JP6336909B2 - 神経変性疾患の診断、予後予測又は治療の方法 - Google Patents
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Description
臨床的には、ADは、記憶形成の早期欠損に関係し、究極的には高次認知機能の完全な低下に至る進行性疾患である。認知障害としては、とりわけ、記憶障害、失語症、健忘及び遂行機能の喪失が挙げられる。ADの病状の特性は、変性プロセスに対する特定脳領域及び神経細胞亜集団の選択的脆弱性である。具体的には、この疾患の進行の間、皮質側頭葉領域及び海馬が早期に、そしてより重篤に影響を受ける。他方、小脳のような他の脳領域のニューロンは、ほとんど無傷のままであり、神経変性から保護される(Annals of Neurology 1981, 10:184-192)。現在、ADの治療法は存在しないし、その進行を止める有効な治療も存在しない。ADの生前診断は、血液又は血漿サンプルでは依然として不可能であり、不幸にも他のタウオパチーからの鑑別的AD診断を単独で達成できる、現在利用可能な脳脊髄液(CSF)中のバイオマーカーはない。
ADの第2の特徴としてはタウタンパク質が挙げられる。これは、アルツハイマー病患者の脳内で、異常にリン酸化され凝集して対合螺旋状フィラメント(paired helical filament;PHF)及び神経原線維もつれ(NFT)を形成する(Iqbal K, Liu F, Gong CX, Grundke-Iqbal I. Tau in Alzheimer disase and related tauropathies. Curr Alzheimer Res Dec;7(8):656-664)。脳内でのタウタンパク質異常リン酸化並びにNFT形成及び蓄積は、この疾患の病理学的、生化学的及び臨床的進行と直接相関付けられることが示されている。ADの予後、早期診断及び関連するタウオパチーからの鑑別診断についての大いなる関心のために、ADに特徴的な予後予測用で且つ特異的なマーカーは発見が望まれている(CSF、血漿、唾液又は他の容易に取得可能な体液)。
ADのバイオマーカー探索は、近年、顕著に進展してきた。体液(例えば、脳脊髄液(CSF)、血漿及び尿)は、ADバイオマーカー開発に重要な供給源と考えられる。しかし、今日まで、CSFのみが、脳細胞外空間との直接的接触に起因して、脳内で起こる生化学的変化を反映し得る。今までは、3つのCSFバイオマーカーAβ42、総タウ(t-タウ)及びリン酸化-タウ(p-タウ)が、高い診断能力を有すると判明している(de Souza LC ら;J Neurol Neurosurg Psychiatry;82(3):240-6)。タウは、通常、細胞内タンパク質であると考えられているにもかかわらず、疾患の場合、過リン酸化タウは、細胞外及び脳脊髄液(CSF)中に見出される。炎症及び酸化ストレスのバイオマーカーも他の供給源として挙げられる。不運にも、現在利用可能なバイオマーカーはいずれも、単独でこの疾患の診断を達成できず、2以上のバイオマーカーを同時にモニターすることが、疾患進行を検出するに適切であると示唆されている(Anoopら,International Journal of Alzheimer's Disease 2010)。
Paquetのタウオパチーモデルは、第17染色体に連関したパーキンソン症候群を伴うFTD(脳における高レベルの異常リン酸化タウの産生によって特徴付けられるタウオパチーである)の患者に見出される、タウをコードする遺伝子MAPTにおけるタウ-P301L変異を再現する(FTDP-17)。Paquetは、新たに設計したGal4-上流活性化配列ベース(Gal4/UASベース)のベクター系(これはまた、同時に発現する蛍光レポーターによるトランスジェニックサカナの同定を大いに容易にする)により、ゼブラフィッシュニューロンにおけるヒトタンパク質のトランスジェニック発現を最適化した。
本発明の別の1つの目的は、組織、CSF又は血液中の3-O-スルホトランスフェラーゼ2若しくは4の遺伝子若しくはタンパク質又はグリカン産物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断又は予後予測する方法を提供することである。
本発明の別の1つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断又は予後予測する前記方法を実施するためのキットを提供することである。
本発明の別の1つの目的は、3-OST-2及び/又は-4遺伝子の発現レベルを減少させるか、又は前記遺伝子若しくはその産物の活性を阻害する化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
本発明の更に別の1つの目的は、ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベルを減少させる化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
本発明の更に別の1つの目的は、グルコサミン残基の3位で硫酸化したヘパラン硫酸のレベルを減少させる化合物により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法を提供することである。
本発明の更に別の1つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターのインビトロスクリーニング方法を提供することである。
本発明の更に別の1つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターのインビボスクリーニング方法を提供することである。
本発明の更に別の1つの目的は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防に使用し得る組成物を提供することである。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに、参照値と比較して、直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなる、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)の治療又は予防に使用するための組成物に関する。
上記標的の少なくとも1つ、すなわち前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物及び/又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖及び/又はタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルに影響し得る2以上の異なる剤もまた理解されるべきである。
用語ヘパリン硫酸又はヘパラン硫酸又はHSを使用することができ、これらは同義である。
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖は、ヘパラン硫酸のヘパリナーゼI〜III消化後に得られる。
用語ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ(2又は4)又はヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ(2又は4)は同義である。両酵素は、3-OST-2及び3-OST-4又は3OST2及び3OST4、HS3ST2及びHS3ST4、h3-OST-2及びh3-OST-4;ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ2;ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ4;ヘパラン硫酸D-グルコサミニル 3-O-スルホトランスフェラーゼ2;ヘパラン硫酸D-グルコサミニル 3-O-スルホトランスフェラーゼ4;ヘパラン硫酸グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2;ヘパラン硫酸グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ4とも呼ばれる。
プリオン病は、本発明の範囲には含まれない。
表現「ヘパラン硫酸」とは、タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸及びタウタンパク質に結合しないヘパラン硫酸を含む総ヘパラン硫酸をいう。
特に、タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸は、本質的に、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸からなる。
総タウタンパク質は、リン酸化タウタンパク質(凝集しているもの又はしていないもの)及び非リン酸化タウタンパク質を意味する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに、参照値と比較して、直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、前記剤が以下:
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響するとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が前記剤により影響されるか、
又は、前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも1つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた影響される、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)の治療又は予防に使用するための組成物に関する。
−a)、b)、c)又はd)から選択される1つの要素のみ(したがって、e)のみ又はf)のみの活性及び/又はレベルは排除されることを意味する);
−以下の組合せから選択される2つの要素:a-b、a-c、a-d、a-e、a-f、b-c、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e、c-f、d-e、d-f又はe-f;
−以下から選択される3つの要素:a-b-c、a-b-d、a-b-e、a-b-f、a-c-d、a-c-e、a-c-f、a-d-e、a-d-f、a-e-f、b-c-d、b-c-e、b-c-f、b-d-e、b-d-f、b-e-f、c-d-e、c-d-f又はd-e-f;
−以下から選択される4つの要素:a-b-c-d、a-b-c-e、a-b-c-f、a-c-d-e、a-c-d-f、a-d-e-f、b-c-d-e、b-c-d-f、c-d-e-f;
−以下から選択される5つの要素:a-b-c-d-e、a-b-c-d-f、a-b-d-e-f、a-c-d-e-f;
−以下から選択される6つの要素:a-b-c-d-e-f
の活性及び/又はレベルに影響する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び
d)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び
d)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
e)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び
d)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
タウオパチーでは、タウタンパク質の異常リン酸化は、タウタンパク質遺伝子における変異又は欠失の結果であり、3-OST-2及び-4遺伝子の発現は変化しない。
1つの有利な実施形態において、本発明は、以下:
a)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び、
b)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
1つの有利な実施形態において、その活性及び/又はレベルが(タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルにも影響する)前記少なくとも1つの剤により影響される前記ヘパラン硫酸とは、タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸をいう。
a)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び
b)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
c)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び
b)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
c)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がタウオパチー、特にアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び
d)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を含んでなり、神経変性疾患がアルツハイマー病である、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
a)約2000ダルトン〜約20,000ダルトン、好ましくは約20,000ダルトンの分子量を有する多糖又はオリゴ糖、特にヘパラン硫酸模擬体、例えばF6分子、D6、D4、E5、CR36、HM 100若しくはHM 2602、又はフコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、又は特にペンタサッカリド、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリン、及び/又は
b)オリゴヌクレオチド、特にsiRNA、例えば配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストより選択されるsiRNA、又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び/又は
c)小分子、ヘパリン及びヘパラン硫酸作用のインヒビター、例えばプロタミン又は硫酸プロタミン
からなる群より選択される、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
このようなグリカンは、単独で又は好ましくは他の療法、例えば遺伝子療法と組み合わせて投与することができる。標的遺伝子の内因性多糖又はオリゴ糖産物を模倣し及び/又はこれと競合し及び/又はこれと置き換わることができる生物学的に活性な硫酸化多糖又はオリゴ糖誘導体の製造は報告されている(WO00/05270)。この製造方法としては、種々のサイズのデキストラン、セルロース又は他のグリカン若しくはポリアルコールにカルボキシレート及び/又はスルフェート及び/又は疎水性部分を導入することが挙げられる(WO00/05270)。
多糖又はオリゴ糖はまた、低分子量のヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、又は超低分子量ヘパリンであり得る。
nは1〜10,000、特に1〜200の間の整数を表し、
Rは、SO3 -、CH2CO2又は-CH2CONHX(ここで、NHXは、直鎖又は分岐鎖のC1〜C10アルキルアミン、特にn-オクチルアミン又はt-オクチルアミン、ベンジルアミン、カルボン酸部分でアルキル又はベンジルでエステル化されているか又はされていないアミノ酸(L、D又はラセミ)、特にL-フェニルアラニンメチルエステル(L-Phe(OMe))又はL-チロシンメチルエステル又はL-ヒスチジンメチルエステル又はそれらの対応するD-アナログを表す)を表す)。
HMは、Papy-Garciaら(Papy-Garcia Dら,Macromolecules, 2005, 38, 4647-4654)に記載されているように、種々の分子量を有するデキストラン分子、特にデキストランT40、T10又はT5(それぞれ、MW=40000、10000又は5000)から製造することができる。
nが1〜50、特に1〜40、特に1〜30、特に1〜20、特に1〜10の間の整数を表し、
Rが、上記のとおりであり、ここで、NHXはベンジルアミン又はアミノ酸、例えばL-Phe(OMe)であり、
置換度が以下:0.2〜1.5CM、0〜0.5(ベンジルアミン又はAA)、0.2〜1.5S(ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(20〜150%含量が可能);ベンジルアミン又はAA(アミノ酸)に相当する(0〜50%置換が可能))である上記式(I)をいう。
− F6分子(T5から製造、NHX=L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する:
0.61CM、0.15L-Phe(OMe)、0.7S
− D4分子(T10から製造)、これは以下の置換度を有する:
0.75CM、0.2S;
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(75%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(20%;20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は0%で存在する(0〜50%置換が可能)
− E5分子(T10から製造)、これは以下の置換度を有する:
0.5CM、1.0S
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(50%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(100%;20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は0%で存在する(0〜50%置換が可能)
− D6分子(T0.5から製造、NHX=L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する:
0.60CM、0.2L-Phe(OMe)、1.2S
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(60%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(120%;20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は20%で存在する(0〜50%置換が可能)
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(61%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(70%;20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は15%で存在する(0〜50%置換が可能)
0.59CM、0.22L-Phe(OMe)、0.83S
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(59%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(83%;20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は22%で存在する(0〜50%置換が可能)
− HM100(フコイダン) 0.50CM、0.20Ac、1S(Ac=アセテート基)
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(50%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(100%;20〜150%含量が可能);アセテート基は10%で存在する(0〜50%置換が可能)
− HM 2602(T40から製造、NHX=ベンジルアミン)、これは以下の置換度を有する
0.88CM、0.20ベンジルアミン、0.66S
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(88%;20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(66%;20〜150%含量が可能);ベンジルアミド基は20%で存在する(0〜50%置換が可能)。
具体的には、前記ペンタサッカリドは、以下の式のArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)である:
よって、前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、タウオパチー及びアルツハイマー病を治療し得る。
前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、約1.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により、又は別の経路、例えば経口経路により約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgの用量で、又はi.vで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
1つの有利な実施形態において、前記多糖、オリゴ糖又はペンタサッカリドは、約100mg〜約3.5gの間の日用量で静脈内経路により、又は別の経路、例えば経口経路により約3.5g〜約50g、特に7.5〜15gの日用量で、又はi.pなどで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
よって、前記遺伝子の転写は、当初の値の少なくとも50%減少するか、又は完全にブロックされ、翻訳も同様であり、3-OST-2及び-4レベルの減少をもたらし、よって異常リン酸化タウタンパク質の減少をもたらす。
小ヘアピンリボ核酸(shRNA)は、リンカーにより連結されたセンス鎖及びアンチセンス鎖のsiRNAを含んでなる二本鎖分子である。これら分子はヘアピンを形成し、リンカーが除去されてsiRNAが遊離される。
1つの有利な実施形態において、前記shRNAは、該shRNAの発現を可能にする核酸配列を含んでなるベクター中に含まれる。
アルツハイマー病の治療はまた、第1療法として遺伝子療法を、第2療法として細胞回復を誘導する細胞外媒体のヘパリン模擬体による保護を含んでなる二重療法で行うことができる。
前記オリゴヌクレオチドは、0.1〜1mMの用量、特に0.5mMで、静脈内経路又は脳室内経路により投与することができる。
前記オリゴヌクレオチドはまた、別の経路、例えば経口経路、i.p.経路などにより、当該経路に適切な投薬量で投与することができる。
プロタミン又は硫酸プロタミンはアルギニンに富む小さい核タンパク質であり、静脈内投与後に即時に作用するヘパリンのアンタゴニストである。
他の3-O-硫酸化インヒビター又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼインヒビター、特にRazi, Nら(J Biol Chem 1995, 270, 11267-75);Rath, V. L.ら(Drug Discov Today 2004, 9, 1003-11)又はSeko, A.ら(J Inorg Biochem 2009, 103, 1061-6)に記載のものを、この実施形態において使用することができる。
US20100048638に記載されるヘパラン硫酸及びヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼのインヒビターもまた使用することができる。
前記少なくとも1つの剤が、以下:
a)上記式(I)のヘパラン硫酸模擬体、特に式(II)のヘパラン硫酸模擬体、特にF6分子、CR36、HM 100又はHM 2602、又はフコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、又はペンタサッカリド、例えばArixtra(登録商標)(フォンダパリヌクス)、フコイダン若しくはペントサンポリ硫酸、及び/又は低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン(Lovenox(登録商標))、及び/又は超低分子量ヘパリン、及び/又は
b)siRNA、例えば配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストより選択されるsiRNA、又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び/又は
c)小分子、プロタミン又は硫酸プロタミンからなる群より選択されるヘパリン及びヘパラン硫酸作用のインヒビター
からなる群より選択される、神経変性疾患の治療又は予防に使用する上記組成物に関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリングルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から事前に得た生物学的流体サンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物及び/又は前記ヘパラン硫酸、特に前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又は前記タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するためのインビトロ方法に関する。
このように、配列番号1及び3で示される遺伝子の一方又は両方のレベル及び/又は活性が上昇しており、また、前記遺伝子の転写産物の一方又は両方のレベル及び/又は活性も、同様に前記遺伝子の翻訳産物、すなわち、配列番号2及び4で示されるタンパク質の一方又は両方のレベル及び/又は活性も上昇している。
3-OST-2及び-4は、ヘパラン硫酸の3-O-硫酸化を担うので、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベルもまた高度に上昇し、タウタンパク質の異常リン酸化をもたらすタウタンパク質の立体構造変化が誘導される。
よって、これら構成要素の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が生物学的流体において参照値と比較して上昇していることの検出により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又はアルツハイマー病とは異なるタウオパチーの診断又は予後予測がもたらされる。
好適な実施形態において、HS3ST2及び/又はHS3ST4をコードする遺伝子の転写産物レベルの測定は、対象者から得たサンプルにおいて、対象者サンプルから抽出したRNAの逆転写により得たcDNAから該遺伝子特異配列を増幅するプライマーの組合せを使用して定量的PCR分析で行う。プライマーの組合せは本発明の「実施例」に示されるが、本発明に開示した配列から作製される他のプライマーもまた使用することができる。前記遺伝子に特異的なプローブを用いるノーザンブロットもまた適用可能である。チップベースのマイクロアレイ技術により転写産物を測定することが好適であり得る。これら技法は当業者に公知である(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001;Schena M., Microarray Biochip technology, Eaton Publishing, Natick, MA, 2000を参照)。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病を含むタウオパチーである上記インビトロ方法に関する。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患が上記タウオパチーであり、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルがそれぞれの参照値に比べて少なくとも10%上昇しているインビトロ方法に関する。
参照値は、種々の形態をとり得る。参照値は、単一のカットオフ値、例えばメジアン若しくは平均、又は集団の75分位、90分位、95分位若しくは99分位であり得る。参照値は、比較群に基づいて確立することができ、例えば、或る規定群におけるリスクは別の規定群におけるリスクの2倍であるという具合である。参照値は範囲であり得、例えば検査集団は幾つかの群(例えば、低リスク群、中リスク群及び高リスク群)に等分(又は不等分)されるか、又は四等分される(第1四分位はリスクが最も低い個体群であり、第4四分位はリスクが最も高い個体群である)。
所定値は、選択した特定の集団の間で、習慣、民族性、遺伝学などに依存して変化し得る。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化は参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は、参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は、前記それぞれの参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパラン硫酸グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から事前に得た生物学的流体サンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
但し、測定された活性及び/又はレベルが以下:
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも1つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定され、
前記遺伝子及び/又は前記転写産物及び/又は前記翻訳産物及び/又は前記ヘパラン硫酸、特に前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸及び/又は前記タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するためのインビトロ方法に関する。
−a)、b)、c)又はd)から選択される1つの要素のみ(したがって、e)のみ又はf)のみの活性及び/又はレベルは排除されることを意味する);
−以下の組合せから選択される2つの要素:a-b、a-c、a-d、a-e、a-f、b-c、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e、c-f、d-e、d-f又はe-f;
−以下から選択される3つの要素:a-b-c、a-b-d、a-b-e、a-b-f、a-c-d、a-c-e、a-c-f、a-d-e、a-d-f、a-e-f、b-c-d、b-c-e、b-c-f、b-d-e、b-d-f、b-e-f、c-d-e、c-d-f又はd-e-f;
−以下から選択される4つの要素:a-b-c-d、a-b-c-e、a-b-c-f、a-c-d-e、a-c-d-f、a-d-e-f、b-c-d-e、b-c-d-f、c-d-e-f;
−以下から選択される5つの要素:a-b-c-d-e、a-b-c-d-f、a-b-d-e-f、a-c-d-e-f;
−以下から選択される6つの要素:a-b-c-d-e-f
からなる。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される前記遺伝子、及び
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の前記転写産物、及び
c)配列番号2及び4でそれぞれ示される前記遺伝子の前記翻訳産物、及び
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と実質的に同じであり、
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも10%上昇している上記インビトロ方法に関する。
よって、上記他の構成要素のいずれについても上昇したレベル及び/又は活性が検出されず、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のみが検出されることで、アルツハイマー病以外のタウオパチーの鑑別的診断及び/又は予後予測が可能になる。
表現「実質的に同じ」は、測定レベルが、選択した特定の集団の間での、習慣、民族性、遺伝学などに依存する個体変動に起因して、参照値に対して変動し得ることを意味する。したがって、測定レベルは、参照値の±10%、±5%又は±2.5%であり得る。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇している上記インビトロ方法に関する。
この実施形態において、3-OST-2遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-4遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
この実施形態において、3-OST-4遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-2遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
1つの有利な実施形態において、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
この実施形態において、3-OST-2及び3-OST-4遺伝子の両方が前記疾患に関与している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、
配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50%上昇しており、及び/又は
配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇しており、
ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100%上昇している。
参照値は基礎レベルであると考えると、アルツハイマー病における前記レベルは海馬及び皮質において少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して100%上昇している。
配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50%上昇しており、及び/又は
配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇しており、
タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
幾つかの硫酸化グリコサミノグリカン及び模擬体は、タウに結合することができ、これらには、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及び他の化学合成の硫酸化多糖、例えばデキストラン硫酸及びペントサン硫酸が含まれる。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150%以上上昇している。
コントロールヒト海馬中のヘパラン硫酸の基礎レベルは、Huynhら(Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)に記載されるジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイで測定するとき、約0.5μg/mg湿潤組織である。
よって、参照値は基礎レベルであると考えると、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は、アルツハイマー病において、海馬で50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150%以上上昇している。
配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50%上昇しており、及び/又は
配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇しており、
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベルが参照値と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
アルツハイマー病における前記上昇は、海馬、皮質、CSF及び血液で観察される。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150%以上上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150%以上上昇している。
これらは、異常リン酸化がタウタンパク質遺伝子中の変異の結果である他のタウオパチーでは、存在しないか、ADより低いレベルで存在するはずである。よって、テトラS及びトリS二糖の検出は、タウオパチーとAD(変異依存性タウリン酸化を伴うものを含む)との間の鑑別的診断及び/又は予後予測に使用することができる。
配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50%上昇しており、及び/又は配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇しており、及び/又はヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベルがそれぞれの参照値と比較して少なくとも10%上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
アルツハイマー病において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベルは上昇しており、総タウタンパク質のレベルも同様である。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物、及び
d)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
e)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と比較して上昇している上記インビトロ方法に関する。
アルツハイマー病には、タウタンパク質の異常リン酸化だけでなく、3-OST-2及び/又は3-OST-4遺伝子、前記遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、ヘパラン硫酸、特にタウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸もまた関与している。
このことにより、タウオパチー間の鑑別的診断及び/又は予後予測が可能になる。
よって、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性及び上記他の構成要素の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が上昇していることを検出することにより、アルツハイマー病の診断及び/又は予後予測が可能になる。
実施例は、GSK-3βによるタウタンパク質のリン酸化がキナーゼ反応媒体に使用する多糖又はオリゴ糖中の3-O-スルフェート基の存在に依存することを具体的に示す。更に、本発明は、使用したヘパリン様物質のいずれかに結合するのはGSK-3β酵素ではなく、タウタンパク質自体であることを示し、立体構造変化によりリン酸化部位がキナーゼ活性に提示されることを示唆する。よって、3-O-硫酸化HSは、タウタンパク質と相互作用して、キナーゼの存在下で、そのリン酸化を調節する。
前記活性及び/又はレベルはまた、前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型のものであり得ることに留意すべきである。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
a)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
b)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも10%上昇しており、前記ヘパラン硫酸は、リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウに、少なくとも10%の比で結合し得る上記インビトロ方法に関する。
本発明者らは、タウオパチー、特にアルツハイマー病において、ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖の活性及び/又はレベル並び印タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルがCSFで上昇しているだけではなく、CSFに存在するHSも総タウに結合する最高能力を有し、よってタウオパチー、特にアルツハイマー病を表すことを更に見出した。
タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は、基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は、基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、
ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖の活性及び/又はレベルは、基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、
リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウに結合し得るHSの比は、10%〜100%の間であり、特に少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%である。
ヘパリナーゼI、II及びIII消化により得られる3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖は、例えば、以下の化合物に相当する(これらに限定されない):
1つの有利な実施形態において、上記のリストから選択される二糖の少なくとも1つが、アルツハイマー病を有する患者の血漿中に存在する;特に、下記の2つの二糖の少なくとも1つが血漿中に存在する。
配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、
のレベル及び/又は活性を、対象者から得た生物学的流体サンプルにおいて認識・検出し、前記サンプルで得られた前記レベル及び/又は活性を、既知の疾患又は健康状態を表すコントロールで得られたものと比較する手段からなる、対象者における神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は前記疾患を発症する対象者の性向若しくは素因を決定するためのキットに関する。
配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ及び/又はそれぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つのレベル及びヘパラン及び/又はヘパラン硫酸のヘパリナーゼI〜III消化後に得られるグルコサミンの3位で硫酸化されたヘパラン硫酸二糖のレベルが健康状態を表すコントロールと比較して上昇していることが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示す。
配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ
のレベル及び/又は活性を、対象者から得た生物学的流体サンプルにおいて認識・検出する手段、及び
任意に、ヘパラン硫酸及び/又はヘパラン硫酸のヘパリナーゼI〜III消化後に得られるグルコサミンの3位で硫酸化されたヘパラン硫酸二糖を認識・検出する手段、
からなり、更に、
前記対象者から得たサンプルにおいて、タウタンパク質のリン酸化のレベルを測定する手段、及び
前記サンプルで得られた前記レベルを、既知の疾患又は健康状態を表すコントロールで得られたものと比較する手段、及び
異常リン酸化タウレベル及び/又は総タウレベル並びに配列番号2及び配列番号4の翻訳産物レベルを、既知の疾患又は健康状態を表すコントロールと比較する手段
を含んでなるキットに関する。
a)哺乳動物又は魚類、特に神経変性疾患に罹患した哺乳動物から事前に採集した生物学的流体サンプルを、試験化合物と接触させ、
b)
i.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
ii.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
iii.それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
iv.前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
v.ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
vi.タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルを測定し、
c)神経変性疾患を有する哺乳動物から事前に採集した、前記化合物に接触させていないコントロールの生物学的流体サンプル中の活性及び/又はレベルを測定し、
d)接触させた生物学的流体サンプル中の前記活性及び/又はレベルの差と、非接触の生物学的流体サンプル中のものとを比較することを含んでなり、
接触させた細胞の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法。
−タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル
−3-OST-2及び/又は4遺伝子及び/又はその転写産物及び/又はその翻訳産物及び/又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
を減少させ得る化合物は、アルツハイマー病のモジュレーターである。
前記生物学的流体は、任意の細胞培養物、特にニューロンの初代培養物の細胞外媒体であり得、また血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液(CSF)でもあり得る。
1つの有利な実施形態において、前記哺乳動物はヒト又はマウス、例えばSAMP8マウス及び/又はADの3xTg-ADマウスモデルである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについての上記インビトロスクリーニング法。
1つの有利な実施形態において、前記魚類はゼブラフィッシュである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについての上記インビトロスクリーニング法。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4のイソフォームをそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
f)異常リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から得たサンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
前記転写産物又は前記翻訳産物又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖又は異常リン酸化タウタンパク質の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための方法に関する。
対象者は、哺乳動物、例えばヒト若しくはマウス、又は魚類であり得る。
よって、本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病では、3-OST-2及び/又は3-OST-4遺伝子の発現レベルが高度に上昇しており、HS鎖のより高度な3-O-硫酸化又はヘパリン様HS構造体をもたらすことを見出した。
このように、配列番号1及び3で示される遺伝子の一方又は両方のレベル及び/又は活性が上昇しており、また、前記遺伝子の転写産物の一方又は両方のレベル及び/又は活性も、同様に前記遺伝子の翻訳産物、すなわち、配列番号2及び4で示されるタンパク質の一方又は両方のレベル及び/又は活性も上昇している。
3-OST-2及び-4は、ヘパラン硫酸の3-O-硫酸化を担うので、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベルもまた高度に上昇し、タウタンパク質の異常リン酸化をもたらすタウタンパク質の立体構造変化が誘導される。
よって、これら構成要素の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が対象者で上昇していることの検出により、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又はタウオパチーの診断又は予後予測がもたらされる。
1つの有利な実施形態において、本発明は、タウタンパク質のリン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルが参照値と比較して少なくとも10%上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
参照値は、種々の形態をとり得る。参照値は、単一のカットオフ値、例えばメジアン若しくは平均、又は集団の75分位、90分位、95分位若しくは99分位であり得る。参照値は、比較群に基づいて確立することができ、例えば、或る規定群におけるリスクは別の規定群におけるリスクの2倍であるという具合である。参照値は範囲であり得、例えば検査集団は幾つかの群(例えば、低リスク群、中リスク群及び高リスク群)に等分(又は不等分)されるか、又は四等分される(第1四分位はリスクが最も低い個体群であり、第4四分位はリスクが最も高い個体群である)。
所定値は、選択した特定の集団の間で、習慣、民族性、遺伝学などに依存して変化し得る。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4のイソフォームをそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
f)異常リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウタンパク質
のレベル及び/又は活性を、対象者から得たサンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
但し、測定された活性及び/又はレベルが、以下:
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも1つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定され、
前記転写産物又は前記翻訳産物又はヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖又は異常リン酸化タウタンパク質の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための方法に関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される前記遺伝子、及び
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の前記転写産物、及び
c)配列番号2及び4でそれぞれ示される前記遺伝子の前記翻訳産物、及び
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と実質的に同じであり、
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者において参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも100%上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
よって、上記他の構成要素のいずれについても上昇したレベル及び/又は活性が検出されず、タウタンパク質の異常リン酸化のみが検出されることで、アルツハイマー病以外のタウオパチーの診断及び/又は予後予測が可能になる。
表現「実質的に同じ」は、測定レベルが、選択した特定の集団の間での、習慣、民族性、遺伝学などに依存する個体変動に起因して、参照値に対して変動し得ることを意味する。したがって、測定レベルは、参照値の±10%、±5%又は±2.5%であり得る。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、本発明は、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルが、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法に関する。
この実施形態において、3-OST-2遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-4遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
この実施形態において、3-OST-4遺伝子のみが前記疾患に関与し、3-OST-2遺伝子のレベルは実質的に変化しない。
1つの有利な実施形態において、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
この実施形態において、3-OST-2及び3-OST-4遺伝子の両方が前記疾患に関与している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも200%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも300%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルは、リアルタイムPCRで測定するとき少なくとも400%上昇している。
当業者に周知の他の方法もまた、前記測定に使用することができる。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100%上昇している。
当業者に周知の他の方法もまた、前記測定に使用することができる。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、CSFにおいてウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、前記基礎レベルと比較して少なくとも100%上昇している。
当業者に周知の他の方法もまた、前記測定に使用することができる。
1つの有利な実施形態において、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルはウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき、配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、本発明は、ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法の1つに関する。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬及び皮質において基礎レベル及び/又は活性と比較して100%上昇している。
配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50%上昇しており、及び/又は
配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇しており、
タウタンパク質に結合し得るヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
幾つかの硫酸化グリコサミノグリカン及び模擬体は、タウに結合することができ、これらには、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及び化学合成の他の硫酸化多糖、例えばデキストラン硫酸及びペントサン硫酸が含まれる。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150%以上上昇している。
コントロールヒト海馬中のヘパラン硫酸の基礎レベルは、Huynhら(Neurobiol Aging. 2012 33(5):1005.e11-22)に記載されるジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイで測定するとき、約0.5μg/mg湿潤組織である。
よって、参照値は基礎レベルであると考えると、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は、アルツハイマー病において、海馬で50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150%以上上昇している。
配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルはリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇しており、及び/又は
配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは少なくとも50%上昇しており、及び/又は
配列番号4で示される前記遺伝子の翻訳産物のレベルは、ウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇しており、
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベルが基礎レベル及び/又は活性と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す上記インビトロ方法に関する。
アルツハイマー病における前記上昇は、海馬、皮質、CSF及び血液で観察される。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に参照値と比較して150%以上上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して110%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して120%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して130%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して140%上昇している。
1つの有利な実施形態において、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性は更に海馬において基礎レベル及び/又は活性と比較して150%以上上昇している。
3-O-硫酸化ヘパラン硫酸の代表的構造は以下のとおりである:
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は参照値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも20%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも30%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも40%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも50%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも60%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも70%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも80%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも90%上昇している。
1つの有利な実施形態において、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも100%上昇している。
1つの有利な実施形態において、タウタンパク質の異常リン酸化のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇しており、総タウタンパク質のレベル及び/又は活性は基礎値と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%上昇している。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物、及び
d)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び
e)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇している、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察のため又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかを決定するための上記方法の1つに関する。
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型
e)ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、
f)異常リン酸化タウタンパク質及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を、治療又は予防有効量で対象者に投与することを含んでなる、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する方法に関する。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が約20,000ダルトンの分子量を有する多糖又はオリゴ糖、特にヘパラン硫酸模擬体、例えばF6分子であり、前記剤が約1.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pなどで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
直接又は間接に影響される活性及び/又はレベルが配列番号1及び配列番号3で示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の転写産物であり、
少なくとも1つの転写産物のレベルが減少しており、特に当初の値のおよそ少なくとも50%である、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えばモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記遺伝子が配列番号3で示され、前記オリゴヌクレオチドが配列番号6で示される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤がオリゴヌクレオチド、例えばモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記少なくとも1つの遺伝子が配列番号1及び配列番号3で示される2つの遺伝子から本質的になり、配列番号1で示される遺伝子用オリゴヌクレオチドが配列番号5で示され、配列番号3で示される遺伝子用オリゴヌクレオチドが配列番号6で示される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路、i.p.経路などにより、当該経路に適切な投薬量で投与することができる。
直接又は間接に影響される活性及び/又はレベルが配列番号2で示される前記遺伝子の翻訳産物である、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
本発明は多糖に限定されず、任意のヘパリンタイプのものを前記剤として使用することができる。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が小分子であり、前記剤が約1.0mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
3-O-硫酸化インヒビター又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼインヒビター、特にRazi, Nら(J Biol Chem 1995, 270, 11267-75);Rath, V. L.ら(Drug Discov Today 2004, 9, 1003-11)又はSeko, A.ら(J Inorg Biochem 2009, 103, 1061-6)に記載のものを、この実施形態において使用することができる。
US20100048638に記載されるヘパラン硫酸のインヒビターもまた使用することができる。
1つの有利な実施形態において、本発明は、前記剤が約0.5mg/Kg〜約50mg/Kgの間の用量で静脈内経路により投与される、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルに直接又は間接に影響し、かつタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルに直接又は間接に影響する少なくとも1つの剤を治療又は予防有効量で対象者に投与することを含んでなる、対象者における神経変性疾患を治療又は予防する上記方法に関する。
前記剤はまた、別の経路、例えば経口経路により、約50mg/kg〜約500mg/kg、特に100〜200mg/kgで、又はi.pなどで該経路に適切な投薬量で投与することができる。
a)神経変性疾患を有する哺乳動物の脳細胞を試験化合物と接触させ、
b)
i.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
ii.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
iii.それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
iv.前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
v.ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
vi.タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルを測定し、
c)神経変性疾患を有する哺乳動物の、前記化合物に接触させていないコントロールの脳細胞における活性及び/又はレベルを測定し、
d)接触させた細胞における前記活性及び/又はレベルの差と、非接触の細胞におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた細胞の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法に関する。
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも1つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定される。
a)神経変性疾患を有する哺乳動物の脳細胞を試験化合物と接触させ、
b)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の固定化ヘパリンへの結合を測定し、
c)神経変性疾患を有する哺乳動物の、前記化合物に接触させていないコントロールの脳細胞における結合を測定し、
d)接触させた細胞における前記結合の差と、非接触の細胞におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた細胞の前記結合の変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法に関する。
a)試験化合物を、神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している試験動物に投与し、
b)
i.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び/又は
ii.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び/又は
iii.それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つ、及び/又は
iv.前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型、及び/又は
v.ヘパラン硫酸、特に3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖、及び/又は
vi.タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
の活性及び/又はレベルを前記動物において測定し、
c)神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している、前記化合物に接触させていないコントロールの動物において活性及び/又はレベルを測定し、
d)接触させた動物における前記活性及び/又はレベルの差と、非接触の動物におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた動物の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビボスクリーニング法に関する。
ヘパラン硫酸、又は
タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質
のものであるとき、ヘパラン硫酸の活性及び/又はレベルとタウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルとの両方が測定されるか、又は
前記遺伝子、前記遺伝子の前記転写産物、前記遺伝子の前記翻訳産物又は前記遺伝子若しくは前記転写産物若しくは前記翻訳産物の前記フラグメント若しくは誘導体若しくは変異型から選択される少なくとも1つの他の要素の活性及び/又はレベルもまた測定される。
a)試験化合物を、神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している試験動物に投与し、
b)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の固定化ヘパリンへの結合を測定し、
c)神経変性疾患の素因を有するか又は該疾患の症状を既に発症している、前記化合物に接触させていないコントロールの動物において結合を測定し、
d)接触させた動物における前記結合の差と、非接触の動物におけるものとを比較することを含んでなり、
接触させた動物の前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビボスクリーニング法に関する。
1つの好適な実施形態において、本発明は、前記動物がゼブラフィッシュである、神経変性疾患、特にアルツハイマー病のモジュレーターについての上記インビボスクリーニング法に関する。
図1は、ヘパラン硫酸(HS)のアセンブリ及び既知のリガンド(FGF、FGFR及びアンチトロンビンを含む)の結合部位を示す。グルコサミン残基の3-O-位の硫酸化は、ヘパラン硫酸(グルコサミン) 3-O-スルホトランスフェラーゼのファミリーHS 3-O-スルホトランスフェラーゼ-1〜-6(HS3ST1〜6)により触媒される。この3-O-硫酸化はヘパラン硫酸生合成における最後の代謝的修飾であり(Bishopら,2007, Heparan sulphate proteoglycans fine-tune manmalian physiology. Nature 446:1030-1037)、ヘパラン硫酸の栄養機能に関連せず、組織発現は非常に低い(総HSの約0.2%)ので、ほとんどが、これら糖のマイナーな硫酸化形態である。
図2A:総GAG(μg/mg組織)。白ヒストグラム:コントロール。黒ヒストグラム:AD患者。
図2B:総HS(μg/mg組織)。白ヒストグラム:コントロール。黒ヒストグラム:AD患者。
図2C:左上(a):コントロール脳;右上(b):AD脳における斑(plaque)及びもつれ(tangle)。左下(c):AD脳における斑;右下(d):AD脳におけるもつれ。
NS:酵素発現に有意な変化なし
ND:当該酵素の検出なし
アルツハイマー病(AD)及び年齢適合のヒト海馬凍結切片を抗HS抗体(10E4)(図4A及びB)及び抗タウ262抗体(図4C及びD)とインキュベートし、続いてフルオロプローブAlexa 568及びAlexa 488を付した二次抗体で標識した。
切片をDAPIで標識した(図4E及びF)。右パネルは重ね合わせである(図4G及びH)。スケールバー50μm。
X軸:総硫酸化GAGへのタウタンパク質結合%
Y軸:コントロール(白ヒストグラム)、AD(黒ヒストグラム)
図6B ELISA型競合アッセイで測定した総GAGのタウへの結合能の変化。固定化ヘパリンへの当該因子の結合の50%を阻害するに必要なGAG濃度を表す。
図7Aは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)による組換えヒトタウタンパク質(ヒトタウの441アミノ酸イソフォーム)の病的異常リン酸化を誘導する、AD海馬抽出GAG(GAG-AD)の効果が年齢適合脳GAG(GAG-CT)の効果と比較して上昇していることを示す。タウ396抗体を使用して、異常リン酸化タウの形成を検出した。
x軸:時間(h)
y軸:pmol Pタウ/mol タウ
黒三角:ヘパリン、黒丸:GAG-AD、白丸:GAG-CT、白三角:コントロール。
x軸:時間(h)
y軸:pmol Pタウ/mol タウ
黒三角:ヘパリン、黒菱形:Arixtra(3硫酸化)、白菱形:ヘキサヘパリン(非3硫酸化)、白三角:コントロール。
図8Aは、野生型分化SH-SY5Y細胞におけるGAG硫酸化阻害の効果を示す。硫酸化は、クロラート(50mM)(3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホスルフェート生合成のインヒビター)を用いて阻害する。クロラート処理後に減少した異常リン酸化タウエピトープS199、T231、S262及びS396レベルをウェスタンブロット分析で確証した。
x軸:タウエピトープ:左から右へ、抗タウ199、抗タウ231、抗タウ262又は抗タウ396リン酸化エピトープ
y軸:pタウ/βアクチン
図8Cは、フローサイトメトリ分析で明らかにされた、野生型細胞での、異常リン酸化タウエピトープS199及びS396レベルに対するクロラート処理(75mM)の効果を示す。
x軸:タウエピトープ:左から右へ、抗タウ199リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)又は抗タウ396リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)
y軸:pタウ/総タウ
x軸:タウエピトープ:左から右へ、抗タウ199リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)又は抗タウ396リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)
y軸:pタウ/総タウ
x軸:タウエピトープ:左から右へ、抗タウ199リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)又は抗タウ396リン酸化エピトープ(クロラートなし及びあり)
y軸:pタウ/総タウ
図8Gは、タウの異常リン酸化(エピトープS396)に対する、hTauP301L SH-SY5Y細胞における3-OST-2サイレンシング(センス用には配列番号73で示されるsiRNA、アンチセンス用には配列番号74で示されるsiRNA)の効果を示す。Ctrl:コントロールのhTauP301L SH-SY5Y細胞;Lipo:リポフェクタミン処理細胞(ネガティブsiRNAコントロール)、10、20、40及び80nMのHS3ST2 siRNA。
駆動構築物は、応答構築物のUASに結合するGal4-VP16の発現を駆動する神経細胞ゼブラフィッシュプロモーターHuCを含有する。これは、最小プロモーターを介してhTAU-P301L及びローダミン(DsRed)の二指向性発現を活性化する。タウ及びDsRedのUAS依存性遺伝子発現は、生存サカナにおいて、DsRed蛍光で示される。駆動構築物及び応答構築物は、Tol2トランスポゾン部位に挟まれている(図2)(Paquetら,2009)。
図10A:5日齢ゼブラフィッシュ胚の脳(野生型(a) 対 hTAU-P301Lトランスジェニックモデル(b))を解剖して抗タウAT180抗体で標識した。標識された過リン酸化部位(緑色)が、トランスジェニックモデルにおいて、終脳(Tel)、小脳(Cer)及び脊髄上部領域(SC)に位置する(略号:A:前側、P:後側、TeO:視蓋、Cer:小脳)。
X軸:リン酸化タウ/総タンパク質。
Y軸:左ヒストグラム:野生型タンパク質、右ヒストグラム:変異タウ。
3-OST-2及び3-OST-4の相対量は、トランスジェニックhTAU-P301Lサカナ(「DsRed」と示す) 対 WTでリアルタイムPCRにより検出した。WTによる酵素発現を100%とした。
X軸:相対量のパーセンテージ
Y軸:左から右へ:
左側の白及び黒ヒストグラム(3-OST-2):白:WT;黒:DsRed
右側の白及び黒ヒストグラム(3-OST-4):白:WT;黒:DsRed
図12A:生存率は、0.5mMのモルホリノ濃度を用いた3-OST-2モルファントで測定した。24hpf(受精後時間)後のトランスジェニックhTAU-P301Lゼブラフィッシュ胚において、3-OST-2をコードする遺伝子のモルホリノ-媒介ノックダウンを、コントロールとして用いた非注入胚と比較した。
X軸:注入の%
Y軸:左ヒストグラム:致死率、右ヒストグラム:生存率
図12B:モルファント胚におけるリン酸化タウタンパク質レベル)/(総タンパク質レベル)と非注入コントロールとの比較(n=98のプール、3つの異なる注射シリーズ)。
X軸:(リン酸化タウ)/(μg/ml 総タンパク質)。Y軸:MO 3-OST-2
図13A、13C及び13E:変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ脊髄の免疫染色(図13A:タウタンパク質(DsRed)、図13C:抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、13E:13A及び13Cを1つにした図)
図13B、13D及び13F:3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)脊髄の免疫染色(図13B:変異の存在を示すDsRed、図13D:抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、図13F:13B及び13Dを1つにした図)。
図14A、14C及び14E:非注入コントロールに相当する、変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ脳の免疫染色(図14A:DsRed、図14C:抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、14E:14A及び14Cを1つにした図)。
図14B、14D及び14F:3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)脳の免疫染色(図14B:DsRed、図14D:抗PHF-タウ抗体クローンAT8で検出した過リン酸化タウタンパク質、14F:14B及び14Dを1つにした図)。
図15A、15C及び15E:非注入コントロールに相当する、変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ軸索の免疫染色(図15A:DsRed、図15C:抗pタウ231で検出した過リン酸化タウタンパク質、15E:15A及び15Cを1つにした図)。(10×、スケールバー=50mm)。
図15B、15D及び15F:3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)軸索の免疫染色(図15B:変異を示すDsRed、図15D:過リン酸化タウタンパク質、15F:15B及び15Dを1つにした図)。
3OST-2スプライスモルファントではDsRed/hTauP301Lよりpタウ231染色が低く、矢印は軸索異常が反転していることを示す(10×、スケールバー=50mm)。
図16A、16C及び16E:非注入コントロールに相当する、変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ軸索の免疫染色(図16A:DsRed、図16C:抗pタウ231で検出した過リン酸化タウタンパク質、16E:16A及び16Cを1つにした図)。(20×、スケールバー=20mm)。
図16B、16D及び16F:3-OST-2タンパク質が阻害されている変異タウタンパク質P301L発現ゼブラフィッシュ(モルファント)軸索の免疫染色(図16B:タウタンパク質(DsRed)、図16D:抗pタウ231で検出した過リン酸化タウタンパク質、16F:16B及び16Dを1つにした図)。
3OST-2スプライスモルファントではDsRed/hTauP301LよりP-タウ231染色が低く、軸索異常は明らかに逆転している(20×、スケールバー=20mm(第1列)、50mm(第2列)。
図17A:空間学習能力(n=10)。プラットフォームへの到達に成功したマウス%
ヒストグラム 左から右へ:コントロールモデル(SAMP8)、フペルジンA、F6:腹腔内50mg/kg、F6:腹腔内25mg/kg、F6:経口200mg/kg、F6:経口100mg/kg。
図17B:空間記憶能力(n=10)。7週齢(2ヶ月処置)時の四分円プラットフォームの探索時間。
ヒストグラム 左から右へ:コントロールモデル(SAMP8)、フペルジンA、F6:腹腔内50mg/kg、F6:腹腔内25mg/kg、F6:経口200mg/kg、F6:経口100mg/kg。
F6は、2ヶ月処置後(7ヶ月齢時)にモリス水迷路において空間記憶保持を増大させた。
上のWB:タウ199、及び下のWB:GADPH
左から右へ:コントロールモデル(SAMP8)、フペルジン(抗アルツハイマーコントロール)、2ヶ月間(5ヶ月齢から7ヶ月齢までの間、週2回)、F6 25mg/kgを腹腔内処置したSAMP、F6 50mg/kgを腹腔内処置したSAMP、F6 100mg/kgを経口処置したSAMP、F6 200mg/kgを経口処置したSAMP。
モデルにおける矢印は、コントロールと比較して上昇した過リン酸化タウタンパク質を示す。
F6処理群(50mg/kg)における矢印は、モデルと比較して減少した過リン酸化タウタンパク質を示す。
図19A、19D及び19G:コントロールSAMR1マウス(コントロール)。
図19B、19E、19H:モデルSAMP8マウス。
図19C、19F、19I:F6処置したモデルSAMP8マウス。
処置動物は、有意な記憶増大を示す。
x軸:左から右へ:ヘパリン、コンドロイチン硫酸A(CSA)、コンドロイチン硫酸C(CSC)、HS、フコイダン、F6。
y軸:hタウに対する試験化合物の結合のパーセンテージ
フコイダン及びF6は、ヒトタウタンパク質への結合についてヘパリンと競合し得る。
x軸:時間(分)
y軸:経膜通過のパーセンテージ
四角:HM-オリゴ糖F6
三角(上向き):HM-オリゴ糖CR36
菱形:HM2602
三角(下向き):オリゴ-デキストラン
全ての患者が、臨床的及び生化学的評価でADと診断された。程度に応じて「+」、「++」、「+++」で示した。ADの程度は、WBのデンシトメトリー分析で測定したCSF中のpタウ231レベルにより推定した。
各々3サンプルを分析した。
x軸:左から右へ:AD+、AD++及びAD+++。
ADの各程度について、左から右へのヒストグラム:pタウ231、HS3ST2、HS。
左y軸:光学密度/タンパク質濃度(任意単位)
右y軸:総HS量(μg/mL)
この図は、OST-2、HS及びリン酸化タウの濃度が、ADの程度の増大(AD+からAD+++まで)につれて、有意に上昇することを示す。
このELISAアッセイに使用した総タウは市販のものであった。
これら結果は、最高量のpタウを含有するCSFは、固定化ヘパリンへのタウ結合を阻害する最も高い能力を有するHSも含むことを示す。
各CSFサンプルを、結合試験で3回アッセイした。
このことは、タウオパチーとCSF HSが総タウに結合する能力との間の相関を示す。
図24A〜24Eはこの研究に使用した一般的なプロトコルを示す。
凝集体ドナー細胞:SH-SY5Y細胞を、Frost B, Jacks RL, Diamond MI. J Biol Chem. 2009 May 8;284(19):12845-52. Transfected cells produce green Tau aggregatesに従って、タウ-EYFPでトランスフェクトする。
レシピエント細胞:野生型SH-SY5Y細胞
図24B:トランスフェクト細胞をトランスウェルの上部チャンバ中で培養した。非トランスフェクト細胞をトランスウェルの底部チャンバ中で培養した。凝集体ドナー細胞(タウ-EYFトランスフェクト細胞)及びレシピエント細胞(非トランスフェクト細胞)の両方を、10μMのレチノール酸の存在下で7日間培養して分化させる。
図24D:凝集体ドナー細胞及びレシピエント細胞を24時間共培養する。
図24E:レシピエント細胞を固定し、bIII-チューブリン(赤)で標識し、顕微鏡で検査する。
細胞を固定し、標識した。A)薬剤処理しなかったストレス負荷細胞。B)F6(10μg/mL)で処理したストレス負荷細胞。C)各条件について、3つの異なる培養物において10の異なる視野でタウ凝集体を計数した。
図24G:F6分子(10μg/mL)で処理され且つストレス負荷SH-SY5Y/タウ-EYFPと共インキュベートしたストレス負荷レシピエントSH-SY5Y細胞。各条件について、3つの異なる培養物において10の異なる視野でタウ凝集体(白色矢印)を計数した。
図24H:処置に応じた視野あたりの蛍光タウ凝集体数。
x軸:左から右へ:非ストレス負荷、ストレス負荷、ストレス負荷+F6(0.1μg/mL)、及びストレス負荷+F6(10μg/mL)。
y軸:視野あたりの蛍光タウ凝集体数
F6分子は、蛍光タウ凝集体数を顕著に減少させる。
x軸:左から右へ:Aβなしコントロール、Aβありコントロール、Aβ+F6(1μg/mL)、Aβ+F6(10μg/mL);
y軸:MTT検査で測定した生存細胞の%
p値<0.05を統計学的に有意とみなした。
注記:*≦0.05、**≦0.01、***≦0.001
x軸:左から右へ:Aβなしコントロール、Aβありコントロール、Aβ+E5(10μg/mL);Aβ+F6(10μg/mL);Aβ+D6(10μg/mL);
y軸:MTT検査で測定した生存細胞の%
カラムをコントロール+Aβと比較する:p値<0.05を統計学的に有意とみなした。
注記:*≦0.05、**≦0.01、***≦0.001
ヘパラン硫酸模擬体はリン酸化タウを減少させる。
図28A:pタウ396
図28B:βアクチン
図28C:種々の化合物に応じたpタウ396/βアクチン
x軸:左から右へ:コントロール、Aβ 12時間、Aβ 24時間、デキストラン、D4、D6、E5、F6。
y軸:pタウ396/β-アクチン(コントロールの%)
統計計算は、2つのWBからの平均シグナルを用いて行う。
ヘパラン硫酸模擬体はリン酸化タウを減少させる。
ヘパラン硫酸模擬体、例えばD4、E5及びF6は、リン酸化タウを減少させる。
実施例1.コントロール及びADヒト脳組織からの脳組織切出し:
死後ヒト脳サンプル採取を、AD登記作成協議会(Consortium to Establish a Registry of AD:CERAD)に従って行った。本研究には2つの実験群が含まれた:60〜77歳(平均年齢67.8±2.9歳)の老齢群(n=8、コントロール群)及び69〜82歳(平均年齢76.8±3.5歳)のAD群(n=8)。本研究に参加した対象者は、有資格者の神経病理学者による死後評価を受けた。死後間隔は、両群について、8.0時間から15.2時間まで異なった。2群間に死後遅延について統計学的に有意な差はなかった(p=0.1781)。剖検時に脳を得て、剖検後2時間以内に矢状方向に半分にした。一方の半球を、前頭面に沿って2cm厚の切片に切り分けて、海馬(側頭葉)、皮質及び小脳を切り出した。切出し直後に組織をドライアイスで凍結させた。組織サンプルを使用時まで−80℃で保存した。
脳内の神経病理学的変化を、アルツハイマー病登記作成協議会(CERAD)及びBraak and Braakのガイドラインを用いて調べた。老人斑及びNFTは、ビールショースキー(Bielschowsky)−中前頭回、中側頭回、下頭頂小葉、後頭極、海馬CA1及び嗅内皮質(enthorinal cortex)の染色切片−に基づいて決定した。老人斑は10×対物レンズを用いて計数し、NFTは20×対物レンズを用いて計数した。相加平均は、各領域について6視野のカウント(老人斑/mm2及びNFT/mm2)から算出した(平均±SEM)。次いで、CERADが提唱するガイドライン及びBraak and Braakの基準を用いて神経病理学的診断を行った。AD脳は、海馬分析からステージIII〜Vであると特徴付けられた。コントロール脳は非ADであると判定された。
アルツハイマー及び年齢適合コントロールのヒト海馬切片(20μm)を3%酢酸で室温(rt)にて10分間固定した。次いで、切片をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中3%のBSAと30分間インキュベートし、PBS中0.2%のTriton X100で30分間透過化した。HSを、透過化緩衝液(1:200)に溶解した抗ヘパラン硫酸(10E4エピトープ, Seikagaku corp.、AMS Biotechnology販売)及び抗タウホスホセリン262(Millipore)とrtにて1時間30分間インキュベートして染色した。Alexa 568蛍光プローブ(Molecular Probes)及びAlexa 488蛍光プローブ(Interchim)に接合した二次抗体で組織スライドを染色することにより、蛍光を導入した。次いで、切片を1μg/mL DAPI溶液で3分間DAPI標識し、エタノールでリンスした。画像は、先ず、BH-2エピ蛍光光学顕微鏡(Olympus)に取り付けたCCDモノクロカメラ(CFW-1310M, Scion Corporation, USA)を用いて撮影した。Scion VisiCapture 2.0ソフトウエアを用いて画像を収集した。画像処理は、ImageJソフトウェア(W. Rasband, National Institute of Mental Health, Maryland, USA)を用いて行なった。核のDAPI標識は、以前に記載されたとおりに定量した(Blondetら,2006)。
本実施例では、HS生合成に関与する3-OST酵素の発現が、アルツハイマー病海馬サンプルでコントロール海馬サンプルと比較して変化しているかどうかを調べた(表2)。結果は、アルツハイマー病海馬における3-OST-2及び3-OST-4の過剰発現を示す。このことにより、脳のHS鎖における3-O-硫酸化の増大及び3-OST-2転写物のは発現増強がアルツハイマー病に特徴的であると考えられ得ることが示唆される。コントロール実験として、(アルツハイマー病脳で増強していることが知られている(Burbaevaら,2005))グルタミンシンセターゼ(GS)及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)が予想どおり発現されており、(アルツハイマー病で年齢適合個体群と比較して安定に維持されていると報告されている(Cartierら,2005))ケモカインレセプター4の発現が不変であることも確証した。遺伝子発現の予想された増大と一致する我々の結果(表2)は、RIN数により示されるように、生物学的材料の質がこれら研究と一致するものであったことを示している。
総RNAをヒト海馬から抽出した。定量的PCR(qPCR)用のプライマー(Eurofins, Germany)はPrimer3outputが設計した。qPCRは、鋳型cDNAからLightCycler FastSart DNA Master SYBR Greenキットの製造業者(Roche, Germany)の指示に従って行った。qPCR条件は、プライマーセットに依存した(表3)。サンプルは1回で同時に増幅させた。遺伝子発現の相対的定量は、ΔΔCT法(Schefeら,2006)とも呼ばれる比較CT法を用いて行った。2つの参照遺伝子(α-チューブリン及びTFIID)を内因性コントロールとして使用した。これら遺伝子の標準化はGenormプログラム(Vandesompeleら,2002)で達成した。
脳脊髄液(CSF)サンプルは、ADの臨床的特徴を有する患者から腰椎穿刺により得た。患者及びサンプルは、Sarazinら(Habertら,Brain perfusion SPECT correlates with CSF biomarkers in Alzheimer's disease. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2010;37:589-593)により以前に記載されている。AD患者は、ADの予測についての国立神経病、感染症、脳卒中、アルツハイマー病及び関連疾患研究所連合(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association:NINCDSADRDA)の基準を満たしていた。全ての対象者は、同じ臨床的、生化学的(CSFバイオマーカー測定)及び神経画像検査手順を受けた。全ての患者は、液体減衰反転回復法(FLAIR)、T1-及びT2-強調シーケンスを含むルーチンのMRI検査を受けた。患者は、巣状病変の臨床上の証拠も神経画像検査上の証拠も示さず、皮質又は皮質下血管病変も示さなかった。AD患者は、種々の程度の皮質及び/又は皮質下萎縮を示すことがあった。患者は、認知行動に干渉する医学的状態を有さず、重篤な抑うつも示さなかった。すべての患者は、診断時から、アセチルコリンエステラーゼインヒビターで治療されていた。患者は、コミュニティーで生活していた。
腰椎穿刺により得たCSFサンプルは、10分間1,500rpmで4℃にて遠心分離して、細胞を除去し、0.4mlポリプロピレンチューブに小分けして、分析まで−80℃で保存した。
凍結脳組織を液体窒素蒸気下でホモジナイズし、Laemmli緩衝液4×(事前に1:100のβ-メルカプトエタノールを添加)中に懸濁させた。混合物を5分間煮沸し、5分間超音波処理した。次いで、チューブを10分間遠心分離した(1,500rpm、4℃)。Pierce(登録商標)BCA Protein Assayキットを製造業者の指示に従って用いて組織ホモジネート及びCSFサンプル中のタンパク質濃度を算出し、等量のサンプルを10%ゲル上で電気泳動させた(Invitrogen Corp)。転写後、膜をブロッキング緩衝液(PBS中3%乳、0.02% Tween-20)で40分間ブロックし、ヤギ抗HS3ST2(T-15, Santa Cruz)で室温にて2時間探査した。膜をPBST中で1回リンスした後、同じ緩衝液中で5分間3回洗浄した。二次抗体をPBST中に希釈し、RTにて45分間インキュベートした(ウサギ抗ヤギ, Jackson Immuno Research)。膜をPBSTでリンスし、同じ緩衝液中で5分間3回洗浄した。ブロットを、Immobilon Western Chemiluminiscent HRP Substrate(Millipore)を製造業者の指示に従って用いて発色させた。
その後、膜をTBS 1×中で洗浄し、次いでTBS中1% BSA、0.1% Tween-20(TBST)中に希釈した抗pタウThr231(ウサギポリクローナル, Millipore, ref 9668, lot NG1863963)と室温にて2時間インキュベートした。膜をTBST中で5分間3回洗浄した後、二次抗体(ロバ抗ウサギ, Jackson ImmunoResearch)とインキュベートした。ブロットを同じ試薬で発色させた。
GAGを脳組織及びCSFから以下のとおり抽出した:凍結脳組織サンプルを粉末にし、ホモジナイズして抽出緩衝液(50mM Tris, pH7.9, 10mM NaCl, 3mM MgCl2及び1%のTriton X-100)中に懸濁して最終的に1mL緩衝液あたり25mgの組織とした。CSF又は脳ホモジネートをプロテイナーゼK(PK)(Merck)(最終50μg/mLサンプル)で56℃にて一晩処理し、続いて90℃にて30分間処理して酵素を不活化させた。室温(rt)まで冷却させた後、DNase I(Qiagen)を加え(7.5mU/mLサンプル)、サンプルを37℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを4M NaClで1:1希釈し、遠心分離し(13 000g, 20分間)、ペレットを廃棄した。脂質を1:1クロロホルム抽出により除去し、記載(Huynhら Neurobiol Aging. 2011)されるような1-9ジメチル-メチレンブルー(DMMB)アッセイに従って総(トータルの)硫酸化GAGを定量した。コンドロイチナーゼABC(ChABC)(Sigma-Aldrich)又は亜硝酸処理を用いて、総GAGサンプル中のHS又はCSを選択的に定量した(Huynhら 2011)。既知量のCS標準物を用いて構築した較正曲線を各アッセイに含ませた。抽出法及び定量法は、GAGをスパイクしたげっ歯類脳サンプルにおいて、以前に記載されたとおりに検証した(Huynhら,Neurobiol Aging. 2011)。
GAGは以下のとおり単離した:PK/DNAse消化サンプルを4M NaCl最終サンプル濃度にして、10分間激しく撹拌した。TCA処理(10%最終濃度)でタンパク質を沈降させた後、上清をクロロホルム洗浄し、続いて水相の抽出緩衝液及びその後の純水に対する迅速透析(Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Units 3,500 MWCO, Pierce)で明澄化した。凍結乾燥後、材料を、水又は必要に応じてグリカナーゼ消化緩衝液(10mM酢酸ナトリウム, 2mM CaCl2, pH7)中に溶解させた。次いで、GAGをDMMBプロトコルに従って定量した。抽出HS又はCSの同定及び特異的回収は、以前に記載されたように、HS回収についてはコンドロイチナーゼABC(ChABC)での特異的消化により、CS回収についてはヘパリナーゼI/II/III又は亜硝酸処理により行った(Huynhら,Neurobiol Aging. 2011)。
グリカナーゼ消化緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、2mM CaCl2、pH7)中に溶解した、脳及びCSFから抽出し凍結乾燥させたGAGサンプルを、同時に、ヘパリナーゼI、II及びIIIカクテル(各0.25mU、24時間、37℃)で消化させた。サンプルをろ過後、キャピラリ液体クロマトグラフィーシステム(LC)に連結したLTQ/orbitrapから構成されたLC/MSシステムに注入した。使用した分離・検出方法は、Methods Enzymol. 2011又はYangら(Ultra-performance ion-pairing liquid chromatography with on-line electrospray ion trap mass spectrometry for heparin disaccharide analysis. Analytical Biochemistry 415 (2011) 59-66)に記載された方法である。
アルツハイマー病及び年齢適合コントロールの海馬からのGAGを、下記のとおり、ELISA競合結合アッセイを用いて、タウタンパク質への結合能力について試験した。図6Aは、アルツハイマー病GAGへのタウ結合能の有意な増大を示す。この効果は、0.1ng/mL GAGについて既に観察されていた。多糖へのタウの50%結合を得るに必要な有効濃度(EC50)の評価により、アルツハイマー病GAGがコントロールと比較して減少していることが示され(図6B)、このことは、疾患例においてタウに対するGAGの親和性が増大していることを意味する。これら結果は、アルツハイマー病による海馬内でのGAG組成変化がより多くのGAGとタウとの結合を生じることを示唆する。
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)によるリン酸化。組換えhTau41(Millipore)を1単位/mlの組換えGSK3(Millipore)と、50mg/mlのヘパリン、Arixtra(登録商標)又は非3-O-硫酸化ヘパリンヘキササッカリドの存在下又は非存在下で0〜24時間インキュベートした。リン酸化アッセイ(0.050ml)を30℃にて行った。リン酸化アッセイは、25mM Tris-HCl、pH7.4、0.1mM EGTA、0.1mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5mM PKI(サイクリックAMP依存性タンパク質キナーゼの特異的インヒビター)、プロテアーゼインヒビター(0.5mMフェニルメチルスルホニルフロリド、5mg/mlアプロチニン、5mg/mlロイペプチン及び0.5mg/mlペプスタチン)、タウタンパク質(4mM)、10mM酢酸マグネシウム、2mM [g-32P]ATP(約100cpm/nmol)、5単位/mlの組換え再構成GSK3を含んでなっていた。反応はATPで開始させ、10分〜24時間の間の種々の時間でアリコートを取り出し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティングに使用した。イムノブロットは記載されたように行った(Masato Hasegawaら,J Bio Chem. (1997) 272 (52), pp. 33118-33124)。或いは、Whatman P-81紙への吸着後に32P放射活性の取込みを記載されたように測定した。ヘパリン及び抽出GAGを50mg/mlでアッセイに含ませた。
2つの細胞タイプを使用した:(i)異常リン酸化が酸化ストレスにより誘導される野生型SH-SY5Y細胞(変異非依存性モデル)、及び(ii)FTDP-17に特徴的な変異hTAU-P301Lを有する完全ヒトタウタンパク質で安定にトランスフェクトされた細胞(変異依存性モデル)。タウ変異の結果として、細胞は高レベルの異常リン酸化タウを示す。
変異依存性モデルについては、細胞を記載されたように培養した(Schaeffer Vら,J Neurobiol 2006, Jul;66(8):868-881)。変異非依存性モデルについては、ヒトSH-SY5Y神経芽腫細胞を、5%ウシ胎仔血清及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で増殖させた(5% CO2及び95%空気)。両モデルについて、細胞を、25cm2ディッシュに106細胞/cm2の密度でプレートし、標準条件下で24時間インキュベートした。次いで、細胞(両モデル)を10μMレチノール酸(RA)で3日間処理して神経分化を誘導した。
変異非依存性モデルに関しては、次いで、分化細胞をH2O2(500mM)で30分間処理し、培地を、RAを補充した新鮮培地に再び交換した。この酸化処理は細胞においてタウのThr231及びSer396での異常リン酸化を誘導する。
酸化剤除去の6時間後。
3日間の分化後、両モデルの細胞を、RA(10μM)の存在下で、50mMの最終濃度で加えた塩素酸ナトリウム(GAG硫酸化のインヒビター)で処理して分化を維持した。細胞をこれら条件下にて更に24時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、採集し、抗タウ-pSer199及び抗タウ-pSer396抗体(Millipore)を用いるpタウのフローサイトメトリ分析及びウェスタンブロット分析に使用した。
HS3ST2及びHS3ST4 siRNAサイレンシングの効果を、記載した2つのAD細胞モデルにおいて試験したが、クロラート処理を、siRNA(センスについては配列番号73で示すsiRNA、アンチセンスについては配列番号74で示すsiRNA)(10、20、40及び80nM)のリポフェクタミンでのトランスフェクションに置き換えた。全ての場合で、細胞をプレートし、標準条件下で60%コンフルーエンスまでインキュベートし、siRNAサイレンシングをhTauP301L細胞においては直接行い、WT細胞についてはH2O2ストレスの前後に行った。随意に、サイレンシングを行った細胞及びコントロールをレチノール酸(10μM)で3日間分化させた。採集した細胞を、抗タウ-pSer199及び抗タウ-pSer396抗体(Millipore)を用いるフローサイトメトリで周知の技法を用いて分析した。少なくとも10000細胞(事象)を分析した。HS3ST2サイレンシングは、HS3ST2転写物のRTqPCR分析により、HS3ST2タンパク質発現についてはウェスタンブロット分析により確証した。
細胞を採集後、1mM Na3VO4及び0.1%プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigam)を含有する溶解緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1% Triton X-100、1mM EDTA、10mM NaF、pH8.0)中で氷浴にて5分間インキュベートした。溶解物を遠心分離し、上清中のタンパク質を、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて定量した。30μgのタンパク質に相当する抽出物を、組織及びCSFタンパク質サンプルに関して記載したように、電気泳動により分離した。上記の抗タウ-pSer199及び抗タウ-pSer396(Millipore)を用いて異常リン酸化タウを検出した。HS3ST2の分析に関しては、酵素の事前の免疫沈降(milteniキット)が培養細胞中の検出を向上させるために必要であった。タンパク質ローディングを評価するために、膜を直ぐに剥がし、β-アクチンについて再探査した。結果は、アクチンに対する標的タンパク質の比として表した。独立実験をコントロールに対して規格化した。
変異した過リン酸化タウタンパク質レベルに対する3-OST発現の効果を調べるために、ニューロン喪失、タウ過リン酸化、凝集、もつれ形成及び行動変化を含むタウオパチーの特性(Paquetら,2009)を示すhTAU-P301Lトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用した。先ず、5日齢のhTAU-P301Lトランスジェニック胚の脳を過リン酸化タウタンパク質に対する抗体で標識して、タウオパチーを示唆する過リン酸化部位が存在するかどうかを評価した。予想通り、野生型がタウ過リン酸化を全く示さなかったこととは対照的に、hTAU-P301L変異体でタウの過リン酸化が観察された(図10A)。更に、過リン酸化タウは変異体の小脳及び脊髄上部領域に位置していただけではなく、終脳にも高度に発現していた。このことは、前脳がタウのミスフォールディングに極度に影響され得ることを示唆する。
異常リン酸化は、同一サンプルで分析した総タウタンパク質レベルに対する異常リン酸化タウレベルの比として古典的に表現される。トランスジェニックゼブラフィッシュでは、異常リン酸化タウレベル/総タウタンパク質レベルは、下記のようにP-タウ及びT-タウELISAアッセイで測定した。トランスジェニックhTAU-P301Lで、異常に過リン酸化したタウタンパク質の蓄積(総タウタンパク質量基準)がWTと比較して90倍上昇していることが観察された(図10B)。更に、Aβ42がこれらサカナに存在するかどうかを決定するために、Aβ42 ELISA分析を行った。予想通り、FTDのこのトランスジェニックhTAU-P301LモデルではAβ42は観察されなかった。
総RNAは、WT及びDsRedポジティブゼブラフィッシュサンプルの100の解剖胚のプールから抽出した。RNA抽出は、RNAeasy(登録商標)ミニキット(50)を用いて達成した。HS3ST2発現をmRNAレベルで測定するために、単離RNAから逆転写酵素反応によりcDNAを合成した。簡潔には、総抽出RNA(1μg)を、5mM dNTP及びRNaseインヒビター(Invitrogen)の混合物中でランダムプライマー(30μg/mL)と65℃にて5分間インキュベートした。その後、5×第1鎖緩衝液、1mM DTT及びRNaseインヒビターSuperscript II Rnase H- Reverse Transcriptase(Invitrogen)と42℃にて52分間、70℃にて15分間インキュベートした。転写酵素を含まない混合物をネガティブコントロールとした。qPCRに関しては、プライマーはPrimer3outputが設計したものをEurofins(Gemany)より入手した(表4)。qPCRに関しは、増幅は、LightCycler(ソフトウェアバージョン3.5;Roche Switserland)で、FastSart DNA Master SYBR Green I(Roche, Switzerland)を用いて、製造業者が提供する標準的な操作手順に従って行った。1回のアッセイで全てのサンプルを同時に増幅した。相対的定量を上記のように行った(Vandesompeleら,2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3:RESEARCH0034)。
モルホリノオリゴヌクレオチド(MO)は、HS3ST2 mRNA:5'-ATGGCATATAGGT TCCTGTCAAGCC…-3'の翻訳をブロックするために、ゼブラフィッシュ3-OST-2遺伝子の隣接領域を標的するように設計した。モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Gene Tools(LLC One Summerton Way, Philomath, OR, USA)により設計した。MO HS3ST2-ATG:5'-GGCTTGACAGGAACCTATATGCCAT-3'。
モルホリノを、Danieau緩衝液(58mM NaCl、0.7mM KCl、0.4mM MgSO4、0.6mM Ca(NO3)、5mM HEPES pH7.6)に異なる3濃度に希釈し、0.3mg/mLデキストランローダミン(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)と共に注入した。1細胞ステージ又は2細胞ステージのトランスジェニックゼブラフィッシュ胚に、プレッシャーマイクロインジェクター及びZeiss立体顕微鏡(Zeiss)を用いて約2nLの0.5mM又は1mMモルホリノ溶液を微小注入した。3つのモルホリノ溶液を、サカナの生存度、異常性及び奇形について試験した。主要な異常性も奇形も引き起こさなかった生存濃度のみを使用した(0.5mM)。胚をフィッシュウォーター中に28℃にて維持した。20hpf後、胚を、メラニン経路中の全てのチロシナーゼ依存性工程のインヒビターである1× PTU(1-フェニル2-チオウレア)とインキュベートした。卵膜除去(dechorionation)の2日後、DsRedポジティブ胚を選択した:変異サカナに特徴的な顕著な赤色蛍光標識を示す胚のみを、モルホリノの存在についてポジティブと見なした。次いで、胚を48及び120hpfで固定又は解剖した。
ゼブラフィッシュ胚を0.64mMトリカイン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で麻酔し、4%パラホルムアルデヒド中で1時間rtにて固定した。5dpfの胚を1時間固定した後、脳をPBS中で解剖した。6回のリン酸緩衝液での各5分間の洗浄後、解剖脳又は全胚を、0.2%ゼラチン(Merck, Darmstadt, Germany)及び0.25% Triton X100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で1時間rtにてブロッキング及び透過化し、続いて0.02% NaN3を含有する緩衝液に1:100希釈した一次抗体たる抗PHF-タウ抗体クローンAT8(Thermo Scientific)及び抗PHF-タウ抗体クローンAT180(Thermo Scientific)とインキュベートした。ポジティブDsRed胚を選択するために、1:50希釈した抗DsRed(Clontech)でも標識した。脳又は胚をヤギ抗マウスビオチン化抗体(Vector, 1:400希釈)溶液と1時間30分間rtにてインキュベートし、続いてストレプトアビジンAlexa 488(Molecular probes、1:400希釈で使用)溶液中で1時間rtにてインキュベートした。脳又は胚をPBS緩衝液中1%アガロース(低融点、Biorad)でマウントした。モルファント表現型の画像を、明視野照明下で、ACT-1ソフトウェア(Version 2.63 Nikon)で制御したデジタルカメラ(DXM 1200F, Nikon)を備えた立体顕微鏡(SteREO Lumar. V12, Zeiss)で記録した。蛍光標識の組合せを、Axiovisionソフトウェアで制御したAxioCam MRmカメラ(Zeiss)を備えるApoTomeシステム(Zeiss)を備えた顕微鏡を用いて画像化した。
AB系統とP301L変異タウ遺伝子を有するトランスジェニックゼブラフィッシュとの交配により得られた胚を、24hpf及び48hpfにDsRed蛍光タンパク質についてスクリーニングし、卵黄を除去した。50mM Tris HCl pH8、150mM NaCl、10% Triton X100、1mM EDTA、プロテアーゼインヒビター(カクテル、Roche)、10mM NaF及び1mMオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷抽出緩衝液を2倍体積で胚に加えた。組織を超音波処理により断片化し(Branson, Sonifier 250)、4℃にてホモジナイズした(Stuart rotator SB3)。10 000rpmで30分間の遠心分離後(Eppendorf Centrifuge, Sigma-202 MK)、上清を廃棄した。タンパク質濃度はBradford法に従って測定した。
異常リン酸化タウ(P-タウ)は、INNOTEST(登録商標) PHOSPHO-TAU (181P) ELISA(Innogenetics, Gent Belgium)で測定した。モノクローナル抗体HT7(正常タウ及びP-タウのアミノ酸159〜163を認識)及びビオチン化モノクローナル抗体AT270(リン酸化スレオニン181残基を含むP-タウを認識)の組合せを用いて、タウオパチー関連病状に特徴的なP-タウ181レベルを測定した。ELISA INNOTESTに備えられた合成ホスホペプチドを標準化に使用した。
総タウ(T-タウ)は、INNOTEST hTAU-Ag ELISA(Innogenetics, Gent, Belgium)で測定した。このT-タウアッセイは、捕捉用にモノクローナル抗体(AT120)を、検出用にビオチン化モノクローナル抗体(HT7及びBT2)を利用する(Vanmechelenら,2000)。Aβ42もまた、INNOTESTTM β-Amyloid (1-42) ELISA(Innogenetics, Gent, Belgium)で測定した。
一般的な合成手順を下記に示す:
D6、D4及びE5は類似の方法で合成する。
生成物の精製は、1000通常分子量カットオフ(NMWCO)の再生セルロース膜(Pellicon2、0.5m2、Millipore, MA)で5LのNaCl 1M、次いで20LのMilli-Q水に対してタンジェンシャル限外ろ過で体系的に達成した。得られる濃縮溶液を凍結乾燥させた。Universal mill A10 IKA(IKA-WERKE GMBH & CO. KG, Germany)により、純粋な乾燥生成物をホモジナイズして微粉末を得た。200 MHz Brukerスペクトロメータ及び600 MHz Varianスペクトロメータを用い、残留H2Oピークを標準として使用してD2O中のサンプルからの1H NMRスペクトルを記録した(4.805ppm)。分子量の絶対値測定及びサイズ分布は、多糖溶液について0.1M LiNO3に溶出させるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により行った。これには、差分屈折率検出器(RI, ERC 7515A, Erma Cr. Inc., France)と直列に接続した多角レーザ光散乱光度計(MALLS;Dawn DSP-F, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)と組み合わせた。TSK Gel G3000 PWXL(TosoHaas, Cambridge, U.K.)カラムを多糖分析に使用した。置換度(ds)は、置換カルボキシメチル基の数(dsCM)、置換カルボキシメチルアミドの数(dsX)及びスルフェート基の数(dsS)として定義した。
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(61%、20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(70%、20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は15%で存在する(0〜50%置換が可能)。
−CR 36:T10から製造(NHX=L-Phe(OMe))、これは以下の置換度を有する:59CM、22L-Phe(OMe)、83S。
ここで、CMはカルボキシメチル基に相当し(59%、20〜150%含量が可能)、Sはスルフェート基に相当し(83%、20〜150%含量が可能);L-Phe(OMe)は22%で存在する(0〜50%置換が可能)。
合計60匹の5ヶ月齢雄性SAMP8及び14匹の5ヶ月齢SAMR1(正常コントロール)を、クリーングレードの動物舎において22〜24にて55±5%の湿度で12時間の明暗サイクルで飼育した。全てのマウスを標準飼料で飼育した。SAMP8及びSAMR1の平均寿命はそれぞれ15±2ヶ月及び30±3ヶ月であった。全てのマウスを5日間順応飼育した後に、60匹のSAMP8マウスを体重に従って各群15マウスの6群に分けた:モデル群、フペルジンA群、F6高用量群(F6 H、50mg/kg)及びF6低用量群(F6 L、50mg/kg)。フペルジンA群には、3.86μg/KgのフペルジンA(ヒト臨床用量と等価、正常ナトリウムに溶解)を1日1回経口投与した;F6 H群には、50mg・Kg-1 F6(正常ナトリウムに溶解)を4日毎に1回腹腔内注射した;F6 L群には、25mg・Kg-1 F6(正常ナトリウムに溶解)を4日毎に1回腹腔内注射した;モデル群及びSAMR1正常コントロール群(コントロール)には、等価用量の溶質(200μL精製水)を1日1回経口投与した。全ての群を2ヶ月間処置した後、行動及び分子生物学検出を行った。
SAMの学習及び記憶能力に対するGAGアナログの効果の測定
行動検出を順次行った:定位ナビゲーション(place navigation)(1〜4日目)、空間探索試験(5日目)及びフットショック回避試験(8〜9日目)。定位ナビゲーションモリス水迷路(MWM)検出は、報告された文献を参照し、若干の改変を加えて行った(参考文献)。各群における、逃避潜時、遊泳距離、異なる四分円内での滞留時間、異なる四分円内での遊泳路長、全遊泳路長、遊泳速度、逃避成功パーセンテージを調べた。実験前に、マウスを先ず、水面下のプラットフォームに15秒間置き(順応期)、次いで第1四分円内及び第3四分円内のそれぞれで水中にプール壁に向けて置いた。マウスに90秒間MWM中を自由に遊泳させ、5秒を超えるプラットフォーム滞留時間を、プラットフォーム探知の成功と見なし、水中に入れてからプラットフォーム探知の成功までの時間を逃避潜時として用いた。マウスが90秒以内にプラットフォームに到達できなかった場合、逃避潜時は90秒として記録した。毎日の平均逃避潜時を算出して、空間記憶の獲得能力を評価した。全てのマウスを4日間継続して訓練し、各群においてプラットフォーム探知に成功したマウスのパーセンテージ(泳いで水から出た率)を毎日算出した。
脱パラフィン化:ジメチルベンゼンに5分間3回、100%アルコールに3分間2回、95%アルコールに1分間、70%アルコールに1分間、50%アルコールに1分間、水で5分間洗浄。
抗原回収:100℃にて20分間のシトレート水浴、水で10分間洗浄、PBSで5分間1回の洗浄。抗原ブロッキング:3% BSAで30分間室温にてブロックした。内因性ビオチンブロッキング:キットの指示書に従って行った。溶液A及びBでそれぞれ15分間ブロックした。一次抗体:1% BSA+0.2% Triton X-100+PBSで希釈し、一晩4℃にてインキュベートした。抗タウ5(1:100)、抗pタウ199/202(1:100)、抗pタウ231(1:100)、抗pタウ262(1:200)、抗pタウ396(1:100)、抗CS(1:100)、抗カテプシンD(1:100)、抗カテプシンB(1:50)、抗HS(A04B08)(1:20)。二次抗体:1% BSA+0.2% Triton X-100+PBSで希釈し(1:200)、暗所で室温にて1時間インキュベートした。HSは報告された文献(Ottenheijmら,2007)を参照し、抗VSVは希釈して(1:5)、室温にて1時間インキュベートした後、染色を行った。
シグナル増幅。キットの指示書に従って行い、それぞれ2滴の溶液A及びBを10mLのPBS中に加え、暗所で30分間室温にてインキュベートした。呈色:5mlのTris-HCl(0.1M、pH8.2)に、レバミゾール溶液を1滴並びにキットの溶液A、B及びCをそれぞれ2滴加え、暗所で20分間室温にてインキュベートした。DAPI染色:1μg・ml-1 DAPIを使用して3分間室温にて染色した。マウントし、暗所で4℃にて保存した。適時写真を撮影した。
F6及びCR36を、分化及び未分化ヒトSH-SY5Y細胞(Datkiら,2003)において、Aβ42毒性を改変する能力についてアッセイした。未分化SH-SY5Y細胞は、10% FBSを補充したDMEM中37℃にて5% CO2で維持した。アッセイのために、細胞を96ウェルプレートに15,000細胞/ウェルで播種し、10% FBSを補充したDMEM中24時間維持した。分化細胞アッセイのために、培地に10μMレチノール酸(Sigma-Aldrich)を補充し、細胞を3日間分化させた。未分化細胞アッセイについてはレチノール酸処理を行わなかった。ヒトAβ42ペプチド(Sigma-Aldrich)を、水溶液(50μM)中で、rtにて3日間穏やかに振盪させることにより、即席に凝集させた。次いで、凝集Aβ42を分化又は未分化細胞に10μMの最終濃度で加えた。このAβ42ペプチド濃度は、50%近辺の細胞生存度が得られるように用量-効果実験により固定した(データは示さず)。F6、CR36又はコントロール生成物(LiCl2、ヘパリン、エノキサパリン、DMMB)を細胞に0.01、0.1又は1μg/mLの最終濃度で10μMの凝集Aβ42ペプチドと共に加え、細胞を1日間インキュベートした。MTTアッセイ(Mosmann, 1983)で細胞生存度を測定した。簡潔には、培地を交換し、10μLのMTTストック溶液(5mg/mL)を各ウェルに加えた。細胞を2時間rtにてインキュベートし、MTT溶液を廃棄した。DMSOを各ウェルに加え、光学密度を560nmで読み取った。光学密度は、分化及び未分化の両方の細胞についての較正曲線(データは示さず)により、細胞数に直接相関させた。
血液脳関門(BBB)透過性研究を、hCMEC/D3細胞単層において、以前に記載されたように作製したBBB細胞(B. B. Wekslerら;FASEB J. 2005 Nov;19(13):1872-4)で行った。簡潔には、トランスウェルポリカーボネートインサートフィルターで、異なるサイズの分子に対するBBBの透過性を測定した。HCMEC/D3細胞をフィルター上にEGM-2培地中2×105細胞/cm2のコンフルーエント密度で播種した。48時間後、F6、CR36、HM2602及びオリゴデキストランを含むアッセイ分子を上部チャンバに加え、下部チャンバを10分間隔でサンプリングし、硫酸化糖を検出するためのDMMB法を用いて、細胞に覆われたインサートを通過する分子を測定した(図22)。
データ分析
データ分析は、Prism 5.0(GraphPad Software Inc., CA)ソフトウェアを用いて行った。データは平均±SEMとして示した。対応のある比較は二試料t検定及びマンホイットニー検定を用いて行い、多重比較は一元ANOVAを用いて行った。
ヒトアルツハイマー海馬において、タウに関するGAG結合親和性の増大が観察された。更に、アルツハイマー病では、(核の周囲で濃い)HS及び過リン酸化タウの共存に伴う強力な染色が観察された。これら結果は、アルツハイマー病でHS含量が上昇することを示した。HSのこの上昇は、HSの構造及び組成変化を伴い、転写物過剰発現で検知される推定の3-O-硫酸化増加を伴っていた。3-O-硫酸化は、ヘパリンに特徴的に見出されるHS生合成の改変であり、3-O-スルホトランスフェラーゼ(3-OST)により行われる。3-OSTにより改変されたHSは、その後、アルツハイマー病で重要な役割を演じ得る。2つの3-OSTイソフォームの発現は、アルツハイマー病脳で顕著に上昇した。我々の結果は、ヘパリンにより誘導されるタウ立体構造変化がタウの過リン酸化を誘導し得ることを示す文献データにより補強されるが、アルツハイマー病脳由来のHSにおける稀な硫酸化パターンの病的徴候が病理に関与している可能性を示唆する。3-OSTに対応する転写物の存在が、本研究で使用したトランスジェニックhTAU-P301Lゼブラフィッシュモデルにおいて確証された。このモデルはまた、タウタンパク質の異常な過リン酸化により特徴付けられる。
ここで、モルホリノによる3-OST-2発現の減少によって、異常タウ過リン酸化の蓄積が顕著に減少することがインビボで証明されている。このことは、リン酸化プロセスにおけるHSの必須要件を強力に示唆する。特に、HSの構造及び組成は、病的タウ改変に3-O-硫酸化を必要とするようである。
アルツハイマー病に存在する3-O-硫酸化HSの構造に誘導される変化、続く3-OST-2の阻害は、微小管分解及び該タンパク質の重合化(この重合化は不溶性PHFの形成をもたらす)を促進する可能性のあるタウ立体構造変化を予防し得る。これら変化は、タウをホスファターゼに曝して、リン酸化タウ蓄積レベルの低下を導き得る。幾つかの証拠が、オリゴマー形態のタウもまた、疾患病理に或る役割を有し得、タウ凝集を標的する薬剤を用いるNFTの解体がおそらくは利用可能なタウオリゴマー量の上昇を生じ得ることを示唆する。このように、3-OST-2の阻害は、細胞を、タウ異常リン酸化、微小管分解及びPHF形成から保護する。
この研究の結果は、タンパク質キナーゼの阻害又はNFT脱凝集ストラテジ以外のアプローチでタウリン酸化を標的することの実現可能性を示唆する。インビボにてタウのリン酸化に対する3-OST-2モルホリノの阻害効果及び/又は細胞におけるsiRNAの使用により、阻害効果の機序に関する更なる研究が可能になる。
F6又は他のHMを、分化及び未分化ヒトSH-SY5Y細胞(Datkiら,2003)において、Ab42毒性を改変する能力についてアッセイした。未分化SH-SY5Y細胞を、10% FBSを補充したDMEM中37℃にて5% CO2で維持した。アッセイのために、細胞を96ウェルプレートに15,000細胞/ウェルで播種し、10% FBSを補充したDMEM中24時間維持した。分化細胞アッセイのために、培地に10μMレチノール酸(Sigma-Aldrich)を補充し、細胞を3日間分化させた。未分化細胞アッセイについてはレチノール酸処理を行わなかった。示されたとおりのヒトAβ25-35ペプチド又はAβ42ペプチド(Sigma-Aldrich)を、水溶液(50μM)中で、rtにて3日間穏やかに振盪させることにより、即席に凝集させた。次いで、凝集Aβ42を分化又は未分化細胞に、Aβ42については10μMで、Aβ25-35については25μMで加えた(最終濃度)。このAβ42ペプチド濃度は、50%近辺の細胞生存度が得られるように用量-効果実験により固定した(データは示さず)。F6又は他の分子を細胞に1又は10μg/mLの最終濃度で凝集Aβ42ペプチドと共に加え、細胞を1日間インキュベートした。MTTアッセイ(Mosmann, 1983)で細胞生存度を測定した。簡潔には、培地を交換し、10μLのMTTストック溶液(5mg/mL)を各ウェルに加えた。細胞を2時間rtにてインキュベートし、MTT溶液を廃棄した。DMSOを各ウェルに加え、光学密度を560nmで読み取った。光学密度は、分化及び未分化の両方の細胞についての較正曲線(データは示さず)により、細胞数に直接相関させた。
この研究で使用したヘパラン硫酸模擬体の構造的特徴(実施例14)
Claims (18)
- a)配列番号71で示されるセンスsiRNA及び配列番号72で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号73で示されるセンスsiRNA及び配列番号74で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号75で示されるセンスsiRNA及び配列番号76で示されるアンチセンスsiRNA、配列番号77で示されるセンスsiRNA及び配列番号78で示されるアンチセンスsiRNAからなるリストから選択されるsiRNA、又は配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び/又は
b)プロタミン又は硫酸プロタミン
からなる群より選択される少なくとも1つの剤を含んでなる、タウオパチー、特にアルツハイマー病の治療又は予防に使用するための組成物。 - (1)
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つのレベル及び/又は活性、
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つのレベル及び/又は活性、
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つのレベル及び/又は活性、並びに
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物の変異型であって、該遺伝子又は該転写産物又は該翻訳産物と少なくとも90%の配列同一性を示し、3-O-スルホントランスフェラーゼ活性を有する変異型のレベル及び/又は活性
の1又は2以上、或いは
(2)
a)〜d)の1又は2以上と、
e)3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベル及び/又は活性、及び
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性
の一方又は両方、或いは
(3)
e)及びf)
を、対象者から事前に得た生物学的流体サンプルにおいて測定し、前記レベル及び/又は前記活性を、既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの参照値と比較することを含んでなり、
前記遺伝子、前記転写産物、前記翻訳産物、前記変異型、前記3-O-硫酸化ヘパラン硫酸並びに前記タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の少なくとも1つのレベル及び/又は活性が対象者サンプル中で上昇していることが神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)を示すか又は前記神経変性疾患を発症するリスクを示す、対象者における神経変性疾患の診断若しくは予後予測若しくは経過観察又は対象者が前記神経変性疾患を発症する増大したリスクにあるかどうかの決定を補助するためのデータの取得方法。 - 前記神経変性疾患がタウオパチーである請求項2に記載の方法。
- タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベルがそれぞれの参照値に比べて少なくとも10%上昇している、請求項3に記載の方法。
- 前記生物学的流体がCSFであり、対象者における以下:
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される前記遺伝子、及び
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の前記転写産物、及び
c)配列番号2及び4でそれぞれ示される前記遺伝子の前記翻訳産物、及び
d)前記遺伝子又は前記転写産物又は前記翻訳産物の変異型であって、該遺伝子又は該転写産物又は該翻訳産物と少なくとも90%の配列同一性を示し、3-O-スルホントランスフェラーゼ活性を有する変異型、及び
e)3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベルがそれぞれの参照値と実質的に同じであり、
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇しており、特に少なくとも10%上昇している、請求項3又は4に記載の方法。 - 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項2に記載の方法。
- 配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルがリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇している、請求項6に記載の方法。
- 配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルがリアルタイムPCRで測定するとき少なくとも100%上昇している、請求項6に記載の方法。
- リアルタイムPCRで測定するとき、配列番号1で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100%上昇しており、配列番号3で示される遺伝子の転写産物のレベルが少なくとも100%上昇している、請求項6に記載の方法。
- 配列番号2で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇している、請求項6に記載の方法。
- 配列番号4で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇している、請求項6に記載の方法。
- 配列番号2で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがELISA又はウェスタンブロットで測定するとき少なくとも50%上昇しており、配列番号4で示される前記遺伝子の前記翻訳産物のレベルがウェスタンブロット、ELISA、質量分析法又は免疫組織化学法で測定するとき少なくとも50%上昇している、請求項6に記載の方法。
- ヘパラン硫酸のレベル及び/又は活性を測定することを更に含んでなり、前記レベル及び/又は活性が参照値と比較して少なくとも50%上昇していることがアルツハイマー病を示す、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
- f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質のレベル及び/又は活性を測定すること
を更に含んでなり、それぞれの参照値と比較して少なくとも10%の上昇がアルツハイマー病を示す、請求項7〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 前記生物学的流体がCSFであり、以下:
a)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼ2及び4をそれぞれコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、及び
b)配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つ、及び
c)それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物、及び
d)3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖
の活性及び/又はレベル、及び
f)タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベルが対象者においてそれぞれの参照値と比較して上昇している、請求項6〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 以下:
配列番号1及び/又は配列番号3を増幅するプライマー組合せ、及び/又は
配列番号2及び/又は配列番号4を検出する特異的抗体
を含んでなる、タウオパチー、特にアルツハイマー病の診断キット。 - 以下:
a)神経変性疾患に罹患した動物、特に哺乳動物から事前に採集した生物学的流体サンプルを、試験化合物と接触させ、
b)
(1)
i.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つのレベル及び/又は活性、
ii.配列番号1及び配列番号3で示され、ヘパリン-グルコサミン 3-O-スルホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される遺伝子の転写産物の少なくとも1つのレベル及び/又は活性、
iii.それぞれ配列番号2及び4で示される前記遺伝子の翻訳産物の少なくとも1つのレベル及び/又は活性、並びに
iv.前記遺伝子又は転写若しくは翻訳産物のフラグメント又は誘導体又は変異型であって、該遺伝子又は転写若しくは翻訳産物と少なくとも90%の同一性を示し、3-O-スルホントランスフェラーゼ活性を有するフラグメント又は誘導体又は変異型のレベル及び/又は活性
の1又は2以上、或いは
(2)
i〜ivの1又は2以上と、
v.3-O-硫酸化ヘパラン硫酸、とりわけ3-O-硫酸化ヘパラン硫酸二糖のレベル及び/又は活性、及び
vi.タウタンパク質の異常リン酸化及び/又は総タウタンパク質の活性及び/又はレベル
の一方又は両方、或いは
(3)
v及びvi
を測定し、
c)神経変性疾患を有する哺乳動物から事前に採集した、前記化合物に接触させていないコントロールの生物学的流体サンプル中の活性及び/又はレベルを測定し、
d)接触させた生物学的流体サンプル中の前記活性及び/又はレベルと、非接触の生物学的流体サンプル中のものとの差を比較することを含んでなり、
接触させたサンプルの前記活性及び/又はレベルの変化が、試験化合物が前記疾患のモジュレーターであることを示す、
神経変性疾患、有利にはタウオパチー、特にアルツハイマー病(但し、前記神経変性疾患はプリオン病とは異なる)のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング方法。 - 前記哺乳動物がヒト又はマウス、例えばSAMP8マウス及び/又はADの3xTg-ADマウスモデルであるか、或いは前記動物がゼブラフィッシュである、請求項17に記載の方法。
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