ES2217250T3 - Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.Info
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Abstract
SECUENCIAS DE DNA SINTETICO O RECOMBINANTE CLONADO RELATIVAS A LA PATOLOGIA DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER SE INYECTAN EN OVULOS FERTILIZADOS DE MAMIFEROS (PREFERIBLEMENTE OVULOS DE RATON). LOS OVULOS INYECTADOS SE IMPLANTAN EN HEMBRAS PSEUDO-PREÑADAS Y SE HACEN CRECER A TERMINO PARA SUMINISTRAR RATONES TRANSGENICOS CUYAS CELULAS EXPRESAN PROTEINAS RELACIONADAS CON LA PATOLOGIA DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. LAS SECUENCIAS INYECTADAS SE CONSTRUYEN POSEYENDO SECUENCIAS PROMOTORAS QUE EXPRESEN LA PROTEINA DESEADA EN TEJIDOS ESPECIFICOS DEL MAMIFERO TRANSGENICO (MAS NOTABLEMENTE EN EL TEJIDO NERVIOSO). LAS PROTEINAS QUE SON PREFERIBLEMENTE EXPRESADAS DE FORMA UBICUOA INCLUYEN 1) PROTEINAS PRECURSORAS DEL NUCLEO (BETA)-AMILOIDE; Y 2) PROTEINAS PRECURSORAS RELACIONADAS CON LOS (BETA)-AMILOIDES; Y 3) UN INHIBIDOR DE LA PROTEASA DE SERINA. LOS RATONES TRANSGENICOS SUMINISTRAN MODELOS UTILES PARA ESTUDIAR LOS COMPUESTOS QUE ESTAN SIENDO COMPROBADOS PARA SU UTILIDAD EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDADDE ALZHEIMER, Y PARA ESTUDIAR LAS RELACIONES "IN VIVO" DE ESTAS PROTEINAS ENTRE SI.
Description
Mamífero transgénico, no humano que muestra la
patología de formación amiloides de la enfermedad de Alzheimer.
Mamífero no humano transgénico que presenta la
patología de formación de amiloides de la enfermedad de
Alzheimer.
La invención se refiere generalmente a modelos
animales útiles para probar una hipótesis relacionada con el
tratamiento de una enfermedad. Más específicamente, se refiere a
mamíferos transgénicos que han tenido incorporados en su genoma
segmentos específicos de material genético exógeno que codifican y
en tipos celulares específicos sobreexpresarán ubícuamente proteínas
\beta-amiloides, sus precursores y las porciones
de tales proteínas y precursores.
El antecedente de la presente invención es doble
ya que se refiere a: (1) organismos biológicos que han sido
transformados genéticamente; y (2) un estudio de material genético
relacionado con la amiloidosis. Ambas áreas se tratan más abajo.
Durante algún tiempo se ha sabido que es posible
llevar a cabo la transformación genética de un zigoto (y del
embrión y el organismo maduro que resulta de allí) mediante la
colocación o inserción de material genético exógeno en el núcleo
del zigoto o en cualquier material genético nucleico que por último
forme parte del núcleo del zigoto. El genotipo del zigoto y el
organismo que resulta del zigoto incluirá el genotipo del material
genético exógeno. Adicionalmente, la inclusión de material genético
exógeno en el zigoto producirá la expresión del fenotipo del
material genético exógeno.
El genotipo del material genético exógeno se
expresa tras la división celular del zigoto. No obstante, se
producirán la expresión del fenotipo, v.g., la formación de un
producto o productos proteicos del material genético exógeno, o
alteraciones del fenotipo natural del zigoto o del organismo, en el
momento del desarrollo del zigoto o del organismo durante el cual
el material genético exógeno concreto es activo. Entre las
alteraciones de la expresión del fenotipo se incluyen un aumento o
disminución de la expresión del fenotipo o una alteración de la
promoción y/o el control de un fenotipo, incluyendo la adición de
un nuevo promotor y/o controlador o la suplementación de un
promotor y/o controlador del fenotipo existente.
La transformación genética de diferentes tipos de
organismos se revela y describe con detalle en la Patente de los
Estados Unidos Núm. 4.873.191, expedida en 10 de Octubre de 1.989,
que se incorpora aquí como referencia para describir los métodos de
producción de organismos transgénicos. La transformación genética
de organismos se puede utilizar como un análisis in vivo de
la expresión génica durante la diferenciación y en la eliminación o
disminución de las enfermedades genéticas.
La transformación genética de un zigoto (y de los
organismos que maduran de allí) se lleva a cabo mediante la
adición de material genético exógeno de tal manera que el material
genético exógeno se vuelve parte de la porción nucleica del zigoto
antes de la división del zigoto. Si el material genético exógeno se
añade después de la mitosis o división celular del zigoto, el
material genético exógeno debe ser añadido a cada núcleo
resultante. No obstante, existe la posibilidad de que el material
genético exógeno no pueda ser integrado y se vuelva una parte del
material genético del zigoto y del organismo que resulte de allí.
Así, el material genético exógeno se puede añadir a cualquier
material genético nucleico que forme parte por último del núcleo
del zigoto, incluyendo el núcleo del zigoto.
El material genético nucleico del organismo que
está siendo transformado debe estar en un estado físico que lo
capacite para absorber el material genético exógeno. Existen
numerosas rutas para lograr esto. Por ejemplo, el material genético
exógeno se puede colocar en el núcleo de una célula germinal
primordial que sea diploide, v.g., un espermatogonio u oogonio. Se
permite después que la célula germinal primordial madure hasta un
gameto, que después se une con otro gameto o fuente de un juego
haploide de cromosomas para formar un zigoto.
El material genético exógeno se puede colocar en
el núcleo de un huevo maduro. Es preferible que el huevo esté en
un estado fertilizado o activado (mediante partenogénesis). Tras la
adición del material genético exógeno, se añade un juego haploide
complementario de cromosomas (v.g., un célula espermática o cuerpo
polar) para posibilitar la formación de un zigoto. Después se deja
que el zigoto se desarrolle hasta un organismo por ejemplo
implantándolo en una hembra pseudopreñada. Se analiza la
integración del material genético exógeno en el organismo
resultante. Si se determina integración positiva, el organismo
puede ser utilizado para el análisis in vivo de la expresión
génica, cuya expresión se cree está relacionada con una enfermedad
genética concreta.
Se han realizado intentos para estudiar algunos
tipos diferentes de enfermedades genéticas utilizando semejantes
animales transgénicos. Los intentos para estudiar la enfermedad de
Alzheimer se describen en la solicitud PCT publicada WO89/06689 y
en la solicitud PCT WO89/06693, ambas publicadas el 27 de Julio de
1.989, cuyas solicitudes publicadas se incorporan aquí como
referencia para describir las secuencias genéticas que codifican la
proteína \beta-amiloide del Alzheimer y la
incorporación de semejantes secuencias al genoma de los animales
transgénicos.
Como se describe con detalle más abajo, se cree
que la producción de la proteína \beta-amiloide
está relacionada con la enfermedad de Alzheimer. No obstante, un
serio obstáculo para la elucidación del mecanismo molecular
implicado en la síntesis y el depósito amiloide en un cerebro con
enfermedad de Alzheimer ha sido la no disponibilidad de modelos
animales satisfactorios para este trastorno únicamente humano. En
las solicitudes PCT publicadas WO/8906689 y WO89/06693 se describen
secuencias de ADN concretas que se cree que están relacionadas con
la producción de amiloide. Estas secuencias concretas se fusionan
con vectores virales tumorales recientemente desarrollados,
derivados de los virus SV40 y JC para producir constructos. Estos
constructos se utilizan para transfectar células y ratones
transgénicos para establecer modelos para la sobreexpresión
amiloide, que puede estar relacionada con la acumulación amiloide en
el cerebro con enfermedad de Alzheimer.
Se pretende que los animales transgénicos
producidos según la presente invención proporcionen un medio
experimental para elucidar aspectos de la patogénesis molecular de
la enfermedad de Alzheimer y sirvan como herramientas para
seleccionar fármacos que puedan tener aplicación potencial como
agentes terapéuticos para prevenir o limitar la acumulación
amiloide.
Se estima que por encima del 5% de la población
de los Estados Unidos mayor de 65 años y por encima del 15% de la
población de los Estados Unidos mayor de 85 años están acosados por
alguna forma de la enfermedad de Alzheimer (Cross, A.J., Eur J
Pharmacol (1982) 82: 77-80; Terry, R.D.,
et al., Ann Neurol (1983) 14:497506). Se cree
que la causa principal para el confinamiento de ancianos en
instalaciones de atención a largo plazo es debida a esta
enfermedad, y aproximadamente el 65% de las muertes en asilos
especializados lo padecen.
Se conocen algunos hechos a cerca de los
fenómenos bioquímicos y metabólicos asociados con la presencia de
la enfermedad de Alzheimer. Dos cambios morfológicos e
histopatológicos observados en cerebros con enfermedad de Alzheimer
son las marañas neurofibrilares (NFT) y los depósitos amiloides.
Las marañas neurofibrilares están presentes también en otras
enfermedades degenerativas, pero la presencia de depósitos
amiloides tanto en los espacios interneuronales (placas neuríticas)
y en la microvasculatura circundante (placas vasculares) parecen
ser características del Alzheimer. De estas, las placas neuríticas
parecen ser las más prevalentes (Price, D.L., et al.,
Drug Developmen Research (1985)
5:59-68). También se han observado placas en
cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer de cierta
edad.
La proteína que forma el grueso de estas placas
ha sido parcialmente purificada y secuenciada. Se han utilizado
cerebros ricos en placas de pacientes con Alzheimer fallecidos como
fuente para extraer un polipéptido "núcleo" de 4,2 kd, la
proteína núcleo de la placa amiloide (APCP en sus siglas en
Inglés), referida aquí como "proteína núcleo
\beta-amiloide". Este péptido fue denominado
proteína \beta por Glenner, G., et al., [Biochem
Biophys Res Commun (1984) 120:885-890]. Se ha
determinado la secuencia de aminoácidos del extremo amino [Glenner,
G., et al., Biochem Biophys Res Commun (1984)
122:1131- 1135; Masters, C.L., et al., Proc Natl
Acad Sci USA (1985) 82:4245-4259] y las
secuencias de aminoácidos presentadas por los dos grupos son
idénticas excepto que Glenner et al., informan de una
glutamina en la posición 11 para el amiloide vascular cerebral de
la enfermedad de Alzheimer mientras que Masters et al.,
informan de un ácido glutámico en la posición 11. Asimismo, los
primeros autores refieren que el amiloide vascular cerebral tiene
un único extremo amino mientras que los últimos autores refieren
que la forma encontrada en núcleos de las placas amiloides tiene un
extremo amino "desigual" - esto es, los péptidos aislados de
esta fuente parecen haber perdido los aminoácidos 3, 7, u 8 del
extremo amino. Ambos grupos han demostrado que se encuentra el
mismo péptido en los núcelos de la placa amiloide y en el amiloide
vascular de individuos adultos afectados por el síndrome de Down y
han informado sobre un ácido glutámico en la posición 11.
Roher, A., et al., Proc Natl Acad Sci
USA (1986) 83:2662-2666 también llevaron
a cabo estudios adicionales sobre la proteína núcleo
\beta-amiloide que mostraron la composición de
aminoácidos completa de la proteína \beta, y verificaron que
coincidía con las de la proteína desconocida. Sin embargo, las
composiciones obtenidas no estaban, evidentemente, de acuerdo con
las de Allsop, D., et al., Brain Res (1983)
259:348352; ni de acuerdo con las publicadas por Glenner o
Masters (supra).
Wong, C.W., et al., Proc Natl Acad Sci
USA (1985) 82:8729-8732 demostraron que
un péptido sintético que era homólogo a los diez primeros
aminoácidos de la proteína núcleo \beta-amiloide
descrita por Masters (supra) era capaz de originar los
anticuerpos en ratones y que estos anticuerpos podían ser
utilizados para teñir no sólo vasos cerebrales cargados de
amiloide, sino también placas neuríticas. Estos resultados fueron
confirmados por Allsop, D. et al., Neuroscience
Letters (1986) 68:252-256 utilizando
anticuerpos monoclonales dirigidos a un péptido sintético
correspondiente a los aminoácidos 8-17. De este
modo, en general, la proteína de la placa encontrada en diferentes
localizaciones del cerebro de pacientes con Alzheimer parece que
tiene una inmunorreactividad similar. Es altamente insoluble, como
se demuestra por la incapacidad de lograr la solubilización en
muchos desnaturalizantes utilizados comúnmente tales como
detergentes y agentes caotrópicos (Masters, supra, Allsop,
D., et al., (supra)).
Se cree, por analogía con algunas otras proteínas
amiloides, que la proteína núcleo \beta-amiloide
se puede formar a partir de un precursor en el sistema
circulatorio periférico o en el sistema linfático. Existen seis
ejemplos conocidos de depósitos amiloides asociados con enfermedad
en los que se conoce la naturaleza de la proteína precursora de la
proteína amiloide; para la amiloidosis primaria, la fuente es una
cadena larga de inmunoglobulina; para la amiloidosis secundaria, el
precursor es la proteína A amiloide; para la polineuropatía
amiloide familiar y la amiloidosis cardíaca senil, la prealbúmina
también conocida como transtireitina o una variante de la misma;
para el carcinoma medular de tiroide, un fragmento de
procalcitonina; y para la hemorragia cerebral hereditaria, un
fragmento gamma traza que se ha demostrado que es la cistatina C.
(Ver, v.g., Glenner, G., New England Journal of Medicine
(1980) 302:1283; Sletton, K., et al., Biochem
J (1981) 195:561; Benditt, et al., FEBS
Lett (1971) 19:169; Sletton, K., et al., Eur J
Biochem (1974) 41:117; Sletton, K., et al., J.
Exp Med (1976) 143:993). Lo anterior es una lista
parcial y existen al menos varias referencias adicionales con
respecto al fragmento de procalcitonina como precursor del amiloide
del carcinoma de tiroide. Alternativamente, o adicionalmente,
semejante precursor de la proteína núcleo
\beta-amiloide puede ser producido en el cerebro o
en otra parte y se deposita específicamente en el cerebro.
Se ha descrito que existe una proteína que
contiene la secuencia de la proteína núcleo
\beta-amiloide (referida como A4) en el marco de
una proteína más grande (Kang, J., et al., Nature
(1987) 325:733-736). Esta proteína, que es
un precursor potencial in vivo de la proteína núcleo
\beta-amiloide, fue pronosticada a partir de la
secuencia de un clon de ADNc aislado de una genoteca de ADNc de
tejido cerebral fetal humano y consta de 695 restos aminoácido
(referida como A695) donde el extremo amino de la proteína núcleo
\beta-amiloide comienza en la posición 597. Por
analogía con las series antes descritas, puede ser que semejante
precursor o un fragmento del mismo circule en el suero a un nivel
más alto diferenciable en víctimas de la enfermedad de Alzheimer
respecto a individuos no afectados. Alternativamente o
adicionalmente, semejantes diferencias pueden ser detectadas en el
fluido cerebroespinal.
Parece como si hubiera diversas proteínas
precursoras además de A695, que fue descrita por Kang et al.
Una de tales proteínas precursoras es descrita en la solicitud de
los Estados Unidos co-pendiente con el Número de
Serie 361.912, presentada el 6 de Junio de 1.989, por investigadores
de la misma organización investigadora que los autores de la
presente invención (A751). Otros han caracterizado una proteína
precursora amiloide adicional (ver Kitaguchi et al.,
Nature 331:530- 532 (1988), que es ligeramente más
grande, de 770 amino ácidos. Se señala que estas proteínas A751 y
A770 contienen un inserto de aproximadamente 57 aminoácidos detrás
de A695. Esta secuencia inserto de 57 aminoácidos es altamente
homóloga a varios inhibidores de tipo Kunitz que son específicos
para algunos inhibidores de serina proteasas. Están presentes 19
aminoácidos adicionales adyacentes al inserto de 57 aminoácidos en
la forma A770.
Como se ha indicado mediante las publicaciones
anteriores y otras numerosas publicaciones no citadas, el material
genético que codifica la producción de las proteínas precursoras
\beta-amiloides es el sujeto de un intenso
estudio. No obstante, hasta el presente, no existe información
verificable directa disponible sobre el mecanismo específico que
regula la producción y el depósito de proteína amiloide en el
cerebro con enfermedad de Alzheimer. Se sabe que el material
genético que codifica la producción de la proteína precursora
\beta-amiloide está en el cromosoma 21.
Adicionalmente, numerosos estudios sugieren que existen
interacciones complejas que implican al material genético de este
cromosoma. Se cree que tales interacciones implican la producción
de proteínas precursoras, proteasas e inhibidores de proteasa.
Adicionalmente, se cree que en individuos que padecen la enfermedad
de Alzheimer estas interacciones están de algún modo sesgadas de
manera que se produce y/o deposita un contenido inusualmente alto
de proteína núcleo \beta-amiloide en el cerebro.
La elevada concentración de proteína núcleo
\beta-amiloide podría ser el resultado de una
variedad de actividades bioquímicas incluyendo la sobreproducción
de semejantes proteínas y/o la incapacidad para escindir un número
suficiente de tales proteínas una vez escindidas.
Los animales transgénicos de la presente
invención proporcionarán una nueva percepción con respecto a cómo y
donde se producen estas interacciones y de este modo proporcionan
modelos más útiles para probar la eficacia de ciertos fármacos para
prevenir o reducir la acumulación de proteína núcleo
\beta-amiloide en el cerebro. Los mamíferos no
humanos transgénicos de la presente invención incluyen material
genético recombinante que consta de segmentos específicos de
proteínas precursora \beta-amiloides cuyos
segmentos se fusionan con promotores específicos capaces de
expresar la proteína en tejidos específicos tales como tejidos
nerviosos generalmente y/o en tipos específicos de tejido nervioso,
v.g., en el cerebro.
La presente invención proporciona un medio para
elucidar los mecanismos moleculares implicados en la síntesis y, de
modo más importante, inhibir la síntesis y el depósito de proteína
\beta-amiloide (de manera más importante, en el
cerebro) inhibiendo la producción y/o incrementando la escisión
tras la producción. Se inyectan secuencias de ADN recombinante o
sintético clonado relacionadas con la patología de la enfermedad de
Alzheimer en huevos de mamífero fertilizados (preferiblemente
huevos de ratón). Los huevos inyectados se implantan en hembras
pseudopreñadas y se desarrollan a término para proporcionar ratones
transgénicos cuyas células expresan las proteínas relacionadas con
la patología de la enfermedad de Alzheimer. Las secuencias
inyectadas son constructos que tienen secuencias promotoras
conectadas de manera que expresan la proteína deseada en tejidos
específicos de los mamíferos transgénicos.
Se cree que las proteínas núcleo
\beta-amiloides A99 y A42 (como se ha definido
aquí) se expresan primero en forma de las proteínas precursoras
A695 y/o A751. Las proteínas precursoras se pueden someter a la
acción de una enzima proteasa lo que permite la formación de
proteínas núcleo \beta-amiloides, que, cuando se
producen en cantidades suficientes, permiten la formación de placas
asociadas con la enfermedad de Alzheimer.
En relación con la presente invención las
secuencias de nucleótidos que codifican la producción de proteínas
precursoras \beta-amiloides y proteínas núcleo
\beta-amiloides específicas están conectadas a
secuencias promotoras específicas. Las secuencias promotoras se
eligen cuidadosamente de manera que algunas secuencias expresen la
secuencia de nucleótidos a la que están ancladas en todos los tipos
de tejidos mientras que otras secuencias promotoras sólo expresan
el nucleótido al que están ancladas cuando el promotor está
presente en tipos específicos de células de un tipo específico de
tejido v.g., tejido nervioso. Produciendo semejante ratón
transgénico, se puede obtener información adicional con respecto a
donde y cuándo se producen (y a veces se degradan) y depositan las
proteínas núcleo \beta-amiloides en un cerebro
con enfermedad de Alzheimer. Utilizando esta información adicional
referente al mecanismo y la localización de la producción (y
posible degradación) y depósito de proteínas núcleo
\beta-amiloides, se pueden probar más eficazmente
agentes terapéuticos con respecto a su capacidad para prevenir la
producción y/o el depósito de tales proteínas y aliviar o prevenir
de este modo la enfermedad de Alzheimer.
Los mamíferos transgénicos de esta invención
proporcionan modelos útiles para estudiar las relaciones in
vivo de las proteínas entre sí y con otros compuestos que se
van a someter a ensayo en cuanto a su utilidad para tratar la
enfermedad de Alzheimer.
Un objeto primordial de esta invención es
proporcionar un mamífero transgénico no humano cuyas células
incluyan una secuencia de ADN recombinante que codifique la
expresión específica del tipo celular de proteínas
\beta-amiloides cuyos mamíferos se pueden utilizar
para el estudio de la etiología de la enfermedad de Alzheimer y de
la eficacia de los fármacos en el tratamiento de la enfermedad.
Una ventaja de la presente invención es que
proporciona un medio in vivo para estudiar los efectos de la
expresión de diferentes proteínas en diferentes tejidos (v.g.,
tejido nervioso incluyendo los tipos específicos de tejidos
nerviosos y tejido no nervioso) con relación a la síntesis de
proteína \beta-amiloide y la formación de placas
asociadas con la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención proporciona un mamífero
transgénico no humano cuyas células contienen la secuencia de ADN
recombinante o sintético clonado cuya secuencia comprende:
una secuencia promotora específica de tejido
nervioso que es un promotor de la enolasa específico neuronal; y
una secuencia codificadora que codifica la
proteína precursora \beta-amiloide A751 y donde
la secuencia promotora y la secuencia codificadora asociadas
operativamente entre sí, son incorporadas establemente en el genoma
del mamífero no humano y se expresan para formar depósitos de
proteína \beta-amiloide en el cerebro del mamífero
no humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
un método para producir un zigoto transformado genéticamente capaz
de desarrollarse en un mamífero transgénico no humano caracterizado
por tener una pluralidad de células que contienen una secuencia de
ADN recombinante o sintético clonada, comprendiendo la
secuencia:
una secuencia promotora específica de tejido
nervioso que es un promotor de la enolasa específico neuronal
asociado operablemente con una secuencia codificadora que codifica
la proteína precursora \beta-amiloide A751 cuyo
método comprende la etapa de:
introducir la secuencia promotora y la secuencia
codificadora en un pronúcleo de un zigoto de mamífero mediante
microinyección, siendo dicho zigoto susceptible de desarrollo en un
mamífero, obteniéndose de ese modo un zigoto transformado
genéticamente;
donde dichas secuencia promotora y secuencia
codificadora se seleccionan de manera que la secuencia codificadora
no está activada de tal manera y grado que evitaría el desarrollo
normal del embrión a término;
donde la proteína precursora
\beta-amiloide se expresa para formar depósitos
de proteína \beta-amiloide en el cerebro del
mamífero no humano.
Una característica de los mamíferos transgénicos
de la invención es que proporcionan medios prognósticos y
diagnósticos para el estudio de la enfermedad de Alzheimer y para
determinar la eficacia de las drogas farmacéuticas en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto de prueba.
Inicialmente, los ratones transgénicos se utilizan como patrones
para identificar uno o más compuestos cantidato capaces de
metabolizar la proteína \beta-amiloide (o evitar
su formación) que está asociada con una predisposición a la
enfermedad de Alzheimer.
Entre otros objetos, ventajas y características
de la presente invención se incluye proporcionar mamíferos no
humanos transgénicos que proporcionen información concerniente al
mecanismo y a la localización de la producción y disposición de la
proteína núcleo \beta-amiloide así como
proporcionen modelos in vivo para probar fármacos capaces de
interferir con o de evitar semejantes producción y/o
disposición.
Este y otros objetos, características y ventajas
de la invención se volverán más completamente evidentes cuando se
lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con
las figuras adjuntas.
La Figura 1, que incluye 1-1,
1-2, 1-3 y 1-4,
muestra la secuencia de bases de un clon de ADNc, denominado
\lambdaAPCP168i4, que codifica los aminoácidos
1-751 de la proteína precursora
\beta-amiloide. El inserto de 168 pb, que
distingue este clon de la secuencia de Kang. et al. está
subrayado.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
de A99.
La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos
de A42 que corresponde a la proteína núcleo
\beta-amiloide.
La Figura 4 muestra la estrategia de construcción
del promotor NSE conectado a A42 y A99.
La Figura 5 muestra la estrategia de construcción
del promotor NSE conectado a A695 y A751.
La Figura 6 muestra la estrategia de construcción
del promotor MT conectado a A42 y A99.
La Figura 7 muestra el esquema de construcción
para un vector de expresión en células de mamíferos para la
expresión de MT-A751 y MT-A695.
La Figura 8 incluye 8-1 y
8-2 y muestra la afinidad del péptido codificado por
el inserto \lambdaAPCP168i4 de 168 pb por una superfamilia de
proteínas, muchos de cuyosmiembros manifiestan actividad inhibidora
de las serina protea-
sas.
sas.
La Figura 9 muestra la secuencia promotora NSE y
un Esquema de Amplificación de la PCR para NSE.
La Figura 10 muestra un esquema de construcción
para un vector de expresión en células de mamífero para la
expresión/selección \beta-amiloide de constructos
núcleo \beta-amiloide.
La Figura 11A muestra un diagrama esquemático del
transgen NSE-A751.
La Figura 11B muestra una hibridación de Southern
de ADN recogido de ratones de tipo salvaje y transgénicos.
La Figura 12 (A, B, C y D) muestra la tinción con
inmunoperoxidasa de cerebro humano y de ratón.
La Figura 13 (A, B, C, D y E) son
fotomicrografías de depósitos imunorreactivos en cerebros de
NSE-A751.
Antes de describir los presentes ratones
transgénicos y los procedimientos para elaborar y utilizar
semejantes fármacos de ensayo, se debe entender que esta invención
no está limitada a los procedimientos y materiales concretos
descritos ya que tales métodos y materiales pueden por supuesto
variar. También se debe entender que la terminología utilizada aquí
tiene el propósito de describir sólo reivindicaciones concretas, y
no se pretende que sea limitante puesto que el alcance de la
presente invención únicamente estará limitado por las
reivindicaciones adjuntas.
Se debe observar que según se utilizan en esta
memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares
"un", "una", "el" o "la" incluyen los
referentes plurales a no ser que el contexto dicte claramente lo
contrario. Así, por ejemplo, en la referencia a "un clon" o
"una secuencia" se incluyen mezclas de clones o secuencias del
tipo descrito, en la referencia a "una proteína amiloide" se
incluyen la referencia a mezclas de semejantes proteínas del tipo
descrito, y en la referencia a "el ratón transgénico" se
incluyen diferentes especies de semejantes ratones etcétera.
Los términos "proteína núcleo" y "proteína
núcleo \beta-amiloide" significan una proteína
de 99 aminoácidos como se muestra en la Figura 2 y fragmentos de la
misma tales como la secuencia de 42 aminoácidos como se muestra en
la Figura 3. Semejantes proteínas son también referidas aquí como
A99 y A42. Masters, C.L., et al., Proc Natl Acad Sci
USA (1985) 82:4245-4249, referidos aquí
como "Masters et al." describen una proteína núcleo de
42 aminoácidos.
"A99" es un símbolo que representa los 99
aminoácidos C-terminales del precursor
\beta-amiloide y se considera una "proteína
núcleo".
"A42" hace referencia a una proteína núcleo
del precursor \beta-amiloide. El extremo N es el
extremo N del núcleo de 42 aminoácidos y contiene por consiguiente
el dominio del núcleo completo. Según se utiliza a lo largo de esta
aplicación, el término A42 corresponde a la secuencia núcleo de 42
aminoácidos de la proteína precursora
\beta-amiloide.
La "proteína relacionada
\beta-amiloide" se define aquí como: (1) una
proteína de 751 aminoácidos como se muestra en la Figura 1; (2) una
proteína de 695 aminoácidos como se muestra en la Figura 1 menos
los 57 aminoácidos subrayados; (3) la secuencia de 57 aminoácidos
subrayada en la Figura 1; y (4) análogos de cualquiera de (1)-(3) y
fragmentos de los mismos incluyendo, pero no limitados a, A99 y
A42. Como ejemplo, este término se utiliza para hacer referencia a
la proteína descrita por Kang, J. et al., Nature
(1987) 325:733-736, referida aquí como
"Kang, et al." que contiene la proteína núcleo
\beta-amiloide en su estructura en el aminoácido
597 de una proteína de 695 aminoácidos.
En la "proteína precursora
\beta-amiloide" se incluye un subgrupo de las
"proteínas relacionadas \beta-amiloides"
definidas antes. Semejantes proteínas precursoras fueron descritas
primero por "Kang et al." y son producidas naturalmente
en forma de proteínas precursoras más grandes de la "proteína
núcleo \beta-amiloide"; la secuencia de 751
aminoácidos es el ejemplo más notable de una proteína precursora
utilizada en relación con la invención.
El "péptido núcleo
\beta-amiloide inmunogénico" o el "péptido
\beta-amiloide relacionado inmunogénico" hace
referencia a péptidos cuyas secuencias de aminoácidos coinciden con
las de alguna región de la proteína núcleo
\beta-amiloide o de la proteína precursora
\beta-amiloide, y que son capaces de provocar una
respuesta con anticuerpos en un animal inmunizado. Los ejemplos de
tales proteínas son descritos con detalle por Kitaguchi et
al., Biochemical and Biophysical Research
Communications, Vol. 166, Núm. 3, Feb. 14, 1990.
La "predisposición genética a la enfermedad de
Alzheimer" hace referencia a una mutación genética o alteración
identificable encontrada en los genomas de individuos con la
enfermedad de Alzheimer, o aquellos individuos destinados a
desarrollar la enfermedad de Alzheimer, pero no en individuos
normales (sin enfermedad).
"A4i" según se utiliza aquí hace referencia
a la secuencia de 57 aminoácidos subrayada en la Figura 1.
"A4i" puede ser un polipéptido correspondiente al inhibidor de
la serina proteasa novedoso codificado por el polinucleótico
derivado del bacteriofago \lambdaAPCP168i4. El polipéptido A4i no
está necesariamente derivado físicamente del producto de expresión
de este bacteriófago, pero puede ser generado de cualquier manera,
incluyendo síntesis peptídica, técnicas de ADN recombinante o
combinaciones de las mismas. "Correspondiente" significa
homóloga o sustancialmente equivalente a la secuencia
designada.
El "material genético" es un material que
contiene una o varias secuencias de ADN cualesquiera ya sea
purificadas o en estado nativo tal como un fragmento de un
cromosoma o un cromosoma completo, ya sean secuencias de ADN de
origen natural o preparadas sintéticamente o parcialmente
sintéticamente, secuencias de ADN que constituyen uno o varios
genes y quimeras génicas, v.g., creadas ligando diferentes
secuencias de ADN. En el material genético no se incluyen las
secuencias de ADN incorporadas a o portadas por un plásmido, un
virus o un fago.
El "material genético exógeno" es un
material genético no obtenido de o que no forma naturalmente parte
de las células germinales específicas o gametos que forman el
zigoto concreto que está siendo transformado genéticamente.
La "secuencia de ADN" es una secuencia
lineal que consta de cualquier combinación de los cuatro monómeros
del ADN, es decir, los nucleótidos de adenina, guanina, citosina y
timina, que codifica la información genética, tal como un código
para un aminoácido, un promotor, un control o un producto génico.
Una secuencia de ADN específica es la que tiene una función
específica conocida, v.g., codifica un polipéptido concreto, un
rasgo genético concreto o afecta a la expresión de un fenotipo
concreto.
Un "gen" es la unidad independientemente
funcional, más pequeña de material genético que codifica un
producto proteico o controla o afecta a la transcripción y
comprende al menos una secuencia de ADN.
El "genotipo" es la constitución genética de
un organismo.
El "fenotipo" es una colección de rasgos
morfológicos, fisiológicos y bioquímicos poseídos por una célula u
organismo que resulta de la interacción del genotipo y el medio
ambiente.
La "expresión fenotípica" es la expresión
del código de una o varias secuencias de ADN que ocasiona la
formación de un producto, v.g., un polipéptido o una proteína, o
altera la expresión del fenotipo natural de los zigotos o de los
organismos.
El "zigoto" es una célula diploide que tiene
el potencial para el desarrollo de un organismo completo. El
zigoto puede producirse por partenogénesis, transplante nuclear, la
fusión de dos gametos mediante fertilización natural o artificial o
cualquier otro método que cree una célula diploide que tenga el
potencial para desarrollarse en un organismo completo. El origen
del zigoto puede ser a partir de cualquier reino animal o
vegetal.
La "partenogénesis" es cualquier técnica que
permite el desarrollo de un gameto femenino o masculino en una
célula y su desarrollo en un organismo, cuya técnica es diferente
del desarrollo natural de gametos femeninos y masculinos.
Con el fin de exponer y describir esta invención
de una manera organizada, se describen los aspectos particulares
de la invención en diferentes secciones. La definición de términos
se ha dado antes en la Sección 5.1.
En la siguiente Sección 5.3. se describen las
diferentes secuencias de ADN que expresan diferentes proteínas,
proteínas precursoras e inhibidores, así como secuencias promotoras
que se fusionan con estas secuencias con el fin de obtener la
expresión de la proteína en tejidos concretos. Estas secuencias se
describen en parte mediante depósitos biológicos realizados en
relación con esta descripción y mediante la referencia a las
figuras adjuntas.
En la sección 5.4. de la exposición se describen
los protocolos mediante los cuales fue posible confirmar que la
secuencia descrita en la sección 5.3 podría ser expresada para
producir proteínas.
En la sección 5.5. se describen ocho diferentes
constructos de promotor/secuencia A4 y, con referencia a las
Figuras 4-7, se describe la síntesis de los
constructos.
En la sección 5.6. se describen los métodos para
producir el ratón transgénico de la invención utilizando las
secuencias de ADN, los constructos y otra información descrita en
las secciones anteriores.
Los diferentes métodos y materiales utilizados en
relación con los diferentes aspectos de la invención se describen
en la Sección 5.7.
Siguen los Ejemplos Detallados, las
Reivindicaciones y el Resumen.
Con el fin de describir el ratón transgénico de
la presente invención, es necesario describir algunas secuencias
de ADN. Por ejemplo, es importante describir la secuencia de ADN
que codifica la proteína precursora
\beta-amiloide que comprende la secuencia de
nucleótidos y la correspondiente, la secuencia de aminoácidos
deducida mostrada en la Figura 1. Esta secuencia de ADN codifica
una proteína de aproximadamente 82.610 dalton que contiene la
proteína núcleo \beta-amiloide relacionada.
Como primera etapa para producir el ratón
transgénico de la presente invención, la secuencia de ADNc de la
proteína \beta-amiloide, mostrada en la Figura 1,
puede ser obtenida de cualquier manera conocida por los expertos en
la técnica. Un método para obtener A751 es aislándola del
bacteriófago que contiene el clon de ADNc \lambdaAPCP168i4. Este
clon de ADNc de fibroblasto humano conocido como \lambdaAPCP168i4
fue consignado en la ATCC el 1 de Julio, de 1987 y tiene el Núm. de
acceso 40347.
El inserto de 168 pares de bases (subrayado en la
Figura 1) interrumpe el codón para Val_{289} de la secuencia de
Kang et al., produciendo la pérdida de este aminoácido de la
proteína \lambdaAPCP168i4. El inserto de 168 pares de bases,
junto con los tres pares de bases ganados a partir del codón
Val_{289} interrumpido, codifican 57 nuevos aminoácidos, que
están subrayados en la Figura 1. Aguas abajo de esta inserción, en
el codón 653 de la Figura 1, se ubica el aspartato
amino-terminal de la proteína núcleo
\beta-amiloide descrita por Masters et
al.
Una característica única de los ratones
transgénicos de la presente invención tiene que ver con la
inclusión de promotores específicos celulares al frente de la
secuencia que codifica A751.
La capacidad de los ratones transgénicos para
expresar selectivamente estos péptidos concretos (en tipos
específicos de células), incluyendo cualquier fragmento de los
mismos, distingue los presentes ratones transgénicos de otros.
Las secuencias de ADN recombinante y/o sintético
clonadas se utilizan a propósito de la presente invención. Entre
las secuencias concretas que son codificadas para la producción de
una proteína replegada, biológicamente activa se incluyen:
| Nombre A4 | Descripción | Secuencia en la Fig. |
| A42 | dominio del núcleo \beta-amiloide | 3 |
| A99 | cola carboxi \beta-amiloide | 2 |
| A695 | proteína precursora \beta-amiloide | 1 |
| A751 | precursor más inhibidor | 1 |
| A4i | inhibidor de la proteasa | 1 |
A4i está subrayado en la Figura 1 y los ratones
que incorporan una secuencia que expresa A4i generalmente o en
células específicas son parte de la presente invención (esto es, a
pesar de los promotores específicos celulares) puesto que la
proteína A4i puede por sí misma ser un compuesto valioso para
prevenir o reducir los efectos de la enfermedad de Alzheimer. Los
animales transgénicos que contienen las secuencias que expresan
A4i no eran conocidos hasta ahora.
Los clones de ADNc que incluyen las secuencias
codificadoras pueden ser expresados para obtener una cualquiera de
A42, A99, A695, A751 y A4i. Las secuencias se insertan primero en un
vector de expresión adecuado para la replicación y para confirmar
la producción de proteína.
Brevemente, se construyó un vector de expresión
en E. coli denominado pAPCP118-3 para la
expresión de una proteína de fusión que constaba de 655 a 751
restos aminoácido mostrada en la Figura 1. La construcción de
pAPCP118-3 se completó ensamblando los tres
fragmentos siguientes: (1) una cadena principal plasmídica (que
constaba de las funciones de replicación de pBR322, un gen de
resistencia a la ampicilina, el promotor del triptófano y un
operador, un sitio de unión al ribosoma, un ADN que codifica los
siete codones amino terminales del gen estructural de la
\beta-galactosidasa seguido de seis restos
treonina, y señales para la terminación de la transcripción); (2)
un fragmento EcoRI-HaeII que codifica los restos
aminoácido 655-728 de la secuencia de la Figura 1; y
(3) un fragmento sintético que codifica los restos aminoácido
729-751 de la secuencia de la Figura 1, seguido de
un codón de terminación.
El vector resultante se utilizó para transformar
E. coli W3110 y se indujo la expresión de la proteína de
fusión reduciendo la concentración de triptófano seguido de la
adición de ácido
3-\beta-indolacrílico. La proteína
resultante puede ser purificada utilizando técnicas de
purificación convencionales y el material purificado resultante es
asequible para el uso en la producción de anticuerpos para análisis
de diagnóstico.
La secuencia codificadora completa de la proteína
precursora \beta-amiloide mostrada en la Figura 1
fue subclonada en dos fragmentos del clon \lambdaAPCP168i4
consignado y preparada para la inserción en vectores de expresión
de virus vaccinia pSC11 o pUV1. Brevemente, un fragmento EcoRI de
1,06 kilobases (kb), que abarca los restos aminoácido
655-751 de la proteína ilustrada en la Figura 1,
fue clonado en el plásmido digerido con EcoRI
pGEM-3® (asequible de Promega Biotec) para crear un
vector intermedio denominado p4BI. Con posterioridad p4BI fue
digerido con HindIII para eliminar la mayor parte de la secuencia
no codificadora 3' de la secuencia relacionada
\beta-amiloide. El vector resultante p4WRI fue
digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa alcalina de intestino de
ternera antes de la ligadura con el fragmento EcoRI de 2088 pb
derivado de \lambdaAPCP168i4 para formar p4T4B. Este plásmido fue
digerido con SmaI y XmnI para generar un fragmento de 2678 pb que
abarcaba la proteína completa que codifica la secuencia mostrada en
la Figura 1.
El gen que codifica este fragmento
SmaI-XmnI fue insertado en uno de los dos vectores
virales vaccinia bien conocidos, pSC11 y pUV1, para la posterior
expresión de la proteína precursora
\beta-amiloide en células de riñón de mono
CV-1 utilizando un sistema de expresión transitoria
eucariótico como describen Cochran, M.A., et al., Proc
Natl Acad Sci USA (1985) 82:19-23. Más
comúnmente, estos vectores se utilizan para la producción de
proteínas y anticuerpos in vivo en animales después de que
sus secuencias han sido insertadas en el genoma del virus
vaccinina.
De un modo similar, se pueden utilizar vectores
de mamíferos para la expresión de la proteína núcleo
\beta-amiloide o de las proteínas precursoras
\beta-amiloides descritas aquí. Un vector de
mamífero útil que utiliza la \beta-actina humana
como promotor se muestra en la Figura 10. Los detalles con respecto
a la descripción del vector mostrado en la Figura 10 son los
siguientes:
Los pares de bases 1-4.300 son el
fragmento EcoRI-AluI de 4,3 kb del producto aislado
del gen de la \beta-actina humana
p14T\beta-17 (Leavitt et al., Mol. Cell.
Biol. (1984) 4:1961-1969).
Para los detalles de la secuenciación del
promotor, ver Ng et al., Mol. Cell. Biol. (1985)
5:2720-2732. Se indican el sitio de la
protección terminal, la región no traducida 5' y las posiciones IVS
1. No hay un codón ATG presente en 5'UT ni en la región
poliligadora del sitio de empalme 3' respecto del sitio BamHI.
Los pares de bases 4.300-4.320
están derivados en parte del poliligador pSP64 (Melton et
al., Nucl. Acids Res. (1984)
12:7035-7056).
Los pares de bases 4.320-6.600
están derivados de pcDV (Okavama & Berg, Mol. Cell.
Biol. (1983) 3:280-289) y contiene el
gen Amp^{R} y el origen bacteriano de pBR322 más la señal de
poliadenilación tardía de SV40.
Los pares de bases 6.600-10.000
son el fragmento PvuII-EcoRI de
pSV2-neo (Southern-Berg, J. Mol.
App. Genet. (1982) 1:327-341)
conteniendo el gen neo bacteriano conectado al promotor ori más el
temprano de SV40. La dirección de la transcripción es la indicada.
El vector puede ser utilizado para la eficiente expresión de la
proteína en células CHO.
Un ejemplo de otro vector potencialmente útil es
el plásmido phGH-SV (10) (un plásmido descrito en
EPA 217.822, publicada el 15 de Abril de 1.987, e incorporada aquí
como referencia) que contiene una cadena principal plasmídica pUC8,
elementos promotores y reguladores del gen hMT-IIa,
el promotor de ADN de SV-40 y elementos
intensificadores, y las porciones codificadoras del gen hGH y
secuencias reguladoras 3'. Este plásmido puede ser digerido con
BamHI y SmaI y tratado con ligadores BamHI para suprimir la
secuencia que codifica la proteína de la hormona del crecimiento
humana y dejando las secuencias no codificadoras 3' y los elementos
reguladores anclados a la cadena principal plasmídica. Esta porción
de ADN de aproximadamente 5.100 pares de bases es purificada en gel
y ligada a conectores BamHI.
La digestión con BamHI, la repurificación del
fragmento de ADN y la posterior ligadura producen un plásmido
denominado pMTSV40 poliA Bam que contiene los elementos
estructurales y reguladores que componen un vector de expresión en
células de mamífero. Tras la digestión con BamHI de pMTSV40 poliA
BamHI y la reparación en presencia de ADN polimerasa I y los cuatro
dNTP, este vector está disponible para la inserción del fragmento
de restricción SmaI-XmnI de \sim2.678 pb del
plásmido p4T4B. El vector puede ser utilizado después para la
expresión eficiente de la proteína en células CHO.
Se prepararon ocho diferentes constructos de
fusión fusionando uno o dos promotores diferentes a secuencias de
ADN diferentes que codifican las proteínas precursoras
\beta-amiloides. Las secuencias promotoras
utilizadas fueron la de la metalotioneína-I (MT) de
ratón y la de la enolasa específica neural de rata (NSE). Estos
promotores u otros promotores útiles conocidos por los expertos en
la técnica pueden ser conectados a diferentes secuencias A4 del
tipo descrito antes.
Aunque no se desea estar ligado a ninguna teoría
concreta referente a la patología de la enfermedad de Alzheimer, se
postula que la razón de la cantidad de A751 respecto a la cantidad
de los precursores A695 que son únicos para el sistema nervioso
central puede estar en un estado de desequilibrio, ocasionando la
patología del Alzheimer. Este desequilibrio (resultante de la
sobre- o sub-expresión de un precursor) podría
crear las condiciones para que el amiloide se forme en abundancia y
cree las placas. Basándose en esta teoría, los constructos fueron
diseñados para expresar cualquiera de los precursores de la
proteína \beta-amiloide A751 o A695.
Alternativamente, la patología del Alzheimer
puede resultar del catabolismo inadecuado o incompleto de la cola
carboxilada de la proteína precursora
\beta-amiloide (secuencias A99) que se libera
cuando A695 y A751 se transforman en proteínas extracelulares
solubles (ver Weidemann, A., et al., Cell. (1989)
57:115-126). Basándose en esta teoría, los
constructos fueron diseñados para expresar la cola carboxilada
(A99) o la proteína núcleo \beta-amiloide
(A-42). Todos los constructos fueron diseñados para
permitir la expresión del constructo ya sea específica de los
tejidos neurales (NSE) o expresada ubícuamente en todos los tipos
de tejidos (promotores MT).
Los siguientes constructos de fusión son ejemplos
de constructos:
| Promotor | Secuencia A4 | Figura |
| NSE | dominio núcleo A42 | 4 |
| NSE | cola carboxilada A99 | 4 |
| NSE | A751 | 5 |
| NSE | A695 | 5 |
| NSE | A4i | |
| MT | A751 | 6 |
| MT | A695 | 6 |
| MT | dominio núcleo A42 | 7 |
| MT | cola carboxilada A99 | 7 |
| MT | A4i |
Como se ha indicado antes, las Figuras
4-7 y 10 detallan las estrategias de clonación
utilizadas para producir los diferentes constructos de fusión. Se
debe observar que los plásmidos de la
\beta-actina A42 y de la
\beta-actina A-99 sirven como
fuente para las secuencias A42 y A99, respectivamente, para las
construcciones. Se mantuvo la fidelidad de codificación completa en
los constructos A42 y A99; cada uno estuvo seguido simplemente por
un codón de iniciación de metionina.
Los vectores de la \beta-actina
A751 y de la \beta-actina A695 se utilizaron para
preparar los otros constructos de los promotores NSE. Todas las
construcciones plasmídicas fueron confirmadas mediante análisis de
mapeo de restricción. Todos los constructos fueron confirmados
definitivamente mediante análisis de la secuencia de ADN de las
uniones de clonación.
El promotor MT-I utilizado para
los constructos de fusión fue derivado utilizando oligonucleótidos
sintéticos. El promotor MT-1 es secuenciado y
descrito con detalle por Swanson, L.W. et al., Novel
Developmental Specificity in the Nervous Systems of Transgenic
Animals Expressing Growth Hormone Fusion Genes, Nature
(1985) 317:363-366, incorporada aquí como
referencia para describir el promotor MT-I. La
región promotora MT-I abarca 373 pares de bases y
puede ser construida mediante síntesis y ligadura de oligómeros de
ADN. Se utilizan cinco pares de oligómeros de 70-80
nucleótidos de longitud. El fragmento de 373 pares de bases
resultante puede ser clonado y secuenciado. El promotor
MT-I puede ser también aislado amplificando
selectivamente esta región del genoma de ratón utilizando el método
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fragmento
amplificado puede ser clonado y caracterizado mediante análisis de
la secuencia de ADN.
El promotor MT-I es secuenciado y
descrito con detalle por Swanson, L.W. et al., Novel
Developmental Specificity in the Nervous Systems of Transgenic
Animals Expressing Growth Hormone Fusion Genes, Nature (1985)
317:363-366, incorporada aquí como
referencia para describir el promotor MT-I.
También se pueden utilizar dos enfoques
diferentes para aislar el promotor de la enolasa específico de
neurona de rata (NSE). La secuencia de nucleótidos de la región
promotora ha sido publicada. Por consiguiente, es posible diseñar
oligonucleótidos sintéticos para el uso en la PCR y para rastrear
bancos genómicos. Se utilizaron cebadores oligonucleotídicos para
amplificar selectivamente la región de interés utilizando la PCR y
ADN genómico de rata. Se aisló y clonó un fragmento de 1,15
kilopares de bases. El mismo oligonucleótido ha sido empleado como
sonda para rastrear bancos genómicos de rata.
Se demostró la funcionalidad del promotor
MT-I evaluando la expresión transitoria de un
constructo que portaba el gen informador CAT (esto es, el gen
informador de la cloramfenicol acetiltransferasa), tras la
transfección del ADN a células CHO.
También se puede aislar el promotor NSE a partir
de un clon genómico purificado de una genoteca de rata búfalo
utilizando sondas oligonucleotídicas diseñadas a partir de la
secuencia publicada del promotor (Sakimura et al.,
Gene (1987) 60:103-113) que se
incorpora aquí como referencia para describir semejante
promotor.
Se preparó un fragmento de la región promotora de
2,3 kilobases incluyendo un intrón de 1,2 kilobases en la región
5' no traducida a partir de un clon de 11 kb utilizando la reacción
de amplificación del gen de la polimerasa. La estrategia para la
PCR y los cebadores oligonucleotídicos utilizados se describen en
la Figura 9. El cebador 3'-terminal para el
fragmento promotor NSE más las sustituciones de 2 nucleótidos
albergadas en el intrón crean un sitio NcoI con fines de clonación,
así como introduce el codón de iniciación de la metionina para las
secuencias A4. Se indica que la amplificación de la reacción en
cadena de la polimerasa es referida por tener una baja tasa de
error.
Todos los organismos transgénicos de la invención
incluyen en una pluralidad de sus células una secuencia de ADN
recombinante o sintética que se cree que tiene que ver con la
patogénesis de la Enfermedad de Alzheimer. Más específicamente, los
organismos transgénicos contienen secuencias específicas de
material genético exógeno, tales como las secuencias descritas
antes con detalle que contienen una secuencia promotora específica
del tejido y una secuencia que codifica para la producción de una
proteína precursora \beta-amiloide. Puesto que es
posible producir los organismos transgénicos de la invención
utilizando una o más de las secuencias antes descritas, se dará una
descripción general de la producción de los organismos transgénicos
remitiéndose generalmente al material genético exógeno. Esta
descripción general puede ser adaptada por los expertos en la
técnica con el fin de incorporar las secuencias de ADN específicas
antes descritas a los organismos y obtener la expresión de esas
secuencias utilizando los métodos y materiales descritos más abajo.
Para más detalles concernientes a la producción de organismos
transgénicos, y específicamente ratones transgénicos, remitirse a
la Patente de los Estados Unidos 4.873.191, expedida el 10 de
Octubre de 1.989 (incorporada aquí como referencia para describir
los métodos para producir ratones transgénicos), y a las numerosas
publicaciones científicas referidas y citadas allí.
El material genético exógeno puede ser colocado
en pronúcleos masculino o femenino del zigoto. Más
preferiblemente, se coloca en el pronúcleo masculino tan pronto
como sea posible una vez que el espermatozoo entra en el huevo. En
otras palabras, justo después de la formación del pronúcleo
masculino cuando los pronúcleos están claramente definidos y están
bien separados, estando localizado cada uno próximo a la membrana
del zigoto. El pronúcleo masculino de un huevo de ratón fertilizado
es el lugar prerido para la adición del material genético exógeno
de la presente invención.
Se prefiere sumamente añadir el material genético
exógeno al complemento del ADN masculino del zigoto antes de que
sea transformado por el núcleo del huevo o el pronúcleo femenino del
zigoto. Se cree que el núcleo del huevo o el pronúcleo femenino
libera moléculas que afectan al complemento de ADN masculino,
quizás remplazando las protaminas del ADN masculino por histonas,
facilitando de ese modo la combinación de los complementos de ADN
femenino y masculino para formar el zigoto diploide.
De este modo, se prefiere añadir el material
genético exógeno al complemento masculino de ADN o cualquier otro
complemento de ADN antes de resultar afectado por el pronúcleo
femenino. Por ejemplo, el material genético exógeno se añade al
pronúcleo masculino temprano, tan pronto como sea posible tras la
formación del pronúcleo masculino, que es cuando los pronúcleos
masculino y femenino están bien separados y están localizados ambos
próximos a la membrana celular. Alternativamente, el material
genético exógeno podría ser añadido al núcleo del espermatozoo una
vez que ha sido inducido a experimentar descondensación. El
espermatozoo que contiene el material genético exógeno podría ser
añadido después al huevo o el espermatozoo descondensado podría ser
añadido al huevo añadiendo el material genético exógeno tan pronto
como fuera posible después de eso.
Para los fines de esta invención un zigoto es
esencialmente la formación de una célula diploide que es suceptible
de desarrollar un organismo completo. Generalmente, el zigoto
constará de un huevo que contiene un núcleo formado, ya sea
naturalmente o artificialmente, mediante la fusión de dos núcleos
haploides a partir de uno o varios gametos. Así, los núcleos del
gameto deben ser aquellos que sean naturalmente compatibles, esto
es, aquellos que produzcan un zigoto viable susceptible de
experimentar diferenciación y desarrollo hasta un organismo
funcional. Generalmente, se prefiere un zigoto euploide. Si se
obtiene un zigoto aneuploide, el número de cromosomas no deberá
variar en más de uno con respecto al número euploide del organismo
que haya originado cualquier gameto.
Además de consideraciones biológicas similares,
las físicas también gobiernan la cantidad de material genético
exógeno que puede ser añadido al núcleo del zigoto o al material
genético que forma parte del núcleo del zigoto. Si no se elimina
material genético, la cantidad de material genético exógeno que se
va a añadir está limitada por la cantidad que puede ser absorbida
sin ser físicamente disrruptiva. Generalmente, el volumen de
material genético exógeno insertado no excederá de aproximadamente
10 picolitros. Los efectos físicos de la adición no deben ser tan
importantes como para destruir físicamente la viabilidad del
zigoto. El límite biológico del número y de la variedad de
secuencias de ADN variará dependiendo del zigoto concreto y de las
funciones del material genético exógeno y resultarán rápidamente
evidentes para los expertos en la técnica, puesto que el material
genético, incluyendo el material genético exógeno, del zigoto
resultante debe ser susceptible biológicamente de iniciar y
mantener la diferenciación y el desarrollo del zigoto en un
organismo funcional.
El número de copias de las secuencias de ADN que
se añaden al zigoto depende de la cantidad total de material
genético exógeno añadido y será la cantidad que permita que la
transformación genética se produzca. Teóricamente sólo se requiere
una copia; no obstante, generalmente, se utilizan numerosas copias,
por ejemplo, de 1.000 a 20.000 copias de un gen, con el fin de
asegurar que una copia sea funcional. Por lo que se refiere a la
presente invención, existe generalmente la ventaja de tener más de
una copia que funcione de cada una de las secuencias de ADN exógeno
insertadas para intensificar la expresión genotípica de las
secuencias de ADN exógeno (esto es, para obtener la expresión
ubícua de las proteínas precursoras
\beta-amiloides relacionadas y las proteínas del
inhibidor de la proteasa).
Se puede utilizar cualquier técnica que permita
la adición del material genético exógeno al material genético
nucleico con tal que no sea destructivo para la célula, la membrana
nuclear u otras estructuras celulares o genéticas existentes. El
material genético exógeno se inserta preferentemente en el material
genético nucleico mediante microinyección. La microinyección de
células y estructuras celulares es conocida y utilizada en la
técnica.
Los mamíferos transgénicos producidos según la
presente invención incluirán material genético exógeno. El material
genético exógeno será una secuencia de ADN que ocasione la
producción de la proteína precursora
\beta-amiloide A751. Adicionalmente, la secuencia
se anclará a un promotor de enolasa específico neuronal que permita
la expresión de la proteína relacionada
\beta-amiloide específicamente en tejido
nervioso.
La mayoría de las técnicas que se utilizan para
transformar células, construir vectores, extraer ARN mensajero,
preparar ADNc, y similares son practicadas ampliamente en la
técnica, y la mayoría de los practicantes están familiarizados con
los materiales recurso normalizados así como con las condiciones y
los procedimientos específicos. No obstante, por conveniencia, los
siguientes párrafos pueden servir como pauta.
Se pueden utilizar sistemas tanto procarióticos
como eucarióticos para expresar el núcleo
\beta-amiloide y las secuencias
\beta-amiloides relacionadas; los huéspedes
procarióticos son, por supuesto, los más convenientes para los
procedimientos de clonación. Los procariotas están representados
muy frecuentemente por diversas cepas de E. coli; no
obstante, también se pueden utilizar otras cepas microbianas. Las
cepas de E. coli pueden secretar el núcleo
\beta-amiloide y las proteínas precursoras
\beta-amiloides al periplasma cuando los genes que
codifican estas proteínas están fusionados con los péptidos señal
apropiados, y ciertas cepas de E. coli, por ejemplo, una
cepa mutante de lipoproteína tal como JE5505 (Kanamari, T.
Gene (1988) 66:295-300), excretará las
proteínas quiméricas directamente al medio de cultivo.
Se utilizan vectores plasmidicos que contienen
sitios de replicación, marcadores seleccionables y secuencias de
control derivadas de una especie compatible con el huésped; por
ejemplo, E. coli es típicamente transformada utilizando
derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E.
coli por Bolivar, et al., Gene (1977)
2:95. pBR322 contiene los genes para la resistencia a la
ampicilina y la tetraciclina, y así proporciona marcadores
seleccionables múltiples que pueden ser retenidos o destruidos al
construir el vector deseado. Entre las secuencias de control
procarióticas utilizadas comúnmente que se definen aquí por incluir
promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente
con un operador, junto con las secuencias del sitio de unión al
ribosoma, se incluyen promotores utilizados comúnmente tales como
los sistemas promotores de la \beta-lactamasa
(penicilinasa) y de la lactosa (lac) (Chang., et al.,
Nature (1977) 198:1056) y el sistema promotor del
triptófano (trp) (Goeddel, et al. Nucleic Acid Res
(1980) 8:4057) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el
sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake, et al.,
Nature (1981) 292:128).
Entre otras secuencias de control procarióticas
se incluyen las secuencias señal con secreción directa de una
proteína al periplasma. Entre los péptidos señal bacterianos
comúnmente utilizados se incluyen los péptidos señal ompA (Kikuchi,
et al., Nucleic Acid Res (1981)
9:5671-5678) y phoA (Beck y Bremer,
Nucleic Acid Res (1980) 8:3011-3024)
que se pueden fusionar con la secuencia del inhibidor de la
proteasa de la invención.
Además de las bacterias, también se pueden
utilizar como huéspedes microbios eucarióticos, tales como
lavaduras. Las cepas de laboratorio de Saccharomyces
cerevisiae, la levadura panadera, son muy utilizadas aunque son
comúnmente asequibles otras diversas cepas o especies. Se pueden
utilizar vectores en los que se emplean, por ejemplo, el origen de
replicación de 2 m de Broach. J.R., Meth Enz (1983)
101:307, u otros orígenes de replicación compatibles de
lavaduras (ver, por ejemplo, Stinchcomb, et al.,
Nature (1979) 282:39, Tschumper, G., et al.,
Gene (1980) 10:157 y Clarke, L., et al.,
Meth Enz (1983) 101:300). En las secuencias de
control para los vectores de levaduras se incluyen promotores para
la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess, et al., J Adv
Enzyme Reg (1968) 7:149; Holland, et al.,
Biochemistry (1978) 17:4900). Entre los promotores adicionales
conocidos en la técnica se incluye el promotor para la
3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman, et al.,
J Biol Chem (1980) 255:2073). Otros promotores, que
tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las
condiciones de crecimiento y/o los antecedentes genéticos son las
regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el
isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradativas
asociadas con el metabolismo del nitrógeno, el sistema del factor
alfa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y
galactosa. También se cree que son deseables secuencias de
terminación en el extremo 3' de las secuencias codificadoras. Tales
terminadores se encuentran en la región no traducida 3' siguiente a
las secuencias codificadoras en los genes derivados de
levaduras.
También es posible, por supuesto, expresar genes
que codifican polipeptidos en cultivos de células huésped
eucarióticas derivadas de organismos multicelulares. Ver, por
ejemplo, Axel, et al., Patente de los Estados Unidos Núm.
4.399.216. Estos sistemas tienen la ventaja adicional de la
capacidad para empalmar intrones y de este modo pueden ser
utilizados directamente para expresar fragmentos genómicos. Entre
las líneas de células huésped útiles se incluyen células VERO y
HeLa, y células de ovario de hámster Chino (CHO). En los vectores
de expresión para tales células se incluyen promotores y secuencias
de control compatibles con células de mamífero tales como, por
ejemplo, los promotores temprano y tardío de Virus de Simio 40 (SV
40) (Fiers, et al., Nature (1978) 273:113),
comúnmente utilizados, u otros promotores virales tales como los
derivados de virus del polioma, adenovirus 2, virus del papiloma
bovino, o virus del sarcoma aviar. También se puede utilizar el
promotor controlable, hMTII (Karin, M., et al.,
Nature (1982) 299:797-802). Los
aspectos generales de las transformaciones de los sistemas huésped
de células de mamífero han sido descritos por Axel (supra).
También parece ahora, que las regiones "intensificadoras" son
importantes para optimizar la expresión; estas son, generalmente,
secuencias encontradas aguas arriba y aguas abajo de la región
promotora en las regiones de ADN no codificadoras. Se pueden
obtener orígenes de replicación, si se necesitaran, de fuentes
virales. No obstante, la integración en el cromosoma es un
mecanismo común para la replicación de ADN en eucariotas.
Dependiendo de la célula huésped utilizada, la
transformación se realiza utilizando técnicas normalizadas
apropiadas para tales células. Se puede utilizar el tratamiento con
calcio empleando cloruro de calcio, descrito por Cohen, S.N.,
Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69:2110, o el método
con RbCl_{2} descrito por Maniatis, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press,
pág. 254 y Hanahan, D., J Mol Biol (1983)
166:557-580 para procariotas u otras células
que contengan barreras de pared celular sustanciales. Para las
células de mamífero sin semejantes paredes celulares, se puede
utilizar el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham
y van der Eb, Virology (1978) 52:546, opcionalmente
según lo modificó Wigler, M., et al., Cell (1979)
16:777-785. Se pueden llevar a cabo
transformaciones en levaduras según el método de Beggs, J.D.,
Nature (1978) 275:104-109 o de
Hinnen, A., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1978)
75:1929.
En la construcción de vectores adecuados que
contienen las secuencias codificadoras y de control deseadas se
emplean técnicas de ligadura y restricción normalizadas que son bien
conocidas en la técnica. Los plásmidos aislados, las secuencias de
ADN, o los oligonucleótidos sintéticos se escinden, confeccionan, y
se vuelven a ligar de la forma deseada.
Las secuencias de ADN que forman los vectores son
asequibles de diversas fuentes. Los vectores de la estructura
principal y los sistemas de control se encuentran generalmente en
vectores "huésped" asequibles que se emplean para el grueso de
las secuencias en construcción. Para la secuencia codificadora
pertinente, la construcción inicial puede ser, y usualmente es,
cuestión de recuperar las secuencias apropiadas de las genotecas de
ADNc o genómico. No obstante, una vez que se ha descrito la
secuencia es posible sintetizar la secuencia génica completa in
vivo partiendo de los derivados nucleotídicos individuales. La
secuencia génica completa para los genes de longitud clasificable
por tamaño, v.g., 500-1.000 pb se puede preparar
sintetizando oligonucleóticos complemetarios solapantes individuales
y rellenando porciones no solapantes de hebra sencilla utilizando
ADN polimerasa en presencia de desoxirribonucleótidos trifosfato.
Este enfoque ha sido utilizado con éxito en la construcción de
varios genes de secuencia conocida. Ver, por ejemplo, Edge, M.D.,
Nature (1981) 292:756; Nambair, K.P., et al.,
Sience (1984) 223:1299; Jay, Ernest, J Biol
Chem (1984) 259:6311.
Los oligonucleótidos sintéticos se preparan o
bien mediante el método del fosfotriéster descrito por Edge, et
al., Nature (supra) y Duckworth, et al.,
Nucleic Acid Res (1981) 9:1691 o el método de la
fosforamidita descrito por Becauge, S.L., y Caruthers, M.H., Tet
Lett (1981) 22:1859 y Matteucci, M.D., y Caruthers, M.H.,
J Am Chem Soc (1981) 103:3185 y se pueden preparar
utilizando sintetizadores oligonucleotídicos automatizados
asequibles comercialmente. El tratamiento con quinasa de hebras
sencillas antes del recocido o para el marcaje se logra utilizando
un exceso, v.g., aproximadamente 10 unidades de polinucleótido
quinasa respecto a 1 nmol de sustrato en presencia de Tris 50 mM, pH
7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, ATP 1-2
mM, 1,7 pmoles de ATP-\gammaP32 (2,9 mCi/mmol),
espermidina 0,1 mM, EDTA 0,1 mM.
Una vez que los componentes de los vectores
deseados son asequibles de este modo, se pueden escindir y ligar
utilizando procedimientos de restricción y ligadura
normalizados.
La escisión de sitio específico del ADN se
realiza mediante tratamiento con una enzima (o enzimas) de
restricción adecuada que son generalmente conocidas en la técnica, y
cuyos detalles son especificados por el fabricante de estas enzimas
de restrucción asequibles comercialmente. Ver, por ejemplo, el
Catálogo de Productos de New England Biolabs. En general, se escinde
aproximadamente 1 mg de plásmido o secuencia de ADN por una unidad
de enzima en aproximadamente 20 ml de solución tampón; en los
presentes ejemplos, típicamente, se utiliza un exceso de enzima de
restricción para asegurar la digestión completa del sustrato de ADN.
Se puede trabajar con tiempos de incubación de aproximadamente una
hora a dos horas a aproximadamente 37ºC, aunque se pueden tolerar
variaciones. Tras cada incubación, la proteína se elimina mediante
extracción con fenol/cloroformo, y puede estar seguido de extracción
con éter, y recuperación del ácido nucleico de las fracciones
acuosas y precipitación con etanol. Si se desea, la separación por
tamaño de los fragmentos escindidos se puede realizar mediante
electroforésis en gel de poliacrilamida o gel de agarosa utilizando
técnicas normalizadas. Una descripción general de las separaciones
por tamaño se encuentra en Methods in Enzymology (1980)
65:499-560.
Los extremos de los fragmentos escindidos
mediante restricción se pueden volver romos mediante tratamiento con
un fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow) de E. coli
en presencia de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
utilizando tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 minutos
de 20 a 25ºC en tampón Tris 50 mM pH 7,6, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 6
mM, DTT 6 mM y dNTP 0,1-1,0 mM. El fragmento de
Klenow rellena los salientes de hebra sencilla 5' pero vuelve a
estropear las hebras sencillas 3' salientes, incluso aunque estén
presentes los cuatro dNTP. Si se desea se puede realizar una
reparación selectiva suministrando sólo uno de los dNTP o uno
seleccionado dentro de las limitaciones dictadas por la naturaleza
del saliente. Después del tratamiento con Klenow, la mezcla se
extrae con fenol/cloroformo y se hace precipitar con etanol. El
tratamiento en las condiciones apropiadas con nucleasa S1 o
BAL-31 produce la hidrólisis de una porción de hebra
sencilla.
Las ligaduras se realizan en volúmenes de
15-50 ml en las siguientes condiciones y
temperaturas normalizadas: por ejemplo, Tris-HCl 20
mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, 33 \mug/ml de BSA, NaCl 10
mM-50 mM, y o bien ATP 40 \muM,
0,01-0,02 (Weiss) unidades de ADN ligasa de T4 a 0ºC
(para la ligadura de "extremo cohesivo") o bien ATP 1 mM,
0,3-0,6 (Weiss) unidades de ADN ligasa de T4 a 14ºC
(para la ligadura de "extremos romos"). Las ligaduras de
"extremo cohesivo" intermoleculares se realizan usualmente a
concentraciones de ADN totales de 33-100 \mug/ml
(concentración de extremo total 5-100 nM). Las
ligaduras de extremo romo intermoleculares se realizan a una
concentración de extremos total 1 mM.
En la construcción del vector en la que se
emplean "fragmentos vectores", el fragmento vector se trata
comúnmente con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa
alcalina intestinal de ternera (CIP) con el fin de eliminar el
fosfato 5' y prevenir la auto-ligadura del vector.
Las digestiones se realizan a pH 8 en Tris-HCl
aproximadamente 10 mM, EDTA 1 mM utilizando alrededor de 1 unidad de
BAP o CIP por mg de vector a 60' durante aproximadamente 1 hora. Con
el fin de recuperar los fragmentos de ácido nucleico, la preparación
se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol.
Alternativamente, la religadura se puede evitar en vectores que han
sido doblemente digeridos mediante la digestión adicional con
enzimas de restricción y separación de los fragmentos no
buscados.
Para las porciones de los vectores derivados de
ADNc o ADN genómico que requieren modificaciones de la secuencia se
puede utilizar mutagénesis dirigida por un cebador de sitio
específico (Zoller, M.J., y Smith, M. Nucleic Acid Res (1982)
10:6487-6500 y Adelman, J.P., et al.,
DNA (1983) 2:183-193). Esto se realiza
utilizando un oligonucleótido sintético cebador complementario a un
ADN de fago de hebra sencilla que va a ser sometido a mutagénesis
excepto para un desemparejamiento limitado, representando la
mutación deseada. Brevemente, el oligonucleótido sintético se
utiliza como cebador para dirigir la síntesis de una hebra
complementaria al fago, y el ADN de hebra parcial o totalmente
sencilla resultante se transforma en una bacteria huésped que
soporta el fago. Los cultivos de la bacteria transformada se
cultivan en placa sobre agar, permitiendo la formación de placa a
partir de células sencillas que albergan el fago.
Teóricamente, el 50% de las nuevas placas
contendrán el fago que tiene, como hebra sencilla, la forma mutada;
el 50% tendrá la secuencia original. Las placas resultantes se lavan
tras la hibridación con un cebador sintético tratado con quinasa a
una temperatura de lavado que permita la unión de un emparejamiento
exacto, pero a la que los desemparejamientos con la hebra original
son suficientes para evitar la unión. Las placas que hibridan con la
sonda se seleccionan, se cultivan, y se recupera el ADN.
En las construcciones mostradas más abajo, las
ligaduras correctas para la construcción de plásmidos se confirman
transformando primero la cepa MC1061 de E. coli obtenida del
Dr. M. Casadaban (Casadaban, M., et al., J Mol Biol
(1980) 138:179-207) u otro huésped adecuado
con la mezcla de ligadura. Los transformantes acertados se
seleccionan por la resistencia a la ampicilina, la tetraciclina u
otro antibiótico o utilizando otros marcadores dependiendo del modo
de construcción del plásmido, como es conocido en la técnica. Los
plásmidos para los transformantes se preparan después según el
método de Clewell, D.B., et al., Proc Natl Acad Sci
(USA) (1969) 62:1159, opcionalmente tras la amplificación
con cloramfenicol (Clewell, D.B., J Bacteriol (1972)
110:667). Se utilizan comúnmente varias minipreparaciones de
ADN, v.g., Holmes, D.S., et al., Anal Biochem (1981)
114:193-197 y Birnboin, H.C., et al.,
Nucleic Acid Res (1979) 7:1513-1523.
El ADN aislado se analiza mediante restricción y/o se secuencia
mediante el método de nucleótidos didesoxi de Sanger, F., et
al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 74:5463 como
describen adicionalmente Messing, et al., Nucleic Acid
Res (1981) 9:309, o mediante el método de Maxam, et
al., Methods in Enzimology@ (1980) 65:499.
Los siguientes ejemplos se exponen para
proporcionar a aquellos con un conocimiento práctico normal en la
técnica una revelación y descripción completa de cómo elaborar las
secuencias de ADN, los constructos de fusión, las proteínas y los
mamíferos transgénicos de la invención y no se pretende que limiten
el alcance de lo que los autores de la invención consideran su
invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con
respecto a los números utilizados (v.g., cantidades, temperatura,
etc.) pero se deberá contar con algunos errores y desviaciones
experimentales. A no ser que se indique de otro modo, las partes son
partes en peso, la temperatura está en grados C, y la presión es la
atmosférica o está próxima a ella.
6.1 Ejemplo
1
Para facilitar la expresión de la proteína
precursora \beta-amiloide en células de mamífero,
se construye un plásmido de manera que el segmento codificador de la
proteína se fusione a un promotor regulado potente derivado del gen
de la metalotioneína II humano (hMTII). Este procedimiento se
realiza en dos etapas. Primero se deriva un vector de expresión
pMTSV40 poliA Bam a partir del vector
phGH-SV(10) mediante digestión de
phGH-SV(10) con las enzimas de restricción
BamHI y SmaI, seguido de incubación con ADN polimerasa I (fragmento
de Klenow) con el fin de crear moléculas con extremos romos. Los
extremos romos se ligan con posterioridad a los ligadores BamHI, se
cortan con BamHI, y se vuelven a ligar para permitir la
recircularización. En esta etapa se elimina toda la secuencia
genómica de la hormona de crecimiento humana de
phGH-SV(10) excepto para la mayoría de la
región 3' no traducida del ARNm y las secuencias genómicas que
codifican la supuesta parada transcripcional 3' y las señales de
maduración. Para el constructo de expresión en células de mamífero
pMTSV40 poliA Bam es digerido con BamHI, después se incuba con los
cuatro nocleótidos trifosfato y con ADN polimerasa I para crear
extremos romos. Este fragmento se liga con posterioridad con el
fragmento SmaI-XmnI de 2.678 pb purificado derivado
de p4T4B. Las moléculas recombinantes son introducidas en MC1061
mediante transformación.
Se hacen crecer células de ovario de hámster
Chino (CHO)-K1 en un medio compuesto de una mezcla
1:1 de medio F12 y medio DME con suero fetal de ternera al 10%. Las
células competentes fueron transformadas simultáneamente con el
vector de expresión recombinante y pSU2:NEO (Southern, P., et
al., J Mol Appl Genet (1982)
1:327-341). pSV2:NEO contiene un gen
funcional que confiere resistencia al análogo de neomicina G418. En
la transformación, se aplican 500 ng de pSV2:NEO y 5 \mug del
vector recombinante a un plato de 60 mm de células CHO en forma de
producto co-precipitado de fosfato de
calcio-ADN como describen Graham, F.L. y Van der Eb,
A.J. Virology (1973) 52:456-467. El
crecimiento de las células en el antibiótico G418 como describen
Southern et al. rendirá una reserva de células CHO
transfectadas establemente conteniendo el ADN del vector de
expresión con la capacidad de expresar el ARNm y la proteína
\beta-amiloide relacionada.
6.2 Ejemplo
2
En el Ejemplo 1 se ha esbozado la construcción de
un sistema de expresión para la proteína precursora
\beta-amiloide (1-751) dirigida
por el promotor humano. Se preparó un constructo casi idéntico
utilizando el fragmento SmaI-XmnI de 2.548 pb
purificado derivado de p4T4B del que se habían suprimido 116 pb de
la región 5' no traducida. Este fragmento fue insertado en el sitio
SalI tras el promotor humano en un plásmido que albergaba el
marcador seleccionable para la neomicina para la expresión en
células de mamífero y el gen de resistencia a la ampicilina para la
selección de los transformantes bacterianos. Este vector,
pHbAPr-1-neo, ha sido descrito por
Gunning, el al., (Proc Nat'l Acad Sci USA (1987)
84:4831-4835) y ha sido modificado para
eliminar el sitio EcoRI del cuerpo del vector original y para
sustituir la región poliligadora original por un nuevo poliligador
que contiene un sitio EcoRI además de los sitios de clonación SalI,
HindIII, y BamHI presentes originalmente. El vector modificado es
referido como pAXneoR. El vector pAXneoR fue linealizado con SalI,
los extremos se rellenaron utilizando el fragmento de Klenow de la
ADN polimerasa para crear moléculas de extremos romos. El fragmento
\beta-amiloide SmaI-XmnI de 2.548
pb fue sometido a ligadura de extremos romos en el vector utilizando
ligasa de T4. Las moléculas recombinantes fueron introducidas en
E. coli MC1061 mediante transformación y se amplificó un clon
que desplegaba la orientación apropiada. Se elaboró una construcción
similar utilizando las secuencias \beta-amiloides
695 descritas por Kang et al. (supra) que coloca la
proteína \beta-amiloide 695 bajo el control del
promotor huma-
no.
no.
Se introdujeron 600 \mug de ADN total de
pAXneo/\beta-amiloide 751 o
pAXneo/\beta-amiloide 695 o una mezcla de igual
masa de ambos constructos plasmídicos en 10^{7} células CHO
mediante electroporación (Neumann, J Membrane Biol (1972)
10:279-290; Zimmerman, Biophys J
(1973) 13:1005-1013) utilizando un BTX
Transfector 100, cubetas de ordenación estériles
Bio-Rad, y un portacubetas construido por encargo.
Las células resistentes a G418 que recibieron el ADN exógeno se
seleccionaron mediante protocolos normalizados (Southern, 1982,
supra) utilizando 500 \mug/ml de G418 de Gibco.
La reserva de células transfectadas positivamente
resistentes a G418 de cada una de las tres transfecciones fue
caracterizada con respecto a la expresión de la proteína precursora
\beta-amiloide. Se incubaron aproximadamente 2 x
10^{6} células de cada reserva conteniendo 5 ml de medio sin suero
a 37ºC durante 48 horas. El medio acondicionado se eliminó y se hizo
precipitar la proteína mediante la adición de ácido tricloroacético
hasta una concentración final del 10%. Las células fueron cosechadas
rascando, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato y se
volvieron a suspender en 50 \mul de tampón para una concentración
de 30 veces. Se cargaron 25 \mul de cada muestra en un gel de
poliacrilamida al 12,5% (Laemmli, Nature (1970)
277:680-685). El precursor
\beta-amiloide fue detectado mediante análisis de
hibridación Western (Towbin, Proc Nat'l Acad Sci USA (1979)
76:4350-4354) utilizando anticuerpos
policlonales específicos de \beta-amiloide
generados por virus vaccinia recombinantes que albergan el ADNc de
\beta-amiloide 751 utilizando procedimientos
normalizados. Típicamente, se ha encontrado que la mayoría de los
precursores \beta-amiloides de aproximadamente
110.000 daltons están relacionados en el medio de cultivo y se
asocian con la célula cantidades muy pequeñas de la proteína. Este
resultado está de acuerdo con la hipótesis de Allsop, et al.,
(Proc Natl Acad Sci USA (1988)
85:2790-2794) que propone que la proteína
\beta-amiloide es una prohormona secretada. El
peso molecular aparente de 110.000 daltons de la proteína
\beta-amiloide expresada recombinantemente es
similar al observado por otros (Dyrks, T., et al., EMBO
J (1988) 7(4):949-957) utilizando
sistemas de transcripción/traducción in vitro y utilizando
células en cultivo (Weidelmann, A., et al., Cell
57, 115-126 (1989).
6.3 Ejemplo
3
Aquí se demuestra la capacidad para distinguir
entre las variantes genéticas de las especies de ARNm de proteínas
precursoras \beta-amiloides utilizando sondas
oligonucleotídicas. Este análisis de diagnóstico puede distinguir
entre dos variantes genéticas íntimamente relacionadas de proteínas
precursoras \beta-amiloides o sus ARNm, y
cuantificar los niveles relativos de expresión de estas proteínas o
ARNm.
El ARN celular o el ARN citoplásmico total fue
preparado a partir de células humanas en cultivo o de tejido
cerebral humano (cerebro con Alzheimer o cerebro normal) con o sin
eliminación de los núcleos (citoplásmicos o totales,
respectivamente) mediante el método de tiocianato de guanidina/CsCl
como describen Maniatis et al. El ARN fue fraccionado
mediante cromatografía de celulosa con oligo-dT, se
sometió a electroforesis sobre un gel de
agarosa-formaldehído, y fue transferido mediante
hibridación a nitrocelulosa (todo como describen Maniatis et
al.). Los filtros se cocieron, se pre-hibridaron
y se hibridaron con las sondas indicadas conforme a protocolos
normalizados.
Las sondas oligonucleotídicas fueron marcadas en
sus extremos con dCTP-[P^{32}] mediante incubación con transferasa
terminal conforme a las sugerencias del fabricante y como describen
Ponte et al. Nature 331, 525.527 (11 de Febrero de
1988) que se incorpora aquí como referencia para describir semejante
marcaje en el extremo. Se sometió a radiomarcaje con CTP-[P^{32}]
un inserto de actina mediante traslado de cortes. Tras la
hibridación, los filtros que hibridaban con los oligonucleótidos se
lavaron con 1 x SSC a 55ºC. El filtro hibridado con actina fue
lavado a 0,1 x SSC a 55ºC. Los filtros se expusieron después a una
película de rayos X para producir el autorradiograma mostrado. La
sonda inserto detecta el ARNm de la proteína del precursor
\beta-amiloide descrito en la Figura 1 en todas
las muestras examinadas. La sonda de empalme detecta el ARNm
\beta-amiloide relacionado descrito por Kang et
al., en todas las células excepto HeLa y MRC5. La sonda de
actina es un control que se espera que hibride con el abundante ARN
en todas las células.
6.4. Ejemplo
4
Las secuencias de A42 y A99 fueron derivadas de
los plásmidos de expresión de la \beta-actina A42
y A99 descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con
el número de serie 07/408.767. Específicamente, los plásmidos de la
\beta-actina A42 y A99 fueron digeridos con NcoI y
EcoRI liberando la región promotora de la
\beta-actina así como la región del promotor neo
de SV2. Además, mediante digestión con EcoRI, se eliminaron cinco
aminoácidos de A42 o A99 que pueden ser reemplazados utilizando un
poliligador sintético. El plásmido A42 o A99 suprimido para los
promotores de la \beta-actina y neo de SV2 se
purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se sintetizó un
poliligador oligonucleotídico sintético que genera múltiples sitios
de clonación así como los cinco aminoácidos para A42 y A99 y se ligó
al fragmento plasmídico A42 o A99 generado antes mediante digestión
con NcoI y EcoRI. La adición del poliligador suprime el sitio NcoI
en el plásmido original y mueve este sitio al interior del
poliligador, y reemplaza el sitio EcoRI dentro de las secuencias A42
o A99. Tras la ligadura del poliligador al fragmento plasmídico A42
o A99, se preparó el ADN plasmídico. El nuevo plásmido se escindió
primero con BglII y NcoI. Estos dos sitios fueron sintetizados en la
región poliligadora recién añadida. Es en el sitio generado mediante
digestión con BglII-NcoI en el que se añadirá el
promotor NSE.
El promotor NSE fue aislado de un banco genómico
de rata. Se seleccionó un fragmento EcoRI genómico de 11 kb
utilizando hibridación con oligonucleótidos diseñados a partir de la
secuencia de la región promotora NSE conocida. El fragmento promotor
NSE de EcoRI genómico de 11 kb se clonó en un plásmido pUC y fue a
partir de este fragmento genómico que se aisló la región promotora
deseada utilizando amplificación mediante PCR como se esboza en la
Fig. 9. Se produjo una porción grande de la región promotora que
contenía un intrón en la región no traducida 5' del gen NSE mediante
amplificación con PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos con
sitios de restricción BglII y NcoI en los extremos 5' y 3',
respectivamente. El fragmento promotor NSE se purificó mediante
electroforesis en gel y después se clonó en la región poliligadora
del plásmido A42 o A99 generado antes. Se utilizaron técnicas
recombinantes moleculares normalizadas para digerir, ligar y aislar
los fragmentos. La secuenciación del ADN documentó la fidelidad de
los plásmidos de expresión NSE-A42 y
NSE-A99.
6.5 Ejemplo
5
El plásmido NSE-A99 elaborado en
el Ejemplo 4 se utilizó para preparar los plásmidos de expresión
NSE-A695 y NSE-A751 eliminando las
secuencias A99 y remplazándolas por cualquiera de las secuencias
A695 o A751. Para eliminar las secuencias A99 del plásmido
NSE-A99, el plásmido fue digerido con NcoI seguido
de digestión con nucleasa de judía mung. El tratamiento con nucleasa
de judía mung genera un extremo romo en el sitio NcoI para fines de
clonación adicionales. El plásmido fue digerido a continuación con
HindIII. Este sitio está dentro de la región poliligadora 3' hacia
las secuencias A99 ocasionando la liberación del fragmento que
codifica A99. El plásmido restante que contenía el promotor NSE, las
secuencias plasmídicas, el sitio de adición poli A, y parte de la
región poliligadora fue purificado mediante electroforesis en gel. A
continuación, se prepararon los fragmentos A695 y A751 para la
clonación en el plásmido NSE con A99 suprimido. Las secuencias A695
y A751 estuvieron derivadas de los plásmidos de expresión de la
\beta-actina A695 y de la
\beta-actina A751. Para eliminar las secuencias
695 y 751, los plásmidos fueron digeridos con NruI y HindIII. El
sitio NruI está inmediatamente 5' respecto al codón de iniciación de
metionina de 695 y 751. El sitio HindIII está localizado en la
región poliligadora 3' con respecto al codón de terminación 695 y
751. El fragmento NruI-HindIII que contenía las
secuencias A695 y A751 fue clonado en el plásmido NSE con
A-99 suprimido tratado con
NcoI-HindIII de extremos romos. Se documentó que los
plásmidos finales, NSE-A695 y
NSE-A751, eran correctos mediante secuenciación del
ADN de las uniones de clonación. Se probó que estos plásmidos
expresaban la proteína 695 y 751 tras la transfección en células de
mamíferos.
6.6 Ejemplo
6
Se preparó un promotor de ratón de la
metalotioneína I sintético diseñado a partir de la secuencia
publicada utilizando síntesis y ligadura de oligonucleótidos. El
promotor de la metalotioneína o MT sintético fue clonado en pUC19.
Para preparar los plásmidos de expresión transgénicos
MT-A99 y MT-A42, las secuencias A42
y A99 fueron aisladas a partir de los plásmidos de expresión A42 y
A99 de la \beta-actina, respectivamente. Las
secuencias A42 y A99 fueron separadas mediante corte del plásmido de
expresión de la \beta-actina utilizando digestión
con SalI y BamHI para A42 y SalI y HindIII para A99. El sitio de
SalI común para A42 y A99 está 5' con respecto a la metionina de
iniciación de A42 y A99. El sitio BamHI y los sitios HindIII están
contenidos ambos en la región poliligadora 3' con respecto a las
secuencias codificadoras A42 y A99. El fragmento
SalI-BamHI para A42 y el fragmento
SalI-BamHI para A99 fueron purificados mediante
electroforésis en gel. El fragmento del promotor MT sintético fue
aislado mediante digestión del plásmido pUC con EcoRI y SalI. El
fragmento del promotor MT EcoRI-SalI fue ligado al
fragmento SalI-BamHI A42. De un modo similar, el
fragmento del promotor MT EcoRI-SalI fue ligado al
fragmento SalI-HindIII de A99. Los fragmentos de
promotor MT-A42 y promotor MT-A99
fueron clonados después en la cadena principal plasmídica para un
plásmido de expresión completo. La cadena principal plasmídica
utilizada es el vector de la \beta-actina parental
del cual estaba derivado el plásmido pAXneoR modificado. El vector
plasmídico fue preparado para la clonación mediante digestión con
EcoRI y BamHI para la inserción del fragmento
RI-BamHI-MT-A42 o la
cadena principal plasmídica fue digerida con EcoRI y HindIII para la
inserción del fragmento
EcoRI-HindIII-MT-A99.
Se utilizaron metodologías normalizadas para la manipulación del ADN
recombinante para crear los plásmidos. Se verificó que los plásmidos
de expresión transgénicos MT-A42 y
MT-A99 tenían la secuencia correcta mediante
análisis de la secuencia de
ADN.
ADN.
6.7 Ejemplo
7
Se construyó un plásmido promotor utilizando el
fragmento MT-1 sintético descrito antes. Este
plásmido también contiene la región de terminación de SV40 que posee
un intrón. Entre el promotor y las secuencias de terminación de
SV40, existe un sitio XbaI. El plásmido se cortó y este sitio XbaI
se trató después con nucleasa de judía mung para crear un extremo
romo. Es en el sitio XbaI de extremo romo del plásmido MT en el que
se insertarán las secuencias 751 y 695. Las secuencias codificadoras
completas 695 y 751 estaban derivadas de los plásmidos de expresión
de la \beta-actina 695 y de la
\beta-actina 751. Para obtener este fragmento los
plásmidos de expresión de la \beta-actina fueron
digeridos con NruI y HindIII. El sitio NruI está inmediatamente 5'
con respecto a la metionina iniciadora de A695 y A751. El sitio
HindIII se localiza 3' principalmente con respecto al codón de
terminación de A695 y A751 dentro de la región poliligadora del
plásmido. La digestión con NruI crea un extremo romo. La digestión
con HindIII crea un extremo cohesivo que se rellena con Klenow para
elaborar un fragmento de extremos romos en ambos extremos 3' y 5' de
695 y 751. El fragmento de extremos romos 695 y el 751 fueron
clonados en el plásmido de SV40-metalotioneína con
el sitio XbaI de extremo romo. Se documentó que la secuencia de los
plásmidos MT-A695 y MT-A751 era
correcta en las uniones de clonación mediante análisis de la
secuencia de ADN.
En la Figura 11A se muestra un diagrama
esquemático del transgen NSE-A751. El promotor NSE
de 2,3 kb y la región 5' no traducida asociada se indica mediante el
recuadro con trama. El intrón dentro del ADN de NSE se indica
mediante líneas. Las secuencias A751 están representadas por el
recuadro oscuro. La región 3' no traducida tardía de SV40 que
contiene las señales de poliadenilación se indica mediante un
recuadro abierto. Las líneas discontínuas definen secuencias
plasmídicas. Se indican los sitios de restricción de las
endonucleasas, así como las sondas (1-4) utilizadas
para la transferencia Southern y los análisis de PCR mediante
transcriptasa inversa.
6.8 Ejemplo
8
Se recolectaron ova fertilizados de los oviductos
de ratones hembra JU emparejados previamente con machos. Los ova
fueron recogidos en una fase pronuclear temprana en la que los
pronúcleos masculino y femenino se separan y son distinguibles en el
citoplasma. Los ova recolectados fueron separados de células y
materiales circundantes, se lavaron apropiadamente y se almacenaron
según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los
zigotos se almacenaron preferiblemente en un porta con una
concavidad conteniendo medio de cultivo con una capa superior con
aceite de parafina en una atmósfera con el 5% de dióxido de carbono,
el 5% de oxígeno, y el 90% de nitrógeno (los porcentajes están
basados en el volumen) a 37ºC.
Se obtuvo un constructo de fusión de NSE con el
intrón de 5' conectado a A751 según el procedimiento descrito antes
y mostrado en la Figura 9. Cualquiera de los constructos de fusión
anteriormente mencionados puede ser clonado e incluido en un ovum
fertilizado de la manera descrita aquí. Por consiguiente, lo
siguiente es una descripción específica con respecto a A751 pero es
un procedimiento generalizado aplicable con cualquiera de los
constructos de fusión anteriormente descritos.
En primer lugar, los constructos de fusión fueron
clonados como se muestra esquemáticamente en la Figura 10. Tras la
clonación, los constructos de fusión se extrajeron del huésped, se
purificaron y se digirieron con la nucleasa apropiada con el fin de
elimina tantas secuencias bacterianas no deseadas como fue posible.
Los plásmidos extraídos se purifican mediante centrifugación en
gradiente de densidad de cloruro de cesio-bromuro de
etidio seguido de extracción con bromuro de etidio y diálisis del
ADN plasmídico. Tras llevar a cabo semejantes procedimientos de
extracción y purificación de cualquiera de las secuencias clonadas,
es posible obtener plásmidos relativamente purificados conteniendo
los constructos de fusión deseados.
Los plásmidos purificados se trataron después con
la endonucleasa apropiada (se utilizaron SalI y NdeI obtener
fragmentos lineales de NSE-A751 o
NSE-A695). Utilizando electroforesis en gel los
fragmentos deseados se aislaron mediante el uso de cuentas de vidrio
Gene Clean (vendidas por Bio 101, San Diego, California) seguido de
filtración a través de una membrana de 0,22 \mu.
Los ADN purificados obtenidos fueron
microinyectados utilizando pipetas de inyección con un diámetro
externo de aproximadamente 1 \mum. Semejantes pipetas pueden ser
preparadas a partir de tubo de vidrio Pyrex como se describe en
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
74:5657-5661 (1971). Se retiraron
aproximadamente diez picolitros de la solución que contenía los
constructors de fusión (que son aproximadamente 20.000 secuencias de
ADN) en una pipeta de inyección. El zigoto se situó en una pipeta de
retención que tenía un diámetro externo de aproximadamente 60 a 70
microlitros, cuya pipeta se podía preparar también según el
procedimiento de la publicación citada antes. El zigoto se situó en
la pipeta de retención de manera que el pronúcleo masculino fue
inyectado con los constructos de fusión presentes en la pipeta de
inyección.
Todos los zigotos fueron microinyectados, después
se colocaron en tubos de cultivo donde se permitió su desarrollo
durante cinco días. Las condiciones adecuadas para el desarrollo de
preimplantación se describen en Biol. Reprod.
8:420-426 (1973). Los ova que se
desarrollaban hasta mórula o blastocitos se trasplantaron a los
úteros de madres de ratón adoptivas JU híbridas F_{1}, que estaban
en el día 3 de seudoembarazo. Estas madres adoptivas llevaron a
término los embriones implantados.
Se utilizaron técnicas de inyección del tipo
descrito antes y del tipo conocido por los expertos en la técnica
con en fin de inyectar embriones con diferentes productos conjugados
de la invención como se muestra más abajo en la Tabla 1, donde los
experimentos 1-5 se llevaron a cabo utilizando
diferentes productos conjugados sobre diferentes números de
embriones de ratón. Los resultados esperados y reales de estos
experimentos se tabulan en la Tabla 1 que muestra el número de
huevos de ratón inyectados, el número de crías vivas que resultaban
de la implantación de esos huevos y el número de crías que volvían a
ser transgénicas realmente, esto es, que volvían realmente a
incorporar los ADN foráneos que fueron inyectados en los
embriones.
Los ratones transgénicos obtenidos mediante los
experimentos 1-5 como se muestra en la Tabla 1
anterior son útiles para determinar la eficacia de un fármaco en la
disminución de la cantidad de placas formadas como resultado de la
enfermedad de Alzheimer. Los ratones transgénicos de uno cualquiera
de los experimentos se puede utilizar comparándolo con los ratones
de control que no son transgénicos o se pueden comparar varias
combinaciones de los ratones transgénicos entre sí y/o con los
controles determinando el objeto la eficacia de uno o más fármacos
para disminuir la cantidad de placas formadas y relacionando de este
modo la disminución de las placas con la eficacia del fármaco en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Para los siguientes ejemplos, los resultados se
describen para los embriones y ratones inyectados con ADN
NSE-A751.
Como se ha indicado en la Tabla 1, 9 de 44
ratones que se desarrollaban a partir de los embriones inyectados
con ADN NSE-A751 portaban el transgen. La crianza de
estos ratones producía el establecimiento de 8 líneas; el transgen
de un fundador no era heredado por la progenie. Se seleccionaron
tres linajes para la caracterización adicional, incluyendo el
fundador 10 (F10), el fundador 11 (F11) y el fundador 24 (F24).
(Tabla 2). El número de copias de los transgenes fue estimado
mediante comparación del gen de ratón b-APP de copia
sencilla endógeno utilizando hibridación mediante transferencia
Southern con una sonda oligonucleotídica común a
b-APP de ratón y a b-A751 humano
(Figura 11B). Se digirieron 40 mg de ADN cola con BglII y se sometió
a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Se prepararon
transferencias Southern y se hibridaron con una sonda
oligonucleotídica (Figura 11A, sonda #1;
5'-GGATGTGTACTGTTTCTTCTTCA-3')
radiomarcada con P^{32} mediante quinasa de T4.
Las transferencias se hibridaron a 60ºC en 6 X
SET (1X SET=NaCl 0,15 M, Tris-HCl 30 mM pH,0, EDTA 2
mM) con 5 x solución de Denhart y se lavaron a 608,8C durante 40
minutos en 6 X SSC (1X SSC = NaCl 0,15 M, citrato Na 0,15 M). Las
líneas F10, F11, y F24 tenían aproximadamente 1, 4, y 8 copias de
NSE:b-A751 por genoma haploide, respectivamente.
Se estudió la expresión de los transgenes
heredados en tres linajes. Se aislaron 2 mg de ARN de cerebro total
de los animales de control positivos y de tipo salvaje, sometidos a
transcripción inversa con oligo dT12-18, y un
subfragmento de ADN específico amplificado mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). La región fue dividida en 2
alícuotas.
Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para la
PCR de manera que sólo podían ser amplificados los transcritos
derivados del transgen, es decir, un cebador hibridaba con la región
de NSE 5' no traducida
(5'-CACCG
CCACCGGCTGAGTCTGCAGTCCTCG-3') y el otro con el dominio codificador 5' de b-APP (5'-TCTTGCACTGCT
TGCGGCCCCGCTTGCACC-3'). Para dar cuenta del ADN genómico contaminante o de los transcritos no transformados, el cebador de la PCR NSE correspondía al sitio localizado aguas arriba del intrón. Se amplificó un fragmento de 373 pares de bases a partir del ADN sometido a transcripción inversa preparado a partir de cada animal transgénico, pero no es amplificó a partir del ARN sometido a transcripción inversa aislado de los ratones de tipo salvaje. Como control, la segunda alícuota del ARN sometido a transcripción inversa se amplificó con el cebador para la secuencia señal (5'-TTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACG-3') secretora de b-APP nativa y el cebador de b-APP del dominio que codifica 5' descrito antes. En estas reacciones, las muestras sometidas a transcripción inversa tanto de tipo salvaje como transgénicas producían el fragmento de ARN de 307 pares de bases que representaba la amplificación a partir del ARN b-APP endógeno.
CCACCGGCTGAGTCTGCAGTCCTCG-3') y el otro con el dominio codificador 5' de b-APP (5'-TCTTGCACTGCT
TGCGGCCCCGCTTGCACC-3'). Para dar cuenta del ADN genómico contaminante o de los transcritos no transformados, el cebador de la PCR NSE correspondía al sitio localizado aguas arriba del intrón. Se amplificó un fragmento de 373 pares de bases a partir del ADN sometido a transcripción inversa preparado a partir de cada animal transgénico, pero no es amplificó a partir del ARN sometido a transcripción inversa aislado de los ratones de tipo salvaje. Como control, la segunda alícuota del ARN sometido a transcripción inversa se amplificó con el cebador para la secuencia señal (5'-TTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACG-3') secretora de b-APP nativa y el cebador de b-APP del dominio que codifica 5' descrito antes. En estas reacciones, las muestras sometidas a transcripción inversa tanto de tipo salvaje como transgénicas producían el fragmento de ARN de 307 pares de bases que representaba la amplificación a partir del ARN b-APP endógeno.
El ADN se sometió a electroforesis sobre geles de
agarosa al 2%, visualizado mediante tinción con bromuro de etidio, y
después se sometió a transferencia Southern y se hibridó con una
sonda oligonucleotídica de la secuencia de fusión
NSE-A751
(5'-AGATCCCAGCCACCGATGCTGCCCGGTTTG-3').
Las transferencias se hibridaron a 65ºC en 6 X
SET y se lavaron a 65ºC durante 40 minutos en 4 X SSC. Cuando los
productos de la reacción de la PCR fueron hibridados con la sonda
oligonucleotídica que formaba puentes en la unión entre las
secuencias NSE y b-A751, únicamente los productos
derivados de los cerebros transgénicos hibridaban con la sonda,
demostrando la autenticidad del producto de la PCR de 373 pb.
Se determinaron los cambios en la expresión de
las proteínas en cerebros de animales transgénicos
NSE:b-A751 mediante análisis de transferencia
Western. Los productos homogeneizados de proteínas se elaboraron a
partir del cerebro completo según los métodos de Shivers, B.D.,
et al., EMBO J (1988) 7:1365-1370. Se
sometieron a electroforesis 50 mg de cada muestra sobre un gel de
poliacrilamida-DSS al 7,5% y se transfirieron a
membranas. Se desarrollaron transferencias Western utilizando una
dilución 1/500 de antisuero policlonal originado contra A695 humano
en toda su longitud por el virus vaccinia recombinante y proteína
A-I^{125}. Se observaron varias bandas de
aproximadamente 120 kD correspondientes al tamaño medio referido de
isoformas b-APP de cerebro de mamífero en los
controles y en cada producto homogeneizado de proteína transgénica.
Se observaron niveles ligeramente crecientes de
b-APP en las muestras de NSE-A751
respecto a las muestras de tipo salvaje sugiriendo elevados niveles
de expresión de A751 en los cerebros transgénicos. Fue difícil
determinar una evaluación exacta de los niveles neuronales de
expresión de A751 endógeno, no obstante, debido a la expresión
neural y glial combinada de b-APP endógeno. Por
consiguiente, se examinaron los niveles neuronales de la expresión
de A751 endógeno mediante inmunocitoquímica de la expresión de
NSR-A751.
Se utilizó anticuerpo monoclonal 4.1 para los
análisis histológicos de los cerebros de los ratones transgénicos.
Este anticuerpo reconoce un epítopo que fue mapeado para los 10
restos N-terminales de la proteína
\beta-amiloide y tiene alta afinidad y
especificidad para las placas neuríticas. Cualquier
inmunoreactividad fue eliminada preincubando el anticuerpo
monoclonal con el inmunógeno peptídico sintético antes de la
tinción. Brevemente, se preparó un péptido sintético correspondiente
a los restos 1-28 de la proteína
\beta-amiloide y se auto-agregó
mediante congelación y descongelación. El agregado peptídico se
mezcló con seralbúmina bovina metilada y coadyuvante para inmunizar
y reforzar al ratón. Se generaron los hibridomas de las células del
bazo sensibilizadas. Los clones que secretan los anticuerpos
anti-péptido fueron expandidos y sunclonados
mediante dilución limitante. Los cerebros de los ratones
transgénicos NSE-A751, los ratones de tipo salvaje,
y se analizaron los animales homozigotos y hemizigotos de tres
líneas transgénicas (Tabla 2). Los cerebros se separaron y se
mezclaron con paraformaldehído, se embebieron en parafina y se
hicieron secciones de cerebro medio coronal. Las secciones se
retiraron de la parafina, se rehidrataron, se trataron durante 30
minutos con H_{2}O_{2} al 0,3%, después con ácido fórmico al 80%
durante aproximadamente 2 minutos. Las secciones se incubaron
después a 37ºC durante 30 minutos con una dilución 1/20 de medio
acondicionado del hibridoma que secreta el anticuerpo 4.1. Se
utilizó un estuche con peroxidasa de rábano picante
avidin-biotinilada anti-ratón (ABC)
según las sugerencias del fabricante (Vector Burlingame, CA), y la
peroxidasa de rábano picante se visualizó con
3,3'-diaminobenzidina. Las secciones se
contratiñeron con hematoxilina y eosina. Para la tinción de
b-APP en toda su longitud, se utilizó una dilución
1/400 de antisuero generado contra b-APP695 humano
expresado mediante vaccinia recombinante y un estuche ABC
anti-conejo. Las secciones se contratiñeron con
hematoxilina y eosina. Se obtuvieron secciones de cerebro humano de
individuos diagnosticados clínicamente con la enfermedad de
Alzheimer. Se prepararon secciones humanas y se tiñeron
idénticamente que las secciones de tejido de ratón excepto que se
trataron con ácido fórmico al 98% durante 10 minutos. Para los
experimentos de competición, el diluyente del anticuerpo se
preincubó a 4ºC durante 12 horas, después a 37ºC durante 30 minutos
con 250 mg/ml de péptido sintético \beta-amiloide
1-28 antes de la aplicación. Como se muestra en la
Figura 12A y 12B, el anticuerpo tiñe selectivamente las placas
neuríticas de la sección de tejido humano y la inmunorreactividad se
elimina preincubando el anticuerpo monoclonal con el inmunógeno
peptídico sintético antes de teñir.
Se tiñeron en paralelo secciones de cerebro
transgénico y de tipo salvaje con el anticuerpo 4.1. Se observó una
mayor cantidad de reactividad inmunoperoxidasa en las neuronas y a
lo largo del neurópilo de las células transgénicas en comparación
con los cerebros de los ratones de tipo salvaje.
Las Figura 12C muestra un ejemplo del aumento de
la tinción neuronal en la capa de células piramidales del hipocampo
de un animal con el linaje del fundador 10 NSE-A751
(Figura 12C). También se observó tinción significativa de procesos
neuríticos. El aumento del proceso neuronal arborizante fue muy
evidente en el estrato que flanqueaba la capa celular piramidal de
las regiones CA-1 y CA-3 de los
hipocampos transgénicos. También se observó el aumento de tinción de
los procesos neuríticos en las capas corticales más profundas de los
cerebros transgénicos. La tinción neuronal y de los procesos se
completó totalmente antes de la incubación del anticuerpo con el
péptido b-amiloide sintético de 28 restos y se
rebajó mediante tratamiento con ácido fórmico. Adicionalmente, como
se muestra en la Figura 12D, la tinción neurítica de los cerebros
transgénicos se detectó utilizando anticuerpos generados contra
b-APP en toda su longitud indicando que el material
inmunorreactivo del proceso neuronal es b-APP en
toda su longitud.
También se observaron depósitos inmunorreactivos
extracelulares en secciones de cerebro de las tres líneas
transgénicas teñidas con el anticuerpo monoclonal 4.1 (Figura
13A-D). Estos depósitos no se observan en los
animales de tipo salvaje estudiados. Los depósitos varían en tamaño,
forma, y frecuencia. En la Figura 13A-E se muestran
depósitos compactos de 10-30 mm de diámetro. Se
observaron depósitos muy frecuentemente en el córtex y el hipocampo
si bien se observaron ocasionalmente en el tálamo y en el cuerpo
estriado. Los depósitos tienden a producirse en grupos. Se observó
una media de 5 depósitos en una única sección de cerebro completo
del fundador 10 u 11 NSE-b-A751, no
obstante, se han observado quince depósitos con un tamaño de
10-50 mm en una sola sección. También se observaron
depósitos extracelulares inmunorreactivos amorfos o granulares en
secciones de cerebros transgénicos teñidos con el anticuerpo
monoclonal 4.1 y no en las secciones de cerebro de control. La
Figura 13e muestra un ejemplo de inmunorreactividad amiloide difusa
en el hipocampo de un animal de la línea del fundador 11
NSE-b-A751. La detección de
depósitos extracelulares en secciones de tejido de los animales
transgénicos requirió tratamiento con ácido fórmico. La tinción de
las estructuras fue completada por el péptido
\beta-amiloide como se observa en la Figura 14e.
Los depósitos se teñían de forma variable con los anticuerpos
producidos contra b-APP en toda su longitud. Los
cerebros de los fundadores 10 y 11 con NSE-A751
presentaban un mayor número de depósitos compactos que el fundador
24 con NSE-b-A751 (Tabla 2) incluso
aunque el fundador 24 tiene más copias del transgen
NSE-bA751.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \begin{minipage}[t]{140mm} ^{1} meses; ^{2} haploide;
^{3} >5 mm de tamaño, (-) (+/++/+++) relativo a la abundancia de
depósitos, esto es, +, <5; ++, 5-10; +++, >10
depósitos por sección como un promdio de múltiples secciones
teñidas. M y H indican ratones macho y hembra, respecticamente; AA y
Aa representan animales homozigotos y hemizigotos, respectivamente;
n.a. indica no aplicable.; *NSE-A751 F10 #31 murió
espontáneamente por causas
desconocidas.\end{minipage} \cr}
Aquellos ratones que albergan los genes exógenos
pueden ser criados hasta 1) documentar que el ADN de
NSE-751 o NSE-695 es incorporado
establemente al genoma, 2) crear una línea pura, 3) caracterizar el
ARNm y la expresión de las proteínas, 4) investigar por último las
posibles consecuencias patológicas de la expresión del ADN foráneo,
y 5) someter a ensayo los potenciales compuestos terapéuticos.
Se puede utilizar una variedad de procedimientos
analíticos para identificar y caracterizar los animales transgénicos
producidos conforme a los protocolos anteriormente descritos. Esto
es, por supuesto, necesario para identificar qué animales
transgénicos incluyen las secuencias insertadas tales como
NSE-A-99,
NSE-A-42,
MT-A-99 y
MT-A-42. Estos insertos, así como
kis insertos A4i, pueden ser detectados utilizando reactivos
oligonucleotídicos para la PCR y la transferencia Southern y
anticuerpos para la transferencia Western racionales y específicos
idénticos. Se harán evidentes para los expertos en la técnica una
variedad de técnicas diferentes y combinaciones de técnicas tras
leer esta descripción.
Se han desarrollado métodos de transferencia
Western para identificar el precursor A751 o A695 en cerebro de
roedores. Como ejemplo, se llevó a cabo una transferencia Western
utilizando antisuero para A695 (producido utilizando el sistema del
virus vaccinia recombinante) que se había hecho reaccionar con
producto homogeneizado de cerebro total. Se reconoció una única
proteína de 120 kd que es el peso molecular pronosticado del
precursor. La membrana a la que se transfiere la proteína para la
transferencia influye en grado sumo en la transferencia de la
proteína. Para proteínas mayores de 30 kd, es óptimo el difluoruro
de polivinileno (PVDF), mientras, por debajo de 30 kd, la
nitrocelulosa es más eficaz. Se pueden utilizar otros antisueros
asequibles desarrollados para las regiones del precursor amiloide,
en concreto, sueros para el dominio inhibidor de Kunitz y para el
dominio del núcleo en los análisis de transferencia Western de
proteína de cerebro total. Adicionalmente, utilizando procedimientos
conocidos en la técnica, es posible aislar anticuerpos monoclonales
para el precursor. Los ratones han sido inmunizados con un virus
vaccinia recombinante que expresa A751 y se demostró que producían
anticuerpos para esta proteína.
La Figura 11B muestra una transferencia Southern
de ADN de ratones de tipo salvaje y transgénicos. Calles 1 y 2, tipo
salvaje (WT); calles 3 y 4, fundador 10 con NSE-A751
(F10); calles 5 y 6, fundador 11 con NSE-A751 (F11);
calles 7 y 8, fundador 24 con NSE-A751 (F24). La
flecha indica el gen b-APP de ratón endógeno. Los
puntos indican b-APP exógeno.
La Figura 12 (A, B, C y D) muestran la tinción
con inmunoperoxidasa de cerebro humano y de ratón. Las Figuras 12A y
12B muestran una sección de tejido con enfermedad de Alzheimer
humana del hipocampo caudal teñido con anticuerpo 4.1 sin
preincubación (12A) y con preincubación (12B) con el inmunógeno
peptídico sintético \beta-amiloide. La Figura 12C
muestra la capa celular piramidal de la región del hipocampo
CA-1 de NSE-A751 F10 (#334) teñida
con el anticuerpo 4.1. La Figura 12D muestra la misma región de
ratón de tipo salvaje (#3) teñida con el anticuerpo 4.1. La
aplicación es de 500X.
La Figura 13 (A, B, C, D y E) son
fotomicrografías de depósitos inmunorreactivos en cerebros con
NSE-A751. La Figura 13A es un depósito compacto en
córtex parietal frontal de F11 (#0); La Figura 13B es un depósito
compacto en el tálamo de F11 (#236); La Figura 13C muestra un
depósito compacto en el campo CA-2 del hipocampo de
F11 (#0); la Figura 13D muestra los grupos de depósitos en el córtex
parietal frontal de F10 (#168); la Figura 13E muestra depósitos
amorfos en estrato del hipocampo molecular de F11 (#236).
Los mamíferos transgénicos de la presente
invención son útiles para determinar la eficacia de las drogas
farmacéuticas con respecto a su capacidad para reducir el número de
placas que se forman en el cerebro del animal. Más específicamente,
los mamíferos son útiles para someter a ensayo la eficacia de
semejantes fármacos para prevenir la formación o reducir la cantidad
de las placas \beta-amiloides formadas así como
para eliminar o reducir las placas ya formadas.
Los métodos para producir los animales
transgénicos de la invención se han descrito antes. Una vez
producida, el fármaco que se va a someter a ensayo se administra a
un animal o grupo de animales de control que no sean los animales
transgénicos de la invención y simultáneamente a los animales
transgénicos de la invención. El fármaco se administra
preferiblemente de forma continua a lo largo de un período de tiempo
que normalmente es suficiente para efectuar el depósito de los
depósitos proteicos amiloides en el cerebro del animal. Tras la
administración del fármaco durante un período de tiempo suficiente
se sacrifican el animal o animales de control junto con el animal o
los animales transgénicos. Se realiza el examen del cerebro de los
animales. Comparando la cantidad de depósitos en el animal o los
animales de control con la cantidad de depósitos en el mamífero o
los mamíferos transgénicos de la invención se puede realizar una
determinación con respecto a la eficacia del fármaco para controlar
la cantidad relativa de depósitos amiloides.
Ya que los animales transgénicos de la invención
se pueden utilizar para someter a ensayo la eficacia de los fármacos
con respecto a la prevención de los depósitos amiloides los animales
son herramientas de investigación valiosas con respecto a la
capacitación de los investigadores para someter a ensayo la eficacia
de tales fármacos para tratar enfermedades asociadas con depósitos
amiloides tales como la enfermedad de Alzheimer. No obstante, se
debe señalar que existen seis casos conocidos de depósitos amiloides
asociados con enfermedades en los que se conoce la naturaleza de la
proteína precursora de la proteína amiloide; para la amiloidosis
primaria, la fuente es una cadena ligera de inmunoglobulina; para la
amiloidosis secundaria, el precursor es la proteína A amiloide; para
la polineuropatía amiloide familiar y la amiloidosis cardíaca senil,
la prealbúmina también conocida como transtireitina o una variante
de la misma; para el carcinoma medular de tiroides, un fragmento de
precalcitonina; y para la hemorragia cerebral hereditaria, un
fragmento gamma traza que se ha demostrado que es la cistatina C.
(ver, v.g., Glenner, G. New England Journal of Medicine
(1980) 302:1283; Sletton, K., et al., Biochem J
(1981) 195:561; Benditt, et al., FEBD Lett
(1971) 19:169; Sletton, K., et al., Eur J
Biochem (1974) 41:117; Sletton, K., et al., J
Exp Med (1976) 143:993). Lo anterior es una lista parcial
y existen al menos varias referencias adicionales en cuanto al
fragmento de procalcitonina como precursor para el amiloide del
carcinoma de tiroide. Alternativamente, o adicionalmente, se puede
producir semejante precursor de la proteína núcleo
\beta-amiloide en el cerebro o en otra parte y se
deposita específicamente en el cerebro.
Los animales transgénicos y específicamente los
mamíferos transgénicos de la presente invención se pueden utilizar
para determinar la eficacia de una variedad de fármacos en el
tratamiento de una variedad de enfermedades (incluyendo aquellas
indicadas antes) cuyas enfermedades están asociadas con depósitos
\beta-amiloides en el cerebro. Se pueden utilizar
protocolos de ensayo de fármacos comparativos conocidos por los
expertos en la técnica en relación con los animales transgénicos de
la invención con el fin de someter a ensayo fármacos.
Las marañas neurofibrilares intraneuronales están
presentes también en otras enfermedades neurodegenerativas, pero la
presencia de depósitos amiloides tanto en los espacios
interneuronales (placas neuríticas) como en la microvasculatura
cincundante (placas vasculares) parece ser característico del
Alzheimer. De estas, las placas neuríticas parecen ser las más
prevalentes (Price, D.L., et al., Drug Development
Reseach (1985) 5:59-68). También se han
observado placas en los cerebros de pacientes con Síndrome de Dawn
de cierta edad que desarrollan la enfermedad de Alzheimer. Los
animales transgénicos de la presente invención pueden ser utilizados
en relación con la determinación de la eficacia de todos los tipos
de fármacos utilizados en relación con el tratamiento de las
enfermedades asociadas con los depósitos amiloides, esto es, en
Enfermedad de Alzheimer, (Dutch) la hemorragia cerebral hereditaria
con amiloidosis, y el síndrome de Down.
Si bien se han descrito las realizaciones
preferidas para elaborar y utilizar la invención, se apreciará que
se pueden hacer cambios y modificaciones sin apartarse de la
invención.
Los siguientes cultivos han sido consignados en
el American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA con
el fin de patentarlos. Los fagos bacteriófagos \lambdaSM2,
\lambdaSM2W9, y \lambdaAPCP168i4 y el plásmido
pNSE-\beta-APP751 se consignaron
bajo las condiciones especificadas por el Tratado de Budapest sobre
el Reconocimiento Internacional de las Consignas de Microorganismos
(Tratado de Budapest).
| Cultivo | Núm. de Acceso | Fecha de Consigna |
| \lambdaSM2 | 40279 | 13 Noviembre 1986 |
| SM2W4 | 40299 | 29 Diciembre 1986 |
| SM2W3 | 40300 | 29 Diciembre 1986 |
| \lambdaSM2W9 | 40304 | 29 Enero 1987 |
| \lambdaACPC168i4 | 40347 | 1 Julio 1987 |
| pNSE-\beta-APP751 | 75012 | 22 Mayo 1991 |
No se debe considerar la disponibilidad de las
cepas consignadas como una licencia para poner en práctica la
invención contraviniendo los derechos garantizados por la autoridad
de cualquier gobierno conforme a sus leyes de patentes.
Claims (6)
1. Un mamífero no humano transgénico cuyas
células contienen la secuencia de ADN recombinante o sintética
clonada cuya secuencia comprende:
una secuencia promotora específica de tejido
nervioso que es el promotor de la enolasa específico neuronal; y
una secuencia codificadora que codifica la
proteína precursora \beta-amiloide A751 y donde el
promotor y la secuencia codificadora están asociados operativamente
entre sí, se incorporan establemente al genoma del mamífero no
humano y son expresados para formar depósitos de proteína
\beta-amiloide en el cerebro de mamíferos no
humanos.
2. Un mamífero según la reivindicación 1 que es
un ratón.
3. Un método para producir un zigoto no humano
transformado genéticamente susceptible de desarrollo en un mamífero
no humano transgénico caracterizado por tener una pluralidad
de células que tienen una secuencia de ADN recombinante o sintético
clonada, comprendiendo la secuencia:
una secuencia promotora específica de tejido
nervioso que es el promotor de la enolasa específico neuronal
asociado operablemente con una secuencia codificadora que codifica
la proteína precursora \beta-amiloide A751 cuyo
método comprende la etapa de:
introducir la secuencia promotora y la secuencia
codificadora en un pronúcleo de un zigoto de mamífero mediante
microinyección, siendo susceptible dicho zigoto de desarrollo en un
mamífero, obteniéndose un zigoto transformado genéticamente;
donde dichas secuencia promotora y secuencia
codificadora se seleccionan de manera que la secuencia codificadora
no sea activada de tal manera y grado que evite el desarrollo normal
del embrión a término; y
donde la proteína precursora
\beta-amiloide es expresada para formar depósitos
de proteína \beta-amiloide en el cerebro del
mamífero no humano.
4. Un método según la reivindicación 3, donde se
microinyectan al menos 1.000 copias del gen en el pronúcleo y el
volumen de material genético inyectado no excede de aproximadamente
10 picolitros.
5. Un método según la reivindicación 3 ó 4, donde
la secuencia promotora y la secuencia codificadora se introducen en
el pronúcleo masculino de un huevo que tiene pronúcleos femenino y
masculino separados.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 3, 4 ó 5 en la que se permite que el zigoto se
desarrolle in vitro hasta la fase de mórula o blastocito.
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Families Citing this family (259)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5912410A (en) * | 1990-06-15 | 1999-06-15 | Scios Inc. | Transgenic non-human mice displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease |
| US5877015A (en) * | 1991-01-21 | 1999-03-02 | Imperial College Of Science, Technology Of Medicine | APP770 mutant in alzheimer's disease |
| US5672805A (en) * | 1991-07-18 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of California | Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein |
| AU2765992A (en) * | 1991-10-03 | 1993-05-03 | Indiana University Foundation | Method for screening for alzheimer's disease |
| WO1993007280A1 (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Astrocyte-specific transcription of human genes |
| WO1993014200A1 (en) * | 1992-01-07 | 1993-07-22 | Tsi Corporation | Transgenic animal models for alzheimer's disease |
| US5604131A (en) * | 1992-01-07 | 1997-02-18 | Athena Neurosciences, Inc. | cDNA-genomic DNA hybrid sequence encoding APP770 containing a genomic DNA insert of the KI and OX-2 regions |
| US5441870A (en) * | 1992-04-15 | 1995-08-15 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein |
| US5604102A (en) * | 1992-04-15 | 1997-02-18 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors |
| US5837672A (en) * | 1992-07-10 | 1998-11-17 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide |
| US6610493B1 (en) | 1993-06-17 | 2003-08-26 | Brigham And Women's Hospital | Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide |
| US5766846A (en) * | 1992-07-10 | 1998-06-16 | Athena Neurosciences | Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production |
| US6264915B1 (en) | 1992-09-13 | 2001-07-24 | The President And Fellows Of Harvard College | Process for detecting potential carcinogens |
| EP1298436B1 (en) * | 1992-10-26 | 2010-07-14 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the identification of Beta-amyloid peptide (BAP) release inhibitor compounds |
| US5605811A (en) * | 1992-10-26 | 1997-02-25 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein |
| CA2125467C (en) * | 1993-07-06 | 2001-02-06 | Heinz Dobeli | Process for producing hydrophobic polypeptides, proteins or peptides |
| GB2295395B (en) * | 1993-08-12 | 1998-04-01 | Inst Of Psychiatry | Models of Alzheimer's disease |
| GB9316727D0 (en) * | 1993-08-12 | 1993-09-29 | Inst Of Psychiatry | Models of alzheimers's disease |
| DK0730643T3 (da) * | 1993-10-27 | 2001-05-14 | Elan Pharm Inc | Transgene dyr, som huser APP-allel med svensk mutation |
| JPH07132033A (ja) * | 1993-11-12 | 1995-05-23 | Hoechst Japan Ltd | アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物 |
| US5877399A (en) * | 1994-01-27 | 1999-03-02 | Johns Hopkins University | Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease |
| EP0742831B1 (en) * | 1994-01-27 | 2004-09-29 | The Regents Of The University Of Minnesota | Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease |
| US6025183A (en) * | 1994-02-28 | 2000-02-15 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Transgenic animal assay system for anti-cholinesterase substances |
| IL113052A0 (en) * | 1994-03-23 | 1995-06-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Recombinant viruses, their preparation and their use in gene therapy |
| US6008435A (en) * | 1994-05-13 | 1999-12-28 | The Regents Of The University Of California | Detecting cow, sheep and human prions in a sample and transgenic mice used for same |
| US5792901A (en) * | 1994-05-13 | 1998-08-11 | The Regents Of The University Of California | Detecting prions in a sample and prion preparation and transgenic animal used for same |
| US6020537A (en) * | 1994-05-13 | 2000-02-01 | The Regents Of The University Of California | Prion protein standard and method of making same |
| AU2635295A (en) * | 1994-06-13 | 1996-01-05 | Henry Ford Health System | A novel neuronal-neonatal gene: neuronatin |
| US5686269A (en) * | 1994-07-28 | 1997-11-11 | The Mclean Hospital Corporation | Method of diagnosing Alzheimer's disease by detecting the level of cathepsin D in cerebrospinal fluid |
| US6211428B1 (en) * | 1994-09-01 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Transgenic mouse expressing a familial form of human amyloid precursor protein |
| US7427392B1 (en) | 1994-11-14 | 2008-09-23 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau |
| US20030152909A1 (en) * | 1994-11-16 | 2003-08-14 | Mitrani Eduardo N. | In vitro micro-organs, and uses related thereto |
| US5698766A (en) * | 1995-04-05 | 1997-12-16 | The Regents Of The University Of California | Transgenic animal model for testing drugs for treating eating disorders and epilepsy |
| US5817911A (en) * | 1995-04-07 | 1998-10-06 | Regents Of The University Of California | Transgenic mice expressing alveolar MCP-1 |
| US5777194A (en) * | 1995-04-26 | 1998-07-07 | Cephalon, Inc. | Gene-targeted mice with humanized Aβ sequence and Swedish FAD mutation |
| US5986054A (en) | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| EP0830606B1 (en) | 1995-05-03 | 2003-08-20 | The President And Fellows Of Harvard College | Assessing calcineurin's role in immunosuppression and neurotoxicity |
| US5777093A (en) * | 1995-05-16 | 1998-07-07 | Ramot-University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. | cDNAs associated with ataxia-telangiectasia |
| US5728807A (en) * | 1995-05-16 | 1998-03-17 | Ramot-University Authority For Applied Research And Industrial Development, Ltd. | Mutated proteins associated with ataxia-telangiectasia |
| US5858661A (en) | 1995-05-16 | 1999-01-12 | Ramot-University Authority For Applied Research And Industrial Development | Ataxia-telangiectasia gene and its genomic organization |
| US6187991B1 (en) | 1995-05-23 | 2001-02-13 | Pfizer Inc | Transgenic animal models for type II diabetes mellitus |
| US6717031B2 (en) | 1995-06-07 | 2004-04-06 | Kate Dora Games | Method for selecting a transgenic mouse model of alzheimer's disease |
| EP0842188A4 (en) * | 1995-07-18 | 2001-06-20 | Univ Washington | GENES S182 MUTANTS |
| US6248555B1 (en) | 1995-08-31 | 2001-06-19 | The General Hospital Corporation | Genetic alterations related to familial alzheimer's disease |
| CA2227306A1 (en) * | 1995-09-01 | 1997-03-27 | Ramot-University Authority For Applied Research And Industrial Developme Nt Ltd. | Manipulation and detection of protein phosphatase 2c - pp2c.alpha. - expression in tumor cells for cancer therapy, prevention and detection |
| US5859311A (en) * | 1995-11-27 | 1999-01-12 | University Of Kentucky Research Foundation | Transgenic mice which overexpress neurotrophin-3 (NT-3) and methods of use |
| AU4353696A (en) | 1996-01-09 | 1997-08-01 | Regents Of The University Of California, The | Ungulate embryonic stem-like cells, making and using the cells to produce transgenic ungulate |
| CN1212009A (zh) | 1996-01-09 | 1999-03-24 | 加利福尼亚大学董事会 | 有蹄动物胚胎干样细胞、制法及用该细胞产生转基因的有蹄动物的方法 |
| WO1997027296A1 (en) * | 1996-01-26 | 1997-07-31 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor |
| US6140309A (en) * | 1996-03-12 | 2000-10-31 | University Of South Florida | Vasoactive effects and free radical generation by β-amyloid peptides |
| US6077697A (en) | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US20030033617A1 (en) * | 1996-04-10 | 2003-02-13 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US20020160970A1 (en) * | 1996-04-10 | 2002-10-31 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| JP2000513230A (ja) | 1996-07-01 | 2000-10-10 | エイ． ライト，ジム | ハウスキーピング遺伝子の非翻訳領域由来のオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖を調節するためのその使用方法 |
| US6353151B1 (en) | 1996-09-26 | 2002-03-05 | University Technology Corporation | Transgenic model for heart failure |
| US5849999A (en) * | 1996-10-16 | 1998-12-15 | The Mclean Hospital Corporation | Transgenic non-human mice expressing Flag-APP-C100 protein develop alzheimer's disease brain morphology and behavior |
| US5898094A (en) * | 1996-10-21 | 1999-04-27 | University Of South Florida | Transgenic mice expressing APPK670N,M671L and a mutant presenilin transgenes |
| AU6260098A (en) * | 1997-02-24 | 1998-09-09 | Hoechst Marion Roussel, Inc. | Improved assays for beta-amyloid processing |
| US5962669A (en) * | 1997-06-02 | 1999-10-05 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid encoding prion protein variant |
| WO1998055132A1 (en) | 1997-06-02 | 1998-12-10 | The Regents Of The University Of California | Prion protein modulator factor (ppmf) and prion resistant animals |
| US7973156B2 (en) * | 1997-08-21 | 2011-07-05 | Quark Pharmaceuticals Inc. | Hypoxia-regulated genes |
| EP1009753B1 (en) * | 1997-08-21 | 2005-04-20 | Quark Biotech, Inc. | Hypoxia-regulated genes |
| US20030104973A1 (en) * | 1997-08-21 | 2003-06-05 | Quark Biotech, Inc. | Hypoxia-regulated genes |
| US6175057B1 (en) | 1997-10-08 | 2001-01-16 | The Regents Of The University Of California | Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy |
| US6455757B1 (en) | 1997-10-08 | 2002-09-24 | The Regents Of The University Of California | Transgenic mice expressing human APP and TGF-β demonstrate cerebrovascular amyloid deposits |
| US6710226B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-03-23 | Neuralab Limited | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics |
| US6743427B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US7179892B2 (en) * | 2000-12-06 | 2007-02-20 | Neuralab Limited | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7588766B1 (en) | 2000-05-26 | 2009-09-15 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic disease |
| US20080050367A1 (en) * | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US6923964B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-08-02 | Neuralab Limited | Active immunization of AScr for prion disorders |
| US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US6761888B1 (en) * | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
| TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US6750324B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-15 | Neuralab Limited | Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies |
| US6913745B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
| US7687057B2 (en) | 1998-01-09 | 2010-03-30 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | In vitro micro-organs, and uses related thereto |
| WO1999035279A1 (en) | 1998-01-12 | 1999-07-15 | Georgetown University Medical Center | G protein-related kinase mutants in essential hypertension |
| US20050059802A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Ltd | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US20030147882A1 (en) * | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
| US20040009535A1 (en) | 1998-11-27 | 2004-01-15 | Celltech R&D, Inc. | Compositions and methods for increasing bone mineralization |
| DE69942782D1 (de) | 1998-11-27 | 2010-10-28 | Ucb Sa | Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung der Knochenmineralisierung |
| WO2000037483A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Myriad Genetics, Inc. | Protein-protein interactions in neurodegenerative disorders |
| EP1026251A3 (en) * | 1999-02-03 | 2000-09-06 | Pfizer Products Inc. | Transgenic animals expressing human P25 |
| US6864235B1 (en) | 1999-04-01 | 2005-03-08 | Eva A. Turley | Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans |
| US6911429B2 (en) * | 1999-04-01 | 2005-06-28 | Transition Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans |
| US20030131364A1 (en) * | 1999-04-27 | 2003-07-10 | Karen Duff | Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animals produced therefrom |
| US6670195B1 (en) | 1999-05-26 | 2003-12-30 | New York University | Mutant genes in Familial British Dementia and Familial Danish Dementia |
| US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
| US6787318B1 (en) | 1999-06-01 | 2004-09-07 | Roskamp Research Institute, Llc | Assay for evaluating the therapeutic effectiveness of agents in reducing Alzheimer's disease pathology |
| UA81216C2 (en) * | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
| US20070160615A1 (en) * | 1999-06-01 | 2007-07-12 | Jun Tan | Methods and compounds for disruption of CD40R/CD40L signaling in the treatment of Alzheimer's disease |
| CA2377541A1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Eduardo N. Mitrani | Method of inducing angiogenesis by micro-organs |
| US6875582B1 (en) | 1999-08-19 | 2005-04-05 | Omniscience Pharmaceuticals, Inc. | Methods and targets of antibiotic resistance |
| US6998232B1 (en) | 1999-09-27 | 2006-02-14 | Quark Biotech, Inc. | Methods of diagnosing bladder cancer |
| AU2579401A (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-25 | Johns Hopkins University, The | Brain protein markers |
| WO2001053323A2 (en) * | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Ramot University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. | Plants tolerant of environmental stress conditions, methods of generating same and novel polynucleotide sequence utilized thereby |
| US7119085B2 (en) * | 2000-03-23 | 2006-10-10 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods to treat alzheimer's disease |
| US6992081B2 (en) | 2000-03-23 | 2006-01-31 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Compounds to treat Alzheimer's disease |
| EP1284729A4 (en) * | 2000-04-13 | 2007-12-19 | Mayo Foundation | REDUCTION AGENTS OF A (BETA) 42 |
| US6713276B2 (en) | 2000-06-28 | 2004-03-30 | Scios, Inc. | Modulation of Aβ levels by β-secretase BACE2 |
| PE20020276A1 (es) | 2000-06-30 | 2002-04-06 | Elan Pharm Inc | COMPUESTOS DE AMINA SUSTITUIDA COMO INHIBIDORES DE ß-SECRETASA PARA EL TRATAMIENTO DE ALZHEIMER |
| CA2410680A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Compounds to treat alzheimer's disease |
| EP1666452A2 (en) | 2000-06-30 | 2006-06-07 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Compounds to treat Alzheimer's disease |
| US20030096864A1 (en) * | 2000-06-30 | 2003-05-22 | Fang Lawrence Y. | Compounds to treat alzheimer's disease |
| US6846813B2 (en) | 2000-06-30 | 2005-01-25 | Pharmacia & Upjohn Company | Compounds to treat alzheimer's disease |
| HUP0300810A2 (hu) | 2000-07-20 | 2003-08-28 | M.G.V.S. Ltd. | Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása |
| US20040037828A1 (en) | 2002-07-09 | 2004-02-26 | Bar-Ilan University | Methods and pharmaceutical compositions for healing wounds |
| US7919670B1 (en) | 2000-08-14 | 2011-04-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) in brain and uses thereof |
| CN105483142A (zh) * | 2000-09-28 | 2016-04-13 | 生物源食物及科学公司 | 脂肪酸去饱和酶家族成员fad4、fad5、fad5-2和fad6及它们的应用 |
| US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
| TWI255272B (en) * | 2000-12-06 | 2006-05-21 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US20030051266A1 (en) * | 2001-02-14 | 2003-03-13 | Serafini Tito Andrew | Collections of transgenic animal lines (living library) |
| US7081561B2 (en) | 2001-03-16 | 2006-07-25 | The Regents Of The University Of California | Gene-targeted animal model of apolipoprotein E4 domain interaction and uses thereof |
| US20040078847A1 (en) * | 2001-03-22 | 2004-04-22 | Nitzan Paldi | Method of enhancing entomophilous |
| DE60228477D1 (de) | 2001-05-08 | 2008-10-02 | Darwin Molecular Corp | Verfahren zur regulierung der immunfunktion in primaten unter verwendung des foxp3-proteins |
| CA2448834A1 (en) | 2001-06-01 | 2002-12-12 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Hydroxy alkyl amine derivatives as beta-secretase inhibitors and their use for the treatment of alzheimer's disease and similar diseases |
| AU2002315131A1 (en) | 2001-06-13 | 2002-12-23 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Aminediols as agents for the treatment of alzheimer's disease |
| JP2005500319A (ja) * | 2001-06-27 | 2005-01-06 | イーラン ファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド | アルツハイマー病の治療に有用なβ−ヒドロキシアミン誘導体 |
| JP2005504022A (ja) * | 2001-07-10 | 2005-02-10 | イーラン ファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド | アルツハイマー病治療のためのジアミンジオール |
| JP2005505517A (ja) * | 2001-07-10 | 2005-02-24 | イーラン ファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド | アルツハイマー病を治療するためのアミンジオール |
| US7297553B2 (en) * | 2002-05-28 | 2007-11-20 | Nanosphere, Inc. | Method for attachment of silylated molecules to glass surfaces |
| WO2003012126A2 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-13 | Diversa Corporation | Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US6943001B2 (en) * | 2001-08-03 | 2005-09-13 | Diversa Corporation | Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| EA200400135A1 (ru) * | 2001-08-31 | 2004-08-26 | Ньюрочем ( Интернэшнл) Лимитед | Применение производных амидинов для лечения амилоидоза |
| EP1432674A2 (en) * | 2001-10-04 | 2004-06-30 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Hydroxypropylamines |
| AP2004003049A0 (en) * | 2001-11-08 | 2004-06-30 | Elan Pharm Inc | N,N' -substituted-1,3-diamino -2-hydroxypropane derivatives. |
| AU2002352811A1 (en) * | 2001-11-19 | 2003-06-10 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Amino diols useful in the treatment of alzheimer's disease |
| AU2002358947A1 (en) * | 2001-12-05 | 2003-06-17 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Nanoparticles containing polymeric nucleic acid homologs, pharmaceutical compositions and articles of manufacture containing same and methods of use thereof |
| US6992176B2 (en) | 2002-02-13 | 2006-01-31 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease |
| US7067321B2 (en) * | 2002-02-22 | 2006-06-27 | University Of Tennessee Research Foundation | Polyglutamine repeat sequences |
| IL163812A0 (en) * | 2002-03-05 | 2005-12-18 | Univ Ramot | Immunizing composition and method for inducing an immune response against the -secretase cleavage site of amyloid precursor protein |
| MY139983A (en) * | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7226771B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-05 | Diversa Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| BR0309391A (pt) | 2002-04-19 | 2005-10-25 | Diversa Corp | Fosfolipases, ácidos nucléicos codificando-as e métodos para preparar e usá-las |
| AU2003303141A1 (en) * | 2002-04-30 | 2004-07-22 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Hydroxypropyl amides for the treatment of alzheimer's disease |
| US20040005571A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-08 | Hawley R. Scott | Axs gene and protein and methods related thereto |
| JP2005533102A (ja) * | 2002-07-12 | 2005-11-04 | イッサム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム | 微小器官によって生物学的プロセスを誘発する方法と装置 |
| UY27967A1 (es) * | 2002-09-10 | 2004-05-31 | Pfizer | Acetil 2-hindroxi-1,3-diaminoalcanos |
| WO2004037204A2 (en) * | 2002-10-25 | 2004-05-06 | University Of South Florida | Methods and compounds for disruption of cd40r/cd40l signaling in the treatment of alzheimer's disease |
| US20060206950A1 (en) * | 2002-11-04 | 2006-09-14 | Kaelin William G Jr | In vivo imaging of e2f-fegulated bioluminescent proteins |
| CA2506666A1 (en) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Nact as a target for lifespan expansion and weight reduction |
| PE20040762A1 (es) | 2002-11-27 | 2004-11-06 | Elan Pharm Inc | Ureas substituidas y carbamatos utiles para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer |
| KR20050118669A (ko) * | 2003-02-01 | 2005-12-19 | 뉴랄랩 리미티드 | 가용성 ａ-베타에 대한 항체를 생성하기 위한 능동 면역화 |
| ES2713024T3 (es) | 2003-03-06 | 2019-05-17 | Basf Enzymes Llc | Amilasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su fabricación y uso |
| US8298799B2 (en) | 2003-03-07 | 2012-10-30 | Dsm Ip Assets B. V. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| CA2521402C (en) | 2003-04-04 | 2015-01-13 | Diversa Corporation | Pectate lyases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| PE20050420A1 (es) * | 2003-04-21 | 2005-06-13 | Elan Pharm Inc | Fenacilo 2-hidroxi-3-diaminoalcanos |
| JP2006524255A (ja) * | 2003-04-21 | 2006-10-26 | イーラン ファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド | ベンズアミド２−ヒドロキシ−３−ジアミノアルカン |
| WO2004110350A2 (en) | 2003-05-14 | 2004-12-23 | Torreypines Therapeutics, Inc. | Compouds and uses thereof in modulating amyloid beta |
| TWI306458B (en) | 2003-05-30 | 2009-02-21 | Elan Pharma Int Ltd | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| RU2376371C2 (ru) | 2003-06-18 | 2009-12-20 | Дженелюкс Корпорейшн | Модифицированные рекомбинантные вакцинирующие вирусы и другие микроорганизмы и их применение |
| AU2004254640B2 (en) | 2003-07-02 | 2010-08-26 | Bp Corporation North America Inc. | Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| WO2005010039A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Pfizer Products Inc. | Bsep polypeptide variants and uses thereof |
| US7741089B2 (en) | 2003-08-11 | 2010-06-22 | Verenium Corporation | Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| WO2005059100A2 (en) * | 2003-12-12 | 2005-06-30 | New York University | Methods and compositions relating to cystatin c |
| WO2005070407A1 (en) * | 2004-01-21 | 2005-08-04 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treatment of amyloidosis using aspartyl-protease inihibitors |
| US7262223B2 (en) * | 2004-01-23 | 2007-08-28 | Neurochem (International) Limited | Amidine derivatives for treating amyloidosis |
| JP2007528403A (ja) * | 2004-03-09 | 2007-10-11 | エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 二環式アスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬を用いるアミロイドーシスの処置方法 |
| JP2007528404A (ja) * | 2004-03-09 | 2007-10-11 | エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 置換された尿素およびカルバメート、フェナシル−２−ヒドロキシ−３−ジアミノアルカン、ならびにベンズアミド−２−ヒドロキシ−３−ジアミノアルカン系のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬 |
| US20060014737A1 (en) * | 2004-03-09 | 2006-01-19 | Varghese John | Methods of treatment of amyloidosis using bi-aryl aspartyl protease inhibitors |
| JP2007528402A (ja) * | 2004-03-09 | 2007-10-11 | エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 置換ヒドロキシエチルアミン系のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬 |
| JP2007528400A (ja) * | 2004-03-09 | 2007-10-11 | エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 置換ヒドロキシエチルアミン系のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害薬 |
| WO2005114217A2 (en) * | 2004-04-20 | 2005-12-01 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Na+ and ci> coupled transport system for endogenous opioid peptides |
| US7544855B2 (en) * | 2004-04-23 | 2009-06-09 | Buck Institute | Transgenic mouse whose genome comprises an APP having a mutation at amino acid 664 |
| JP2007538024A (ja) * | 2004-05-19 | 2007-12-27 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | アミロイドベータペプチドのレベル変化に関連する疾患及び状態の治療方法及び新規エノールカルボキサミド化合物 |
| AU2005264938B2 (en) | 2004-06-16 | 2011-11-24 | Verenium Corporation | Compositions and methods for enzymatic decolorization of chlorophyll |
| AU2005265354A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Oxime derivative hydroxyethylamine aspartyl-protease inhibitors |
| WO2006010095A2 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-26 | Elan Pharmaceuticals Inc. | Oxime derivative substituted hydroxyethylamine aspartyl protease inhibitors |
| US8383637B2 (en) * | 2004-08-06 | 2013-02-26 | Jansssen Pharmaceutica N.V. | 2-amino-quinazoline derivatives useful as inhibitors of β-secretase (BACE) |
| US8436006B2 (en) * | 2004-08-06 | 2013-05-07 | Jansssen Pharmaceutica N.V. | 2-amino-quinazoline derivatives useful as inhibitors of β-secretase (BACE) |
| US8426429B2 (en) * | 2004-08-06 | 2013-04-23 | Jansssen Pharmaceutica N.V. | 2-amino-quinazoline derivatives useful as inhibitors of β-secretase (BACE) |
| EP1802574A2 (en) * | 2004-08-27 | 2007-07-04 | Elan Pharmaceuticals Inc. | Methods of treatment of amyloidosis using ethanol cyclicamine derivatives aspartyl protease inhibitors |
| TW200636066A (en) * | 2004-12-15 | 2006-10-16 | Elan Pharm Inc | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| WO2006066089A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | Neuralab Limited | Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition |
| AR051800A1 (es) * | 2004-12-15 | 2007-02-07 | Wyeth Corp | Anticuerpos a beta usados en mejorar la cognicion |
| EP1859277A4 (en) | 2005-02-17 | 2010-03-17 | Biogen Idec Inc | TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS |
| CA2614769A1 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Verenium Corporation | Lyase enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| EP1861506B1 (en) | 2005-03-15 | 2015-04-15 | BP Corporation North America Inc. | Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| EP1907566A4 (en) * | 2005-05-27 | 2008-12-10 | Memory Pharm Corp | ALZHEIMER TRANSGENIC MOUSE MODEL VECTORS AND USES THEREOF |
| EP1746092A1 (en) | 2005-07-22 | 2007-01-24 | Exonhit Therapeutics SA | Compounds and methods for treatment of amyloid-B-peptide related disorders |
| US20080293680A1 (en) * | 2005-08-03 | 2008-11-27 | Stefan Peters | Substituted Ethane-1,2-Diamines for the Treatment of Alzheimer's Disease II |
| CA2618013A1 (en) * | 2005-08-11 | 2007-02-15 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Beta-secretase inhibitors for use in the treatment of alzheimer's disease |
| CA2618019A1 (en) * | 2005-08-11 | 2007-02-15 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Compounds for the treatment of alzheimer's disease |
| JP2009504614A (ja) * | 2005-08-11 | 2009-02-05 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | アルツハイマー病の治療用化合物 |
| JP2009504613A (ja) * | 2005-08-11 | 2009-02-05 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | アルツハイマー病の治療用化合物 |
| WO2007047306A1 (en) * | 2005-10-12 | 2007-04-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating amyloidosis using aryl-cyclopropyl derivative aspartyl protease inhibitors |
| WO2007047305A1 (en) | 2005-10-12 | 2007-04-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating amyloidosis using cyclopropyl derivative aspartyl protease inhibitors |
| JP2009525110A (ja) | 2006-01-31 | 2009-07-09 | マルチ ジーン バスキュラー システムズ， インコーポレイテッド | 薬物溶出血管内プロテーゼおよび使用方法 |
| EP1987142A4 (en) | 2006-02-02 | 2009-07-15 | Verenium Corp | ESTERASES AND ASSOCIATED NUCLEIC ACIDS AND METHODS |
| US7776882B2 (en) * | 2006-02-06 | 2010-08-17 | Baxter Ellen W | 2-amino-3,4-dihydro-quinoline derivatives useful as inhibitors of β-secretase (BACE) |
| WO2007092854A2 (en) * | 2006-02-06 | 2007-08-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | 2-AMINO-QUINOLINE DERIVATIVES USEFUL AS INHIBITORS OF β-SECRETASE (BACE) |
| WO2007092839A2 (en) * | 2006-02-06 | 2007-08-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Macrocycle derivatives useful as inhibitors of beta-secretase (bace) |
| NZ595499A (en) | 2006-02-10 | 2013-05-31 | Verenium Corp | Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8043839B2 (en) | 2006-02-14 | 2011-10-25 | Verenium Corporation | Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| CN101400349A (zh) * | 2006-03-01 | 2009-04-01 | 罗斯坎普研究有限责任公司 | 抑制β-淀粉样蛋白产生的化合物 |
| CN101437954B (zh) | 2006-03-07 | 2015-09-09 | 嘉吉公司 | 醛缩酶和编码醛缩酶的核酸以及它们的制备和使用方法 |
| EA029538B1 (ru) | 2006-03-07 | 2018-04-30 | Басф Энзаймс Ллк | Полипептид, обладающий активностью альдолазы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способы получения и применения полинуклеотида и полипептида |
| US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
| BRPI0714876B1 (pt) | 2006-08-04 | 2022-04-19 | Verenium Corporation | Ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula bacteriana, fúngica ou de levedura transformada, polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante, composição, bem como métodos de produção e de usos dos mesmos |
| US8454948B2 (en) | 2006-09-14 | 2013-06-04 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Long lasting drug formulations |
| EP2061515A4 (en) | 2006-09-14 | 2013-01-30 | Medgenics Medical Israel Ltd | LONG-TERM MEDICINAL FORMULATIONS |
| EP2617814B1 (en) | 2006-09-21 | 2015-11-18 | BASF Enzymes LLC | Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| WO2008036863A2 (en) | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Verenium Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| SG10201502642TA (en) | 2006-10-12 | 2015-05-28 | Bhi Ltd Partnership | Methods, Compounds, Compositions And Vehicles For Delivering 3-Amino-1-Propanesulfonic Acid |
| WO2008070284A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-06-12 | Johnnie B. Byrd, Sr. Alzheimer's Center And Research Institute | Amyloid beta peptides and methods of uses thereof |
| US20100119599A1 (en) * | 2006-12-08 | 2010-05-13 | Archer Pharmaceuticals, Inc. | Polyhydroquinoline compounds and dihydropyridine compounds for inhibiting beta-amyloid production |
| EP2479266B1 (en) | 2006-12-21 | 2016-03-09 | BASF Enzymes LLC | Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US7618944B2 (en) * | 2007-03-01 | 2009-11-17 | Intezyne Technologies, Inc. | Encapsulated amyloid-beta peptides |
| EP2134863B1 (en) | 2007-03-13 | 2014-05-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Genetic alterations on chromosome 16 and methods of use thereof for the diagnosis of type 1 diabetes |
| US7943590B2 (en) * | 2007-03-16 | 2011-05-17 | Multi-Gene Vascular Systems Ltd. | Compositions and methods for treating ophthalmic disorders |
| CA2682093A1 (en) | 2007-03-29 | 2008-10-09 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Antibodies, methods and kits for diagnosing and treating melanoma |
| US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
| KR20100016661A (ko) * | 2007-04-18 | 2010-02-12 | 얀센 알츠하이머 이뮤노테라피 | 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 예방 및 치료 |
| JP5450407B2 (ja) | 2007-07-06 | 2014-03-26 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 置換アミノ−キナゾリノン、前記化合物を含む薬物、それらの使用及び製造方法 |
| EP2182983B1 (en) | 2007-07-27 | 2014-05-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases with humanised anti-abeta antibodies |
| NZ583799A (en) * | 2007-09-12 | 2011-12-22 | Probiodrug Ag | Transgenic mice comprising a DNA transgene encoding ABeta peptide |
| EP2205744B1 (en) | 2007-10-03 | 2015-01-14 | BP Corporation North America Inc. | Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| JO3076B1 (ar) * | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| CA2739011A1 (en) * | 2007-10-29 | 2009-05-07 | The Regents Of The University Of California | Osteoarthritis gene therapy |
| JP5563990B2 (ja) | 2008-01-03 | 2014-07-30 | ヴェレニウム コーポレイション | トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼ、それらをコードする核酸並びにそれらを製造および使用する方法 |
| CA2710922A1 (en) | 2008-01-03 | 2009-07-16 | Verenium Corporation | Isomerases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| NZ586831A (en) * | 2008-01-28 | 2012-02-24 | Janssen Pharmaceutica Nv | 6-substituted-thio-2-amino-quinoline derivatives useful as inhibitors of beta-secretase (bace) |
| TW200936156A (en) | 2008-01-28 | 2009-09-01 | Novartis Ag | Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides |
| US8420088B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-04-16 | Novartis Ag | Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides |
| NZ586830A (en) * | 2008-01-29 | 2012-02-24 | Janssen Pharmaceutica Nv | 2-amino-quinoline derivatives useful as inhibitors of beta-secretase (bace) |
| AU2009215441B2 (en) | 2008-02-19 | 2015-07-02 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Identification of pediatric onset inflammatory bowel disease loci and methods of use thereof for the diagnosis and treatment of the same |
| WO2009140679A2 (en) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Genetic alterations on chromosomes 21q, 6q and 15q and methods of use thereof for the diagnosis and treatment of type i diabetes |
| US8153391B2 (en) | 2008-08-29 | 2012-04-10 | Bunge Oils, Inc. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8198062B2 (en) | 2008-08-29 | 2012-06-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8357503B2 (en) | 2008-08-29 | 2013-01-22 | Bunge Oils, Inc. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| MX347112B (es) | 2008-09-15 | 2017-04-12 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para regular osmolaridad celular. |
| US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
| US9695403B2 (en) | 2009-05-21 | 2017-07-04 | Syngenta Participations Ag | Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8324450B2 (en) | 2009-06-02 | 2012-12-04 | Academia Sinica | Non-human animal model for frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions (FTLD-U) |
| UA111708C2 (uk) | 2009-10-16 | 2016-06-10 | Бандж Ойлз, Інк. | Спосіб рафінування олії |
| UA109884C2 (uk) | 2009-10-16 | 2015-10-26 | Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування | |
| EP2582396A4 (en) | 2010-06-15 | 2014-01-01 | Medgenics Medical Israel Ltd | REMEDY FORMULATIONS WITH LONG-TERM EFFECT |
| MX353096B (es) | 2010-08-19 | 2017-12-19 | Buck Institute For Age Res Star | Metodos para tratar el deterioro cognitivo leve (mci) y trastornos relacionados. |
| WO2013027191A1 (en) | 2011-08-25 | 2013-02-28 | Novartis Ag | Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides |
| WO2013090356A2 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
| JP6482458B2 (ja) | 2012-03-19 | 2019-03-13 | バック・インスティテュート・フォー・リサーチ・オン・エイジング | Ａｐｐ特異性のｂａｃｅ（ａｓｂｉ）およびその使用 |
| AU2014216390B2 (en) | 2013-02-12 | 2018-05-10 | Buck Institute For Research On Aging | Hydantoins that modulate BACE-mediated APP processing |
| JP6621747B2 (ja) | 2013-08-14 | 2019-12-18 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 疼痛を制御するための組成物及び方法 |
| EP3060144A1 (en) | 2013-10-24 | 2016-08-31 | Medgenics Medical Israel, Ltd | Micro-organs providing sustained delivery of a therapeutic polypeptide and methods of use thereof |
| ES2725951T3 (es) | 2014-03-28 | 2019-09-30 | Univ Leland Stanford Junior | Proteínas de canales aniónicos activadas por la luz modificadas por ingeniería genética y métodos de uso de las mismas |
| KR101890978B1 (ko) | 2014-06-17 | 2018-08-24 | 서울대학교산학협력단 | 알츠하이머 질환 모델용 형질전환 돼지 및 이의 용도 |
| US10704098B2 (en) | 2014-10-29 | 2020-07-07 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Diagnosis and treatment of genetic alterations associated with eosinophilic esophagitis |
| EP3227319B1 (en) | 2014-12-04 | 2019-11-27 | Novartis AG | Methods and compositions using klotho variant polypeptides |
| EP3730188A1 (en) | 2015-08-21 | 2020-10-28 | The Children's Hospital of Philadelphia | Compositions and methods for use in combination for the treatment and diagnosis of autoimmune diseases |
| JP2018525447A (ja) | 2015-08-27 | 2018-09-06 | ナントネウロ，エルエルシー | Ａｐｐ選択的ｂａｃｅ阻害のための組成物およびそのための使用 |
| US10667691B2 (en) | 2015-08-31 | 2020-06-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compressed sensing high resolution functional magnetic resonance imaging |
| KR20180090876A (ko) | 2015-12-09 | 2018-08-13 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 기능적 뇌 회로 분석법 |
| JP6987062B2 (ja) | 2016-02-01 | 2021-12-22 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 機能の画像データを解析するための方法及びシステム |
| JP7027341B2 (ja) | 2016-05-12 | 2022-03-01 | バック・インスティテュート・フォー・リサーチ・オン・エイジング | Ａｐｐの正常なプロセシングを促進する化合物 |
| IL265486A (en) | 2019-03-19 | 2020-09-30 | Yeda Res & Dev | Bistable type ii opsins and uses thereof |
| CN116832146B (zh) * | 2023-06-30 | 2024-02-13 | 广东暨安特博生物科技有限公司 | Il-27蛋白在制备治疗阿尔茨海默症的产品的应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989006689A1 (en) * | 1988-01-13 | 1989-07-27 | The Mclean Hospital Corporation | Genetic constructs containing the alzheimer brain amyloid gene |
| AU3055889A (en) * | 1988-01-13 | 1989-08-11 | Mclean Hospital Corporation, The | Genetic sequences coding for alzheimer amyloid from brain |
| EP0451700A1 (en) * | 1990-04-10 | 1991-10-16 | Miles Inc. | Recombinant APP minigenes for expression in transgenic mice as models for Alzheimers's disease |
| JPH06502071A (ja) * | 1990-09-28 | 1994-03-10 | ジ・アップジョン・カンパニー | アルツハイマーのアミロイド前駆遺伝子を有するトランスジェニック動物 |
| US5672805A (en) * | 1991-07-18 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of California | Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein |
-
1991
- 1991-06-17 CA CA002085127A patent/CA2085127C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-17 US US07/716,725 patent/US5387742A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-17 AU AU82102/91A patent/AU646877B2/en not_active Expired
- 1991-06-17 WO PCT/US1991/004447 patent/WO1991019810A1/en active IP Right Grant
- 1991-06-17 EP EP91912653A patent/EP0647268B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-17 AT AT91912653T patent/ATE260974T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-17 JP JP3511791A patent/JPH06507782A/ja active Pending
- 1991-06-17 ES ES91912653T patent/ES2217250T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-17 DE DE69133372T patent/DE69133372T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5387742A (en) | 1995-02-07 |
| DE69133372T2 (de) | 2005-02-24 |
| CA2085127A1 (en) | 1991-12-16 |
| AU8210291A (en) | 1992-01-07 |
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| EP0647268A1 (en) | 1995-04-12 |
| JPH06507782A (ja) | 1994-09-08 |
| ATE260974T1 (de) | 2004-03-15 |
| AU646877B2 (en) | 1994-03-10 |
| DE69133372D1 (de) | 2004-04-08 |
| EP0647268A4 (en) | 1993-05-27 |
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