solubilizer (e.g., a cyclodextrin, polyethylene glycol, or a surfactant such as Tween, pluronic, cremophor, phospholipid), a soothing agent.
  • solubilizer e.g., a cyclodextrin, polyethylene glycol, or a surfactant such as Tween, pluronic, cremophor, phospholipid
  • a component such as a pharmaceutically acceptable solvent, a stabilizer, or an antioxidant (for example, ascorbic acid) may be further contained as necessary.
  • the administration method, dosage form, and the like of the pharmaceutical composition of the present invention are appropriately selected so as to achieve a concentration that effectively suppresses the production of A ⁇ around cells targeted by ILEI.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately
  • the content of ILEI in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected from the range of 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 100% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can prevent and treat the progression of a disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated (particularly Alzheimer's disease). Furthermore, since ILEI does not inhibit Notch cleavage, the side effects observed with administration of ⁇ -secretase inhibitors can be avoided.
  • Screening method 1 The method for screening a compound for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein of the present invention accumulates abnormally comprises the following steps: (1) contacting a candidate compound with a cell expressing ILEI; and (2) A step of selecting a compound that increases the expression level of ILEI as compared to the case where no candidate compound is present.
  • the cell is not particularly limited as long as it expresses ILEI, and examples thereof include a cell into which the ILEI gene has been introduced.
  • Candidate compounds can also be used without particular limitation, and examples include low molecular compounds, high molecular compounds, biopolymers (proteins, nucleic acids, polysaccharides, etc.), and various compound libraries containing such compounds. Can be used.
  • the expression level of ILEI when contacting a candidate compound with a cell is 10% or more, preferably 25% or more, more preferably 50% or more, compared to the case where the candidate compound is not present.
  • the compound when the increase is 75% or more, can be selected as effective for the treatment and prevention of diseases in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated.
  • the method for detecting the expression level of ILEI is by detecting mRNA encoding ILEI or ILEI itself. Extraction of mRNA or protein from a biological sample can be performed according to a conventional method.
  • the method for detecting mRNA is not particularly limited as long as it is a method capable of quantifying mRNA, and examples thereof include DNA chip method, realtime PCR method, Northern blot method and the like.
  • the method for detecting mRNA here also includes detecting cDNA corresponding to mRNA.
  • the method for detecting the protein is not particularly limited as long as it is a method capable of quantifying the protein, and examples thereof include an ELISA method, a protein chip, an analysis method by Western blotting, and the like.
  • the compound selected by the above method and capable of increasing the expression of ILEI can be effective for the treatment and prevention of diseases in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated (particularly Alzheimer's disease).
  • a method for screening a compound for treating and / or preventing a disease in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated having an activity similar to that of ILEI of the present invention comprises the following steps: (1) contacting a candidate compound with a cell producing amyloid ⁇ protein; and (2) A step of selecting a compound that does not inhibit Notch cleavage, decreases amyloid ⁇ protein production, and decreases APP-CTF as compared to the case where no candidate compound is present.
  • the cells and candidate compounds are the same as described above.
  • amyloid ⁇ protein production when a candidate compound is brought into contact with a cell is 10% or more, preferably 25% or more, more preferably 50%, compared to the case where no candidate compound is present.
  • APP-CTF when a candidate compound is brought into contact with the cell is 10% or more, preferably 25% or more, more preferably 50% or more, compared to the case where the candidate compound is not present If it has decreased more than 75%, more preferably: (c) When the candidate compound is brought into contact with the cell, the level of Notch cleavage is not reduced compared to the case where the candidate compound is not present, preferably not more than 10%. .
  • the method for detecting amyloid ⁇ protein and APP-CTF is not particularly limited as long as they can be quantified, and examples thereof include an ELISA method, a protein chip, and an analysis method by Western blotting.
  • the method for detecting the Notch cleavage level can be carried out, for example, by detecting NICDNIC (Notch intracellular domain) released by being cleaved by ⁇ -secretase.
  • the method for detecting NICD is not particularly limited as long as it can be quantified, and examples thereof include an ELISA method, a protein chip, an analysis method by Western blotting, and the like.
  • APP-CTF means a transmembrane C-terminal fragment (CTF) of APP.
  • CTF transmembrane C-terminal fragment
  • APP-C99 is particularly desirable because it is directly related to A ⁇ production.
  • the compound selected by the above method and having an activity similar to ILEI can be effective in the treatment and prevention of diseases in which amyloid ⁇ protein is abnormally accumulated (particularly Alzheimer's disease).
  • Method ⁇ Plasmid> A cDNA encoding ILEI / FAM3C with or without a stop codon was amplified from a human brain cDNA library (Clontech) using PCR and inserted into pcDNA6 / V5-His (Invitrogen).
  • pcDNA6 / V5-His Invitrogen.
  • the oligonucleotide 5′-GGAGAAGUAUUAGACACU-3 ′ was inserted into pSUP (Oligoengine).
  • pSUP Oligonucleotide
  • 5 neutral mutations were introduced into ILEI cDNA using PCR-based site-directed mutagenesis. The sequence of all constructs was confirmed by sequencing.
  • Anti-human ILEI polyclonal antibody is a rabbit against a synthetic polypeptide (C + GGDVAPFIEFLKAIQDGT) corresponding to amino acid residues 126-143 of ILEI in which thyroglobulin is bound to a Cys residue added to the N-terminus. was produced. This antibody was purified using immunoaffinity chromatography with immobilized antigen. The following antibodies were also used: rabbit polyclonal anti-APP-CTF antibody and mouse monoclonal anti- ⁇ -actin antibody (Sigma); mouse monoclonal anti-Notch-1 antibody (AbD Serotec); mouse monoclonal anti-human A ⁇ antibody (4G8, Covance).
  • siRNA duplexes were purchased from Dharmacon: siGENOME SMART pool M-020514 for ILEI knockdown and D001210 for non-targeted control.
  • the M-020514 pool consisted of four duplexes targeting the following sequences: F1: 5'-GAACAGCACAUAAAGAACA-3 '; F2: 5'-GGAGAAGUAUUAGACACUA-3'; F3: 5'-GGAGCACAUCUAUUACUAA-3 '; F4: 5'-GAACAAUAAGGAUACAAAC-3'.
  • siRNA duplexes were introduced into cultured cells using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen).
  • ⁇ Immunoblotting> The brain homogenate was dissolved in a buffer containing 1% Nonidet P40 (25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, protease inhibitor cocktail and 10% glycerol). Immunoblotting was performed as previously reported (Nishimura, M., et al. Nat Med 5, 164-169 (1999)).
  • the left half of the mouse brain was fixed in 4% paraformaldehyde in phosphate buffer for 24 hours at 4 ° C. and cut with a cryostat as a 20 ⁇ m thick floating section. Sections were incubated for 30 minutes in PBS 0.3% H 2 O 2 and then each primary antibody at 24 ° C. for 24 hours followed by a biotinylated secondary antibody followed by avidin / biotinylated horseradish peroxidase complex (Vector Laboratories ). The immune response was detected using 0.03% 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride containing 0.003% H 2 O 2 and 0.5 mg ml ⁇ 1 nickel ammonium sulfate hexahydrate.
  • ⁇ ILEI-Tg mouse> The gene transfer vector pMoPrP-ILEI was constructed by subcloning the XhoI-XhoI fragment of human ILEI cDNA into the XhoI site of the MoPrP vector containing the mouse prion promoter for neuron-specific expression.
  • Transgenic mice were generated by injecting pMoPrP-ILEI DNA into C57BL / 6 mouse fertilized eggs using standard techniques. Primary transgenic individuals were identified using PCR (see below).
  • the genotype of the transgenic mice was determined by PCR using the following transgene specific primer pairs: mPrP-s 5'-CTGCTCCATTTTGCGTGACTC-3 'and hFAM3C-as 5'-CTTCCAGGCAGATTTTGGGTC-3'.
  • mice brain A ⁇ measurements the right half of the mouse brain was motor-driven Tefron / glass homogenizer (10 strokes) in a 4-fold solution of Tris buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM mM EDTA). ) was used to homogenize. The homogenate was centrifuged at 100,000 ⁇ g for 20 minutes and the supernatant was used as the soluble fraction. The pellet was dissolved by a short sonication in a 1 volume solution of 50 mM Tris, pH 7.5-6 M guanidine hydrochloride, and centrifuged at 100,000 ⁇ g for 10 minutes. The supernatant was diluted 12-fold and used as an insoluble fraction. Soluble and insoluble fractions were subjected to DC protein assay (BioRad) and mouse / rat A ⁇ 40 and A ⁇ 42 specific ELISA (IBL). The A ⁇ concentration was determined as the molar concentration per total protein weight.
  • Tris buffer 20 m
  • Test example 1 Control or ILEI-specific siRNA was transiently transfected into HEK293 cells. A ⁇ 40 (black) and A ⁇ 42 (gray) in the culture were measured using ELISA (FIG. 1a). From FIG. 1a, RNAi-mediated knockdown of endogenous ILEI in HEK293 cells resulted in approximately double A ⁇ 40 and A ⁇ 42 levels in restriction medium.
  • ILEI cDNA was transiently transfected into HEK293 cells.
  • a ⁇ 40 (black) and A ⁇ 42 (gray) in the culture were measured using ELISA (FIG. 1b). From FIG. 1b, overexpression of ILEI reduced A ⁇ secretion by HEK293 cells.
  • HEK293 cells transfected with control or ILEI siRNA or ILEI cDNA (ILEI-k / d and ILEI-oe in the figure, respectively) were treated with N ethyl maleimide (NEM) for 60 minutes to prevent AICD degradation.
  • AICD production was suppressed by DAPT treatment, a ⁇ -secretase inhibitor (D in the figure).
  • ⁇ -actin was used as a sample volume control.
  • FIG. 1c shows that ILEI knockdown increases AICD production and ILEI overexpression decreases AICD production.
  • ⁇ -secretase cleavage of endogenous Notch-1 in mouse fetal fibroblasts was tested (FIG. 1d).
  • Treatment of MEF with EDTA® (1.5 mM) induces the cleavage of TMIC® (transmembrane / intracellular® Notch) and generates NEXT® (Notch® extracellular® truncation).
  • NEXT is further cleaved by ⁇ -secretase to release NICD (Notch intracellular domain).
  • NICD production was inhibited by DAPT (1 ⁇ M).
  • ⁇ -actin was used as a sample volume control.
  • Test example 2 Purified ILEI-His at the indicated concentration ( ⁇ g ml ⁇ 1 ) was added to the culture medium of HEK293 cells stably knocked down ILEI. The results are shown in FIG. Administration of purified ILEI-His reduced A ⁇ secretion in a dose-dependent manner. At a concentration of 7 ⁇ g ml ⁇ 1 , A ⁇ secretion was reduced to the same extent as the introduction of siRNA resistant ILEI cDNA.
  • Test example 3 In order to analyze the results of ILEI overexpression in the mammalian brain, transgenic (Tg) mice using the mouse prion (PrP) promoter were developed to significantly promote the expression of the human ILEI cDNA transgene in the brain. Heterozygous Tg mice showed normal growth and fertility without morphological abnormalities.
  • FIG. 3a it was shown by immunohistochemistry that ILEI is expressed in the cerebral cortex and hippocampal neurons of the wild type and ILEI-Tg mouse brain. Like wild-type mice, ILEI expression was restricted to neurons in the brains of Tg mice.
  • ILEI-Tg mice and their wild-type littermate brain homogenates were subjected to immunoblotting.
  • ⁇ -actin was analyzed as a sample volume control. Immunoblotting of brain homogenates showed that ILEI protein levels increased approximately 3-fold in Tg mouse brains compared to wild-type littermates (FIG. 3b). It was also revealed that APP-CTF levels in the brains of Tg mice were reduced by 30% and that there was no change in NICD levels (FIG. 3b).

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Abstract

開示されているのは、ILEI、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法、並びにアミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防方法である。

Description

アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物
　本発明は、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物に関する。さらに、本発明は、アミロイドβタンパク質が蓄積する疾患を治療及び／予防するための化合物のスクリーニング方法に関する。
　アミノイドβタンパク質(Aβ)が脳内に異常蓄積することが、アルツハイマー病(AD)の分子病態であり、Aβを減少させることは病態に基づいた治療法となる可能性が期待されている。
　Aβは神経細胞においてアミロイドβ前駆体タンパク質(APP)の2段階のタンパク質分解によって産生する。細胞外の膜近傍部位における最初の切断はβセクレターゼ(β-secretase)によって触媒され、分泌型のN末端外部ドメイン(sAPPβ)と膜貫通C末端フラグメント(APP-CTFβ又はAPP-C99)を産生する。次に、膜内のアスパルチルプロテアーゼγセクレターゼ(γ-secretase)(次の4つのコア成分からなる巨大分子複合体：presenilin, nicastrin, anterior pharynx defective-1 (APH-1), presenilin enhancer-2 (PEN-2))が、APP-C99をAβとAPP細胞内ドメイン(AICD)に分解する(図４参照)。APP-C99の分解にはこの他、Aβを産生しない経路も知られている。
　アルツハイマー病治療のストラテジー開発の中で、APPからのAβ産生を減少させる方法として、従来γセクレターゼ活性の阻害剤が主に用いられてきた。多くの阻害剤が開発されてきたが、それらγセクレターゼ阻害剤の投与では、臨床治験の結果から細胞内APP-C99の蓄積、及びAPPと共に基質となるNotchタンパク質の切断不全によると考えられる副作用として認知症の憎悪や皮膚癌発症頻度の増加が認められることが明らかとなっている。
　特許文献１ではアルツハイマー病のバイオマーカーについて報告されている。具体的には、被験体におけるアルツハイマー病の状態を定性化するための方法に関する発明であって、当該方法は、（ａ）該被験体由来の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定する工程であって、該少なくとも１つのバイオマーカーは、サポシンD（Ｉ）、サポシンD（ＩＩ）、サポシンD（ＩＩＩ）及びFAM3C（Ｉ）から選択される、工程；ならびに（ｂ）該測定結果をアルツハイマー病の状態と関連付ける工程、を包含することを特徴としている。
　しかしながら、特許文献１では、4種のタンパク質をアルツハイマー病のバイオマーカーとして使用することが記載されているだけであって、その他の用途については記載されていない。
特表2008-537143号公報
　本発明は、Aβ産生を減少させるが、Notch切断を阻害しないタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明は、Aβ産生を減少させるが、Notch切断を阻害しないタンパク質の発現レベルを増加させる化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明は、Aβ産生を減少させるが、Notch切断を阻害しないタンパク質と類似の活性を有する化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、APP-C99の非Aβ産生経路による分解を促進することによりAβ産生を減少させる活性を示すタンパク質としてILEI (interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer) (別名 family with sequence similarity 3, member C (FAM3C))を同定した。このような活性は特異であるとともに、ILEIは分泌タンパク質であり、培養動物細胞によって作製した組換え体のILEIタンパク質が細胞の外側から作用することにより同様の活性によって培養細胞のAβ産生を用量依存的に減少させることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の医薬組成物、スクリーニング方法並びに治療及び／又は予防方法を提供するものである。
　(I) 医薬組成物
(I-1) ILEI、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物。
(I-2) アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、(I-1)に記載の医薬組成物。
(I-3) アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物の製造における、ILEI、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターの使用。
　(II) スクリーニング方法１
(II-1) 以下の工程を含む、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法：
(1) ILEIを発現する細胞に候補となる化合物を接触させる工程、及び
(2) 候補となる化合物が存在しない場合と比較し、ILEIの発現レベルを増加させる化合物を選択する工程。
(II-2) アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、(II-1)に記載のスクリーニング方法。
　(III) スクリーニング方法２
(III-1) 以下の工程を含む、ILEIと類似の活性を有する、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法：
(1) アミロイドβタンパク質を産生する細胞に候補となる化合物を接触させる工程、及び
(2) 候補となる化合物が存在しない場合と比較し、Notch切断を阻害せず、アミロイドβタンパク質産生を減少させ且つAPP-CTF (amyloid-β precursor protein C-terminal fragment)を減少させる化合物を選択する工程。
(III-2) アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、(III-1)に記載のスクリーニング方法。
　(IV) 治療及び／又は予防方法
(IV-1) ILEI、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを投与することを特徴とするアミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防方法。
(IV-2) アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、(IV-1)に記載の治療及び／又は予防方法。
　本発明の医薬組成物は、細胞の外側から作用し、APP-C99を選択的に減らすことにより細胞のAβ産生を減少させながら、Notch切断を阻害しないという優れた効果を有する。それ故、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患(特にアルツハイマー病)の進行を予防及び治療することができる上に、γセクレターゼ阻害剤の投与で認められた副作用を回避することが可能である。
　また、ILEIを利用することで、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患(特にアルツハイマー病)の進行を予防及び治療するための化合物のスクリーニングも可能となる。
試験例１の結果を示すグラフである。(a)及び(b) 黒: Aβ40、グレー: Aβ42、**: コントロール又はmockに対するp < 0.01 (c) 示されたイムノブロットは3回の独立した実験の代表的なものである。**: コントロールに対するp < 0.01 試験例２の結果を示すグラフである。*: p < 0.05、**: p < 0.01 試験例３の結果を示す図である。(b) FL: full-length、Sec: secreted form (c)黒: Aβ40、グレー: Aβ42、*: WTに対するp < 0.05、**: WTに対するp < 0.01 APPからのAβ産生経路を示す図である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明において、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患としては、アルツハイマー病の他、ダウン症候群が挙げられる。
　ILEI
　本発明者らは、γセクレターゼ複合体に結合するタンパク質をスクリーニングし、その一つとしてILEIを同定した。そして、培養細胞に用いた解析から、当該ILEIが、(i)Aβ産生を減少させる、(ii)γセクレターゼ複合体に結合するが、その活性には影響を与えない、(iii)Aβ産生の中間産物APP-C99の細胞内レベルを減少させる、(iv)Notch切断を阻害しない、(v)トランジェニック技術によりマウスに強制発現させると脳Aβを減少させること等を見出した。
　ILEIは、4へリックスバンドル構造を有するサイトカイン様構造に対するデータベース検索で同定された分泌型タンパク質であり、進化的によく保存されている。ILEIは、翻訳後に全長前駆体タンパク質のシグナル配列が切断され分泌小胞の膜から遊離される。
　本明細書において「ILEI」とは、特に記載が無い限りタンパク質のことを意味する。
　ILEIのアミノ酸配列としては、配列番号１に記載されるものが挙げられる(GenBank Accession No.NP_055703)。配列番号１の1～24位はシグナルペプチドであり、成熟タンパク質は配列番号１の25～227位のアミノ酸配列からなるタンパク質である(配列番号２)。
　本発明におけるILEIは、全長タンパク質及び成熟タンパク質のいずれも包含するものである。
　本発明において、ILEIは、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の生物学的活性を有するものであれば、配列番号１又は２で表されるタンパク質の変異体であってもよい。
　変異体としては、例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、1又は2以上、例えば1～50個、1～25個、1～12個、1～9個、1～5個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる。
　ILEIは、APP-C99を選択的に減らすことにより細胞のAβ産生を減少させることができる上に、Notch切断を阻害しないという従来報告がない極めて特異な生物活性を有している。また、ILEIは、細胞の外側から作用することが可能である。
　医薬組成物
　本願発明は、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物であって、ILEI、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含むことを特徴とする。
　ILEIとしては、シグナル配列が無い成熟タンパク質を使用することが望ましい。
　ILEIは、公知のタンパク質の製造方法に従い製造することができ、例えば、公知の遺伝子配列の情報を利用して遺伝子を取得し形質転換体を作製することにより生産することができる。生産したILEIの精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩折法等により行うことができる。
　ベクターを使用する場合は、シグナル配列を有する分泌型のILEIをコードするポリヌクレオチドを用いることが望ましい。分泌されたILEIは、細胞の外側から作用することによってAβの産生を抑制することが可能である。ILEIをコードするポリヌクレオチドは、公知のポリヌクレオチドの製造方法に従い製造することができ、例えば、ILEI遺伝子の配列情報に基づいてポリヌクレオチドを化学合成することや、ILEI遺伝子を増幅することができるプライマーを使用し相補的DNA(cDNA)を鋳型とするPCRにより製造することができる。ベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。ベクターの投与は、in vivo又はex vivoの何れであってもよい。
　本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対して投与される。本発明の医薬組成物の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、経口的又は非経口的に投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、静脈、動脈、脳脊髄液若しくは脳室内への注射又は点滴、経皮的投与等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、ヒトへの投与に適した医薬上許容される形態であって、生理学的に許容し得る添加剤を含む。かかる組成物は、適宜、医薬として許容し得る希釈剤、緩衝剤、可溶化剤(例えば、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、あるいはTween、プルロニック、クレモフォール、リン脂質などの界面活性剤)、無痛化剤等を添加してもよく、更に必要に応じて、医薬として許容し得る溶剤、安定化剤又は酸化防止剤(例えばアスコルビン酸等)のような成分を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物の投与方法、投与形態等は、ILEIが標的となる細胞周囲においてAβの産生を有効に抑制する濃度となるように適宜選択される。本発明の医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、及び疾患の程度により適宜選択される。
　本発明の医薬組成物におけるILEIの含量は、0.01～100重量%、好ましくは0.1～100重量%の範囲から適宜選択することが可能である。
　本発明の医薬組成物は、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患(特にアルツハイマー病)の進行を予防及び治療することができる。さらには、ILEIがNotch切断を阻害しないことから、γセクレターゼ阻害剤の投与で認められた副作用を回避することができる。
　スクリーニング方法１
　本発明のアミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
(1) ILEIを発現する細胞に候補となる化合物を接触させる工程、及び
(2) 候補となる化合物が存在しない場合と比較し、ILEIの発現レベルを増加させる化合物を選択する工程。
　上記細胞としては、ILEIを発現するものであれば特に限定されないが、例えば、ILEI遺伝子が導入された細胞等が挙げられる。
　候補となる化合物も特に制限なく使用でき、例えば、低分子化合物、高分子化合物、生体高分子(タンパク質、核酸、多糖類等)等が挙げられ、このような化合物を含む種々の化合物ライブラリーを使用することができる。
　候補となる化合物を細胞に接触させた場合のILEIの発現レベルを、候補となる化合物が存在していない場合と比較し、10%以上、好ましくは25%以上、より好ましくは50%以上、更に好ましくは75%以上増加していた場合、当該化合物をアミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び予防に有効なものとして選択できる。
　ILEIの発現レベルを検出する方法としては、ILEIをコードするmRNA、又はILEI自体を検出することにより行う。生体試料中からのmRNA又はタンパク質の抽出は常法に従い行うことができる。
　mRNAを検出する方法としては、mRNAを定量できる方法であれば特に限定されないが、例えば、DNAチップ法、realtime PCR法、ノーザンブロット法等が挙げられる。ここでのmRNAを検出する方法は、mRNAに対応するcDNAを検出することも含む。
　タンパク質を検出する方法としては、タンパク質を定量できる方法であれ特に限定されないが、例えば、ELISA法、プロテインチップ、ウェスタンブロッティング法による解析法等が挙げられる。
　上記方法により選択される、ILEIの発現を増加させることができる化合物は、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患(特に、アルツハイマー病)の治療及び予防に有効であり得る。
　スクリーニング方法２
　本発明のILEIと類似の活性を有する、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
(1) アミロイドβタンパク質を産生する細胞に候補となる化合物を接触させる工程、及び
(2) 候補となる化合物が存在しない場合と比較し、Notch切断を阻害せず、アミロイドβタンパク質産生を減少させ且つAPP-CTFを減少させる化合物を選択する工程。
　上記細胞及び候補となる化合物については、前述するものと同様である。
　以下の(a)～(b)の条件を全て満たす化合物をアミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び予防に有効なものとして選択できる：
(a) 候補となる化合物を細胞に接触させた場合のアミロイドβタンパク質産生を、候補となる化合物が存在していない場合と比較し、10%以上、好ましくは25%以上、より好ましくは50%以上、更に好ましくは75%以上減少していた場合：
(b) 候補となる化合物を細胞に接触させた場合のAPP-CTFを、候補となる化合物が存在していない場合と比較し、10%以上、好ましくは25%以上、より好ましくは50%以上、更に好ましくは75%以上減少していた場合：
(c) 候補となる化合物を細胞に接触させた場合のNotch切断レベルを、候補となる化合物が存在していない場合と比較し、低下無し、好ましくは10％以上には低下していなかった場合。
　アミロイドβタンパク質及びAPP-CTFを検出する方法としては、これらを定量できる方法であれば特に限定されないが、例えば、ELISA法、プロテインチップ、ウェスタンブロッティング法による解析法等が挙げられる。
　Notch切断レベルを検出する方法としては、例えば、γセクレターゼにより切断されることによって遊離するNICD (Notch intracellular domain)を検出することにより行うことができる。NICDを検出する方法としては、これを定量できる方法であれば特に限定されないが、例えば、ELISA法、プロテインチップ、ウェスタンブロッティング法による解析法等が挙げられる。
　上記APP-CTFは、APPの膜貫通C末端フラグメント(CTF)を意味する。APP-CTFとしては、Aβ産生に直接関わっているためAPP-C99が特に望ましい。
　上記方法により選択される、ILEIと類似の活性を有する化合物は、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患(特に、アルツハイマー病)の治療及び予防に有効であり得る。
　次に本発明に係わる試験例を記載するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
　方法
　＜プラスミド＞
　ストップコドンを持つ又は持たないILEI/FAM3CをコードするcDNAは、ヒト脳cDNAライブラリー(Clontech)からPCRを使用して増幅し、pcDNA6/V5-His (Invitrogen)に挿入した。ILEIノックダウンベクターを構築するために、オリゴヌクレオチド5'-GGAGAAGUAUUAGACACU-3'をpSUP (Oligoengine)に挿入した。siRNA抵抗性ILEIのための発現プラスミドを調製するために、PCRに基づく部位特異的突然変異導入法を使用して5つの中立的変異をILEI cDNAに導入した。全ての構築物の配列は、シークエンシングによって確認した。
　＜抗体＞
　抗ヒトILEIポリクローナル抗体(ILEI-C)は、N末端に追加したCys残基にチログロブリンを結合させたILEIのアミノ酸残基126-143に対応する合成ポリペプチド(C+GGDVAPFIEFLKAIQDGT)に対してウサギで産生させた。この抗体は、固定化抗原を有するイムノアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。次の抗体も使用した：ウサギポリクローナル抗APP-CTF抗体及びマウスモノクローナル抗βアクチン抗体(Sigma); マウスモノクローナル抗Notch-1抗体(AbD Serotec); マウスモノクローナル抗ヒトAβ抗体(4G8, Covance)。
　＜RNA干渉＞
　次のsiRNA二重鎖をDharmaconから購入した：ILEIノックダウンのためのsiGENOME SMART pool M-020514及び非標的コントロールのためのD001210。M-020514 poolは次の配列を標的とする4つの二重鎖からなっていた：F1: 5'-GAACAGCACAUAAAGAACA-3'; F2: 5'-GGAGAAGUAUUAGACACUA-3'; F3:5'-GGAGCACAUCUAUUACUAA-3'; F4: 5'-GAACAAUAAGGAUACAAAC-3'。siRNA二重鎖はリポフェクタミンRNAi MAX (Invitrogen)を使用して培養細胞に導入された。
　＜イムノブロッティング＞
　脳ホモジネートは、1% Nonidet P40を含むバッファー(25 mM HEPES, pH7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, protease inhibitor cocktail及び10%グリセロール)中で溶解した。イムノブロッティングは、以前に報告したように行った(Nishimura, M., et al. Nat Med 5, 164-169 (1999))。
　＜免疫組織化学＞
　マウスの脳の左半分を4℃で24時間、リン酸バッファー4%パラホルムアルデヒド中で固定し、クリオスタットで20μm厚さのフローティングセクションとして切断した。切片は30分間PBS 0.3%H2O2中でインキュベートし、それから24時間4℃で各々の一次抗体と、その後、ビオチン化二次抗体、次にアビジン/ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Vector Laboratories)でインキュベートした。免疫反応は、0.003% H2O2と0.5 mg ml-1硫酸ニッケルアンモニウム六水和物を含む0.03% 3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩を使用して検出した。
　＜ILEI-Tgマウス＞
　遺伝子導入ベクターpMoPrP-ILEIは、神経細胞特異的発現のためのマウスプリオンプロモーターを含むMoPrPベクターのXhoI部位にヒトILEI cDNAのXhoI-XhoIフラグメントをサブクローニングすることによって構築した。遺伝子導入マウスは、標準的な技術を用いてC57BL/6マウス受精卵にpMoPrP-ILEI DNAを注入することによって産生した。初代遺伝子導入個体は、PCRを用いて同定した(下記参照)。遺伝子導入マウスの遺伝型は、次の導入遺伝子特異的プライマー対を使用したPCRによって決定した：mPrP-s 5'-CTGCTCCATTTTGCGTGACTC-3'及びhFAM3C-as 5'-CTTCCAGGCAGATTTTGGGTC-3'。
　＜Aβの測定＞
　細胞からの分泌Aβの測定は、当該細胞培養液を用いヒトAβ40及びAβ42特異的ELISA (和光純薬工業)によった。
　マウス脳のAβ測定については、マウスの脳の右半分をTrisバッファー(20 mM Tris, pH7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA)の4倍量溶液中でモーター駆動Tefron/glassホモジナイザー(10ストローク)を使用してホモジナイズした。ホモジネートは20分間100,000×gで遠心し、上清は可溶性分画として使用した。ペレットは50 mM Tris, pH7.5 6Mグアニジン塩酸塩の1倍量溶液中で短時間の超音波処理によって溶解し、100,000×gで10分間遠心した。上清は12倍に希釈し、不溶性分画として使用した。可溶性及び不溶性分画は、DCプロテインアッセイ(BioRad)、並びにマウス/ラットAβ40及びAβ42特異的ELISA(IBL)に供した。Aβ濃度は、総タンパク質重量あたりのモル濃度で求めた。
　＜統計解析＞
　統計的評価は、スチューデントのunpaired t検定を使用して行った。データは、平均±s.d. (標準偏差)で表している。統計学的有意性は、*p < 0.05又は**p < 0.01で定義した。
　試験例１
　コントロール又はILEI特異的siRNAをHEK293細胞に一過性に形質移入した。培養液中のAβ40(黒)及びAβ42(グレー)をELISAを用いて測定した(図１a)。図１aから、HEK293細胞における内在性ILEIのRNAi媒介ノックダウンにより、制限培地中でAβ40とAβ42レベルが約2倍になるという結果になった。
　Mock又はILEI cDNAをHEK293細胞に一過性に形質移入した。培養液中のAβ40(黒)及びAβ42(グレー)をELISAを用いて測定した(図１b)。図１bから、ILEIの過剰発現が、HEK293細胞によるAβ分泌を減少させた。
　コントロール又はILEI siRNA又はILEI cDNAで形質移入されたHEK293細胞(図中それぞれILEI-k/d、ILEI-oe)を、AICDの分解を防ぐためにNエチルマレイミド(NEM)で60分間処理した。γセクレターゼ阻害剤であるDAPT処理によりAICD産生は抑制された(図中D)。βアクチンは、サンプル量コントロールとして使用した。グラフは、AICDシグナル強度を定量化した結果を示す(n=3)。図１cから、ILEIノックダウンはAICDの生成を増加、ILEI過剰発現はAICD生成を減少させることが示された。
　次に、マウス胎仔繊維芽細胞(MEFs)における内在性Notch-1のγセクレターゼ切断を試験した(図１d)。MEFのEDTA (1.5mM)での処理は、TMIC (transmembrane/intracellular Notch)の切断を誘導し、NEXT (Notch extracellular truncation)を生成する。NEXTはさらにγセクレターゼによって切断され、NICD (Notch intracellular domain)を遊離する。NICDの生成は、DAPT (1μM)によって阻害された。βアクチンは、サンプル量コントロールとして使用した。グラフは、NICDシグナル強度を定量化した結果を示す(n=3)。図１dから、ILEIノックダウンは、EDTAの存在でNICDの生成に変化を与えなかった。これらの結果は、ILEIがγセクレターゼによるNotch切断に影響を与えないことを意味している。
　試験例２
　安定的にILEIをノックダウンしたHEK293細胞の培養液中に、示された濃度(μg ml-1)の精製ILEI-Hisを添加した。結果を図２に示す。精製ILEI-Hisの投与は、用量依存的にAβ分泌を減少させた。濃度7μg ml-1では、siRNA抵抗性ILEI cDNAの導入と同程度にAβ分泌を減少させた。
　試験例３
　哺乳類の脳におけるILEI過剰発現の結果を分析するため、脳でヒトILEI cDNA導入遺伝子の発現を顕著に促進するためにマウスプリオン(PrP)プロモーターを使用したトランスジェニック(Tg)マウスを開発した。ヘテロ接合性のTgマウスは、形態異常が無く通常の成長及び生殖能力を示した。
　図３aでは、免疫組織化学により、ILEIが野生型とILEI-Tgマウスの脳の大脳皮質と海馬の神経細胞において発現されていることが示された。野生型のマウスと同様に、ILEI発現はTgマウスの脳の神経細胞に限定された。
　6週齢のILEI-Tgマウスとその野生型同腹仔の脳ホモジネートをイムノブロッティングに供した。βアクチンは、サンプル量コントロールとして分析した。脳ホモジネートのイムノブロッティングにより、野生型の同腹仔と比べてTgマウスの脳でILEIタンパク質レベルが約3倍に増加していることが示された(図３b)。また、Tgマウスの脳におけるAPP-CTFレベルは30%減少すること、及びNICDレベルには変化がないことが明らかになった(図３b)。
　脳ホモジネートのTris緩衝生理食塩水への可溶性及び不溶性分画のAβ40 (黒)とAβ42 (グレー)をELISAを使用して測定した(8月齢、n=5)。両方の分画のマウスAβ40及びAβ42レベルは、野生型の同腹仔コントロールと比べてILEI-Tgマウスで有意に減少していた(図３c)。これらの結果は、過剰のILEIはマウス個体の脳においてAPP-CTF蓄積とAβ産生を抑制する一方で、Notch切断を阻害しないことを示唆した。

Claims (7)

  1. 　ILEI (interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer)、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防用の医薬組成物。
  2. 　アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　以下の工程を含む、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法：
    (1) ILEIを発現する細胞に候補となる化合物を接触させる工程、及び
    (2) 候補となる化合物が存在しない場合と比較し、ILEIの発現レベルを増加させる化合物を選択する工程。
  4. 　アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、請求項３に記載のスクリーニング方法。
  5. 　以下の工程を含む、ILEIと類似の活性を有する、アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患を治療及び／又は予防するための化合物のスクリーニング方法：
    (1) アミロイドβタンパク質を産生する細胞に候補となる化合物を接触させる工程、及び
    (2) 候補となる化合物が存在しない場合と比較し、Notch切断を阻害せず、アミロイドβタンパク質産生を減少させ且つAPP-CTF (amyloid-β precursor protein C-terminal fragment)を減少させる化合物を選択する工程。
  6. 　アミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患がアルツハイマー病である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
  7. 　ILEI、又はILEIをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを投与することを特徴とするアミロイドβタンパク質が異常に蓄積する疾患の治療及び／又は予防方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020051749A (ja) * 2018-09-21 2020-04-02 国立大学法人滋賀医科大学 血液検体を用いたｍｃｉ及び認知症の補助診断方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002063009A2 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 Eli Lilly And Company Lp mammalian proteins; related reagents
WO2006113289A2 (en) * 2005-04-19 2006-10-26 Vermillion, Inc. Saposin d and fam3c are biomarkers for alzheimer's disease
WO2011100197A1 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating glucose metabolism disorders

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003530437A (ja) * 2000-04-13 2003-10-14 マヨ ファウンデーション フォー メディカル エデュケーション アンド リサーチ Ａβ４２低下物質
JP2003169699A (ja) * 2001-12-10 2003-06-17 Japan Science & Technology Corp 特異的γプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法
US7312079B1 (en) * 2005-10-06 2007-12-25 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Variants of FAM3C

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002063009A2 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 Eli Lilly And Company Lp mammalian proteins; related reagents
WO2006113289A2 (en) * 2005-04-19 2006-10-26 Vermillion, Inc. Saposin d and fam3c are biomarkers for alzheimer's disease
WO2011100197A1 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating glucose metabolism disorders

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020051749A (ja) * 2018-09-21 2020-04-02 国立大学法人滋賀医科大学 血液検体を用いたｍｃｉ及び認知症の補助診断方法
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