JPH06507782A - アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルツハイマー　のアミロイド≦　を六ヒトν　の　え 関ＪＪＬ願 本出願は、本発明者の、１９９０年６月１５日に出願され、係属中の米国特許出 願第０７７５３８．８５７号の一部継続出願であり、ここで該原出願全体が参考 資料としてここに援用されており、本発明者はその出願に対し米国特許法第１２ ０条（３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，ｇ１２０）の下優先権を主張している。

１、ル咀五旦１ 本発明は、一般的に、疾患治療に関連した仮説を試験するうえで有用な動物モデ ルに関するものである。より特異的には、ｂ−アミロイドタンパク質、その前駆 体、および前述のタンパク質および前駆体の一部を偏在的に過剰発現する特定細 胞型をコードし、およびコードされる、外来性遺伝物質の特定遺伝子断片を含む 組換え哺乳動物に関するものである。

２．１Ｌ咀皇１１ 本発明の背景は、２つの面からなり：（１）遺伝子的に形質転換した生物体、お よび（２）アミロイド−シスに関連した遺伝物質の試験、に関するものである。

これらの面の両方について以下に示す。

２．１．１　−５ｌＬ１ 接合子の遺伝子的形質転換（およびその結果得られる胚および成熟生物体）は、 接合子の核または接合子の核の一部を最終的に形成する核遺伝物質に、外来性遺 伝物質を配置または挿入することにより行うことができることが知られている。

接合子および接合子から得られる生物体の遺伝子型は、・外来性遺伝物質の遺伝 子型を含み得る。さらに、接合子の中に外来性遺伝物質が含まれると、外来性遺 伝物質の表現型の発現が起こり得る。

外来性遺伝物質の遺伝子型は、接合子の細胞分裂の際に発現する。しかし、表現 型の発現、例えば、タンパク質産生物の産生、外来性遺伝物質の産生、接合子ま たは生物体の自然の表現型の変化は、特定の外来性遺伝物質が活性化している間 に、接合子または生物体の発達部位において起こり得る。

表現型発現の変化は、表現型発現の増加や減少あるいは、新規プロモーターおよ び／または制御配列の付加、あるいは表現型の既存のプロモーターおよび／また は制御配列の追加を含む、表現型の促進および／または制御における変化を含み 得る。

生物体の種々のタイプの遺伝子的形質転換が、１９８９年１０月１０日に発行さ れた米国特許第４．８７３．１９１号に詳細が示されており、この特許は、組換 え生物体を産生ずる方法を開示するための参考資料として本明細書に援用される 。生物体の遺伝子的形質転換は、インビボにおける分化中の遺伝子発現の分析と して、および遺伝的疾患の消失または軽減に使用し得る。

接合子の遺伝子的形質転換（およびその結果得られる成熟生物体）は、外来性遺 伝物質が接合子の分裂前に接合子の核部分の一部になるように外来性遺伝物質を 付加することにより行う。外来性遺伝物質が接合子の有糸分裂または細胞分裂の 後に付加された場合、この外来性遺伝物質は、生じた各校に付加する必要がある 。しかし、この外来性遺伝物質が組み込まれ得ず、そしてこの接合子およびそれ から生じる生物体の遺伝物質の一部となる可能性がある。このように、この外来 性遺伝物質は、接合子核を含む、接合子の核の一部分を最終的に形成するすべて の核遺伝物質に付加し得る。

形質転換された生物体の核遺伝物質は、外来性遺伝物質を取り込むことのできる 生物的状態にある必要がある。これを達成するには多くの方法がある。例として 、外来性遺伝物質は、積厚細胞または卵原細胞等の二倍体の生殖始原細胞の核に 配置することができる。この原基形成芽胞細胞は配偶子に成熟し、その後、別の 配偶子、または染色体の一倍体セットの供給源と合体して接合子となる。

外来性遺伝物質は、成熟卵の核に配置し得る。卵は、受精状態または活性化状態 （重傷生殖による）であることが好ましい。外来性遺伝物質の添加後、染色体の 相補的−倍体セット（例、精子細胞またはポラ−ボディ）を添加し、接合子を形 成し得る。この接合子は、偽値妊娠した雌に取り込ませるなどにより生物体に発 達させることができる。得られた生物体は、外来性遺伝物質の組み込みにより分 析する。組み込み陽性である場合、この生物体は、特定の遺伝的疾患に関連して いると考えられる遺伝子発現のインビボにおける分析に用い得る。

前述の組換え動物を利用して遺伝的疾患の多くの異なるタイプを検査する試みが なされた。アルツハイマー病の研究に関する試みは、ともに１９８９年７月２７ 日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ３９１０６６８９およびＰＣＴ出願ＷＯ３９１０ ６６９３の中で開示されており、これらの公開された出願は、アルツハイマー病 のβ−アミロイドタンパク質をフードする遺伝子配列、および該配列の組換え動 物のゲノム中への取り込みを開示する、参考資料として本明細書に援用される。

以下に詳細を示す通り、β−アミロイドタンパク質の産生は、アルツハイマー病 に関連すると考えられている。しかし、アルツハイマー病の脳内におけるアミロ イド生合成および沈着の分子メカニズムを明らかにするうえでの重大な障害は、 これが唯一ヒトにおける疾患であるため動物モデルに置き換えられないことであ った。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ３９１０６６８９およびＰＣＴ出願ＷＯ３９１ ０６６９３は、アミロイド産生に関連すると考えられる特定のＤＮＡ配列を開示 している。これらの特定の配列は、ＳＶ４０およびＪＣウィルスから得られた新 規に開発された腫瘍ウィルスベクターに融合され、構築物を作る。これらの構築 物は、アルツハイマー病の脳におけるアミロイド蓄積に関連があり得るアミロイ ド過剰発現のモデルを確立するため、トランスフェクト細胞および組換えマウス に利用される。

本発明の方法により作製した組換え動物は、アルツハイマー病の分子病理の面を 明らかにするための実験媒体を提供し、アミロイド蓄積を予防または抑制する治 療薬として適応可能な薬剤をスクリーニングする道具を提供する。

２．２．アルツハイマー　および　アミロイド　７８７６５才を越える米国民の ５％、８５才を越える米国民の１５％、を越える人々がアルツハイマー病の何ら かの型を示すといわれている。（Ｃｒｏｓｓ、　Ａ、Ｊ、　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌ　（１９８２）　８２　ニア７−８０；　Ｔｅｒｒｙ、　Ｒ，Ｄ、 、らＡｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ　（１９８３）　１４　：　４９７５０６）。

長期間のケア施設において、高齢者が寝たきりになる主な原因は、この疾患であ り、専門的介護施設において死亡する高齢者の約６５％がこの疾患に罹患してい ると考えられている。

アルツハイマー病における生化学的および代謝現象に関する一部の事実は知られ ている。アルツハイマー病の脳には、２つの形態学的および組織病理学的変化が みられ、それらは、神経細線維変性（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎ ｇｌｅｓ　ＮＦＴ）およびアミロイド沈着である。神経内の神経細線維変性は、 他の変性疾患にもみられるが、神経内間隙（神経炎性斑）およびその周囲の微小 血管系（血管性斑）の両方におけるアミロイド沈着の存在は、アルツハイマー病 の特徴と考えられる。これらのうち、神経炎性斑が最も普通にみられる（　Ｐｒ １ｃｅ、　Ｄ、　Ｌ、　、らｐｒｕ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｗｅｎｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　（１９８５）　ｃＬ：　５９−６８）　ａ　ｍハ、マタアルツハイマー病が 進行した高齢のダウン症候群患者の脳にもみられる。

これらの斑の大部分を構成するタンパク質は、部分的に精製され、配列決定され ている。死亡したアルツハイマー病患者の斑に富む脳を供給源として用い、本明 細書において「β−アミロイドコアタンパク質」と呼ぶ、約４．２ｋｄの「コア 」ポリペプチド、アミロイド斑コアタンパク質（ＡＰＣＰ）を抽出した。このペ プチドは、Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、、らによりβ−タンパク質と名付けられた［ Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏａｕ＊ｕｎ　（１９８４）　１ ２０：　８８５−８９０］。アミノ末端のアミノ酸配列は、決定され［Ｇｌｅｎ ｎｅｒ、Ｇ、、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏ＋ｕ＋ｕｎ 　（１９８４）　１２２　：　１１３１−１１３５　；　Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｃ， Ｌ、、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８５）υ： 　４２４５−４２５９］　、この２グループにより報告されたアミノ酸配列は、 アルツハイマー病脳血管アミロイドについて、Ｇ　１ｅｎｎｅｒらは、１１位を グルタミンと報告し、Ｍａｓｔｅｒらは１１位をグルタミン酸と報告した以外は 同一である。さらに、前者の著者らは、脳血管アミロイドが独有のアミン末端を 有すると報告しているが、後者の著者らは、アミロイド斑コアに見い出された型 が「欠損のある」アミノ末端を有すること、すなわち、この供給源から単離され たペプチドのアミノ末端から３．７．あるいは８番目のアミノ酸が欠損している ことを報告している。両グループ共、成人ダウン症候群罹患者のアミロイド斑コ アおよび血管アミロイドにおいても同じペプチドが見いだされることを示し、１ １位のグルタミン酸を報告している。

β−アミロイドコアタンパク質に関する研究は、さらに、Ｒｏｈｅｒ、　Ａ、、 らＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８６）　８３　：　 ２６６２−２６６６も行っており、β−タンパク質の完全なアミノ酸組成が示さ れ、既知のタンパクと一致しないことが確かめられた。

しかし、該組成はＡ１１ｓｏｐ、　Ｄ、、らＢｒａｉｎ　Ｒｅｓ　（１９８３） 　２５９　：３４ｇ３５２の組成と一致せず、ＧｌｅｎｎｅｒまたはＭａｓｔｅ ｒｓ　（上記）により公表されたそれらとも一致しなかった。

Ｗｏｅ、ＣＪ、ら、Ｐｒａｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８５ ）　８２：　８７２９−８７３２は、Ｍａｓｔｅｒｓ　（上記）により示された β−アミロイドコアタンパク質の最初の１０個のアミノ酸と相同性のある合成ペ プチドが、マウスにおいて抗体を産生じ得ること、さらにこれらの抗体をアミロ イド沈着脳血管だけでなく神経炎天の染色にも用い得ることを示した。これらの 結果は、アミノ酸８−１７に対応した合成ペプチドに対するモノクロナル抗体を 用いて、Ａ１１ｓｏｐ、Ｄ、ら、Ｎｅｕｒｏｓｅｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（ １９８６）　６８；２５２−２５６により確かめられた。従って、一般的に、ア ルツハイマー病患者の脳の種々の部位にみられる斑タンパク質は、免疫反応的に 類似であると考えられる。このタンパク質は、洗浄剤およびカオトロピズム剤等 の汎用される多（の変性剤中でも溶解されないことから、高度な不溶性を示す。

（Ｍａｓｔｅｒｓ、上記。

Ａ１１ｓｏｐ、　Ｄ、ら（上記））。

他のアミロイドタンパク質との類似性により、β−アミロイドコアタンパク質は 、末梢循環系あるいはリンパ系における前駆体から生成され得ると考えられる。

アミロイド前駆体タンパク質の性質が知られている疾患に関連したアミロイド沈 着の例として、６例が知られている：原発性アミロイド−シス、供給源は免疫グ ロブリンＬ鎖；続発性アミロイド−シス、前駆体はアミロイドＡタンパク質；家 族性アミロイド多発性神経障害および老年性心臓アミロイド−シスにおいては、 トランスチレイチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｉｔｉｎ）またはその変異体として も知られているプレアルブミン；甲状腺の髄様癌においては、プロカルシトニン 断片；および遺伝性脳出血においては、シスタチンＣとして示されるγトレース 断面。（例として、Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、、Ｎｅｗ　Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕ ｒｎａ上ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９８０）３０２　：１２８３　；　５ｌ ｅｔｔｏｎ、　Ｋ、、らＢｉｏｃｈｅ＋＋　Ｊ　（１９８１）　１９５　：　５ ６１；　Ｂｅｎｄｉｔｔ、ら　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　（１９７１）　１９　：　 １６９　；　５ｌｅｔｔｏｎ、　Ｋ。

、らＥｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９７４）　４１　：　１１７　；　５ｌ ｅｔｔｏｎ、Ｋ、、ら　Ｌ−ム■蜘Δ（１９７６）　１４３　：　９９３を参照 ）。前述は、一部分であり、少なくとも甲状腺癌のアミロイドの前駆体としての プロカルシトニン断片に関する参考文献は、他に多（ある。その代り、あるいは さらに、β−アミロイドコアタンパク質の前駆体は、脳その池で産生され、脳内 に特異的に沈着し得る。

β−アミロイドコアタンパク質（Ａ４と呼ぶ）配列を、より大きなタンパク質の フレーム枠中に含むタンパクが存在することが示されている（　Ｋａｎｇ、　Ｊ 、　、らＮａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２５　ニア３３−７３６）。このタン パク質は、β−アミロイドコアタンパク質のインビボにおける前駆体である可能 性があり、ヒト胎児脳組織ｃＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡクローン の配列から予測され、６９５個のアミノ酸残基からなり（Ａ６９５と呼ぶ）、そ の５９７位からβ−アミロイドコアタンパク質のアミノ末端が開始する。上記に 示された配列との類似性により、前述の前駆体またはその断片が、アルツハイマ ー病患者の方が非罹患者に比べ区別可能な程高濃度で血清中を循環し得る。ある いは、このような差は、脳を髄液中に検出され得る。あるいは、さらに血清中と 脳を髄液中の中に両方検出される。

Ｋａｎｇらにより示されたＡ６９５の他にも、多くの前駆体タンパク質がある。

このような前駆体タンパク質の１つは、１９８９年６月６日に出願され、本発明 者と同じ研究組織の研究者による係属中の同種出願、米国特許出願第３６１，９ １２号に示されている（Ａ７５１）。他に、少し大きな７７０個のアミノ酸のア ミロイド前駆体タンパク質も特性決定されている０［ｉｔａｇｕｃｌら、Ｎａｔ ｕｒｅ　３３１　：　５３０−５３２　（１９８８））。これらのＡ７５１およ びＡ７７０タンパク質は、Ａ６９５を越えて約５７アミノ酸挿入を含む。この特 定の５７個のアミノ酸挿入配列は、多くのセリンプロテアーゼに特異的な多くの クニッツ型阻害物質と高度な相同性を示す。

Ａ７７０型タンパク質中の５７個のアミノ酸挿入部位に隣接してさらに１９個の アミノ酸が存在する。

上記刊行物および引用されていない多くの他の刊行物に示されている通り、β− アミロイド前駆体タンパク質の産生をコードする遺伝物質が、より高次な試験の 対象となる。しかし、現時点では、アルツハイマー病患者脳におけるアミロイド タンパク質の産生および沈着を調節する特異的メカニズムに関して利用可能な、 直接的で証明可能な情報はない。β−アミロイド前駆体タンパク質の産生をコー ドする遺伝物質は、第２１型染色体上にあることが知られている。さらに、数多 くの研究において、この染色体上の遺伝物質を含む複雑な相互作用があることが 示唆されている。このような相互作用は、前駆体タンパク質、プロテアーゼ、プ ロテアーゼインヒビターの産生を含むと考えられている。さらに、アルツハイマ ー病患者においては、これらの相互作用がある程度異常となり、通常β−アミロ イドコアタンパク質が脳内に高濃度産生および／または沈着する。この高濃度β −アミロイドコアタンパク質は、このようなタンパク質の過剰産生および／また は一度切断されたこのようなタンパク質の十分な数の切断不能を含む、種々の生 化学的活性の結果であり得る。

本発明の組換え哺乳類は、これらの相互作用がどのようにかつどこで起こるかに 関して洞察を提供し、それにより、脳内のβ−アミロイドコアタンパク質の蓄積 を予防しあるいは減少させる薬物の有効性を試験するためのより有用なモデルを 提供する。本発明のヒト以外の組換え哺乳類は、神経組織一般的におよび／また は脳等の特定タイプの神経組織等の特定組織において、このタンパク質を発現可 能にする特異的プロモーターに融合する、β−アミロイド前駆体タンパク質の特 異的セグメントを有する、組換え遺伝物質を含む。

３、産月ドη」旨 本発明は、β−アミロイドタンパク質（より重要には、脳内の）の生合成および 、より重要には生合成と沈着の抑制に関する分子メカニズムを、産生の抑制およ び／または産生後の切断促進により確認する方法を提供する。アルツノ１イマー 病の症状に関連のある、クローニングされた組換えまたは合成りＮＡ配列は、授 精した哺乳類の卵（好ましくは、マウスの卵）に注射する。注射した卵を疑似妊 娠した雌性動物に移植し、アルツハイマー病の症状に関連するタン７＜り質を発 現する細胞を有する組換えマウスを得るために妊娠満期間まで育てる。

注射した配列は、組換え哺乳類の特定の組織において、目的の、タンパク質を発 現するように、プロモーター配列を結合させた構築物である。

β−アミロイドファタンパク質Ａ９９およびＡ４２（本明細書で定義された）は 、最初に前駆体タンパクＡ６９５および／またはＡ７５１の形で発現すると考え られる。この前駆体タンノくり質は、プロテアーゼ酵素の作用を受け得、β−ア ミロイドコアタンパク質を生成し、これを十分量生成すると、アルツノ１イマー 病に関連した斑を形成する。本発明の重要な側面は、特定の細胞（例えば、神経 細胞）においてＡ４２、Ａ９９、Ａ６９５、およびＡ７５１のすべての産生をコ ードする配列に関するものであり、そして、β−アミロイド前駆体タンパク質を 、β−アミロイドコアタンパク質に変換し得るタンパク質分解酵素の作用を制御 したり、あるいはβ−アミロイドコアタンノくり質を異化または分解するタンパ ク質分解酵素（あるいは酵素群）を制御し得るプロテアーゼインヒビターをコー ドする配列に関するものである。

本発明に関連して、特定のβ−アミロイド前駆体タンパク質およびβ−アミロイ ドコアタンパク質の産生をコードするヌクレオチド配列は、特定のプロモーター 配列に結合している。このプロモータ配列は、注意深く選択し、それによって一 部の配列は、すべてのタイプの組織に付着するヌクレオチドを発見し、一方、他 のプロモーター配列は、神経組織等、特定のタイプの組織の特定のタイプの細胞 内にプロモータが存在する場合にのみ、結合したヌクレオチドを発現する。

前述の組換えマウスを作成することにより、アルツノ１イマー病の脳内において 、β−アミロイドコアタン／ｆり質がどのようにして、およびどこに産生され（ そして時々分解され）そして沈着するかに関する付加的情報が得られる。β−ア ミロイドコアタンパク質の産生（および分解）および沈着のメカニズムおよび部 位に関するこの付加的な情報を用いると、このようなタンパク質の産生および／ または沈着を予防し、アルツハイマー病を緩和または予防する効力に関して、よ り効果的に治療薬を試験し得る。

さらに、本発明の重要な側面は、５７個のアミノ酸からなるプロテアーゼインヒ ビターのアナログをフードするＤＮＡ配列を含む組み換え哺乳動物の産生であり 、このアナログは、改変したプロテアーゼ特異性を持つインヒビターを産生ずる ために効果的な、少なくとも１つ以上のアミノ酸の置換を含む。

本発明の組換え哺乳動物は、インビボにおいて、タンパク質問の相互関係、およ びタンパク質とアルツハイマー病治療への有用性を試験する他の化合物との関係 を検討するモデルとして有用である。

３．１．　・　。

本発明の主要目的は、β−アミロイドコアタンパク質またはそのアナログの細胞 タイプ特異的発現をコードする組換えＤＮＡ配列を含む細胞を有する、ヒト以外 の組換え哺乳動物を提供することであり、この哺乳動物は、アルツハイマー病の 病因および疾患治療薬の有効性の研究に用い得る。

本発明の利点は、β−アミロイドコアタンパク質の生合成およびにアルツハイマ ー病に関した斑の形成に関し、異なる組織（例として、特定タイプの神経組織及 び非神経組織を含む神経組織）において異なるタンパク質の発現作用を検討する インビボの方法を提供することである。

本発明の別の目的は、細胞特異的プロモーター配列、および１つ以上のβ−アミ ロイド前駆体タンパク質のみを、または、アルツハイマー病の病因研究に用い得 るある種のプロテアーゼインヒビタータンパク質をともにフードする配列からな る組換えＤＮＡ配列を含む細胞を有するヒト以外の組換え哺乳類動物を提供する ことである。

本発明のさらに別の目的は、神経組織および神経組織サブタイプおよび／または すべてのタイプの組織において、β−アミロイド前駆体タンパク質を偏在的に発 現する、特徴的なプロモーター／コード配列を細胞内に有する組換えマウスを提 供することである。

本発明の他の面は、β−アミロイド前駆体タンパク質を単独で、またはインヒビ タータンパク質と組み合わせて、ゲノム中の取り込んだ場合に、組換え哺乳動物 の種々の組織中で発現するプロモーター／コード配列構築物の合成と使用に関す る。本発明の組換え哺乳動物の特徴は、アルツハイマー病の研究および被験動物 のアルツハイマー病治療における薬剤の有効性測定において、予後診断および診 断方法の両方を提供することである。最初、組換えマウスは、アルツハイマー病 の疾病素因に関連するβ−アミロイドタンパク質の代謝（あるいはその生成抑制 ）を可能とする１つ以上の候補化合物を同定するための標準として用いられる。

本発明のさらに別の面は、組織特異的プロモーター配列、および神経組織内でイ ンヒビターを特異的に発現可能なプロモーターを含む５７個のアミノ酸を有する プロテアーゼインヒビターおよび／またはアナログの発現をコードする配列から なる、組換えＤＮＡ配列を取り込んだ組換え哺乳動物に関するものである。

本発明のその他の目的、利点、特徴は、β−アミロイドコアタンパク質産生およ び沈着のメカニズムと部位に関する情報を提供するヒト以外の組換え哺乳動物を 提供し、そしてこのような産生および／または沈着を妨害あるいは予防し得る試 験薬物のインビボモデルを提供することを含む。

本発明のこれらの、およびその他の目的、特徴、利点は、以下の本発明のより詳 細な明細書および添付図面により明かである。

４、ｉ星広二皿旦１皿 図１−Ｌ　１−２．１−３および１−４を含む図１は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４と 名付けられたｃＤＮＡクローンの塩基配列を示し、これは、β−アミロイド前駆 体タンパク質の１−７５１のアミノ酸をコードする。Ｋａｎｇらの配列とこのク ローンを区別する１６８ｂｐの挿入部分に下線を付した。

図２は、Ａ９９のアミノ酸配列を示す。

図３は、β−アミロイドコアタンパク質に対応するＡ４２のアミノ酸配列を示す 。

図４は、Ａ４２およびＡ９９に結合したＮＳＥプロモーターの構築ストラテジー を示す。

図５は、Ａ６９５およびＡ７５１に結合したＮＳＥプロモーターの構築ストラテ ジーを示す。

図６は、Ａ４２およびＡ９９に結合したＭＴプロモーターの構築ストラテジーを 示す。

図７は、ＭＴ−Ａ７５１およびＭＴ−Ａ６９５の発現のための哺乳動物細胞発現 ベクターの構築スキームを示す。

図８は、図８−１と８−２を含み、λＡＰＣＰ１６８ｉ４　ｔｓａｂｐ挿入部分 によりフードされるペプチドと、その多くがセリンプロテアーゼの阻害作用を示 す上位のタンパク質との関連性を示す。

図９は、ＮＳＥプロモーター配列およびＮＳＥのＰＣＲ増幅スキームを示す。

図１０は、β−アミロイドコア構築物のβ−アミロイド発現／選択のための哺乳 動物細胞発現ベクターの構築スキームを示す。

図１１Ａは、導入遺伝子Ｎ５Ｅ−Ａ７５１のスキーム図を示す。

図１１Ｂは、野生型および組み換えマウスから採取したＤＮＡのサザンブロ１ト を示す。

図１２（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は、ヒトおよびマウス脳の免疫ペルオキシダーゼ 染色を示す。

図１３　（Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥ）は、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１脳における免疫反応 性沈着物の顕微鏡写真を示す。

５、　な　の−なセロ 本発明による組換えマウスおよびそれらを薬物試験のために作成し利用する方法 を記載する前に、本発明が、記載された特定の方法や材料に限定されるものでは なく、材料および方法はもちろん改変し得る。また、本明細書で用いる用語は特 定実施例を説明する目的にのみ使われ、そして本発明の範囲は、添付の特許請求 の範囲によってのみ限定されるため、この説明により限定する意図はない。

本明細書および特許請求の範囲において用いられている、（ｒａＪ　ｒａｎＪ　 ｒｔｈｅＪの）単数表現は、本文中に明かな説明がない限り、複数表現を含むこ とを述べておく必要がある。

従って、例えば、「クローン」または「配列」の表現は、記載の型の複数形を含 み、「アミロイドタンパク質」の表現は、記載のタンパク質の複数形を含み、「 組み換えマウス」の表現は、異なる種類のマウスを含む。

（以下余白） ５．１．定１ 「コアタンパク質」および「β−アミロイドコアタンパク質−１という用語は、 図２に示す９９個のアミノ酸のタンパク質および図３に示す４２個のアミノ酸の 配列等のフラグメントを意味する。前述のタンパク質はまた、ここでは、Ａ９９ およびＡ４２とも記述される。４２個のアミノ酸のコアタンパク質は、Ｍａｓｔ ｅｒｓ、　Ｃ，Ｌら　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９ ８５）　８２　：　４２４５−４２４９により示されており、ここではｒＭａｓ ｔｅｒｓら」と記述する。

ｒＡ９９Ｊは、β−アミロイド前駆体のＣ末端の９９個のアミノ酸を示す記号で あり、「コアタンパク質」と考えられる。

ｒＡ４２Ｊは、β−アミロイド前駆体のコアタンパク質をさす。

このＮ末端は、４２個のアミノ酸のＮ末端と同じであるため、完全なコア領域を 含む。本願を通じて、Ａ４２という用語は、β−アミロイド前駆体タンパク質の ４２個のアミノ酸のコア配列に対応する。

「β−アミロイド関連タンパク質」は、ここでは以下のよいに定義される＝（１ ）図１に示す７５１個のアミノ酸のタンパク質、（２）図１に示す６９５個のア ミノ酸のタンパク質から下線の５７個のアミノ酸を除いたもの、（３）図１に示 す下線の５７個のアミノ酸、（４）（１）−＜３）のアナログおよびそれらのフ ラグメントを含み、Ａ９９およびＡ４２に限らない。例としては、この用語はＫ ａｎｇ、Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２５　：　７３３−７３６に より示されたタンパク質をさして用いられ、ここではｒ　Ｋａｎｇら」と記述さ れ、これは、６９５個のアミノ酸のタンパク質のアミノ酸５９７個の構造中のβ −アミロイドコアタンパク質を含む。

「β−アミロイド前駆体タンパク質Ｊは、上記で定義した「β−アミロイド関連 タンパク質」のサブグループを含む。

このような前駆体タンパク質は、最初ｒ　Ｋａｎｇら」により開示され、「β− アミロイドコアタンパク質」のより大きな前駆体として生体内で産生される。こ の７５１個のアミノ酸の配列は、本発明に関連して用いられるような前駆体タン パク質の最もよくみられる例である。

「免疫原性β−アミロイドコアペプチド」あるいは「免疫原性β−アミロイド関 連ペプチド」は、そのアミノ酸配列がβ−アミロイドコアタンパク質またはβ− アミロイド前駆体タンパク質の一部と一致し、免疫動物の抗体反応を刺激し得る ペプチドをさす。このようなタンパク質の例は、Ｋｉｔａｇｕｅｈｉら、Ｂｉｏ ｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈ　５ｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏ ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｖｏｌ、　１６６、　ＮｏＪ、　Ｆｅｂ　１４．１ ９９０に詳細に示されている。

「アルツハイマー病の遺伝的疾病素因」は、アルツハイマー病の患者またはアル ツハイマー病が発現するであろう患者のゲノム中で見られ、正常な（非罹患の） ヒトではみられないような、同定可能な遺伝的変異または改変をさす。

ここで用いられているｒＡ４ｉＪは、図１において下線を付けた５７個のアミノ 酸の配列をさす。ｒＡ４ｉＪは、バクテリオファージλＡＰＣＰ１６８ｉ４由来 のポリヌクレオチドによりフードされる新規セリンプロテアーゼインヒビターに 対応するポリペプチドであり得る。Ａ４ｉポリペプチドは、物理的にこのバクテ リオファージの発現産生物に由来する必要はないが、ペプチド合成を含めた組換 えＤＮＡ技術またはその組み合わせにより生成され得る。「対応する」というこ とは、指摘の配列と相同性があるとか、実質的に全く同等という意味である。

「遺伝物質」とは、精製された状態あるいは天然の状態のいずれかの状態のいず れのＤＮＡ配列あるいは複数のＤＮＡ配列をも含む物質である。例えば生体内で 生じたＤＮＡ配列または合成されたあるいは部分的に合成されたＤＮＡ配列のい ずれかである、染色体のフラグメントまたは染色体全体；１つの遺伝子または複 数の遺伝子を構成するＤＮＡ配列；および例えば、異なるＤＮＡ配列の結合によ って作製される遺伝子キメラが挙げられる。

遺伝物質は、取り込まれたＤＮＡ配列またはプラスミド、ウィルス、あるいはフ ァージにより担持された配列を包含しない。

「外来性遺伝物質」は、遺伝的に形質転換される特定の接合子を形成する特異的 芽胞細胞または配偶子から得られたり、またはそのような特異的芽胞細胞または 配偶子を生体内で形成したりしない遺伝物質である。

ｒＤＮＡ配列」は、４種のＤＮＡモノマー、すなわちアデニン、グアニン、ント シン、およびチミンのヌクレオチドの任意の組み合わせからなる直鎖状配列で、 それはアミノ酸、プロモーター、コントロールまたは遺伝子産生物のコード等の 遺伝的情報をフードする。特異的ＤＮＡ配列は、例えば、特定のポリペプチド、 特定の遺伝的特性をコードしたり、特定の表現型の発現に影響を与える、既知の 特異的機能を有するＤＮＡ配列のことである。

「遺伝子」とは、タンパク質の産生をコードし、転写を制御するかまたは転写に 影響を与える遺伝物質の、最も小さく、独立した機能を有する単位であり、それ は、１つ以上のＤＮＡ配列からなる。

「遺伝子型」とは、有機体の遺伝的構成である。

「表現型」は、細胞または有機体の有する形態学的、生理学的、生化学的特性の 集合であり、遺伝子型と環境との相互作用により決定される。

「表現型の発現」とは、例えば、ポリペプチドまたはタンパク等の産生物を産生 じたり、接合体または有機体の天然の表現型の発現を改変させたりする、１つの ＤＮＡ配列または複数のＤＮＡ配列のコードの発現をいう。

「接合子」とは、完全な有機体へ発達する可能性のある二倍体細胞である。この 接合子は、単為生殖、核移植、２つの配偶子の融合において、完全な有機体に発 達する可能性のある二倍体細胞を生成する、人工的なまたは天然の受精やその他 の方法により得られる。この接合子の起源は、植物界でも動物界でもよい。

「単為生殖」は、雌性または雄性配偶子の細胞への発達およびその有機体への発 達を可能とするいかなる方法でもあり、この方法は、雌性および雄性配偶子の自 然な発達とは異なる。

５．２．開ｊＪｕｌ股ｌ」臼１成 本発明を系統だてて開示および説明するため、発明の特定の局面を項目別に示す 。用語の定義は、上記５．１項に示しである。

以下の５．３項では、異なるタンパク質、前駆体タンパク質、インヒビターを発 現する種々のＤＮＡ配列および、特定の組織においてタンパク質の発現が得られ るようにこれらの配列と融合したプロモーター配列を示す。これらのＤＮＡ配列 は、この開示に関連した生物学的沈着および添付の図面の参照により、部分的に 示す。

開示５．４項は、５．３項に示す配列がタンパク質の産生を発現し得ることを確 かめるためのプロトコールを示す。

５．５項は、８種の異なるプロモーター／Ａ４配列構築物を示し、図４から図７ によって構築物の合成を示す。

５．６項は、上項で示すＤＮＡ配列、構築物および他の情報を利用して、本発明 の組換えマウスの産生方法を示す。

本発明の異なる局面と関連して用いられる種々の方法および材料は、５．７項に 示す。

詳細な実施例、特許請求の範囲、および要約書を以下に示す。

５．３．１凡人至且 本発明の組換えマウスを示すため、特定のＤＮＡ配列について説明する必要があ る。例えば、図１に示されるヌクレオチド配列およびこれに対応する推定アミノ 酸配列からなるβ−アミロイド前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列につい て記載することは重要である。このＤＮＡ配列は、β−アミロイド関連コアタン パク質を含む、約８２．６１０ダルトンのタンパク質をコードする。

本発明の組換えマウスを産生ずるための第１工程として、図１に示すβ−アミロ イドタンパク質のｃＤＮＡ配列は、当業者に既知のいかなる方法を用いても得る ことができる。Ａ７５１を得る１つの方法は、ｃＤＮＡクローンλＡＰＣＰＩＳ ８ｉ４を含むバクテリオファージから単離することによる。λ、へＰＣＰ１６８ 　ｉ４として既知のヒト線維芽胞細胞ｃＤＮＡクローンは、１９８７年７月１日 に、ＡＴＣＣから寄託され、受託番号Ｎｏ、　４０３４７を有する。

１６８塩基対の挿入物（図１の下線部）は、Ｋａｎｇらの配列のＶａ１２ｓ９の コドンを切断し、λＡＰＣＰ１６８ｉ４タンパク質からこのアミノ酸が欠損する ことになる。１６８塩基対挿入物は、欠損したＶａ１２ａ９コドンの３塩基対と 合わせて図１において下線で示される、新しい５７個のアミノ酸をコードする。

この挿入物の下流、図１のコドン６５３の部位に、β−アミロイドコアタンパク 質のアミノ末端アスパラギン酸が存在するとＭａｓｔｅｒｓらは述べている。

本発明の組換えマウスの独特の特徴は、Ａ４２、Ａ９９、Ａ６９５、Ａ７５１お よびＡ４ｉをコードする配列の前に細胞特異的プロモーターを含むことに関する （Ａ４ｉは、λＡＰＣＰ１６８ｉ４にみられる５７個のアミノ酸挿入物である） 。

特異的細胞型におけるこれらの特定のペプチド（その任意のフラグメントを包含 する）を選択的に発現する組換えマウスの能力によって、本発明の組換えマウス と他のマウスとは区別される。

本発明に関連して用いられるクローニングされた組換えＤＮＡおよび／または合 成りＮＡ配列は、生物学的に活性を有し、折り畳まれたタンパク質の産生をコー ドする配列であり、そのタンパク質は、好ましくは、以下からなる群より選択さ れるＡ４２　β−アミロイドコア領域　３ Ａ９９　β−アミロイドカルボキシ末端　２Ａ６９５　β−アミロイド前駆体タ ンパク質　１Ａ７５１　前駆体＋インヒビター　１ Ａ４ｉ　プロテアーゼインヒビター　ｌＡ４４は、図１において下線で示されて おり、一般的にまたは特異的な細胞においてＡ４ｉを発現する配列を含むマウス は、本発明の一部である（すなわち細胞特異的プロモーターにもかかわらず）。

なぜならば、Ａ４ｉ部分はそのものがアルツノ）ゴマ−病の影響の予防または軽 減に有用な化合物であるからである。Ａ４ｉを発現する配列を含む組換え動物は 、現在まで知られていない。

５．４．、ｕヱーロ【生 組換えマウスを作るのに用いられる、好ましいｃＤＮＡクローンには、Ａ４２、 Ａ９９、Ａ６９５、Ａ７５１およびＡ４ｉのうちいずれか１つを得るために発現 し得るコード配列が包含される。複製のために、およびタンパク質の産生を確認 するために、最初にこれらの配列を適切な発現ベクター中に挿入する。

簡単にいうと、ｐＡＰｃＰｌ　１８−３と示されているＥ、　ｃｏｌｔ発現ベク ターは、図１に示されているアミノ酸残基６５５−７５１からなる融合タンパク 質を発現するために構築された。ｐＡＰｃＰｌｌｇ−３の構築は、次の３つのフ ラグメントを結合することによって行われた（１）プラスミド骨格（＋）ＢＲ３ ２２複製機能、アンピシリン耐性遺伝子、トワブトファンプロモーターおよびオ ペレーター、リポソーム結合部位、β−ガラクトシターゼ構造遺伝子の７個のア ミノ末端のコドン、次いで６個のスレオニン残基をコードするＤＮＡ、および転 写末端シグナルからなる）；（２）図１の配列のアミノ酸残基６５５−７２８を コードするＥｃｏＲＩ−１（ａｅｌｌフラグメント；および（３）図１の配列の アミノ酸残基７２９−７５１、次いで、終止コドンをフードする合成フラグメン ト。

得られたベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０を形質転換するために用いられ 、融合タンパク質の発現はトリプトファン濃度を低下させること次いで３−β− インドールアクリル酸を添加することによって誘導された。得られたタンノくり 質は従来の精製技術を用いることによって精製することができ、得られた精製物 質は、診断分析のための抗体を産生ずるのに用いることができる。

図１に示したβ〜ルアミロイド駆体タンパク質の完全なコード配列は、沈着した えＡＰＣＰ１６８１４クローン由来の２個のフラグメントにサブクローニングさ れ、ｐｓｃｌ工またはｐｔｌＶ１ワクシニアウィルス発現ベクターに挿入するた めに調製された。簡単にいえば、図１に例示されたタンパク質のアミノ酸残基６ ５５−７５１に及ぶ、約１．０６キロベース（ｋｂ）のＥｃｏＲＩフラグメント を、ｐ４Ｂ＋と称される中間体のベクターを作り出すためにｓ　ＥｃｏＲＩ消化 プラスミドｐＧＥＭ−３’ｒ′にクローニングした。次に、β−アミロイド関連 配列の３′非コ一ド配列の多くを取り除くために、ｐ４Ｂ＋を旧ｎｄｍで消化し た。得られたベクター９４Ｂ’ｆＲＩをＥｃｏＲＩで消化し、λＡＰＣＰ１６８ ｉ４に由来する２０８８ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに結合する前に、ウシ腸 アルカリホスファターゼを作用させることにより、ｐ４Ｔ４Ｂが形成された。こ のプラスミドをＳｍａｌおよびＸｍｎ１で消化することにより、図１に示された 配列をコードする完全なタンパク質を含む２６７８ｂｐのフラグメントを生成し た。

このＳｍａｌ−Ｘｍｎｌフラグメントでコードされた遺伝子、次に続くβ−アミ ロイド前駆体タンパク質のＣｖ−１サル腎臓細胞中の発現のために、Ｃｏｃｈｒ ａｎ、　Ｍ、　Ａ、ら、Ｐ　ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９ ８５）　８２　：　１９〜２３で説明されている真核細胞の一時的な発現を用い て、よく知られている２つのワクシニアウィルスベクター、ｐｓｃｌ　１および ｐＵＶｌ、のうちの一つの中に挿入した。より一般的には、これらのベクターは その配列がワタシニアウィルスのゲノム内に挿入された後に、動物におけるイン ビボでのタンパク質産生および抗体産生に用いられる。

同様に、哺乳類のベクターはβ−アミロイドコアタンパク質またはここで説明し たβ−７ミロイド前駆体タンパク質の発現に利用することができる。プロモータ ーとしてヒトβ−アクチンを用いる有効な哺乳類ベクターを図１０に示す。図１ ０に示したベクターの記述に関する詳細は次の通りである。

塩基対１−４３００は、ヒトβ−アクチン遺伝子単離体ｐ１４Ｔβ−１７の４． ３ｋｂのＥｃｏＲＩ　Ａｌｕｌフラグメントである（Ｌｅａｖｉｔｔら、初１、 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８４）　４　：　１９６１−１９６９）。

プロモーターの配列の詳細については、Ｎｇら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、（１９８５）　Ｓ−：　２７２０−２７３２を参照すること。キ＋　 ツブ部位、５′非關訳領域およびＩＶｓ　１位、を示す。５’ＵＴにも、また３ ′　スプライシング部位からＢａａ旧部位までのポリリンカー範囲にもＡＴＧコ ドンは存在しない。

塩基対４３００−４３２０は、一部ｐＳＰ６４ポリソンカーに由来する（　Ｍｅ ｌ　ｔｏｎら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　１２　：　７（ １３５−７０５６）。

塩基対４３２０−６６００は、ｐｃＤＶｌに由来し、（ＯｋａｖａｍａおよびＢ ｅｒｇ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８３）　＠　＋　２８０ −２８９）　、ｐＢＲ３２２ＡｍｐＲ遺伝子および細菌由来でＳＶ４０後期領域 ポリアデニル化シグナルを含有している。

塩基対６６００−１００００は、ＳＶ４０　ｏｒｉと早期プロモーターに結合し た、細菌性ｎｅｏ遺伝子を含有するｐｓＶ２−ｎｅｏ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎおよ びＢｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　、　Ｇｅｎｅｔ、（１９８２＞　１　：　 ３２７−３４１）由来のＰｖｕ　Ｕ　−ＥｃｏＲｌフラグメントである。転写の 方向は示した通りである。そのベクターは、Ｃ）１０細胞内の有効なタンパク質 発現に用いることができる。

もう一つの潜在的に有用なベクターの例は、プラスミドｐｈＧＨ−ＳＶ（１０） １９８７年４月１５日に発行されたＥＰＡ２１７．８２２に記載されており、か つここで参考として示されているプラスミドであり、それは、ｐＵｃ８プラスミ ド骨格、ｈＭＴ−ＩＩ　ａ遺伝子プロモーターおよびレギュレーター要素、Ｓ’ ／−４０ＤＮＡプロモーターおよびエンハサー要素、およびｈＧＨ遺伝子および ３′調節配列のコード部分を含有する。このプラスミドはＢａｌ１１旧およびＳ ｍａｌで消化され得、配列をフード化し、そして３′非コ一ド配列およびプラス ミド骨格に結合した調節要素を切り離す、ヒト成長ホルモンタンパク質を打ち消 すために、Ｂａｍ旧リンカ−で処理され得る。この約５１００の塩基対のＤＮＡ 単位はゲル精製され、Ｂａｎ旧リンカ−に結合している。

Ｂａｇ旧による消化、ＤＮＡフラグメントの再精製およびそれに続く結合によっ て、哺乳類細胞発現ベクターからなる構造および調節要素を含む、ｐＭＴｓＶ４ ＱポリＡ　Ｂａ１ｌと称されるプラスミドが生じる。ｐＭＴｓＶ４０　ポリＡ　 Ｂａｌ旧のＢａｍＨＩ消化およびＤＮＡポリメラーゼＩおよび４つのｄＮＴＰす べての存在下での修復の後に、このベクターは、プラスミドｐ４Ｔ４Ｂの一２６ ７８ｂｐのＳｍａｌ−Ｘｍｎｌ制限フラグメントの挿入に利用できる。次いで、 このベクターはＣ）１０細胞中の有効なタンパク質発現にも使用できる。

５．５．プロモーターＡ４１　Ａ β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする異なるＤＮＡ配列に対する２つの 異なるプロモーターのうちの一つを融合することによって、８種類の異なる融合 構築物は調製された。

ここで用いたプロモーター配列は、マウスのメタロチオネイン−１（ＭＴ）およ びラットの神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）であった。当業者に知られているこ れらのプロモーターまたは他の有用なプロモーターは、上述したようなタイプの 様々なＡ４配列に結合され得る。

構築物を精製するのに使用し、本発明に関連して組換えマウスに挿入した、ある 種の有用な神経特異性プロモーターは次の通りである。

（１）　フィラメントＭ　たはＬブロモ−−これらのプロモーターは高度の発現 を示し、そして最も豊富な神経タンパク質と関連して見い出される。それらはＣ ＮＳ／ＰＮＳニューロンの特異的発現によって特徴づけられており、組換え発現 に関して用いられてきた。このプロモーターのマウス遺伝子は、公表された配列 であり、プロモーター領域の単離は、本発明に関連してプロモーターを使用する ために必要である。

（２）り１／ア　ンバク　ＧＦＡＰプロモーター配列。

このようなプロモーターは、ネズミ特異性およびＣＮＳ／ＰＮＳＮＳ／時異的発 現によって特徴付けられる。このプロモーターは特徴付けられており、入手可能 である。

（３）　ンバク　４３ＧＡＰ４３　もまたＣＮＳ／ＰＮＳ神経細胞特異的発現に より特徴付けられる。このプロモーターは、発展的に発現され、損傷を誘導する 。ラットに存在するこのプロモーターは特徴付けられており、入手可能である。

（４）搬径或１１■−億捜ｌプロモーターは、ＰＮＳ発達性発現および、アルツ ハイマー病によって傷害を受ける部位と同じである、海馬および皮質中の中のＣ ＮＳ維持発現によって特徴付けられる。マウスの遺伝子プロモーターは公表され ており、このプロモーターの単離は可能であり、本発明に関して用いるために必 要である。

（５）ＪＣ’７　（Ｊ）　ｘ工、ｌｄを用いることができる。ヒトパピローマウ ィルスはニコーロン向性を有す。Ｔ　Ａｇプロモーターは特徴付けられており、 入手可能である。

（６）旺ハニユニは、非ニューロン細胞中の発現と比較すると、ＣｕＳ中の発現 レベルは１０倍高い。ＣＮＳ発現領域は特定の脳の領域に限られており、そのプ ロモーターは特徴付けられている。

（７）Ｎ−ＣＡＭ　・　はネズミのニューロン特異的発現を示す。

アルツハイマー病の病状に関して、何か特別な理論に限定されたくはないが、神 経系に独特なＡ６５９の前駆体の量に対するＡ７５１の前駆体の量の比率は、非 平衡状態にあり得、それはアルツハイマーの病状を引き起こす。この非平衡（一 種の前駆体の発現の過剰または不足によって生じる）は、アミロイドの過剰状態 を作る可能性があり、斑を作る。この理論に基づき、Ａ７５１またはＡ６９５β −アミロイドタンパク質前駆体を発現するように構築物を設計した。

その代わりに、Ａ６９５およびＡ７５１を細胞外タンパク質を溶解するように処 理するとき、遊離されるβ−アミロイド前駆体タンパク質（Ａ９９配列）のカル ボキシ末端の異化作用が不十分または不完全なために、アルツハイマー病の病状 が生じ得る（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ、　Ａ、ら、む上１．　（１９８９）　５７　 ：　１１５−１２６）　Ｏこの理論に基づき、カルボキシ末端（Ａ９９）または β−アミロイドコアタンパク質（Ａ−４２）を発現するように構築物を設計した 。

全ての構築物は、神経組繊に特異的であるか（ＮＳＥ）　、またはすべての型の 組織中で遍在して発現するか（ＭＴプロモーター）のいずれかの構築物を発現さ せるように設計された。

次の融合構築物は、本発明に関して有用な構築物である好ましい例である。

プロモーター　−一■酊舅−区 ＮＳＥ　Ａ４２コア領域　４ ＮＳＥ　Ａ９９カルボキシ末端　４ ＮＳＥ　Ａ７５１　５ ＮＳＥ　Ａ６９５　５ ＮＳＥ　Ａ４ｉ ＭＴ　Ａ７５１　６ ＭＴ　Ａ６９５　６ ＭＴ　Ａ４２コア領域　７ ＭＴ　Ａ９９カルボキシ末端　７ ＭＴ　＾４ｉ 上記のように、図４−７および１０に、異なる融合構築物を産生ずるのに用いた クローニング計画の詳細を示す。β〜アクチンＡ４２およびβ−アクチンＡ９９ プラスミドは、構築におて、それぞれＡ４２およびＡ９９配列の源として働いた ことを強調すべきである。Ａ４２およびＡ９９構築物で完全なコーディングの正 確性が維持された。それぞれは単にメチオニン開始コドンで処理されただけであ る。

β−アクチンＡ７５１およびβ〜アクチンＡ６９５ベクターは他のＮＳＥプロモ ーター構築物を調製するのに用いた。すべてのプラスミド構築物は制限酵素地図 分析によって確認されている。

すべての構築物はクローニング接続部位のＤＮＡ配列分析によって明確に確認さ れている。

融合構築物に用いたＭＴ−１プロモーターは、合成オリゴヌクレオチドを用いて 誘導された。ＭＴ−１プロモ一ター配列決定され、５ｖａｎｓｏｎ、　Ｌ、　Ｗ 、ら、「成長ホルモン融合遺伝子を発現する組換え動物の神経系における新しい 発達特異性Ｊ　ｓ　Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）　３１７　：　３６３−３６６、 によって詳細が説明されている。この文献はここでＭＴ−１プロモーターを記載 するための参考として示されている。ＭＴ−１プロモーター領域には３７３塩基 対が含まれており、ＤＮＡオリゴマーの合成および結合によってもＭＴ−１プロ モーターを構築することができる。

長さが７０−８０のヌクレオチドのオリゴマーの５対が用いられる。得られた３ ７３−塩基対フラグメントは、クローニングされ、そして配列決定され得る。Ｍ Ｔ−１プロモーターは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、マウスの ゲノムを選択的に増幅することによっても単離できる。増幅されたフラグメント はクローニングされ、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けられる。

ＭＴ−１プロモーターは配列決定され、５ｖａｎｓｏｎ、　Ｌ、　Ｗ、ら、「成 長ホルモン融合遺伝子を発現する組換え動物の神経系における新しい発達特異性 Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１７　：　３６３−３６６、によって詳 細が説明されている。この文献はＭＴ−１プロモーターを説明するためにここで 参考として示されている。

ラットのニューロン特異性エノラーゼプロモーター（ＮＳＥ）を単離するために 、２つの異なる方法もまた、用いることができる。このプロモーター領域のヌク レオチド配列についても発表されている。ＰＣＨに使用するために、およびゲノ ムライブラリーをスクリーニングするために、合成オリゴヌクレオチドを設計す ることは可能である。ＰＣＲおよびラットのゲノムＤＩＩＡを用いて重要な領域 を選択的に増幅するため、オリゴヌクレオチドブライマーが用いられた。１．１ ５キロ塩基対フラグメントを分離し、クローニング′した。ラットのゲノムライ ブラリーをスクリーニングするために、同じオリゴヌクレオチドがプローブとし て採用された。

ＤＮＡのＣＩＯ細胞内へのトランスフェクシゴン後に、ＣＡＴレポーター遺伝子 （すなわち、レポーター遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ）を有する一種の構築物の一時的な発現を評価することによって、ＭＴ−１プ ロモーターが機能的であることが証明された。

ＮＳＥプロモーターはまた、公表されたプロモーター配列（Ｓａｋｉｍｕｒａら 、Ｇｅｎｅ　（１９１３７）　６０　：　１０３−１１３、この文献はこのよう なプロモーターを明らかにするために参考として、ここで示されている）より設 計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、バンフ７０−ラット（ｂｕｆｆ ａｌｏ　ｒａｔ）のＤＮＡライブラリーから精製することができる。

１．２キロベースのイントロンを５°非翻訳領域に含む２．３キロベースのプロ モーター領域フラグメントを、１ｌｋｂクロ一ンカラホリメラーゼ遺伝子増幅反 応を用いて調製した。ＰＣＲ方法について、および使用したオリゴヌクレオチド プリマーについての詳細を図９に示す。

ＮＳＥプロモーターフラグメントの３′末端プライマーを、イントロンを持つ２ 個のヌクレオチド置換体と合わせることによって、クローニングのためのＮｃｏ １部位が製造され、そしてＡ４配列の開始メチオニンコドンが導入された。ポリ メラーゼ連鎖反応の増幅は誤差が低いと報告されていることを指摘しておく。

５６、柾」」３【窃 本発明の組換え生物は全て、その複数の細胞内に、アルツハイマー病の発病と関 係があると信じられている、クローニングされた組換えＤＮＡ配列または合成り ＮＡ配列が含まれている。

さらに詳細には、この組換え生物は組織特異性プロモーター配列オよびβ−アミ ロイド前駆体タンパク質を産生ずるためにコードされた配列を包含する、例えば 上に詳細に説明したような、外因性の遺伝物質の特異的な配列を含む。上記配列 を１つ以上用いた本発明の組換え生物の産生が可能であるため、外因性の遺伝物 質の一般的説明を基に、組換え生物の一般的な説明を行う。この一般的な説明は 、上述の特異的なりＮＡ配列を生物中に組み込み、そして、以下に述べる方法と 材料を用いて、これらの配列の発現を得るために、当業者によって適用され得る 。組換え生物の製造、および特に組換えマウスに関する詳細は、１９８９年１０ 月１０日発行の米国特許第４．８７３゜１９１号（組換えマウスを製造する方法 を開示するために、本明細書では参考文献として援用する）、およびその中で言 及および引用された多くの科学的な出版物を参照。

外因性遺伝物質は、雄または雌のいずれかの接合子の前核内に導入し得る。精子 が卵子に入った後可能な限り早く、雄の前核内に入れるのが好ましい。換言する と雄の前核の形成後、前核がはっきりと確認され十分分離し、それぞれが接合子 膜近く位置した時である。受精したマウス卵子の雄の前核は、本発明の外因性遺 伝物質の添加に好適な部位である。

卵子の核または接合子の雌の前核によりプロセッシングされる前に、外因性遺伝 物質を接合子の雄のＤＮＡ相補鎖に添加するのが最も好ましい。卵子の核または 雌の前核は、雄のＤＮＡ相補鎖に影響を与える分子を放出すると考えられている 。この分子はおそらく、雄のＤＮＡのプロタミンをヒストンに置き換え、それに より二倍体接合子を形成するための雌および雄のＤＮＡ相補鎖の結合を推進する 。

従って、雌の前核の影響を受ける前に、外因性遺伝物質を雄のＤＮＡ相補鎖また は池のＤＮＡの相補鎖に添加するのが好ましい。例えば、外因性遺伝物質を雄の 前核の形成後可能な限り早く、即ち、雄、および雌の前核が十分に分離し、そし て両方が細胞膜近くに位置する時に、早期の雄の前核に添加する。

あるいは、精子の核が凝縮を解くよう誘起された後、外因性遺伝物質を精子の核 に添加し得る。次に外因性遺伝物質を有する精子を卵子に加える、あるいは外因 性遺伝物質を添加された凝集を解いた精子を可能な限り早く卵子に加え得る。

本発明の目的は、接合子は完全な生物に成長し得る二倍体細胞の形成を行うこと が必要不可欠である。通常、接合子は、一つあるいは複数の配偶子から一倍体の 融合により、自然または人工的に形成した核を含有する一つの卵子を包含する。

従って、前記配偶子の核は自然に適合するもの、即ち、分化を行い、機能する生 物に発達し得る、生存能力のある接合子を与えなければならない。一般に、正倍 体の接合子が好ましい。異数体の接合子が得られたならば、染色体数は、いづれ かの配偶子が由来する生物の正倍体数よりも染色体の数は、１個以上変化し得な い。

同様の生物学的考察に加えて、物理学的接合子の核または、接合子膜の一部を形 成する遺伝物質の加え得る外因性遺伝物質の量を支配する物理的要因も存在する 。もし遺伝物質を除去しないならば、添加し得る外因性遺伝物質の量は、物理的 に妨げられずに結合する量によって制限される。一般に、挿入する外因性遺伝物 質の体積は、約１０ピコリツトルを越えない。添加の物理的な影響は接合子の生 存能力を物理的に破壊する程、大きくしてはならない。ＤＮＡ配列の数および種 類に関する生物学的制限は、特定の接合子および外因性遺伝物質の機能に依存し て変化するが、当業者には明白である。なぜなら、得られた接合子の外因性遺伝 物質を含む遺伝物質は、生物学的に分化を開始および維持させ、接合子を機能す る生物に発達させなけらばならないためである。

接合子に添加するＤＮＡ配列のコピー数は、添加した外因性遺伝物質の総量に依 存し、遺伝子的形質転換を起こさせる量である。理論的には、１個のコピーだけ 十分であるが、しがし、一般には、数多くのコピーを用いている。例えば、−個 のコピーの機能を保証するために、１．０００−２．０００個の遺伝子のコピー を用いる。本発明の場合、外因性ＤＮＡ配列の表現型の発現を促進する、（すな わち、β−アミロイド関連前駆体タンパク質およびプロテアーゼ阻害タンパク質 の遍在的発現を得るために）挿入した外因性ＤＮＡ配列の各々の少なくとも１つ 以上の機能するコピーを有するという利点がある。

細胞、核膜、または存在する他の細胞内構造または遺伝子構造を破壊しない限り 、外因性遺伝物質を核遺伝物質中に添加することのできるいかなる技術をも利用 し得る。この外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションにより核の遺伝物質 中へ挿入するのが好ましい。細胞および細胞内構造へのマイクロインジェクショ ンは当該分野で公知であり、使用さ九ている。

本発明による組換え哺乳類動物の製造は、外因性の遺伝物質を包含する。

外因性遺伝物質は、β−アミロイド関連タンパク質を産生ずるＤＮＡ配列であり 得る。さらに、その連鎖を神経細胞のような特定のタイプの細胞中でβ−アミロ イド関連タンパク質の発現を起こすことが好ましいプロモーターに結合し得、ま た、特定のタイプの神経細胞内で発現するようなプロモーターを含んでも良い。

本発明の好適な実施態様においては、組換え動物は、β−アミロイド前駆体タン パク質の産生をもたらすＤＮＡ配列に結合した細胞特異的プロモーターを含んで いる。そのような前駆体タンパク質の多くの例が開示、記載されている。本発明 の組換え哺乳類動物の特に好ましい例として、上記第５．５０項で説明したタン パク橿の全てまたはいずれかを産生し得るＤＮＡ配列を含有する組換え哺乳類動 物が提供される。この配列は、第５．５項に併せて示したプロモーターと共に含 まれるのが好ましい。しかし、細胞に特異的な発現、および特に神経細胞に特異 的な発現、そしてさらに特異的にはある型の神経細胞に特異的に発現を起こし得 る、その他のプロモーターが、本発明の好適な実施態様である。さらに別の本発 明の好適な実施態様においては、組換え哺乳動物は、Ａ４ｉタンパク質を産生可 能な配列を含有する。この独特な配列は、全ての種類のプロモーターに結合して 産生じ得る。Ａ４ｉタンパク質の発現が可能な配列を含有する組換え哺乳動物は 、本発明の以前には公知ではなかった。本発明の特に好適な実施態様には、神経 細胞に特異的なプロモーター等の細胞型に特異的なプロモーター、特に特定の型 の神経細胞に特異的なプロモーターに結合される、Ａ４ｉタンパク質のようなタ ンパク質の産生が可能な配列を含有する。

５．７左去亙主互ｙ旦 細胞を形質転換する、ベクターを構築する、メツセンジャーＲＮＡを抽出する、 ｃＤＮＡを調製する、等に用いられる技術のほとんどが、当該分野では広〈実施 され、はとんどの実施者が標準的な材料源および特定の条件および方法に慣れて いる。

しかし、便宜上、以下の段落をガイドラインとして供する。

５．７．ａ、　および　１ 原核システムおよび真核システムの両方が、β−アミロイドコアおよびβ−アミ ロイド−関連配列を発現させるのに用い得る；もちろん、原核宿主が、クローニ ング工程には最も便利である。最も頻繁に用いられる原核生物は、Ｌ−１Ｈの様 々な菌株である；しかじ、その他の微生物菌株も用い得る。これらのタンパク質 をコードする遺伝子が適切なシグナルペプチドと融合すると、Ｅ、　ｃｏｌｉ菌 株は、β−アミロイドコアおよびβ−アミロイド前駆体タンパク質をペリプラズ ムに分泌し得、あるｉ：、　ｃｏｌｉ菌株、例えばＪＥ５５０５　（Ｋａｎａｍ ａｒｉ、　Ｔ、　Ｇｅｎｅ　（１９８８）　６６：２９５−３００）などのりボ タンバク質変異体菌株は、キメラタンパク質を、直接、培養培地に分泌する。

復製部位、選択可能なマーカー、および宿主と適合し得る種に由来する制御配列 とを含有するプラスミドベクターが用いられる；たとえば、Ｌ」旦■は典型的に は、Ｂｏｌｉｖａｒら、むｎｅ　（１９７７）　２＋９５によるＥ、　ｃｏｌｔ 種に由来するプラスミドである、ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される 。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、 それによって、所望のベクターを構築する際に、維持または破壊し得る多重選択 マーカーを提供する。リポソーム結合部位配列と共に、任意にオペレーターを有 する転写開始のプロモーターを含むと本明細書では定義され、通常用いられる原 核制御配列には、β−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトース（Ｉａ ｃ）プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）　１ ９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄ ｄｅｌら、？Ｊｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　ｆｉ：４０ ５７）　、およびラムダ由来ＰＬプロモーターならびにＮ−遺伝子リポソーム結 合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２：１２ ８）などの、一般に用いられるプロモーターが含まれる。

その他の原核制御配列としては、直接にタンパク質をペリプラズムに分泌するシ グナル配列が挙げられる。一般に用いられる細菌性シグナルペプチドには、ｏｍ ｐＡ　（Ｘｉｋｕｃｈｉ、ら、■ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１ ）旦：５６７１−５６７８）およびｐｈｏＡ　（ＢｅａｋおよびＢｒｅｗｅｒ、 　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　８：３０１１−３０２ ４）　シグナルペプチドが含まれ、これらは本発明のプロテアーゼインヒビター 配列に融合され得る。

細菌に加えて、酵母などの真核性微生物もまた宿主として用い得るｏ　Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｊｓｉａｅｓ　つまりＢａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａ ｓｔの実験室株が、最もよく用いられるが、その他の多くの菌株または種も一般 に利用し得る。たとえば、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１ ９８３）　１０１：３０７、の２＋ａ複製起点、またはその他の酵母適合複製起 点（たとえば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２８２ ：３９、Ｔｓｃｈｕｒａｐｅｒ、　Ｇ、ら、Ｇｅｎｅ　（１９８０）　ｌＯ：１ ５７、およびＣ１ａｒｋｅ、　Ｌ、ら、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）　１０ １：３００参照）などを用いたベクターも用い得る。酵母ベクターの制御配列に は、解糖酵素の合成のためのプロモーター（Ｍｅｓｓら、Ｊ、　Ａｄｖ　Ｅｎｚ 　ｍｅ　Ｒｅ　（１９６８）　７：１４９；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒ　（１９７８）　１７：４９００）が含まれる。当該分野で公知のそ の他のプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｌｔｚｅｍ ａｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ＋ｅ（１９８０）　２５５：２０７３）のプロモ ーターが挙げられる。生育条件および／または遺伝的背景によってコントロール される転写の、その他の利点を有している他のプロモーターとしては、アルコー ルデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関 連する分解酵素、アルファ因子システム、およびマルトースおよびガラクトース の資化に反応可能な酵素のプロモーター領域が挙げられる。また、コーディング 配列の３′末端には終結配列が必要であると考えられる。

このような終結信号は、酵母由来遺伝子において、コーディング配列に続（３゛ 非翻訳領域に見られる。

もちろん、多細胞有機体に由来する真核性宿主細胞培養において、ポリペプチド をフードする遺伝子を発現することも可能である。たとえば、Ａｘｅｌらの米国 特許第４．３９９．２１６号を参照の４二と。これらのシステムは、イントロン をスプライシングし、ゲノムフラグ、ノントを発現するのに直接用い得るという 、もう１つの利点も有している。有用な宿主細胞株には、ＶＥＲＯおよびＨｅＬ ａ細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。このよ うな細胞の発現ベクターには、通常たとえば、一般に用いられる、シミアンウィ ルス４０（ＳＶ４（１）　（Ｆｌｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７ｇ）　２３ ７：１１３）からの初期および後期プロモーター、または、ポリオーマ、アデノ ウィルス２、ウンバピローマウィルス、または鳥肉腫ウィルスに由来するものな どの他のウィルス性プロモーターのような、哺乳動物細胞に適合するプロモータ ーおよび制御配列が含まれる。制御可能なプロモーター、ｈＭＴｌｌ　（Ｋａｒ ｉｎ、　Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２＞　２９９ニア９７−８０２）も用 い得る。哺乳動物細胞宿主システム形質転換の一般的な局面は、Ａｘｅｌ　（上 述）によって説明されている。また、発現を最適化するには「エンハンサ−」領 域も重要である；一般にこの領域は、非コードＤＮＡ領域におけるプロモーター 領域の下流または上流にある配列である。複製起点は、必要に応じて、ウィルス 源から得ることもできる。しかし、真核生物においては、染色体への組込みは、 ＤＮＡ複製の一般的機構である。

５、７．　ｂ、肱ｉ五長 使用する宿主細胞に応じて、このような細胞に適切な標準技術を用いて形質転換 を行う。Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、Ｐｒｏ＜　Ｎａｔ上Ｊす４針±Ｊ紅（１９７ ２＞６９：２１１０により記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウ ム処理、またはＭａｎｉａｔｔｓら、肢農赳ＩｒＣｌ０ｎ’ｎ　：　Ａ　Ｌ　ｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ１’１ａｒ ｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、２５４およびＦｌａｎａｈａｎ、　Ｄ、、Ｊ　Ｍｏ ｌ　Ｂｉｏｉ　（１９８３）１６６：　５５７−５８０により記載されるＲｂＣ １２法は、実質的な細胞壁バリアを含む原核生物または他の細胞に使用され得る 。このような細胞壁を有しない哺乳動物細胞には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎｄ ｅｒ　Ｅｂ、　■胆包■（１９７８）　５２：５４６により記載され、必要に応 じてＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら、Ｃｅ１ｌ　（１９７９）１６＋７７７−７８５に より改変されたリン酸カルシウム沈澱法が使用され得る。

酵母への形質転換は、Ｂｅｇｇｓ、、Ｊ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　 ２７５：１０４−１０９または旧ｎｎｅｎ、　Ａ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７８）７５：１９２９の方法により実施され得 る。

５、７．　ｃ、二久叉二■ゑ 所望のコーディングおよびコントロール配列を含む適切なベクターの構築には、 当該技術分野に公知の標準的な連結および制限の技術が用いられる。単離された プラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドを開裂し、調整 し、所望の形態に再連結する。

ベクターを形成するＤＮＡ配列は多数の源から入手可能である。

骨格となるベクターおよび制御系は、一般に、構築の際、大多数の配列に使用さ れる入手可能な「宿主」ベクター上で見いだされる。適切なコーディング配列の ためには、構築の開始ではｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから適切な 配列が回収されるかどうかが問題になり得、通常は問題になる。しかし、一旦配 列が示されると、個々のヌクレオチド誘導体から開始して、全遺伝子配列をイン ビトロで合成することが可能になる。相当な長さ、例えば、５００−１０００ｂ ｐの全遺伝子配列は、個々の重なる相補的オリゴヌレオチドを合成し、デオキシ リボヌクレオチド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、一本鎖の 重なっていない部分に埋め込むことにより調製され得る。このアプローチにより 、既知の配列をもついくつかの遺伝子の構築が成功した。

例えば、Ｅｄｇｅ、　Ｍ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）２９２＋７５ｆｉ ；Ｎａｍｂａｉｒ、に。

Ｐ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）２２３：１２９９；　Ｊａｙ、Ｅｒｎｅ ｓｔ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８４）出６３１１を参照。

合成オリゴヌレオチドは、Ｅｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ　（上記）およびＤｕｃｋ ｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）９：１６９ １により記載されるホスホトリエステル法、またはＢｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ 、　：　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　（１９８１）２ ２：１８５９：　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、Ｄ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、Ｈ，、Ｊ　ＡＱＩ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１９８１）１０３：３１８５によ り記載されているホスホルアミダイト法により調製され、市販されている自動オ リゴヌクレオチド合成器を用いて調製され得る。アユ−ソング前または標識に際 して、一本鎖のキナーゼ処理（ｋｉｎａｓｉｎｇ）は、５０ｍＭ　）リス、ｐＨ ７，６，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５ｍＭのジチオスレイトール、１−２ｍＭのＡ ＴＰ、１．７ｐｍｏｌｅｓ　７３２ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍＣ１／＋ｕ＋ｏｌｅ ）　、Ｏ，１ｍＭのスペルミジンおよび０．１＊ＭのＥＤＴＡの存在下で、過剰 の、例えば、約１０ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを、１ｒｖｏｌｅの基 質に使用することにより行われる。

このようにして、一旦、所望のベクターの成分が得られると、それらは切り出さ れ、標準的な制限および連結の手法を用いて連結され得る。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、当該技術分野において一般に公知の条件下で、適切な 制限酵素（または酵素類）で処理することにより行われ、その条件の細目は、こ れらの市販の制限酵素の製造者により規定される。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇを参照。一般に、約１ｍｇのプラスミドまたは ＤＮＡ配列が、約２０＋ａｌの緩衝溶液中の１ユニツトの酵素により開裂され、 本願の実施例においては、典型的には、ＤＮＡ基質を完全に消化させるために、 過剰の制限酵素が使用される。インキュベーション時間は、約３７℃で、約１か ら２時間が適切であり、それを改変することも可能である。各インキュベーショ ン後、タンパク質を、フェノール／クロロホルムで抽出することにより除去し、 その後エーテル抽出を行い、核酸は、エタノールで沈澱させることにより水性画 分から回収され得る。

所望されるなら、開裂フラグメントのサイズ分離が、標準技術を用いた、ポリア クリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行われ得る。サイズ分離 の一般的な記載は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎヱｕＤ舅旦■（１９８０）　６５　： 　４９９−５６０１；ｚ見られる。

制限により開裂されたフラグメントは、４個のデオキシヌクレオチドトリホスフ ェート（ｄＮＴＰ）の存在下で、５０ｍＭのトリスｐＨ７，６，５０ｗＭのＮａ Ｃ１，６ｄのＭｇＣｌ２．６ｍＭのＤＴＴ、および０．１−１０１ＭのｄＮＴＰ 中で２０〜２５℃で約１５〜２５分間インキュベージマンを行って、Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ）の大きなフラグメントにより処理する ことにより平滑末端とされ得る。

フレノウフラグメントは、４個のｄＮＴＰが存在する場合でも、５゛単鎖の突き 出た部分を満たすが、突出している３゛単鎖は削る。

所望であれば、突き出た部分の性質により与えられる制限内でこれらまたは選択 されたｄＮＴＰのうちの１つのみを供給することにより、選択修復が行われ得る 。フレノウによる処理の後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そし てエタノールで沈澱させる。Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１による適切な 条件下での処理の結果、すべての単鎖部分が加水分解する。

結合は、以下の標準的な条件および温度の下で１５−５ｏｕｌの容量にて行われ る。すなわち、例えば、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７５，１０ｍＭのＭｇ Ｃｌ２．１０ｍＭのＤＴＴ、　３３μｇ／ｍ　ＩのＢＳＡ、１０■Ｍ−５０■Ｍ のＮａＣｌ、およびｏ’ｃにおいて４０ＭＭのＡＴＰ、　０．０１−０．０２　 （ウニイス（Ｗｅｉｓｓ））ユニットの７４　ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」結 合に対して）、または１４℃において１ｍＭのＡＴＰ、　０Ｊ−０，６（ウニイ ス）ユニットの７４　ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」結合に対して）である。分 子間の「粘着末端」結合は、通常は全ＤＮＡ濃度が３３−１００μｇ／■ｌで（ 全末端濃度は５−５−１Ｏ０ｎで行われる。分子間平滑末端結合は、１１Ｍの全 末端濃度で行われる。

「ベクターフラグメント」を使用するベクター構築においては、ベクターフラグ メントは、５゛リン酸塩を除去し、且つベクターの自己結合を防ぐために、通常 はバクテリアのアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシの腸のアルカリ ホスファターゼ（ＣＩＰ）により処理される。消化は、約１時間、６０゛でベク ター１■ｇあたり約１ユニツトのＢＡＰまたはＣＩＰを使用して、約１０ｍＭの トリス−ＨＣｌ、　１ｍＭのＥＤＴＡ中でｐＨ８で行われる。核酸フラグメント を回収するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノ ールで沈澱させる。もしくは、不必要なフラグメントをさらに制限酵素により消 化および分離することにより二重に消化されたベクターにおける再結合を妨げ得 る。

配列の改変を必要とするｃ　ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクターのある部 分に対しては、部位特異的プライマー指向の変異誘発を使用し得る（Ｚｏｌｌｅ ｒ、　Ｍ、Ｊ、およびＳ＋＋ｉｔｈ、　Ｍ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ ｓ　（１９８２）　１０：６４ｇ？−６５００、ならびにＡｄｅｌ＋＊ａｎ、　 Ｊ、Ｐ、ら、喝（１９８３）ス：１８３−１９３）。これは、所望の変異を示す 、限られた不適合を除いて変異誘発される、単鎖ファージＤＮＡに相補的なプラ イマー合成オリゴヌクレオチドを使用して行われる。

つまり、合成オリゴヌクレオチドを、ファージに相補する鎖の合成を目指すプラ イマーとして使用し、得られる一部または全てが二本鎖となったＤＮＡをファー ジ支持の宿主バクテリウムへと形質転換する。形質転換されたバクテリアの培養 物を寒天の上に置き、ファージを有する単細胞から斑を形成させ理論上は、新し い斑の５０％が、単鎖として変異形態を有するファージを含有し、５０％が元来 の配列を有するはずである。得られる斑をキナーゼ処理された（　ｋｉｎａｓｅ ｄ）合成プライマーでハイブリダイゼーシブンした後、正確な適合による結合は 可能であるが、元来の鎖との非適合は結合を妨げるのに十分な温度で洗浄する。

次にプローブとハイブリダイズする斑を採取して培養し、ＤＮＡを回収する。

５．７．ｄ　！Ｌ灸曳ｌ工 以下に示す構築物において、プラスミド構築のために正しく結合しているかどう か、先ずＤｒ、　Ｍ、　Ｃａ５ａｄａｂａｎにより得られたＥ、　ｃｏｌｉ　Ｍ Ｃ１０６１株（Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍら、Ｊ、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９ ８０）　１３８・１７９−２０７）または他の適切な宿主を結合混合物により形 質転換することにより確認される。適切な形質転換株は、当該分野では周知の、 アンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質への耐性により、または プラスミド構築の様式に依存する他のマーカーを使用することによって選択され る。次に形質転換株から得られるプラスミドをＣ１ｅｖｅｌｌ、　Ｄ、Ｂら、Ｐ ｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９６９）　６２：１１５９ の方法により調製し、選択的に、次にクロラムフェニコール増幅（Ｃ１ｅｖｅｌ ｌ、　Ｄ、Ｂ、、Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９７２）　１１０：６６７）を 行う。通常はいくつかのミニＤＮＡ調製物、例えば、Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ、 らＳＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ　（１９８１）　１１４：１９３−１９７、および Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ら、ｎｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９ ７９）ヱ：１５１３−１５２３を使用する。単離したＤＮＡを制限酵素により分 析、および／また１ま、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９７？）　７４：５４６３のジデオキシヌクレオチド 法によりさらにＭｅｓｓｉｎｇら、■旦渇ｌ尤山江ユ且（１９８１）　９：３０ ９に記載のように、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ玉Ｕ唄出■（１ ９８０）　６５：４９９の方法により、配夕１ｊ決定する。

（以下余白） 実１１凱 以下の実施例は、当業者に、本発明のＤＮＡ配列、融合構築物、タンパク質、お よび組換え哺乳動物を作製する方法の完全な開示および記述を提供するために提 示されるものであって、本発明者が自らの発明であると見なすものの範囲を限定 するように意図されてはいない。使用する数（例えば、量、温度など）について は正確であるべく努めたが、実験上の誤差および偏差は考慮されるべきである。

特記なき場合は、部は重量部であり、温度は摂氏であり、また圧力は大気圧また はこれに近い圧力である。

実」１例」工 立　した　の　（こお（る ２血上瀾漣ｌｚ！り１−７５１　（７）哺乳類の細胞におけるβ−アミロイド前 駆体タン７＜り質の発現を促進するために、プラスミドを、タンパク質のための コードセグメントがヒトメタロチオネインＩＩ　（ｈＭＴｌｌ）遺伝子由来の強 力な調節プロモーターに融合されるように構築する。

この手順は２工程で行われる。先ず、発現ベクターｐＭＴｓＶ４０ポリＡ　Ｂａ ｎを、ＢａＪＩおよびＳｍａ＋制限酵素によるｐｈＧＩ（−ＳＶ（１０）の消化 によりｐｈｃｕ−ｓｖ　（１０）ベクターから誘導し、引続き、ＤＮＡポリメラ ーゼ１（フレノウ断片）によりインキユベートして平滑末端分子を生成した。こ の後、平滑末端をＢａ１１旧リンカ−に結合し、Ｂａ間旧により切断し、また再 環状化のために再結合する。

この工程により、ｐｈＨＧ−ＳＶ（１０）から、ヒト成長ホルモン遺伝子配列の すべてが、ｍＲＮＡの３′非翻訳領域のほとんど、ならびに推定３′転写停止信 号およびプロセッシング信号をコードするゲノム配列以外は除去される。哺乳類 の細胞の発現構築物に対しては、ｐＭＴｓＶ４０ポリＡ　Ｂａ間をＢａｎ旧によ り消化し、次にすべての４つのヌクレオチドトリホスフェートおよびＤＮＡポリ メラーゼｌによりインキュベートして、平滑末端を生成する。続いてこの断片を ｐ４Ｔ４Ｂ由来の精製２６７８　ｂｐ　ＳＩＩａｌ−Ｘｇ＋ｎ＋断片と結合する 。組換え分子を形質転換によりＭＣ１０６１に導入する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−４１細胞を、Ｆ１２培地と１０％の牛 胎児血清を有するＤＭＥ培地との１：１混合物よりなる培地にて成長させる。コ ンピテント細胞を組換え発現ベクターおよびｐＳＵ２：ＮＥＯ（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ、　Ｐ、ら、Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）、ｊｌ＋３２７ −３４１）　ニより同時形質転換する。ｐｓＶ２　：ＮＥＯは、ネオマイシンア ナログ０４１８に対する耐性を示す機能遺伝子を含有する。

形質転換においては、５００ｎｇのｐｓＶ２　：　ＮＥＯおよび５μｇの組換え ベクターを、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａｊ、 、Ｙｉ匹ＬしＪ１９７３）　５２：４５６−４６７に述べられているように、リ ン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物として６０■■デイツシユのＣＨＯ細胞に与える 。５ｏｕｔｈｅｒｎらにより述べられているように抗生物質６４１８において細 胞を成長させることにより、β−アミロイド関連ｍＲＮＡおよびタンパク質を発 現する能力を有する発現ベクターＤＮＡを含有する、安定にトランスフェクトさ れたＣＨＯ細胞のプールが産生ず６．２ 実施」乳」工 唾　の　における　−アミロイド〒　の実施例１では、ヒトプロモーターにより 発現されるβ−アミロイド前駆体タンパク質（１−７５１）に対する発現システ ムの構築について概説している。はぼ同じ構築物を、５°非翻訳領域から１１６ ｂｐが削除されたｐ４Ｔ４Ｂ由来の精製２５４８ｂｐ　５ｌａｌ−Ｘ＋ａｎｌ断 片を使用して調製した。この断片を、哺乳類の細胞の発現のためのネオマイシン 選択可能マーカー、およびバクテリア形質転換株の選択のためのアンピシリン耐 性遺伝子を有するプラスミドにおけるヒトプロモーターの後ろのＳａｌ　１部位 に挿入した。このベクターｐｉ（ｂＡＰｒ−１−ｎｅｏは、Ｇｕｎｎｉｎｇら（ Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９８７）　８４：４８３ １−４８３５）により述べられており、ＥｃｏＲ１部位を最初のベクターの本体 から除去し、また最初のポリワンカー領域を、最初に存在する５ａｌＩＳＩＬｆ ｎｄｌｌ＋、およびＢａｇ旧クローニング部位の他にＥｃｏＲ１部位を含有する ｎｅｏのポリリンカーで置換するように改変された。改変ベクターをｐＡＸｎｅ ｏＲと命名する。ｐＡＸｎｅｏＲベクターを５ａｌｔにより線形にし、ＤＮＡポ リメラーゼのフレ／つ断片を使用して末端を埋めて平滑末端分子を生成した。２ ５４８ｂｐ　Ｓｍａｌ−Ｘｍｎｌβ−アミロイド断片をＴ４リガーゼを用いてベ クターの平滑末端のままで結合した。

組換え分子を形質転換によりＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１に導入し、適切な方 向を示すクローンを増幅した。６９５アミロイドタンパク質をヒトプロモーター の制御の下におく、Ｋａｎｇら（上述）により述べられた６９５β−アミロイド 配列を使用して、同様の構築を行った。

ｐＡＸｎｅｏ／７５１β−アミロイドまたはｐＡＸｎｅｏ／６９５β−アミロイ ドの６００βｇの全ＤＮＡ、あるいは両プラスミド構築物の等質量混合物を、Ｂ ＴＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ　１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄの無菌使い捨てキュベ ツト、および特別注文のキニベットホルダーを使用して、エレクトロポレーショ ン（Ｎｅｕｍａｎｎ、　Ｊ■蛙ｎμロ注虹ユ１９７２）１０：２Ｔ９−２９０； 　Ｚｆ＋＊ｍｅｒ＋ａａｎ、　Ｂｆ姐鐸」」１９７３）　１３ＪＯＯ５−１０１ ３）により１０７個のＣＨＯ細胞に導入した。外因性ＤＮＡを受け取るＧ４１８ 耐性のある細胞を、Ｇｉｂｃｏの５００βｇ／■ｌの６４１８を使用して、標準 プロトコル（Ｓ（＋ｕｔｈｅｒｎ、　１９８２、上述）により選択した。

３度のトランスフェクションの各々から能動的にトランスフェクトされたＧ４１ ８耐性のある細胞のプールを、β−アミロイド前駆体タンパク質の発現に関して 特徴付けを行った。Ｓａｌの血清を含まない培地を含有する各プールからの約２ ｘ１０６個の細胞を、３７°Ｃで４８時間インキュベートした。この馴化培地を 除去し、トリクロロ酢酸を最終濃度１０％まで添加してタンノ（り質を沈澱させ た。細胞をかき取ることにより回果し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、５０μ ｍの緩衝液で再懸濁して３０倍の濃度とした。各試料２５μｍを１２．５％ポリ アクリルアミドゲル加した（Ｌａｅｍｍｌｉ，　Ｎａ■匹ユ１９７０）　２７７ ：６８０−６８５）　ｏ標準的な方法を用いることによりβ−アミロイド７５１ 　ｃＤＮＡを有する組換えワタシニアウイルスから生成される、β−アミロイド 特異的ポリクローナル抗体を使用して、ウェスタンプロット分析（Ｔｏｖｂｉｎ 、　Ｐｒｏｃ　Ｎ　ｔ’ｌ　ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７９）　７６：４ ３５０−４３５４）により、β−アミロイド前駆体を検出した。典型的には、約 １１０、　（１００ダルトンのβ−アミロイド前駆体の大部分は培地に放出され るのがわかり、きわめて小量のタンパク質が細胞に結合する。この結果は、β− アミロイドタンパク質が分泌プロホルモンであると提案しているＡ１１ｓｏｐら （Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡＪ１９８８）　８５：２７９ ０−２７９４）の仮説を支持する。見掛は分子量が１１０、０００ダルトンであ る、組換えにより発現したβ−アミロイドタンパク質は、インビトロにおける転 写／翻訳システムを使用して、および培養中の細胞を使用して（Ｗｅｉｄｅｗ＋ ａｎｎ、　Ａ、ら、Ｃｅ１ｌ　５７エ１１５−１２６　（１９８９））他者（Ｄ ｙｒｋｓ、　Ｔ、ら、ＥＭＢＯユニ１９８８）　７（４）：９４９−９５７）に より観察されたものに類似する。

６．３ 実施」乳」− オリゴヌクレオチドプローブを用いて、β−アミロイド前駆体タンパク質ｔｇＲ ＮＡ橿の遺伝変異体を識別する能力を、本実施例において示す。この診断アッセ イでは、β−アミロイド前駆体タンパク質またはそれらのｇ＋ＲＮＡの２つの密 接に関連した遺伝変異体が識別され、これらのタンパク質またはｍＲＮＡの発現 の相対レベルが定量され得る。

全細胞ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓらにより記載されるグア ニジンチオシアネート／ＣｓＣ１法を用いて、核を除去しまたは除去しないで（ それぞれ細胞質または全細胞）、培養物またはヒトの脳組織（Ａｌｚｈｅｉｍｅ ｒの脳または正常な脳）中のヒト細胞から調製した。ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセル ロースクロマトグラフィーにより分画し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で 電気泳動にかけ、ニトロセルロースにプロットトランスファーしたくこれらは、 すべてＭａｎｉａｔｉｓらに記載の通りに行った）。標準ブトロコルに従って、 フィルターを焼成し、プレハイブリダイズし、目的のプローブにハイブリダイズ した。

製造者の提案、およびＰｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３：Ｈ，５２５，５２７（ １９８８年２月１１日）に記載されるように、オリゴヌクレオチドプローブを、 末端トランスフェラーゼを用いたインキュベーションにより［３２”−ｄＣＴＰ で末端標識した。尚、Ｐｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１．５２５．５２７は 、このような末端標識を開示するために、本願で参照例として援用されている。

挿入アクチンをニックトランスレーシランにより［３２”−ＣＴＰで放射性標識 した。ハイブリダイゼーション後、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたフ ィルターを１ｘＳＳＣ，５５℃で洗浄した。アクチンにハイブリダイズしたフィ ルターをＯ，ｌＸ５ＳＣ１５５°Ｃで洗浄した。次いで、フィルターをＸ線フィ ルムに露光し、オートラジオグラムを作成した。インサードブａ−ブは、調べた すべての試料において、図１に示されるβ−アミロイド前駆体タンパク質冒ＲＮ Ａを検出する。結合プローブは、ＨｅＬａおよびＭＲＣ５以外のすべての細胞に おいて、Ｋａｎｇらにより記載されるβ−アミロイド関連■ＲＮＡを検出する。

アクチンプローブは、すべての細胞における豊富なＲＮＡにハイブリダイズする と予想されるコントロールである。

６．４ 実施」札Ａユ Ｎ５Ｅ−Ａ４２およびＡ９９　え　プラスミドのＡ４２およびＡ９９配列を、米 国特許出願筒０７７４０８．７６７号に記載のβ−アクチンＡ４２およびＡ９９ 発現プラスミドから誘導した。

特に、β−アクチンＡ４２およびβ−アクチンＡ９９プラスミドは、β−アクチ ンプロモーター領域およびＳＶ２ネオプロモーター領域を切り出すＮｅｏ　Ｉお よびＥｃｏＲｌで消化した。さらに、ＥｃｏＲＩで消化することにより、合成ポ リリンカーを用いて置換され得るＡ４２またはＡ９９の５つのアミノ酸を除去し た。β−アクチンおよびＳＶ２ネオプロモーターを欠失したＡ４２またはＡ９９ プラスミドを、アガロースゲル電気泳動法により精製した。多数のクローニング 部位、ならびにＡ４２およびＡ９９の５つのアミノ酸を生成する合成オリゴヌク レオチドポリリンカーを合成し、ＮｃＯＩおよびＥｃｏＲｌ消化により先に生成 したＡ４２またはＡ９９プラスミド断片に結合した。ポリリンカーを付加するこ とにより最初のプラスミド中のＮｃｏ１部位は欠失し、この部位はポリリンカー 内に移動し、Ａ４２またはＡ９９配列内のＥｃｏＲ１部位と置換する。

ポリリンカーをＡ４２またはＡ９９プラスミド断片に結合後、プラスミドＤＮＡ を調製した。次いで、新しいプラスミドをＢｇｌｌ＋およびＮｃａｌで開裂した 。これらの部位を両方とも、新たに付加されたポリリンカー領域に合成した。Ｎ ＳＥプロモーターが付加され得るのは、Ｂｇｌ　Ｉｆ−Ｎｃｏｌ消化により生成 された部位内である。

ＮＳＥプロモーターをラットゲノムライブラリーから単離した。

公知のＮＳＥプロモーター領域配列から設計されたオリゴヌクレオチドによるハ イブリダイゼーションを用いて、１ｌｋｂのゲノムＥｃｏＲＩ断片を選択した。

１ｌｋｂのゲノムＥｃｏＲＩ　ＮＳＥプロモーター断片を、ｐＵＣプラスミドに クローニングし、それはこのゲノム断片から得られたので、所望のプロモーター 領域を、図９で示されるように、ＰＣＲ増幅を用いて単離した。ＮＳＥ遺伝子の ５′非翻訳領域内にイントロンを含むプロモーター領域の大部分を、それぞれ５ °末端および３゛末端において、Ｂｇｌ　Ｉ　！およびＮｃｏｌ制限部位でオリ ゴヌクレオチドブライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより生成した。ＮＳＥ プロモーター断片を、ゲル電気泳動法により精製し、次いで、先に生成したＡ４ ２またはＡ９９プラスミドのＢｇｌ　！　１−Ｎｃｏｌポリリンカー領域にクロ ーニングした。断片を消化、結合および単離するために、標準的な分子組換え技 術を用いた。ＤＮＡ塩基配列決定法により、Ｎ５Ｅ−Ａ４２およびＮ５Ｅ−Ａ９ ９発現プラスミドの適合度が証明された。

６．５ 実敷蝕１ 実施例４で作成したＮ５Ｅ−Ａ９９プラスミドを使用して、Ａ９９配列を除去し それらをＡ６９５またはＡ７５１配列のいずれがで置換することにより、Ｎ５Ｅ −Ａ６９５およびＮ５Ｅ−Ａ７５１発現プラスミドを調製した。ＮＳＥ−Ａ９９ プラスミドからＡ９９配列を除去するために、このプラスミドをＮｃｏｌで消化 し、次いで、緑豆（マングビーン）ヌクレアーゼで消化した。緑豆ヌクレアーゼ 処理は、さらなるクローニングの目的のために、Ｎｅｏ　１部位で平滑末端を生 成する。次いで、プラスミドを旧ｎｄｌｌｌで消化した。この部位は、Ａ９９配 列に対するポリリンカーの３°領域内にあり、Ａ９９コード断片を遊離させる。

ＮＳＥプロモーター、プラスミド配列、ポリＡ付加部位、およびポリリンカー領 域の一部を含む残りのプラスミドを、ゲル電気泳動法により精製した。次いで、 Ａ６９５およびＡ７５１断片を、Ａ９９が欠失したＮＳＥプラスミドにクローニ ングするために調製した。Ａ６９５およびＡ７５１配列を、β−アクチンＡ６９ ５およびβ−アクチンＡ７５１発現プラスミドから誘導した。６９５および７５ １配列を除去するために、プラスミドをＮｒｕｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し た。　Ｎｒｕ１部位は、６９５および７５１の開始メチオニンコドンの直接５゛ 側にある。Ｈｉｎｄ　！　＋　１　部位１；！、６９５および７５１の終止フド ンのポリリンカー３′領域に位置する。Ａ６９５またはＡ７５１配列を含むＮｒ ｕｌ−）１ｊｎｄｌｌ＋断片を、平滑末端化されたＮｃｏｌ−Ｂｉｎｄｌｌｌで 処理したＡ９９が欠失したＮＳＥプラスミドにクローニングした。最終プラスミ ドである、Ｎ５Ｅ−Ａ６９５およびＮ５Ｅ−Ａ７５１は、クローニング結合のＤ ＮＡ塩基配列決定法により正しいと証明された。これらのプラスミドは、哺乳類 細胞にトランスフェクトされた後、６９５および７５１タンパク質を発現するこ とが証明された。

実施」叩ｊ− 公表された配列から設計された合成メタロチオネインエマウスプロモーターを、 オリゴヌクレオチド合成および結合反応を用いて調製した。合成メタロチオネイ ンまたはＭＴプロモーターをｐＵｃｌ　９にクローニングした。ＭＴ−Ａ９９お よびＭＴ−Ａ４２組換え発現プラスミドを調製するために、Ａ４２およびＡ９９ 配列をそれぞれβ−アクチンＡ４２およびＡ９９発現プラスミドから単離した。

Ａ４２に対しては５ａｉｌおよびＢａ冒旧、Ａ９９に対してはＳａｌ　ｌおよび Ｈｉｎｄｌｌｌで消化することを用いて、Ａ４２およびＡ９９配列をβ−アクチ ン発現プラスミドから切除した。Ａ４２およびＡ９９に共通するＳａｌ１部位は 、Ａ４２およびＡ９９の開始メチオニンの５゛側にある。

ＢａＩ２旧部位および旧ｎｄ１１１部位は共に、Ａ４２およびＡ９９をコードす る配列のポリリンカー３°領域に含まれる。Ａ４２の５ａｌｌ−Ｂａ■■Ｉ断片 およびＡ９９のＳａｌ　Ｉ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片をゲル電気泳動法により 精製した。合成ＭＴプロモーター断片を、ＥｃｏＲｌおよび５ａｉｌを用いたｐ ＵＣプラスミドの消化により単離した。ＥｃｏＲｌ−Ｓａｉｌ　ＭＴプロモータ ー断片をＳａｉｌ−ＢａｍＨＩ　Ａ４２断片と結合した。同様に、ＥｃｏＲｌ− Ｓａｉｌ　ＭＴプロモーター断片をＡ９９のＳａｌ　１−Ｈｉｎｄｌ　ｌ　Ｉ断 片に結合した。次いで、ＭＴプロモーター−Ａ４２およびＭＴプロモーター−Ａ ９９断片を完全発現プラスミドのプラスミドバックボーンにクローニングした。

用いたプラスミドバックボーンは、改変ｐＡＸｎｅｏＲプラスミドが誘導された 親β−アクチンベクターである。プラスミドベクターを、Ｒ１−Ｂａ型旧−ＭＴ −Ａ４２断片を挿入するためにＥｃｏＲＩおよびＢａｍ旧で消化することにより クローニングのために調製し、またはプラスミドバックボーンをＥｃｏＲＩ−Ｈ ｉｎｄｌ１−ＭＴ−Ａ９９断片を挿入するためにＥｃｏＲＩおよびＢ　ｉｎｄ　 Ｉ　Ｉ　Ｉで消化した。プラスミドを生成するために組換えＤＮＡ操作の標準的 な方法を用いた。ＭＴ−Ａ　４２およびＭＴ−Ａ９９組換え発現プラスミドは、 ＤＮＡ配列分析法により配列が正しいことが確認された。

実施」舛１− ＭＴ−Ａ７５１およびＭＴ−Ａ６９５　え　プラスミドのプロモータープラスミ ドを、先に記載の合成ＭＴ−１断片を用いて構築した。このプラスミドはまたイ ントロンを有する５ｖ４０終止領域をも含有する。プロモーターおよびＳＶ４０ 終止配列の間にＸｂａ１部位が存在する。プラスミドをこのＸｂａ１部位で切断 し、次いで緑豆ヌクレアーゼで処理して平滑末端を生成した。７５１および６９ ５配列が挿入されるのはＭＴプラスミドの平滑末端化されたＸｂａ１部位内であ る。６９５および７５１完全コ一ド配列をβ−アクチン６９５およびβ−アクチ ン７５１発現プラスミドから誘導した。この断片を得るために、β−アクチン発 現プラスミドをＮｒｕｌおよび旧ｎｄｌｌｌで消化した。Ｎｒｕ１部位はＡ６９ ５およびＡ７５１の開始メチオニンの直接５゛側にある。Ｈｉｎｄｌ１１部位は 、プラスミドのポリリンカー領域内のＡ６９５およびＡ７５１の終止コドンの３ “側の始まりに位置している。Ｎｒｕｌでの消化により平滑末端が生成する。Ｂ ｉｎｄｌｌｌでの消化により、フレノウで満たされた付着末端が生成し、６９５ および７５１の３°末端および５′末端の両方で平滑末端断片を作製する。６９ ５および７５１平滑末端断片を平滑末端化されたＸｂａｌメタロチオネインＳＶ ４０プラスミドにクローニングした。得られたＭＴ−Ａ６９５およびＭＴ−Ａ７ ５１プラスミドは、ＤＮＡ配列分析法によりクローニング結合での配列が正しい ことが証明された。

図１１ＡはＮ５Ｅ−Ａ７５１　）ランスゲンの図式である。”２．３ｋｂのＮＳ Ｅプロモーターおよび関連５−非翻訳領域は斜線で囲まれた部分で示されている 。ＮＳＥ　ＤＮＡ内のイントロンは線で示されている。

Ａ７５１配列は黒（塗りつぶした部分で示されている。ポリアデニル化信号を含 有する、ＳＶ４０後期３−非翻訳領域は白い囲い部分で示されている。破線はプ ラスミド配列を限定している。

制限エンドヌクレアーゼ部位、並びにサザンプロットおよび逆転写酵素ＰＣＲ分 析に用いられるプローブ（１−４）を示した。

冥加Ｉ乳」工 卵のＵ　および゛ ６、８．　ａ、手順− 受精卵を、雄と予め交尾させたＪｕｌ雌マウマウス管から回収した。この卵を、 雄および雌の前核が分離して細胞質内で識別可能である早い前核段階で回収した 。当業者に公知の手順に従い、回収した卵を全ての周囲の細胞および物質から隔 離して、適切に洗浄し、貯蔵した。接合子を好ましくは、５％の二酸化炭素、５ ％の酸素、および９０％の窒素（容積率）の雰囲気下においてパラフィンオイル で重層した培地を含有する抑制スライド中に３７℃（’Ｃ）で貯蔵した。

Ａ７５１に結合した５゛イントロンを有するＮＳＨの融合構築物を上述の手順に 従い、図９に示すようにして得た。任意の上述の融合構築物をクローニングし、 本実施例に記載の方法で受精卵内に含ませることが出来る。従って、以下に本実 施例の手順をＡ７５１を用いて説明するが、上述のどの融合構築物においても適 用可能である。

まず、融合構築物を図１０に図式的に示したようにクローニングした。クローニ ング後、出来るだけ多くの望ましくない細菌の配列を除去するために、その融合 構築物を宿主から抽出し、精製し、次いで適切なヌクレアーゼで消化した。抽出 したプラスミドを塩化セシウム臭化エチジウム密度勾配遠心分離法により精製し 、続いて臭化エチジウムを抽出し、プラスミドＤＮＡを透析した。任意のクロー ニングされた配列上でそのような抽出および精製プロセスを行った後に、所望の 融合構築物を含有する、比較的精製されたプラスミドを得ることが可能である。

次いで、その精製プラスミドを適切なエンドヌクレアーゼで処理した（ＮＳＥ− Ａ７５１またはＮ５Ｅ−Ａ６９５の線状断片を得るために、５ａｉｌおよびＮｄ ｅ　Ｉを用いた）。ゲル電気泳動法を利用することにより、所望の断片を、遺伝 子洗浄ガラスピーズ（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ　ｇｌａｓｓ　ｂｅａｄｓ）　（販売 元Ｂｉｏ　１０１、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ［ｆ。

ｒｎｉａ）を用いて単離し、次に０１２２μの膜を濾過した。

得られた精製ＤＮＡを、約１μｌの外径を有する注入ピペットを用いてマイクロ インジェクションした。そのようなピペットを、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４：５６５７−５６６１　（１９７１）に記載されてい るバイレックス管から作成することが可能である。

融合構築物（約２０．０００のＤＮＡ配列である）を含有する溶液の約１０ピコ リツトルを注入ピペットに取った。接合子を、約６０から７０マイクロリツトル の外径を有する保持ピペットの上に置いた。そのピペットもまた上述の刊行物に 記載の手順に従って作成可能である。雄の前核を注入ピペット中に存在する融合 構築物で注入するように、接合子を保持ピペットの上に置いた。

全ての接合子をマイクロインジェクションし、次いで培養管に入れて、それらを ５日間発育させた。移植前の発育に適切な条件は、し匣−七」二回一旦：４２０ −４２６　（１９７３）に記載されている。桑実胚または胚盤胞に発育した卵を 、Ｆｌ　／＼イブリッドＪＵ、疑疑似妊娠３目目養母マウスの子宮に移植した。

これらの養母は妊娠満期間まで移植された胚を保持した。

以下の表１に示すように、本発明の異なる結合体で胚を注入するために、上述の ようなタイプ、および当業者に公知のタイプの注入技術を使用した。ここで異な る数のマウスの胚について異なる結合体を用いて実験１から５を行った。これら の実験の予測結果および実際の結果を表１に示した。表１に、注入されたマウス 卵の数、これらの卵の移植の結果得られた生きている子供の数、および実際に組 換え体になった子供の数、すなわち実際に胚に注入された外来ＤＮＡを取り込む ようになった子供の数を示す。

（以下余白） 上記の表１に示したような実験１〜５で得られた組換えマウスは、アルツハイマ ー病の結果として形成された斑の量を減少させるという薬剤の有効性を測定する のに有用である。

１つまたはそれ以上の薬剤の、形成された斑の量を減少させるという有効性を測 定するという目的で、いずれの実験からの組換えマウスも、非組換えである対照 マウスと比較して用い得、または、組換えマウスの様々な組み合せを互いにおよ び／または対照と比較し得、それによって、斑の減少を、アルツハイマー病の治 療における薬剤の有効性に関連づける。

支立拠■ °　コピー　の１ 以下の実施例については、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１　ＤＮＡを注射した胚およびマウス について結果を説明する。

表１に示すように、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１　ＤＮＡを注入した胚から発生した４４匹 のマウスのうち９匹が導入遺伝子を有した。これらのマウスを交配させた結果、 ８つの株が確立された；１つの創始細胞の導入遺伝子は子孫には遺伝されなかっ た。創始細胞１０（ＦＩＯ）　、創始細胞１１　（Ｆｉｌ）および創始細胞２４ 　（Ｆ２４）を含む３つの株を、さらに特性化するために選択した（表２）。導 入遺伝子コピー数を、マウスｂ−ＡＰＰおよびヒトｂ−Ａ７５１の双方に共通の オリゴヌクレオチドプローブを使ったサザンプロットハイブリダイゼーションを 用いて、内因性単一コヒーｂ−Ａｐｐ　ｖウス遺伝子との比較により見積った（ 図１１Ｂ）。４０ｍｇのテールＤＮＡをＢｇｌｌ＋で消化し、０．８％のアガロ ースゲル上で電気泳動にかけた。サザンブロノトを調製して、Ｔ４キナーゼによ って３２Ｐで放射性同位元素標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（図１１Ａ １　プローブ１１；　５−ＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡ− ３°）とハイブリダイゼーションした。

ブ０　’７トを、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液を加えたＳＸ　ＳＥＴ中（Ｉ ＸＳＥＴ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ　ｐｔｒ、ｏ、 　２ｍＭ　ＥＤＴＡ）で、６０℃でハイブリダイゼーションし、６Ｘ　ＳＳＣ（ ＬＸ　５ＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１５Ｍクエン酸ナトリウム）で、６ ０８．８Ｃで４０分間洗浄した。Ｆｌｏ、　ＦｉｌおよびＦ２４の株は、それぞ れ、ノ１プロイドゲノム１つにつき、約１つ、４つおよび８つのＮＳＥ：ｂ−Ａ ７５１のコピーを有支五匹上■ された　゛　のＲＮＡ 遺伝された導入遺伝子のＲＮＡ発現を３つの株において研究した。２１ｇの全編 ＲＮＡを、陽性で野生型の対照動物から単離し、オリゴｄＴ１２−１８で逆転写 し、特定のＤＮＡサブフラグメントをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した 。この反応物を２つの部分に分けた。

ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーは、導入遺伝子に由来する転写のみが 増幅される、つまり、１つのプライマーがＮＳＥ　５−非翻訳領域（５°−ＣＡ ＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧ−３゛）にハイブ リダイゼーションされ、もう１つはｂ−ＡＰＰの５°コード領域（５°−ＴＣＴ ＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＴＴＧＣＡＣＣ−３°）にハイブリ ダイゼーションされるように設計された。混入するゲノムＤＮＡまたは未処理の 転写を説明するために、ＮＳＥ　ＰＣＲプライマーをイントロンの上流に位置す る部位に対応させた。予測された３７３塩基対フラグメントは、各組換え動物か ら調製された逆転写ＤＮＡからは増幅されたが、野生型マウスから単離された逆 転写ＲＮＡからは増幅されなかった。対照として、逆転写されたＲＮＡの第二部 分を、天然ｂ−ＡＰ　Ｐ分泌信号（５−ＴＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧ ＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＧ−３’　）配列に対するプライマー、および上記の５ −コーディング領域ｂ−ＡＰＰのプライマーで増幅した。これらの反応において 、野生型、および組換え遺伝子逆転写試料の両方とも、内因性ｂ−ＡＰＰ　ＲＮ Ａから増幅されたことを示す、３０７塩基対ＤＮＡフラグメントを産生じた。

ＤＮＡを２％のアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して可視 化し、モしてサザンプロットして、３２Ｐ標識化されたＮ５Ｅ−Ａ７Ｓ１融合配 列（５°−ＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧ− ３’　）に対するオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションした。

プロットを、６Ｘ　ＳＥＴで６５℃でハイブリダイゼーションし、４Ｘ　５ＳＣ Ｔ６５’ＣＴ４０分間洗浄した。ＰＣＢ反応産生物を、ＮＳＥ配列とｂ−Ａ７５ １配列との結合部分を架橋したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼー ションすると、導入遺伝子の脳に由来する産生物のみがプローブにハイブリダイ ゼーションし、３７３　ｂｐ　ＰＣＲ産生物の確実性を示した。

Ｌ息史上上 ウェス　ンプロット ＮＳＥ　：ｂ−Ａ７５１組換え動物の脳におけるタン／（り質発現の変化がウェ スタンプロット分析によって測定された。タンノイク質ホモジネートを、５ｈｉ ｖｅｒｓ、　Ｂ、Ｄ、ら、ＥＭＢＯＪ（１９８８）７：１３６５−１３７０の方 法に従って全編から作製した。各試料を５０℃１ｇずつ、７゜５％のＳＤＳポリ アクリルアミドゲル上で電気泳動し、膜ζこ移した。組換えワクシニアウィルス および１２５１−タンプくり質Ａ；こよって発現した、完全な長さのヒトＡ６９ ５に対する、ポリクローナル抗血清の１１５００希釈物を用いて、ウェスタンプ ロットを行った。報告されている、哺乳動物脳ｂ−ＡＰＰイソホーマーの平均サ イズに一致する、約１２０ｋＤのいくつかの／＜ンドカ（、対照および各組換え 遺伝子タンプ（り質ホモジネートで観察された。野生型の試料に比較して、わず かに増加したレベルのｂ−ＡＰＰ力（、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１試料に見られ、これは 組換え脳におけるＡ７５１の発現のレベルが高められたことを示唆している。し 力）し、内因性ｂ−ＡＰＰの神経および神経膠の発現が組み合わせられるため、 外因性Ａ７５１発現の神経レベルの正確な評価を判断すること１ま難しい。従っ て、外因性Ａ７５１発現のニー−ロンレベル１よ、Ｎ５Ｅ−八ツ５１発現の免疫 細胞化学によって検討された。

モノクローナル抗体４．１が、組換えマウス脳の組織学的分析に用いられた。こ の抗体は、β−アミロイドタンｉ＜り質のＮ末端の１０残基に認められるエピト ープを認識し、神経炎による斑に対して高い親和性と特異性を有している。染色 の前に、モノクローナル抗体を合成ペプチド免疫原とプレインキュベーンコンす ることによって、すべての免疫反応性を除去した。

藺単に言うと、β−アミロイドタンパク質の１〜２８位の残基に相当する合成ペ プチドを調製し、冷凍および解凍することによって自己凝集させた。このペプチ ド凝集を、マウスを免疫し、追加免疫するために、メチル化したウシ血清アルブ ミンおよびアジュバントと混合した。感作された肺臓細胞からのハイブリドーマ を産生じた。抗ペプチド抗体を分泌するクローンを増殖させて、限界希釈によっ てサブクローンした。Ｎ５Ｅ−Ａ７５１組換えマウス、野生型マウス、ならびに ３つの組換え株からの同型接合体および生棲合体動物の脳を分析した（表２）。

脳を除去し、４％のバラホルムアルデヒドと混合し、パラフィン中に包埋し、６ ｍｍの冠状中脳切片を作製した（６ｍｍ　ｃｏｒｏｎａｌ　ｍ１ｄｂｒａｉｎ　 ５ｅｃｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　＋ｇａｄｅ）　ａ　これらの切片を脱パラフイン 化し、再水和し、０．３％のＨ２Ｏ２で３０分間処理し、８０％の蟻酸で約２分 間処理した。次に、それらの切片を、４゜１抗体を分泌するハイブリドーマから の、馴化培地の１７２０希釈物と、３７°Ｃで３０分間インキュベージコンした 。抗マウスアビジンビオチン化ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＡＢＣ） キットを、製造者の指示（Ｖｅｃｔｏｒ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）に 従って用い、ホースラディツシュペルオキシダーゼを３，３°−ジアミノベンジ ジンで可視化した。これらの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色し た。完全な長さのｂ−ＡＰＰを染色するために、組換えワクチンおよび抗つサギ ＡＢＣキットによって発現された、完全な長さのヒｌ−ｂ−ＡＰＰ５９５に対す る抗血清の１７４００希釈物を用いた。これら切片をヘマトキシリンおよびエオ シンで対比染色した。ヒト脳切片を、アルツハイマー病と臨床的に診断された個 体から得た。ヒト切片を調製し、９８％の蟻酸で１０分間処理したこと以外は、 マウス組織切片と同様に染色した。競合実験として、抗体希釈液を、適用の前に 、４°Ｃで１２時間、３７℃で３０分間、２５０ｍｇ／ｍｌの１〜２８β−アミ ロイド合成ペプチドでプレインキュベーンコンした。図１２Ａおよび図１２Ｂに 示すように、抗体が、ヒト組織切片における神経炎による斑を選択的に染色し、 染色の前に、モノクローナル抗体を合成ペプチド免疫原とプレインキュベーンコ ンすることによって、免疫反応性を除去する。

組換え遺伝子および野生型の脳の切片を、４．１抗体で並行して染色した。野生 型マウスの脳よりも、大量の免疫ペルオキシダーゼの反応性が、組換え脳のニュ ーロン、および神経網全体で観察された。

図１２Ｃは、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１の創始細胞１０の株の動物からの、海馬錘体細胞 層において、増加した二ニーロン染色の例を示している（図１２０）。神経炎突 起が顕著に染色されているのも観察される。分枝するニコーロン突起は、組換え 海鳥のＣＡ−１およびＣＡ−３領域の踵体細胞層の側面の層において、最も明白 に増加した。組換え脳のより深い表層において、神経炎突起の染色が増大してい るのも見られた。ニューロンおよび突起の染色は、その前に行う抗体の２８残基 の合成り一アミロイドペプチドとのインキュベーションにより十分に競合し、そ して蟻酸処理によって減少した。さらに、図１２Ｄに示すように、組換え脳にお ける神経炎の染色は、完全な長さのｂ−ＡＰＰに対する抗体を用いて検出され、 ニニーロン突起における免疫反応物質が完全な長さのｂ−ＡＰＰであることを示 した。

４１モノクローナル抗体で染色された３つの組換え株からの脳切片には、細胞外 免疫反応沈着物も見られた（図１３Ａ−Ｄ）。

これらの沈着物は、研究された野生型動物には見られない。

この沈着物は、寸法、形状および頻度は様々である。直径１０〜３０ｍｍの小型 の沈着物を、図１３Ａ−Ｈに示す。沈着物は、視床および線条においてもよく見 られたが、皮質および海馬において最もよく見られた。沈着は密集して起こる傾 向がある。

Ｎ５Ｅ−ｂ−Ａ７Ｓ１創始細胞１０または１１からの全編切片１つにつき、平均 して５つの沈着物が見られたが、１つの切片には１５個の１０〜５０ＩＩ１１の 大きさの沈着物が観察されている。無定形または顆粒状の免疫反応細胞外沈着物 も、４．１モノクローナル抗体で染色した組換え脳切片では見られたが、対照の 脳切片では見られなかった。図１３ｅに、Ｎ５Ｅ−ｂ−Ａ７５１７５１創始細胞 １１の動物の海馬における、広がったβ−アミロイド免疫反応性の例を示す。組 換え動物からの組織切片における細胞外沈着物を検出するためには、蟻酸で処理 を行う必要がある。図１４ｅに示すように、組織の染色はβ−アミロイドペプチ ドと競合する。沈着物は、完全な長さのｂ−ＡＰＰに対する抗体で、可変的に染 色される。Ｎ５Ｅ−Ａ７５１創始細胞１０および１１からの脳は、Ｎ５Ｅ−ｂ− Ａ７５１創始細胞２４より多くの小型沈着物を示した（表２）が、創始細胞２４ の方がＮ５Ｅ−ｂＡ７５１導入遺伝子のコピー数は多い。

紅 “に　いたマウスの　とめ 株　動物　性　年齢１　遺伝子型　コピー数２　沈着物３ＮＳＥ−７５１ １００Ｆ　１２　Ａａ　１　＋＋＋ ３１ネ　Ｆ　７　Ａａ　＋＋ １６８　Ｆ　５　Ａａ　＋＋＋ ３３４　Ｍ　２　ＡＡ　＋ １１　０　Ｍ　１５　Ａａ　４　＋＋＋５１　Ｍ　１２　Ａａ　＋ ２３６　Ｍ　４　ＡＡ　＋＋＋ ２８７　Ｆ　３　ＡＡ　＋ ２４　７７　Ｍ　８　Ａａ　８　＋ ２０１　Ｆ　５　ＡＡ　＋ 野生型 ５　Ｍ　９　− ６Ｆ１２− １月；２−培体；３大きさ＞　５　ｍｍ、（−）　（＋／＋＋／＋＋＋）沈着物 の相対発生量、つまり、染色した複数切片の平均として、１つの切片につき、＋ は〈５の、＋＋は５〜１０の；＋＋＋は〉１０の沈着物。ＭおよびＦは、それぞ れ雄および雌のマウスを示し；ＡＡおよびＡａは、それぞれ同型接合体および手 探合体を示し；ｎ、ａ、は適用不能を表し；　傘Ｎ５Ｅ−Ａ７５１　ＦＩＯ＃３ １は原因不明で自然死した。

これらのマウス潜伏外因性遺伝子は、１）ＮＳＥ−７５１またはＮ５Ｅ−６９５ ＤＮＡがゲノムに安定して取り込まれることの実証、２）純粋株の産生、３）ｄ ＮＡおよびタンパク質発現の特性化、４）考え得る外来ＤＮＡの発現の病理学的 重要性の究極的な研究、そして５）潜在的な治療上の化合物のテストを行うよう になり得る。

上記のプロトコルによって産み出される、組換え動物を同定し、特性化するため に、様々な分析方法を用い得る。もちろん、どの組換え動物が、Ｎ５Ｅ−Ａ−９ ９、Ｎ５Ｅ−Ａ−４２、ＭＴ−Ａ−９９およびＭＴ−＾−４２などの、挿入され た配列を含有するかを確認する必要がある。これらの挿入物は、Ａ４ｉ挿入物と 同じく、同一の原理、および特定のＰＣＲｌおよびサザンプロットオリゴヌクレ オチド試薬、およびウェスタンプロット用の抗体を用いて検出し得る。様々な異 なる技術および技術の組み合せは、この開示を読むことで当業者には明らかにな るであろう。

誓書動物の脳内のＡ７５１またはＡ６９５前駆体を同定するためのウェスタンプ ロット法が開発されている。例えば、全編のホモジネートと反応する、（組換え ワクシニアウィルスシステムを用いて得られる）　Ａ３９５に対する抗血清を用 いるウェスタンプロットが行われた。１つのタンパク質は、予測される前駆体の 分子量である、１２０ｋｄと認識された。プロットのためにタンパク質を転移さ せる膜は、タンパク質転移に大きな影響を及ぼす。３０ｋｄ以上のタンパク質に ついては、ポリビニレンジフルオライド（ＰＶＤＦ）が最適であり、一方、３０ ｋｄ以下のものはニトロセルロースがより有効である。その他の、アミロイド前 駆体の領域に対する、入手可能な抗血清、特に、クニノツ（ｌ［ｕｎｉｔｚ）イ ンヒビター領域に対する、およびコア領域に対する血清を、全編タンパク質のウ ェスタンプロット分析で用いることができる。さらに、当該技術分野で既知の方 法を用いることによって、前駆体に対するモノクローナル抗体を単離することが 可能である。Ａ７５１を発現する、組換えワクシニアウィルスでマウスを免疫す ると、このタンパク質に対する抗体が生じることが示された。

図１１Ｂは、野生型および組換えマウスからのＤＮＡのサザンブロ、トを示して いる。レーン１および２、野生型（ＷＴ）　；レーン３および４、Ｎ５Ｅ−Ａ７ ５１創始細胞１０　（ＦＩＯ）　、レーン５および６、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１創始細 胞１１　（Ｆｉｌ）　；レーン７および８、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１創始細胞２４　（ Ｆ２４）。矢印は内因性マウスｂ−ＡＰＰ遺伝子を示す。点は外因性ｂ−ＡＰＰ を示す。

図１２（Ａ％Ｂ％ＣおよびＤ）は、ヒトおよびマウスの脳のイムノペルオキシダ ーゼ染色を示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、４．１抗体で染色した、ｂ−アミロ イド合成ペプチド免疫原とのブレインキュベーションを行わなかったもの（１２ Ａ）およびブレインキュベーションを行ったもの（１２Ｂ）の、尾部海馬から得 たヒトアルツハイマー病組織切片を示す。図１２Ｃは、４．１抗体で染色した、 Ｎ５Ｅ−Ａ７５１　ＦＩＯ（Ａ３３４）の海馬ＣＡ〜１領域の錘体細胞層を示す 。図１２Ｄは、４．１抗体で染色した、野生型マウス（：３）からの同一領域を 示す。倍率は５００倍である。

図１３　（Ａ、　Ｂ、　Ｃ，Ｄ、およびＥ）は、Ｎ５Ｅ−Ａ７５１の脳における 、免疫反応沈着物の顕微鏡写真である。図１３Ａは、Ｆｉｌ　（＄１０）の前頭 頭頂皮質における小型沈着物であり；図１３Ｂは、Ｆｉｌ　（Ａ２３６）の視床 における小型沈着物であり；図１３Ｃは、Ｆｉｌ　（＃０）の海馬ＣＡ〜２領域 における小型沈着物であり；図１３Ｄは、Ｆｌｏ（Ａ１６１３）の前頭頭頂皮質 における沈着物の群であり；図１３Ｅは、Ｆｉｌ　（Ａ２３６）の海馬層分子に おける不定形沈着物である。

Ｌ」すｖ１Δ史里 本発明の組換え哺乳動物は、その動物の脳内に形成される斑の量を減少させる能 力についての、薬学的薬剤の有効性を測定するのに有用である。より明確には、 これらの哺乳動物は、β−アミロイド斑の形成を抑制する、または形成されたβ アミロイド斑の量を減少させる、およびすでに形成されている斑を消滅もしくは 減少させることにおける、このような薬剤の効力をテストするのに有用である。

本発明の組換え動物の産生方法を下記に説明する。テストする薬剤は、一旦製造 すると、対照動物または本発明の組換え動物ではない動物の群に投与され、それ と同時に本発明の組換え動物に投与される。この薬剤は、好ましくは、アミロイ ドタンパク質沈着物が動物の脳内に沈着するのに通常十分な期間にわたって、連 続的に投与される。十分な期間、薬剤を投与した後、対照動物および組換え動物 は殺される。これらの動物の脳の検査を行う。対照動物内の沈着物の量を、本発 明の組換え哺乳動物内の沈着物の量と比較することによって、アミロイド沈着物 の相対量をコントロールする、薬剤の有効性についての測定がなされる。

本発明の組換え動物は、アミロイド沈着物の抑制に関する薬剤の有効性をテスト するのに用い得るため、アルツハイマー病などのこのようなアミロイド沈着物と 関連する疾病の治療における、このような薬剤の効力をテストするための研究を 行うという点においては、これらの動物は貴重な研究道具である。しかし、アミ ロイドタンパク質に対する前駆体タンパク質の性質が既知である、疾病に関連す るアミロイド沈着が起こるのは６つの既知の場合があることに留意されたい：第 一のアミロイド症については、病因はイムノグロブリン軽鎖である；第二のアミ ロイド症については、前駆体はアミロイドタンパク質である；家族性アミロイド ニューロパシーおよび老人性心臓性アミロイド症については、トラスチレイチン （ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｉ　ｔｉｎ）としても知られているプレアルブミンまた はその突然変異体が前駆体である；甲状の髄様癌については、プロカルシトニン フラグメントが前駆体である；そして、遺伝性脳溢血については、シスタチンＣ であることが示されたガンマトレースフラグメントが前駆体である（たとえば、 Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、　Ｎｅ＋ｗ　Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９８０）　３０２：１２８３；　５ｌｅｔｔｏｎ、Ｋ、 ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９８１）　１ｊｊ−：５６１；Ｂｅｎｄｔｔｔら 、■那」星巳（１９７１）　１９：１６９；　５ｌｅｔｔｏｎ、Ｋ、ら、ｌｘ」 」■匹工東（１９７４）　４１：１１７；　５ｌａｔｔｏｎ、に、ら、Ｊ　Ｅｘ ｐ　Ｍｅｄ　（１９７６）　１４３：９９３参照のこと）。上記は一部を挙げた ものであり、少なくとも、甲状癌のアミロイドの前駆体としてのプロカルシトニ ンフラグメントについては、数多くのその他の文献がある。また、あるいはさら に、このようなβ−アミロイドファタンパク質の前駆体は、脳内あるいはその他 の場所で産生され得、特異的に脳内に沈着される。

本発明の組換え動物および特に組換え哺乳動物は、様々な薬剤の、脳内のβ−ア ミロイド沈着物に関連する様々な疾病（上記を含む）の治療における効力を測定 するのに用い得る。

本発明の組換え哺乳動物に関して、薬剤をテストするためには、当業者に既知の 、比較薬剤テストプロトコルを用い得る。

ニューロン内神経原繊維のもつれは、その他の変性疾病にも存在スるが、ニュー ロン間の空間におけるアミロイド沈着物（神経炎斑）の存在、および周辺の微小 血管におけるアミロイド沈着物（血管性斑）の存在が、アルツハイマー病の特性 であるように思われる。その中で、神経炎斑が最も一般的である（　Ｐｒ１ｃｅ 、　Ｄ、　Ｌ、ら、Ｄｒｕ　Ｄｅｖｅ　ｏ　ｍｅ　ｔ　Ｒ５ｅａｒｃｈ　（１９ ８５）　５：５９−６８）。斑は、アルツハイマー病が発病した老齢のダウン症 患者の脳内にも見られる。本発明の組換え動物は、アミロイド沈着物に関連する 疾病、つまり、アルツノ１イマー病、アミロイド症による（ダッチ）遺伝性脳溢 血、およびダウン症の治療に関して用いられるすべての種類の薬剤の有効性を測 定するのに用い得る。

本発明を製造し、使用する好適な実施態様を説明してきたが、本発明から離れる ことな（、様々な変更および改変がなされ得る。

Ｌ」五 以下の培養を、特許目的のためのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）　、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　ＵＳ Ａに寄託した。ノイクテリオファージファージλＳＭ２、λ５Ｍ２Ｗ９、および λＡＰＣＰ１６８１４、並びにｐＮＳＥ−β−ＡＰＰ７５１を、微生物の寄託の 国際的認識に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）に特定された条件の下で 寄託した。

隻１　！■１号　菟丘旦 λＳＭ２　４０２７９　１９８６年１１月１３日５Ｍ２Ｗ４　４０２９９　１９ ８６年１２月２９日５Ｍ２Ｗ３　４０３００　１９８６年１２月２９日λ５Ｍ２ Ｗ９　４０３０４　１９Ｂ７年１月２９日λＡＣＰＣ１６８ｉ４　４０３４７　 １９１１７年７月１日ｐＮＳＥ−β−ＡＰＰ７５１　７５０１２　１９９１年５ 月２２日寄託された細胞株の利用は、いずれの政府の権威の下でもその特許法に 基づいて付与された権利に違反して、本発明を実０１Ｍ講ＣＡＣＡｍ唱ＧＣＣμ 礒３唱ａ１αＸム！Ｇａで＾＾！Ｑ（αにαにαにａ噛昭ＧＬｕ　ｎｃ　Ｗｉｇ 　＃ＬＩ？　ＡＡａ　ｈｔｇ　ｖａｘ　Ｇ１５ｓ　Ａｌａ　凰ｔｔ　Ｌａｕ　ｈ ｍ　Ｍｙ　＾τ１　＾Ｋｑ　Ｍｌ　ム[暢　ム工ａ ＣＴＣＩ　ＣＡａ　ＡＡＣ？ＡＣＡ？ｃＡｃｅ　ＧＣ！ｌ：’Ｍ　ＣＭＩ　ＧＣ ’？　（１’ｆｆ　ＣＣＩＣＣ？　Ｃ＠Ｉ＄　１：Ｃ？　Ｃh３？　ζ＾Ｃ（１ ？０ ムーｕＧλｕ　Ａａａ　ｑｔ　Ｘｌａ　テｂｅ　ム五１　Ｌ−鴫　Ｇ１烏　ムＡ ｍ　Ｖａｌ　Ｐｆ＠　ＷＥ＠　ムｔｑ　Ｔｅｅｔｈ　＾ｔ１@厘五Ｓ　ｖａ工 ４感０　４７０ ？！’ＣＡＡ？　Ａｒｇ　Ｃ？Ａ　ＪＩＡＩＳ　ＭＱ　ＴＡ？　ＧＩＣＣ１８０ ３Ｑ＆Ａ　ＣＡａ　ＪＪｉａ　Ｗ　Ａｌａ　ＣＡａ　ＣＡＩF　ＡＣｅ Ｍ＃　ａｂａａ　ＩＩＪ？　ｔ、＊ｕ　Ｌｙｅ　Ｌｙｍ　ｔｙｔ　Ｖａｌ　Ａｒ ｇ　ＡＡａ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　ｃｙｓ　為葛９為ｇ啼　Ｃ上≠轟■■@！カに ４＠Ｏ α＾テ　ＣＡａ　ｃ？ａ　ｃ〒〒　ＣＡａ　入Ａ＾　ＧＡＧ　Ｃ入＾　為ＡＣテ Ａテ　〒ζ為　α＾！　Ｇ＾ＣＧＩＣ↑ＷＥ　ａｃｃ　＾＾b＾ｔａ ＾ａｐ　Ｇｌｕ　Ｌａａｕ　Ｌ債ｕ　Ｇ工Ｑ　ＬＹｍ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　ｈｓｔ ｓ　？７ｆ　！ｏｒ　＾Ｓ９　ムｓｐ　Ｖａｌ　ｃｍ−＾λ\　Ａａａ　ＭＩＣ テ Ａ？？　４Ｇ？　α＾＾　Ｃにｈ　ｋＱＧ　Ａｒｇ　Ａ１３？　？ＡＣＧＧＪｋ 　ＡＡＣ（！？　ＧＣ？　ＣＴＣＡｒｇ　ＣｅＡ　デＣ？？eＣ＾ＣＣ Ｈａ　Ｓａｔ　ＧＬｕ　Ｐｅａ　ｋｔｑ　ＬＬ＠　ｍａｔ　ｔｙｔ　Ｇｌｙ　ｈ ａｍ　Ａｓｐ＾工ａ　ＬＪ％Ｉ　ｇｔ’ｔ　ｐｒｏ　Ｓｅ（狽≠普@ｍｒ ＄７０ 人＾Ｃ嚇Ｇ？？υ−ＣＣτＧ〒！Ｇ＾ＴＧζＣα＜ｃｅテＧζテａｃｅ　ｃ＾Ｃ Ｃα＾鎮論ｅｒａ　＾ＣＣ＾Ｃ〒＾ｓｎ　ＧＬｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ｐｅａ　ｖ ａＬ　Ａｍｐ　ＡＡａ　ｋｔｑ　？ｔＯＡＡａ　ＡＡａ　＾峠　＾ｔｑＧλＹ　 Ｌｌａｕ　Ｔ■b丁？１（ ６２Ｑ　６コロ ＣＣ講Ｃ（：Ａ　ＧＯ？　？ｅ？　ＧＷ　？？ＯＡＣＡ　ＡＡ？　Ａｒｇ　ＡＡ Ｇ　ＡＣＯＳＡＧ　ＧＡＧ　ＡＭ　賀ゴ（Ｊ−ｋＣ−〒Ｇ＾`Ｇ ｈｔｑ　Ｐｒｏ　Ｇｕｙ　Ｓｅｅ　Ｑｌｙ　Ｌｓｕ　？Ｍ　Ａｓｎ　ＸＬ＊　Ｌ ｙｓ　Ｔｈｅ　ＧＬＩＪ　ＧＬｕ　Ｈａ　Ｓｅｃ　ＧＬｕ　魔≠k　Ｌｙｓ ＾ｔｅ　ａａｙ　Ｇｅａ　ａ＾＾　ｒｙｅ　ＣＧＡ　（Ｊ？　ＯＡＣＴＣＡ　Ｇ Ｇ＾　〒ｈＴ　ｃａａ　ａ〒’ｒ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　Ｃ＾＾@＾＾＾　ｆ〒Ｃ ＭＥ？　Ａｓｐ　ｈＬａ　ＧＬｕ　ｐｈ＠＾ｃｑ　Ｕｓ＾ｓｐ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ 　ｔｙｔ　ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｈａｓ　８４ｍ　Ｇｉｎ　Ｌｙ■@Ｌａｕ ＦＩＧ、ｌ−４ Ｈｅ　ｒｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｖａｌ　Ｖ ａｌ　ｒｙｅ　ＡＬａ、、　ａ−＋’ｃ’＋’ｃａｍｍｍ　−“°“′４Ｐｃ％ ↓、ｕ’ｂｔＪａｗ＊ｔ （７１ｈ　？ ｕ”＋　ａコ ［ＥｃｏＲＱ ＦＩＧ、　ｌ○ ＦＩＧ、　Ｉ　ＩＡ ＦＩＧ、ｌＩＢ　Ｍｒ　ＷＴ　ＦＩＯＦｌｌ　Ｆ２４ｋｂ１２３４５６７８ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、Ｉ３ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細胞 を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であって、該配列が、 組織特異的なプロモーター配列；およびβ−アミロイド前駆体タンパク質の産生 をコードする配列；を包含する、組換え哺乳類動物。
2. ２．前記プロモーターが、神経組織特異的プロモーターである、請求項１に記載 のヒト以外の組換え哺乳類動物。
3. ３．前記神経組織特異的プロモーターが、神経細胞の特異的エノラーゼ（ＮＳＥ ）である、請求項２に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
4. ４．前記β−アミロイド前駆体タンパク質の産生をコードする配列が、Ａ４２、 Ａ９９、Ａ６９５、Ａ７５１およびＡ７７０から成る群から選択されるタンパク 質をコードする配列である、請求項２に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
5. ５．前記β−アミロイド前駆体タンパク質の産生をコードする配列が、Ａ４ｉを コードする配列である、請求項１に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
6. ６．前記哺乳類動物が、マウスである、請求項１に記載のヒト以外の組換え哺乳 類動物。
7. ７．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細胞 を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であって、該配列が、 組織特異的なプロモーター配列；および【配列があります】 のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現をコードする配列； を包含する、組換え哺乳類動物。
8. ８．前記組織特異的プロモーター配列が、神経細胞の特異的エノラーゼである、 請求項７に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
9. ９．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細胞 を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であって、該配列が、 組織特異的なプロモーター配列；および【配列があります】 のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性な折り畳まれたタンパク質を発現し与 える配列； を包含する、組換え哺乳類動物。
10. １０．前記組織特異的プロモーター配列が、神経細胞の特異的エノラーゼである 、請求項９に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
11. １１．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細 胞を有するヒト以外の紺換え哺乳類動物であって、該配列が、 組織特異的なプロモーター配列；および【配列があります】 のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する配列；を包含する、組換え哺乳類 動物。
12. １２．前記組織特異的プロモーター配列が、神経細胞の特異的エノラーゼである 、請求項１１に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
13. １３．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細 胞を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であって、該配列が、 組織特異的なプロモーター配列；および【配列があります】 のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性な折り畳まれたタンパク質を発現し与 える配列； を包含する、組換え哺乳類動物。
14. １４．前記組織特異的プロモーター配列が、神経細胞の特異的エノラーゼである 、請求項１３に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
15. １５．図１のＤＮＡ配列のサブフラグメントを含む細胞を有するヒト以外の組換 え動物であって、該サブフラグメントが、バクテリオファージλＡＰＣＰ１６８ ｉ４のβ−アミロイド関連遺伝子の１６８塩基対挿入フラグメントに対応する、 組換え哺乳類動物。
16. １６．前記１６８塩基対挿入フラグメントが、【配列があります】 のアミノ酸配列を有するβ−アミロイド前駆体タンパク質を発現する、請求項１ ５に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
17. １７．前記哺乳類動物が、マウスである、請求項１６に記載のヒト以外の組換え 哺乳類動物。
18. １８．前記クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列が、 Ａ４ｉを遍在的に過剰発現する、請求項１５に記載のヒト以外の組換え哺乳類動 物。
19. １９．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細 胞を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であって、該配列が、 組織特異的なプロモーター配列；および【配列があります】 のアミノ酸配列を有する、プロテアーゼインヒビターを発現する配列； を包含する、組換え哺乳類動物。
20. ２０．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細 胞を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であって、 【配列があります】 のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性な折り畳まれたロテアーゼインヒビタ ーを発現し与える、組換え哺乳類動物。
21. ２１．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細 胞を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であ以下の配列 【配列があります】 の位置１３のアルギニンに対応するアミノ酸が、芳香族アミノ酸で置換された、 ヒトアミロイド斑コアタンパク質プロテアーゼインヒビターのアナログを発現し 、該アナログが、キモトリプシン障害活性を示す、組換え哺乳類動物。
22. ２２．前記芳香族アミノ酸が、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファ ンから成る群から選択される、請求項２１に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物 。
23. ２３．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む細 胞を有するヒト以外の組換え哺乳類動物であて、 以下の配列 【配列があります】 の位置１３のアルギニンに対応するアミノ酸が、中性疎水性アノ酸で置換された 、ヒトアミロイド斑コアタンパク質プロテアーゼインヒビターのアナログを発現 し、該アナログが、ヒトのエラスターゼ阻害活性を示す、組換え哺乳類動物。
24. ２４．前記中性疎水性アミノ酸が、ロイシン、メチオニンおよびバリンから成る 群から選択される、請求項２３に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
25. ２５．神経組織特異的プロモーター配列を含む複数の神経組織細胞；および、 バクテリオファージλＰＡＰＣＰ１６８ｉ４のβ−アミロイド前駆体遺伝子の１ ６８塩基対挿入フラグメント、および、それに機能する様に連結された制御配列 ； を有することで特徴付けられ、 定められた条件下で、哺乳類動物細胞中で、該制御配列の制御下に、該遺伝子を 発現する、 組換え哺乳類動物。
26. ２６．前記哺乳類動物が、神経細胞中でβ−アミロイド前駆体遺伝子を過剰発現 する、請求項２５に記載のヒト以外の組換え哺乳類動物。
27. ２７．前記哺乳類動物が、マウスである、請求項１に記載のヒト以外の組換え哺 乳類動物。
28. ２８．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む複 数の細胞を有することで特徴付けられるヒト以外の組換え哺乳類動物を製造する 方法であって、該配列が、β−アミロイド前駆体タンパク質をコードする配列に 機能する様に連結された神経組織特異的制御配列を包含し、 以下の工程： （ａ）哺乳動物に発達可能なヒト接合子の前核中に、マイクロインジェクション により該制御配列および連結された配列を導入し、遺伝子的に形質転換した接合 子を得る工程；（ｂ）該遺伝子的に形質転換した接合子に由来する胚（ｅｍｂｒ ｙｏ）を、妊娠満期間まで該胚を保持し得る疑似妊娠した雌中に移植する工程； （ｃ）該胚を妊娠満期間まで発達させる工程；を包含し、 ここで、該制御配列および連結された配列が、該胚を妊娠満期間まで正常に発達 させるのを妨げる様式および程度に該連結された配列が活性化しない様に、選択 される、方法。
29. ２９．前記制御配列が、前記遺伝子に自然界で連結している配列である、請求項 ２８に記載方法。
30. ３０．前記制御配列が、前記遺伝子の自然界での刺激とは異なる刺激に細胞が曝 された時、該遺伝子を活性化する配列である、請求項２８に記載方法。
31. ３１．前記前核中に、少なくとも約１，０００コピーの前記遺伝子がマイクロイ ンジェクションされ、そして、注入される遺伝物質の体積が、約１０ピコリット ルを越えない、請求項２８に記載方法。
32. ３２．前記制御配列および連結された配列が、別々の雌および雄の前核を有する 卵の雄の前核中に導入される、請求項２８に記載方法。
33. ３３．移植の前に前記接合子を、桑実胚あるいは胚盤胞段階までインビトロで発 達させる、請求項２８に記載方法。
34. ３４．クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む複 数の細胞、および、それに機能する様に連結されたプロモーター配列を有するこ とで特徴付けられるヒト以外の組換え哺乳類動物であって、 ここで、該プロモーターおよびＤＮＡ配列が、以下から成る群から選択され： プロモーターＡ４配列 ＮＳＥＡ４２コア領域 ＮＳＥＡ９９カルボキシ末端 ＮＳＥＡ７５１ ＮＳＥＡ６９５ ＮＳＥＡ４ｉ ＭＴＡ７５１ ＭＴＡ６９５ ＭＴＡ４２コア領域 ＭＴＡ９９カルボキシ末端 ＭＴＡ４ｉ 哺乳類動物細胞中で該プロモーター配列の制御下でＤＮＡ配列を発現する、組換 え哺乳類動物。
35. ３５．Ａ４配列およびそれに機能する様に連結されたプロモーター配列をから成 る、クローニングされた組換えＤＮＡ配列あるいは合成のＤＮＡ配列を含む複数 の細胞を有することで特徴付けられるヒト以外の組換え哺乳類動物を製造する方 法であって、 定められた条件下で、哺乳類動物細胞中で該プロモーター配列の制御下で、該Ａ ４配列を発現し、以下の工程： （ａ）哺乳動物に発達可能な哺乳類動物接合子の前核中に、マイクロインジェク ションにより該ＤＮＡ配列を導入し、遺伝子的に形質転換した接合子を得る工程 ； （ｂ）該遺伝子的に形質転換した接合子に由来する胚（ｅｍｂｒｙｏ）を、妊娠 満期間まで該胚を保持し得る疑似妊娠した雌中に移植する工程； （ｃ）該胚を妊娠満期間まで発達させる工程；を包含し、 ここで、該Ａ４配列およびプロモーターが、以下から成る群から選択される： プロモーターＡ４配列 ＮＳＥＡ４２コア領域 ＮＳＥＡ９９カルボキシ末端 ＮＳＥＡ７５１ ＮＳＥＡ６９５ ＮＳＥＡ４ｉ ＭＴＡ７５１ ＭＴＡ６９５ ＭＴＡ４２コア領域 ＭＴＡ９９カルボキシ末端 ＭＴＡ４ｉ 方法。
36. ３６．前記プロモーター配列がＮＳＥであり、そして、前記Ａ４配列がＡ７５１ である、請求項３５に記載の方法。
37. ３７．前記プロモーター配列がＮＳＥであり、そして、前記Ａ４配列がＡ５９５ である、請求項３５に記載の方法。
38. ３８．前核中に、少なくとも約１，０００コピーの前記ＤＮＡ配列がマイクロイ ンジェクションされ、そして、注入される遺伝物質の体積が、約１０ピコリット ルを越えない、請求項３５に記載の方法。
39. ３９．前記ＤＮＡ配列が、別々の雌および雄の前核を有する卵の雄の前核中に導 入される、請求項３５に記載方法。
40. ４０．移植の前に前記接合子を、桑実胚あるいは胚盤胞段階までインビトロで発 達させる、請求項３５に記載方法。
41. ４１．斑の減少量により薬剤の有効性を決定する方法であって、以下の工程： 請求項１に記載の組換え哺乳類動物に該薬剤を投与し、そして、該哺乳類動物の 脳にアミロイドタンパク質の沈着を起こすのに通常は有効な期間の間、該薬剤を 投与し続ける工程；および インデューサーに関連したアミロイド沈着に関して脳を試験し、そして、アミロ イド沈着の相対的量を標準と比較することで、該薬剤の有効性を決定する工程； を包含する、方法。
42. ４２．前記標準が、薬剤投与を受けていない、請求項１に記載の組換え哺乳類動 物から得られる、請求項４１に記載の方法。
43. ４３．薬剤の有効性を決定する方法であって、以下の工程： 請求項１４に記載の組換え哺乳類動物に該薬剤を投与する、ここで、該哺乳類動 物の脳にアミロイドタンパク質の沈着を起こすのに通常は有効な期間の間、哺乳 類動物に充分な量で、周期的に該薬剤を投与する、工程；およびアミロイド沈着 に関して哺乳類動物の脳を試験し、そして、アミロイド沈着の相対的量を標準と 比較することで、該薬剤の有効性を決定する工程； を包含する、方法。
44. ４４．前記標準が、薬剤投与を受けていない、請求項１４に記載の組換え哺乳類 動物の脳である、請求項４３に記載の方法。