ES2713024T3

ES2713024T3 - Amilasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su fabricación y uso

Info

Publication number: ES2713024T3
Application number: ES15196988T
Authority: ES
Inventors: Carl Miller; Nelson Barton; Janne S Kerovuo; Toby Richardson; Kevin Gray; Matgorzata Slupska; Gerhard Frey; Walter Callen; Eileen O'donoghue
Original assignee: BASF Enzymes LLC
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 2003-03-06
Filing date: 2004-03-08
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2024-03-08
Also published as: EP2194133A3; JP2015164421A; EP2194133A2; JP2017006131A; CN104388449A; EP3023498B1; EP3508578A1; ZA200508046B; PL3023498T3; EP2194133B1; JP2013236628A; JP6177580B2; DK2194133T3; JP6396371B2; CN102618564A; EP3023498A1; CA2920416A1; JP6208163B2; CN102618564B

Abstract

Un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 617, en la que el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de glucano alfa maltotetrahidrolasa.

Description

DESCRIPCION

Amilasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para su fabricacion y uso

Campo tecnico

Esta invencion se relaciona con la biologia molecular y celular y la bioquimica. En un aspecto, la invencion esta dirigida a polipeptidos que tienen actividad de glucano alfa maltotetrahidrolasa, polinucleotidos que codifican los polipeptidos y metodos para preparar y usar estos polinucleotidos y polipeptidos. En un aspecto, los polipeptidos de la divulgacion se pueden usar como amilasas para catalizar la hidrolisis del almidon en azucares. En un aspecto, la divulgacion esta dirigida a polipeptidos que tienen actividad de amilasa termoestable. En un aspecto, los polipeptidos de la divulgacion se pueden usar como amilasas para catalizar la hidrolisis del almidon en azucares, tales como glucosa. La divulgacion tambien se dirige a constructos y vectores de acido nucleico, que comprenden las secuencias de acido nucleico de la invencion, asi como a metodos recombinantes para producir los polipeptidos de la invencion. La divulgacion tambien se refiere al uso de las amilasas de la invencion en los procesos de conversion de almidon, incluida la produccion de jarabe de maiz con alto contenido de fructosa (HFCS), etanol, dextrosa y jarabes de dextrosa.

Antecedentes

El almidon es un carbohidrato complejo que se encuentra a menudo en la dieta humana. La estructura del almidon es de polimeros de glucosa unidos por enlaces a-1,4 y a-1,6 glucosidicos. La amilasa es una enzima que cataliza la hidrolisis de los almidones en azucares. Las amilasas hidrolizan los enlaces a-1,4-glucosidicos internos en el almidon, en gran parte al azar, para producir maltodextrinas de peso molecular mas pequeno. La descomposicion del almidon es importante en el sistema digestivo y comercialmente. Las amilasas tienen un valor comercial considerable, y se utilizan en las etapas iniciales (licuefaccion) del procesamiento del almidon; en la molienda del maiz en humedo; en la produccion de alcohol; como agentes de limpieza en matrices de detergentes; en la industria textil para el desencolado del almidon; en aplicaciones de coccion; en la industria de las bebidas; en campos petroleros en procesos de perforacion; en entintado de papel reciclado; y en la alimentacion animal.

Las amilasas son producidas por una amplia variedad de microorganismos, incluyendo Bacillus y Aspergillus, y la mayoria de las amilasas comerciales se producen a partir de fuentes bacterianas tales como Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, o Bacillus stearothermophilus. En los ultimos anos, las enzimas en uso comercial han sido las de Bacillus licheniformis debido a su estabilidad termica y rendimiento, al menos a pH neutros y ligeramente alcalinos.

Comercialmente, las glucoamilasas se utilizan ademas para hidrolizar aun mas la maicena, que ya se ha hidrolizado parcialmente con una alfa-amilasa. La glucosa producida en esta reaccion puede convertirse luego en una mezcla de glucosa y fructosa mediante una enzima glucosa isomerasa. Esta mezcla, o una enriquecida con fructosa, es el jarabe de maiz con alto contenido de fructosa que se comercializa en todo el mundo. En general, el procesamiento de almidon en fructosa consta de cuatro etapas: licuefaccion del almidon granulado, sacarificacion del almidon licuado en dextrosa, purificacion e isomerizacion en fructosa. El objetivo de un proceso de licuefaccion de almidon es convertir una suspension concentrada de granulos de polimero de almidon en una solucion de dextrinas solubles de cadena mas corta de baja viscosidad.

La glucoamilasa mas utilizada se produce a partir del hongo Aspergillus niger. Uno de los problemas con el uso comercial de esta enzima es su relativamente baja termoestabilidad. Se han descrito otras glucoamilasas fungicas, entre ellas Rizopus, Thielavia, Thermoascus y Thalaromyces, y una glucoamilasa del hongo termofilo Thermomyces lanuginosus.

En general, el procesamiento de almidon en fructosa consta de cuatro etapas: licuefaccion de almidon granulado, sacarificacion del almidon licuado en dextrosa, purificacion e isomerizacion en fructosa. El objetivo de un proceso de licuefaccion de almidon es convertir una suspension concentrada de granulos de polimero de almidon en una solucion de dextrinas solubles de cadena mas corta de baja viscosidad. Este paso es esencial para un manejo conveniente con equipo estandar y para una conversion eficiente a glucosa u otros azucares. Para licuar el almidon granulado, es necesario gelatinizar los granulos elevando la temperatura del almidon granulado a mas de aproximadamente 72°C. El proceso de calentamiento rompe instantaneamente los granulos de almidon insoluble para producir una solucion de almidon soluble en agua. La solucion de almidon solubilizada se licua luego con amilasa. Un granulo de almidon se compone de: 69-74% de amilopectina, 26-31% de amilosa, 11-14% de agua, 0,2-0,4% de proteinas, 0,5-0,9% de lipidos, 0,05-0,1% de cenizas, 0,02-0,03% de fosforo, 0,1% de pentosano. Aproximadamente el 70% de un granulo es amorfo y el 30% es cristalino.

Un proceso de licuefaccion enzimatica comun implica ajustar el pH de una suspension de almidon granulado entre 6,0 y 6,5, el pH optimo de alfa-amilasa derivado de Bacillus licheniformis, con la adicion de hidroxido de calcio, hidroxido de sodio o carbonato de sodio. La adicion de hidroxido de calcio tiene la ventaja de que tambien proporciona iones de calcio que se sabe que estabilizan la alfa-amilasa contra la inactivacion. Tras la adicion de alfa-amilasa, la suspension se bombea a traves de un chorro de vapor para elevar instantaneamente la temperatura entre 80°C y 115°C. El almidon se gelatiniza inmediatamente y, debido a la presencia de alfa-amilasa, se despolimeriza por hidrolisis aleatoria de enlaces glicosidicos (1 -4) por la alfa-amilasa hasta una masa fluida que se bombea facilmente.

En una segunda variacion del proceso de licuefaccion, se agrega alfa-amilasa a la suspension de almidon, la suspension se mantiene a una temperatura de 80-100°C para hidrolizar parcialmente los granulos de almidon, y la suspension de almidon parcialmente hidrolizada se bombea a traves de un chorro a temperaturas superiores a 105°C para gelatinizar completamente cualquier estructura granulada restante. Despues de enfriar el almidon gelatinizado, se puede hacer una segunda adicion de alfa-amilasa para hidrolizar aun mas el almidon.

Una tercera variacion de este proceso se denomina proceso de molienda en seco. En la molienda en seco, el grano entero se muele y se combina con agua. El germen se elimina opcionalmente mediante separacion por flotacion o tecnicas equivalentes. La mezcla resultante, que contiene almidon, fibra, proteina y otros componentes del grano, se licua utilizando alfa-amilasa. La practica general en la tecnica es llevar a cabo la licuefaccion enzimatica a una temperatura mas baja cuando se utiliza el proceso de molienda en seco. En general, se cree que la licuefaccion a baja temperatura es menos eficiente que la licuefaccion a alta temperatura para convertir el almidon en dextrinas solubles.

Tipicamente, despues de la gelatinizacion, la solucion de almidon se mantiene a una temperatura elevada en presencia de alfa-amilasa hasta que se alcanza un DE de 10-20, generalmente un periodo de 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es el estandar de la industria para medir la concentracion de azucares reductores totales, calculada como D-glucosa con base en el peso seco. El almidon granulado no hidrolizado tiene un DE de practicamente cero, mientras que el DE de D-glucosa se define como 100.

La molienda humeda de maiz es un proceso que produce aceite de maiz, harina de gluten, pienso de gluten y almidon. La amilasa alcalina se usa en la licuefaccion del almidon y la glucoamilasa se usa en la sacarificacion, produciendo glucosa. El maiz, cuyo grano consiste en una cubierta de semilla externa (fibra), almidon, una combinacion de almidon y glucosa y el germen interno, se somete a un proceso de cuatro pasos, que resulta en la produccion de almidon. El maiz se remoja, se despoja del germen, se despoja de la fibra, y finalmente se separa el gluten. En el proceso de remojo, los solubles se eliminan. El producto restante despues de la eliminacion de los solubles se despoja del germen, dando como resultado la produccion de aceite de maiz y la produccion de una torta, que se agrega a los solubles de la etapa de remojo. El producto restante se despoja de la fibra y los solidos de fibra se agregan a la mezcla de la torta/solubles. Esta mezcla de solidos de fibra, torta y solubles forma un pienso de gluten. Despues de la separacion de la fibra, el producto restante se somete a la separacion del gluten. Esta separacion da como resultado una harina de gluten y almidon. El almidon se somete luego a licuefaccion y sacarificacion para producir glucosa.

El envejecimiento de productos horneados (como el pan) ha sido reconocido como un problema que se agrava a medida que pasa mas tiempo entre el momento de la preparacion del producto de panaderia y el momento del consumo. El termino envejecimiento se usa para describir cambios no deseados para el consumidor en las propiedades del producto de panaderia despues de dejar el horno, tal como un aumento de la firmeza de la miga, una disminucion de la elasticidad de la miga y cambios en la corteza, que se vuelve resistente y correosa. La firmeza de la miga de pan aumenta aun mas durante el almacenamiento hasta un nivel, que se considera negativo. El aumento de la firmeza de la miga, que se considera como el aspecto mas importante del envejecimiento, es reconocido por el consumidor mucho tiempo antes de que el producto de panaderia se haya vuelto inadecuado para el consumo.

Existe una necesidad en la industria para la identificacion y optimizacion de amilasas, utiles para diversos usos, incluyendo procesos comerciales de licuefaccion de la maicena. Estas amilasas acidas de segunda generacion ofreceran caracteristicas mejoradas de fabricacion y/o rendimiento sobre las enzimas estandar de la industria de Bacillus licheniformis, por ejemplo.

Tambien es necesario identificar y optimizar las amilasas que tienen utilidad en productos de lavado automatico de platos (ADW) y detergentes para ropa. En los productos ADW, la amilasa funcionara a pH 10-11 y a 45-60°C en presencia de quelantes de calcio y condiciones oxidativas. Para el lavado de ropa, se requerira actividad a pH 9-10 y 40°C en la matriz de detergente adecuada. Las amilasas tambien son utiles en procesos de desencolado de textiles, elaboracion de cerveza, modificacion de almidon en la industria del papel y la pulpa y otros procesos descritos en la tecnica.

Las amilasas se pueden usar comercialmente en las etapas iniciales (licuefaccion) del procesamiento de almidon; en molienda de maiz humedo; en la produccion de alcohol; como agentes de limpieza en matrices de detergentes; en la industria textil para el desencolado de almidon; en aplicaciones de coccion; en la industria de las bebidas; en campos petroleros en procesos de perforacion; en entintado de papel reciclado y en pienso animal. Las amilasas tambien son utiles en los procesos de desencolado de textiles, elaboracion de cerveza, modificacion de almidon en la industria del papel y la pulpa y otros procesos.

Las publicaciones discutidas en este documento se proporcionan unicamente para su divulgacion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admision de que la invencion no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgacion en virtud de la invencion anterior.

Resumen

La invencion proporciona acidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de acido nucleico que tiene al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el acido nucleico de la invencion. En un aspecto, el acido nucleico codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, y las identidades de secuencia se determinan mediante analisis con un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante una inspeccion visual. En otro aspecto, la divulgacion proporciona acidos nucleicos para su uso como sondas, moleculas inhibidoras (por ejemplo, antisentido, iARN), regulacion transcripcional o traduccional, y similares. Los acidos nucleicos de la invencion incluyen acidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de acido nucleico como se expone en la SEQ ID NO: 617. Los acidos nucleicos de la invencion tambien incluyen acidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican un polipeptido de la invencion que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 618 y sus subsecuencias y variantes, y polipeptidos que tienen al menos aproximadamente el 90% (o mas, como se describe a continuacion) de identidad de secuencia con el polipeptido de la invencion. En un aspecto, el polipeptido tiene una actividad de glucano alfa maltotetrahidrolasa. En un aspecto, el polipeptido actua como un inmunogeno o epitopo.

En un aspecto, la divulgacion tambien proporciona acidos nucleicos que codifican amilasa con una novedad comun en que se derivan de cultivos mixtos. La divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican amilasa aislados de cultivos mixtos que comprenden una secuencia de acido nucleico que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o identidad de secuencia completa (100%) con un ejemplo de acido nucleico de la invencion en una region de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,

65, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o mas, en donde el acido nucleico codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de amilasa y las identidades de secuencia se determinan mediante analisis con un algoritmo de comparacion de secuencia o mediante una inspeccion visual. En un aspecto, la divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican amilasa aislados de cultivos mixtos que comprenden un acido nucleico de la invencion.

En un aspecto, la divulgacion tambien proporciona acidos nucleicos que codifican amilasa con una novedad comun en que se derivan de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas. En un aspecto, la divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican amilasa aislados de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas, que comprenden una secuencia de acido nucleico que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, , 72%, , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o una identidad de secuencia completa (100%) con un ejemplo de acido nucleico sobre una region de al menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,

650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o mas, en donde el acido nucleico codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, y las identidades de secuencia se determinan mediante analisis con un algoritmo de comparacion de secuencias o por una inspeccion visual. En un aspecto, la divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican amilasa aislados de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas, que comprenden un acido nucleico de la invencion. En un aspecto, la divulgacion tambien proporciona amilasas y acidos nucleicos que codifican amilasa, con una novedad comun en que se derivan de fuentes arqueas, incluidas las amilasas derivadas de arqueas. En un aspecto, el algoritmo de comparacion de secuencias es un algoritmo BLAST version 2.2.2, donde una configuracion de filtrado se expone en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las demas opciones se configuran en los valores predeterminados.

Otro aspecto de la divulgacion es un acido nucleico aislado o recombinante que incluye al menos 10 bases consecutivas de una secuencia de acido nucleico de la invencion, secuencias sustancialmente identicas a las mismas, y las secuencias complementarias a las mismas.

En un aspecto, la actividad de amilasa comprende actividad de a-amilasa, que incluye la capacidad de hidrolizar enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en almidon para producir maltodextrinas de peso molecular mas pequeno. En un aspecto, la actividad de la a-amilasa incluye la hidrolisis de enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en el almidon al azar. La actividad de amilasa puede comprender una actividad de a-amilasa, una actividad de p-amilasa, una actividad de glucoamilasa, una actividad de 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa, una actividad de exoamilasa, una actividad de glucano a-maltotetrahidrolasa, una actividad de maltasa, una actividad de la isomaltasa, una actividad de glucano 1,4,-a-glucosidasa, una actividad de a-glucosidasa, una actividad de sucrasa o una actividad de agarasa (por ejemplo, una actividad de p-agarasa).

La actividad de amilasa puede comprender hidrolizar enlaces glucosidicos. En un aspecto, los enlaces glucosidicos comprenden un enlace a-1,4-glucosidico. En otro aspecto, los enlaces glucosidicos comprenden un enlace a-1,6-glucosidico. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende hidrolizar enlaces glucosidicos en almidon, por ejemplo, almidon licuado. La actividad de amilasa puede comprender ademas hidrolizar enlaces glucosidicos en maltodextrinas.

En un aspecto, la actividad de amilasa comprende escindir una maltosa o una unidad de D-glucosa del extremo no reductor del almidon.

En un aspecto, el acido nucleico aislado o recombinante codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa que es termoestable. El polipeptido puede retener una actividad de amilasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 37°C, o entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C o mas, por ejemplo, 98°C, 100°C o mas; entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 95°C, o entre aproximadamente 90°C y aproximadamente

952C. Por ejemplo, el ejemplo de polipeptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 437 es termoestable, reteniendo el 50% de la actividad despues de 25 minutos a 100°C en ausencia de calcio agregado.

En otro aspecto, el acido nucleico aislado o recombinante codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa que es termotolerante. El polipeptido puede retener una actividad de amilasa despues de la exposicion a una temperatura en el intervalo de mas de 37°C a aproximadamente 95°C o en cualquier parte del intervalo de mas de 55°C a aproximadamente 85°C. En un aspecto, el polipeptido retiene una actividad de amilasa despues de la exposicion a una temperatura en el intervalo de mas de 90°C a aproximadamente 95°C a pH 4,5.

La divulgacion proporciona acidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con un acido nucleico de la invencion, SEQ ID NO: 617. En un aspecto, las condiciones rigurosas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 65°C durante aproximadamente 15 minutos.

La divulgacion proporciona una sonda de acido nucleico para identificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en donde la sonda comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas, bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invencion, o fragmentos o subsecuencias de la misma, en donde la sonda identifica el acido nucleico mediante union o hibridacion. La sonda puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 30 a 70, aproximadamente 40 a 80, o aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invencion, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

La divulgacion proporciona una sonda de acido nucleico para identificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en donde la sonda comprende un acido nucleico que comprende una secuencia de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas residuos que tengan al menos aproximadamente el 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o la identidad de secuencia completa (100%) con un acido nucleico de la invencion, en donde las identidades de secuencia se determinan mediante analisis con un algoritmo de comparacion de secuencias o inspeccion visual.

La sonda puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 30 a 70, aproximadamente 40 a 80, o aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia de acido nucleico de la invencion, o una subsecuencia de los mismos.

La divulgacion proporciona un par de secuencias de cebadores de amplificacion para amplificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en el que el par cebador es capaz de amplificar un acido nucleico que comprende una secuencia de la divulgacion, o fragmentos o subsecuencias de las misma. Uno o cada miembro del par de secuencias de cebadores de amplificacion puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia.

La divulgacion proporciona metodos para amplificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa que comprende la amplificacion de un acido nucleico plantilla con un par de secuencia de cebador de amplificacion capaz de amplificar una secuencia de acido nucleico de la divulgacion, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

La invencion proporciona casetes de expresion que comprenden un acido nucleico de la invencion. En un aspecto, el casete de expresion puede comprender el acido nucleico que esta unido operativamente a un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, de mamifero o vegetal. En un aspecto, el promotor vegetal puede ser un promotor de patata, arroz, maiz, trigo, tabaco o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor especifico de tejido o un promotor regulado por el medio ambiente o un promotor regulado por el desarrollo. Por lo tanto, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor especifico de la semilla, especifico de la hoja, especifico de la raiz, especifico del tallo o inducido por la abscision. En un aspecto, el casete de expresion puede comprender ademas un vector de expresion de planta o de virus de planta.

La divulgacion proporciona vehiculos de clonacion que comprenden un casete de expresion (por ejemplo, un vector) de la invencion o un acido nucleico de la invencion. El vehiculo de clonacion puede ser un vector viral, un plasmido, un fago, un fagemido, un cosmido, un fosmido, un bacteriofago o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adenoasociado. El vehiculo de clonacion puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plasmido, un vector derivado de bacteriofagos PI (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC) o un cromosoma artificial de mamifero (MAC).

La divulgacion proporciona una celula huesped transformada que comprende un acido nucleico de la invencion o un casete de expresion (por ejemplo, un vector) de la invencion, o un vehiculo de clonacion de la divulgacion. En un aspecto, la celula transformada puede ser una celula bacteriana, una celula de mamifero, una celula fungica, una celula de levadura, una celula de insecto o una celula vegetal. En un aspecto, la celula vegetal puede ser una celula de patata, trigo, arroz, maiz, tabaco o cebada.

La divulgacion proporciona animales transgenicos no humanos que comprenden un acido nucleico de la invencion o un casete de expresion (por ejemplo, un vector) de la invencion. En un aspecto, el animal es un raton.

La divulgacion proporciona plantas transgenicas que comprenden un acido nucleico de la invencion o un casete de expresion (por ejemplo, un vector) de la invencion. La planta transgenica puede ser una planta de maiz, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada o una planta de tabaco.

La divulgacion proporciona semillas transgenicas que comprenden un acido nucleico de la invencion o un casete de expresion (por ejemplo, un vector) de la invencion. La semilla transgenica puede ser una semilla de maiz, una semilla de trigo, una semilla oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de soja, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de sesamo, una semilla de cacahuete o una semilla de una planta de tabaco.

La divulgacion proporciona un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia de acido nucleico complementaria o capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un acido nucleico de la divulgacion. La divulgacion proporciona metodos para inhibir la traduccion de un mensaje de amilasa en una celula que comprende administrar a la celula o expresar en la celula un oligonucleotido antisentido que comprende una secuencia de acido nucleico complementaria o capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un acido nucleico de la divulgacion.

La invencion proporciona un polipeptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o identidad de secuencia completa (100%) con un ejemplo de polipeptido de la invencion. Las secuencias de polipeptidos de la invencion incluyen la SEQ ID NO: 618. Los ejemplos de secuencias polipeptidicas de la invencion incluyen secuencias codificadas por un acido nucleico de la invencion. Los ejemplos de secuencias de polipeptidos de la divulgacion incluyen polipeptidos unidos especificamente por un anticuerpo de la divulgacion. En un aspecto, un polipeptido de la invencion tiene actividad de glucano alfa maltotetrahidrolasa.

Otro aspecto de la divulgacion es un polipeptido o peptido aislado o recombinante que incluye al menos 10 bases consecutivas de un polipeptido de la invencion, secuencias sustancialmente identicas a las mismas, y las secuencias complementarias a las mismas.

En un aspecto, la actividad de amilasa de un polipeptido de la divulgacion comprende una actividad de a-amilasa, que incluye la capacidad de hidrolizar enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en almidon para producir maltodextrinas de peso molecular mas pequeno. En un aspecto, la actividad de la a-amilasa incluye la hidrolisis de enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en el almidon al azar. La actividad de amilasa puede comprender una actividad de glucoamilasa, una actividad de 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa, una actividad de a-amilasa, una actividad de exoamilasa o una actividad de p-amilasa. La actividad de amilasa puede comprender hidrolizar enlaces glucosidicos. En un aspecto, los enlaces glucosidicos comprenden un enlace a-1,4-glucosidico. En otro aspecto, los enlaces glucosidicos comprenden un enlace a-1,6-glucosidico. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende hidrolizar enlaces glucosidicos en almidon, por ejemplo, almidon licuado. La actividad de amilasa puede comprender ademas hidrolizar enlaces glucosidicos en maltodextrinas. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende escindir una maltosa o una unidad de D-glucosa del extremo no reductor del almidon.

En un aspecto, la actividad de amilasa de la divulgacion comprende una actividad de glucoamilasa, que puede comprender la catalisis de la hidrolisis de los enlaces glucosidicos. La actividad glucoamilasa de la divulgacion puede comprender catalizar la liberacion hidrolitica por etapas de D-glucosa de los extremos no reductores del almidon u otras dextrinas relacionadas. La actividad de la glucoamilasa puede comprender una actividad de la 1,4-a-D-glucanoglucohidrolasa. La actividad de la glucoamilasa puede comprender la catalisis de la hidrolisis de maltodextrinas que resulta en la generacion de glucosa libre. La actividad glucoamilasa puede comprender una actividad exoamilasa. La actividad glucoamilasa puede comprender una a-amilasa o una p-amilasa. Los enlaces glucosidicos hidrolizados pueden comprender enlaces a-1,4-glucosidicos o enlaces a-1,6-glucosidicos. La actividad de glucoamilasa puede comprender hidrolizar enlaces glucosidicos en un almidon. La actividad de la glucoamilasa puede comprender ademas hidrolizar los enlaces glucosidicos en el almidon para producir maltodextrinas. La actividad de la glucoamilasa puede comprender escindir una maltosa o una unidad de D-glucosa del extremo no reductor del almidon.

En un aspecto, la actividad de la amilasa puede ser termoestable. El polipeptido puede retener una actividad de amilasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura entre aproximadamente 37°C a aproximadamente 95°C, entre aproximadamente 55°C a aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C a aproximadamente 95°C, o entre aproximadamente 90°C a aproximadamente 95°C. En otro aspecto, la actividad de la amilasa puede ser termotolerante. El polipeptido puede retener una actividad de amilasa despues de la exposicion a una temperatura en el intervalo de mas de 37°C a aproximadamente 95°C, o en el intervalo de mas de 55°C a aproximadamente 85°C. En un aspecto, el polipeptido puede retener una actividad de amilasa despues de la exposicion a una temperatura en el intervalo de mas de 90°C a aproximadamente 95°C a pH 4,5.

En un aspecto, el polipeptido aislado o recombinante puede comprender el polipeptido de la invencion que carece de una secuencia senal. En un aspecto, el polipeptido aislado o recombinante puede comprender el polipeptido de la invencion que comprende una secuencia senal heterologa, tal como una secuencia senal de amilasa o no amilasa heterologa.

En un aspecto, la divulgacion proporciona una secuencia senal que comprende un peptido como se muestra en la Tabla 3. En un aspecto, la divulgacion proporciona una secuencia senal que consiste en un peptido como se expone en la Tabla 3. En un aspecto, la divulgacion proporciona proteinas quimericas que comprenden un primer dominio que comprende una secuencia senal de la divulgacion y al menos un segundo dominio. La proteina puede ser una proteina de fusion. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una amilasa (por ejemplo, una amilasa de la invencion, u, otra amilasa).

En un aspecto, la actividad de amilasa comprende una actividad especifica a aproximadamente 37°C en el intervalo de aproximadamente 10 a 10.000, o de 100 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteina. En otro aspecto, la actividad de la amilasa comprende una actividad especifica de aproximadamente 500 a aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteina. Alternativamente, la actividad de amilasa comprende una actividad especifica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteina. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende una actividad especifica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 750 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteina. En otro aspecto, la termotolerancia comprende la retencion de al menos la mitad de la actividad especifica de la amilasa a 37°C despues de ser calentada a la temperatura elevada. Alternativamente, la termotolerancia puede comprender la retencion de actividad especifica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteina despues de ser calentada a la temperatura elevada.

La divulgacion proporciona polipeptidos aislados o recombinantes de la invencion, en los que el polipeptido comprende al menos un sitio de glicosilacion. En un aspecto, la glicosilacion puede ser una glicosilacion ligada a N. En un aspecto, el polipeptido puede estar glicosilado despues de expresarse en una P. pastoris o una S. pombe. La divulgacion tambien proporciona metodos para agregar glicosilacion a un polipeptido, ya sea postraduccionalmente o quimicamente, para cambiar la propiedad de los polipeptidos, por ejemplo, su estabilidad termica, solubilidad, tendencia a la agregacion, y similares.

En un aspecto, el polipeptido de la divulgacion puede retener una actividad de amilasa en condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4. En otro aspecto, el polipeptido puede retener una actividad de amilasa bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11.

La divulgacion proporciona preparaciones de proteina que comprenden un polipeptido de la invencion, en donde la preparacion de proteina comprende un liquido, un solido o un gel.

La divulgacion proporciona heterodimeros que comprenden un polipeptido de la invencion y un segundo dominio. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipeptido y el heterodimero puede ser una proteina de fusion. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epitopo o una etiqueta. En un aspecto, la divulgacion proporciona homodimeros que comprenden un polipeptido de la invencion.

La divulgacion proporciona polipeptidos inmovilizados que tienen una actividad de amilasa, en donde el polipeptido comprende un polipeptido de la invencion, un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion, o un polipeptido que comprende un polipeptido de la invencion y un segundo dominio. En un aspecto, el polipeptido puede inmovilizarse en una celula, un metal, una resina, un polimero, una ceramica, un vidrio, un microelectrodo, una particula grafitica, una perla, un gel, una placa, una matriz o un tubo capilar.

La divulgacion proporciona matrices que comprenden un acido nucleico inmovilizado de la invencion. La divulgacion proporciona matrices que comprenden un anticuerpo de la divulgacion.

La divulgacion proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen especificamente a un polipeptido de la invencion o a un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. La divulgacion proporciona hibridomas que comprenden un anticuerpo de la divulgacion, por ejemplo, un anticuerpo que se une especificamente a un polipeptido de la invencion o a un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion.

La divulgacion proporciona complementos alimenticios para un animal que comprende un polipeptido de la invencion, por ejemplo, un polipeptido codificado por el acido nucleico de la invencion. En un aspecto, el polipeptido en el suplemento alimenticio puede estar glicosilado. La divulgacion proporciona matrices de suministro de enzimas comestibles que comprenden un polipeptido de la invencion, por ejemplo, un polipeptido codificado por el acido nucleico de la invencion. En un aspecto, la matriz de suministro comprende un pellet. En un aspecto, el polipeptido puede estar glicosilado. En un aspecto, la actividad de la amilasa es termotolerante. En otro aspecto, la actividad de amilasa es termoestable.

La divulgacion proporciona un metodo para aislar o identificar un polipeptido que tiene una actividad de amilasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar un anticuerpo de la invencion; (b) proporcionar una muestra que comprende polipeptidos; y (c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) en condiciones en las que el anticuerpo puede unirse especificamente al polipeptido, aislando o identificando asi un polipeptido que tiene una actividad de amilasa.

La divulgacion proporciona metodos para elaborar un anticuerpo anti-amilasa que comprende administrar a un animal no humano un acido nucleico de la invencion o un polipeptido de la invencion o sus subsecuencias en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, elaborando asi un anticuerpo anti-amilasa. La divulgacion proporciona metodos para elaborar una anti-amilasa inmune que comprenden administrar a un animal no humano un acido nucleico de la invencion o un polipeptido de la invencion o sus subsecuencias en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria.

La invencion proporciona metodos para producir un polipeptido recombinante que comprende las etapas de: (a) proporcionar un acido nucleico de la invencion unido operativamente a un promotor; y (b) expresar el acido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresion del polipeptido, produciendo asi un polipeptido recombinante. En un aspecto, el metodo puede comprender ademas transformar una celula huesped con el acido nucleico de la etapa (a) seguido de la expresion del acido nucleico de la etapa (a), produciendo asi un polipeptido recombinante en una celula transformada.

La divulgacion proporciona metodos para identificar un polipeptido que tiene una actividad de amilasa que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion; (b) proporcionar un sustrato de amilasa; y (c) poner en contacto el polipeptido o un fragmento o variante del mismo de la etapa (a) con el sustrato de la etapa (b) y detectar una disminucion en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reaccion, en donde una disminucion en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reaccion detecta un polipeptido que tiene una actividad de amilasa. En un aspecto, el sustrato puede ser un almidon, por ejemplo, un almidon licuado.

La divulgacion proporciona metodos para identificar un sustrato de amilasa que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion; (b) proporcionar un sustrato de prueba; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con el sustrato de prueba de la etapa (b) y detectar una disminucion en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad de producto de reaccion, en donde una disminucion en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reaccion identifica el sustrato de prueba como un sustrato de amilasa.

La divulgacion proporciona metodos para determinar si un compuesto de prueba se une especificamente a un polipeptido que comprende las siguientes etapas: (a) expresar un acido nucleico o un vector que comprende el acido nucleico en condiciones permisivas para la traduccion del acido nucleico a un polipeptido, en donde el acido nucleico comprende un acido nucleico de la invencion, o, proporcionar un polipeptido de la invencion; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipeptido con el compuesto de ensayo; y (d) determinar si el compuesto de prueba de la etapa (b) se une especificamente al polipeptido.

La divulgacion proporciona metodos para identificar un modulador de una actividad de amilasa que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con el compuesto de prueba de la etapa (b) y medir una actividad de la amilasa, en donde un cambio en la actividad de la amilasa medida en presencia del compuesto de prueba en comparacion con la actividad en ausencia del compuesto de prueba proporciona una determinacion de que el compuesto de prueba modula la actividad de la amilasa. En un aspecto, la actividad de la amilasa puede medirse proporcionando un sustrato de amilasa y detectando una disminucion en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reaccion, o un aumento en la cantidad del sustrato o una disminucion en la cantidad de un producto de reaccion. Una disminucion en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reaccion con el compuesto de prueba en comparacion con la cantidad de sustrato o producto de reaccion sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como un activador de la actividad de amilasa. Un aumento en la cantidad del sustrato o una disminucion en la cantidad del producto de reaccion con el compuesto de prueba en comparacion con la cantidad de sustrato o producto de reaccion sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como un inhibidor de la actividad de la amilasa.

La divulgacion proporciona sistemas informaticos que comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos en el que dicho dispositivo de almacenamiento de datos ha almacenado en el una secuencia polipeptidica o una secuencia de acido nucleico de la invencion (por ejemplo, un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion). En un aspecto, el sistema informatico puede comprender ademas un algoritmo de comparacion de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene al menos una secuencia de referencia almacenada en el mismo. En otro aspecto, el algoritmo de comparacion de secuencias comprende un programa de ordenador que indica polimorfismos. En un aspecto, el sistema informatico puede comprender ademas un identificador que identifica una o mas caracteristicas en dicha secuencia. La divulgacion proporciona medios legibles por ordenador que tienen almacenados en la misma una secuencia polipeptidica o una secuencia de acido nucleico de la invencion. La divulgacion proporciona metodos para identificar una caracteristica en una secuencia que comprende las etapas de: (a) leer la secuencia usando un programa de ordenador que identifica una o mas caracteristicas en una secuencia, en donde la secuencia comprende una secuencia polipeptidica o una secuencia de acido nucleico de invencion; y (b) identificar una o mas caracteristicas en la secuencia con el programa de ordenador. La divulgacion proporciona metodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia que comprende las etapas de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia mediante el uso de un programa informatico que compara secuencias, en donde la primera secuencia comprende una secuencia polipeptidica o una secuencia de acido nucleico de la invencion; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de ordenador. La etapa de determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia puede comprender ademas la etapa de identificar polimorfismos. En un aspecto, el metodo puede comprender ademas un identificador que identifica una o mas caracteristicas en una secuencia. En otro aspecto, el metodo puede comprender leer la primera secuencia usando un programa de ordenador e identificar una o mas caracteristicas en la secuencia.

La divulgacion proporciona metodos para aislar o recuperar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa de una muestra ambiental que comprende las etapas de: (a) proporcionar un par de secuencias de cebadores de amplificacion para amplificar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en la que el par cebador es capaz de amplificar un acido nucleico de la invencion; (b) aislar un acido nucleico de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental de modo que el acido nucleico en la muestra sea accesible para la hibridacion con el par cebador de amplificacion; y, (c) combinar el acido nucleico de la etapa (b) con el par cebador de amplificacion de la etapa (a) y amplificar el acido nucleico de la muestra ambiental, aislando o recuperando asi un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa de una muestra ambiental. Uno o cada miembro del par de secuencias de cebadores de amplificacion puede comprender un oligonucleotido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de una secuencia de la invencion.

La divulgacion proporciona metodos para aislar o recuperar un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa de una muestra ambiental que comprende las etapas de: (a) proporcionar una sonda polinucleotidica que comprende un acido nucleico de la invencion o una subsecuencia de la misma; (b) aislar un acido nucleico de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental de modo que el acido nucleico en la muestra sea accesible para la hibridacion con una sonda polinucleotidica de la etapa (a); (c) combinar el acido nucleico aislado o la muestra ambiental tratada de la etapa (b) con la sonda de polinucleotido de la etapa (a); y (d) aislar un acido nucleico que hibrida especificamente con la sonda polinucleotidica de la etapa (a), aislando asi o recuperando un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa de una muestra ambiental. La muestra ambiental puede comprender una muestra de agua, una muestra liquida, una muestra de suelo, una muestra de aire o una muestra biologica. En un aspecto, la muestra biologica puede derivarse de una celula bacteriana, una celula protozoaria, una celula de insecto, una celula de levadura, una celula vegetal, una celula fungica o una celula de mamifero.

La divulgacion proporciona metodos para generar una variante de un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar un acido nucleico plantilla que comprende un acido nucleico de la invencion; y (b) modificar, eliminar o agregar uno o mas nucleotidos en la secuencia de la plantilla, o una combinacion de los mismos, para generar una variante del acido nucleico de la plantilla. En un aspecto, el metodo puede comprender ademas expresar la variante de acido nucleico para generar una variante de polipeptido de amilasa. Las modificaciones, adiciones o supresiones se pueden introducir mediante un metodo que comprende PCR propensa a errores, transposicion, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblaje, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis de casete, mutagenesis de ensamble recursiva, mutagenesis de ensamble exponencial, mutagenesis especifica del sitio, reensamblaje de genes, mutagenesis de saturacion del sitio del gen (GSSM), reensamblaje de ligacion sintetica (SLR) o una combinacion de los mismos. En otro aspecto, el metodo comprende tratar con agentes mutagenicos el primer acido nucleico de la etapa (a) o variantes mediante un metodo que comprende recombinacion, recombinacion de secuencia recursiva, mutagenesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagenesis de la plantilla que contiene uracilo, mutagenesis duplex con huecos, mutagenesis de reparacion de desajustes puntuales, mutagenesis de la cepa huesped deficiente en la reparacion, mutagenesis quimica, mutagenesis radiogenica, mutagenesis por eliminacion, mutagenesis de seleccion por restriccion, mutagenesis de purificacion por restriccion, sintesis genica artificial, mutagenesis de ensamble, creacion de multimero de acido nucleico quimerico y una combinacion de los mismos.

En un aspecto, el metodo puede repetirse iterativamente hasta que se produce una amilasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de un polipeptido codificado por el acido nucleico plantilla. En un aspecto, el polipeptido de amilasa variante es termotolerante y retiene algo de actividad despues de ser expuesto a una temperatura elevada. En otro aspecto, el polipeptido de amilasa variante ha aumentado la glicosilacion en comparacion con la amilasa codificada por un acido nucleico plantilla. Alternativamente, el polipeptido de amilasa variante tiene una actividad de amilasa a alta temperatura, en donde la amilasa codificada por el acido nucleico plantilla no es activa a alta temperatura. En un aspecto, el metodo puede repetirse iterativamente hasta que se produce una secuencia codificante de amilasa que tiene un uso de codon alterado del de la plantilla de acido nucleico. En otro aspecto, el metodo puede repetirse iterativamente hasta que se produzca un gen de amilasa que tenga un nivel mas alto o mas bajo de expresion de mensaje o estabilidad con respecto al del acido nucleico plantilla.

La divulgacion proporciona metodos para modificar codones en un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa para aumentar su expresion en una celula huesped, comprendiendo el metodo las siguientes etapas: (a) proporcionar un acido nucleico de la invencion que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa; y, (b) identificar un codon no preferido o menos preferido en el acido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo por un codon preferido o usado neutralmente que codifica el mismo aminoacido que el codon reemplazado, en donde un codon preferido es un codon sobrerrepresentado en secuencias codificantes en genes en la celula huesped y un codon no preferido o menos preferido es un codon subrepresentado en secuencias codificadoras en genes en la celula huesped, modificando asi el acido nucleico para aumentar su expresion en un huesped celula.

La divulgacion proporciona metodos para modificar codones en un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa; el metodo comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un acido nucleico de la invencion; y, (b) identificar un codon en el acido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo con un codon diferente que codifica el mismo aminoacido que el codon reemplazado, modificando asi los codones en un acido nucleico que codifica una amilasa.

La divulgacion proporciona metodos para modificar codones en un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa para aumentar su expresion en una celula huesped, comprendiendo el metodo las siguientes etapas: (a) proporcionar un acido nucleico de la divulgacion que codifica una polipeptido amilasa; y, (b) identificar un codon no preferido o menos preferido en el acido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo por un codon preferido o usado neutralmente que codifica el mismo aminoacido que el codon reemplazado, en donde un codon preferido es un codon sobrerrepresentado en secuencias codificantes en genes en la celula huesped y un codon no preferido o menos preferido es un codon subrepresentado en secuencias codificadoras en genes en la celula huesped, modificando asi el acido nucleico para aumentar su expresion en una celula huesped.

La divulgacion proporciona metodos para modificar un codon en un acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una actividad de amilasa para disminuir su expresion en una celula huesped, comprendiendo el metodo las siguientes etapas: (a) proporcionar un acido nucleico de la invencion; y (b) identificar al menos un codon preferido en el acido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo con un codon no preferido o menos preferido que codifica el mismo aminoacido que el codon reemplazado, en donde un codon preferido es un codon sobrerrepresentado en secuencias codificantes en genes en una celula huesped y un codon no preferido o menos preferido es un codon subrepresentado en secuencias codificantes en genes en la celula huesped, modificando asi el acido nucleico para disminuir su expresion en una celula huesped. En un aspecto, la celula huesped puede ser una celula bacteriana, una celula fungica, una celula de insecto, una celula de levadura, una celula vegetal o una celula de mamifero.

La divulgacion proporciona metodos para producir una biblioteca de acidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de amilasa modificados o sitios de union al sustrato, en donde los sitios activos modificados o sitios de union al sustrato se derivan de un primer acido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de union al sustrato, comprendiendo el metodo las siguientes etapas: (a) proporcionar un primer acido nucleico que codifica un primer sitio activo o primer sitio de union al sustrato, en donde la primera secuencia de acido nucleico comprende una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con un nucleo acido de la invencion, y el acido nucleico codifica un sitio activo de amilasa o un sitio de union al sustrato de amilasa; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleotidos mutagenicos que codifican variantes de aminoacidos naturales en una pluralidad de codones dirigidos en el primer acido nucleico; y, (c) usar el conjunto de oligonucleotidos mutagenicos para generar un conjunto de acidos nucleicos variantes que codifican el sitio activo o el sitio de union al sustrato que codifican un intervalo de variaciones de aminoacidos en cada codon de aminoacido que fue tratado con agentes mutagenicos, produciendo asi una biblioteca de acidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de amilasa modificados o sitios de union al sustrato. En un aspecto, el metodo comprende tratar con agentes mutagenicos el primer acido nucleico de la etapa (a) mediante un metodo que comprende un sistema de evolucion dirigido optimizado, mutagenesis de saturacion del sitio del gen (GSSM), reensamblaje de ligacion sintetica (SLR), PCR propenso a error, transposicion, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblaje, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis de casete, mutagenesis de ensamble recursiva, mutagenesis de ensamble exponencial, mutagenesis especifica del sitio, reensamblaje de genes, mutagenesis de saturacion del sitio del gen (GSSM), reensamblaje de ligacion sintetica (SLR) y una combinacion de los mismos. En otro aspecto, el metodo comprende tratar con agentes mutagenicos el primer acido nucleico de la etapa (a) o variantes mediante un metodo que comprende recombinacion, recombinacion de secuencia recursiva, mutagenesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagenesis de la plantilla que contiene uracilo, mutagenesis duplex con huecos, mutagenesis de reparacion de desajustes puntuales, mutagenesis de la cepa huesped deficiente en la reparacion, mutagenesis quimica, mutagenesis radiogenica, mutagenesis por eliminacion, mutagenesis de seleccion por restriccion, mutagenesis de purificacion por restriccion, sintesis genica artificial, mutagenesis de ensamble, creacion de multimero de acido nucleico quimerico y una combinacion de los mismos.

La divulgacion proporciona metodos para fabricar una molecula pequena que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas biosinteticas capaces de sintetizar o modificar una molecula pequena, en donde una de las enzimas comprende una enzima amilasa codificada por un acido nucleico de la invencion; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas de la etapa (a); y (c) hacer reaccionar el sustrato de la etapa (b) con las enzimas en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocataliticas para generar una molecula pequena mediante una serie de reacciones biocataliticas. La divulgacion proporciona metodos para modificar una molecula pequena que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una enzima amilasa, en donde la enzima comprende un polipeptido de la divulgacion, o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la divulgacion, o una subsecuencia del mismo; (b) proporcionar una molecula pequena; y (c) hacer reaccionar la enzima de la etapa (a) con la pequena molecula de la etapa (b) en condiciones que facilitan una reaccion enzimatica catalizada por la enzima amilasa, modificando asi una molecula pequena mediante una reaccion enzimatica con amilasa. En un aspecto, el metodo puede comprender una pluralidad de sustratos de molecula pequena para la enzima de la etapa (a), generando asi una biblioteca de moleculas pequenas modificadas producidas por al menos una reaccion enzimatica catalizada por la enzima amilasa. En un aspecto, el metodo puede comprender una pluralidad de enzimas adicionales en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocataliticas por parte de las enzimas para formar una biblioteca de pequenas moleculas modificadas producidas por la pluralidad de reacciones enzimaticas. En otro aspecto, el metodo puede comprender ademas la etapa de probar la biblioteca para determinar si una molecula pequena modificada particular que exhibe una actividad deseada esta presente dentro de la biblioteca. La etapa de probar la biblioteca puede comprender ademas las etapas de eliminar sistematicamente todas las reacciones biocataliticas excepto una de ellas, utilizada para producir una porcion de la pluralidad de moleculas pequenas modificadas dentro de la biblioteca, probando la porcion de la molecula pequena modificada para detectar la presencia o ausencia de la pequena molecula modificada particular con una actividad deseada, e identificacion de al menos una reaccion biocatalitica especifica que produce la pequena molecula modificada particular de la actividad deseada.

La divulgacion proporciona metodos para determinar un fragmento funcional de una enzima amilasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar una enzima amilasa, en donde la enzima comprende un polipeptido de la divulgacion, o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la divulgacion, o una subsecuencia de los mismos; y (b) eliminar una pluralidad de residuos de aminoacidos de la secuencia de la etapa (a) y probar la subsecuencia restante para determinar la actividad de amilasa, determinando asi un fragmento funcional de una enzima amilasa. En un aspecto, la actividad de amilasa se mide proporcionando un sustrato de amilasa y detectando una disminucion en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reaccion.

La divulgacion proporciona metodos para modificar geneticamente celulas enteras de fenotipos nuevos o modificados mediante el analisis de flujo metabolico en tiempo real, comprendiendo el metodo las siguientes etapas: (a) hacer una celula modificada modificando la composicion genetica de una celula, en donde la composicion genetica se modifica mediante la adicion a la celula de un acido nucleico de la invencion; (b) cultivar la celula modificada para generar una pluralidad de celulas modificadas; (c) medir al menos un parametro metabolico de la celula mediante el monitoreo del cultivo celular de la etapa (b) en tiempo real; y, (d) analizar los datos de la etapa (c) para determinar si el parametro medido difiere de una medicion comparable en una celda no modificada en condiciones similares, identificando asi un fenotipo modificado en la celda mediante analisis de flujo metabolico en tiempo real. En un aspecto, la composicion genetica de la celula puede modificarse mediante un metodo que comprende la eliminacion de una secuencia o modificacion de una secuencia en la celula, o, eliminando la expresion de un gen. En un aspecto, el metodo puede comprender ademas seleccionar una celula que comprenda un fenotipo recientemente modificado. En otro aspecto, el metodo puede comprender cultivar la celula seleccionada, generando asi una nueva cepa celular que comprende un fenotipo recientemente modificado.

La invencion proporciona metodos para hidrolizar un almidon que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; (b) proporcionar una composicion que comprende un almidon; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido hidroliza el almidon. En un aspecto, la composicion comprende almidon que comprende un enlace a-1,4-glucosidico o un enlace a-1,6-glucosidico.

La divulgacion proporciona metodos para licuar o eliminar un almidon de una composicion que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en donde el polipeptido comprende un polipeptido de la divulgacion; (b) proporcionar una composicion que comprende un almidon; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido elimina o licua el almidon.

La divulgacion proporciona metodos para aumentar la termotolerancia o la termoestabilidad de un polipeptido de amilasa, comprendiendo el metodo glicosilar un polipeptido de amilasa, en el que el polipeptido comprende al menos treinta aminoacidos contiguos de un polipeptido de la divulgacion; o un polipeptido codificado por una secuencia de acido nucleico de la divulgacion, aumentando asi la termotolerancia o termoestabilidad del polipeptido de amilasa. En un aspecto, la actividad especifica de la amilasa puede ser termoestable o termotolerante a una temperatura en el intervalo de mas de aproximadamente 37°C a aproximadamente 95°C.

La divulgacion proporciona metodos para la sobreexpresion de un polipeptido de amilasa recombinante en una celula que comprende expresar un vector que comprende un acido nucleico que comprende un acido nucleico de la divulgacion o una secuencia de acido nucleico de la divulgacion, en la que las identidades de la secuencia se determinan mediante analisis con un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual, en el que la sobreexpresion se efectua mediante el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistronico o mediante la amplificacion genica del vector.

La invencion proporciona composiciones detergentes que comprenden un polipeptido de la invencion.

La divulgacion proporciona metodos para lavar un objeto que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composicion que comprende un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en donde el polipeptido comprende: un polipeptido de la divulgacion o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la divulgacion; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) en condiciones en las que la composicion puede lavar el objeto.

La divulgacion proporciona metodos para hidrolizar almidon, por ejemplo, en un pienso o un alimento antes de ser consumido por un animal, que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una composicion, por ejemplo, un material de pienso, que comprende un almidon, en donde el polipeptido comprende: un polipeptido de la invencion o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la invencion; y (b) agregar el polipeptido de la etapa (a) a la composicion, por ejemplo, el pienso o el material alimenticio, en una cantidad suficiente durante un periodo de tiempo suficiente para provocar la hidrolisis del almidon, hidrolizando asi el almidon. En un aspecto, el alimento o pienso comprende arroz, maiz, cebada, trigo, legumbres o patata.

La divulgacion proporciona metodos para el desencolado textil que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en el que el polipeptido comprende un polipeptido de la divulgacion o un polipeptido codificado por un acido nucleico de la divulgacion; (b) proporcionar una tela; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y la tela de la etapa (b) en condiciones en las que la amilasa pueda desencolar la tela.

La divulgacion proporciona metodos para desentintar papel o fibras que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en donde el polipeptido comprende un polipeptido de la divulgacion; (b) proporcionar una composicion que comprende papel o fibra; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido puede desentintar el papel o la fibra.

La divulgacion proporciona metodos para el tratamiento de fibras lignocelulosicas que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, en el que el polipeptido comprende un polipeptido de la divulgacion; (b) proporcionar una fibra lignocelulosica; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y la fibra de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido puede tratar la fibra mejorando asi las propiedades de la fibra.

La invencion proporciona metodos para producir un jarabe con alto contenido de maltosa o alto contenido de glucosa que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; (b) proporcionar una composicion que comprende un almidon; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido de la etapa (a) puede licuar la composicion de la etapa (b) produciendo asi un hidrolizado de almidon soluble y sacarificacion del hidrolizado de almidon soluble produciendo asi el jarabe. En un aspecto, el almidon puede ser de arroz, maiz, cebada, trigo, legumbres, patata o batata.

La invencion proporciona metodos para mejorar el flujo de los fluidos de produccion que contienen almidon que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; (b) proporcionar fluido de produccion; y (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y el fluido de produccion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido pueda hidrolizar el almidon en el fluido de produccion, mejorando asi su flujo al disminuir su densidad. En un aspecto, el fluido de produccion puede ser de una formacion subterranea.

La invencion proporciona composiciones antienvejecimiento que comprenden un polipeptido de la invencion. La invencion proporciona metodos para prevenir el envejecimiento de los productos horneados que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; (b) proporcionar una composicion que contiene almidon usado para hornear; (c) combinar el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido pueda hidrolizar el almidon en la composicion utilizada para hornear, evitando asi el envejecimiento del producto horneado. En un aspecto, el producto horneado puede ser pan.

La invencion proporciona metodos para la elaboracion de cerveza o produccion de alcohol que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido de la invencion; (b) proporcionar una composicion que contiene almidon y se usa para elaborar cerveza o en la produccion de alcohol; (c) combinar el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) en condiciones en las que el polipeptido pueda hidrolizar el almidon en la composicion utilizada para la elaboracion de cerveza o en la produccion de alcohol. En un aspecto, la composicion que contiene almidon puede ser cerveza.

La divulgacion proporciona metodos para fabricar una planta transgenica que comprende las siguientes etapas: (a) introducir una secuencia heterologa de acido nucleico en la celula, en donde la secuencia heterologa de acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico de la invencion, produciendo asi una celula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgenica a partir de la celula transformada. En un aspecto, la etapa (a) puede comprender ademas la introduccion de la secuencia heterologa de acido nucleico por electroporacion o microinyeccion de protoplastos de celulas vegetales. En otro aspecto, la etapa (a) puede comprender ademas la introduccion de la secuencia heterologa de acido nucleico directamente en el tejido de la planta mediante el bombardeo de particulas de ADN. Alternativamente, la etapa (a) puede comprender ademas la introduccion de la secuencia heterologa de acido nucleico en el ADN de la celula vegetal utilizando un huesped de Agrobacterium tumefaciens. En un aspecto, la celula vegetal puede ser una celula de patata, mafz, arroz, trigo, tabaco o cebada.

La divulgacion proporciona metodos para expresar una secuencia heterologa de acido nucleico en una celula vegetal que comprende las siguientes etapas: (a) transformar la celula vegetal con una secuencia heterologa de acido nucleico unida operativamente a un promotor, en donde la secuencia heterologa de acido nucleico comprende un nucleo acido de la invencion; (b) cultivar la planta en condiciones en las que la secuencia heterologa de acidos nucleicos se expresa en la celula vegetal.

La divulgacion tambien proporciona un proceso para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de la masa que comprende anadir una amilasa de la divulgacion a la masa en una cantidad que sea eficaz para retardar el envejecimiento del pan. La divulgacion tambien proporciona una masa que comprende dicha amilasa y una premezcla que comprende harina junto con dicha amilasa. Finalmente, la divulgacion proporciona un aditivo enzimatico para hornear, que contiene dicha amilasa. El uso de la amilasa de acuerdo con la presente divulgacion proporciona un efecto antienvejecimiento mejorado segun se mide, por ejemplo, mediante menos endurecimiento de la miga, retencion de la elasticidad de la miga, mejor capacidad de corte (por ejemplo, menos migas, miga no gomosa), mejor sabor o gusto.

La divulgacion proporciona composiciones de liberacion retardada ("liberacion controlada") que comprenden un ingrediente deseado recubierto por un recubrimiento de polfmero de latex (o equivalente). En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una enzima, por ejemplo, una enzima de la invencion. En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una molecula pequena, un farmaco, un polisacarido, un lfpido, un acido nucleico, una vitamina, un antibiotico o un insecticida. En un aspecto, el ingrediente deseado comprende un granulo o una matriz, por ejemplo, un granulo o una matriz que comprende un material comestible (por ejemplo, como un alimento o pienso o suplemento o medicamento para animales). La divulgacion tambien proporciona metodos para la "liberacion controlada" o la "liberacion retardada" de una composicion, en donde la composicion esta recubierta por un recubrimiento de polfmero de latex (o equivalente).

En un aspecto, el recubrimiento de polfmero de latex comprende una pintura de latex, o equivalente. El recubrimiento de polfmero de latex puede comprender un (met)acrilato, un acetato de vinilo, un estireno, un etileno, un cloruro de vinilo, un butadieno, un cloruro de vinilideno, un versatato de vinilo, un propionato de vinilo, un acrilato de t-butilo, un acrilonitrilo, un neopreno, un maleato, un fumarato, sus equivalentes, sus combinaciones y/o sus derivados.

Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripcion a continuacion. Otras caracterfsticas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema informatico.

La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso para comparar una nueva secuencia de nucleotidos o protefnas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homologfa entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos.

La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso en un ordenador para determinar si dos secuencias son homologas.

La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 300 identificador para detectar la presencia de una caracterfstica en una secuencia.

La Figura 5 es un grafico que muestra la actividad residual de varias amilasas despues del calentamiento a 90°C durante 10 minutos en el Ejemplo 1.

La Figura 6 es un grafico que muestra el porcentaje neto de almidon eliminado frente a la concentracion de enzima en la prueba de lavado con ADW con ^ a y quelantes.

La Figura 7 es un grafico que muestra la actividad de las amilasas parentales a pH 8, 40°C en una formulacion de ADW a 55°C.

La Figura 8 es un grafico de datos sobre la tolerancia al H2O2 de las nuevas enzimas en el Ejemplo 4.

La Figura 9 es un grafico de los datos de pH y temperatura para una seleccion de las amilasas caracterizadas. La Figura 9a muestra los datos a pH 8 y 40°C y la Figura 9b muestra los datos a pH 10 y 50°C.

La Figura 10 muestra las secuencias que se utilizaran en los experimentos de reensamblaje con las enzimas.

La Figura 11 ilustra una muestra de curva estandar del ensayo del Ejemplo 5.

La Figura 12 ilustra los perfiles de tasa de pH para la SEQ ID NO: 127, que tiene un pH optimo neutro y la SEQ ID NO: 211, que tiene un optimo alrededor de pH 10.

La Figura 13 muestra la estabilidad de ejemplos de amilasas frente a una enzima comercial, como se analiza en el Ejemplo 2.

La Figura 14 muestra los alineamientos de secuencia de a-amilasas hipotermofilas, como se expone en el Ejemplo 8. La Figura 14a muestra un alineamiento de secuencias de amilasa. SEQ ID NO: 81 = un clon ambiental; pyro = Pyrococcus sp. (cepa: KOD1), Tachibana (1996) J. Ferment. Bioeng. 82: 224-232; pyro2 = Pyrococcus furiosus, Appl. Environ. Microbiol. 63 (9): 3569-3576, 1997; Thermo = Thermococcus sp.; Thermo2 = Thermococcus hydrothermalis, Leveque, E. et al. Patente: Francia 98.05655, 5 de mayo de 1998. La Figura 14b muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de las secuencias identificadas: SEQ ID NO: 81; pyro; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; thermo2; SEQ ID NO: 79; thermo; pyro2; clon A; thermo3. La Figura 14c muestra la alineacion de la secuencia de acido nucleico correspondiente a la secuencia polipeptidica de las Figuras 5 y 6. SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 79; clon A; y SEQ ID NO: 73.

La Figura 15 es un arbol de union de vecinos para los Thermococcales.

La Figura 16 muestra secuencias de ejemplos de secuencias de la divulgacion.

La Figura 17 ilustra los metodos de la invencion para la sacarificacion por licuefaccion del almidon, como se describe en detalle a continuacion.

La Figura 18 ilustra la Tabla 7, que enumera las identidades porcentuales relativas de ejemplos de secuencias de la divulgacion, como se describe en el Ejemplo 8, a continuacion.

La Figura 19 muestra el perfil de pH de las amilasas analizadas de la divulgacion y una enzima de referencia comercial, como se describe en el Ejemplo 15, a continuacion.

La Figura 20 muestra los perfiles de actividad de temperatura de ejemplos de amilasas de la divulgacion, como se describe en el Ejemplo 15, a continuacion.

La Figura 21 muestra la actividad enzimatica (de los ejemplos de amilasas de la divulgacion) en presencia de EDTA, como se describe en el Ejemplo 15, a continuacion.

La Figura 22 muestra la actividad enzimatica (de los ejemplos de amilasas de la divulgacion) en presencia de peroxido de hidroxido, como se describe en el Ejemplo 15, a continuacion.

La Figura 23 muestra la actividad enzimatica (de los ejemplos de amilasas de la divulgacion) en la solucion de ADW (agua destilada, solucion de endurecimiento, lejia, quelantes, tensioactivos) con sustrato soluble (almidon BODIPY), como se describe en el Ejemplo 15, a continuacion.

La Figura 24 muestra los resultados de las pruebas de lavado con portaobjetos recubiertos con almidon utilizando ejemplos de amilasas de la divulgacion, como se describe en el Ejemplo 15, a continuacion.

La Figura 25 ilustra un ejemplo de proceso de molienda humeda de maiz de la divulgacion (utilizando al menos una enzima de la invencion).

La Figura 26, la Figura 27 y la Figura 28 ilustran ejemplos alternativos de procesos de almidon, que incluyen procesos de licuefaccion de almidon, de la invencion (usando al menos una enzima de la divulgacion), como se describe en detalle a continuacion.

La Figura 29 muestra datos que resumen estos hallazgos que comparan la amilasa de la SEQ ID NO: 437 con la amilasa TERMAMYLmr SC (Novozymes A/S, Dinamarca) en el procesamiento de etanol en molino seco, como se describe en el Ejemplo 1, a continuacion.

La Figura 30 ilustra un perfil de actividad de pH de un ejemplo de enzima de la divulgacion (SEQ ID NO: 594) en regulador de acetato y regulador de fosfato para determinar la velocidad relativa para la glucoamilasa a cada pH, como se describe en detalle en el Ejemplo 16, a continuacion.

La Figura 31 ilustra un perfil de actividad de la temperatura de un ejemplo de enzima de la divulgacion (SEQ ID NO: 594) en un regulador de acetato, como se describe en detalle en el Ejemplo 16, a continuacion.

La Figura 32 ilustra un perfil de estabilidad a la temperatura de un ejemplo de enzima de la divulgacion (SEQ ID NO: 594), como se describe en detalle en el Ejemplo 16, a continuacion.

La Figura 33 ilustra un perfil de actividad de utilizacion de sustrato de un ejemplo de enzima de la divulgacion (SEQ ID NO: 594) utilizando dextrinas maltosa (G2), maltotriosa (G3), panosa (Pan), maltotetraosa (G4) y maltoheptaosa (G7), como se discutio en detalle en el Ejemplo 16, a continuacion.

La Figura 34 ilustra un ejemplo de acido nucleico que codifica glucoamilasa de la divulgacion, la secuencia genomica expuesta en la SEQ ID NO: 587. Las secuencias de codificacion (exones) se indican con el aminoacido de una sola letra debajo de el. Las secuencias de intrones estan subrayadas.

La Figura 35 es un grafico que describe las caracteristicas seleccionadas de los ejemplos de acidos nucleicos y polipeptidos de la divulgacion, como se describe con mas detalle a continuacion.

Los simbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.

Descripcion detallada

La invencion proporciona enzimas amilasas, por ejemplo, alfa-amilasas, polinucleotidos que codifican las enzimas, metodos para fabricar y usar estos polinucleotidos y polipeptidos. La invencion esta dirigida a nuevos polipeptidos que tienen actividad de glucano alfa maltotetrahidrolasa y acidos nucleicos que los codifican. Los polipeptidos de la invencion se pueden usar en una variedad de contextos diagnosticos, terapeuticos e industriales. Los polipeptidos de la invencion se pueden usar, por ejemplo, como un aditivo para un detergente, para procesar alimentos y para sintesis quimica utilizando una reaccion inversa. Ademas, los polipeptidos de la invencion se pueden usar en el tratamiento de telas, la produccion de alcohol y como aditivos para alimentos o piensos.

En un aspecto, las amilasas de la divulgacion son activas a una temperatura alta y/o baja, o en un amplio intervalo de temperaturas. Por ejemplo, pueden ser activas en temperaturas que oscilan entre 20°C y 90°C, entre 30°C y 80°C o entre 40°C y 70°C. La divulgacion tambien proporciona amilasas que tienen actividad a pH alcalinos o a pH acidos, por ejemplo, baja acidez del agua. En aspectos alternativos, las amilasas de la divulgacion pueden tener actividad en pH acidos tan bajos como pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0 y pH 3,5. En aspectos alternativos, las amilasas de la divulgacion pueden tener actividad en pH alcalinos tan altos como pH 9,5, pH 10, pH 10,5 y pH 11. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion son activas en el intervalo de temperatura de entre aproximadamente 40°C a aproximadamente 70°C en condiciones de baja actividad de agua (bajo contenido de agua).

La divulgacion tambien proporciona metodos para modificar adicionalmente los ejemplos de amilasas de la invencion para generar proteinas con propiedades deseables. Por ejemplo, las amilasas generadas por los metodos de la divulgacion pueden tener actividad enzimatica alterada, estabilidad termica, pH/perfil de actividad, pH/perfil de estabilidad (tal como mayor estabilidad a valores bajos, por ejemplo, a valores de pH tales como pH < 6 o pH < 5, o altos, por ejemplo pH > 9), estabilidad frente a la oxidacion, dependencia de Ca2+, actividad especifica y similares. La divulgacion preve la alteracion de cualquier propiedad de interes. Por ejemplo, la alteracion puede dar como resultado una variante que, en comparacion con una enzima parental, tiene perfiles de actividad enzimatica, o pH o temperatura alterados.

Definiciones

El termino "amilasa" incluye todos los polipeptidos, por ejemplo, enzimas, que catalizan la hidrolisis de un polisacarido, por ejemplo, un almidon. El termino "amilasa" incluye polipeptidos que tienen una actividad de a-amilasa, una actividad de p-amilasa, una actividad de glucoamilasa, una actividad de 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa, una actividad de exoamilasa, una actividad de glucano a-maltotetrahidrolasa, una actividad de maltasa, una actividad isomaltasa, una actividad de glucano 1,4 a-glucosidasa, una actividad de a-glucosidasa, una actividad de sucrasa o una actividad de agarasa (por ejemplo, una actividad de p-agarasa). Por ejemplo, una actividad de amilasa de la divulgacion incluye actividad de a-amilasa, que incluye la capacidad de hidrolizar enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en almidon para producir maltodextrinas de peso molecular mas pequeno. En un aspecto, la actividad de la a-amilasa incluye la hidrolisis de enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en el almidon al azar. Una actividad de amilasa de la divulgacion incluye polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa, tal como la capacidad de hidrolizar polimeros de glucosa unidos por enlaces a-1,4- y a-1,6-glucosidicos. En un aspecto, los polipeptidos de la divulgacion tienen actividad de glucoamilasa, que hidroliza los enlaces a-1,4-glucosidicos internos para producir maltodextrinas de peso molecular mas pequeno. Una actividad de amilasa de la divulgacion tambien incluye la actividad de glucano 1,4-a-glucosidasa o 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa, comunmente llamada glucoamilasa, pero tambien llamada amiloglucosidasa y yamilasa que, en un aspecto, libera p-D-glucosa de los glucanos ligados a 1,4-a, 1,6-a y 1,3-a. Una actividad de amilasa de la divulgacion tambien incluye actividad de exo-amilasa.

En un aspecto, la actividad de la glucoamilasa comprende la catalisis de la hidrolisis de los enlaces glucosidicos. La actividad de la glucoamilasa puede comprender catalizar la liberacion hidrolitica por etapas de D-glucosa de los extremos no reductores del almidon u otras dextrinas relacionadas. La actividad de la glucoamilasa puede comprender una actividad de la 1,4-a-D-glucano-glucohidrolasa. La actividad de la glucoamilasa puede comprender la catalisis de la hidrolisis de maltodextrinas que resulta en la generacion de glucosa libre. La actividad glucoamilasa puede comprender una actividad de exoamilasa. La actividad de glucoamilasa puede comprender una a-amilasa o una pamilasa. Los enlaces glucosidicos hidrolizados pueden comprender enlaces a-1,4-glucosidicos o enlaces a-1,6-glucosidicos. La actividad de glucoamilasa puede comprender hidrolizar enlaces glucosidicos en un almidon. La actividad de la glucoamilasa puede comprender ademas hidrolizar los enlaces glucosidicos en el almidon para producir maltodextrinas. La actividad de la glucoamilasa puede comprender escindir una maltosa o una unidad de D-glucosa del extremo no reductor del almidon.

Una actividad de amilasa de la divulgacion tambien incluye hidrolizar un polisacarido, por ejemplo, un almidon, a altas temperaturas, bajas temperaturas, pH alcalinos y a pH acidos. Por ejemplo, en un aspecto, la divulgacion proporciona polipeptidos y acidos nucleicos que los codifican, que tienen una amilasa, por ejemplo, una glucoamilasa, actividad que es termoestable. El polipeptido puede retener una actividad de amilasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de aproximadamente 37°C a aproximadamente 95°C; entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 95°C, o entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 95°C. En otro aspecto, un polipeptido de la divulgacion puede tener una actividad de glucoamilasa que es termotolerante. El polipeptido puede retener una amilasa, por ejemplo, una glucoamilasa, actividad despues de la exposicion a una temperatura en el intervalo de mas de 37°C a aproximadamente 95°C o en cualquier lugar en el intervalo de mas de 55°C a aproximadamente 85°C. En un aspecto, el polipeptido retiene una actividad de amilasa despues de la exposicion a una temperatura en el intervalo de mas de 90°C a aproximadamente 95°C a pH 4,5.

Una "variante de amilasa" comprende una secuencia de aminoacidos que se deriva de la secuencia de aminoacidos de una "amilasa precursora". La amilasa precursora puede incluir amilasas naturales y amilasas recombinantes. La secuencia de aminoacidos de la variante de amilasa se puede "derivar" de la secuencia de aminoacidos de la amilasa precursora mediante la sustitucion, eliminacion o insercion de uno o mas aminoacidos de la secuencia de aminoacidos precursora. Dicha modificacion puede ser de la "secuencia de ADN precursora" que codifica la secuencia de aminoacidos de la amilasa precursora en lugar de la manipulacion de la enzima amilasa precursora misma. Los metodos adecuados para tal manipulacion de la secuencia de ADN precursora incluyen los metodos descritos en el presente documento, asi como los metodos conocidos por los expertos en la tecnica.

El termino "anticuerpo" incluye un peptido o polipeptido derivado de, modelado despues o codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse especificamente a un antigeno o epitopo, vease, por ejemplo, Fundamental Immunology, tercera edicion, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97. El termino anticuerpo incluye porciones de union a antigeno, es decir, "sitios de union a antigeno" (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias, regiones determinantes de complementariedad (CDR)) que retienen la capacidad de unirse al antigeno, incluido (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH ; y (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada. Los anticuerpos de cadena unica tambien se incluyen como referencia en el termino "anticuerpo".

Los terminos "matriz" o "micromatriz" o "biochip" o "chip" como se usa en este documento son una pluralidad de elementos objetivo, comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de uno o mas polipeptidos (incluidos los anticuerpos) o acidos nucleicos inmovilizados en un area definida de una superficie de sustrato, como se explica con mas detalle a continuacion.

Como se usa en el presente documento, los terminos "ordenador", "programa informatico" y "procesador" se utilizan en sus contextos generales mas amplios e incorporan todos estos dispositivos, como se describe en detalle a continuacion. Una "secuencia codificadora de" o una "secuencia codifica" un polipeptido o proteina particular, es una secuencia de acido nucleico que se transcribe y traduce a un polipeptido o proteina cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.

El termino "casete de expresion", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleotidos que es capaz de afectar a la expresion de un gen estructural (es decir, una secuencia codificante de proteinas, tal como una amilasa de la divulgacion) en un huesped compatible con tales secuencias. Los casetes de expresion incluyen al menos un promotor unido operativamente con la secuencia codificante del polipeptido; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, senales de terminacion de la transcripcion. Tambien se pueden usar factores adicionales necesarios o utiles para efectuar la expresion, por ejemplo, potenciadores. Por lo tanto, los casetes de expresion tambien incluyen plasmidos, vectores de expresion, virus recombinantes, cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante, y similares.

"Operativamente enlazado" como se usa en el presente documento se refiere a una relacion funcional entre dos o mas segmentos de acido nucleico (por ejemplo, ADN). Tipicamente, se refiere a la relacion funcional de la secuencia reguladora de la transcripcion con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor esta operativamente enlazado a una secuencia de codificacion, tal como un acido nucleico de la invencion, si estimula o modula la transcripcion de la secuencia de codificacion en una celula huesped apropiada u otro sistema de expresion. En general, las secuencias reguladoras de la transcripcion que estan operativamente enlazadas a una secuencia transcrita son fisicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de accion cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripcion, como las potenciadoras, no necesitan ser fisicamente contiguas o ubicadas cerca de las secuencias codificantes cuya transcripcion potencian.

Un "vector" comprende un acido nucleico que puede infectar, transfectar, o transducir transitoria o permanentemente una celula. Se reconocera que un vector puede ser un acido nucleico desnudo o un acido nucleico complejado con proteina o lipido. El vector comprende opcionalmente acidos nucleicos y/o proteinas virales o bacterianas, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura lipidica viral, etc.). Los vectores incluyen, pero no se limitan a replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriofagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN y replicarse. Por lo tanto, los vectores incluyen, pero no se limitan a ARN, a Dn o ARN autorreplicante circular o lineal autonomo (por ejemplo, plasmidos, virus y similares, vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No.

5.217.879) e incluyen tanto plasmidos de expresion como de no expresion. Cuando se describe un microorganismo recombinante o un cultivo celular que alberga un "vector de expresion", esto incluye tanto el ADN circular como lineal extracromosomico y el ADN que se ha incorporado en el cromosoma o cromosomas del huesped. Cuando un vector es mantenido por una celula huesped, el vector puede ser replicado de manera estable por las celulas durante la mitosis como una estructura autonoma, o bien se incorpora dentro del genoma del huesped.

Como se usa en el presente documento, el termino "promotor" incluye todas las secuencias capaces de conducir la transcripcion de una secuencia codificante en una celula, por ejemplo, una celula vegetal. Por lo tanto, los promotores utilizados en los constructos de la invencion incluyen elementos de control de la transcripcion que actuan en cis y secuencias reguladoras que participan en la regulacion o modulacion del tiempo y/o la velocidad de transcripcion de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de la transcripcion que actua en cis, incluido un potenciador, un promotor, un terminador de transcripcion, un origen de replicacion, una secuencia de integracion cromosomica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intronica, que estan implicados en la regulacion transcripcional. Estas secuencias que actuan en cis tipicamente interactuan con proteinas u otras biomoleculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripcion. Los promotores "constitutivos" son aquellos que dirigen la expresion continuamente en la mayoria de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciacion celular. Los promotores "inducibles" o "regulables" dirigen la expresion el acido nucleico de la invencion bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones de desarrollo. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripcion por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobicas, temperatura elevada, sequia o la presencia de luz.

Los promotores "especificos de tejido" son elementos de control transcripcional que solo son activos en celulas o tejidos u organos particulares, por ejemplo, en plantas o animales. La regulacion especifica del tejido puede lograrse mediante ciertos factores intrinsecos que aseguran que se expresen los genes que codifican proteinas especificas de un tejido dado. Se sabe que tales factores existen en mamiferos y plantas para permitir el desarrollo de tejidos especificos.

El termino "planta" incluye plantas enteras, partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raices, etc.), protoplastos de plantas, semillas y celulas de plantas y su progenie. La clase de plantas que se puede usar en el metodo de la divulgacion es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles de tecnicas de transformacion, que incluyen angiospermas (plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas), asi como gimnospermas. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidia, incluidos los estados poliploides, diploides, haploides y hemicigotas. Tal como se usa en el presente documento, el termino "planta transgenica" incluye plantas o celulas vegetales en las que se ha insertado una secuencia heterologa de acido nucleico, por ejemplo, los acidos nucleicos y varios constructos recombinantes (por ejemplo, casetes de expresion) de la invencion.

Los "plasmidos" pueden estar disponibles comercialmente, publicamente sin restricciones, o pueden construirse a partir de los plasmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Los plasmidos equivalentes a los descritos en el presente documento son conocidos en la tecnica y seran evidentes para los expertos en la tecnica.

El termino "gen" incluye una secuencia de acido nucleico que comprende un segmento de ADN involucrado en la produccion de un producto de transcripcion (por ejemplo, un mensaje), que a su vez se traduce para producir una cadena polipeptidica, o regula la transcripcion, reproduccion o estabilidad de genes. Los genes pueden incluir regiones que preceden y siguen a la region de codificacion, como guia y avance, promotores y potenciadores, asi como, cuando corresponda, secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificacion individuales (exones).

Las frases "acido nucleico" o "secuencia de acido nucleico" incluyen oligonucleotidos, nucleotidos, polinucleotidos, o un fragmento de cualquiera de estos, al ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt) de origen genomico o sintetico que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una cadena sentido o antisentido, a acido nucleico peptidico (PNA), o a cualquier material similar al ADN o similar al ARN, de origen natural o sintetico, incluyendo, por ejemplo, ARNi, ribonucleoproteinas (por ejemplo, iRNP). El termino abarca acidos nucleicos, es decir, oligonucleotidos, que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales. El termino tambien abarca estructuras similares a acidos nucleicos con cadenas principales sinteticas, vease, por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189 197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153 156.

"Aminoacido" o "secuencia de aminoacidos" incluye un oligopeptido, peptido, polipeptido o secuencia proteica, o un fragmento, porcion o subunidad de cualquiera de estos, y moleculas naturales o sinteticas. Los terminos "polipeptido" y "proteina" incluyen aminoacidos unidos entre si por enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados, es decir, isosteros peptidicos, y pueden contener aminoacidos modificados distintos de los 20 aminoacidos codificados por genes. El termino "polipeptido" tambien incluye peptidos y fragmentos de polipeptidos, motivos y similares. El termino tambien incluye polipeptidos glicosilados. Los polipeptidos de la divulgacion tambien incluyen todas las formas "mimeticas" y "peptidomimeticas", como se describe con mas detalle a continuacion.

El termino "aislado" incluye un material removido de su entorno original, por ejemplo, el entorno natural si se produce de forma natural. Por ejemplo, un polinucleotido o polipeptido presente en la naturaleza en un animal vivo no se aisla, pero el mismo polinucleotido o polipeptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, se aisla. Dichos polinucleotidos podrian ser parte de un vector y/o tales polinucleotidos o polipeptidos podrian ser parte de una composicion, y todavia estar aislados, ya que dicho vector o composicion no es parte de su entorno natural. Como se usa en este documento, un material o composicion aislada tambien puede ser una composicion "purificada", es decir, no requiere pureza absoluta; mas bien, se pretende como una definicion relativa. Los acidos nucleicos individuales obtenidos de una biblioteca pueden purificarse convencionalmente hasta homogeneidad electroforetica. En aspectos alternativos, la invencion proporciona acidos nucleicos que se han purificado a partir de ADN genomico o de otras secuencias en una biblioteca u otro entorno por al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas ordenes de magnitud.

Como se usa en el presente documento, el termino "recombinante" puede incluir acidos nucleicos adyacentes a un acido nucleico "de cadena principal" a los que no es adyacente en su entorno natural. En un aspecto, los acidos nucleicos representan el 5% o mas del numero de inserciones de acido nucleico en una poblacion de "moleculas de cadena principal" de acido nucleico. Las "moleculas de la cadena principal" de acuerdo con la invencion incluyen acidos nucleicos tales como vectores de expresion, acidos nucleicos autorreplicantes, virus, acidos nucleicos integrantes y otros vectores o acidos nucleicos utilizados para mantener o manipular un inserto de acido nucleico de interes. En un aspecto, los acidos nucleicos enriquecidos representan 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas del numero de inserciones de acido nucleico en la poblacion de moleculas de la cadena principal recombinante. Los polipeptidos o proteinas "recombinantes" se refieren a polipeptidos o proteinas producidos por tecnicas de ADN recombinante; por ejemplo, producidos a partir de celulas transformadas por un constructo de ADN exogeno que codifica el polipeptido o proteina deseados. Los polipeptidos o proteinas "sinteticos" son aquellos preparados por sintesis quimica, como se describe con mas detalle a continuacion.

Una secuencia promotora puede estar "operativamente enlazada a" una secuencia codificadora cuando la ARN polimerasa que inicia la transcripcion en el promotor transcribira la secuencia codificante en ARNm, como se explica adicionalmente, a continuacion.

"Oligonucleotido" incluye un polidesoxinucleotido monocatenario o dos cadenas de polidesoxinucleotido complementarias que pueden sintetizarse quimicamente. Tales oligonucleotidos sinteticos no tienen fosfato 5' y, por lo tanto, no se ligaran a otro oligonucleotido sin agregar un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleotido sintetico puede ligarse a un fragmento que no ha sido desfosforilado.

La frase "sustancialmente identico" en el contexto de dos acidos nucleicos o polipeptidos, puede referirse a dos o mas secuencias que tienen, por ejemplo, al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas identidad de residuos de nucleotidos o aminoacidos (secuencia), cuando se comparan y alinean para obtener la maxima correspondencia, segun lo medido utilizando cualquier algoritmo de comparacion de secuencias conocido, como se explica en detalle a continuacion, o por inspeccion visual. En aspectos alternativos, la invencion proporciona secuencias de acido nucleico y polipeptido que tienen una identidad sustancial con un ejemplo de secuencia de la invencion en una region de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas residuos, o una region que varia entre aproximadamente 50 residuos y la longitud total del acido nucleico o polipeptido. Las secuencias de acido nucleico de la invencion pueden ser sustancialmente identicas en toda la longitud de una region codificante de polipeptido.

Una secuencia de aminoacidos "sustancialmente identica" tambien puede incluir una secuencia que difiere de una secuencia de referencia por una o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones conservadoras o no conservadoras de aminoacidos, particularmente cuando tal sustitucion ocurre en un sitio que no es el sitio activo de la molecula, y siempre que el polipeptido retenga esencialmente sus propiedades funcionales. Una sustitucion de aminoacidos conservadora, por ejemplo, sustituye a un aminoacido por otro de la misma clase (por ejemplo, la sustitucion de un aminoacido hidrofobico, como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, o la sustitucion de un aminoacido polar por otro, como la sustitucion de arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico o glutamina por asparagina). Uno o mas aminoacidos pueden eliminarse, por ejemplo, de una amilasa, lo que resulta en la modificacion de la estructura del polipeptido, sin alterar significativamente su actividad biologica. Por ejemplo, pueden eliminarse los aminoacidos del terminal amino o carboxilo que no son necesarios para la actividad de la amilasa.

La "hibridacion" incluye el proceso mediante el cual una cadena de acido nucleico se une con una cadena complementaria a traves del emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridacion pueden ser sensibles y selectivas de modo que se pueda identificar una secuencia particular de interes incluso en muestras en las que esta presente en concentraciones bajas. Las condiciones rigurosas se pueden definir, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridacion e hibridacion, o por la temperatura de hibridacion, y son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se puede aumentar la rigurosidad reduciendo la concentracion de sal, aumentando la concentracion de formamida o elevando la temperatura de hibridacion, alterando el tiempo de hibridacion, como se describe en detalle a continuacion. En aspectos alternativos, los acidos nucleicos de la divulgacion se definen por su capacidad para hibridar bajo diversas condiciones de rigurosidad (por ejemplo, alta, media y baja), como se expone en el presente documento.

La "variante" incluye polinucleotidos o polipeptidos de la invencion modificados en uno o mas pares de bases, codones, intrones, exones o residuos de aminoacidos (respectivamente) que aun retienen la actividad biologica de una amilasa de la invencion. Se pueden producir variantes por cualquier numero de medios incluidos metodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a errores, transposicion, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblaje, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis de casete, mutagenesis de ensamble recursiva, mutagenesis exponencial de ensamble, mutagenesis especifica del sitio, reensamblaje de genes, GSSM y cualquier combinacion de los mismos. Las tecnicas para producir amilasa variante que tiene actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que es diferente de una amilasa de tipo silvestre, se incluyen aqui.

El termino "mutagenesis de saturacion" o "GSSM" incluye un metodo que utiliza cebadores oligonucleotidicos degenerados para introducir mutaciones puntuales en un polinucleotido, como se describe en detalle a continuacion. El termino "sistema de evolucion optimizada dirigida" o "evolucion optimizada dirigida" incluye un metodo para volver a ensamblar fragmentos de secuencias de acido nucleico relacionadas, por ejemplo, genes relacionados, y se explica en detalle a continuacion.

El termino "reensamblaje de ligacion sintetica" o "SLR" incluye un metodo para ligar fragmentos de oligonucleotidos de una manera no estocastica, y se explica en detalle a continuacion.

Generacion y manipulacion de acidos nucleicos

En un aspecto, la invencion proporciona acidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de acido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas de identidad, o identidad completa (100%) de secuencia con el acido nucleico de la invencion en una region de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o mas, residuos. En un aspecto, el acido nucleico codifica al menos un polipeptido que tiene una actividad de amilasa, por ejemplo, una actividad de alfa amilasa.

Por ejemplo, la siguiente tabla describe algunos ejemplos de acidos nucleicos que codifican amilasa de la divulgacion, por ejemplo, la divulgacion proporciona una amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 474, que tiene un ejemplo de secuencia de codificacion como se expone en la SEQ ID NO: 473, y en un aspecto esta codificada por un gen, incluyendo intrones y exones, que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 467 (incluidos los exones que tienen secuencias como se expone en la SEQ ID NO: 468, SEQ ID. NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 y SEQ ID NO: 472); etc.:

SEQ ID NO: del SEQ ID NOS: de SEQ ID NO: de la SEQ ID NO: de la

gen completo secuencias de secuencia de ADN de secuencia de proteina Amilasa (exones e exones la secuencia de la secuencia TOTAL intrones) codificadora (solo codificadora (solo

exones) exones)

A 460, 461 N/A 460 461 460, 461 B 462 463, 464 465 466 462-466 C 467 468-472 473 474 467-474 D 475 476-477 478 479 475-479 E 480 481-483 484 485 480-485 F 486 487-491 492 493 486-493 G 494 495-497 498 499 494-499 H 500 501-508 509 510 500-510 I 511 512-514 515 516 511-516 J 517, 518 N/A 517 518 517, 518 K 519 520-521 522 523 519-523

L 524 525-526 527 528 524-528

M 529 530-531 532 533 529-533

N 534 535-538 539 540 534-540

O 541 542-543 544 545 541-545

P 546 547-551 552 553 546-553

Q 554 555-557 558 559 554-559

R 560 561-564 565 566 560-566

S 587 588-592 593 594 587-594

Las amilasas enumeradas anteriormente (descritas como A hasta S) y los acidos nucleicos que las codifican tienen una novedad comun en el sentido de que se aislaron/derivaron inicialmente de fuentes fungicas.

La divulgacion tambien proporciona glucoamilasas, tales como la enzima que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 594 codificada por los residuos 4111 de la SEQ ID NO: 587 genomica, o el ADNc de 1854 residuos de longitud de la SEQ ID NO: 593). La SEQ ID NO: 587 genomica comprende intrones y exones, y los exones pueden describirse como fragmentos de polipeptidos codificadores que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 592. En un aspecto, la glucoamilasa procesada "madura" que consiste en los residuos 32 a 617 de la SEQ ID NO: 594.

La invencion proporciona acidos nucleicos aislados y recombinantes, que incluyen casetes de expresion tales como vectores de expresion que codifican los polipeptidos de la invencion. La divulgacion proporciona sondas que comprenden o consisten en acidos nucleicos de la invencion. La divulgacion tambien incluye metodos para descubrir nuevas secuencias de amilasa utilizando los acidos nucleicos de la divulgacion. La divulgacion tambien incluye metodos para inhibir la expresion de genes de amilasa, transcripciones y polipeptidos usando los acidos nucleicos de la divulgacion. Tambien se proporcionan metodos para modificar los acidos nucleicos de la invencion mediante, por ejemplo, reensamble de ligacion sintetica, sistema de evolucion dirigido optimizado y/o mutagenesis de saturacion del sitio del gen (GSSMMR).

Los acidos nucleicos de la invencion pueden fabricarse, aislarse y/o manipularse, por ejemplo, mediante clonacion y expresion de bibliotecas de ADNc, amplificacion de mensaje o ADN genomico mediante PCR, y similares. Al practicar los metodos de la divulgacion, los genes homologos pueden modificarse manipulando un acido nucleico plantilla, como se describe en este documento. La invencion puede ponerse en practica junto con cualquier metodo o protocolo o dispositivo conocido en la tecnica, que estan bien descritos en la literatura cientifica y de patentes.

Tecnicas generales

Los acidos nucleicos utilizados para practicar esta invencion, ya sea ARN, ARNi, acido nucleico antisentido, ADNc, ADN genomico, vectores, virus o hibridos de los mismos, se pueden aislar de una variedad de fuentes, modificarse por ingenieria genetica, amplificarse y/o expresarse/generarse de forma recombinante. Los polipeptidos recombinantes generados a partir de estos acidos nucleicos pueden aislarse o clonarse individualmente y analizarse para determinar la actividad deseada. Se puede usar cualquier sistema de expresion recombinante, incluidos los sistemas de expresion de celulas bacterianas, de mamiferos, de levaduras, de insectos o de plantas.

Como alternativa, estos acidos nucleicos pueden sintetizarse in vitro mediante tecnicas de sintesis quimica bien conocidas, como se describe, por ejemplo, en Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett.

22: 1859; patente de Estados Unidos N° 4.458.066.

Las tecnicas para la manipulacion de acidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonacion, sondas de marcacion (por ejemplo, marcacion con cebadores aleatorios utilizando polimerasa Klenow, traduccion de muescas, amplificacion), secuenciacion, hibridacion y similares estan bien descritas en la literatura de patentes, vease, por ejemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

Otro medio util para obtener y manipular acidos nucleicos utilizados para practicar los metodos de la invencion es clonar a partir de muestras genomicas y, si se desea, seleccionar y volver a clonar insertos aislados o amplificados, por ejemplo, a partir de clones genomicos o clones de ADNc. Las fuentes de acido nucleico usadas en los metodos de la invencion incluyen bibliotecas genomicas o de ADNc contenidas, por ejemplo, en cromosomas artificiales de mamiferos (MAC), vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.721.118, 6.025.155; cromosomas artificiales humanos, vease, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Gineta. 15: 333-335; cromosomas artificiales de levadura (YAC); cromosomas artificiales bacterianos (BAC); cromosomas artificiales PI, vease, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306-316; Vectores derivados de P1 (PAC), vease, por ejemplo, Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; cosmidos, virus recombinantes, fagos o plasmidos.

En un aspecto, un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion se ensambla en una fase apropiada con una secuencia lider capaz de dirigir la secrecion del polipeptido traducido o fragmento del mismo.

La divulgacion proporciona proteinas de fusion y acidos nucleicos que los codifican. Un polipeptido de la invencion puede fusionarse a un peptido o polipeptido heterologo, tal como peptidos de identificacion N-terminales que imparten caracteristicas deseadas, tales como mayor estabilidad o purificacion simplificada. Los polipeptidos de la invencion tambien pueden sintetizarse y expresarse como proteinas de fusion con uno o mas dominios adicionales enlazados a ellos, por ejemplo, para producir un peptido mas inmunogenico, para aislar mas facilmente un peptido sintetizado de forma recombinante, para identificar y aislar anticuerpos y B celulas que expresan anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la deteccion y la purificacion incluyen, por ejemplo, peptidos quelantes de metales tales como tramos de polihistidina y modulos de histidina-triptofano que permiten la purificacion en metales inmovilizados, dominios de proteina A que permiten la purificacion en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificacion de extension/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle WA). La inclusion de secuencias enlazadoras escindibles, como el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificacion y el peptido o polipeptido que comprende el motivo para facilitar la purificacion. Por ejemplo, un vector de expresion puede incluir una secuencia de acido nucleico que codifica un epitopo unida a seis residuos de histidina seguidos de una tiorredoxina y un sitio de escision de enteroquinasa (vease, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404-414). Los residuos de histidina facilitan la deteccion y la purificacion, mientras que el sitio de escision de la enteroquinasa proporciona un medio para purificar el epitopo del resto de la proteina de fusion. La tecnologia relativa a vectores que codifican proteinas de fusion y la aplicacion de proteinas de fusion se describen bien en la literatura cientifica y de patentes, vease, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53.

Secuencias de control transcripcional y translacional

La invencion proporciona secuencias de acido nucleico (por ejemplo, ADN) de la invencion operativamente unidas a la secuencia o secuencias de control de expresion (por ejemplo, transcripcional o de traduccion), por ejemplo, promotores o potenciadores, para dirigir o modular la sintesis/expresion de ARN. La secuencia de control de la expresion puede estar en un vector de expresion. Los ejemplos de promotores bacterianos incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los ejemplos de promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardio, LTR de retrovirus y metalotioneina I de raton.

Los promotores adecuados para expresar un polipeptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacI, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor PR lambda, el promotor PL lambda, promotores de operones que codifican enzimas glicoliticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), y el promotor de la fosfatasa acida. Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de HSV, los promotores de choque termico, el promotor de SV40 temprano y tardio, las LTR de retrovirus y el promotor de metalotioneina-I de raton. Tambien se pueden usar otros promotores conocidos para controlar la expresion de genes en celulas procariotas o eucariotas o sus virus.

Promotores de plantas especificos del tejido

La invencion proporciona casetes de expresion que pueden expresarse de una manera especifica del tejido, por ejemplo, que puede expresar una amilasa de la divulgacion de una manera especifica del tejido. La invencion tambien proporciona plantas o semillas que expresan una amilasa de la divulgacion de una manera especifica del tejido. La especificidad del tejido puede ser especifica de la semilla, especifica del tallo, especifica de la hoja, especifica de la raiz, especifica del fruto y similares.

En un aspecto, un promotor constitutivo tal como el promotor 35S de CaMV puede usarse para la expresion en partes especificas de la planta o semilla o en toda la planta. Por ejemplo, para la sobreexpresion, se puede emplear un fragmento promotor de la planta que dirigira la expresion de un acido nucleico en algunos o todos los tejidos de una planta, por ejemplo, una planta regenerada. Dichos promotores se denominan en la presente memoria como promotores "constitutivos" y son activos en la mayoria de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciacion celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la region de iniciacion de la transcripcion 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1' o 2' derivado de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones de iniciacion de la transcripcion de diversos genes de plantas conocidos por los expertos. Tales genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33: 125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251: 196-203); el gen que codifica la proteina desaturasa portadora de estearoil-acilo de Brassica napus (GenBank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104: 1167 1176); GPc1 de maiz (GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208: 551-565); el Gpc2 de maiz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33: 97-112); promotores de plantas descritos en las patentes de Estados Unidos Nos. 4.962.028, 5.633.440.

La invencion utiliza promotores constitutivos o especificos del tejido derivados de virus que pueden incluir, por ejemplo, el promotor subgenomico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1679-1683; el virus baciliforme del arroz tungro (RTBV), que se replica solo en celulas de floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que impulsa la fuerte expresion del gen informador especifico del floema; el promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca (CVMV), con mayor actividad en elementos vasculares, en celulas del mesofilo de la hoja, y en las puntas de las raices (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139).

Alternativamente, el promotor de la planta puede dirigir la expresion del acido nucleico que expresa la amilasa en un tejido, organo o tipo de celula especifico (promotores especificos del tejido) o puede estar bajo un control ambiental o de desarrollo mas preciso o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripcion incluyen condiciones anaerobicas, temperatura elevada, la presencia de luz o rociado con quimicos/hormonas. Por ejemplo, la invencion incorpora el promotor inducible por sequia del maiz (Busk (1997) citado anteriormente); el promotor inducible por frio, sequia y alto contenido de sal de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897-909).

Los promotores especificos del tejido pueden promover la transcripcion solo dentro de un cierto marco de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Vease, por ejemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10: 791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de Arabidopsis. Vease tambien Cardon (1997) Plant J 12: 367-77, que describe el factor de transcripcion SPL3, que reconoce un motivo de secuencia conservado en la region promotora del gen API de identidad del meristemo floral de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, vol. 29, paginas 995-1004, que describe el promotor eIF4 del meristemo. Se pueden usar promotores especificos de tejido que son activos a lo largo del ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los acidos nucleicos de la invencion estan unidos operativamente a un promotor activo principalmente solo en celulas de fibra de algodon. En un aspecto, los acidos nucleicos de la invencion estan unidos operativamente a un promotor activo principalmente durante las etapas de elongacion celular de la fibra de algodon, por ejemplo, como se describe por Rinehart (1996) citado anteriormente. Los acidos nucleicos pueden unirse operativamente al promotor del gen Fbl2A para expresarse preferentemente en celulas de fibra de algodon (Ibid.). Vease tambien, John (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 5769-5773; John, et al., patentes de Estados Unidos Nos. 5.608.148 y 5.602.321, que describen promotores especificos de la fibra de algodon y metodos para la construccion de plantas de algodon transgenicas. Tambien pueden usarse promotores especificos de la raiz para expresar los acidos nucleicos de la invencion. Los ejemplos de promotores especificos de la raiz incluyen el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39-60). Otros promotores que se pueden usar para expresar los acidos nucleicos de la invencion incluyen, por ejemplo, promotores especificos del ovulo, especificos del embrion, especificos del endospermo, especificos del integumento, especificos de la cubierta de la semilla, o alguna combinacion de los mismos; un promotor especifico de la hoja (vease, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285-1295, que describe un promotor especifico de la hoja en el maiz); el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que exhibe una alta actividad en las raices, vease, por ejemplo, Hansen (1997) citado anteriormente); un promotor especifico del polen de maiz (vease, por ejemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet.

224: 161-168); se puede usar un promotor de tomate activo durante la maduracion de la fruta, la senescencia y la abscision de las hojas y, en menor medida, de las flores (vease, por ejemplo, Blume (1997) Plant J. 12: 731-746); un promotor especifico del pistilo del gen SK2 de patata (vease, por ejemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425-431); el gen Blec4 del guisante, que es activo en el tejido epidermico de los apices de brotes vegetativos y florales de alfalfa transgenica, lo que lo convierte en una herramienta util para dirigir la expresion de genes foraneos a la capa epidermica de brotes o fibras en crecimiento activo; el gen BEL1 especifico del ovulo (vease, por ejemplo, Reiser (1995) Cell 83: 735-742, GenBank No. U39944); y/o, el promotor en Klee, patente de Estados Unidos No. 5.589.583, que describe una region promotora de la planta, es capaz de conferir altos niveles de transcripcion en tejido meristematico y/o celulas que se dividen rapidamente.

Alternativamente, los promotores vegetales que son inducibles tras la exposicion a hormonas vegetales, tales como auxinas, se usan para expresar los acidos nucleicos de la invencion. Por ejemplo, la invencion puede usar el fragmento del promotor E1 de elementos de respuesta a la auxina (AuxRE) en la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol.

115: 397-407); el promotor GST6 de Arabidopsis sensible a la auxina (tambien sensible al acido salicilico y al peroxido de hidrogeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC del tabaco inducible por auxina (Sakai (1996) 37: 906-913); un elemento de respuesta de biotina vegetal (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937); y, el promotor sensible a la hormona del estres acido abscisico (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).

Los acidos nucleicos de la invencion tambien pueden unirse operativamente a promotores de plantas que son inducibles tras la exposicion a reactivos quimicos que pueden aplicarse a la planta, tales como herbicidas o antibioticos. Por ejemplo, se puede usar el promotor In2-2 de maiz, activado por los protectores del herbicida bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicacion de diferentes protectores contra herbicidas induce distintos patrones de expresion genica, incluida la expresion en la raiz, los hidatodos y el meristemo apical del brote. La secuencia de codificacion puede estar bajo el control, por ejemplo, de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con plantas de tabaco transgenicas que contienen el gen de arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); o un elemento sensible al acido salicilico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Usando promotores inducidos quimicamente (por ejemplo, inducidos por hormonas o pesticidas), es decir, un promotor sensible a un compuesto quimico que se puede aplicar a la planta transgenica en el campo, la expresion de un polipeptido de la invencion puede inducirse en una etapa particular de desarrollo de la planta. Por lo tanto, la divulgacion tambien proporciona plantas transgenicas que contienen un gen inducible que codifica los polipeptidos de la invencion cuyo intervalo de hospedador se limita a especies de plantas objetivo, tales como maiz, arroz, cebada, trigo, patata u otros cultivos, inducibles en cualquier etapa del desarrollo del cultivo.

Un experto en la materia reconocera que un promotor de plantas especifico del tejido puede dirigir la expresion de secuencias enlazadas operativamente en tejidos distintos del tejido objetivo. Por lo tanto, un promotor especifico del tejido es uno que impulsa la expresion preferentemente en el tejido o tipo de celula objetivo, pero tambien puede conducir a cierta expresion en otros tejidos.

Los acidos nucleicos de la invencion tambien pueden unirse operativamente a promotores vegetales que son inducibles tras la exposicion a reactivos quimicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sinteticas o antibioticos que se pueden aplicar, por ejemplo, en aerosol, sobre plantas transgenicas. La expresion inducible de los acidos nucleicos productores de amilasa de la invencion permitira al productor seleccionar plantas con la proporcion optima de almidon/azucar. El desarrollo de las partes de la planta puede asi controlarse. De esta manera, la divulgacion proporciona los medios para facilitar la recoleccion de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en varias realizaciones, se usa el promotor In2-2 de maiz, activado por los protectores del herbicida bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicacion de diferentes protectores contra herbicidas induce distintos patrones de expresion genica, incluida la expresion en la raiz, los hidatodos y el meristemo apical del brote. Las secuencias de codificacion de la invencion tambien estan bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con las plantas de tabaco transgenicas que contienen el gen de arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); o un elemento sensible al acido salicilico (Stange (1997) Plant J.

11: 1315-1324).

Si se desea la expresion apropiada del polipeptido, se debe incluir una region de poliadenilacion en el extremo 3' de la region codificante. La region de poliadenilacion se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas o de genes en el ADN-T de Agrobacterium.

Vectores de expresion y vehiculos de clonacion

La invencion proporciona vectores de expresion que comprenden acidos nucleicos de la invencion. Los vectores de expresion de la invencion pueden comprender particulas virales, baculovirus, fagos, plasmidos, fagemidos, cosmidos, fosmidos, cromosomas bacterianos artificiales, ADN viral (por ejemplo, vacuna, adenovirus, virus de la viruela, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales basados en P1, plasmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura y cualquier otro vector especifico para huespedes especificos de interes (tales como bacilos, Aspergillus y levadura). Los vectores de la invencion pueden incluir secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas. Los expertos en la tecnica conocen un gran numero de vectores adecuados y estan disponibles comercialmente. Los ejemplos de vectores incluyen: bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plasmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro plasmido u otro vector siempre que sean replicables y viables en el huesped. Con la presente invencion se pueden emplear vectores de bajo numero de copias o alto numero de copias.

El vector de expresion puede comprender un promotor, un sitio de union a ribosoma para el inicio de la traduccion y un terminador de transcripcion. El vector tambien puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresion. Los vectores de expresion de mamiferos pueden comprender un origen de replicacion, cualquier sitio de union a ribosoma necesario, un sitio de poliadenilacion, empalme de sitios donantes y aceptores, secuencias de terminacion de la transcripcion y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. En algunos aspectos, las secuencias de ADN derivadas de los sitios de empalme y poliadenilacion de SV40 pueden usarse para proporcionar los elementos geneticos no transcriptos requeridos.

En un aspecto, los vectores de expresion contienen uno o mas genes marcadores seleccionables para permitir la seleccion de celulas huesped que contienen el vector. Dichos marcadores seleccionables incluyen genes que codifican dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a la neomicina para cultivos de celulas eucariotas, genes que confieren resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae. Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado utilizando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Los vectores para expresar el polipeptido o fragmento del mismo en celulas eucarioticas tambien pueden contener potenciadores para aumentar los niveles de expresion. Los potenciadores son elementos de ADN que actuan en cis, generalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pb de longitud que actuan sobre un promotor para aumentar su transcripcion. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardio del origen de replicacion pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardio del origen de replicacion y los potenciadores de adenovirus.

Una secuencia de acido nucleico puede insertarse en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia se liga a la posicion deseada en el vector despues de la digestion del inserto y el vector con endonucleasas de restriccion apropiadas. Alternativamente, los extremos romos en el inserto y el vector pueden estar ligados. Una variedad de tecnicas de clonacion son conocidas en la tecnica, por ejemplo, como se describe en Ausubel y Sambrook. Tales y otros procedimientos se consideran dentro del alcance de los expertos en la tecnica.

El vector puede estar en forma de un plasmido, una particula viral o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas, derivados de SV40; plasmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plasmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fago, ADN viral como vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Una variedad de vectores de clonacion y expresion para uso con huespedes procariotas y eucariotas se describen, por ejemplo, en Sambrook.

Los vectores bacterianos particulares que pueden usarse incluyen los plasmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos geneticos del vector de clonacion bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE. Uu .), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en la celula huesped.

Los acidos nucleicos de la invencion se pueden expresar en casetes de expresion, vectores o virus y se pueden expresar de forma transitoria o estable en celulas y semillas de plantas. Un ejemplo de sistema de expresion transitoria utiliza sistemas de expresion episomal, por ejemplo, ARN viral del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) generado en el nucleo mediante la transcripcion de un minicromosoma episomal que contiene ADN superenrollado, vease, por ejemplo, Covey (1990) Proc. Natl Acad Sci. USA 87: 1633-1637. Alternativamente, las secuencias codificantes, es decir, todas o subfragmentos de secuencias de la invencion pueden insertarse en el genoma de una celula huesped vegetal convirtiendose en una parte integral del ADN cromosomico huesped. Los transcriptos sentido o antisentido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificantes) de los acidos nucleicos de la invencion puede comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable a una celula vegetal o una semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, particularmente resistencia a antibioticos, tal como resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o herbicida, tal como resistencia a clorosulfurona o Basta.

Los vectores de expresion capaces de expresar acidos nucleicos y proteinas en plantas son bien conocidos en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, vectores de Agrobacterium spp., virus X de la patata (vease, por ejemplo, Angell (1997) EMb O J. 16: 3675-3684), virus del mosaico del tabaco (vease, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173: 69-73), virus del tomate arbustivo achaparrado (vease, por ejemplo, Hillman (1989) Virology 169: 42-50), virus del grabado del tabaco (vease, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234: 243-252), virus del mosaico dorado del frijol (vease, por ejemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37: 471-476), virus del mosaico de la coliflor (vease, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol Plant Microbe Interact. 10: 1094-1101), elemento transponible Ac/Ds del maiz (vease, por ejemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17: 6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol 204: 161-194), y el elemento transponible supresor-mutador del maiz (Spm) (vease, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32: 717-725); y sus derivados.

En un aspecto, el vector de expresion puede tener dos sistemas de replicacion para permitir que se mantenga en dos organismos, por ejemplo en celulas de mamiferos o insectos para la expresion y en un huesped procariota para clonacion y amplificacion. Ademas, para integrar vectores de expresion, el vector de expresion puede contener al menos una secuencia homologa al genoma de la celula huesped. Puede contener dos secuencias homologas que flanquean al constructo de expresion. El vector integrador puede dirigirse a un locus especifico en la celula huesped seleccionando la secuencia homologa apropiada para su inclusion en el vector. Los constructos para la integracion de vectores son bien conocidos en la tecnica.

Los vectores de expresion de la invencion tambien pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de cepas bacterianas que se han transformado, por ejemplo, genes que hacen que las bacterias sean resistentes a farmacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores seleccionables tambien pueden incluir genes biosinteticos, como los de las rutas biosinteticas de histidina, triptofano y leucina.

Celulas huesped y celulas transformadas

La divulgacion tambien proporciona una celula transformada que comprende una secuencia de acido nucleico de la invencion, por ejemplo, una secuencia que codifica una amilasa de la divulgacion, o un vector de la divulgacion. La celula huesped puede ser cualquiera de las celulas huesped conocidas por los expertos en la tecnica, incluidas las celulas procariotas, celulas eucariotas, tales como celulas bacterianas, celulas fungicas, celulas de levadura, celulas de mamiferos, celulas de insectos o celulas vegetales. Los ejemplos de celulas bacterianas incluyen E. coli, cualquier Streptomyces o Bacillus (por ejemplo, Bacillus cereus, Bacillus subtilis), Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los generos Bacillus, Streptomyces, y Staphylococcus. Los ejemplos de celulas de insectos incluyen Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Los ejemplos de celulas animales incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes o cualquier linea celular de raton o humana. La seleccion de un anfitrion apropiado esta dentro de las capacidades de los expertos en la materia. Las tecnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura tecnica y cientifica. Vease, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet.

22: 421-477, patente de Estados Unidos No. 5.750.870.

El vector puede introducirse en las celulas huesped utilizando cualquiera de una variedad de tecnicas, que incluyen transformacion, transfeccion, transduccion, infeccion viral, pistolas de genes o transferencia de genes mediada por Ti. Los metodos particulares incluyen transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion o electroporacion (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

En un aspecto, los acidos nucleicos o vectores de la invencion se introducen en las celulas para seleccion, por lo tanto, los acidos nucleicos entran en las celulas de una manera adecuada para la expresion posterior del acido nucleico. El metodo de introduccion es dictado en gran medida por el tipo de celula objetivo. Los ejemplos de metodos incluyen la precipitacion con CaPO4, la fusion de liposomas, la lipofeccion (por ejemplo, LIPOFECTlNMR), la electroporacion, la infeccion viral, etc. Los acidos nucleicos candidatos pueden integrarse de manera estable en el genoma de la celula huesped (por ejemplo, con introduccion retroviral) o pueden existir de forma transitoria o estable en el citoplasma (es decir, mediante el uso de plasmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras estandar, marcadores de seleccion, etc.). Como muchos cribados farmaceuticamente importantes requieren objetivos celulares de mamiferos humanos o modelo, se prefieren los vectores retrovirales capaces de transfectar tales objetivos.

Cuando sea apropiado, las celulas huesped modificadas geneticamente pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados segun sea apropiado para activar los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la invencion. Despues de la transformacion de una cepa huesped adecuada y el crecimiento de la cepa huesped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado puede ser inducido por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o induccion quimica) y las celulas pueden cultivarse durante un periodo adicional para permitirles producir el polipeptido deseado o fragmento del mismo.

Las celulas pueden recogerse por centrifugacion, romperse por medios fisicos o quimicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificacion adicional. Las celulas microbianas empleadas para la expresion de proteinas pueden romperse por cualquier metodo conveniente, incluido el ciclo de congelacion y descongelacion, la sonicacion, rompimiento mecanico o el uso de agentes de lisis celular. Tales metodos son bien conocidos por los expertos en la tecnica. El polipeptido expresado o fragmento del mismo puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos de celulas recombinantes mediante metodos que incluyen sulfato de amonio o precipitacion con etanol, extraccion con acido, cromatografia de intercambio anionico o cationico, cromatografia de fosfocelulosa, cromatografia de interaccion hidrofobica, cromatografia de afinidad, cromatografia de hidroxilapatita y cromatografia de lectina. Se pueden usar etapas de replegamiento de proteinas, segun sea necesario, para completar la configuracion del polipeptido. Si se desea, puede emplearse cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificacion finales.

Tambien se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de celulas de mamiferos para expresar proteinas recombinantes. Los ejemplos de sistemas de expresion en mamiferos incluyen las lineas COS-7 de fibroblastos de rinon de mono y otras lineas celulares capaces de expresar proteinas de un vector compatible, tales como las lineas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.

Los constructos en celulas huesped pueden usarse de una manera convencional para producir el producto genico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del huesped empleado en un procedimiento de produccion recombinante, los polipeptidos producidos por las celulas huesped que contienen el vector pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipeptidos de la invencion pueden incluir o no tambien un residuo de aminoacido metionina inicial.

Los sistemas de traduccion libres de celulas tambien pueden emplearse para producir un polipeptido de la invencion. Los sistemas de traduccion libres de celulas pueden usar ARNm transcriptos a partir de un constructo de ADN que comprende un promotor operativamente unido a un acido nucleico que codifica el polipeptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, el constructo de ADN puede linealizarse antes de realizar una reaccion de transcripcion in vitro. El ARNm transcrito se incuba luego con un extracto de traduccion libre de celulas apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipeptido deseado o un fragmento del mismo.

Los vectores de expresion pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotipico para la seleccion de celulas huesped transformadas tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivos de celulas eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Amplificacion de acidos nucleicos

En la practica de la invencion, los acidos nucleicos de la invencion y los acidos nucleicos que codifican los polipeptidos de la invencion pueden reproducirse por amplificacion. La amplificacion tambien se puede usar para clonar o modificar los acidos nucleicos de la invencion. Por lo tanto, la divulgacion proporciona pares de secuencia de cebadores de amplificacion para amplificar acidos nucleicos de la invencion. Un experto en la tecnica puede disenar pares de secuencias de cebadores de amplificacion para cualquier parte o la longitud completa de estas secuencias.

Las reacciones de amplificacion tambien se pueden usar para cuantificar la cantidad de acido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular), marcar el acido nucleico (por ejemplo, para aplicarlo a una matriz o una transferencia), detectar el acido nucleico, o cuantificar la cantidad de un acido nucleico especifico en una muestra. En un aspecto de la divulgacion, se amplifica el mensaje aislado a partir de una celula o una biblioteca de ADNc.

El experto en la materia puede seleccionar y disenar cebadores de amplificacion de oligonucleotidos adecuados. Los metodos de amplificacion tambien son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa, PCR (vease, por ejemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., NY, reaccion en cadena de la ligasa (LCR) (vease, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117), amplificacion de la transcripcion (vease, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), y replicacion de secuencias autosostenida (vease, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874); amplificacion de Q Beta replicasa (vease, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491), ensayo de amplificacion automatizada de la Q-beta replicasa (vease, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) y otras tecnicas mediadas por la RNA polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); vease tambien Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316; Sambrook; Ausubel; las patentes de Estados Unidos Nos. 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564.

Determinacion del grado de identidad de secuencia

La invencion proporciona acidos nucleicos que comprenden secuencias que tienen al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o identidad completa de secuencia (100%) con el acido nucleico de la invencion en una region de al menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o mas, residuos. La invencion proporciona polipeptidos que comprenden secuencias que tienen al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o una identidad de secuencia completa (100%) con el polipeptido de la invencion. El grado de identidad de secuencia (homologia) se puede determinar utilizando cualquier programa informatico y los parametros asociados, incluidos los descritos en este documento, como BLAST 2.2.2. o FASTA version 3.0t78, con los parametros predeterminados.

La Figura 35 es un grafico que describe caracteristicas seleccionadas de ejemplos de acidos nucleicos y polipeptidos de la divulgacion, incluida la comparacion de identidad de secuencia de los ejemplos de secuencias con bases de datos publicas. Todas las secuencias descritas en la Figura 35 se sometieron a una busqueda por BLAST (como se describe en detalle a continuacion) contra dos conjuntos de bases de datos. El primer conjunto de bases de datos esta disponible a traves del NCBI (Centro Nacional de Informacion Biotecnologica). Todos los resultados de las busquedas en estas bases de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripcion de NR", "Codigo de acceso de NR", "Evaluacion de NR" u "Organismo de NR". "NR" se refiere a la base de datos de nucleotidos no redundantes mantenida por el NCBI. Esta base de datos esta compuesta por el GenBank, actualizaciones del GenBank y actualizaciones de EMBL. Las entradas en la columna "Descripcion de NR" se refieren a la linea de definicion en cualquier registro del NCBI dado, que incluye una divulgacion de la secuencia, tal como el organismo de origen, el nombre del gen/nombre de la proteina, o alguna divulgacion de la funcion de la secuencia. Las entradas en la columna "Codigo de acceso de NR" se refieren al identificador unico dado a un registro de secuencia. Las entradas en la columna "valor E de NR" se refieren al valor esperado (valor E), que representa la probabilidad de que se encuentre una puntuacion de alineacion tan buena como la encontrada entre la secuencia de consulta (las secuencias de la invencion) y una secuencia de base de datos que se encontraria en el mismo numero de comparaciones entre secuencias aleatorias como se hizo en la presente busqueda de BLAST. Las entradas en la columna "Organismo de NR" se refieren al organismo fuente de la secuencia identificada como el acierto de BLAST mas cercano. El segundo conjunto de bases de datos se conoce colectivamente como la base de datos GeneseqMR, que esta disponible a traves de Thomson Derwent (Filadelfia, PA). Todos los resultados de las busquedas en esta base de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripcion de la proteina de Geneseq", "Codigo de acceso a la proteina de Geneseq", "Evaluacion de la proteina de Geneseq", "Descripcion del ADN de Geneseq", "Codigo de acceso al ADN de Geneseq" o "valor E del ADN de Geneseq". La informacion que se encuentra en estas columnas es comparable a la informacion que se encuentra en las columnas de NR descritas anteriormente, excepto que se derivo de busquedas de BLAST contra la base de datos GeneseqMR en lugar de las bases de datos del NCBI. Ademas, esta tabla incluye la columna "EC predicho No.". Un numero de EC es el numero asignado a un tipo de enzima segun un esquema de nomenclatura enzimatica estandarizada desarrollado por la Comision de Enzimas del Comite de Nomenclatura de la Union Internacional de Bioquimica y Biologia Molecular (IUBMB). Los resultados en la columna "EC predicho No." se determinan mediante una busqueda por BLAST contra la base de datos de Kegg (Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto). Si la coincidencia superior de BLAST tiene un valor E igual o menor que e-6, el numero de EC asignado a la coincidencia superior se ingresa en la tabla. El numero de EC del primer acierto se utiliza como una guia para determinar cual debe ser el numero de EC de la secuencia de la divulgacion. Las columnas "Longitud de ADN de consulta" y "Longitud de proteina de consulta" se refieren al numero de nucleotidos o al numero de aminoacidos, respectivamente, en la secuencia de la divulgacion que se busco o se consulto contra las bases de datos del NCBI o Geneseq. Las columnas "Longitud de ADN de Geneseq o NR" y "Longitud de proteina de Geneseq o NR" se refieren al numero de nucleotidos o al numero de aminoacidos, respectivamente, en la secuencia de la coincidencia superior de la busqueda por BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas provienen de la busqueda que arrojo el valor E inferior, ya sea de las bases de datos del NCBI o de la base de datos de Geneseq. Las columnas "% de ID de proteina de Geneseq o NR" y "% de ID de ADN de Geneseq o NR" se refieren al porcentaje de identidad de secuencia entre la secuencia de la divulgacion y la secuencia de la mayor coincidencia por BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas provienen de la busqueda que arrojo el valor E inferior, ya sea de las bases de datos del NCBI o de la base de datos de Geneseq.

Las secuencias homologas tambien incluyen secuencias de ARN en las que las uridinas reemplazan a las timinas en las secuencias de acido nucleico. Las secuencias homologas pueden obtenerse utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento o pueden resultar de la correccion de un error de secuenciacion. Se apreciara que las secuencias de acido nucleico tal como se exponen en el presente documento pueden representarse en el formato tradicional de un solo caracter (vease, por ejemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a edicion, W. H Freeman & Co., Nueva York) o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleotidos en una secuencia.

En este aspecto de la invencion se usan diversos programas de comparacion de secuencias identificados en el presente documento. Las identidades de secuencia de proteinas y/o acidos nucleicos (homologias) pueden evaluarse utilizando cualquiera de los diversos algoritmos y programas de comparacion de secuencias conocidos en la tecnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266: 383 -402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3: 266-272, 1993).

La homologia o identidad de secuencia se puede medir utilizando un software de analisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software de analisis de secuencia del Genetics Computer Group, Centro de Biotecnologia de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Dicho software empareja secuencias similares asignando grados de homologia a varias eliminaciones, sustituciones y otras modificaciones. Los terminos "homologia" e "identidad" en el contexto de dos o mas secuencias de acidos nucleicos o polipeptidicas, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especifico de residuos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales cuando se comparan y alinean para una correspondencia maxima en una ventana de comparacion o region designada segun lo medido utilizando cualquier numero de algoritmos de comparacion de secuencias o mediante alineacion manual e inspeccion visual. Para la comparacion de secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia de la invencion, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en un ordenador, las coordenadas de la subsecuencia se designan, si es necesario, y se designan los parametros del programa de algoritmos de secuencia. Se pueden usar los parametros predeterminados del programa, o se pueden designar parametros alternativos. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula luego el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relacion con la secuencia de referencia, en funcion de los parametros del programa.

Una "ventana de comparacion", como se usa en este documento, incluye una referencia a un segmento de uno cualquiera de los numeros de residuos contiguos. Por ejemplo, en aspectos alternativos de la invencion, los residuos contiguos que van desde 20 hasta el polipeptido de longitud completa o la secuencia de acido nucleico de la invencion se comparan con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias esten alineadas de manera optima. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida para un ejemplo de secuencia de polipeptido o de acido nucleico de la invencion, por ejemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas de identidad de secuencia con una secuencia de la invencion, esa secuencia esta dentro del alcance de la invencion.

Los metodos de alineacion de secuencia para comparacion son bien conocidos en la tecnica. En aspectos alternativos, la alineacion optima de secuencias para comparacion se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, por el algoritmo de alineacion de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, por la busqueda mediante el metodo de similitud de persona y Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85: 2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genetica de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineacion manual e inspeccion visual. Otros algoritmos para determinar la homologia o identidad incluyen, por ejemplo, ademas de un programa BLAST (herramienta de busqueda de alineacion local basica en el Centro Nacional de Informacion Biologica), ALIGN, AMAS (analisis de secuencias de alineacion multiple), AMPS (alineamiento de secuencias multiples de proteinas), ASSET (herramienta de evaluacion estadistica de segmentos alineados), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (nodo de analisis comparativo de secuencias biologicas), BLIMPS (buscador mejorado de bloques), FASTA, intervalos y puntos, b Mb , CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo Las Vegas, FNAT (herramienta de alineacion forzada de nucleotidos), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (paquete de analisis de secuencia de Fristensky), GAP (programa de alineacion global), GENIAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Comparacion de secuencia sensible), LALIGN (alineacion de secuencia local), LCP (programa de contenido local), MACAW (banco de trabajo de construccion y analisis de alineacion multiple), MAP (programa de alineacion multiple), MBLKP, MBLKN, PIMa (alineacion de secuencia multiple inducida por patron), SAGA (alineacion de secuencia por algoritmo genetico) y WHAT-IF. Dichos programas de alineacion tambien pueden usarse para seleccionar bases de datos genomicas para identificar secuencias de polinucleotidos que tienen secuencias sustancialmente identicas. Se encuentran disponibles varias bases de datos de genoma, por ejemplo, una parte sustancial del genoma humano esta disponible como parte del Proyecto de Secuenciacion del Genoma Humano (Gibbs, 1995). Varios genomas han sido secuenciados, por ejemplo, M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), y levadura (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997), y D. melanogaster (Adams et al., 2000). Tambien se ha logrado un progreso significativo en la secuenciacion de los genomas de un organismo modelo, como el raton, C. elegans, y Arabadopsis sp. Las bases de datos que contienen informacion genomica anotada con cierta informacion funcional son mantenidas por diferentes organizaciones y son accesibles a traves de Internet.

Los algoritmos BLAST, BLAST 2.0 y BLAST 2.2.2 tambien se pueden usar para practicar la invencion. Se describen, por ejemplo, en Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El software para realizar los analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica. Este algoritmo involucra primero la identificacion de pares de secuencias de alta puntuacion (HSP) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuacion de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se conoce como el umbral de puntuacion de la palabra vecina (Altschul (1990) citado anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actuan como semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP mas largos que los contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se puede aumentar la puntuacion de alineacion acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0). Para las secuencias de aminoacidos, se utiliza una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulativa. La extension de los aciertos de palabras en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulada cae en una cantidad X desde su valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuacion negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) usa como predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP utiliza como valor predeterminado una longitud de palabra de 3, y expectativas (E) de 10, y las alineaciones de matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de ambas cadenas. El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadistico de la similitud entre dos secuencias (vease, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la cual se produciria una coincidencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,01, y mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,001. En un aspecto, las homologias de secuencia de acido nucleico y proteina se evaluan utilizando la herramienta de busqueda de alineacion local basica ("BLAST"). Por ejemplo, se pueden usar cinco programas BLAST especificos para realizar la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de consulta de aminoacidos con una base de datos de secuencias de proteinas; (2) BLASTN compara una secuencia de consulta de nucleotidos con una base de datos de secuencias de nucleotidos; (3) BLASTX compara los productos de traduccion conceptual de seis marcos de una secuencia de nucleotidos de consulta (ambas cadenas) con una base de datos de secuencias de proteinas; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteinas de consulta con una base de datos de secuencias de nucleotidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); y, (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleotidos con las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleotidos. Los programas BLAST identifican secuencias homologas identificando segmentos similares, a los que se hace referencia aqui como "pares de segmentos de alta puntuacion", entre una secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos de consulta y una secuencia de prueba que se obtiene preferiblemente de una base de datos de secuencias de acidos nucleicos o proteinas. Los pares de segmentos de puntuacion alta se identifican preferiblemente (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuacion, muchas de las cuales son conocidas en la tecnica. Preferiblemente, la matriz de puntuacion utilizada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256: 1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993). Menos preferiblemente, tambien se pueden usar las matrices PAM o PAM250 (vease, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices para Detectar Relaciones a Distancia: Atlas de Secuencia y Estructura de Proteinas, Washington: National Biomedical Research Foundation).

En un aspecto de la invencion, para determinar si un acido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida para estar dentro del alcance de la invencion, se usan los programas BLAST 2.2.2 del NCBI, opciones predeterminadas para blastp. Hay alrededor de 38 opciones de configuracion en el programa BLAST 2.2.2. En este aspecto ejemplar de la invencion, se utilizan todos los valores predeterminados excepto el ajuste de filtrado predeterminado (es decir, todos los parametros establecidos de forma predeterminada, excepto el filtrado que se coloca en APAGADO); en su lugar se usa una configuracion "-F F", que deshabilita el filtrado. El uso del filtrado predeterminado a menudo da como resultado violaciones de Karlin-Altschul debido a una secuencia de corta longitud.

Los valores predeterminados utilizados en este aspecto ejemplar de la invencion, y para determinar los valores en la Figura 35, como se discutio anteriormente, incluyen:

"Filtro para baja complejidad: ENCENDIDO

Tamano de palabra: 3

Matriz: Blosum62

Costes de la brecha: Existencia: 11

Extension: 1"

Otros ajustes predeterminados pueden ser: filtro para baja complejidad APAGADO, tamano de palabra de 3 para proteina, matriz BLOSUM62, penalizacion por existencia de hueco de -11 y penalizacion por extension de hueco de -1. Un ejemplo de configuracion del programa BLAST 2.2.2 del NCBI tiene la opcion "-W" predeterminada en 0. Esto significa que, si no se establece, el tamano de palabra predeterminado es 3 para proteinas y 11 para nucleotidos.

Sistemas informaticos y productos de programas informaticos.

Para determinar e identificar identidades de secuencia, homologias estructurales, motivos y similares in silico, la secuencia de la invencion puede almacenarse, grabarse y manipularse en cualquier medio que pueda ser leido y accedido por un ordenador. Por consiguiente, la divulgacion proporciona ordenadores, sistemas informaticos, medios legibles por ordenador, productos de programas informaticos y similares grabados o almacenados en ellos las secuencias de acidos nucleicos y polipeptidos de la invencion. Tal como se usa en el presente documento, las palabras "grabado" y "almacenado" se refieren a un proceso para almacenar informacion en un medio informatico. Un experto en la tecnica puede adoptar facilmente cualquier metodo conocido para registrar informacion en un medio legible por ordenador para generar productos que comprenden una o mas de las secuencias de acido nucleico y/o polipeptidos de la invencion.

Otro aspecto de la divulgacion es un medio legible por ordenador que tiene registrado en el al menos una secuencia de acido nucleico y/o polipeptido de la invencion. Los medios legibles por ordenador incluyen medios legibles magneticamente, medios legibles opticamente, medios legibles electronicamente y medios magneticos/opticos. Por ejemplo, los medios legibles por ordenador pueden ser un disco duro, un disquete, una cinta magnetica, un CD-ROM, un disco digital versatil (DVD), una memoria de acceso aleatorio (RAM) o una memoria de solo lectura (ROM), entre otros tipos de otros medios conocidos por los expertos en la tecnica.

Los aspectos de la divulgacion incluyen sistemas (por ejemplo, sistemas basados en Internet), particularmente sistemas informaticos, que almacenan y manipulan las secuencias y la informacion de secuencias descritas en el presente documento. Un ejemplo de un sistema 100 informatico se ilustra en forma de diagrama de bloques en la Figura 1. Como se usa en este documento, "un sistema informatico" se refiere a los componentes de hardware, componentes de software y componentes de almacenamiento de datos utilizados para analizar una secuencia de nucleotidos o polipeptidos de la invencion. El sistema 100 informatico puede incluir un procesador para procesar, acceder y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo conocido de unidad central de procesamiento, tal como, por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o un procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD o International Business Machines. El sistema 100 informatico es un sistema de proposito general que comprende el procesador 105 y uno o mas componentes 110 de almacenamiento de datos internos para almacenar datos, y uno o mas dispositivos de recuperacion de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un experto en la tecnica puede apreciar facilmente que cualquiera de los sistemas informaticos actualmente disponibles es adecuado.

En un aspecto, el sistema 100 informatico incluye un procesador 105 conectado a un bus que esta conectado a una memoria 115 principal (preferiblemente implementada como RAM) y uno o mas dispositivos 110 internos de almacenamiento de datos, tal como un disco duro y/u otros medios legibles por ordenador que tengan datos grabados en ellos. El sistema 100 informatico puede incluir ademas uno o mas dispositivos 118 de recuperacion de datos para leer los datos almacenados en los dispositivos 110 internos de almacenamiento de datos. El dispositivo 118 de recuperacion de datos puede representar, por ejemplo, una unidad de disquete, una unidad de disco compacto, una unidad magnetica, o un modem capaz de conectarse a un sistema de almacenamiento de datos remoto (por ejemplo, a traves de Internet), etc. En algunas realizaciones, el dispositivo 110 interno de almacenamiento de datos es un medio extraible que se puede leer en un ordenador, tal como un disquete, un disco compacto, una cinta magnetica, etc., que contenga logica de control y/o datos grabados en ella. El sistema 100 informatico puede incluir ventajosamente o ser programado por un software apropiado para leer la logica de control y/o los datos del componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperacion de datos. El sistema 100 informatico incluye una pantalla 120 que se utiliza para mostrar la salida a un usuario del ordenador. Tambien se debe tener en cuenta que el sistema 100 informatico se puede vincular a otros sistemas 125a-c informaticos en una red o red de area amplia para proporcionar acceso centralizado al sistema 100 informatico. Software para acceder y procesar las secuencias de nucleotidos o aminoacidos de la invencion puede residir en la memoria 115 principal durante la ejecucion. En algunos aspectos, el sistema 100 informatico puede comprender ademas un algoritmo de comparacion de secuencias para comparar una secuencia de acido nucleico de la invencion. El algoritmo y la secuencia o secuencias se pueden almacenar en un medio legible por ordenador. Un "algoritmo de comparacion de secuencias" se refiere a uno o mas programas que se implementan (local o remotamente) en el sistema 100 informatico para comparar una secuencia de nucleotidos con otras secuencias de nucleotidos y/o compuestos almacenados dentro de un medio de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparacion de secuencias puede comparar las secuencias de nucleotidos de la invencion almacenadas en un medio legible por ordenador para hacer referencia a las secuencias almacenadas en un medio legible por ordenador para identificar homologias o motivos estructurales.

Los parametros utilizados con los algoritmos anteriores pueden adaptarse segun la longitud de la secuencia y el grado de homologia estudiado. En algunos aspectos, los parametros pueden ser los parametros predeterminados utilizados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleotidos o proteinas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homologia entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema 100 informatico, o una base de datos publica como GENBANK que esta disponible a traves de la Internet. El proceso 200 comienza en un estado 201 de inicio y luego se mueve a un estado 202 en el que la nueva secuencia que se va a comparar se almacena en una memoria en un sistema 100 informatico. Como se explico anteriormente, la memoria podria ser cualquier tipo de memoria, incluida la RAM o un dispositivo interno de almacenamiento. El proceso 200 luego se mueve a un estado 204 en el que se abre una base de datos de secuencias para analisis y comparacion. El proceso 200 luego se mueve a un estado 206 en el que la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en el ordenador. Luego se realiza una comparacion en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante tener en cuenta que este paso no se limita a realizar una comparacion exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Los expertos en la tecnica conocen metodos bien conocidos para comparar dos secuencias de nucleotidos o proteinas, incluso si no son identicas. Por ejemplo, se pueden introducir huecos en una secuencia para elevar el nivel de homologia entre las dos secuencias probadas. Los parametros que controlan si los huecos u otras caracteristicas se introducen en una secuencia durante la comparacion normalmente los ingresa el usuario del sistema informatico. Una vez que se ha realizado una comparacion de las dos secuencias en el estado 210, se realiza una determinacion en un estado 210 de decision si las dos secuencias son iguales. Por supuesto, el termino "igual" no se limita a secuencias que son absolutamente identicas. Las secuencias que estan dentro de los parametros de homologia ingresados por el usuario se marcaran como "iguales" en el proceso 200. Si se determina que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 se mueve a un estado 214 en el que el nombre de la secuencia de la base de datos se muestra al usuario. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre mostrado cumple las restricciones de homologia que se ingresaron. Una vez que el nombre de la secuencia almacenada se muestra al usuario, el proceso 200 pasa a un estado 218 de decision en el que se determina si existen mas secuencias en la base de datos. Si no existen mas secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en un estado 220 final. Sin embargo, si existen mas secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 se mueve a un estado 224 en el que un puntero se mueve a la siguiente secuencia en la base de datos para que pueda ser comparada con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia en la base de datos. Se debe tener en cuenta que si se hubiera realizado una determinacion en el estado 212 de decision de que las secuencias no eran homologas, el proceso 200 pasaria inmediatamente al estado 218 de decision para determinar si habia otras secuencias disponibles en la base de datos para comparacion. Por consiguiente, un aspecto de la divulgacion es un sistema informatico que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenado en el una secuencia de acido nucleico de la invencion y un comparador de secuencias para realizar la comparacion. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homologia entre las secuencias comparadas o identificar motivos estructurales, o puede identificar motivos estructurales en secuencias que se comparan con estos codigos de acidos nucleicos y codigos de polipeptidos. La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una realizacion de un proceso 250 en un ordenador para determinar si dos secuencias son homologas. El proceso 250 comienza en un estado 252 de inicio y luego se mueve a un estado 254 en el que se almacena en una memoria una primera secuencia para comparar. La segunda secuencia que se compara se almacena luego en una memoria en un estado 256. El proceso 250 luego se mueve a un estado 260 en el que se lee el primer caracter de la primera secuencia y luego a un estado 262 en donde el primer caracter de la segunda secuencia es leido. Debe entenderse que si la secuencia es una secuencia de nucleotidos, entonces el caracter seria normalmente A, T, C, G o U. Si la secuencia es una secuencia de proteina, entonces puede ser un codigo de aminoacidos de una sola letra para que la primera secuencia y las demas puedan compararse facilmente. Luego se toma una determinacion en un estado 264 de decision si los dos caracteres son iguales. Si son iguales, entonces el proceso 250 pasa a un estado 268 en el que se leen los siguientes caracteres de la primera y la segunda secuencia. Luego se determina si los siguientes caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 continua este circuito cerrado hasta que dos caracteres no sean iguales. Si se determina que los siguientes dos caracteres no son iguales, el proceso 250 pasa al estado 274 de decision para determinar si hay mas caracteres o secuencia para leer. Si no hay mas caracteres para leer, entonces el proceso 250 pasa a un estado 276 en el que el nivel de homologia entre la primera y la segunda secuencia se muestra al usuario. El nivel de homologia se determina calculando la proporcion de caracteres entre las secuencias que eran iguales del numero total de secuencias en la primera secuencia. Por lo tanto, si cada caracter en una primera secuencia de 100 nucleotidos se alinea con cada caracter en una segunda secuencia, el nivel de homologia seria 100%.

Alternativamente, el programa informatico puede comparar una secuencia de referencia con la secuencia de la invencion para determinar si las secuencias difieren en una o mas posiciones. El programa puede registrar la longitud y la identidad de nucleotidos o residuos de aminoacidos insertados, eliminados o sustituidos con respecto a la secuencia de la referencia o la invencion. El programa infofrmatico puede ser un programa que determina si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de nucleotido unico (SNP) con respecto a una secuencia de la invencion, o si una secuencia de la invencion comprende un SNP de una secuencia conocida. Por lo tanto, en algunos aspectos, el programa informatico es un programa que identifica los SNP. El metodo puede ser implementado por los sistemas informaticos descritos anteriormente y el metodo ilustrado en la Figura 3. El metodo puede realizarse leyendo una secuencia de la invencion y las secuencias de referencia mediante el uso del programa informatico e identificando las diferencias con el programa informatico.

En otros aspectos, el sistema basado en ordenador comprende un identificador para identificar caracteristicas dentro de un acido nucleico o polipeptido de la invencion. Un "identificador" se refiere a uno o mas programas que identifican ciertas caracteristicas dentro de una secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifica un marco de lectura abierto (ORF) en una secuencia de acido nucleico. La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 300 identificador para detectar la presencia de una caracteristica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un estado 302 de inicio y luego se desplaza a un estado 304 en el que se almacena una primera secuencia que debe verificarse en una memoria 115 en el sistema 100 informatico. El proceso 300 luego se desplaza a un estado 306 en el que se abre la base de datos de caracteristicas de la secuencia. Dicha base de datos incluiria una lista de los atributos de cada caracteristica junto con el nombre de la caracteristica. Por ejemplo, un nombre de caracteristica podria ser "Codon de inicio" y el atributo seria "ATG". Otro ejemplo seria el nombre de la caracteristica "Caja TAATAA" y el atributo de la caracteristica seria "TAATAA". Un ejemplo de tal base de datos es producido por el Grupo de Computacion de Genetica de la Universidad de Wisconsin. Alternativamente, las caracteristicas pueden ser motivos de polipeptidos estructurales tales como helices alfa, laminas beta o motivos de polipeptidos funcionales tales como sitios activos enzimaticos, motivos de helice-giro-helice u otros motivos conocidos por los expertos en la tecnica. Una vez que la base de datos de caracteristicas se abre en el estado 306, el proceso 300 pasa a un estado 308 en el que la primera caracteristica se lee de la base de datos. A continuacion, se realiza una comparacion del atributo de la primera caracteristica con la primera secuencia en un estado 310. Luego se realiza una determinacion en un estado 316 de decision si el atributo de la caracteristica se encontro en la primera secuencia. Si se encontro el atributo, entonces el proceso 300 pasa a un estado 318 en el que el nombre de la caracteristica encontrada se muestra al usuario. El proceso 300 luego pasa a un estado 320 de decision en el que se determina si existen caracteristicas de movimiento en la base de datos. Si no existen mas caracteristicas, entonces el proceso 300 termina en un estado 324 final. Sin embargo, si existen mas caracteristicas en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente caracteristica de secuencia en un estado 326 y vuelve al estado 310 en el que el atributo de la siguiente caracteristica se compara con la primera secuencia. Si el atributo de la caracteristica no se encuentra en la primera secuencia en el estado 316 de decision, el proceso 300 pasa directamente al estado 320 de decision para determinar si existen mas caracteristicas en la base de datos. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgacion proporciona un programa informatico que identifica marcos de lectura abiertos (ORF).

Una secuencia de polipeptidos o acidos nucleicos de la invencion puede almacenarse y manipularse en una variedad de programas procesadores de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de textos, tal como Microsoft WORD o WORDPERFECT o como un archivo ASCII en una variedad de programas de base de datos que son familiares para los expertos en la tecnica, tales como DB2, SYBASE u ORACLE. Ademas, muchos programas informaticos y bases de datos pueden usarse como algoritmos de comparacion de secuencias, identificadores o fuentes de secuencias de nucleotidos de referencia o secuencias polipeptidicas para comparar con una secuencia de acido nucleico de la invencion. Los programas y bases de datos utilizados para practicar la invencion incluyen, entre otros: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST and BLAST2 (NCBI), BLa St N and BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FAs TA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report, la base de datos Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos World Drug Index de Derwent, la base de datos BioByteMasterFile, la base de datos GenBank y la base de datos Geneseq. Muchos otros programas y bases de datos serian evidentes para un experto en la tecnica dada la presente divulgacion.

Los motivos que pueden detectarse utilizando los programas anteriores incluyen secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de helice-giro-helice, sitios de glicosilacion, sitios de ubiquitinacion, helices alfa y laminas beta, secuencias senal que codifican peptidos senal que dirigen la secrecion de las proteinas codificadas, secuencias implicadas en la regulacion de la transcripcion, tales como homeoboxes, tramos acidos, sitios enzimaticos activos, sitios de union al sustrato y sitios de escision enzimatica.

Hibridacion de acidos nucleicos

La divulgacion proporciona acidos nucleicos aislados o recombinantes que se hibridan en condiciones rigurosas con un ejemplo de secuencia de la invencion, o un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion. Las condiciones rigurosas pueden ser condiciones altamente rigurosas, condiciones rigurosas medias, condiciones rigurosas bajas, incluidas las condiciones de rigurosidad alta y reducida descritas en este documento. En un aspecto, es la rigurosidad de las condiciones de lavado las que establecen las condiciones que determinan si un acido nucleico esta dentro del alcance de la invencion, como se describe a continuacion.

En realizaciones alternativas, los acidos nucleicos de la divulgacion, tal como se define por su capacidad para hibridar en condiciones rigurosas, pueden estar entre aproximadamente cinco residuos y la longitud completa del acido nucleico de la invencion; por ejemplo, pueden ser al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas, residuos de longitud. Tambien se incluyen los acidos nucleicos mas cortos que la longitud total. Estos acidos nucleicos pueden ser utiles, por ejemplo, como sondas de hibridacion, sondas de marcaje, sondas de oligonucleotidos de PCR, ARNi, antisentido o secuencias que codifican peptidos de union a anticuerpos (epitopos), motivos, sitios activos y similares.

En un aspecto, los acidos nucleicos de la divulgacion se definen por su capacidad para hibridar bajo condiciones rigurosas que comprende condiciones de aproximadamente formamida al 50% a aproximadamente 37°C a 42°C. En un aspecto, los acidos nucleicos de la divulgacion se definen por su capacidad para hibridar bajo condiciones de rigurosidad reducida que comprenden condiciones de aproximadamente formamida del 35% al 50% a aproximadamente 30°C a 35°C.

Alternativamente, los acidos nucleicos de la divulgacion se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de alta rigurosidad que comprenden condiciones a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, SDS al 0,3% y una secuencia repetitiva que bloquea el acido nucleico, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmon (por ejemplo, 200 ng/mL de ADN de esperma de salmon esquilado y desnaturalizado). En un aspecto, los acidos nucleicos de la divulgacion se definen por su capacidad para hibridar bajo condiciones de rigurosidad reducida que comprenden formamida al 35% a una temperatura reducida de 35°C.

Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5% a 50°C. Estas condiciones se consideran condiciones "moderadas" por encima de formamida al 25% y condiciones "bajas" por debajo de formamida al 25%. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se realiza con formamida al 30%. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion de "baja rigurosidad" es cuando la hibridacion anterior se realiza con formamida al 10%.

El intervalo de temperatura correspondiente a un nivel particular de rigurosidad puede reducirse adicionalmente calculando la relacion de purina a pirimidina del acido nucleico de interes y ajustando la temperatura en consecuencia. Los acidos nucleicos de la divulgacion tambien se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de rigurosidad alta, media y baja como se expone en Ausubel y Sambrook. Las variaciones en los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la tecnica. Las condiciones de hibridacion se discuten adicionalmente, a continuacion.

El procedimiento anterior se puede modificar para identificar acidos nucleicos que tienen niveles decrecientes de homologia con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener acidos nucleicos de homologia decreciente con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, la temperatura de hibridacion puede disminuirse en incrementos de 5°C desde 68°C a 42°C en un regulador de hibridacion que tiene una concentracion de Na+ de aproximadamente 1M. Despues de la hibridacion, el filtro puede lavarse con 2X SSC, SDS al 0,5% a la temperatura de hibridacion. Estas condiciones se consideran condiciones "moderadas" por encima de 50°C y condiciones "bajas" por debajo de 50°C. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se realiza a 55°C. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion de "baja rigurosidad" es cuando la hibridacion anterior se realiza a 45°C.

Como alternativa, la hibridacion se puede llevar a cabo en reguladores, tales como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentracion de formamida en el regulador de hibridacion puede reducirse en incrementos de 5% desde 50% al 0% para identificar clones que tienen niveles decrecientes de homologia con la sonda. Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5% a 50°C. Estas condiciones se consideran condiciones "moderadas" por encima de formamida al 25% y condiciones "bajas" por debajo de formamida al 25%. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se realiza con formamida al 30%. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion de "baja rigurosidad" es cuando la hibridacion anterior se realiza con formamida al 10%.

Sin embargo, la seleccion de un formato de hibridacion no es critica, es la rigurosidad de las condiciones de lavado las que establecen las condiciones que determinan si un acido nucleico esta dentro del alcance de la divulgacion. Las condiciones de lavado utilizadas para identificar los acidos nucleicos dentro del alcance de la divulgacion incluyen, por ejemplo: una concentracion de sal de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50°C o aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C; o, una concentracion de sal de aproximadamente NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos; o, una concentracion de sal de aproximadamente 0.2X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50°C o aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridacion se lava dos veces con una solucion con una concentracion de sal de aproximadamente 2X SSC que contiene SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se lava dos veces con 0,1X SSC que contiene SDS al 0,1% a 68°C durante 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Vease Sambrook, Tijssen y Ausubel para obtener una descripcion del regulador SSC y condiciones equivalentes.

Estos metodos pueden usarse para aislar acidos nucleicos de la divulgacion.

Sondas de oligonucleotidos y metodos para su uso

La divulgacion tambien proporciona sondas de acido nucleico que pueden usarse, por ejemplo, para identificar acidos nucleicos que codifican un polipeptido con una actividad de amilasa o fragmentos de los mismos o para identificar genes de amilasa. En un aspecto, la sonda comprende al menos 10 bases consecutivas de un acido nucleico de la invencion. Alternativamente, una sonda de la divulgacion puede ser al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 o aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 20 a 60 aproximadamente 30 a 70, bases consecutivas de una secuencia como se expone en un acido nucleico de la invencion. Las sondas identifican un acido nucleico mediante union y/o hibridacion. Las sondas se pueden usar en las matrices de la divulgacion, vease la discusion a continuacion, que incluye, por ejemplo, matrices capilares. Las sondas de la divulgacion tambien se pueden usar para aislar otros acidos nucleicos o polipeptidos.

Las sondas de la divulgacion se pueden usar para determinar si una muestra biologica, tal como una muestra de suelo, contiene un organismo que tiene una secuencia de acido nucleico de la invencion o un organismo del cual se obtuvo el acido nucleico. En tales procedimientos, se obtiene una muestra biologica que alberga potencialmente el organismo a partir del cual se aislo el acido nucleico y se obtienen acidos nucleicos de la muestra. Los acidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda se hibride especificamente con cualquier secuencia complementaria presente en la muestra. Cuando sea necesario, las condiciones que permiten que la sonda se hibride especificamente con secuencias complementarias pueden determinarse colocando la sonda en contacto con secuencias complementarias de muestras que se sabe que contienen la secuencia complementaria, asi como secuencias de control que no contienen la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridacion, como la concentracion de sal del regulador de hibridacion, la concentracion de formamida del regulador de hibridacion o la temperatura de hibridacion, se pueden variar para identificar las condiciones que permiten que la sonda se hibride especificamente con acidos nucleicos complementarios (vease discusion sobre condiciones especificas de hibridacion).

Si la muestra contiene el organismo a partir del cual se aislo el acido nucleico, entonces se detecta la hibridacion especifica de la sonda. La hibridacion puede detectarse marcando la sonda con un agente detectable tal como un isotopo radioactivo, un colorante fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formacion de un producto detectable. Muchos metodos para usar las sondas marcadas para detectar la presencia de acidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para los expertos en la tecnica. Estos incluyen transferencias Southern, transferencias Northern, procedimientos de hibridacion de colonias y transferencias de puntos. Los protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y Sambrook.

Alternativamente, mas de una sonda (al menos una de las cuales es capaz de hibridar especificamente con cualquier secuencia complementaria que este presente en la muestra de acido nucleico), se puede usar en una reaccion de amplificacion para determinar si la muestra contiene un organismo que contiene una secuencia de acido nucleico de la invencion (por ejemplo, un organismo a partir del cual se aislo el acido nucleico). En un aspecto, las sondas comprenden oligonucleotidos. En un aspecto, la reaccion de amplificacion puede comprender una reaccion de PCR. Los protocolos de PCR se describen en Ausubel y Sambrook (vease discusion sobre las reacciones de amplificacion). En tales procedimientos, los acidos nucleicos en la muestra se ponen en contacto con las sondas, se realiza la reaccion de amplificacion y se detecta cualquier producto de amplificacion resultante. El producto de amplificacion se puede detectar realizando una electroforesis en gel en los productos de reaccion y tinendo el gel con un intercalador como el bromuro de etidio. Alternativamente, una o mas de las sondas pueden marcarse con un isotopo radioactivo y la presencia de un producto de amplificacion radioactivo puede detectarse mediante autorradiografia despues de la electroforesis en gel.

Las sondas derivadas de secuencias cercanas a los extremos 3' o 5' de una secuencia de acido nucleico de la invencion tambien se pueden usar en procedimientos de desplazamiento de cromosomas para identificar clones que contienen secuencias adicionales, por ejemplo, genomicas. Tales metodos permiten el aislamiento de genes que codifican proteinas adicionales de interes del organismo huesped.

En un aspecto, las secuencias de acido nucleico de la invencion se usan como sondas para identificar y aislar acidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los acidos nucleicos relacionados asf identificados pueden ser ADNc o ADN genomico de organismos distintos de los que se aislo por primera vez el acido nucleico de la invencion. En tales procedimientos, una muestra de acido nucleico se pone en contacto con la sonda en condiciones que permitan que la sonda se hibride especfficamente con secuencias relacionadas. La hibridacion de la sonda con los acidos nucleicos del organismo relacionado se detecta luego utilizando cualquiera de los metodos descritos anteriormente.

En las reacciones de hibridacion de acidos nucleicos, las condiciones utilizadas para lograr un nivel particular de rigurosidad pueden variar, dependiendo de la naturaleza de los acidos nucleicos que se hibridan. Por ejemplo, la longitud, el grado de complementariedad, la composicion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, contenido de GC frente a AT) y el tipo de acido nucleico (por ejemplo, ARN frente a ADN) de las regiones de hibridacion de los acidos nucleicos pueden considerarse al seleccionar las condiciones de hibridacion. Una consideracion adicional es si uno de los acidos nucleicos esta inmovilizado, por ejemplo, en un filtro. La hibridacion se puede llevar a cabo en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad moderada o alta rigurosidad. Como ejemplo de hibridacion de acido nucleico, una membrana polimerica que contiene acidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados se prehidrata primero durante 30 minutos a 45°C en una solucion que consiste en NaCl 0,9 M, NaH2PO450 mM, pH 7,0, Na2EDTA 5,0 mM, SDS al 0,5%, reactivo de Denhardt 10X, y 0,5 mg/mL de acido polirriboademlico. Luego, se pueden agregar a la solucion aproximadamente 2 X 107 cpm (actividad especffica 4-9 X 108 cpm/pg) de la sonda de oligonucleotido marcada en el extremo con 32P. Despues de 12-16 horas de incubacion, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en 1X SET (NaCl 150 mM, Tris clorhidrato 20 mM, pH 7,8, Na2EDTA 1 mM) que contiene SDS al 0,5%, seguido de 30 lavado por minuto en 1X SET fresco a Tm-10°C para la sonda oligonucleotfdica. La membrana se expone luego a una pelfcula autorradiografica para la deteccion de senales de hibridacion.

Al variar la rigurosidad de las condiciones de hibridacion utilizadas para identificar acidos nucleicos, como los ADNc o ADN genomico, que se hibridan con la sonda detectable, se pueden identificar y aislar acidos nucleicos que tienen diferentes niveles de homologfa con la sonda. La rigurosidad puede variar realizando la hibridacion a temperaturas variables por debajo de las temperaturas de fusion de las sondas. La temperatura de fusion, Tm, es la temperatura (con una fuerza ionica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales o aproximadamente 5°C mas bajas que la Tm para una sonda en particular. La temperatura de fusion de la sonda se puede calcular utilizando los siguientes ejemplos de formulas. Para sondas de 14 y 70 nucleotidos de longitud, la temperatura de fusion (Tm) se calcula utilizando la formula: Tm = 81,5 16,6 (log [Na+]) 0,41 (fraccion G C) - (600/N) en donde N es el Longitud de la sonda. Si la hibridacion se lleva a cabo en una solucion que contiene formamida, la temperatura de fusion se puede calcular mediante la ecuacion: Tm = 81,5 16,6 (log[Na+]) 0,41 (fraccion G C) - (formamida al 0,63%) -(600/N) donde N es la longitud de la sonda. La prehibridacion se puede llevar a cabo en 6X SSC, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5%, 100 pg de ADN de esperma de salmon fragmentado desnaturalizado o 6X SSC, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5%, 100 pg de ADN de esperma de salmon fragmentado desnaturalizado, formamida al 50%. Las formulas para SSC y reactivo de Denhardt y otras soluciones se enumeran, por ejemplo, en Sambrook.

La hibridacion se lleva a cabo anadiendo la sonda detectable a las soluciones de prehibridacion enumeradas anteriormente. Cuando la sonda comprende ADN de cadena doble, se desnaturaliza antes de la adicion a la solucion de hibridacion. El filtro se pone en contacto con la solucion de hibridacion durante un perfodo de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride con los ADNc o ADN genomicos que contienen secuencias complementarias u homologas a la misma. Para sondas de mas de 200 nucleotidos de longitud, la hibridacion se puede llevar a cabo a 15-25°C por debajo de la Tm. Para sondas mas cortas, como las sondas de oligonucleotidos, la hibridacion puede realizarse a 5-10°C por debajo de la Tm. En un aspecto, las hibridaciones en 6X SSC se llevan a cabo a aproximadamente 68°C. En un aspecto, las hibridaciones en soluciones que contienen formamida al 50% se realizan a aproximadamente 42°C. Se considerarfa que todas las hibridaciones anteriores estan bajo condiciones de alta rigurosidad.

Tras la hibridacion, el filtro se lava para eliminar cualquier sonda detectable no unida especfficamente. La rigurosidad utilizada para lavar los filtros tambien puede variar dependiendo de la naturaleza de los acidos nucleicos que se hibridan, la longitud de los acidos nucleicos que se hibridan, el grado de complementariedad, la composicion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, contenido de GC frente a AT), y el tipo de acido nucleico (por ejemplo, ARN frente a ADN). Los ejemplos de lavados de condicion de rigurosidad progresivamente mayor son las siguientes: 2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos (rigurosidad baja); s Sc 0,1X, SDS al 0,5% a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (rigurosidad moderada); 0,1X SSC, SDS al 0,5% durante 15 a 30 minutos entre la temperatura de hibridacion y 68°C (rigurosidad alta); y 0,15 M de NaCl durante 15 minutos a 72°C (rigurosidad muy alta). Se puede realizar un lavado final de baja rigurosidad en 0,1X SSC a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son simplemente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden usar para lavar filtros. Un experto en la tecnica sabrfa que existen numerosas recetas para diferentes rigurosidades de lavado.

Los acidos nucleicos que se han hibridado con la sonda pueden identificarse mediante autorradiograffa u otras tecnicas convencionales. El procedimiento anterior puede modificarse para identificar acidos nucleicos que tienen niveles decrecientes de homologfa con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener acidos nucleicos de homologfa decreciente con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, la temperatura de hibridacion puede disminuirse en incrementos de 5°C de 68°C a 42°C en un regulador de hibridacion que tiene una concentracion de Na+ de aproximadamente 1 M. Despues de la hibridacion, el filtro puede lavarse con 2X SSC, SDS al 0,5% a la temperatura de hibridacion. Estas condiciones se consideran condiciones "moderadas" por encima de 50°C y condiciones "bajas" por debajo de 50°C. Un ejemplo de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se realiza a 55°C. Un ejemplo de condiciones de hibridacion de "baja rigurosidad" es cuando la hibridacion anterior se realiza a 45°C.

Como alternativa, la hibridacion puede llevarse a cabo en reguladores, tales como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentracion de formamida en el regulador de hibridacion puede reducirse en incrementos del 5% del 50% al 0% para identificar clones que tienen niveles decrecientes de homologia con la sonda. Despues de la hibridacion, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5% a 50°C. Estas condiciones se consideran condiciones "moderadas" con formamida por encima del 25% y condiciones "bajas" con formamida por debajo del 25%. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion "moderadas" es cuando la hibridacion anterior se realiza con formamida al 30%. Un ejemplo especifico de condiciones de hibridacion de "baja rigurosidad" es cuando la hibridacion anterior se realiza con formamida al 10%.

Estas sondas y metodos de la divulgacion se pueden usar para aislar acidos nucleicos que tienen una secuencia con al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia ("homologia") con una secuencia de acido nucleico de la invencion que comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o mas bases consecutivas de los mismos, y las secuencias complementarias de los mismos. La homologia se puede medir utilizando un algoritmo de alineacion, como se explica en este documento. Por ejemplo, los polinucleotidos homologos pueden tener una secuencia de codificacion que es una variante alelica natural de una de las secuencias de codificacion descritas en el presente documento. Dichas variantes alelicas pueden tener una sustitucion, eliminacion o adicion de uno o mas nucleotidos cuando se comparan con un acido nucleico de la invencion.

Ademas, las sondas y los metodos de la divulgacion se pueden usar para aislar acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tienen al menos aproximadamente el 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia (homologia) con un polipeptido de la invencion que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos consecutivos, segun lo determinado mediante un algoritmo de alineacion de secuencias (por ejemplo, como el algoritmo FASTA version 3.0t78 con los parametros predeterminados, o un programa BLAST 2.2.2 con ejemplos de ajustes como se expone en el presente documento).

Inhibicion de la expresion de la amilasa

La divulgacion proporciona acidos nucleicos complementarios (por ejemplo, secuencias antisentido) a las secuencias de acidos nucleicos de la invencion. Las secuencias antisentido son capaces de inhibir el transporte, el empalme o la transcripcion de los genes que codifican la amilasa. La inhibicion puede efectuarse a traves del direccionamiento del ADN genomico o el ARN mensajero. La transcripcion o funcion del acido nucleico direccionado puede inhibirse, por ejemplo, por hibridacion y/o escision. Un conjunto particularmente util de inhibidores proporcionado por la presente divulgacion incluye oligonucleotidos que pueden unirse al gen o al mensaje de la amilasa, en cualquier caso previniendo o inhibiendo la produccion o funcion de la amilasa. La asociacion puede ser a traves de hibridacion especifica de secuencia. Otra clase util de inhibidores incluye oligonucleotidos que causan la inactivacion o escision del mensaje de amilasa. El oligonucleotido puede tener actividad enzimatica que causa tal escision, tal como los ribozimas. El oligonucleotido puede modificarse quimicamente o conjugarse con una enzima o composicion capaz de escindir el acido nucleico complementario. Un conjunto de muchos de estos oligonucleotidos diferentes puede seleccionarse para aquellos con la actividad deseada.

Oligonucleotidos antisentido

La divulgacion proporciona oligonucleotidos antisentido capaces de unirse al mensaje de amilasa que puede inhibir la actividad proteolitica mediante direccionamiento del ARNm. Las estrategias para disenar oligonucleotidos antisentido estan bien descritas en la literatura cientifica y de patentes, y el experto en la tecnica puede disenar dichos oligonucleotidos de amilasa utilizando los nuevos reactivos de la divulgacion. Por ejemplo, en la tecnica se conocen bien los protocolos de desplazamiento de genes/mapeo de ARN para detectar oligonucleotidos antisentido eficaces, vease, por ejemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314: 168-183, que describe un ensayo de mapeo de ARN, que se basa en tecnicas moleculares estandar para proporcionar un metodo facil y confiable para la seleccion potente de secuencias antisentido. Ver tambien Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198.

Los acidos nucleicos naturales se usan como oligonucleotidos antisentido. Los oligonucleotidos antisentido pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, en aspectos alternativos, los oligonucleotidos antisentido estan entre aproximadamente 5 a 100, aproximadamente 10 a 80, aproximadamente 15 a 60, aproximadamente 18 a 40. La longitud optima puede determinarse por seleccion de rutina. Los oligonucleotidos antisentido pueden estar presentes en cualquier concentracion. La concentracion optima se puede determinar mediante un examen de rutina. Se conoce una amplia variedad de analogos de nucleotidos y acidos nucleicos sinteticos, no naturales, que pueden abordar este problema potencial. Por ejemplo, se pueden usar acidos nucleicos peptfdicos (PNA) que contienen cadenas principales no ionicas, tales como unidades de N-(2-aminoetil)glicina. Tambien se pueden usar oligonucleotidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato, como se describe en el documento WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144: 189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Los oligonucleotidos antisentido que tienen analogos de la cadena principal del ADN sintetico proporcionados por la divulgacion tambien pueden incluir fosfo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquilfosfotriester, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato y acidos nucleicos morfolino carbamato, como se describio anteriormente.

La metodologfa de la qufmica combinatoria se puede usar para crear grandes cantidades de oligonucleotidos que pueden seleccionarse rapidamente para oligonucleotidos especfficos que tienen afinidades de union apropiadas y especificidades hacia cualquier objetivo, como las secuencias de amilasa sentido y antisentido de la divulgacion (vease, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270: 13581 -13584).

Ribozimas inhibitorias

La divulgacion proporciona ribozimas capaces de unirse al mensaje de amilasa. Estas ribozimas pueden inhibir la actividad de la amilasa, por ejemplo, dirigiendose al ARNm. Las estrategias para disenar ribozimas y seleccionar la secuencia antisentido especffica de amilasa para direccionamiento estan bien descritas en la literatura cientffica y de patentes, y el experto en la tecnica puede disenar dichas ribozimas utilizando los nuevos reactivos de la divulgacion. Las ribozimas actuan uniendose a un ARN objetivo a traves de la parte de union al ARN objetivo de una ribozima que se mantiene muy cerca de una parte enzimatica del ARN que escinde el ARN objetivo. Por lo tanto, la ribozima reconoce y se une a un ARN objetivo mediante un par de bases complementarias, y una vez que se une al sitio correcto, actua enzimaticamente para escindir e inactivar el ARN objetivo. La escision de un ARN objetivo de tal manera destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada si la escision se produce en la secuencia de codificacion. Una vez que una ribozima se ha unido y escindido su objetivo de ARN, se puede liberar de ese ARN para unirse y escindir nuevos objetivos repetidamente.

En algunas circunstancias, la naturaleza enzimatica de una ribozima puede ser ventajosa sobre otras tecnologfas, como la tecnologfa antisentido (donde una molecula de acido nucleico simplemente se une a un objetivo de acido nucleico para bloquear su transcripcion, traduccion o asociacion con otra molecula) ya que la concentracion efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapeutico puede ser menor que la de un oligonucleotido antisentido. Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimaticamente. Por lo tanto, una sola molecula de ribozima es capaz de escindir muchas moleculas de ARN objetivo. Ademas, una ribozima es tfpicamente un inhibidor altamente especffico, con la especificidad de la inhibicion que depende no solo del mecanismo de union de la base, sino tambien del mecanismo por el cual la molecula inhibe la expresion del ARN al que se une. Es decir, la inhibicion es causada por la escision del objetivo de ARN y, por lo tanto, la especificidad se define como la relacion de la tasa de escision del ARN dirigido sobre la tasa de escision del ARN no dirigido. Este mecanismo de escision depende de factores adicionales a los involucrados en el emparejamiento de bases. Por lo tanto, la especificidad de accion de una ribozima puede ser mayor que la de un oligonucleotido antisentido en el mismo sitio de ARN.

La ribozima de la divulgacion, por ejemplo, una molecula de ARN de ribozima enzimatica, puede formarse en un motivo de cabeza de martillo, un motivo de horquilla, como un motivo del virus de la hepatitis delta, un motivo de intron del grupo I y/o un ARN similar a RNasaP en asociacion con una secuencia gufa de ARN. Ejemplos de motivos de cabeza de martillo se describen, por ejemplo, en Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8: 183; motivos de horquilla de Hampel (1989) Biochemistry 28: 4929, y Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18: 299; el motivo del virus de la hepatitis delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; el motivo de RNasaP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35: 849; y el intron del grupo I por Cech, patente de los Estados Unidos No.4.987.071. La mencion de estos motivos especfficos no pretende ser limitante. Los expertos en la materia reconoceran que una ribozima de la divulgacion, por ejemplo, una molecula de ARN enzimatica de esta divulgacion, puede tener un sitio de union a sustrato especffico complementario a una o mas de las regiones de ARN del gen objetivo. Una ribozima de la divulgacion puede tener una secuencia de nucleotidos dentro o alrededor de ese sitio de union al sustrato que imparte una actividad de escision de ARN a la molecula.

ARN de interferencia (ARNi)

En un aspecto, la divulgacion proporciona una molecula inhibidora de ARN, la denominada molecula "ARNi", que comprende una secuencia de amilasa de la divulgacion. La molecula de ARNi comprende una molecula de ARN de cadena doble (ARNcd). El ARNi puede inhibir la expresion de un gen de amilasa. En un aspecto, el ARNi tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o mas nucleotidos duplex de longitud. Si bien la divulgacion no esta limitada por ningun mecanismo particular de accion, el ARNi puede entrar en una celula y causar la degradacion de un ARN de cadena sencilla (ARNcs) de secuencias similares o identicas, incluidos los ARNm endogenos. Cuando una celula se expone a un ARN de cadena doble (ARNcd), el ARNm del gen homologo se degrada selectivamente por un proceso llamado ARN de interferencia (ARNi). Un posible mecanismo basico detras del ARNi es la ruptura de un ARN de cadena doble (ARNcd) que hace coincidir una secuencia genica especffica en fragmentos cortos llamados ARN pequeno de interferencia, que desencadenan la degradacion del mRNA que coincide con su secuencia. En un aspecto, las ARNi de la divulgacion se usan en terapias de silenciamiento genico, vease, por ejemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Hoy 7: 1040-1046. En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para degradar selectivamente el ARN utilizando los ARNi de la divulgacion. El proceso se puede practicar in vitro, ex vivo o in vivo. En un aspecto, las moleculas de ARNi de la divulgacion se pueden usar para generar una mutacion de perdida de funcion en una celula, un organo o un animal. Los metodos para fabricar y utilizar moleculas de ARNi para degradar selectivamente el ARN son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos.

6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.

Modificacion de los acidos nucleicos

La divulgacion proporciona metodos para generar variantes de los acidos nucleicos de la invencion, por ejemplo, aquellos que codifican una amilasa. Estos metodos pueden repetirse o usarse en diversas combinaciones para generar amilasas que tienen una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de una amilasa codificada por el acido nucleico plantilla. Estos metodos tambien pueden repetirse o usarse en varias combinaciones, por ejemplo, para generar variaciones en la expresion de genes/mensajes, la traduccion de mensajes o la estabilidad de mensajes. En otro aspecto, la composicion genetica de una celula se altera, por ejemplo, mediante la modificacion de un gen homologo ex vivo, seguido de su reinsercion en la celula.

Un acido nucleico de la invencion puede alterarse por cualquier medio. Por ejemplo, metodos aleatorios o estocasticos, o metodos no estocasticos o de "evolucion dirigida", vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.361.974. Los metodos para la mutacion aleatoria de genes son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.830.696. Por ejemplo, se pueden usar mutagenos para mutar aleatoriamente un gen. Los mutagenos incluyen, por ejemplo, irradiacion con luz ultravioleta o gamma, o un mutageno quimico, por ejemplo, mitomicina, acido nitroso, psoralenos fotoactivados, solos o en combinacion, para inducir rompimientos de ADN susceptibles de ser reparados por recombinacion. Otros mutagenos quimicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, acido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o acido formico. Otros mutagenos son analogos de precursores de nucleotidos, por ejemplo, nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina o acridina. Estos agentes pueden agregarse a una reaccion de PCR en lugar del precursor de nucleotidos mutando asi la secuencia. Tambien se pueden usar agentes de intercalacion tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares.

Se puede usar cualquier tecnica en biologia molecular, por ejemplo, mutagenesis por PCR aleatoria, vease, por ejemplo, Rice (1992) Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 5467-5471; o, mutagenesis de casete multiple combinatoria, vease, por ejemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18: 194-196. Alternativamente, los acidos nucleicos, por ejemplo, los genes, se pueden volver a ensamblar despues de una fragmentacion aleatoria o "estocastica", vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238; 5.605.793. En aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones o eliminaciones mediante PCR propensa a errores, transposicion, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, PCR de ensamblaje, mutagenesis por PCR sexual, mutagenesis in vivo, mutagenesis de casete, mutagenesis de ensamblaje recursivo, mutagenesis de ensamblaje exponencial, mutagenesis especifica del sitio, reensamblaje genico, mutagenesis saturada del sitio del gen (GSSM), reensamblaje de la ligacion sintetica (SLR), recombinacion, recombinacion de secuencia recursiva, mutagenesis del ADN modificado con fosfotioato, mutagenesis de la plantilla que contiene uracilo, mutagenesis duplex con huecos, mutagenesis de reparacion de desajustes puntuales, mutagenesis de cepa huesped de reparacion deficiente, mutagenesis quimica, mutagenesis radiogenica, mutagenesis de eliminacion, mutagenesis de seleccion por restriccion, mutagenesis de purificacion por restriccion, sintesis genica artificial, mutagenesis de ensamblaje, creacion multimerica de acido nucleico quimerico y/o una combinacion de estos y otros metodos.

Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos de recombinacion recursiva y/o metodos que pueden incorporarse en los metodos de la divulgacion: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4: 1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3: 284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391: 288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15: 436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by Dn A shuffling" Nature Medicine 2: 100-103; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries a display on a lac repressor "headpiece dimer’" Journal of Molecular Biology 255: 373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly pCr " En: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. paginas 447-457; Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18: 194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164: 49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13: 549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.

Los metodos mutacionales para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997)

"Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotidedirected random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57: 369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19: 423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229: 1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237: 1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagenesis usando plantillas que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol.

154, 367-382; and Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242: 240 245); oligonucleotide-directed mutagenesis (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329 350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100: 468-500; y Zoller & Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154: 329-350); mutagenesis de ADN modificado por fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16: 791-802; y Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagenesis usando ADN duplex con huecos (Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154: 350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).

Los protocolos adicionales que se pueden usar incluyen la reparacion de desajustes puntuales (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38: 879-887), mutagenesis usando cepas huesped de reparacion deficiente (Carter et al. (1985) " Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; y Carter (1987)" Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagenesis de eliminacion (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), seleccion por restriccion y seleccion por restriccion y purificacion por restriccion (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagenesis por sintesis genica total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34: 315-323; y Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ’shot-gun’ gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparacion de rompimiento de doble cadena (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455". "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl Acad Sci. USA, 83: 7177-7181). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre muchos de los metodos anteriores en Methods in Enzymology Volumen 154, que tambien describe controles utiles para resolucion de problemas con varios metodos de mutagenesis.

Los protocolos que se pueden usar se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.605.793 de Stemmer (25 de febrero de 1997), "Methods for In Vitro Recombination"; patente de Estados Unidos No. 5.811.238 de Stemmer et al. (22 de septiembre de 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" patente de Estados Unidos No. 5.830.721 de Stemmer et al. (3 de noviembre de 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" patente de Estados Unidos No.

5.834.252 de Stemmer, et al. (10 de noviembre de 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" patente de Estados Unidos No. 5.837.458 de Minshull, et al. (17 de noviembre de 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" document WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" documento WO 96/33207 por Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction;" documento WO 97/20078 por Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" documento WO 97/35966 por Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" documento WO 99/41402 por Punnonen et al.

"Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" documento WO 99/41383 por Punnonen et al. "Antigen Library Immunization;" documento WO 99/41369 por Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering;" documento WO 99/41368 por Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;" documento EP 752008 por Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" documento EP 0932670 por Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;" documento WO 99/23107 por Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" documento WO 99/21979 por Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors;" documento WO 98/31837 por del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;" documento WO 98/27230 por Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;" documento WO 98/27230 por Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection," documento WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries," documento WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences," documento WO 98/42832 por Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers," documento WO 99/29902 por Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences," documento WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library," documento WO 98/41622 por Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling," y documento WO 98/42727 por Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination."

Los protocolos que se pueden usar (que proporcionan detalles sobre varios metodos de generacion de diversidad) se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. (USSN) 09/407,800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" por Patten et al. presentado el 28 de septiembre de 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" por del Cardayre et al., patente de Estados Unidos No. 6.379.964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" por Crameri et al., patentes de los Estados Unidos Nos. 6.319.714; 6.368.861; 6,376,246; 6.423.542; 6.426.224 y PCT/US00/01203; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch et al., patente de los Estados Unidos No. 6.436.675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov et al., presentada el 18 de enero de 2000, (PCT/US00/01202) y, por ejemplo, "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov et al., presentada el 18 de julio de 2000 (solicitud de patente de Estados Unidos 09/618.579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" por Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de enero de 2000 (PCT/US00/01138); y "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATEMEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" por Affholter, presentada el 6 de septiembre de 2000 (solicitud de patente de Estados Unidos 09/656.549); y las patentes de Estados Unidos Nos. 6.177.263; 6.153.410.

Los metodos no estocasticos, o de "evolucion dirigida", incluyen, por ejemplo, mutagenesis de saturacion del sitio del gen (GSSMMR), reensamblaje de la ligacion sintetica (SLR), o una combinacion de los mismos se utilizan para modificar los acidos nucleicos de la invencion para generar amilasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad en condiciones altamente acidas o alcalinas, altas temperaturas y similares). Los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos modificados pueden cribarse para detectar una actividad antes de probar la actividad proteolitica u otra actividad. Se puede usar cualquier modalidad de prueba o protocolo, por ejemplo, usando una plataforma de matriz de capilares. Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.

Mutagenesis de saturacion, o, GSSMMR

En un aspecto, los cebadores de codon que contienen una secuencia degenerada de N,N,G/T se usan para introducir mutaciones puntuales en un polinucleotido, por ejemplo, una amilasa o un anticuerpo de la divulgacion, para generar un conjunto de polipeptidos de progenie en el que se representa un intervalo completo de sustituciones de aminoacidos individuales en cada posicion de aminoacido, por ejemplo, un residuo de aminoacido en un sitio de enzima activa o sitio de union a ligando destinado a ser modificado. Estos oligonucleotidos pueden comprender una primera secuencia homologa contigua, una secuencia degenerada de N,N,G/T y, opcionalmente, una segunda secuencia homologa. Los productos de traduccion de la progenie descendente del uso de tales oligonucleotidos incluyen todos los posibles cambios de aminoacidos en cada sitio de aminoacidos a lo largo del polipeptido, debido a que la degeneracion de la secuencia N,N,G/T incluye codones para los 20 aminoacidos. En un aspecto, uno de dichos oligonucleotidos degenerados (que comprende, por ejemplo, un casete N,N,G/T degenerado) se usa para someter cada codon original en una plantilla de polinucleotido parental a un intervalo completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, se usan al menos dos casetes degenerados, ya sea en el mismo oligonucleotido o no, para someter al menos dos codones originales en una plantilla de polinucleotido parental a un intervalo completo de sustituciones de codones. Por ejemplo, mas de una secuencia N,N,G/T puede estar contenida en un oligonucleotido para introducir mutaciones de aminoacidos en mas de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T puede ser directamente contigua o separada por una o mas secuencias de nucleotidos adicionales. En otro aspecto, los oligonucleotidos utiles para introducir adiciones y eliminaciones se pueden usar solos o en combinacion con los codones que contienen una secuencia N,N,G/T, para introducir cualquier combinacion o permutacion de adiciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoacidos.

En un aspecto, la mutagenesis simultanea de dos o mas posiciones de aminoacidos contiguos se realiza utilizando un oligonucleotido que contiene tripletes N,N,G/T contiguos, es decir, una secuencia (N,N,G/T)n degenerada. En otro aspecto, se utilizan casetes degenerados que tienen menos degeneracion que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser deseable en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligonucleotido) una secuencia de triplete degenerada que comprende solo un N, donde dicho N puede estar en la primera o segunda posicion del triplete. Cualquier otra base, incluyendo cualquier combinacion y permutacion de las mismas, puede usarse en las dos posiciones restantes del triplete. Alternativamente, puede ser deseable en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete N,N,N degenerada.

En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, tripletes N,N,G/T) permite la generacion sistematica y facil de un intervalo completo de posibles aminoacidos naturales (para un total de 20 aminoacidos) en cada uno y cada posicion de aminoacido en un polipeptido (en aspectos alternativos, los metodos tambien incluyen la generacion de menos de todas las posibles sustituciones por posicion de residuo de aminoacido, o de codon). Por ejemplo, para un polipeptido de 100 aminoacidos, se pueden generar 2000 especies distintas (es decir, 20 posibles aminoacidos por posicion x 100 posiciones de aminoacidos). Mediante el uso de un oligonucleotido o un conjunto de oligonucleotidos que contienen un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuales pueden codificar todos los 20 aminoacidos naturales posibles. Por lo tanto, en un recipiente de reaccion en el que una secuencia de polinucleotidos parental se somete a mutagenesis de saturacion utilizando al menos uno de tales oligonucleotidos, se generan 32 polinucleotidos de progenie distintos que codifican 20 polipeptidos distintos. Por el contrario, el uso de un oligonucleotido no degenerado en la mutagenesis dirigida al sitio conduce a solo un producto polipeptidico de progenie por recipiente de reaccion. Los oligonucleotidos no degenerados pueden usarse opcionalmente en combinacion con cebadores degenerados descritos; por ejemplo, se pueden usar oligonucleotidos no degenerados para generar mutaciones puntuales especificas en un polinucleotido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas especificas, mutaciones puntuales que conducen a cambios de aminoacidos correspondientes, y mutaciones puntuales que causan la generacion de codones de parada y la expresion correspondiente de fragmentos de polipeptidos.

En un aspecto, cada recipiente de reaccion de mutagenesis de saturacion contiene polinucleotidos que codifican al menos 20 moleculas de polipeptidos de progenie (por ejemplo, amilasas) de manera que los 20 aminoacidos naturales estan representados en la posicion de un aminoacido especifico correspondiente a la posicion del codon tratada con agente mutagenico en el polinucleotido parental (otros aspectos usan menos de las 20 combinaciones naturales). Los polipeptidos de la progenie degenerada 32 veces generados a partir de cada recipiente de reaccion de mutagenesis de saturacion pueden someterse a amplificacion clonal (por ejemplo, clonarse en un huesped adecuado, por ejemplo, huesped de E. coli, utilizando, por ejemplo, un vector de expresion) y someterse a un cribado de la expresion. Cuando se identifica un polipeptido de progenie individual mediante cribado para mostrar un cambio favorable en la propiedad (cuando se compara con el polipeptido parental, como el aumento de la actividad proteolitica en condiciones acidas o alcalinas), se puede secuenciar para identificar la sustitucion de aminoacidos favorable correspondiente contenida alli.

En un aspecto, tras la mutagenesis de todas y cada una de las posiciones de aminoacidos en un polipeptido parental usando mutagenesis de saturacion como se divulga en el presente documento, los cambios favorables de aminoacidos pueden identificarse en mas de una posicion de aminoacidos. Se pueden generar una o mas nuevas moleculas de progenie que contienen una combinacion de todas o parte de estas sustituciones favorables de aminoacidos. Por ejemplo, si se identifican 2 cambios de aminoacidos favorables especificos en cada una de las 3 posiciones de aminoacidos en un polipeptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posicion (sin cambio del aminoacido original y cada uno de los dos cambios favorables) y 3 posiciones. Por lo tanto, hay 3 x 3 x 3 o 27 posibilidades totales, incluidas 7 que se examinaron previamente, 6 mutaciones de un solo punto (es decir, 2 en cada una de las tres posiciones) y ningun cambio en ninguna posicion.

En otro aspecto, la mutagenesis de saturacion de sitio se puede usar junto con otros medios estocasticos o no estocasticos para variar la secuencia, por ejemplo, el reensamblaje de la ligacion sintetica (vease a continuacion), transposicion, quimerizacion, recombinacion y otros procesos de tratamiento con agente mutagenico y agentes mutagenicos. Esta divulgacion proporciona el uso de cualquier proceso de tratamiento con agente mutagenico, incluida la mutagenesis de saturacion, de manera iterativa.

Reensamblaje de ligacion sintetica (SLR)

La divulgacion proporciona un sistema de modificacion genica no estocastica denominado "reensamblaje de ligacion sintetica" o simplemente "SLR", un "proceso de evolucion dirigida" para generar polipeptidos, por ejemplo, amilasas o anticuerpos de la invencion, con propiedades nuevas o alteradas. SLR es un metodo para ligar fragmentos de oligonucleotidos juntos de forma no estocastica. Este metodo difiere de la transposicion estocastica de oligonucleotidos en que los bloques de construccion del acido nucleico no experimentan transposicion, se concatenan o quimerizan al azar, sino que se ensamblan de forma no estocastica. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense No. (USSN) 09/332.835 titulada "Reensamblaje de ligacion sintetica en evolucion dirigida" y presentada el 14 de junio de 1999 ("USSN 09/332.835"). En un aspecto, el SLR comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polinucleotido de plantilla, en el que el polinucleotido de plantilla comprende una secuencia que codifica un gen homologo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleotidos de bloque de construccion, en donde los polinucleotidos de bloque de construccion estan disenados para reensamblarse de manera cruzada con el polinucleotido de plantilla en una secuencia predeterminada, y un polinucleotido de bloque de construccion comprende una secuencia que es una variante del gen homologo y una secuencia homologa al polinucleotido de plantilla que flanquea la secuencia variante; (c) combinar un polinucleotido de bloque de construccion con un polinucleotido de plantilla de modo que el polinucleotido de bloque de construccion se reensamble de manera cruzada con el polinucleotido de plantilla para generar polinucleotidos que comprenden variaciones de secuencia de genes homologos.

El SLR no depende de la presencia de altos niveles de homologia entre los polinucleotidos que se van a reorganizar. Por lo tanto, este metodo se puede utilizar para generar de forma no estocastica bibliotecas (o conjuntos) de moleculas de progenie que comprenden mas de 10100 quimeras diferentes. El SLR se puede usar para generar bibliotecas que comprenden mas de 101000 quimeras de progenie diferentes. Por lo tanto, los aspectos de la presente divulgacion incluyen metodos no estocasticos para producir un conjunto de moleculas de acido nucleico quimericas finalizadas que remueve un orden de ensamblaje global que se elige por diseno. Este metodo incluye las etapas de generar por diseno una pluralidad de bloques de construccion de acido nucleico especificos que tienen extremos ligables compatibles mutuamente utiles, y ensamblar estos bloques de construccion de acido nucleico, de manera que se logre un orden de ensamblaje general disenado.

Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques de construccion de acido nucleico a ensamblar se consideran "utiles" para este tipo de ensamblaje ordenado si permiten que los bloques de construccion se acoplen en ordenes predeterminados. Por lo tanto, el orden de ensamblaje general en el que se pueden acoplar los bloques de construccion de acido nucleico se especifica mediante el diseno de los extremos ligables. Si se va a usar mas de una etapa de ensamblaje, entonces el orden de ensamblaje global en el que se pueden acoplar los bloques de construccion de acido nucleico tambien se especifica por el orden secuencial de las etapas de ensamblaje. En un aspecto, las piezas de construccion hibridadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, ADN ligasa T4), para lograr un enlace covalente de las piezas de construccion.

En un aspecto, el diseno de los bloques de construccion de oligonucleotidos se obtiene analizando un conjunto de plantillas de secuencias de acido nucleico progenitoras que sirven como base para producir un conjunto de progenitores de polinucleotidos quimericos finalizados. Estas plantillas de oligonucleotidos parentales sirven, por lo tanto, como una fuente de informacion de secuencia que ayuda en el diseno de los bloques de construccion de acido nucleico que se deben tratar con agentes mutagenicos, por ejemplo, quimerizar o transponer. En un aspecto de este metodo, las secuencias de una pluralidad de plantillas de acidos nucleicos parentales se alinean para seleccionar uno o mas puntos de demarcacion. Los puntos de demarcacion pueden ubicarse en un area de homologia y estan compuestos por uno o mas nucleotidos. Estos puntos de demarcacion son compartidos preferiblemente por al menos dos de las plantillas progenitoras. Los puntos de demarcacion se pueden usar para delinear los limites de los bloques de construccion de oligonucleotidos que se generaran para reorganizar los polinucleotidos parentales. Los puntos de demarcacion identificados y seleccionados en las moleculas progenitoras sirven como puntos de quimerizacion potenciales en el ensamblaje de las moleculas de progenie quimericas finales. Un punto de demarcacion puede ser un area de homologia (que comprende al menos una base de nucleotidos homologa) compartida por al menos dos secuencias de polinucleotidos parentales. Alternativamente, un punto de demarcacion puede ser un area de homologia que sea compartida por al menos la mitad de las secuencias polinucleotidicas parentales, o puede ser un area de homologia que sea compartida por al menos dos tercios de las secuencias polinucleotidicas parentales. Aun mas preferiblemente, un punto de demarcacion util es un area de homologia que es compartida por al menos tres cuartos de las secuencias polinucleotidicas parentales, o puede ser compartida por casi todas las secuencias polinucleotidicas parentales. En un aspecto, un punto de demarcacion es un area de homologia que comparten todas las secuencias de polinucleotidos parentales.

En un aspecto, un proceso de reensamblaje de ligacion se realiza de manera exhaustiva para generar una biblioteca exhaustiva de polinucleotidos quimericos de progenie. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construccion de acido nucleico estan representadas en el conjunto de moleculas de acido nucleico quimerico finalizadas. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamblaje (es decir, el orden de ensamblaje de cada bloque de construccion en la secuencia 5' a 3' de cada acido nucleico quimerico finalizado) en cada combinacion es por diseno (o no estocastico) como se describe mas arriba. Debido a la naturaleza no estocastica de esta invencion, la posibilidad de productos secundarios no deseados se reduce considerablemente.

En otro aspecto, el metodo de reensamblaje de ligacion se realiza de manera sistematica. Por ejemplo, el metodo se realiza para generar una biblioteca sistematicamente compartimentada de moleculas de progenie, con compartimentos que se pueden analizar sistematicamente, por ejemplo, uno a uno. En otras palabras, esta divulgacion establece que, a traves del uso selectivo y juicioso de bloques de construccion especificos de acidos nucleicos, junto con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamblaje secuencialmente escalonadas, se puede lograr un diseno donde se elaboran conjuntos especificos de productos de la progenie en cada uno de los diferentes recipientes de reaccion. Esto permite realizar un examen sistematico y un procedimiento de seleccion. Por lo tanto, estos metodos permiten que un numero potencialmente muy grande de moleculas de progenie sean examinadas sistematicamente en grupos mas pequenos. Debido a su capacidad para realizar quimerizaciones de una manera que es altamente flexible pero a la vez exhaustiva y sistematica tambien, particularmente cuando hay un bajo nivel de homologia entre las moleculas progenitoras, estos metodos proporcionan la generacion de una biblioteca (o conjunto) compuesta por un gran numero de moleculas de progenie. Debido a la naturaleza no estocastica de la divulgacion de reensamblaje de la ligacion instantanea, las moleculas de progenie generadas comprenden preferiblemente una biblioteca de moleculas quimericas de acido nucleico finalizadas que tienen un orden de ensamblaje global que se elige por diseno. La mutagenesis de saturacion y los metodos optimizados de evolucion dirigida tambien pueden usarse para generar diferentes especies moleculares de progenie. Se aprecia que la divulgacion proporciona libertad de eleccion y control con respecto a la seleccion de puntos de demarcacion, el tamano y numero de los bloques de construccion de acido nucleico y el tamano y diseno de los acoplamientos. Se aprecia, ademas, que el requisito de homologia intermolecular es altamente relajado para la operabilidad de esta divulgacion. De hecho, los puntos de demarcacion se pueden elegir incluso en areas con poca o ninguna homologia intermolecular. Por ejemplo, debido a la fluctuacion de los codones, es decir, la degeneracion de los codones, se pueden introducir sustituciones de nucleotidos en los bloques de construccion de acidos nucleicos sin alterar el aminoacido originalmente codificado en la plantilla progenitora correspondiente. Alternativamente, un codon puede alterarse de manera tal que se modifique la codificacion de un aminoacido original. Esta divulgacion establece que tales sustituciones pueden introducirse en el bloque de construccion de acido nuclei

por lo tanto, permitir un mayor numero de acoplamientos entre los bloques de construccion, lo que a su vez permite generar un mayor numero de progenies quimericas.

En otro aspecto, la naturaleza sintetica de la etapa en la que se generan los bloques de construccion permite el diseno y la introduccion de nucleotidos (por ejemplo, uno o mas nucleotidos, que pueden ser, por ejemplo, codones o intrones o secuencias reguladoras) que luego puede eliminarse opcionalmente en un proceso in vitro (por ejemplo, por mutagenesis) o en un proceso in vivo (por ejemplo, utilizando la capacidad de empalme de genes de un organismo huesped). Se aprecia que en muchos casos, la introduccion de estos nucleotidos tambien puede ser deseable por muchas otras razones, ademas del beneficio potencial de crear un punto de demarcacion util.

En un aspecto, se usa un bloque de construccion de acido nucleico para introducir un intron. Por lo tanto, se introducen intrones funcionales en un gen artificial fabricado de acuerdo con los metodos descritos en este documento. El intron o los intrones introducidos artificialmente pueden ser funcionales en una celula huesped para el empalme de genes de manera muy similar a la forma en que los intrones que se producen naturalmente sirven funcionalmente en el empalme de genes.

Sistema optimizado de evolucion dirigida

La divulgacion proporciona un sistema de modificacion genica no estocastica denominado "sistema optimizado de evolucion dirigida" para generar polipeptidos, por ejemplo, amilasas o anticuerpos de la divulgacion, con propiedades nuevas o alteradas. La evolucion optimizada dirigida se refiere al uso de ciclos repetidos de reordenamiento reductivo, recombinacion y seleccion que permiten la evolucion molecular dirigida de los acidos nucleicos a traves de la recombinacion. La evolucion optimizada dirigida permite la generacion de una gran poblacion de secuencias quimericas evolucionadas, en donde la poblacion generada se enriquece significativamente de las secuencias que tienen un numero predeterminado de eventos cruzados.

Un evento de cruce es un punto en una secuencia quimerica donde se produce un cambio en la secuencia de una variante parental a otra variante parental. Un punto de este tipo se encuentra normalmente en la union de los oligonucleotidos de dos progenitores que se ligan entre si para formar una unica secuencia. Este metodo permite el calculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleotidos para que la poblacion quimerica final de secuencias se enriquezca en el numero elegido de eventos de cruce. Esto proporciona un mayor control sobre la eleccion de variantes quimericas que tienen un numero predeterminado de eventos de cruce.

Ademas, este metodo proporciona un medio conveniente para explorar una cantidad tremenda del posible espacio de variante de proteina en comparacion con otros sistemas. Anteriormente, si uno generaba, por ejemplo, 1013 moleculas quimericas durante una reaccion, seria extremadamente dificil probar un numero tan alto de variantes quimericas para una actividad particular. Ademas, una porcion significativa de la poblacion de la progenie tendria un numero muy alto de eventos cruzados que resultaron en proteinas que tenian menos probabilidades de tener niveles elevados de una actividad particular. Al utilizar estos metodos, la poblacion de moleculas quimericas se puede enriquecer para aquellas variantes que tienen un numero particular de eventos de cruce. Por lo tanto, aunque todavia se pueden generar 1013 moleculas quimericas durante una reaccion, cada una de las moleculas elegidas para un analisis adicional probablemente tenga, por ejemplo, solo tres eventos de cruce. Debido a que la poblacion de la progenie resultante se puede sesgar para tener un numero predeterminado de eventos de cruce, los limites en la variedad funcional entre las moleculas quimericas se reducen. Esto proporciona un numero mas manejable de variables cuando se calcula que oligonucleotido de los polinucleotidos originales podria ser responsable de afectar un rasgo particular.

Un metodo para crear una secuencia de polinucleotidos de progenie quimerica es crear oligonucleotidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia parental. Cada oligonucleotido incluye preferiblemente una region unica de solapamiento, de modo que la mezcla de los oligonucleotidos da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleotido ensamblado en el orden correcto. Tambien se puede encontrar informacion adicional, por ejemplo, en la solicitud de patente USSN 09/332.835; la patente de Estados Unidos No.

6.361.974.

El numero de oligonucleotidos generados para cada variante parental guarda una relacion con el numero total de cruces resultantes en la molecula quimerica que se crea en ultima instancia. Por ejemplo, se podrian proporcionar tres variantes de secuencia de nucleotidos parentales para experimentar una reaccion de ligacion con el fin de encontrar una variante quimerica que tenga, por ejemplo, una mayor actividad a alta temperatura. Como ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleotidos correspondientes a cada porcion de cada variante parental. En consecuencia, durante el proceso de reensamblaje de la ligacion, podrfa haber hasta 50 eventos de cruce dentro de cada una de las secuencias quimericas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleotidos quimericos generados contenga oligonucleotidos de cada variante parental en orden alternante es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleotido esta presente en la reaccion de ligacion en la misma cantidad molar, es probable que en algunas posiciones los oligonucleotidos del mismo polinucleotido parental se unan uno al lado del otro y, por lo tanto, no produzcan un evento cruzado. Si la concentracion de cada oligonucleotido de cada progenitor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligacion en este ejemplo, existe una probabilidad de 1/3 (suponiendo 3 progenitores) de que un oligonucleotido de la misma variante parental se ligue dentro de la secuencia quimerica y no produzca ningun cruce.

Por consiguiente, se puede determinar una funcion de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la poblacion de eventos cruzados que probablemente ocurran durante cada etapa en una reaccion de ligacion dado un numero establecido de variantes parentales, un numero de oligonucleotidos correspondiente a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada paso en la reaccion de ligacion. Las estadfsticas y las matematicas detras de la determinacion de la PDF se describen a continuacion. Al utilizar estos metodos, se puede calcular dicha funcion de densidad de probabilidad, y asf enriquecer la poblacion de progenie quimerica para un numero predeterminado de eventos de cruce resultantes de una reaccion de ligacion particular. Ademas, se puede predeterminar un numero objetivo de eventos de cruce, y luego el sistema puede programarse para calcular las cantidades iniciales de cada oligonucleotido parental durante cada etapa en la reaccion de ligacion para dar como resultado una funcion de densidad de probabilidad que se centra en el numero predeterminado de eventos de cruce. Estos metodos se dirigen al uso de ciclos repetidos de reordenamiento reductivo, recombinacion y seleccion que permiten la evolucion molecular dirigida de un acido nucleico que codifica un polipeptido mediante recombinacion. Este sistema permite la generacion de una gran poblacion de secuencias quimericas evolucionadas, en donde la poblacion generada se enriquece significativamente en secuencias que tienen un numero predeterminado de eventos de cruce. Un evento de cruce es un punto en una secuencia quimerica donde ocurre un cambio en la secuencia de una variante parental a otra variante parental. Dicho punto se encuentra normalmente en la union donde los oligonucleotidos de dos progenitores se ligan entre sf para formar una unica secuencia. El metodo permite el calculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleotidos para que la poblacion quimerica final de secuencias se enriquezca en el numero elegido de eventos de cruce. Esto proporciona un mayor control sobre la eleccion de variantes quimericas que tienen un numero predeterminado de eventos de cruce.

Ademas, estos metodos proporcionan un medio conveniente para explorar una cantidad tremenda del posible espacio de variante de protefna en comparacion con otros sistemas. Al utilizar los metodos descritos en el presente documento, la poblacion de moleculas quimericas se puede enriquecer en aquellas variantes que tienen un numero particular de eventos de cruce. Por lo tanto, aunque todavfa se pueden generar 1013 moleculas quimericas durante una reaccion, cada una de las moleculas elegidas para un analisis adicional probablemente tenga, por ejemplo, solo tres eventos de cruce. Debido a que la poblacion de la progenie resultante se puede sesgar para tener un numero predeterminado de eventos de cruce, los lfmites en la variedad funcional entre las moleculas quimericas se reducen. Esto proporciona un numero mas manejable de variables cuando se calcula que oligonucleotido de los polinucleotidos originales podrfa ser responsable de afectar un rasgo particular.

En un aspecto, el metodo crea una secuencia de polinucleotidos de progenie quimerica creando oligonucleotidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia parental. Cada oligonucleotido incluye preferiblemente una region unica de solapamiento, de modo que la mezcla de los oligonucleotidos da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleotido ensamblado en el orden correcto. Vease tambien el documento USSN 09/332.835.

Determinacion de eventos de cruce

Los aspectos de la divulgacion incluyen un sistema y un software que reciben una funcion de densidad de probabilidad de cruce deseada (PDF), el numero de genes progenitores que se reensamblaran y el numero de fragmentos en el reensamblado como entradas. El resultado de este programa es un "fragmento PDF" que se puede usar para determinar una receta para producir genes reensamblados, y el PDF de cruce estimado de esos genes. El procesamiento descrito aquf se realiza preferiblemente en MATLABMR (The Mathworks, Natick, Massachusetts), un lenguaje de programacion y entorno de desarrollo para computacion tecnica.

Procesos iterativos

En la practica de la divulgacion, estos procesos pueden repetirse iterativamente. Por ejemplo, un acido nucleico (o, el acido nucleico) responsable de un fenotipo de amilasa nuevo o alterado se identifica, se afsla nuevamente, se modifica de nuevo, se vuelve a analizar su actividad. Este proceso se puede repetir de forma iterativa hasta que se genere un fenotipo deseado. Por ejemplo, una ruta bioqufmica anabolica o catabolica completa se puede generar en una celula, incluida, por ejemplo, la actividad de hidrolisis del almidon.

De manera similar, si se determina que un oligonucleotido particular no tiene ningun efecto en absoluto sobre el rasgo deseado (por ejemplo, un nuevo fenotipo de amilasa), puede eliminarse como una variable sintetizando oligonucleotidos parentales mas grandes que incluyen la secuencia a eliminar. Dado que la incorporacion de la secuencia dentro de una secuencia mas grande evita cualquier evento de cruce, ya no habra ninguna variacion de esta secuencia en los polinucleotidos de la progenie. Esta practica iterativa de determinar que oligonucleotidos estan mas relacionados con el rasgo deseado, y cuales no estan relacionados, permite una exploracion mas eficiente de todas las posibles variantes de proteinas que podrian proporcionar un rasgo o actividad particular.

Transposicion in vivo

La transposicion in vivo de moleculas se utiliza en los metodos de la divulgacion que proporcionan variantes de polipeptidos de la invencion. La transposicion in vivo se puede realizar utilizando la propiedad natural de las celulas para recombinar multimeros. Si bien la recombinacion in vivo ha proporcionado la principal ruta natural a la diversidad molecular, la recombinacion genetica sigue siendo un proceso relativamente complejo que involucra 1) el reconocimiento de homologias; 2) escision de la cadena, invasion de la cadena y etapas metabolicas que conducen a la produccion de quiasma recombinante; y finalmente 3) la resolucion del quiasma en moleculas recombinadas discretas. La formacion del quiasma requiere el reconocimiento de secuencias homologas.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para producir un polinucleotido hibrido a partir de al menos un primer polinucleotido (por ejemplo, una amilasa de la divulgacion) y un segundo polinucleotido (por ejemplo, una enzima, tal como una amilasa de la divulgacion o cualquier otra amilasa, o, una etiqueta o un epitopo). La divulgacion se puede usar para producir un polinucleotido hibrido introduciendo al menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido que comparten al menos una region de homologia de secuencia parcial en una celula huesped adecuada. Las regiones de homologia de secuencia parcial promueven procesos que resultan en una reorganizacion de secuencia que produce un polinucleotido hibrido. El termino "polinucleotido hibrido", como se usa en este documento, es cualquier secuencia de nucleotidos que resulta del metodo de la presente divulgacion y contiene una secuencia de al menos dos secuencias de polinucleotidos originales. Tales polinucleotidos hibridos pueden resultar de eventos de recombinacion intermolecular que promueven la integracion de secuencias entre las moleculas de ADN. Ademas, dichos polinucleotidos hibridos pueden resultar de procesos de reordenamiento reductivos intramoleculares que utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleotidos dentro de una molecula de ADN.

Produccion de variantes de secuencia

La divulgacion tambien proporciona metodos adicionales para elaborar variantes de secuencia de las secuencias de acido nucleico (por ejemplo, amilasa) de la invencion. La divulgacion tambien proporciona metodos adicionales para aislar amilasas usando los acidos nucleicos y polipeptidos de la invencion. En un aspecto, la divulgacion proporciona variantes de una secuencia de codificacion de amilasa (por ejemplo, un gen, ADNc o mensaje) de la divulgacion, que puede alterarse por cualquier medio, incluidos, por ejemplo, metodos aleatorios o estocasticos, o, metodos no estocasticos, o de "evolucion dirigida", como se describio anteriormente.

Las variantes aisladas pueden ser naturales. La variante tambien puede crearse in vitro. Las variantes se pueden crear utilizando tecnicas de ingenieria genetica como la mutagenesis dirigida al sitio, la mutagenesis quimica aleatoria, los procedimientos de eliminacion con exonucleasa III y las tecnicas de clonacion estandar. Alternativamente, tales variantes, fragmentos, analogos o derivados pueden crearse usando procedimientos de sintesis o modificacion quimica. Otros metodos para hacer variantes tambien son familiares para los expertos en la tecnica. Estos incluyen procedimientos en los que las secuencias de acido nucleico obtenidas de aislados naturales se modifican para generar acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tienen caracteristicas que aumentan su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se generan y caracterizan un gran numero de secuencias variantes que tienen una o mas diferencias de nucleotidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Estas diferencias de nucleotidos pueden dar como resultado cambios de aminoacidos con respecto a los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos de los aislados naturales.

Por ejemplo, las variantes se pueden crear utilizando una PCR propensa a errores. En la PCR propensa a errores, la PCR se realiza en condiciones donde la fidelidad de copia de la ADN polimerasa es baja, de modo que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de la PCR. La PCR propensa a errores se describe, por ejemplo, en Leung, D. W., et al., Technique, 1: 11-15, 1989) y Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2: 28-33, 1992. Brevemente, en dichos procedimientos, los acidos nucleicos que se van a tratar con agentes mutagenicos se mezclan con cebadores de PCR, regulador de reaccion, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa y una concentracion apropiada de dNTP para lograr una alta tasa de mutacion puntual a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reaccion se puede realizar utilizando 20 fmoles de acido nucleico a someter a mutagenesis, 30 pmoles de cada cebador de PCR, un regulador de reaccion que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3) y gelatina al 0,01%, MgCl27 mM, MgCl27 mM, MnCl20,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP 1 mM. La PCR se puede realizar durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciara que estos parametros pueden variar segun sea apropiado. Los acidos nucleicos tratados con agentes mutagenicos se clonan en un vector apropiado y se evalua la actividad de los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos tratados con agentes mutagenicos.

Las variantes tambien pueden crearse utilizando mutagenesis dirigida a oligonucleotidos para generar mutaciones especificas del sitio en cualquier ADN clonado de interes. La mutagenesis de oligonucleotidos se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241: 53-57. Brevemente, en tales procedimientos, se sintetiza una pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios que portan una o mas mutaciones para ser introducidas en el ADN clonado y se insertan en el ADN clonado a mutagenizar. Los clones que contienen el ADN tratado con agentes mutagenicos se recuperan y se evaluan las actividades de los polipeptidos que codifican.

Otro metodo para generar variantes es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR a partir de una mezcla de pequenos fragmentos de ADN. Un gran numero de reacciones de PCR diferentes se producen en paralelo en el mismo vial, con los productos de una reaccion cebando los productos de otra reaccion. La PCR de ensamblaje se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 5.965.408.

Otro metodo para generar variantes es la mutagenesis por PCR sexual. En la mutagenesis por PCR sexual, se produce una recombinacion homologa forzada entre moleculas de ADN de una secuencia de ADN diferente pero altamente relacionada in vitro, como resultado de la fragmentacion aleatoria de la molecula de ADN basada en la homologia de la secuencia, seguida de la fijacion del cruce por extension del cebador en una reaccion de PCR. La mutagenesis por PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Natl Acad Sci. USA 91: 10747-10751. Brevemente, en tales procedimientos, una pluralidad de acidos nucleicos a ser recombinados se digieren con DNasa para generar fragmentos que tienen un tamano promedio de 50-200 nucleotidos. Los fragmentos del tamano promedio deseado se purifican y se resuspenden en una mezcla de PCR. La PCR se realiza en condiciones que facilitan la recombinacion entre los fragmentos de acido nucleico. Por ejemplo, la PCR se puede realizar resuspendiendo los fragmentos purificados a una concentracion de 10-30 ng/:1 en una solucion de 0,2 mM de cada dNTP, MgCl22,2 mM, KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 9,0 y Triton X-100 al 0,1%. Se agregan 2,5 unidades de Taq polimerasa por 100:1 de mezcla de reaccion y se realiza la PCR utilizando el siguiente regimen: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30-45 veces) y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciara que estos parametros pueden variar segun sea apropiado. En algunos aspectos, los oligonucleotidos pueden incluirse en las reacciones de PCR. En otros aspectos, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I puede usarse en un primer conjunto de reacciones de PCR y la Taq polimerasa puede usarse en un conjunto posterior de reacciones de PCR. Las secuencias recombinantes se aislan y se evaluan las actividades de los polipeptidos que codifican.

Las variantes tambien pueden ser creadas por mutagenesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interes mediante la propagacion de la secuencia de interes en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. Coli, que transporta mutaciones en una o mas de las vias de reparacion del ADN. Estas cepas "mutadoras" tienen una tasa de mutacion aleatoria mas alta que la de un progenitor de tipo silvestre. La propagacion del ADN en una de estas cepas generara eventualmente mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para uso en mutagenesis in vivo se describen, por ejemplo, en la publicacion PCT No. WO 91/16427.

Las variantes tambien pueden generarse usando mutagenesis de casete. En la mutagenesis de casete, una pequena region de una molecula de ADN de cadena doble se reemplaza con un "casete" de oligonucleotidos sinteticos que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleotido a menudo contiene una secuencia nativa completa y/o al azar.

La mutagenesis de ensamble recursivo tambien se puede usar para generar variantes. La mutagenesis de ensamble recursivo es un algoritmo para la ingenieria de proteinas (mutagenesis de proteinas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotipicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoacidos. Este metodo utiliza un mecanismo de retroalimentacion para controlar rondas sucesivas de mutagenesis de casete combinatoria. La mutagenesis de ensamble recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin (1992) Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 7811-7815.

En algunos aspectos, las variantes se crean utilizando mutagenesis de ensamble exponencial. La mutagenesis de ensamble exponencial es un proceso para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes unicos y funcionales, en donde los grupos pequenos de residuos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posicion alterada, los aminoacidos que conducen a proteinas funcionales. La mutagenesis de ensamble exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11: 1548-1552. Se describen mutagenesis aleatoria y dirigida al sitio, por ejemplo, en Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455.

En algunos aspectos, las variantes se crean utilizando procedimientos de mezcla aleatoria en los que porciones de una pluralidad de acidos nucleicos que codifican polipeptidos distintos se fusionan para crear secuencias de acido nucleico quimericas que codifican polipeptidos quimericos como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.965.408 ; 5.939.250 (vease tambien la discusion, arriba).

La divulgacion tambien proporciona variantes de polipeptidos de la invencion que comprenden secuencias en las que uno o mas de los residuos de aminoacidos (por ejemplo, de un ejemplo de polipeptido de la invencion) estan sustituidos con un residuo de aminoacido conservado o no conservado (por ejemplo, un residuo de aminoacido conservado) y dicho residuo de aminoacido sustituido puede o no estar codificado por el codigo genetico. Las sustituciones conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoacido dado en un polipeptido por otro aminoacido de caracteristicas similares. Por lo tanto, los polipeptidos de la divulgacion incluyen aquellos con sustituciones conservadoras de secuencias de la invencion, por ejemplo, los ejemplos de polipeptidos de la invencion, que incluyen pero no se limitan a los siguientes reemplazos: reemplazos de un aminoacido alifatico tal como alanina, valina, leucina e isoleucina con otro aminoacido alifatico; reemplazo de una serina por una treonina o viceversa; reemplazo de un residuo acido tal como acido aspartico y acido glutamico con otro residuo acido; la sustitucion de un residuo que porta un grupo amida, como la asparagina y la glutamina, con otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo basico tal como lisina y arginina con otro residuo basico; y el reemplazo de un residuo aromatico tal como fenilalanina, tirosina con otro residuo aromatico. Otras variantes son aquellas en las que uno o mas de los residuos de aminoacidos de los polipeptidos de la invencion incluyen un grupo sustituyente.

Otras variantes dentro del alcance de la divulgacion son aquellas en las que el polipeptido esta asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipeptido, por ejemplo, polietilenglicol.

Las variantes adicionales dentro del alcance de la invencion son aquellas en las que aminoacidos adicionales se fusionan con el polipeptido, como una secuencia lider, una secuencia secretora, una secuencia proproteina o una secuencia que facilita la purificacion, el enriquecimiento o la estabilizacion del polipeptido.

En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados y analogos de los polipeptidos de la invencion conservan la misma funcion o actividad biologica que los ejemplos de polipeptidos, por ejemplo, la actividad de amilasa, como se describe en el presente documento. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado o analogo incluye una proproteina, de modo que la variante, fragmento, derivado o analogo puede activarse por escision de la porcion de proproteina para producir un polipeptido activo.

Optimizacion de codones para lograr altos niveles de expresion de proteinas en las celulas huesped

La divulgacion proporciona metodos para modificar los acidos nucleicos que codifican la amilasa para modificar el uso de codones. En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para modificar codones en un acido nucleico que codifica una amilasa para aumentar o disminuir su expresion en una celula huesped. La divulgacion tambien proporciona acidos nucleicos que codifican una amilasa modificada para aumentar su expresion en una celula huesped, la amilasa modificada de esta manera, y metodos para elaborar las amilasas modificadas. El metodo comprende identificar un codon "no preferido" o "menos preferido" en el acido nucleico que codifica amilasa y reemplazar uno o mas de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codon preferido" que codifica el mismo aminoacido que el codon reemplazado y al menos un codon no preferido o menos preferido en el acido nucleico se han reemplazado por un codon preferido que codifica el mismo aminoacido. Un codon preferido es un codon representado en exceso en las secuencias de codificacion en genes en la celula huesped y un codon no preferido o menos preferido es un codon representado en las secuencias de codificacion en genes en la celula huesped.

Las celulas huesped para expresar los acidos nucleicos, los casetes de expresion y los vectores de la invencion incluyen bacterias, levaduras, hongos, celulas vegetales, celulas de insectos y celulas de mamiferos. Por lo tanto, la divulgacion proporciona metodos para optimizar el uso de codones en todas estas celulas, acidos nucleicos de codones alterados y polipeptidos producidos por los acidos nucleicos de codones alterados. Los ejemplos de celulas huesped incluyen bacterias Gram negativas, tales como Escherichia coli; bacterias Gram positivas, tales como Bacillus cereus, Streptomyces, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Los ejemplos de celulas huesped tambien incluyen organismos eucariotas, por ejemplo, diversas levaduras, tales como, Saccharomyces sp., incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, y celulas de mamiferos y lineas celulares y celulas de insectos y lineas celulares. Por lo tanto, la divulgacion tambien incluye acidos nucleicos y polipeptidos optimizados para la expresion en estos organismos y especies.

Por ejemplo, los codones de un acido nucleico que codifica una amilasa aislada de una celula bacteriana se modifican de manera que el acido nucleico se expresa de manera optima en una celula bacteriana diferente de la bacteria de la cual se derivo la amilasa, una levadura, un hongo, una celula vegetal, una celula de insecto o una celula de mamifero. Los metodos para optimizar los codones son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30: 113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12: 185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253. Vease tambien Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253, que describe la optimizacion de codones en sistemas de raton; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24: 18-24, que describe la optimizacion de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39: 15399-15409, que describe la optimizacion de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20: 252-264, que describe la optimizacion del uso del codon que afecta la secrecion en E. coli.

Animales transgenicos no humanos

La divulgacion proporciona animales transgenicos no humanos que comprenden un acido nucleico, un polipeptido, un casete de expresion o un vector o una celula transformada de la divulgacion. La divulgacion tambien proporciona metodos para hacer y usar estos animales no humanos transgenicos.

Los animales transgenicos no humanos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprenden los acidos nucleicos de la invencion. Estos animales pueden usarse, por ejemplo, como modelos in vivo para estudiar la actividad de la amilasa o, como modelos para detectar agentes que cambian la actividad de la amilasa in vivo. Las secuencias codificantes para los polipeptidos que se expresaran en los animales transgenicos no humanos pueden disenarse para ser constitutivos o, bajo el control de factores reguladores transcripcionales especificos del tejido, especificos del desarrollo o inducibles. Los animales transgenicos no humanos pueden disenarse y generarse utilizando cualquier metodo conocido en la tecnica; veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 6.211.428; 6.187.992; 6.156.952; 6.118.044; 6.111.166; 6.107.541; 5.959.171; 5.922.854; 5.892.070; 5.880.327; 5.891.698; 5.639.940; 5.573.933; 5.387.742; 5.087.571, que describen la fabricacion y el uso de celulas y ovulos transformados y ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos y vacas transgenicos. Vease tambien, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157, que describe la produccion de proteinas recombinantes en la leche de animales transgenicos productores de leche; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17: 456-461, demostrando la produccion de cabras transgenicas. La patente de Estados Unidos No. 6.211.428 describe la fabricacion y el uso de mamiferos no humanos transgenicos que expresan en sus cerebros un constructo de acido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente de Estados Unidos No. 5.387.742 describe la inyeccion de secuencias de ADN recombinantes o sinteticas clonadas en ovulos de raton fertilizados, la implantacion de ovulos inyectados en hembras pseudo-embarazadas y el crecimiento a termino de ratones transgenicos cuyas celulas expresan proteinas relacionadas con la patologia de la enfermedad de Alzheimer. La patente estadounidense No. 6.187.992 describe la fabricacion y el uso de un raton transgenico cuyo genoma comprende una alteracion del gen que codifica la proteina precursora de amiloide (APP).

Tambien se pueden usar "animales con inactivacion genica" para practicar los metodos de la invencion. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgenicos o modificados de la divulgacion comprenden un "animal con inactivacion genica", por ejemplo, un "raton con inactivacion genica", disenado para no expresar un gen endogeno, que se reemplaza con un gen que expresa una amilasa de la divulgacion, o, una proteina de fusion que comprende una amilasa de la divulgacion.

Plantas y semillas transgenicas

La divulgacion proporciona plantas y semillas transgenicas que comprenden un acido nucleico, un polipeptido (por ejemplo, una amilasa, tal como una alfa amilasa), un casete de expresion o un vector o una celula transfectada o transformada de la divulgacion. La divulgacion tambien proporciona productos vegetales, por ejemplo, aceites, semillas, hojas, extractos y similares, que comprenden un acido nucleico y/o un polipeptido de la invencion. La planta transgenica puede ser dicotiledonea (una dicot) o monocotiledonea (una monocot). La divulgacion tambien proporciona metodos para elaborar y usar estas plantas y semillas transgenicas. La planta transgenica o celula vegetal que expresa un polipeptido de la presente invencion puede construirse de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.309.872.

Los acidos nucleicos y los constructos de expresion de la invencion pueden introducirse en una celula vegetal por cualquier medio. Por ejemplo, pueden introducirse acidos nucleicos o constructos de expresion en el genoma de un huesped de planta deseado, o, los acidos nucleicos o constructos de expresion pueden ser episomas. La introduccion en el genoma de una planta deseada puede ser tal que la produccion de a-amilasa del huesped este regulada por elementos de control transcripcional o de traduccion endogenos. La divulgacion tambien proporciona "plantas con inactivacion genica" en las que la insercion de la secuencia genica mediante, por ejemplo, recombinacion homologa, ha interrumpido la expresion del gen endogeno. Los medios para generar plantas "con inactivacion genica" son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad Sci. USA 95: 4368-4373; Miao (1995) Plant J 7: 359-365. Vease la discusion sobre plantas transgenicas, a continuacion.

Los acidos nucleicos de la invencion pueden usarse para conferir rasgos deseados esencialmente a cualquier planta, por ejemplo, a plantas productoras de almidon, tales como patata, trigo, arroz, cebada y similares. Los acidos nucleicos de la invencion se pueden usar para manipular las rutas metabolicas de una planta con el fin de optimizar o alterar la expresion de a-amilasa del huesped. Pueden cambiar la proporcion de conversion de almidon/azucar en una planta. Esto puede facilitar el procesamiento industrial de una planta. Alternativamente, las alfa-amilasas de la divulgacion se pueden usar en la produccion de una planta transgenica para producir un compuesto no producido naturalmente por esa planta. Esto puede reducir los costes de produccion o crear un producto novedoso.

En un aspecto, el primer paso en la produccion de una planta transgenica implica elaborar un constructo de expresion para la expresion en una celula vegetal. Estas tecnicas son bien conocidas en el arte. Pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia de codificacion para facilitar la union eficiente de los ribosomas al ARNm y seleccionar las secuencias de terminacion de genes apropiados. Un ejemplo de promotor constitutivo es CaMV35S, del virus del mosaico de la coliflor, que generalmente resulta en un alto grado de expresion en las plantas. Otros promotores son mas especificos y responden a senales en el entorno interno o externo de la planta. Un ejemplo de promotor inducible por luz es el promotor del gen cab, que codifica la principal proteina de union a clorofila a/b.

En un aspecto, el acido nucleico se modifica para lograr una mayor expresion en una celula vegetal. Por ejemplo, es probable que una secuencia de la invencion tenga un mayor porcentaje de pares de nucleotidos A-T en comparacion con el observado en una planta, algunos de los cuales prefieren pares de nucleotidos G-C. Por lo tanto, los nucleotidos A-T en la secuencia codificante pueden sustituirse con nucleotidos G-C sin cambiar significativamente la secuencia de aminoacidos para mejorar la produccion del producto genico en celulas vegetales.

Se puede anadir un gen marcador seleccionable al constructo genico para identificar celulas o tejidos vegetales que hayan integrado con exito el transgen. Esto puede ser necesario porque lograr la incorporacion y expresion de genes en celulas vegetales es un evento raro, que ocurre en solo un pequeno porcentaje de los tejidos o celulas objetivo.

Los genes marcadores seleccionables codifican proteinas que proporcionan resistencia a los agentes que normalmente son toxicos para las plantas, como los antibioticos o los herbicidas. Solo las celulas vegetales que tienen integrado el gen marcador seleccionable sobreviviran cuando se cultiven en un medio que contenga el antibiotico o herbicida apropiado. En cuanto a otros genes insertados, los genes marcadores tambien requieren secuencias promotoras y de terminacion para una funcion adecuada.

En un aspecto, elaborar plantas o semillas transgenicas comprende incorporar secuencias de la invencion y, opcionalmente, genes marcadores en un constructo de expresion objetivo (por ejemplo, un plasmido), junto con el posicionamiento del promotor y las secuencias de terminacion. Esto puede implicar transferir el gen modificado a la planta a traves de un metodo adecuado. Por ejemplo, un constructo puede introducirse directamente en el ADN genomico de la celula vegetal utilizando tecnicas como la electroporacion y la microinyeccion de protoplastos de celulas vegetales, o los constructos pueden introducirse directamente en el tejido vegetal utilizando metodos balisticos, como el bombardeo de particulas de ADN. Por ejemplo, vease, por ejemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35: 197 203; Pawlowski (1996) Mol. Biotecnol. 6: 17-30; Klein (1987) Nature 327: 70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst.

72: 63-69, que discuten el uso del bombardeo de particulas para introducir transgenes en el trigo; y Adam (1997) citado anteriormente, para el uso del bombardeo de particulas para introducir YAC en celulas vegetales. Por ejemplo, Rinehart (1997) citado anteriormente, utilizo el bombardeo de particulas para generar plantas de algodon transgenicas. El aparato para acelerar las particulas se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.015.580; y, el instrumento de aceleracion de particulas PDS-2000 de BioRad (Biolistics) disponible comercialmente; vease tambien, John, patente de Estados Unidos No. 5.608.148; y Ellis, Patente de Estados Unidos No. 5, 681,730, que describen la transformacion de gimnospermas mediada por particulas.

En un aspecto, los protoplastos pueden inmovilizarse e inyectarse con un acido nucleico, por ejemplo, un constructo de expresion. Aunque la regeneracion de plantas a partir de protoplastos no es facil con los cereales, la regeneracion de plantas es posible en leguminosas utilizando embriogenesis somatica a partir de callos derivados de protoplastos. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo mediante la tecnica de pistola de genes, donde el ADN se recubre con microproyectiles de tungsteno, se inyecta una centesima parte del tamano de las celulas, que portan el ADN en la profundidad de las celulas y organulos. Luego se induce la regeneracion del tejido transformado, generalmente por embriogenesis somatica. Esta tecnica ha sido exitosa en varias especies de cereales incluyendo maiz y arroz.

Los acidos nucleicos, por ejemplo, constructos de expresion, tambien pueden introducirse en celulas vegetales utilizando virus recombinantes. Las celulas vegetales pueden transformarse utilizando vectores virales, tales como, por ejemplo, vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33: 989-999), vease Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5: 209-221.

Alternativamente, los acidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresion, pueden combinarse con regiones flanqueantes de T-ADN adecuadas e introducirse en un vector convencional huesped Agrobacterium tumefaciens. Las funciones de virulencia del huesped Agrobacterium tumefaciens dirigiran la insercion del constructo y el marcador adyacente en el ADN de la celula vegetal cuando la celula esta infectada por la bacteria. Las tecnicas de transformacion mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluido el desarme y el uso de vectores binarios, estan bien descritas en el informe cientifico. literatura. Vease, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233: 496-498; Fraley (1983) Proc. Natl Acad Sci. USA 80: 4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995). El ADN en una celula de A. tumefaciens esta contenido en el cromosoma bacteriano, asi como en otra estructura conocida como plasmido Ti (inductor de tumores). El plasmido Ti contiene un tramo de ADN denominado T-ADN (~20 kb de largo) que se transfiere a la celula de la planta en el proceso de infeccion y una serie de genes vir (virulencia) que dirigen el proceso de infeccion. A. tumefaciens solamente puede infectar una planta a traves de heridas: cuando una raiz o tallo de una planta esta herida, emite ciertas senales quimicas, en respuesta a las cuales, los genes vir de A. tumefaciens se activan y dirigen una serie de eventos necesarios para la transferencia del T-ADN desde plasmido Ti al cromosoma de la planta. El T-ADN luego entra en la celula de la planta a traves de la herida. Una especulacion es que el T-ADN espera hasta que el ADN de la planta se replica o transcribe, luego se inserta en el ADN de la planta expuesta. Para utilizar A. tumefaciens como un vector transgenico, la seccion que induce el tumor del T-ADN debe eliminarse, mientras se conservan las regiones limitantes del T-ADN y los genes vir. Luego, el transgen se inserta entre las regiones limitantes del T-ADN, donde se transfiere a la celula de la planta y se integra en los cromosomas de la planta.

La divulgacion proporciona la transformacion de plantas monocotiledoneas utilizando los acidos nucleicos de la invencion, incluyendo cereales importantes, vease Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205-218. Vease tambien, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc. Natl Acad. Sci USA 80: 4803; Thykjaer (1997) citado anteriormente; Parque (1996) Planta Mol. Biol. 32: 1135-1148, que discuten la integracion de T-Ad N en el ADN genomico. Vease tambien D'Halluin, patente de Estados Unidos No. 5.712.135, que describe un proceso para la integracion estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una celula de un cereal u otra planta monocotiledonea.

En un aspecto, la tercera etapa puede implicar la seleccion y regeneracion de plantas completas capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generacion. Dichas tecnicas de regeneracion se basan en la manipulacion de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, tipicamente confiando en un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleotidos deseadas. La regeneracion de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, paginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, paginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneracion tambien se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, organos o partes de los mismos. Tales tecnicas de regeneracion se describen en general en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486. Para obtener plantas completas de tejidos transgenicos, como embriones inmaduros, se pueden cultivar en condiciones ambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejidos. Una vez que se generan plantas enteras y producen semillas, comienza la evaluacion de la progenie.

Despues de que el casete de expresion se incorpore de manera estable en las plantas transgenicas, se puede introducir en otras plantas por cruce sexual. Se puede utilizar cualquiera de una serie de tecnicas de reproduccion estandar, dependiendo de la especie a cruzar. Dado que la expresion transgenica de los acidos nucleicos de la invencion conduce a cambios fenotipicos, las plantas que comprenden los acidos nucleicos recombinantes de la invencion pueden cruzarse sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por lo tanto, la semilla de la divulgacion se puede derivar de un cruce entre dos plantas transgenicas de la divulgacion, o un cruce entre una planta de la divulgacion y otra planta. Los efectos deseados (por ejemplo, la expresion de los polipeptidos de la invencion para producir una planta en la que se altera el comportamiento de floracion) pueden potenciarse cuando ambas plantas parentales expresan los polipeptidos de la invencion. Los efectos deseados pueden transmitirse a las futuras generaciones de plantas mediante medios de propagacion estandar.

Los acidos nucleicos y polipeptidos de la invencion se expresan o insertan en cualquier planta o semilla. Las plantas transgenicas de la divulgacion pueden ser dicotiledoneas o monocotiledoneas. Ejemplos de plantas transgenicas monocotiledoneas de la divulgacion son gramineas, tales como gramineas de prado (pasto azul, Poa), gramineas forrajeras tales como festuca, lolium, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maiz. Ejemplos de plantas transgenicas dicotiledoneas de la divulgacion son tabaco, leguminosas, como lupinas, patatas, remolacha azucarera, arveja, frijol y soja, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, las plantas y semillas transgenicas de la divulgacion incluyen una amplia gama de plantas, que incluyen, pero no se limitan a, especies de los generos Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.

En formas de realizacion alternativas, los acidos nucleicos de la invencion se expresan en plantas que contienen celulas fibrosas, que incluyen, por ejemplo, algodon, arbol de algodon de seda (Kapok, Ceiba pentandra), sauce del desierto, arbusto de creosota, winterfat, balsa, ramio, kenaf, canamo, roselle, Yute, sisal abaca y Lino. En realizaciones alternativas, las plantas transgenicas de la divulgacion pueden ser miembros del genero Gossypium, incluyendo miembros de cualquier especie de Gossypium, tal como G. arboreum ;. G. herbaceum, G. barbadense y G. hirsutum.

La divulgacion tambien proporciona el uso de plantas transgenicas para producir grandes cantidades de los polipeptidos de la invencion. Por ejemplo, vease Palmgren (1997) Trends Genet. 13: 348; Chong (1997) Transgenic Res. 6: 289-296 (que produce la proteina beta-caseina de leche humana en plantas transgenicas de patata utilizando un promotor de manopina sintasa bidireccional inducible por auxina (mas1', 2'), con metodos de transformacion de disco de hoja mediados por Agrobacterium tumefaciens).

Usando procedimientos conocidos, un experto puede seleccionar plantas de la divulgacion detectando el aumento o disminucion de ARNm o proteina del transgen en plantas transgenicas. Los medios para detectar y cuantificar ARNm o proteinas son bien conocidos en la tecnica.

Polipeptidos y peptidos

En un aspecto, la invencion proporciona polipeptidos aislados o recombinantes que tienen una identidad de secuencia de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, o identidad de secuencia completa (100%) con la secuencia de la invencion y sus subsecuencias y variantes. En un aspecto, el polipeptido tiene una actividad de glucano a-maltotetrahidrolasa.

La identidad puede estar en toda la longitud del polipeptido, o, la identidad puede estar en una region de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas residuos. Los polipeptidos de la divulgacion tambien pueden ser mas cortos que la longitud completa de ejemplos de polipeptidos. En aspectos alternativos, la invencion proporciona polipeptidos (peptidos, fragmentos) que varian en tamano entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipeptido, por ejemplo, una enzima, tal como una amilasa; los ejemplos de tamanos son de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas residuos, por ejemplo, residuos contiguos de un ejemplo de amilasa de la divulgacion. Los peptidos de la divulgacion pueden ser utiles, por ejemplo, como sondas marcadores, antigenos, toleragenos, motivos, sitios activos de amilasa.

Por ejemplo, la siguiente tabla resume las caracteristicas (por ejemplo, actividad, fuente inicial, ubicacion de la secuencia senal y un ejemplo de secuencia senal) de ejemplos de polipeptidos de la divulgacion. Por ejemplo, el polipeptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 437, codificada por la SEQ ID NO: 436, se genero artificialmente; el polipeptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 439, codificada por la SEQ ID NO: 438, tiene actividad de amilasa en condiciones alcalinas y se derivo inicialmente (se aislo) de una fuente desconocida; el polipeptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 441, codificada por la SEQ ID NO: 440, tiene actividad de amilasa en condiciones alcalinas y se derivo inicialmente (aislo) de una fuente desconocida, y tiene una secuencia senal que consiste en 1 a 32 residuos de aminoacido de la SEQ ID N.° 441 ("AA 1-32"); vease tambien la discusion a continuacion sobre las secuencias senal de la divulgacion, etc.:

Los polipeptidos y peptidos de la invencion pueden aislarse de fuentes naturales, ser sinteticos o ser polipeptidos generados de forma recombinante. Los peptidos y protefnas pueden expresarse de forma recombinante in vitro o in vivo. Los peptidos y polipeptidos de la invencion se pueden fabricar y aislar usando cualquier metodo conocido en la tecnica. El polipeptido y los peptidos de la invencion tambien pueden sintetizarse, total o parcialmente, usando metodos qufmicos bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser 215-223; Cuerno (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, la sfntesis de peptidos se puede realizar utilizando varias tecnicas en fase solida (vease, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289: 3-13) y la sfntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, usando el sintetizador de peptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Los peptidos y polipeptidos de la invencion tambien pueden estar glicosilados. La glicosilacion se puede agregar despues de la traduccion, ya sea qufmicamente o por mecanismos biosinteticos celulares, en donde el ultimo incorpora el uso de motivos conocidos de glicosilacion, que pueden ser nativos de la secuencia o pueden agregarse como un peptido o agregarse en la secuencia codificante del acido nucleico. La glicosilacion puede estar unida a O o N. La glicosilacion se puede agregar a cualquier polipeptido de la invencion para generar una enzima que sea mas termotolerante o termoestable que la enzima "progenitora" (a la que se agrego la glicosilacion). La glicosilacion se puede agregar mediante mecanismos qufmicos o biosinteticos celulares.

La divulgacion proporciona amilasas que tienen un amplio intervalo de actividad especffica en un amplio intervalo de temperaturas, por ejemplo, a aproximadamente 37°C en el intervalo de aproximadamente 10 a 10.000, o de 100 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de protefna. Las amilasas de la divulgacion tambien pueden tener actividad a temperaturas tan altas como 120°C. En aspectos alternativos, la amilasa utilizada en estos metodos es activa a estas temperaturas, por ejemplo, activa a temperaturas en un intervalo de entre aproximadamente 80°C a aproximadamente 115°C, entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 110°C, y desde aproximadamente 105°C a aproximadamente 108°C. Sin embargo, las amilasas de la divulgacion tambien pueden tener actividad a bajas temperaturas, por ejemplo, tan bajas como 4°C a 5°C.

La Tm de una enzima de la divulgacion puede cambiarse (por ejemplo, puede cambiarse entre aproximadamente 10°C y 90°C) mediante activacion termica. Por ejemplo, la Tm de la SeQ ID NO: 336/337 puede cambiarse de 17°C a 87°C por activacion termica: por ejemplo, preincubacion a 80°C durante 5 minutos.

Los peptidos y polipeptidos de la divulgacion, como se definieron anteriormente, incluyen todas las formas "mimeticas" y "peptidomimeticas". Los terminos "mimetico" y "peptidomimetico" se refieren a un compuesto qufmico sintetico que tiene sustancialmente las mismas caracterfsticas estructurales y/o funcionales de los polipeptidos de la divulgacion. El mimetico puede estar compuesto completamente de analogos sinteticos, no naturales de aminoacidos, o es una molecula quimerica de aminoacidos peptfdicos en parte naturales y analogos de aminoacidos en parte no naturales. El mimetico tambien puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoacidos naturales siempre que tales sustituciones no alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimetico. Al igual que con los polipeptidos de la invencion que son variantes conservadoras, la experimentacion de rutina determinara si un mimetico esta dentro del alcance de la invencion, es decir, que su estructura y/o funcion no se altera sustancialmente. Por lo tanto, en un aspecto, una composicion mimetica esta dentro del alcance de la invencion si tiene una actividad de amilasa.

Las composiciones mimeticas de polipeptidos de la divulgacion pueden contener cualquier combinacion de componentes estructurales no naturales. En un aspecto alternativo, las composiciones mimeticas de la divulgacion incluyen uno o todos los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos distintos de los enlaces del enlace amida natural ("enlace peptfdico"); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoacidos naturales; o c) residuos que inducen un mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, un giro beta, un giro gamma, una lamina beta, una conformacion de helice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipeptido de la invencion se puede caracterizar como un mimetico cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios qufmicos distintos de los enlaces peptfdicos naturales. Los residuos peptidomimeticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptfdicos, otros enlaces qufmicos o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehfdo, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa al enlace tradicional de amida ("enlace peptfdico") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (Ch =CH), eter (CH2-O), tioeter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida o ester (vease, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, paginas 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NY).

Un polipeptido de la invencion tambien puede caracterizarse como un mimetico por contener todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos de aminoacidos que se producen de forma natural. Los residuos no naturales estan bien descritos en la literatura cientffica y de patentes; a continuacion se describen algunos ejemplos de composiciones no naturales utiles como mimeticos de residuos de aminoacidos naturales y directrices. Se pueden generar mimeticos de aminoacidos aromaticos reemplazandolos, por ejemplo, con D o L-nafilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2-tieneilalanina; D- o L-1, -2, 3-, o 4-pireneilalanina; D- o L-3 tieneilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L- 3-piridinil) alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; D- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D- o L-2-indol(alquil) alaninas; y D-o L-alquilaninas, donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isoctilo, iso-pentilo, o aminoacidos no acidos sustituidos o no sustituidos. Los anillos aromaticos de un aminoacido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromaticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo.

Los mimeticos de aminoacidos acidos pueden generarse por sustitucion con, por ejemplo, aminoacidos no carboxilatos mientras se mantiene una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) tambien pueden modificarse selectivamente por reaccion con carbodiimidas (R'-NCN-R') como, por ejemplo, 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil)carbodiimida. El aspartilo o glutamilo tambien se puede convertir en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reaccion con iones de amonio. Se pueden generar mimeticos de aminoacidos basicos por sustitucion con, por ejemplo, (ademas de la lisina y la arginina) los aminoacidos ornitina, citrulina, o acido (guanidino)-acetico o acido (guanidino)alquil-acetico, en donde el alquilo se definio anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contiene la fraccion CN en lugar de COOH) se puede sustituir por asparagina o glutamina. Los residuos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los correspondientes residuos de aspartilo o glutamilo. Los mimeticos de residuos de arginina se pueden generar haciendo reaccionar arginilo con, por ejemplo, uno o mas reactivos convencionales, incluyendo, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanediona, 1,2-ciclohexanediona o ninhidrina, preferiblemente en condiciones alcalinas. Los mimeticos de residuos de tirosina pueden generarse haciendo reaccionar tirosilo con, por ejemplo, compuestos de diazonio aromaticos o tetranitrometano. El N-acetilimidizol y el tetranitrometano se pueden usar para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los mimeticos de residuos de cisteina pueden generarse haciendo reaccionar residuos de cisteinilo con, por ejemplo, alfa-haloacetatos tales como acido 2-cloroacetico o cloroacetamida y las correspondientes aminas; para producir derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los mimeticos de residuos de cisteina tambien se pueden generar haciendo reaccionar residuos de cisteinilo con, por ejemplo, bromo-trifluoroacetona, acido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propionico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil 2-piridilo; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Se pueden generar mimeticos de lisina (y pueden alterarse los residuos amino terminales) haciendo reaccionar lisinilo con, por ejemplo, anhidridos de acido succinico u otros acidos carboxilicos. La lisina y otros compuestos mimeticos que contienen alfa-amino tambien se pueden generar por reaccion con imidoesteres, como el picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, acido trinitro-bencenosulfonico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Se pueden generar mimeticos de metionina por reaccion con, por ejemplo, sulfoxido de metionina. Los mimeticos de la prolina incluyen, por ejemplo, acido pipecolico, acido tiazolidin carboxilico, 3- o 4-hidroxiprolina, deshidroprolina, 3-o 4-metilprolina, o 3,3-dimetilprolina. Los mimeticos de residuos de histidina pueden generarse haciendo reaccionar histidilo con, por ejemplo, dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo. Otros mimeticos incluyen, por ejemplo, los generados por la hidroxilacion de prolina y lisina; fosforilacion de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo; metilacion de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilacion de la amina N-terminal; metilacion de los residuos de amida de la cadena principal o sustitucion con aminoacidos N-metilo; o amidacion de grupos carboxilo C-terminales.

Un residuo, por ejemplo, un aminoacido, de un polipeptido de la invencion tambien puede reemplazarse por un aminoacido (o residuo peptidomimetico) de la quiralidad opuesta. Por lo tanto, cualquier aminoacido que se presente naturalmente en la configuracion L (que tambien se puede denominar R o S, dependiendo de la estructura de la entidad quimica) puede reemplazarse con el aminoacido del mismo tipo estructural quimico o un peptidomimetico, pero de la quiralidad opuesta, denominada como D-aminoacido, pero tambien puede ser referida como forma R o S.

La divulgacion tambien proporciona metodos para modificar los polipeptidos de la invencion mediante procesos naturales, tales como el procesamiento posterior a la traduccion (por ejemplo, fosforilacion, acilacion, etc.), o mediante tecnicas de modificacion quimica, y los polipeptidos modificados resultantes. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte del polipeptido, incluyendo la cadena principal peptidica, las cadenas laterales de aminoacidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciara que el mismo tipo de modificacion puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios en un polipeptido dado. Tambien un polipeptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, ADP-ribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de una fraccion hemo, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un lipido o derivado lipidico, union covalente de un fosfatidilinositol, ciclizacion de entrecruzamiento, formacion de enlaces disulfuro, desmetilacion, formacion de enlaces cruzados covalentes, formacion de cisteina, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, glicosilacion, formacion de anclaje GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, pegilacion, procesamiento proteolitico, fosforilacion, prenilacion, racemizacion, selenoilacion, sulfatacion y adicion de aminoacidos mediada por ARN de transferencia a una proteina tal como arginilacion. Vease, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, paginas 1-12 (1983).

Los metodos de sintesis de peptidos quimicos en fase solida tambien se pueden usar para sintetizar el polipeptido o fragmentos de la invencion. Tal metodo se conoce en la tecnica desde principios de la decada de 1960 (Merrifield, RB, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154, 1963) (vease tambien Stewart, jM y Young, JD, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., paginas 11-12)) y recientemente se han empleado en kits de sintesis y diseno de peptidos de laboratorio disponibles comercialmente (Cambridge Research Biochemicals). Dichos kits de laboratorio disponibles comercialmente han utilizado generalmente las ensenanzas de H. M. Geysen et al, Proc. Natl Acad Sci., USA, 81: 3998 (1984) y proporcionan la sintesis de peptidos en las puntas de una multitud de "varillas" o "clavijas", todos los cuales estan conectados a una sola placa. Cuando se utiliza un sistema de este tipo, una placa de varillas o clavijas se invierte y se inserta en una segunda placa de pozos o depositos correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoacido apropiado a las puntas de las clavijas o varillas. Al repetir esta etapa del proceso, es decir, al invertir e insertar las puntas de las varillas y las clavijas en las soluciones apropiadas, los aminoacidos se incorporan a los peptidos deseados. Ademas, hay disponibles varios sistemas de sintesis de peptidos FMOC disponibles. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipeptido o fragmento se puede llevar a cabo en un soporte solido utilizando un sintetizador de peptidos automatizado modelo 431AMR de Applied Biosystems, Inc. Dicho equipo proporciona acceso inmediato a los peptidos de la divulgacion, ya sea por sintesis directa o por sintesis de una serie de fragmentos que pueden acoplarse utilizando otras tecnicas conocidas.

La divulgacion proporciona nuevas amilasas (por ejemplo, alfa-amilasas), incluidos los ejemplos de enzimas de la divulgacion, los acidos nucleicos que las codifican, los anticuerpos que las unen y los metodos para fabricarlas y usarlas. En un aspecto, los polipeptidos de la divulgacion tienen una actividad de amilasa, como se describe en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, la capacidad de hidrolizar almidones en azucares. En un aspecto, los polipeptidos de la divulgacion tienen una actividad de alfa amilasa. En aspectos alternativos, las amilasas de la divulgacion tienen actividades que se han modificado de aquellas de los ejemplos de amilasas descritas en este documento.

La divulgacion incluye amilasas de la divulgacion con y sin secuencias senal (incluidas las secuencias senal de la divulgacion, vease, por ejemplo, la Tabla 3, a continuacion, u otras secuencias senal) y las secuencias senal en si mismas (por ejemplo, la Tabla 3, a continuacion). La divulgacion tambien incluye polipeptidos (por ejemplo, proteinas de fusion) que comprenden una secuencia senal de la invencion, vease, por ejemplo, la Tabla 3, a continuacion. El polipeptido que comprende una secuencia senal de la divulgacion puede ser una amilasa de la divulgacion u otra amilasa u otra enzima u otro polipeptido.

La divulgacion incluye amilasas inmovilizadas, anticuerpos anti-amilasa y fragmentos de los mismos. La divulgacion proporciona metodos para inhibir la actividad de amilasa, por ejemplo, usando mutantes negativos dominantes o anticuerpos anti-amilasa de la divulgacion de la invencion. La divulgacion incluye heterocomplejos, por ejemplo, proteinas de fusion, heterodimeros, etc., que comprenden las amilasas de la divulgacion.

En un aspecto, las amilasas (por ejemplo, alfa-amilasas) de la divulgacion hidrolizan enlaces polisacaridos internos, por ejemplo, enlaces a-1,4 y 1,6-glucosidicos en almidon para producir maltodextrinas de menor peso molecular. En un aspecto, esta hidrolisis es en gran parte aleatoria. Por lo tanto, la divulgacion proporciona metodos para producir maltodextrinas de peso molecular mas pequeno.

Las amilasas de la divulgacion pueden usarse en entornos de laboratorio e industriales para hidrolizar almidon o cualquier compuesto que comprenda maltodextrina para una variedad de propositos. Estas amilasas pueden usarse solas para proporcionar una hidrolisis especifica o pueden combinarse con otras amilasas para proporcionar un "coctel" con un amplio espectro de actividad. Los ejemplos de usos incluyen la eliminacion o la hidrolisis parcial o completa del almidon o cualquier compuesto que comprenda maltodextrina de muestras biologicas, de alimentos, piensos para animales, farmaceuticas o industriales.

Por ejemplo, las amilasas de la presente divulgacion pueden formularse en detergentes para ropa para ayudar a eliminar las manchas que contienen almidon. En un aspecto, la invencion proporciona detergentes que comprenden polipeptidos de la invencion. Estas composiciones detergentes incluyen soluciones y aplicaciones para lavar la ropa y lavavajillas (por ejemplo, lavavajillas automatico). Las amilasas de la divulgacion se pueden usar como agentes de limpieza en cualquier matriz de detergente (veanse las aplicaciones industriales a continuacion). Las amilasas de la presente divulgacion se pueden usar en las etapas iniciales (licuefaccion) del procesamiento de almidon, en la molienda de maiz humedo, en la produccion de alcohol, en la industria textil para el desencolado de almidon, en aplicaciones de panificacion, en la industria de bebidas, en campos petroleros en procesos de perforacion; en entintado de papel reciclado; y en pienso animal.

Las amilasas de la divulgacion pueden tener una actividad de amilasa en diversas condiciones, por ejemplo, extremos en pH y/o temperatura, agentes oxidantes y similares. La divulgacion proporciona metodos que conducen a preparaciones de amilasa alternativas con diferentes eficiencias y estabilidades cataliticas, por ejemplo, hacia la temperatura, los agentes oxidantes y las condiciones de lavado cambiantes. En un aspecto, las variantes de amilasa pueden producirse usando tecnicas de mutagenesis dirigida al sitio y/o mutagenesis aleatoria. En un aspecto, la evolucion dirigida puede usarse para producir una gran variedad de variantes de amilasa con especificidades y estabilidad alternativas.

Las proteinas de la invencion tambien son utiles como reactivos de investigacion para identificar moduladores de amilasa, por ejemplo, activadores o inhibidores de la actividad de la amilasa. Brevemente, las muestras de prueba (compuestos, caldos, extractos y similares) se agregan a los ensayos de amilasa para determinar su capacidad para inhibir la escision del sustrato. Los inhibidores identificados de esta manera se pueden usar en la industria y en la investigacion para reducir o prevenir la proteolisis no deseada. Al igual que con las amilasas, los inhibidores se pueden combinar para aumentar el espectro de actividad.

La divulgacion tambien proporciona metodos para descubrir nuevas amilasas usando los acidos nucleicos, polipeptidos y anticuerpos de la divulgacion. En un aspecto, las bibliotecas de fagos lambda se analizan para el descubrimiento de amilasas basado en la expresion. En un aspecto, la divulgacion usa bibliotecas de fagos lambda en la seleccion para permitir la deteccion de clones toxicos; acceso mejorado al sustrato; reduccion de la necesidad de modificar geneticamente un huesped, evitando la posibilidad de cualquier sesgo resultante de la escision masiva de la biblioteca; y, un crecimiento mas rapido con bajas densidades de clones. La seleccion de bibliotecas de fagos lambda puede ser en fase liquida o en fase solida. En un aspecto, la divulgacion proporciona una seleccion en fase liquida. Esto da una mayor flexibilidad en las condiciones de ensayo; flexibilidad adicional del sustrato; mayor sensibilidad para clones debiles; y facilidad de automatizacion sobre la cribado en fase solida.

La divulgacion proporciona metodos de cribado que utilizan las proteinas y los acidos nucleicos de la invencion y la automatizacion robotica para permitir la ejecucion de muchos miles de reacciones biocataliticas y ensayos de cribado en un corto periodo de tiempo, por ejemplo, por dia, asi como garantizar un alto nivel de precision y reproducibilidad (vease la discusion de matrices, a continuacion). Como resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en cuestion de semanas. Para obtener mas informacion sobre la modificacion de moleculas, incluidas las moleculas pequenas, vease el documento PCT/US94/09174.

La presente divulgacion incluye enzimas amilasa que son variantes de carbonil hidrolasa de origen no natural (por ejemplo, variantes de amilasa) que tienen una actividad proteolitica, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o caracteristicas de rendimiento diferentes en comparacion con la carbonil hidrolasa precursora de la cual se deriva la secuencia de aminoacidos de la variante. Especificamente, tales variantes de amilasa tienen una secuencia de aminoacidos no encontrada en la naturaleza, que se deriva por sustitucion de una pluralidad de residuos de aminoacidos de una amilasa precursora con diferentes aminoacidos. La amilasa precursora puede ser una amilasa natural o una amilasa recombinante. Las variantes de amilasa utiles abarcan la sustitucion de cualquiera de los L-aminoacidos naturales en las posiciones designadas de residuos de aminoacidos.

Secuencias de senal de amilasa

La divulgacion proporciona secuencias senal que consisten en o que comprenden un peptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 29, 1 a 30 o 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 0 1 a 39, o mas, de un polipeptido de la divulgacion. Vease la Tabla 3 para las secuencias senal de amilasa y los acidos nucleicos que codifican estas secuencias senal.

La divulgacion tambien proporciona secuencias senal de amilasa y acidos nucleicos que codifican estas secuencias senal que comprenden o consisten en los residuos 1 a 32 o 1 a 33 de la SEQ ID NO: 441; los residuos 1 a 27 o 1 a 28 de la SEQ ID NO: 443; los residuos 1 a 24 o 1 a 25 de la SEQ ID NO: 445; los residuos 1 a 23 o 1 a 24 de la SEQ ID NO: 449; los residuos 1 a 49 o 1 a 50 de la SEQ ID NO: 451; los residuos 1 a 34 o 1 a 35 de la SEQ ID NO: 453; los residuos 1 a 37 o 1 a 38 de la SEQ ID NO: 455; los residuos 1 a 26 o 1 a 27 de la SEQ ID NO: 457; los residuos 1 a 29 o 1 a 30 de la SEQ ID NO: 459; los residuos 1 a 22 o 1 a 23 de la SEQ ID NO: 466; los residuos 1 a 19 o 1 a 20 de la SEQ ID NO: 485; los residuos 1 a 54 o 1 a 55 de la SEQ ID NO: 493; los residuos 1 a 22 a 1 a 23 de la SEQ ID NO: 499; los residuos 21 o 1 a 22 de la SEQ ID NO: 516; los residuos 1 a 26 o 1 a 27 de la SEQ ID NO: 518; los residuos 1 a 20 o 1 a 21 de la SEQ ID NO: 540; los residuos 1 a 23 o 1 a 24 de la SEQ ID NO: 553; los residuos 1 a 19 o 1 a 20 de la SEQ ID NO: 559; los residuos 1 a 33 o 1 a 34 de la SEQ ID NO: 566.

Por ejemplo, con respecto a la Tabla 3, la divulgacion proporciona peptidos que comprenden o consisten en los residuos de aminoacidos 1 a 23 (SEQ ID NO: 213) de la SeQ ID NO: 87, etc.

Tabla 3

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Las secuencias senal de amilasa de la divulgacion pueden ser peptidos aislados o secuencias unidas a otra amilasa o un polipeptido no amilasa, por ejemplo, como una protefna de fusion. En un aspecto, la divulgacion proporciona polipeptidos que comprenden secuencias senal de amilasa de la divulgacion. En un aspecto, los polipeptidos que comprenden secuencias senal de amilasa de la divulgacion comprenden secuencias heterologas a una amilasa de la divulgacion (por ejemplo, una protefna de fusion que comprende una secuencia senal de amilasa de la invencion y secuencias de otra amilasa o una protefna no amilasa). En un aspecto, la invencion proporciona amilasas de la invencion con secuencias senal heterologas, por ejemplo, secuencias con una secuencia senal de levadura. Por ejemplo, una amilasa de la invencion que comprende una secuencia senal heterologa en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

En un aspecto, las secuencias senal de la divulgacion se identifican despues de la identificacion de nuevos polipeptidos de amilasa. Las vfas por las que las protefnas se clasifican y transportan a su ubicacion celular adecuada a menudo se denominan vfas de direccionamiento de protefnas. Uno de los elementos mas importantes en todos estos sistemas de direccionamiento es una secuencia corta de aminoacidos en el terminal amino de un polipeptido recien sintetizado llamado secuencia senal. Esta secuencia senal dirige una protefna a su ubicacion apropiada en la celula y se elimina durante el transporte o cuando la protefna llega a su destino final. La mayorfa de las protefnas lisosomales, de membrana o secretadas tienen una secuencia senal amino-terminal que las marca para su translocacion al lumen del retfculo endoplasmico. Se han determinado mas de 100 secuencias senal para protefnas en este grupo. Las secuencias senal pueden variar en longitud de 13 a 36 residuos de aminoacidos. Los expertos en la tecnica conocen diversos metodos de reconocimiento de secuencias senal. Por ejemplo, en un aspecto, los nuevos peptidos senal de amilasa se identifican mediante un metodo denominado SignalP. SignalP usa una red neuronal combinada que reconoce los peptidos senal y sus sitios de escision. (Nielsen, et al., "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites." Protein Engineering, vol. 10, no. 1, pag. 1-6 (1997).

Debe entenderse que, en algunos aspectos, las amilasas de la divulgacion pueden no tener secuencias senal. En un aspecto, la divulgacion proporciona las amilasas de la divulgacion que carecen de toda o parte de una secuencia senal, por ejemplo, las secuencias senal de la divulgacion (vease la Tabla 3, a continuacion). En un aspecto, la divulgacion proporciona una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia senal de una amilasa unida operativamente a una secuencia de acido nucleico de una amilasa diferente u, opcionalmente, puede desearse una secuencia senal de una protefna no amilasa. La Tabla 3 muestra ejemplos de secuencias senal de la divulgacion.

Amilasa prepro y secuencias senal y dominios catalfticos

Ademas de las secuencias senal (por ejemplo, peptidos senal (SP)), como se discutio anteriormente, la divulgacion proporciona dominios prepro y dominios catalfticos (CD). Los SP, los dominios prepro y/o los CD de la divulgacion pueden ser peptidos recombinantes o aislados o pueden ser parte de una protefna de fusion, por ejemplo, como un dominio heterologo en una protefna quimerica. La divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican estos dominios catalfticos (CD) (por ejemplo, "sitios activos"), dominios prepro y secuencias senal (SP, por ejemplo, un peptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste en residuos amino terminales de un polipeptido de la invencion).

Las secuencias senal (SP) de amilasa, los dominios catalfticos (CD) y/o las secuencias prepro de la divulgacion pueden ser peptidos aislados, o secuencias unidas a otra amilasa o un polipeptido no amilasa, por ejemplo, como una protefna de fusion (quimerica). En un aspecto, los polipeptidos que comprenden secuencias senal SP de amilasa y/o prepro de la divulgacion comprenden secuencias heterologas a las amilasas de la invencion (por ejemplo, una protefna de fusion que comprende un SP y/o prepro de la divulgacion y secuencias de otra protefna amilasa o no amilasa). En un aspecto, la invencion proporciona amilasas de la invencion con secuencias CD, SP y/o prepro heterologas, por ejemplo, secuencias con una secuencia senal de levadura. Una amilasa de la invencion puede comprender CD, SP y/o prepro heterologos en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

En un aspecto, se identifican secuencias SP, CD y/o prepro de la divulgacion despues de la identificacion de nuevos polipeptidos de amilasa. Las vfas por las que las protefnas se clasifican y transportan a su ubicacion celular adecuada a menudo se denominan vias de direccionamiento de proteinas. Uno de los elementos mas importantes en todos estos sistemas de direccionamiento es una secuencia corta de aminoacidos en el terminal amino de un polipeptido recien sintetizado llamado secuencia senal. Esta secuencia senal dirige una proteina a su ubicacion apropiada en la celula y se elimina durante el transporte o cuando la proteina llega a su destino final. La mayoria de las proteinas lisosomales, de membrana o segregadas tienen una secuencia senal amino-terminal que las marca para su translocacion a la luz del reticulo endoplasmico. Las secuencias senal pueden variar en longitud de 13 a 45 o mas residuos de aminoacidos. Los expertos en la tecnica conocen diversos metodos de reconocimiento de secuencias senal. Por ejemplo, en un aspecto, los nuevos peptidos senal de hidrolasa se identifican mediante un metodo denominado SignalP. SignalP usa una red neuronal combinada que reconoce los peptidos senal y sus sitios de escision. (Nielsen, et al., "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites." Protein Engineering, vol. 10, no.

1, pag. 1-6 (1997).

En algunos aspectos, una amilasa de la divulgacion puede no tener SP y/o secuencias prepro, y/o dominios cataliticos (CD). En un aspecto, la divulgacion proporciona amilasas que carecen de todo o parte de un SP, un CD y/o un dominio prepro. En un aspecto, la divulgacion de la invencion proporciona una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia senal (SP), un CD y/o prepro de una amilasa unida operativamente a una secuencia de acido nucleico de una amilasa diferente u, opcionalmente, se puede desear una secuencia senal (SP), un dominio CD y/o prepro de una proteina no amilasa.

La divulgacion tambien proporciona polipeptidos aislados o recombinantes que comprenden secuencias senal (SP), dominio prepro y/o dominios cataliticos (CD) de la divulgacion y secuencias heterologas. Las secuencias heterologas son secuencias no asociadas naturalmente (por ejemplo, a una amilasa) con un SP, dominio prepro y/o CD. La secuencia a la que el SP, el dominio prepro y/o el CD no estan naturalmente asociados puede estar en el extremo amino terminal del SP, el dominio prepro y/o el CD, el extremo carboxi terminal y/o en ambos extremos del SP y/o CD. En un aspecto, la divulgacion proporciona un polipeptido aislado o recombinante que comprende (o consiste en) un polipeptido que comprende una secuencia senal (SP), un dominio prepro y/o un dominio catalitico (CD) de la divulgacion con la condicion de que no este asociado con cualquier secuencia a la que se asocie naturalmente (por ejemplo, secuencia de amilasa). De manera similar, en un aspecto, la divulgacion proporciona acidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipeptidos. Por lo tanto, en un aspecto, el acido nucleico aislado o recombinante de la invencion comprende la secuencia codificante de una secuencia senal (SP), dominio prepro y/o dominio catalitico (CD) de la divulgacion y una secuencia heterologa (es decir, una secuencia no naturalmente asociada con una secuencia senal (SP), dominio prepro y/o dominio catalitico (CD) de la divulgacion). La secuencia heterologa puede estar en el extremo terminal 3', el extremo terminal 5' y/o en ambos extremos de la secuencia de codificacion SP, el dominio prepro y/o CD.

Los polipeptidos de la divulgacion incluyen amilasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipeptidos de la divulgacion incluyen proproteinas antes de la "maduracion" o el procesamiento de secuencias prepro, por ejemplo, por una enzima procesadora de proproteinas, tal como una proproteina convertasa para generar una proteina madura "activa". Los polipeptidos de la divulgacion incluyen amilasas inactivas por otras razones, por ejemplo, antes de la "activacion" por un evento de procesamiento postraduccional, por ejemplo, una accion de endo o exopeptidasa o proteinasa, un evento de fosforilacion, una amidacion, una glicosilacion o sulfatacion, un evento de dimerizacion, y similares. Los metodos para identificar secuencias de dominio "prepro", CD y secuencias senal son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4 (2): 115-136. Por ejemplo, para identificar una secuencia prepro, la proteina se purifica del espacio extracelular y la secuencia de la proteina N-terminal se determina y se compara con la forma no procesada.

Los polipeptidos de la invencion incluyen todas las formas activas, incluidas subsecuencias activas, por ejemplo, dominios cataliticos (CD) o sitios activos, de una enzima de la invencion. En un aspecto, la divulgacion proporciona dominios cataliticos o sitios activos como se establece a continuacion. En un aspecto, la divulgacion proporciona un peptido o polipeptido que comprende o consiste en un dominio de sitio activo tal como se predice mediante el uso de una base de datos como Pfam (que es una gran coleccion de alineamientos de secuencias multiples y modelos ocultos de Markov que cubren muchas familias de proteinas comunes. Base de datos Pfam de familias de proteinas, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, SR Eddy, S. Griffiths-Jones, KL Howe, M. Marshall y ELL Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30 (1): 276-280, 2002) o equivalente.

Amilasas hibridas y bibliotecas de peptidos

En un aspecto, la divulgacion proporciona amilasas hibridas y proteinas de fusion, que incluyen bibliotecas de peptidos, que comprenden secuencias de la divulgacion. Las bibliotecas de peptidos de la divulgacion se pueden usar para aislar moduladores de peptidos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de objetivos, tales como sustratos de amilasa, receptores, enzimas. Las bibliotecas de peptidos de la divulgacion se pueden usar para identificar parejas de union formales de objetivos, tales como ligandos, por ejemplo, citoquinas, hormonas y similares.

En un aspecto, las proteinas de fusion de la divulgacion (por ejemplo, la fraccion peptidica) se estabilizan conformacionalmente (en relacion con los peptidos lineales) para permitir una mayor afinidad de union por los objetivos. La divulgacion proporciona fusiones de amilasas de la divulgacion y otros peptidos, incluyendo peptidos conocidos y aleatorios. Se pueden fusionar de tal manera que la estructura de las amilasas no se perturbe de manera significativa y el peptido se estabilice conformacionalmente metabolicamente o estructuralmente. Esto permite la creacion de una biblioteca de peptidos que se controla facilmente tanto por su presencia dentro de las celulas como por su cantidad.

Las variantes de la secuencia de aminoacidos de la divulgacion se pueden caracterizar por una naturaleza predeterminada de la variacion, una caracteristica que los diferencia de una forma natural, por ejemplo, una variacion alelica o interespecies de una secuencia de amilasa. En un aspecto, las variantes de la divulgacion muestran la misma actividad biologica cualitativa que el analogo natural. Alternativamente, las variantes pueden seleccionarse por tener caracteristicas modificadas. En un aspecto, aunque el sitio o region para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la mutacion en si no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutacion en un sitio determinado, se puede llevar a cabo una mutagenesis aleatoria en el codon o region objetivo y las variantes de amilasa expresadas pueden examinarse para la combinacion optima de actividad deseada. Las tecnicas para realizar mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, como se describe en este documento, por ejemplo, mutagenesis del cebador M13 y mutagenesis por PCR. La seleccion de los mutantes se puede realizar mediante ensayos de actividades proteoliticas. En aspectos alternativos, las sustituciones de aminoacidos pueden ser residuos individuales; las inserciones pueden ser del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoacidos, aunque se pueden hacer inserciones considerablemente mas grandes. Las eliminaciones pueden variar desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 residuos o mas. Para obtener un derivado final con las propiedades optimas, se pueden usar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas. Generalmente, estos cambios se realizan en unos pocos aminoacidos para minimizar la alteracion de la molecula. Sin embargo, cambios mayores pueden ser tolerados en ciertas circunstancias.

La divulgacion proporciona amilasas en las que se ha modificado la estructura de la cadena principal del polipeptido, la estructura secundaria o terciaria, por ejemplo, una estructura alfa-helicoidal o de lamina beta. En un aspecto, la carga o hidrofobicidad ha sido modificada. En un aspecto, la mayor parte de una cadena lateral ha sido modificada. Se realizan cambios sustanciales en la funcion o en la identidad inmunologica seleccionando sustituciones que son menos conservadoras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones que afectan de manera mas significativa: la estructura de la cadena principal del polipeptido en el area de la alteracion, por ejemplo, una estructura alfa-helicoidal o de lamina beta; una carga o un sitio hidrofobo de la molecula, que puede estar en un sitio activo; o una cadena lateral. La divulgacion proporciona sustituciones en el polipeptido de la invencion en donde (a) residuos hidrofilos, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrofobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteina o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) una que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina. Las variantes pueden exhibir la misma actividad biologica cualitativa (es decir, actividad de amilasa) aunque se pueden seleccionar variantes para modificar las caracteristicas de las amilasas segun sea necesario.

En un aspecto, las amilasas de la divulgacion comprenden epitopos o etiquetas de purificacion, secuencias senal u otras secuencias de fusion, etc. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion pueden fusionarse a un peptido aleatorio para formar un polipeptido de fusion. Por "fusionado" o "operativamente enlazado" en el presente documento se entiende que el peptido aleatorio y la amilasa estan unidos entre si, de tal manera que se minimice la alteracion de la estabilidad de la estructura de la amilasa, por ejemplo, retiene la actividad de la amilasa. El polipeptido de fusion (o polinucleotido de fusion que codifica el polipeptido de fusion) tambien puede comprender otros componentes, incluyendo multiples peptidos en multiples bucles.

En un aspecto, los peptidos y los acidos nucleicos que los codifican son aleatorios, completamente aleatorizados o sesgados en su aleatorizacion, por ejemplo, en la frecuencia de nucleotidos/residuos en general o por posicion. "Aleatorizado" significa que cada acido nucleico y peptido se compone de nucleotidos y aminoacidos esencialmente aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los acidos nucleicos que dan lugar a los peptidos pueden sintetizarse quimicamente, y por lo tanto pueden incorporar cualquier nucleotido en cualquier posicion. Por lo tanto, cuando los acidos nucleicos se expresan para formar peptidos, cualquier residuo de aminoacido puede incorporarse en cualquier posicion. El proceso sintetico se puede disenar para generar acidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formacion de todas o la mayoria de las combinaciones posibles en la longitud del acido nucleico, formando asi una biblioteca de acidos nucleicos aleatorizados. La biblioteca puede proporcionar una poblacion suficientemente estructuralmente diversa de productos de expresion aleatorizados para afectar un rango probabilisticamente suficiente de respuestas celulares para proporcionar una o mas celulas que muestren una respuesta deseada. Por lo tanto, la descripcion proporciona una biblioteca de interaccion lo suficientemente grande como para que al menos uno de sus miembros tenga una estructura que le de afinidad por alguna molecula, proteina u otro factor.

Metodologias de deteccion y dispositivos de monitoreo "en linea"

En la practica de los metodos de la invencion, se puede usar una variedad de aparatos y metodologias junto con los polipeptidos y acidos nucleicos de la invencion, por ejemplo, para seleccionar polipeptidos en busca de actividad amilasa, para seleccionar compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores, de una actividad de amilasa, para anticuerpos que se unen a un polipeptido de la invencion, para acidos nucleicos que se hibridan con un acido nucleico de la invencion, para detectar celulas que expresan un polipeptido de la invencion y similares.

Matrices capilares

Las matrices de capilares, tales como GIGAMATRIXMR, Diversa Corporation, San Diego, CA, pueden utilizarse para los metodos de la invencion. Los acidos nucleicos o polipeptidos de la invencion pueden inmovilizarse o aplicarse a una matriz, incluyendo matrices capilares. Las matrices se pueden usar para detectar o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moleculas pequenas, anticuerpos, acidos nucleicos, etc.) para determinar su capacidad para unirse o modular la actividad de un acido nucleico o un polipeptido de la invencion. Las matrices capilares proporcionan otro sistema para sostener y seleccionar muestras. Por ejemplo, un aparato de cribado de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en una matriz de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprende al menos una pared que define un lumen para retener una muestra. El aparato puede incluir ademas material intersticial dispuesto entre capilares adyacentes en la matriz, y una o mas marcas de referencia formadas dentro del material intersticial. Un capilar para cribar una muestra, en donde el capilar esta adaptado para unirse a una serie de capilares, puede incluir una primera pared que define un lumen para retener la muestra, y una segunda pared formada por un material filtrante, para filtrar la energia de excitacion provista al lumen para excitar la muestra. Un polipeptido o acido nucleico, por ejemplo, un ligando, puede introducirse en un primer componente en al menos una porcion de un capilar de una matriz de capilares. Cada capilar de la matriz de capilares puede comprender al menos una pared que define un lumen para retener el primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detras del primer componente. Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en el que el segundo componente esta separado del primer componente por la burbuja de aire. Se puede introducir una muestra de interes tal como un primer liquido marcado con una particula detectable en un capilar de una matriz de capilares, en donde cada capilar de la matriz de capilares comprende al menos una pared que define un lumen para retener el primer liquido y la particula detectable, y en el que al menos una pared esta recubierta con un material de union para unir la particula detectable a al menos una pared. El metodo puede incluir ademas eliminar el primer liquido del tubo capilar, en donde la particula detectable unida se mantiene dentro del capilar, e introducir un segundo liquido en el tubo capilar. El metodo puede incluir ademas eliminar el primer liquido del tubo capilar, en donde la particula detectable unida se mantiene dentro del capilar, e introducir un segundo liquido en el tubo capilar.

La matriz de capilares puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden al menos una pared exterior que define un lumen. La pared exterior del capilar puede ser una o mas paredes fusionadas. De manera similar, la pared puede definir un lumen que es cilindrico, cuadrado, hexagonal o cualquier otra forma geometrica, siempre y cuando las paredes formen un lumen para la retencion de un liquido o muestra. Los capilares de la matriz de capilares se pueden mantener juntos muy cerca para formar una estructura plana. Los capilares se pueden unir entre si, fusionandolos (por ejemplo, cuando los capilares estan hechos de vidrio), pegados, unidos o sujetados uno al lado del otro. La matriz de capilares se puede formar de cualquier numero de capilares individuales, por ejemplo, un intervalo de 100 a 4.000.000 de capilares. Una matriz de capilares puede formar una placa de microtitulacion con aproximadamente 100.000 o mas capilares individuales unidos entre si.

Matrices, o "Biochips"

Los acidos nucleicos o polipeptidos de la invencion pueden inmovilizarse o aplicarse a una matriz. Las matrices se pueden usar para detectar o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moleculas pequenas, anticuerpos, acidos nucleicos, etc.) para determinar su capacidad para unirse o modular la actividad de un acido nucleico o un polipeptido de la invencion. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgacion, un parametro supervisado es la expresion de transcripcion de un gen de amilasa. Uno o mas, o, todos los transcriptos de una celula pueden medirse por hibridacion de una muestra que comprende transcriptos de la celula, o acidos nucleicos representativos o complementarios de los transcriptos de una celula, por hibridacion con acidos nucleicos inmovilizados en una matriz, o "biochip". Al utilizar una "matriz" de acidos nucleicos en un microchip, algunas o todas las transcripciones de una celula pueden cuantificarse simultaneamente. Alternativamente, tambien se pueden usar matrices que comprenden acido nucleico genomico para determinar el genotipo de una cepa recientemente modificada fabricada por los metodos de la invencion. Las matrices de polipeptidos tambien se pueden usar para cuantificar simultaneamente una pluralidad de proteinas. La presente invencion se puede poner en practica con cualquier "matriz" conocida, tambien denominada "micromatriz" o "matriz de acido nucleico" o "matriz de polipeptidos" o "anticuerpo" o "biochip" o una variacion del mismo. Las matrices son genericamente una pluralidad de "puntos" o "elementos objetivo", comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de una o mas moleculas biologicas, por ejemplo, oligonucleotidos, inmovilizados en un area definida de una superficie de sustrato para la union especifica a una molecula de muestra, por ejemplo, transcriptos de ARNm.

En la practica de los metodos de la invencion, cualquier matriz conocida y/o metodo de fabricacion y uso de matrices se pueden incorporar en su totalidad o en parte, o variaciones de los mismas, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.965.452; 5.959.098; 5.856.174; 5.830.645; 5.770.456; 5.632.957; 5.556.752; 5.143.854; 5.807.522; 5.800.992; 5.744.305; 5.700.637; 5.556.752; 5.434.049; vease tambien, por ejemplo, los documentos WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; vease tambien, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32. Vease tambien las solicitudes de patente publicadas de Estados Unidos Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449;20010014448;20010012537;20010008765.

Anticuerpos y metodos de deteccion basados en anticuerpos

La divulgacion proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen especificamente a una amilasa de la divulgacion. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar, identificar o cuantificar las amilasas de la divulgacion o polipeptidos relacionados. Estos anticuerpos pueden usarse para aislar otros polipeptidos dentro del alcance de la invencion u otras amilasas relacionadas. Los anticuerpos pueden disenarse para unirse a un sitio activo de una amilasa. Por lo tanto, la divulgacion proporciona metodos para inhibir las amilasas usando los anticuerpos de la divulgacion.

Los anticuerpos pueden usarse en inmunoprecipitacion, tincion, columnas de inmunoafinidad y similares. Si se desea, pueden generarse secuencias de acido nucleico que codifican antigenos especificos mediante inmunizacion seguida por aislamiento del polipeptido o acido nucleico, amplificacion o clonacion e inmovilizacion del polipeptido en una matriz de la divulgacion. Alternativamente, los metodos de la divulgacion se pueden usar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una celula a modificar, por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo puede aumentar o disminuir. Ademas, la capacidad de producir o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo modificado en una celula por los metodos de la divulgacion.

Los metodos de inmunizacion, produccion y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por los expertos en la tecnica y se describen en la literatura cientifica y de patentes, vease, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York. Los anticuerpos tambien pueden generarse in vitro, por ejemplo, usando bibliotecas de despliegue en fagos que expresan sitios de union a anticuerpos recombinantes, ademas de los metodos tradicionales in vivo que usan animales. Vease, por ejemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct 26: 27 45.

Los polipeptidos o peptidos se pueden usar para generar anticuerpos que se unen especificamente a los polipeptidos, por ejemplo, las amilasas, de la divulgacion. Los anticuerpos resultantes se pueden usar en procedimientos de cromatografia de inmunoafinidad para aislar o purificar el polipeptido o para determinar si el polipeptido esta presente en una muestra biologica. En tales procedimientos, una preparacion de proteina, tal como un extracto, o una muestra biologica se pone en contacto con un anticuerpo capaz de unirse especificamente a uno de los polipeptidos de la invencion.

En los procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se une a un soporte solido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparacion de proteinas se coloca en contacto con el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se une especificamente a uno de los polipeptidos de la invencion. Despues de un lavado para eliminar proteinas unidas no especificamente, los polipeptidos unidos especificamente se eluyen.

La capacidad de las proteinas en una muestra biologica para unirse al anticuerpo puede determinarse utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la union puede determinarse marcando el anticuerpo con un marcador detectable tal como un agente fluorescente, un marcador enzimatico o un radioisotopo. Alternativamente, la union del anticuerpo a la muestra puede detectarse utilizando un anticuerpo secundario que tenga un marcador detectable en la misma. Los ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos en sandwich, radioinmunoensayos y transferencias Western.

Los anticuerpos policlonales generados contra los polipeptidos de la invencion pueden obtenerse mediante inyeccion directa de los polipeptidos en un animal o administrando los polipeptidos a un animal no humano. El anticuerpo asi obtenido se unira entonces al propio polipeptido. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solo un fragmento del polipeptido puede usarse para generar anticuerpos que pueden unirse a todo el polipeptido nativo. Dichos anticuerpos pueden usarse luego para aislar el polipeptido de las celulas que expresan ese polipeptido.

Para la preparacion de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier tecnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de lineas celulares. Los ejemplos incluyen la tecnica de hibridoma, la tecnica de trioma, la tecnica de hibridoma de celulas B humanas y la tecnica de hibridoma EBV (vease, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., paginas 77-96).

Las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena unica (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena unica para los polipeptidos de la invencion. Alternativamente, pueden usarse ratones transgenicos para expresar anticuerpos humanizados contra estos polipeptidos o fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos generados contra los polipeptidos de la invencion se pueden usar en la seleccion de polipeptidos similares (por ejemplo, amilasas) de otros organismos y muestras. En tales tecnicas, los polipeptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan aquellos polipeptidos que se unen especificamente al anticuerpo. Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente se puede usar para detectar la union del anticuerpo.

Kits

La divulgacion proporciona kits que comprenden las composiciones, por ejemplo, acidos nucleicos, casetes de expresion, vectores, celulas, semillas o plantas transgenicas o partes de plantas, polipeptidos (por ejemplo, amilasas) y/o anticuerpos de la divulgacion. Los kits tambien pueden contener material de instruccion que ensene las metodologias y usos industriales de la invencion, como se describe en este documento.

Medicion de parametros metabolicos

Los metodos de la divulgacion proporcionan la evolucion celular completa, o modificacion celular completa, de una celula para desarrollar una nueva cepa celular que tiene un nuevo fenotipo, por ejemplo, una actividad de amilasa nueva o modificada, modificando la composicion genetica de la celula. La composicion genetica puede modificarse mediante la adicion a la celula de un acido nucleico de la invencion. Para detectar el nuevo fenotipo, al menos un parametro metabolico de una celula modificada se monitoriza en la celula en un marco de tiempo "en tiempo real" o "en linea". En un aspecto, una pluralidad de celulas, tal como un cultivo celular, se monitoriza en "tiempo real" o "en linea". En un aspecto, una pluralidad de parametros metabolicos se monitoriza en "tiempo real" o "en linea". Los parametros metabolicos pueden monitorizarse utilizando las amilasas de la divulgacion.

El analisis de flujo metabolico (MFA) se basa en un marco bioquimico conocido. Se construye una matriz metabolica linealmente independiente basada en la ley de conservacion de masas y en la hipotesis del estado pseudoestable (PSSH) sobre los metabolitos intracelulares. Al practicar los metodos de divulgacion, se establecen redes metabolicas, que incluyen:

• la identidad de todos los sustratos de la ruta, productos y metabolitos intermedios,

• la identidad de todas las reacciones quimicas que interconvierten los metabolitos de la ruta, la estequiometria de las reacciones de la ruta,

• la identidad de todas las enzimas que catalizan las reacciones, la cinetica de la reaccion enzimatica,

• las interacciones reguladoras entre los componentes de la ruta, por ejemplo, interacciones alostericas, interacciones enzima-enzima, etc.,

• compartimentacion intracelular de enzimas o cualquier otra organizacion supramolecular de las enzimas, y,

• la presencia de cualquier gradiente de concentracion de metabolitos, enzimas o moleculas efectoras o barreras de difusion para su movimiento.

Una vez que se construye la red metabolica para una cepa dada, se puede introducir la presentacion matematica por nocion de matriz para estimar los flujos metabolicos intracelulares si los datos del metaboloma en linea estan disponibles. El fenotipo metabolico se basa en los cambios de toda la red metabolica dentro de una celula. El fenotipo metabolico se basa en el cambio de la utilizacion de la ruta con respecto a las condiciones ambientales, la regulacion genetica, el estado de desarrollo y el genotipo, etc. En un aspecto de los metodos de la divulgacion, despues del calculo de MFA en linea, el comportamiento dinamico de las celulas, se analizan su fenotipo y otras propiedades investigando la utilizacion de la ruta. Por ejemplo, si el suministro de glucosa aumenta y el oxigeno disminuye durante la fermentacion de la levadura, la utilizacion de las vias respiratorias se reducira y/o se detendra, y la utilizacion de las vias fermentativas dominara. El control del estado fisiologico de los cultivos celulares sera posible despues del analisis de la ruta. Los metodos de la divulgacion pueden ayudar a determinar como manipular la fermentacion determinando como cambiar el suministro de sustrato, la temperatura, el uso de inductores, etc. para controlar el estado fisiologico de las celulas para moverse en la direccion deseada. Al practicar los metodos de la divulgacion, los resultados de MFA tambien se pueden comparar con los datos del transcriptoma y el proteoma para disenar experimentos y protocolos para modificacion metabolica o combinacion de genes, etc.

En la practica de los metodos de la invencion, cualquier fenotipo modificado o nuevo puede ser conferido y detectado, incluyendo caracteristicas nuevas o mejoradas en la celula. Cualquier aspecto del metabolismo o crecimiento puede ser monitoreado.

Control de la expresion de un transcrito de ARNm

En un aspecto de la divulgacion, el fenotipo modificado comprende aumentar o disminuir la expresion de un transcrito de ARNm (por ejemplo, un mensaje de amilasa) o generar nuevos transcriptos (por ejemplo, amilasa) en una celula. Este aumento o disminucion de la expresion se puede rastrear probando la presencia de una amilasa de la divulgacion o mediante ensayos de actividad de la amilasa. Los transcriptos de mRNA, o mensajes, tambien se pueden detectar y cuantificar por cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, transferencias Northern, reacciones de amplificacion cuantitativa, hibridacion con matrices y similares. Las reacciones de amplificacion cuantitativa incluyen, por ejemplo, PCR cuantitativa, que incluye, por ejemplo, reaccion en cadena de polimerasa de transcripcion inversa cuantitativa, o RT-PCR; RT-PCR cuantitativa en tiempo real, o "RT-PCR cinetica en tiempo real" (vease, por ejemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114: 313-318; Xia (2001) Transplantation 72: 907-914).

En un aspecto de la divulgacion, el fenotipo modificado se genera eliminando la expresion de un gen homologo. La secuencia de codificacion del gen o uno o mas elementos de control de la transcripcion pueden ser eliminados, por ejemplo, promotores o potenciadores. Por lo tanto, la expresion de una transcripcion puede ser completamente ablacionada o solo disminuida.

En un aspecto de la divulgacion, el fenotipo modificado comprende aumentar la expresion de un gen homologo. Esto puede efectuarse eliminando un elemento de control negativo, incluido un elemento regulador de la transcripcion que actua en cis o trans, o tratando con agente mutagenico un elemento de control positivo. Uno o mas, o, todos los transcriptos de una celula pueden medirse mediante la hibridacion de una muestra que comprende transcriptos de la celula, o acidos nucleicos representativos de o complementarios a los transcriptos de una celula, mediante hibridacion con acidos nucleicos inmovilizados en una matriz.

Control de la expresion de polipeptidos, peptidos y aminoacidos

En un aspecto de la divulgacion, el fenotipo modificado comprende aumentar o disminuir la expresion de un polipeptido (por ejemplo, una amilasa) o generar nuevos polipeptidos en una celula. Este aumento o disminucion de la expresion puede rastrearse determinando la cantidad de amilasa presente o mediante ensayos de actividad de la amilasa. Los polipeptidos, peptidos y aminoacidos tambien pueden detectarse y cuantificarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, incluidos, por ejemplo, resonancia magnetica nuclear (RMN), espectrofotometria, radiografia (radiomarcacion de proteinas), electroforesis, electroforesis capilar, cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografia de capa fina (TLC), cromatografia de hiperdifusion, diversos metodos inmunologicos, por ejemplo, inmunoprecipitacion, inmunodifusion, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE), tincion con anticuerpos, clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACS), espectrometria de masas con pirolisis, espectrometria de infrarrojos por transformada de Fourier, espectrometria Raman, GC-MS y espectrometrias de masas de LC-electroaspersion y cap-LC-tandem-electroaspersion, y similares. Las bioactividades novedosas tambien pueden cribarse utilizando metodos, o variaciones de los mismos, descritos en la patente de Estados Unidos No.

6.057.103. Ademas, como se explica a continuacion en detalle, uno o mas, o todos los polipeptidos de una celula pueden medirse utilizando una matriz de proteinas.

Aplicaciones industriales

Composiciones detergentes

La invencion proporciona composiciones detergentes que comprenden el polipeptido de la invencion y metodos que usan estas composiciones. La divulgacion incorpora todos los metodos para elaborar y usar composiciones detergentes, vease, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. Las composiciones detergentes pueden ser una composicion acuosa de una y dos partes, una composicion liquida no acuosa, un solido fundido, una forma granulada, una forma en particulas, una tableta comprimida, un gel y/o una pasta y una forma en suspension. La divulgacion tambien proporciona metodos capaces de una eliminacion rapida de manchas gruesas de alimentos, peliculas de residuos de alimentos y otras composiciones alimenticias menores utilizando estas composiciones detergentes. Las amilasas de la divulgacion pueden facilitar la eliminacion de manchas de almidon por medio de hidrolisis catalitica del polisacarido de almidon. Las amilasas de la divulgacion se pueden usar en detergentes para lavavajillas en detergentes para lavado de textiles.

El contenido de enzima activa real depende del metodo de fabricacion de una composicion detergente y no es critico, suponiendo que la solucion detergente tenga la actividad enzimatica deseada. En un aspecto, la cantidad de amilasa presente en la solucion final varia de aproximadamente 0,001 mg a 0,5 mg por gramo de la composicion detergente. La enzima particular elegida para su uso en el proceso y los productos de esta divulgacion depende de las condiciones de uso final, incluida la forma fisica del producto, el uso del pH, la temperatura de uso y los tipos de suelo a degradar o alterar. La enzima se puede elegir para proporcionar una actividad y estabilidad optimas para cualquier conjunto dado de condiciones de utilidad. En un aspecto, los polipeptidos de la presente divulgacion son activos en los intervalos de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 y en el intervalo de temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C. Los detergentes de la divulgacion pueden comprender tensioactivos cationicos, semipolares no ionicos o bipolares; o, mezclas de los mismos.

Las amilasas de la presente divulgacion pueden formularse en detergentes en polvo y liquidos que tienen un pH entre 4,0 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5% (preferiblemente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones detergentes tambien pueden incluir otras enzimas tales como proteasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, asi como coadyuvantes y estabilizantes. La adicion de amilasas de la divulgacion a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitacion de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente tambien son adecuados para las presentes composiciones siempre que el pH se encuentre dentro del intervalo anterior, y la temperatura este por debajo de la temperatura de desnaturalizacion de la enzima descrita. Ademas, los polipeptidos de la divulgacion se pueden usar en una composicion de limpieza sin detergentes, nuevamente solos o en combinacion con coadyuvantes y estabilizantes.

La presente divulgacion proporciona composiciones limpiadoras que incluyen composiciones detergentes para limpiar superficies duras, composiciones detergentes para limpiar telas, composiciones para lavavajillas, composiciones orales de limpieza, composiciones limpiadoras para dentaduras postizas y soluciones de limpieza para lentes de contacto.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para lavar un objeto que comprende poner en contacto el objeto con un polipeptido de la invencion en condiciones suficientes para el lavado. En un aspecto, un polipeptido de la invencion se usa en un detergente, es decir, como un aditivo detergente. La composicion detergente de la divulgacion puede, por ejemplo, formularse como una composicion detergente para lavado de ropa a mano o maquina que comprende un polipeptido de la divulgacion. Las composiciones detergentes de la divulgacion incluyen soluciones y aplicaciones para lavar la ropa y lavavajillas (por ejemplo, lavavajillas automatico). Un aditivo para lavado de ropa adecuado para el tratamiento previo de tejidos tenidos puede comprender un polipeptido de la divulgacion. Una composicion suavizante de tejidos puede comprender un polipeptido de la divulgacion. Alternativamente, un polipeptido de la divulgacion puede formularse como una composicion detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras generales en el hogar. En aspectos alternativos, los aditivos detergentes y las composiciones detergentes de la divulgacion pueden comprender una o mas enzimas diferentes tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lactasa y/o una peroxidasa. Las propiedades de la enzima o enzimas de la divulgacion se eligen para que sean compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH optimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimaticos y no enzimaticos, etc.) y la enzima o enzimas estan presentes en cantidades eficaces. En un aspecto, las enzimas amilasas de la divulgacion se usan para eliminar materiales malolientes de las telas. Se describen diversas composiciones detergentes y metodos para fabricarlos que se pueden usar para poner en practica la divulgacion, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038; 6.309.871; 6.204.232; 6.197.070; 5.856.164.

Tratamiento de telas

La divulgacion proporciona metodos para tratar telas usando uno o mas polipeptidos de la invencion. Los polipeptidos de la invencion se pueden usar en cualquier metodo de tratamiento de telas, que son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.077.316. Por ejemplo, en un aspecto, la sensacion y el aspecto de una tela se mejoran mediante un metodo que comprende poner en contacto la tela con una amilasa de la divulgacion en una solucion. En un aspecto, la tela se trata con la solucion a presion.

En un aspecto, las enzimas de la divulgacion se aplican durante o despues del tejido de textiles, o durante la etapa de desencolado, o una o mas etapas adicionales de procesamiento de telas. Durante el tejido de los textiles, los hilos estan expuestos a una tension mecanica considerable. Antes de tejer en telares mecanicos, los hilos de urdimbre a menudo se recubren con almidon de encolado o derivados de almidon para aumentar su resistencia a la traccion y evitar la rotura. Las enzimas de la divulgacion se pueden aplicar para eliminar estos almidones de encolado o derivados de almidon. Una vez que los textiles se han tejido, una tela puede pasar a una etapa de desencolado. Esto puede ser seguido por una o mas etapas de procesamiento de tejido adicionales. El desencolado es el acto de eliminar el encolado de los textiles. Despues de tejer, el recubrimiento del encolado debe eliminarse antes de seguir procesando la tela para garantizar un resultado homogeneo y resistente al lavado. La divulgacion proporciona un metodo de determinacion del encolado que comprende hidrolisis enzimatica del encolado por la accion de una enzima de la divulgacion.

Las enzimas de la divulgacion se pueden usar para desencolar telas, incluyendo telas que contienen algodon, como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. La divulgacion proporciona metodos para producir un aspecto de lavado a la piedra en telas y prendas de mezclilla tenidas con anil. Para la fabricacion de ropa, la tela se puede cortar y coser en prendas de ropa o prendas, que luego se terminan. En particular, para la fabricacion de pantalones de mezclilla, se han desarrollado diferentes metodos de acabado enzimatico. El acabado de la prenda de mezclilla normalmente se inicia con una etapa de desencolado enzimatico, durante el cual las prendas se someten a la accion de enzimas amiloliticas para proporcionar suavidad al tejido y hacer que el algodon sea mas accesible a las etapas de acabado enzimatico posteriores. La divulgacion proporciona metodos para el acabado de prendas de mezclilla (por ejemplo, un "proceso de biolavado a la piedra"), el desencolado enzimatico y proporcionar suavidad a las telas utilizando las amilasas de la divulgacion. La divulgacion proporciona metodos para suavizar rapidamente las prendas de mezclilla en un proceso de desencolado y/o acabado.

Alimentos y procesamiento de alimentos: licuefaccion del almidon

Las enzimas de la divulgacion tienen numerosas aplicaciones en la industria de procesamiento de alimentos. Las amilasas de la divulgacion se usan en el procesamiento de almidon a fructosa. El procesamiento de almidon a fructosa puede consistir en cuatro etapas: licuefaccion del almidon granulado, sacarificacion del almidon licuado en dextrosa, purificacion e isomerizacion hasta fructosa.

La divulgacion proporciona metodos de licuefaccion de almidon utilizando las enzimas de la divulgacion. Las suspensiones concentradas de granulos de polimero de almidon se convierten en una solucion de dextrinas solubles de cadena mas corta de baja viscosidad. Esta etapa es util para un manejo conveniente con equipos estandar y para una conversion eficiente a glucosa u otros 103 azucares. En un aspecto, el almidon granulado se licua gelatinizando los granulos elevando la temperatura del almidon granulado a mas de aproximadamente 72°C. El proceso de calentamiento rompe instantaneamente los granulos de almidon insoluble para producir una solucion de almidon soluble en agua. La solucion de almidon solubilizada se puede licuar luego mediante una amilasa de la divulgacion. Por lo tanto, la divulgacion proporciona procesos de licuefaccion enzimatica de almidon utilizando una amilasa de la divulgacion.

La Figura 26, la Figura 27 y la Figura 28 ilustran ejemplos de procesos alternativos del almidon, incluyendo procesos de licuefaccion de almidon, de la divulgacion (utilizando al menos una enzima de la divulgacion). Por ejemplo, la Figura 26 ilustra un ejemplo de un proceso de licuefaccion de almidon de la divulgacion que comprende tratar una suspension de almidon (por ejemplo, que tiene aproximadamente 30% a 35% de solidos) con vapor para la licuefaccion primaria (por ejemplo, a aproximadamente 105°C durante aproximadamente 5 minutos), entrada en un tanque de evaporacion instantanea, seguido de licuefaccion secundaria (por ejemplo, a aproximadamente 90°C a 95°C durante aproximadamente 90 minutos), implicando cada una o una de estas etapas el uso de una enzima de la divulgacion. La Figura 27 ilustra otro ejemplo de proceso de licuefaccion de almidon de la divulgacion que comprende tratar una suspension de almidon a aproximadamente entre pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, ajustar el pH, adicion de calcio, licuefaccion a aproximadamente pH 5 a pH 6, por ejemplo, pH 5,4, a aproximadamente 95°C utilizando una alfa amilasa de la divulgacion, seguido de otro ajuste de pH y temperatura para la sacarificacion entre aproximadamente pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, a una temperatura de entre aproximadamente 60°C y 65°C utilizando una glucoamilasa de la divulgacion. La Figura 28 ilustra otro ejemplo de proceso de almidon de la divulgacion que comprende tratar una suspension de almidon a aproximadamente entre pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, (ajuste opcional de pH, adicion de calcio), licuefaccion-sacarificacion combinada utilizando una alfa amilasa y/o glucoamilasa de la divulgacion entre aproximadamente pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, a una temperatura superior a aproximadamente 90°C, o superior a aproximadamente 95°C, seguido de otro ajuste de pH y temperatura para la sacarificacion aproximadamente entre pH 4 a pH 5, por ejemplo, pH 4,5, a una temperatura de entre aproximadamente 60°C y 65°C usando una glucoamilasa de la divulgacion. En un aspecto, la licuefaccion-sacarificacion combinada de la divulgacion es un proceso en "un solo recipiente". En un aspecto, todo el proceso es un proceso en "un solo recipiente". Cualquiera de estos procesos, y cualquiera de estas etapas, tambien pueden comprender, o puede comprender adicionalmente, otra enzima de la divulgacion (por ejemplo, una glucosidasa tal como una a-1,6-glucosidasa, una maltasa, etc.), u otra enzima tal como una pululanasa o una isomerasa.

Un ejemplo de un proceso de licuefaccion enzimatica implica ajustar el pH de una suspension de almidon granulado entre 6,0 y 6,5 y la adicion de hidroxido de calcio, hidroxido de sodio o carbonato de sodio. En un aspecto, se anade hidroxido de calcio. Esto proporciona iones de calcio para estabilizar la glucoamilasa de la divulgacion contra la inactivacion. En un aspecto, tras la adicion de amilasa, la suspension se bombea a traves de un chorro de vapor para elevar instantaneamente la temperatura entre 80°C-115°C. En un aspecto, el almidon se gelatiniza inmediatamente y, debido a la presencia de amilasa, se despolimeriza mediante hidrolisis aleatoria de enlaces a-1,4-glicosidicos mediante amilasa hasta una masa fluida. La masa fluida puede ser facilmente bombeada.

La divulgacion proporciona diversos procesos de licuefaccion enzimatica de almidon utilizando una amilasa de la divulgacion. En un aspecto del proceso de licuefaccion de la divulgacion, se anade una amilasa a la suspension de almidon y la suspension se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 80°C-100°C para hidrolizar parcialmente los granulos de almidon. En un aspecto, la suspension de almidon parcialmente hidrolizada se bombea a traves de un chorro a temperaturas superiores a aproximadamente 105°C para gelatinizar completamente cualquier estructura granulada restante. En un aspecto, despues de enfriar el almidon gelatinizado, se realiza una segunda adicion de amilasa para hidrolizar aun mas el almidon.

La divulgacion proporciona enzimas y procesos para hidrolizar almidon liquido (licuado) y granulado. Dicho almidon puede derivarse de cualquier fuente, por ejemplo, maiz, trigo, millo, sorgo, centeno o bulgur. La divulgacion aplica a cualquier fuente de almidon en grano que sea util en licuefaccion, por ejemplo, cualquier otra fuente de grano o vegetal conocida por producir almidon adecuado para la licuefaccion. Los metodos de la divulgacion comprenden licuar almidon de cualquier material natural, tal como arroz, arroz germinado, maiz, cebada, millo, trigo, legumbres y batata. El proceso de licuefaccion puede hidrolizar sustancialmente el almidon para producir un jarabe. El intervalo de temperatura de la licuefaccion puede ser cualquier temperatura de licuefaccion que se sepa que es eficaz para licuar el almidon. Por ejemplo, la temperatura del almidon puede estar entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 115°C, entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 110°C, y desde aproximadamente 105°C hasta aproximadamente 108°C. En aspectos alternativos, la amilasa utilizada en estos metodos es activa a estas temperaturas, por ejemplo, activa a temperaturas en un intervalo de entre aproximadamente 80°C a aproximadamente 115°C, entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 110°C, y desde aproximadamente 105°C a aproximadamente 108°C.

La divulgacion proporciona metodos para la licuefaccion y sacarificacion como se ilustra en la Figura 17. En un aspecto, las alfa-amilasas de la divulgacion se usan en la etapa de licuefaccion ilustrada (algunos metodos industriales actuales usan a-amilasa de B. licheniformis). En un aspecto, el proceso se lleva a cabo a aproximadamente pH 6,0 a una temperatura en cualquier lugar dentro del intervalo de aproximadamente 95°C a 105°C, durante un periodo de tiempo entre aproximadamente 0,5 y 5 horas, por ejemplo, 60, 90 o 120 minutos. En un aspecto, en un proceso de remojo de maiz, antes de las celulasas de licuefaccion, se agregan proteasas y/o proteinas tiorreductasas.

En un aspecto de un proceso de licuefaccion de la divulgacion, se agrega una amilasa de la divulgacion que tiene actividad a aproximadamente pH 4,5 (o, en cualquier lugar entre aproximadamente pH 5 y pH 5), que puede o no ser dependiente de Ca2+. La eliminacion de la adicion de sales al comienzo del proceso elimina la necesidad de eliminarlas al final del proceso. En un aspecto de un proceso de licuefaccion de la divulgacion, se usa una amilasa que es mas activa. Esto puede permitir disminuir la cantidad de enzima necesaria. En un aspecto, la licuefaccion y la sacarificacion se realizan en el mismo recipiente, como un "proceso en un solo recipiente", por ejemplo, bajo condiciones que comprenden de aproximadamente 90°C a 95°C (o, en cualquier lugar, entre aproximadamente 80°C y 105°C), como un proceso de aproximadamente 3 horas (o, como un proceso que dura entre aproximadamente 1 y 5 horas). En este aspecto, la carga de enzima puede reducirse a la mitad nuevamente.

En un aspecto de un proceso de sacarificacion de la divulgacion, se usa una glucoamilasa de la divulgacion. En un aspecto, las glucoamilasas de la divulgacion se usan en la etapa de sacarificacion ilustrada (algunos metodos industriales actuales utilizan glucoamilasa de A. niger). En un aspecto, el proceso tiene lugar a aproximadamente pH 4,5, en un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 60°C a 62°C (o, en cualquier lugar dentro del intervalo de entre aproximadamente 50°C a 72°C, o, entre aproximadamente 40°C a 80°C) tal como un proceso que dura entre 12 y 96 horas o mas. En un aspecto de un proceso de sacarificacion de la divulgacion, se usa una glucoamilasa de la divulgacion para dar un mayor nivel de dextrosa en el jarabe. En un aspecto, se agregan otras enzimas, por ejemplo, pululanasas para aumentar la cantidad de glucosa.

En un aspecto, las amilasas de la divulgacion se usan en la etapa de isomerizacion ilustrada (algunos metodos industriales actuales usan glucosa isomerasa de Streptomyces sp.). En un aspecto, la reaccion de isomerizacion de la divulgacion tiene lugar en condiciones que comprenden en cualquier lugar entre aproximadamente pH 5 y pH 10, o en cualquier lugar entre aproximadamente pH 6 y pH 9, o en cualquier lugar entre aproximadamente pH 7,0 y 8,5. En un aspecto, la reaccion de isomerizacion de la divulgacion tiene lugar en condiciones que comprenden entre aproximadamente 40°C y 75°C, o entre aproximadamente 50°C y 65°C, o entre aproximadamente 55°C y 60°C.

En un aspecto de un proceso de isomerizacion de la divulgacion, se usa una xilosa isomerasa. En un aspecto, el cobalto se usa en la reaccion (algunas isomerasas de glucosa termoestables conocidas requieren cobalto). En un aspecto, se usa una enzima de la divulgacion que no depende, o tiene menos dependencia, del cobalto. En un aspecto, se usa una enzima de la divulgacion que tiene actividad a un pH mas bajo, por ejemplo, pH 7,0, pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5, pH 4, pH 3,5 o menos, o, por ejemplo, entre un intervalo de aproximadamente pH 3,5 a 7,0). En un aspecto, esto permite una menor formacion de color (de lo contrario, es posible que haya que eliminar el exceso de color). En un aspecto, se aumenta la temperatura durante la isomerizacion, por ejemplo, entre aproximadamente 80°C a 110°C, 85°C a 105°C, o 90°C a 100°C. Esto puede aumentar la cantidad de fructosa producida, por ejemplo, hasta aproximadamente el 51%. Sin embargo, en un aspecto, para las gaseosas (por ejemplo, refrescos y similares), el nivel de fructosa puede estar en cualquier lugar entre aproximadamente el 45% y el 65%, o el 50% y el 60%, por ejemplo, aproximadamente el 55%.

En un aspecto, una, algunas o todas las enzimas utilizadas en los procesos de la divulgacion (incluidas las enzimas de la invencion) estan inmovilizadas, por ejemplo, inmovilizadas en cualquier superficie, por ejemplo, una superficie plana o una columna de enzimas, por ejemplo, inmovilizadas en una matriz, una perla, fibra, poro, capilar y similares. En un aspecto, al estar inmovilizadas, pueden reutilizarse.

En un aspecto, la divulgacion proporciona "cocteles de enzimas" que utilizan al menos una enzima de la invencion. En un aspecto, se usan "cocteles de enzimas" en los procesos de la divulgacion, por ejemplo, que incluyen los metodos de licuefaccion y sacarificacion, como se ilustra en la Figura 17. Por ejemplo, en un aspecto, se utilizan las enzimas degradadoras de la pared celular (CWDE), por ejemplo, para textiles, pulpa y papel, y procesos de lavanderia de la divulgacion, que incluyen, por ejemplo, combinaciones de celulasas, hemicelulasas, xilanasa, galactomananasas, galactomananasas, arabinofuranosidasas, y otras. En un aspecto, los "cocteles de enzimas" utilizados en los procesos de la divulgacion para el blanqueo biologico (por ejemplo, procesos de pasta y papel, lavanderia) incluyen combinaciones de lacasas, peroxidasas, oxidasas y similares. En un aspecto, las enzimas que degradan la pared celular se combinan con enzimas de blanqueo biologico y enzimas de la divulgacion para degradar las paredes celulares de las plantas para liberar agentes de color.

Procesos para producir jarabes de dextrosa de alto PM

La divulgacion proporciona procesos para producir jarabes de dextrosa de alto PM utilizando las enzimas de la invencion, que incluyen metodos para producir oligosacaridos que tienen grupos de estrecho PM a aproximadamente 20.000 PM. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion de origen arqueal, incluidas las amilasas derivadas de arqueas de la SEQ ID NO: 80 (codificadas por la SEQ ID NO: 79), SEQ ID NO: 82 (codificadas por la SEQ ID NO: 81), SEQ ID NO: 116 (codificada por la SEQ ID NO: 115), SEQ ID NO: 323 (codificada por la SEQ ID NO: 322), SEQ ID NO: 570 (codificada por la SEQ ID NO: 169) y enzimas de la divulgacion que tienen la misma actividad de estas amilasas arqueales se usa para licuar una composicion que comprende almidon, por ejemplo, un almidon de maiz, para producir un patron de oligosacaridos que se agrupa a aproximadamente 20.000 PM (las amilasas de Bacillus produciran jarabes que contienen fragmentos de PM mucho mas altos y oligosacaridos de alto PM no son convertidos completamente en glucosa por las glucoamilasas, por ejemplo, glucoamilasas de Aspergillus, durante la sacarificacion).

Utilizando las amilasas de la divulgacion de origen arqueal para catalizar la hidrolisis de una composicion que comprende almidon, por ejemplo, un almidon de maiz, se producen los fragmentos de aproximadamente 20.000 PM. Estos fragmentos de aproximadamente 20.000 PM pueden convertirse rapida y completamente en glucosa. Por lo tanto, en un aspecto, los jarabes sacarificados resultantes de la licuefaccion de amilasa de Bacillus contienen menos dextrosa que los jarabes sacarificados de la licuefaccion utilizando amilasas de la divulgacion.

Procesos para producir maltodextrinas homogeneas

La divulgacion proporciona procesos para producir maltodextrinas homogeneas utilizando enzimas de la divulgacion. Las maltodextrinas homogeneas producidas por los metodos de la divulgacion se pueden usar en una amplia variedad de aplicaciones de alimentos, medicamentos y recubrimientos. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion de origen arqueal, incluyendo las amilasas arqueales de la SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, y las enzimas de la divulgacion que tienen la misma actividad que estas amilasas arqueales pueden generar una composicion de maltodextrina extremadamente uniforme (procesos de fabricacion convencionales que utilizan hidrolisis acida o enzimatica del almidon dan como resultado una distribucion de PM amplia, tipicamente bimodal de oligosacaridos). Las maltodextrinas homogeneas producidas por los metodos de la divulgacion tienen una distribucion de PM homogenea y pueden usarse en una variedad de productos que comprenden maltodextrina, lo que da como resultado soluciones claras de viscosidad mas baja (sin turbidez), mejores propiedades de recubrimiento, mejores propiedades de formacion de pelicula, y similares.

En un aspecto, las amilasas de la divulgacion de origen arqueal (y las enzimas de la divulgacion que tienen la misma actividad que estas amilasas arqueales) se usan para licuar almidon de maiz para producir una composicion uniforme que comprende maltodextrina. En un aspecto, la licuefaccion se realiza a un pH de entre aproximadamente pH 4,5 y aproximadamente pH 6,5, por ejemplo, pH 5,0 o 5,5, a temperaturas de hasta aproximadamente 105°C. La composicion de maltodextrina uniforme puede producirse a un DE que varia desde aproximadamente 5 hasta tan alta como aproximadamente 20. Los jarabes producidos por estas amilasas derivadas de la presente divulgacion pueden filtrarse, tratarse con carbon vegetal y/o secarse por atomizacion para producir el producto que comprende maltodextrina.

Procesos de molienda enzimatica en seco

La divulgacion proporciona procesos de molienda enzimatica en seco utilizando una amilasa de la divulgacion. En la molienda en seco, el grano entero se muele y se combina con agua. El germen se elimina opcionalmente mediante separacion por flotacion o tecnicas equivalentes. La mezcla resultante, que contiene almidon, fibra, proteina y otros componentes del grano, se licua con amilasa. En un aspecto, la licuefaccion enzimatica se realiza a temperaturas mas bajas que los procesos de licuacion de almidon discutidos anteriormente. En un aspecto, despues de la gelatinizacion, la solucion de almidon se mantiene a una temperatura elevada en presencia de amilasa hasta que se alcanza un DE de 10-20. En un aspecto, este es un periodo de aproximadamente 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es el estandar de la industria para medir la concentracion de azucares reductores totales, calculada como D-glucosa con base en el peso seco. El almidon granulado no hidrolizado tiene un DE de practicamente cero, mientras que el DE de D-glucosa se define como 100.

Procesos de molienda enzimatica humeda

La divulgacion proporciona procesos de molienda humeda, por ejemplo, molienda humeda de maiz, usando una enzima, por ejemplo, una amilasa, de la divulgacion. La molienda humeda de maiz es un proceso que produce aceite de maiz, harina de gluten, pienso de gluten y almidon. Por lo tanto, la divulgacion proporciona metodos para elaborar aceite de maiz, harina de gluten, pienso de gluten y almidon utilizando una enzima de la divulgacion. En un aspecto, se usa una amilasa alcalina de la divulgacion en la licuefaccion del almidon. En un aspecto, una glucoamilasa de la divulgacion se usa en la sacarificacion para producir glucosa. Un ejemplo de proceso de molienda humeda de maiz de la divulgacion (que utiliza al menos una enzima de la divulgacion) se ilustra en la Figura 25. La Figura 25 ilustra un ejemplo de proceso de aceite de maiz de la divulgacion que comprende remojo, despojado del germen, despojado de la fibra y la separacion del gluten, seguido de licuefaccion utilizando una enzima de la divulgacion (por ejemplo, una alfa amilasa), y sacarificacion utilizando una enzima de la divulgacion (por ejemplo, glucoamilasa).

En un aspecto, se somete el maiz (un grano que consiste en una cubierta de semilla externa (fibra), almidon, una combinacion de almidon y glucosa y el germen interno), a un proceso de cuatro etapas, que resulta en la produccion de almidon. En un aspecto, el maiz se remoja, se despoja del germen, se despoja de la fibra y se separa el gluten. En un proceso de remojo los solubles se eliminan. El producto restante despues de la eliminacion de los solubles se despoja del germen, dando como resultado la produccion de aceite de maiz y la produccion de una torta, que se agrega a los solubles de la etapa de remojo. El producto restante se descompone y los solidos de fibra se agregan a la mezcla de torta/solubles. Esta mezcla de solidos de fibra, torta y solubles forma un pienso de gluten. Despues del despojo de fibra, el producto restante se somete a separacion de gluten. Esta separacion da como resultado una harina de gluten y almidon. El almidon se somete luego a licuefaccion y sacarificacion utilizando polipeptidos de la divulgacion para producir glucosa.

La Figura 25 ilustra un ejemplo de proceso de molienda humeda de maiz de la divulgacion (utilizando al menos una enzima de la divulgacion). La Figura 26, la Figura 27 y la Figura 28 ilustran ejemplos de procesos alternativos de almidon, incluyendo procesos de licuefaccion de almidon, de la divulgacion (usando al menos una enzima de la divulgacion).

Procesos antienvejecimiento

La invencion proporciona procesos antienvejecimiento (por ejemplo, de productos horneados tales como pan) usando una amilasa de la divulgacion. La invencion proporciona metodos para ralentizar el aumento de la firmeza de la miga (del producto horneado) y una disminucion de la elasticidad de la miga utilizando una amilasa de la divulgacion. El envejecimiento de los productos horneados (como el pan) es mas serio a medida que el tiempo transcurre entre el momento de preparacion del producto de panaderia y el momento del consumo. El termino envejecimiento se usa para describir cambios no deseados para el consumidor en las propiedades del producto de panaderia despues de dejar el horno, como un aumento de la firmeza de la miga, una disminucion de la elasticidad de la miga y cambios en la corteza, que se vuelve resistente y correosa. La firmeza de la miga de pan aumenta aun mas durante el almacenamiento hasta un nivel, que se considera negativo. Las amilasas de la divulgacion se usan para retardar el envejecimiento del pan como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 6.197.352; 2.615.810 y 3.026.205; Silberstein (1964) Baker's Digest 38: 66-72.

En un aspecto, una enzima de la invencion se usa para retardar el envejecimiento de los productos horneados aunque no hidroliza el almidon en las dextrinas ramificadas. Las dextrinas ramificadas se forman por escision de las cadenas ramificadas de las dextrinas generadas por la hidrolisis de la a-amilasa que no puede degradarse mas por la a-amilasa. Esto puede producir una miga gomosa en el pan resultante. Por consiguiente, la invencion proporciona un proceso para retrasar el envejecimiento de productos horneados (por ejemplo, productos horneados con levadura) que comprende anadir una enzima de la invencion que comprende actividad exoamilasa a una harina o una masa usada para producir un producto horneado. Las exoamilasas de la divulgacion pueden tener glucoamilasa, p-amilasa (que libera maltosa en la configuracion beta) y/o actividad de amilasa maltogenica.

La divulgacion tambien proporciona un proceso para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de la masa que comprende anadir una amilasa de la divulgacion a la masa en una cantidad que sea eficaz para retardar el envejecimiento del pan. La divulgacion tambien proporciona una masa que comprende dicha amilasa y una premezcla que comprende harina junto con dicha amilasa. Finalmente, la divulgacion proporciona un aditivo enzimatico para hornear, que contiene dicha amilasa.

La divulgacion tambien proporciona un proceso de alto rendimiento para producir goma de fibra de maiz de alta calidad por tratamiento de la fibra de maiz con una enzima de la divulgacion seguida por tratamiento con peroxido de hidrogeno para obtener un extracto de fibra de maiz molida. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.147.206.

Piensos y aditivos para animales

La divulgacion proporciona metodos para tratar piensos y aditivos para animales usando enzimas amilasas de la divulgacion. La divulgacion proporciona piensos y aditivos para animales que comprenden amilasas de la divulgacion. En un aspecto, el tratamiento de piensos y aditivos para animales usando enzimas amilasas de la divulgacion puede ayudar en la disponibilidad del almidon en el pienso o aditivo para animales. Esto puede dar como resultado la liberacion de azucares facilmente digeribles y de facil absorcion.

El uso de una amilasa de la divulgacion puede aumentar la capacidad digestiva de los animales y las aves. El uso de una amilasa de la divulgacion puede garantizar la disponibilidad de un suministro adecuado de nutrientes para un mejor crecimiento y rendimiento. En un aspecto, las enzimas de la invencion pueden anadirse como aditivos para piensos para animales. En otro aspecto, el pienso para animales se puede tratar con amilasas antes del consumo por los animales. En otro aspecto, las amilasas pueden suministrarse expresando las enzimas directamente en cultivos de piensos transgenicos (como, por ejemplo, plantas transgenicas, semillas y similares), tal como el maiz. Como se discutio anteriormente, la divulgacion proporciona plantas transgenicas, partes de plantas y celulas vegetales que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion. En un aspecto, el acido nucleico se expresa de manera que la amilasa se produce en cantidades recuperables. La amilasa se puede recuperar de cualquier planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipeptido recombinante se puede usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, el sabor agradable y las propiedades reologicas, o para destruir un factor antinutricional.

Tratamiento de papel o pulpa

Las enzimas de la invencion se pueden usar en tratamiento de papel o de pulpa o destintado de papel. Por ejemplo, en un aspecto, la divulgacion proporciona un proceso de tratamiento del papel utilizando amilasas de la divulgacion. En un aspecto, las enzimas de la invencion se pueden usar para modificar el almidon en el papel, convirtiendolo asi en una forma licuada. En otro aspecto, componentes de papel de papel fotocopiado reciclado durante procesos de destintado quimicos y enzimaticos. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion se pueden usar en combinacion con celulasas. El papel se puede tratar mediante los siguientes tres procesos: 1) desintegracion en presencia de una enzima de la invencion, 2) desintegracion con un quimico desentintante y una enzima de la invencion, y/o 3) desintegracion despues de remojar con una enzima de la invencion. El papel reciclado tratado con amilasa puede tener un mayor brillo debido a la eliminacion de las particulas de toner en comparacion con el papel tratado con celulasa solamente. Si bien la divulgacion no esta limitada por ningun mecanismo particular, el efecto de una amilasa de la divulgacion puede deberse a su comportamiento como agentes tensioactivos en la suspension de pulpa.

La divulgacion proporciona metodos para tratar papel y pasta de papel usando uno o mas polipeptidos de la invencion. Los polipeptidos de la invencion se pueden usar en cualquier metodo de tratamiento de papel o pulpa, que son bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 6.241.849; 6,066,233; 5.582.681. Por ejemplo, en un aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para desentintar y decolorar un papel impreso que contiene un tinte, que comprende despulpar un papel impreso para obtener una suspension de pulpa, y desalojar una tinta de la suspension de pulpa en presencia de una enzima de la invencion (tambien se pueden anadir otras enzimas). En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para mejorar el refinado de la pulpa, por ejemplo, pulpa hecha de fibra secundaria, mediante la adicion de una mezcla enzimatica que comprende una enzima de la invencion (tambien puede incluir otras enzimas, por ejemplo, enzimas pectinasas) a la pulpa y el tratamiento en condiciones para provocar una reaccion para producir una pulpa tratada enzimaticamente. El refinado de la pulpa tratada enzimaticamente aumenta a partir del refinado inicial de la pulpa de fibra secundaria sin perdida de brillo.

Nuevo batido de la pulpa: tratamiento de materiales lignocelulosicos

La divulgacion tambien proporciona un metodo para el tratamiento de fibras lignocelulosicas, en el que las fibras se tratan con un polipeptido de la invencion, en una cantidad que es eficaz para mejorar las propiedades de las fibras. Las amilasas de la divulgacion tambien pueden usarse en la produccion de materiales lignocelulosicos tales como pulpa, papel y carton, a partir de papel de desecho reforzado con almidon y carton, especialmente cuando la eliminacion se produce a un pH superior a 7 y donde las amilasas pueden facilitar la desintegracion del material de desecho a traves de la degradacion del almidon reforzante. Las amilasas de la divulgacion pueden ser utiles en un proceso para producir una pasta para la fabricacion de papel a partir de papel impreso recubierto con almidon. El proceso se puede realizar como se describe en, por ejemplo, el documento WO 95/14807.

Un ejemplo de proceso comprende desintegrar el papel para producir una pulpa, tratar con una enzima que degrada el almidon antes, durante o despues de la desintegracion, y separar las particulas de tinta de la pulpa despues de la desintegracion y el tratamiento con enzimas. Vease tambien la patente de Estados Unidos No. 6.309.871 y otras patentes de Estados Unidos citadas en este documento. Por lo tanto, la divulgacion incluye un metodo para el destintado enzimatico de la pulpa de papel reciclada, en donde el polipeptido se aplica en una cantidad que es eficiente para el destintado efectivo de la superficie de la fibra.

Tratamiento de desechos

Las enzimas de la invencion se pueden usar en una variedad de otras aplicaciones industriales, por ejemplo, en el tratamiento de residuos. Por ejemplo, en un aspecto, la divulgacion proporciona un proceso de digestion de residuos solidos utilizando enzimas de la invencion. Los metodos pueden comprender reducir la masa y el volumen de desechos solidos sustancialmente no tratados. Los residuos solidos pueden tratarse con un proceso digestivo enzimatico en presencia de una solucion enzimatica (incluida una enzima de la invencion) a una temperatura controlada. Esto da como resultado una reaccion sin fermentacion bacteriana apreciable a partir de microorganismos anadidos. Los residuos solidos se convierten en residuos licuados y cualquier residuo solido residual. El residuo licuado resultante puede separarse de dicho residuo solido residual. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.709.796.

Productos de cuidado bucal

La divulgacion proporciona un producto para el cuidado oral que comprende una amilasa de la divulgacion. Los ejemplos de productos para el cuidado oral incluyen pastas dentales, cremas dentales, geles o polvos dentales, odonticos, enjuagues bucales, formulaciones de enjuague antes o despues del cepillado, gomas de mascar, pastillas o dulces. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.264.925.

Fabricacion de cerveza y fermentacion

La invencion proporciona metodos para elaborar cerveza (por ejemplo, fermentacion) que comprenden una amilasa de la divulgacion. En un ejemplo de proceso, las materias primas que contienen almidon se desintegran y procesan para formar una malta. Una amilasa de la divulgacion se utiliza en cualquier punto del proceso de fermentacion. Por ejemplo, las amilasas de la divulgacion se pueden usar en el procesamiento de malta de cebada. La principal materia prima de la elaboracion de cerveza es la malta de cebada. Esto puede ser un proceso de tres etapas. Primero, el grano de cebada se puede remojar para aumentar el contenido de agua, por ejemplo, hasta alrededor del 40%. En segundo lugar, el grano puede germinarse mediante incubacion a 15-25°C durante 3 a 6 dias cuando la sintesis de enzimas se estimula bajo el control de giberelinas. Durante este tiempo los niveles de amilasa aumentan significativamente. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion se agregan en esta etapa (o en cualquier otra) del proceso. La accion de la amilasa produce un aumento de los azucares reductores fermentables. Esto se puede expresar como la potencia diastatica, DP, que puede aumentar de aproximadamente 80 a 190 en 5 dias a 12°C.

Las amilasas de la divulgacion se pueden usar en cualquier proceso de produccion de cerveza, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.762.991; 5.536.650; 5.405.624; 5.021.246; 4.788.066.

Uso en pozos de perforacion y operaciones mineras

La divulgacion tambien incluye metodos que utilizan enzimas de la invencion en operaciones de pozos y perforacion, por ejemplo, gas, petroleo u otras operaciones de perforacion o mineria. Por ejemplo, en un aspecto, las enzimas de la invencion se usan para aumentar el flujo de fluidos de produccion desde una formacion subterranea, por ejemplo, un pozo o una mina. En un aspecto, las enzimas de la invencion se usan para eliminar fluidos viscosos que contienen almidon que pueden ser daninos, por ejemplo, fluidos formados durante las operaciones de produccion. Estos fluidos que contienen almidon se pueden encontrar dentro de una formacion subterranea que rodea un pozo completado. En un aspecto, el polipeptido de la invencion se usa en un fluido de perforacion de pozos de petroleo para ayudar a llevarse el lodo de perforacion.

En un aspecto, el metodo comprende permitir que los fluidos de produccion (que comprenden las enzimas de la invencion) fluyan del pozo o de una mina. Los metodos pueden comprender reducir el flujo de fluidos de produccion desde la formacion por debajo de los caudales esperados y formular un tratamiento enzimatico mezclando un fluido acuoso y un polipeptido de la invencion. Los metodos pueden comprender bombear el tratamiento enzimatico a una ubicacion deseada dentro del pozo u otro pozo perforado y permitir que el tratamiento enzimatico degrade el fluido viscoso nocivo, que contiene almidon. Los metodos pueden comprender eliminar el fluido de la formacion subterranea al pozo o la superficie del pozo. En un aspecto, el tratamiento enzimatico es eficaz para atacar los enlaces alfa glucosidicos en el fluido que contiene almidon. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion se utilizan en la perforacion de minas, la perforacion de pozos (por ejemplo, la perforacion de pozos de gas o petroleo) y similares para arrastrar el lodo de perforacion, por ejemplo, mientras se perfora el orificio (el agujero o chimenea del pozo).

Las enzimas de la invencion se pueden usar en cualquier operacion de perforacion de pozos, chimeneas o minas, muchas de las cuales son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la divulgacion proporciona metodos para introducir una enzima de la invencion, que en un aspecto tambien puede comprender un producto quimico de produccion de campos de petroleo o gas, en una formacion de roca que contiene petroleo y/o gas, que comprende pasar una microemulsion que comprende la enzima (y, en un aspecto, el compuesto quimico) hasta el pozo de produccion y luego dentro de la formacion. En un aspecto, un pozo de produccion se somete a un tratamiento "cerrado" mediante el cual una composicion acuosa que comprende una enzima de la invencion se inyecta en el pozo de produccion bajo presion y se "presiona" en la formacion y se mantiene alli. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 6.581.687.

En un aspecto, las amilasas de la divulgacion utilizadas en operaciones de perforacion o mineria de gas, petroleo o de otro tipo son activas a pH alto o bajo y/o temperaturas altas o bajas, por ejemplo, las amilasas de la divulgacion utilizadas en estos procesos son activas bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4, o inferior, o, en condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11 o superior. En un aspecto, las amilasas de la divulgacion utilizadas en estos procesos son activas en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 37°C, o, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C o mas, o, entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 120°C, por ejemplo, 85°C, 90°C, 95°C, 98°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C, 120°C o mas.

Composiciones de liberacion retardada

La divulgacion proporciona composiciones de liberacion retardada o "liberacion controlada" que comprenden una composicion deseada revestida con un polimero de latex, por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente. Las composiciones de liberacion retardada/controlada de la divulgacion pueden comprender cualquier composicion deseada, incluyendo enzimas o cualquier ingrediente activo, incluyendo moleculas pequenas, farmacos, polisacaridos, lipidos, acidos nucleicos, vitaminas, antibioticos, insecticidas y similares. En un aspecto, el recubrimiento no se disolvera facilmente a una temperatura relativamente baja, pero se descompondra para liberar la composicion deseada (por ejemplo, enzima) a una temperatura relativamente mas alta.

La divulgacion proporciona metodos para la liberacion retardada/liberacion controlada de composiciones en las que la composicion esta recubierta por un polimero de latex, por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente.

Las composiciones de liberacion retardada/liberacion controlada y los metodos de la divulgacion se pueden usar para una variedad de aplicaciones medicas e industriales, por ejemplo, en un aspecto, las composiciones enzimaticas de liberacion retardada/liberacion controlada de la divulgacion comprenden enzimas involucradas en fluidos de fracturamiento de guar en operaciones mejoradas de recuperacion de petroleo. La aplicacion degradante de guar del campo petrolero de la divulgacion se ve facilitada por un recubrimiento que no se disolvera facilmente a baja temperatura pero se descompondra para liberar la enzima a temperaturas mas altas.

En otro aspecto, las composiciones enzimaticas de liberacion retardada/liberacion controlada de la divulgacion comprenden piensos para animales o suplementos nutricionales que comprenden, por ejemplo, enzimas, vitaminas, antibioticos y/u otros alimentos, farmacos o suplementos nutricionales. Estos compuestos activos en los piensos para animales o suplementos nutricionales estan protegidos de las condiciones de granulacion o digestion gastrica por el recubrimiento en una composicion de liberacion retardada/controlada de la divulgacion.

En un aspecto, la liberacion es una liberacion activada por temperatura, por ejemplo, la composicion deseada (por ejemplo, enzima) se libera a una temperatura elevada, por ejemplo, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C o mas, por ejemplo, 85°C, 90°C, 95°C, 98°C, 100°C o mas. La velocidad de liberacion se puede controlar mediante el espesor o la cantidad de "barrera" o polimero de latex, aplicada a la composicion deseada, por ejemplo, un granulo o matriz que comprende la composicion deseada. Por lo tanto, la divulgacion proporciona granulos o matrices que tienen un intervalo de espesores de polimero de latex o equivalente y metodos para su uso.

La divulgacion proporciona composiciones enzimaticas de liberacion retardada/liberacion controlada, por ejemplo, en un aspecto, que comprenden una enzima de la invencion. En un aspecto, la divulgacion proporciona una enzima (por ejemplo, una enzima de la invencion), o una composicion granulada que comprende una enzima (por ejemplo, una enzima de la invencion), recubierta con un polimero de latex, por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente. En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para elaborar composiciones enzimaticas de liberacion retardada que comprenden recubrir una enzima (por ejemplo, una enzima de la invencion), o una composicion granulada que comprende una enzima (por ejemplo, una enzima de la invencion), con un polimero de latex. Por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente. En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para elaborar composiciones de liberacion retardada/liberacion controlada que comprenden recubrir un compuesto deseado con un polimero de latex, por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente.

Los polimeros de latex que se usan en las composiciones de liberacion retardada/liberacion controlada (por ejemplo, composiciones enzimaticas de liberacion retardada/liberacion controlada) y los metodos de la divulgacion incluyen, pero no se limitan a, varios tipos tales como los siguientes: acrilicos; alquidos; celulosas; cumarona-indenos; epoxicas; esteres; hidrocarburos; maleicas; melaminas; resinas naturales; oleo resinas; fenolicas; poliamidas; poliesteres; colofonias; siliconas; estirenos; terpenos; ureas; uretanos; vinilos; y similares. Los polimeros de latex que se utilizan en las composiciones de liberacion retardada y los metodos de la divulgacion tambien incluyen, pero no se limitan a, uno o mas homo o copolimeros que contienen uno o mas de los siguientes monomeros: (met)acrilatos; acetato de vinilo; estireno; etileno; cloruro de vinilo; butadieno; cloruro de vinilideno; versatato de vinilo; propionato de vinilo; acrilato de t-butilo; acrilonitrilo; neopreno; maleatos; fumaratos y similares, incluidos los derivados plastificados u otros derivados de los mismos.

La cantidad de polimero de latex utilizada en la composicion de latex de la divulgacion no es critica, pero puede ser cualquier cantidad siguiendo procedimientos bien establecidos que usan polimeros de latex. En aspectos alternativos, la cantidad de polimero de latex seco es al menos aproximadamente 1, o, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50, o, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 por ciento en peso de la composicion total de latex. La composicion de latex de la divulgacion puede contener opcionalmente otros componentes tales como los utilizados generalmente en composiciones de latex. Estos componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: disolventes tales como hidrocarburos alifaticos o aromaticos, alcoholes, esteres, cetonas, glicoles, eteres de glicol, nitroparafinas o similares; pigmentos; rellenos, secadores; agentes aplanadores; plastificantes; estabilizadores dispersantes; tensioactivos; viscosificantes que incluyen espesantes asociativos polimericos, espesantes a base de polisacaridos y otros; agentes de suspension; agentes de control de flujo; antiespumantes; agentes antirrevestimiento; conservantes; extensores; auxiliares de formacion de pelicula; entrelazadores; mejoradores de superficie; inhibidores de corrosion; y otros ingredientes utiles en composiciones de latex. En un aspecto, las composiciones de latex de la divulgacion que tienen una reologia y estabilidad mejoradas se proporcionan combinando el polimero de latex y un polisacarido con agua siguiendo procedimientos establecidos. Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 6.372.901; 5.610.225.

En un aspecto, al elaborar una composicion granulada o que comprende una matriz de la divulgacion que comprende una composicion activa, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, una enzima de la divulgacion), recubierta con un polimero de latex, por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente, la composicion activa (por ejemplo, enzima) esta incrustada en el cuerpo del granulo (en un aspecto, la mayoria o la totalidad de la composicion activa (por ejemplo, la enzima) esta incrustada en el granulo. Por lo tanto, se pueden usar sustancias quimicas agresivas, por ejemplo, el recubrimiento de latex, que puede ser un inactivador del ingrediente activo deseado, para recubrir la superficie del granulo o la matriz. La composicion del recubrimiento se puede descomponer mediante agentes tales como calor, acido, base, presion, enzimas, otros productos quimicos y similares, para tener una liberacion controlada de la actividad enzimatica deseada activada por la exposicion al agente degradante del recubrimiento.

En un aspecto, una composicion activa, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, una enzima de la divulgacion, u otra enzima, por ejemplo, una mananasa), se dispersa en harina de germen de maiz y/o una matriz de almidon de maiz (por ejemplo, como un granulo). Esta mezcla (por ejemplo, granulo) se desintegra en diez minutos a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 22°C) para liberar toda la composicion activa (100%), por ejemplo, libera toda la actividad enzimatica. A temperaturas mas altas, la velocidad de liberacion aumenta. Esta no es una tasa aceptable de desintegracion para muchos usos.

Sin embargo, como una composicion de liberacion retardada/controlada de la divulgacion, es decir, cuando esta mezcla se recubre con un polimero de latex, por ejemplo, una pintura de latex, o equivalente, la desintegracion de la mezcla (por ejemplo, granulos, matriz) se retrasa. La velocidad y el grado de liberacion se pueden controlar por el espesor del recubrimiento (barrera) aplicado al granulo o matriz. Por ejemplo, una particula recubierta liberara solo el 30% de la actividad despues de seis horas en agua a 22°C. A 60°C, el 50% de la enzima se libera en 90 minutos. A 80°C, el 80% de la enzima se libera durante una hora.

La invencion se describira adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que la invencion no esta limitada a tales ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificacion y caracterizacion de a-amilasas termoestables

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de un metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la divulgacion. Este ejemplo describe la identificacion de nuevas amilasas acidas. El programa de seleccion se llevo a cabo en condiciones de pH neutro y bajo. Las bibliotecas de ADN generadas a partir de muestras de pH bajo fueron seleccionadas para su descubrimiento. Este esfuerzo permitio el descubrimiento de cientos de clones que tienen la capacidad de degradar el almidon. La secuencia de ADN y los analisis bioinformaticos clasificaron muchos de estos genes como amilasas previamente no identificadas.

Estudios bioquimicos

El analisis bioquimico de los clones genomicos de amilasa mostro que muchos tenian un pH optimo inferior a 6. Los lisados de estos clones genomicos se probaron para determinar la tolerancia termica mediante incubacion a 70°C, 80°C, 90°C o 100°C durante 10 minutos y medicion de la actividad residual a pH 4,5. Los clones que conservan una actividad > 50% despues del tratamiento termico a 80°C se seleccionaron para un analisis adicional. Estos clones se incubaron a 90°C durante 10 minutos a pH 6,0 y 4,5 y se probaron para determinar la actividad residual a pH 4,5 (Figura 5). Varios clones conservaron > 40% de su actividad despues de este tratamiento. Para fines comparativos, la actividad residual de una enzima de la divulgacion (una amilasa "evolucionada"), SEQ ID NO: 437 (codificada por la SEQ ID NO: 436), fue equivalente a la mejor de las enzimas de segunda generacion; la actividad especifica de la SEQ ID NO: 437 fue mayor.

La actividad termica de los clones con actividad residual despues del tratamiento termico a 90°C a pH 4,5 se midio a temperatura ambiente, 70°C y 90°C a pH 4,5. La Tabla 1 muestra que las tasas de hidrolisis de la SEQ ID NO: 87 (amilasa de B. stearothermophilus) y la SEQ ID NO. 113 (amilasa de B. licheniformis) disminuyen a temperaturas mas altas, mientras que la tasa de SEQ ID NO: 125 continua aumentando a medida que la temperatura se eleva a 70°C y solo se reduce alrededor del 50% a 90°C.

El ejemplo de polipeptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 437 (codificada por la SEQ ID NO: 436) es termoestable, reteniendo una actividad del 50% despues de 25 minutos a 100°C en ausencia de calcio agregado, a pH 4,5. Este ejemplo de polipeptido retuvo una actividad del 90% despues de 60 minutos a 100°C en presencia de 40 mg/L de calcio, pH 4,5. El perfil de actividad del polipeptido de la SEQ ID NO: 437 esta en el intervalo de entre aproximadamente 4,8 y 5,0. No se requiere calcio agregado para la actividad.

El polipeptido de la SEQ ID NO: 437 puede tener un liquido de color marron claro a amarillo con un peso especifico de 1,1, a pH 10, cuando se formula con un 35% de glicerol. Su actividad de alfa amilasa esta entre aproximadamente 110 y 115 IAU*/gramo (*IAU = unidad de actividad INNOVASEMR). Un metodo analitico utilizado comprendio la hidrolisis del 4-nitrofenil-alfa-D-hexa-glucopiranosido (este mismo metodo se puede usar para determinar si una enzima esta dentro del alcance de la divulgacion).

Evaluacion de candidatos

Segun la actividad residual a pH 4,5 despues de un tratamiento termico a 90°C, la actividad especifica y la velocidad de hidrolisis del almidon a 90°C en comparacion con la amilasa de B. licheniformis, SEQ ID NO: 125 se compara con la enzima (una amilasa "evolucionada") de la SEQ ID NO: 437 en un ensayo de licuefaccion de almidon.

La tabla 1 muestra las tasas de hidrolisis de almidon marcado con colorante (unidades de fluorescencia relativa/s) de tres clones genomicos a pH 4,5 y 3 temperaturas diferentes. 1Amilasa de B. stearothermophilus, 2Amilasa de B. licheniformis.

La siguiente tabla es un resumen de la Actividad Relativa Media (ARA), la Tolerancia Termica, la Estabilidad Termica, la Actividad Especifica y la Expresion (Unidades/L) para ejemplos de enzimas seleccionadas de la divulgacion (por ejemplo, SEQ ID NOS: 125, 126, se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 126, codificada por la SEQ ID NO: 125, etc.):

A.R.A. es la actividad relativa media. ARA. se calcula como la actividad relativa media de una amilasa entre pH 4 y pH 7,5.

# Las unidades aproximadas por litro de expresion se calculan de la siguiente manera: (unidades totales de amilasa presentes en el polvo liofilizado recuperado) (volumen de cultivo en el fermentador)

Evaluacion de la amilasa de la SEQ ID NO: 437

La amilasa de la SEQ ID NO: 437 (codificada por la SEQ ID NO: 436) se evaluo en diversas condiciones. En los siguientes protocolos, se uso mafz Yellow dent No. 2 como fuente de almidon.

Licuefaccion

Una suspension de almidon que contenfa 35% de solidos secos ("DS") se sometio a licuefaccion primaria durante cinco minutos a diversas temperaturas en el intervalo de 95°C a 119°C (por ejemplo, a aproximadamente 110°C), con una concentracion enzimatica de entre 0,2 a 0,8 gramos/kilogramo (g/kg) de almidon DS, con calcio agregado en el intervalo de entre cero y 30 partes por millon (ppm), a pH 4,0 a pH 5,6. La licuefaccion secundaria comprendfa condiciones de 120 minutos a 95°C.

Sacarificacion

La sacarificacion se probo inicialmente utilizando 35% de solidos secos ("DS") (suspension de almidon) y glucoamilasa AMG 300L (Novozymes A/S, Dinamarca) a razon de 0,225 de AGU/gramo DS (AGU = unidades de amiloglucosidasa, o glucoamilasa), pH 4.3, a 60°C durante 44 horas.

Se demostro que la amilasa de la SEQ ID NO: 437 era util en las condiciones de pH descritas anteriormente, era independiente del calcio y tenfa una alta estabilidad termica. En un aspecto, la amilasa de la SEQ ID NO: 437, u otra amilasa de la divulgacion, se usa en un intervalo de dosificacion entre 0,5 y 0,7 kg/MT DS de almidon.

La divulgacion proporciona metodos para elaborar edulcorantes nutritivos usando enzimas de la invencion, por ejemplo, procesos que comprenden los protocolos de licuefaccion y sacarificacion descritos anteriormente usando, por ejemplo, amilasa de la SEQ ID NO: 437, u otra enzima de la divulgacion. En un aspecto, el intervalo de dosificacion para una enzima de la invencion en estos procesos esta entre aproximadamente 0,5 a 0,7 gramos por kg de almidon DS, una temperatura de chorro (por ejemplo, utilizando una cocina a chorro) de aproximadamente 110°C, pH 4,5, sin adicion calcio.

Produccion de etanol en molino seco

La divulgacion proporciona metodos para la produccion de etanol en molino seco utilizando enzimas de la divulgacion, por ejemplo, amilasa de la SEQ ID NO: 437, u otra enzima de la divulgacion.

En la evaluacion de enzimas de la divulgacion para uso en la produccion de etanol en molino seco, particularmente en la licuefaccion de harina de mafz de molino seco, se uso un reactor a escala de laboratorio con harina de mafz procedente de un molino seco comercial. Se uso amilasa TERMAMYLmr SC (Novozymes A/S, Dinamarca) como un punto de referencia competitivo. La prueba encontro que las condiciones optimas eran 85°C, pH 5,7. Se estudiaron cinco variables independientes: temperatura (en un intervalo de entre 80°C a 100°C), dosis de enzima entre 0,2 a 1,0 g/kg de almidon, pH 4,4 a 6,0, calcio en un intervalo de 0 ppm a 200 ppm, y una contracorriente reciclada entre aproximadamente 0% y 40%.

A 95°C la amilasa de la SEQ ID NO: 437 reduce la viscosidad de la harina de mafz de molino seco mas rapidamente que la amilasa TERMAMYLmR SC (Novozymes A/S, Dinamarca) en sus condiciones optimas, incluso a 85°C. La tasa de reduccion de la viscosidad por la amilasa de la SEQ ID NO: 437 estuvo mas influenciada por la dosis de enzima y la temperatura. Se encontro que el intervalo optimo estaba en el intervalo de 0,4 a 0,6 g/kg de almidon, con una temperatura optima a 95°C. La amilasa de la SEQ ID NO: 437, fue efectiva a un pH mas bajo y una temperatura mas alta que la amilasa TERMAMYLmR SC (Novozymes A/S, Dinamarca) a un pH en el intervalo entre pH 4,4 y pH 5,6. La adicion de calcio tuvo un efecto mmimo sobre la tasa de reduccion de la viscosidad a 95°C. La amilasa de la SEQ ID NO: 437, fue efectiva en presencia de una contracorriente reciclada al 30% (por ejemplo, sedimento fino, lavado gastado = reciclaje de subproductos nuevamente a la licuefaccion). La Figura 29 muestra datos que resumen estos hallazgos que comparan la amilasa de la SEQ ID NO: 437 con la amilasa TERMAMYLmR SC (Novozymes A/S, Dinamarca) en el procesamiento de etanol en molino seco.

En aspectos alternativos, el uso de la amilasa de la SEQ ID NO: 437 en los procesos de etanol en molinos secos puede proporcionar ventajas operativas, por ejemplo: reduccion rapida de la viscosidad de la harina de mafz en suspension, lo que hace posible un aumento de solidos disueltos y un rendimiento sin una inversion de capital adicional; estabilidad termica superior al mejor competidor, lo que elimina la dosificacion dividida (la amilasa de la SEQ ID NO: 437 es una enzima termoestable y elimina la necesidad de dosificar antes y despues de la coccion a chorro), se obtienen viscosidades mas bajas a temperaturas de proceso mas altas y proporciona un mejor control microbiano en el tanque de lodos (el proceso se realiza a una temperatura mas alta, por lo que se eliminan los microbios no deseados); un pH mas bajo de licuefaccion, que elimina la necesidad de ajustar el pH, disminuye la formacion de incrustaciones (el precipitado de oxalato de calcio se forma en el equipo, etc.; si la licuefaccion se realiza a un pH bajo, existe un mayor potencial de formacion de incrustaciones) y reduce la formacion de subproductos.

En resumen, la amilasa de la SEQ ID NO: 437, es una enzima termoestable que puede satisfacer las necesidades clave de la industria, por ejemplo, bajo ciertas condiciones, reduce rapidamente la viscosidad de la suspension de harina de mafz con alto contenido de solidos secos, puede ser termoestable (temperatura optima 95°C), pueden ser independientes del calcio, pueden ser activos con un pH optimo bajo y puede tolerar hasta un 30% de contracorriente reciclada. En un aspecto, la dosis recomendada esta en el intervalo de entre aproximadamente 0,4 y 0,6 kg/MT de almidon.

Ejemplo 2: Amilasas termoestables activas a pH alcalino

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la divulgacion, por ejemplo, es una amilasa termoestable.

El enfoque inicial de este ejemplo fue la evaluacion de un panel existente de amilasas en una formulacion comercial de lavado de platos automatico (ADW). Este esfuerzo identifico dos candidatos: uno con actividad a pH alto (SEQ ID NO: 115) y otro con estabilidad en la formulacion de ADW (SEQ ID NO: 207). Los estudios tambien incluyeron la identificacion de amilasas de pH alto. Este esfuerzo permitio el descubrimiento de cientos de clones que tienen la capacidad de degradar el almidon. La secuencia de ADN y los analisis bioinformaticos clasificaron muchos de estos genes como amilasas no identificadas previamente. Los marcos de lectura abiertos restantes fueron neopululanasas, amilopululanasas y amilomaltasas. Los amplios estudios bioquimicos y de aplicaciones demostraron que 3 candidatos: el clon B, la SEQ ID NO:147 y la s Eq ID NO: 139) tienen una actividad especifica alta a pH 10, pero desafortunadamente carecen de estabilidad en la formulacion de ADW. En resumen, se identifico un panel de nuevas amilasas que tienen fenotipos deseables para la aplicacion de ADW.

Estudios bioquimicos

El analisis bioquimico de los clones genomicos de amilasa mostro que muchos de ellos hidrolizaron el almidon a pH 10 y 50°C. Para producir cantidades suficientes de enzima para pruebas bioquimicas y de aplicaciones adicionales, los marcos de lectura abiertos de amilasa de los 40 clones genomicos mas activos se subclonaron en vectores de expresion. Este esfuerzo incluyo la creacion de 2 constructos para aquellos clones que contienen una secuencia senal putativa y el establecimiento de las condiciones de crecimiento e induccion para cada subclon (mas y menos el peptido senal de amilasa).

La proteina activa soluble se purifico exitosamente hasta homogeneidad de 34 subclones y se midio la actividad especifica (unidades/mg, donde 1 unidad = gmol de azucares reductores/min) a pH 8 y pH 10 (40°C y 50°C) utilizando 2% de almidon en regulador. La amilasa de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 113) se eligio como punto de referencia para estos estudios. La actividad especifica se determino mediante la eliminacion de muestras en varios puntos de tiempo durante una reaccion de 30 minutos y el analisis de la reduccion de azucares. La tasa inicial se determino ajustando las curvas de progreso a una ecuacion lineal. Una comparacion de los mejores candidatos se muestra en la Tabla 2.

Un estudio para determinar la dependencia de la velocidad de hidrolisis con el pH mostro que solo el clon B es una "amilasa alcalina" con un pH optimo de aproximadamente 8; todos los demas tenian un pH optimo de 7 o menos. Sin embargo, esta claro que el panel de aciertos incluyo varias amilasas principales con actividad apreciable a pH 10 y 50°C.

Tabla 2. Actividades especificas (U/mg de enzima pura) de amilasas

Estabilidad

La estabilidad en presencia de la formulacion de ADW se midio para cada uno de los 3 candidatos principales identificados mediante analisis bioquimico. La referencia para estos estudios fue una enzima comercial en la matriz de formulacion. La Figura 13 ilustra la actividad residual (medida a pH 8 y 50°C) despues de una incubacion de 30 minutos a 50°C en presencia de varios componentes de la formulacion de ADW; pH 8, pH 10,8, solucion de ADW (con blanqueador) y solucion de ADW (sin blanqueador). La actividad medida despues de la incubacion se expresa como un porcentaje de la actividad original. Los datos muestran que el clon B era muy sensible a las altas temperaturas, mientras que las otras amilasas estaban menos afectadas. Cuando las enzimas se incubaron a pH y temperatura altos, la enzima comercial de la SEQ ID NO: 139 se volvio menos estable; sin embargo, la SEQ ID NO: 127 mantuvo la actividad completa. El comportamiento aparentemente anomalo de la SEQ ID NO: 127 despues de una incubacion de pH 10 frente a pH 8 se observo en ensayos repetidos.

Cuando se mide la actividad de la amilasa sobre el almidon marcado con colorante en la matriz de ADW a 50°C, la amilasa comercial exhibe aproximadamente el 5% de su actividad a pH 8. En el mismo ensayo, clon B, la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 127 exhiben < 2% de su actividad original medida a pH 8.

Pruebas de lavado

Se llevaron a cabo pruebas de lavado con portaobjetos recubiertos con almidon para evaluar el rendimiento de cada una de las enzimas purificadas en comparacion con la amilasa comercial. Los portaobjetos recubiertos de almidon de espagueti se prepararon de acuerdo con el protocolo. Dos portaobjetos recubiertos con almidon previamente pesados se colocaron espalda con espalda en un tubo conico de 50 mL y se agregaron 25 mL de solucion de ADW, /- enzima por tubo. Los tubos se incubaron durante 20 minutos a 50°C con rotacion suave en un carrusel vertical. Despues del periodo de incubacion, los portaobjetos se enjuagaron inmediatamente en agua y se secaron en horno durante la noche. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y la enzima comercial se uso como un control positivo. Los resultados (Figura 6) de estos experimentos se expresan como % neto de almidon eliminado, por ejemplo, % de almidon eliminado en ADW con enzima, menos el % de almidon eliminado en ADW solo.

Ejemplo 3: Optimizacion de genes

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de un metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la divulgacion, por ejemplo, evaluar el rendimiento de la enzima en presencia del rendimiento de ADW.

Las propiedades de las enzimas pueden mejorarse mediante diversas estrategias de evolucion, incluidas GeneSiteSaturationMutagenesis (GSSm mr) y GeneReassemblyMR (Diversa Corporation, San Diego, CA). Dichas tecnicas se aplicaran a los acidos nucleicos de amilasa de la divulgacion con el fin de generar conjuntos de variantes que se pueden analizar para mejorar el rendimiento. En un aspecto, las moleculas parentales para la evolucion incluyen cualquier acido nucleico de la divulgacion, por ejemplo, son uno o todos los siguientes: SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 127 (una forma truncada de la SEQ ID NO: 127).

Se ha desarrollado un cribado de alto rendimiento para evaluar el rendimiento de la enzima en presencia del rendimiento de ADW. El desarrollo de un HTS es de suma importancia en cualquier programa de evolucion. El HTS es automatico y ha mostrado resultados consistentes para las amilasas parentales (Figura 7). Las amilasas parentales tienen actividad medible en la formulacion de ADW, sin embargo, muy reducida en relacion con la actividad a pH 8.

Ejemplo 4: Caracterizacion de a-amilasas que tienen actividad a pH alcalino

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la divulgacion, por ejemplo, tiene actividad alfa-amilasa a pH alcalino.

Las amilasas de la divulgacion que tienen actividad a pH alcalino se caracterizaron adicionalmente. Se han realizado cineticas en almidon al 2% a pH 8 y 10 (40°C y 50°C).

Tabla 4:

Ejemplo 5: Ensayo de actividad de amilasa: Ensayo de extremos reductores de BCA

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la divulgacion, por ejemplo, mediante un ensayo de extremos reductores de BCA. La actividad de la amilasa de los clones de interes se determino utilizando la siguiente metodologia.

1. Preparar 2 soluciones de sustrato, de la siguiente manera:

a) 2% de solucion de almidon soluble (patata) pH 8 disolviendo 2 g de almidon de patata en 100 mL de fosfato de sodio 100 mM pH 8).

b) 2% de solucion de almidon soluble (patata) de pH 10 disolviendo 2 g de almidon de patata en 100 mL de carbonato de sodio 100 mM.

Calentar ambas soluciones en un bano de agua hirviendo, mientras se mezcla, durante 30-40 minutos hasta que el almidon se disuelva.

2. Preparar la Solucion A a partir de 64 mg/mL de carbonato de sodio monohidrato, 24 mg/mL de bicarbonato de sodio y 1,95 mg/mL de BCA (sal disodica de 4,4'-dicarboxi-2,2'-biquinolina (Sigma Chemical cat. # D-8284)). Anadido sobre dH2O.

3. Preparar la solucion B combinando 1,24 mg/mL de sulfato cuprico pentahidratado y 1,26 mg/mL de L-serina. Anadir la mezcla a dH2O.

4. Preparar un reactivo de trabajo en una relacion 1:1 de soluciones A y B.

5. Preparar una solucion estandar de maltosa de maltosa 10 mM en dH2O, donde la maltosa 10 mM se combina en almidon soluble al 2% al pH deseado hasta una concentracion final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 pM. La curva estandar se generara para cada conjunto de puntos de tiempo. Dado que la curva se determina agregando 10 pL de los estandares al reactivo de trabajo, se resuelve en 0, 1, 2, 3, 4, 6 nmoles de maltosa.

6. Colocar alicuota de 1 mL de solucion de sustrato en tubos de microcentrifuga, equilibrar a la temperatura deseada (5 min) en un bloque de calentamiento o en un bano de agua caliente. Anadir 50 pL de solucion de la enzima en el interior de la tapa del tubo.

7. Mientras la solucion se equilibra, mezclar 5 mL de ambas soluciones A y B. Colocar alicuota de 100 pL en una placa de PCR de 96 pozos. Colocar la placa sobre hielo.

8. Despues de 5 minutos de equilibrio de temperatura, cerrar la tapa de los tubos, invertir y agitar en vortice 3 veces. Inmediatamente colocar alicuotas de 10 pL en la placa como t = 0 (punto de tiempo cero). Dejar la mezcla de enzimas en el bloque de calentamiento y colocar alicuotas de 10 pL en cada punto de tiempo deseado (por ejemplo, 0, 5, 10, 15, 20, 30 minutos).

9. Asegurarse de que los 12 pozos queden vacios (solo reactivos de trabajo con alicuota) para la adicion de 10 pL de estandares, para la curva estandar.

10. Cuando se hayan recopilado todos los puntos de tiempo y se hayan agregado los estandares, cubrir la placa y calentar a 80°C durante 35 min. Enfriar la placa sobre hielo durante 10 min. Anadir 100 pL de H2O a todos los pozos. Mezclar y colocar alicuota de 100 pL en una placa de 96 pozos de fondo plano y leer la absorbancia a 560 nm.

11. Poner en cero los puntos de tiempo de cada muestra contra su propio t = 0 (restar el valor promedio de t = 0 A560 de otros valores promedio de A560). Convertir la A560 (experimental) en pmoles (Dividir A560 (experimental) por la pendiente de la curva estandar (A560/pmoles). Generar una pendiente de los puntos de tiempo y los pmoles (en pmoles/min), multiplicar por 100 (ya que el valor de pmoles solo representa los 10 pL utilizados en el ensayo, no la cantidad obtenida en la reaccion de 1 mL). Para obtener la actividad especifica, dividir la pendiente (en pmoles/min) por los mg de proteina. Todos los puntos deben realizarse como minimo por duplicado siendo mejor 3. Se muestra un ejemplo de curva estandar en la Figura 11.

Tabla 5: Datos de muestra:

Ejemplo 6: Seleccion de la actividad de a-amilasa

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de un metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la divulgacion. La actividad de amilasa de los clones puede evaluarse mediante una serie de metodos conocidos en la tecnica. La siguiente es la metodologia general que se utilizo en la presente invencion. El numero de placas cribadas, por placa, debe ser de aproximadamente 10.000 pfu. Para cada biblioteca de ADN: se deben seleccionar al menos 50.000 placas por biblioteca aislada y 200.000 placas por biblioteca no aislada, dependiendo el titulo de pfu para el lisado amplificado A Zap Express.

Determinacion del titulo de la biblioteca lambda

1) pL del patron de la biblioteca amplificada de Lambda Zap Express agregados a 600 pL de celulas MRF' de E. Coli (OD600 = 1,0). Para diluir el patron de MRF, se utiliza MgSO410 mM.

2) Incubar a 37°C durante 15 minutos.

3) Transferir la suspension a 5-6 mL de agar de superficie NZY a 50°C y mezclar suavemente.

4) Verter inmediatamente la solucion de agar en una placa de medio NZY grande (150 mm).

5) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la placa.

6) Incubar la placa a 39°C durante 8-12 horas.

7) El numero de placas es aproximado. Se determino los titulos de fago para obtener 10.000 pfu/placa. Diluir una parte alicuota de fago de biblioteca con regulador SM si es necesario.

Cribado del sustrato

1) Lambda Zap Express (50.000 pfu) de la biblioteca amplificada agregada a 600 pL de celulas MRF' de E. Coli(OD600 = 1,0). Para bibliotecas que no sean para el medio ambiente, preparar 4 tubos (50.000 pfu por tubo).

2) Incubar a 37°C durante 15 minutos.

3) Mientras se incuban las suspensiones de fagos/celulas, se agrega 1,0 mL de sustrato de almidon rojo (1,2% p/v) a 6.0 mL de agar de superficie NZY a 50°C y se mezclan completamente. Mantener la solucion a 50°C hasta que sea necesario.

4) Transferir 1/5 (10.000 pfu) de la suspension celular a la solucion de agar sustrato/superior y mezclar suavemente.

5) La solucion se vierte inmediatamente en una placa de medio NZY grande (150 mm).

6) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la placa.

7) Repetir los procedimientos 4-6, 4 veces, para el resto de la suspension celular (1/5 de la suspension cada vez). 8) Incubar las placas a 39°C durante 8-12 horas.

9) Observar las zonas claras (halos) alrededor de las colonias.

10) Las colonias con halos se extraen del agar y se transfieren a un microtubo esteril. Una punta de pipeta de 200 pL de gran calibre funciona bien para retirar (remover) el tapon de agar que contiene la colonia deseada.

11) Los fagos se resuspenden en 500 pL de regulador SM. Se agregan 20 pL de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional.

12) La suspension de fagos pura se incuba a temperatura ambiente durante 4 horas o toda la noche antes de la siguiente etapa.

Aislamiento de clones puros

1) Se agregan 10 pL de suspension de fago resuspendida a 500 pL de celulas MRF' de E. coli (OD600 = 1,0).

2) Incubar a 37°C durante 15 minutos.

3) Mientras se incuba la suspension de fagos/celulas, se agrega 1 mL del sustrato de almidon rojo (1,2% p/v) a 6,0 mL de agar de superficie NZY a 50°C y se mezcla completamente. Mantener la solucion a 50°C hasta que sea necesario.

4) La suspension celular se transfiere a la solucion de agar de superficie/sustrato y se mezcla suavemente.

7) Incubar la placa a 39°C durante 8-12 horas.

8) Observar las zonas claras (halos) alrededor de una colonia individual (clon puro). Si no se puede aislar una sola colonia, ajustar el titulo y volver a sembrar en placa la suspension de fagos.

9) La colonia individual con halo se extrae del agar y se transfiere a un microtubo esteril. Una punta de pipeta de 200 pL de gran calibre funciona bien para retirar (remover) el tapon de agar que contiene la colonia deseada. Para amplificar el titulo, remover 5 colonias activas individuales en un microtubo.

10) Los fagos se resuspenden en 500 pL de regulador SM. Se agregan 20 pL de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional.

11) La suspension de fagos pura se incuba a temperatura ambiente durante 4 horas o toda la noche antes de la siguiente etapa. La suspension de fagos pura se almacena a -80°C agregando DMSO a la suspension de fagos (7% v/v).

Escision del clon puro

1) Se agregan 100 pL de suspension de fago puro a 200 pL. de celulas MRF' de E. coli (OD600 = 1,0). A esto, se agregan 1,0 pL del fago auxiliar EXASSIST (> 1 x 106 pfu/mL; Stratagene). Usar el tubo Falcon 2059 para la escision.

2) La suspension se incuba a 37°C durante 15 minutos.

3) Se agregan 3,0 mL de medio 2x YT a la suspension celular.

4) Incubar a 30°C durante al menos 6 horas o toda la noche mientras se agita.

5) Se transfiere el tubo a 70°C durante 20 minutos. La suspension de fagemidos se puede almacenar a 4°C durante 1 a 2 meses.

6) 100 pL de suspension de fagemidos transferidos a un microtubo que contiene 200 pL de celulas Exp 505 de E. coli (OD600 = 1,0).

7) Se incuba la suspension a 37°C durante 15 minutos.

8) Se agregan 300 pL de SOB a la suspension.

9) La suspension se incuba a 37°C durante 30 a 45 minutos.

10) 100 pL de suspension se transfieren a una pequena placa de medio LB (90 mm) que contiene Kanamicina (medio LB con 50 pg/mL de Kanamicina) para bibliotecas de ADN de Zap Express o Ampicilina (medio LB con 100 pg/mL de kanamicina) para bibliotecas de ADN de Zap II.

11) El resto de la suspension se transfiere a otra pequena placa de medio LB.

12) Usar perlas de vidrio esteriles para distribuir uniformemente la suspension en la placa.

13) Las placas se incuban a 30°C durante 12 a 24 horas.

14) Observar la placa por la presencia de colonias.

15) Inocular una colonia individual en medio liquido LB que contenga antibioticos adecuados e incubar a 30°C durante 12 a 24 horas.

16) El patron de glicerol se puede preparar agregando glicerol al 80% al cultivo liquido (15% v/v) y almacenando a -80°C.

Verificacion de actividad

1) 50 gL de cultivo liquido se transfieren a un microtubo. Agregar 500 gL de Amilopectina Azure pH7 al 8% en el mismo tubo. Preparar 2 tubos para cada clon.

2) La actividad se prueba a 50°C durante 3 horas y durante la noche. Utilizar un regulador de pH 7 como control. 3) Enfriar la muestra de prueba en un bano de agua con hielo durante 5 minutos.

4) Agregar 750 gL de etanol y mezclar bien.

5) Centrifugar a 13.000 rpm (16.000 g) durante 5 minutos.

6) Medir la OD del sobrenadante a 595 nm.

Analisis de RFLP

1) Se transfiere 1,0 mL de cultivo liquido a un microtubo esteril.

2) Centrifugar a 13.200 rpm (16.000 g) durante 1 minuto.

3) Desechar el sobrenadante. Agregar otro 1,0 mL de cultivo liquido en el mismo microtubo esteril.

4) Centrifugar a 13.200 rpm (16.000 g) durante 1 minuto.

5) Desechar el sobrenadante.

6) Seguir el protocolo del mini kit de centrifugacion QIAprep para el aislamiento del plasmido.

7) Verificar la concentracion de ADN utilizando BioPhotometer.

8) Usar Sac I y Kpn I para la primera digestion doble. Incubar a 37°C durante 1 hora.

9) Usar Pst I y Xho I para la segunda digestion doble. Incubar a 37°C durante 1 hora.

10) Anadir el colorante de carga en la muestra digerida.

11) Pasar la muestra digerida en un gel de agarosa al 1,0% durante 1-1,5 horas a 120 voltios.

12) Observar el gel con el formador de imagenes en gel. Todos los clones con un patron de digestion diferente se enviaran para el analisis de secuencia.

Ejemplo 7: Ensayo de amilasas

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de un metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion.

Preparacion de cultivos huesped

1. Iniciar un cultivo nocturno de celulas huesped XL 1-Blue MRF'. Usar una sola colonia de una placa sembrada en estrias para inocular 10 mL de LB suplementado con 20 ug/mL de tetraciclina. Cultivar durante la noche el cultivo agitando a 37°C durante al menos 16 horas.

2. Usando una tecnica aseptica, inocular 100 mL frescos de cultivo de dia LBTet con el huesped XL1-Blue MRF' del cultivo LBTet durante la noche.

3. Dejar crecer en un agitador a 37°C hasta que la OD alcance 0,75 - 1,0.

4. Sedimentar las celulas huesped a 1000 x g durante 10 minutos y resuspender suavemente en MgSO4 10 mM a OD5.

5. Diluir una pequena cantidad de celulas huesped a OD1 para utilizarlas en titulacion y pipeteo.

6. Las preparaciones huesped se pueden usar hasta por 1 semana cuando se almacenan en hielo o a 4°C.

- Para acortar el tiempo de crecimiento para el cultivo de dfa, usar 12X, la concentracion habitual de Tet en LB (12X = 10 pg/mL), u omitir el antibiotico por completo.

- No utilizar NZY al seleccionar con tetraciclina. La alta concentracion de Mg++ en el medio NZY hace que Tet se inactive.

Titulacion de bibliotecas lambda

7. Colocar tres tubos de microcentrffuga esteriles en un estante.

8. Colocar alfcuotas de 995 pL de celulas huesped preparadas en un tubo y 45 pL de celulas huesped OD1 preparadas en cada uno de los dos tubos restantes.

9. Agregar 5 pL de la biblioteca lambda al tubo que contiene 995 pL de celulas huesped y mezclar mediante agitacion tipo vortice. Esto resulta en un factor de dilucion de 200.

10. Preparar diluciones de 1/2.000 y 1/20.000 agregando consecutivamente 5 pL de la dilucion previa a los dos tubos restantes que contienen 45 pL de celulas huesped preparadas. Mezclar mediante agitacion tipo vortice despues de cada dilucion.

11. Permitir que los fagos se adsorban al huesped incubandolos a 37°C durante 15 minutos.

12. Mientras tanto, pipetear 100 pL de celulas huesped OD1 preparadas en cada uno de los tres tubos Falcon 2059.

13. Agregar 5 pL de cada dilucion a un tubo 2059 separado que contiene celulas huesped.

14. Sembrar en placa cada uno agregando 3 mL de agar de superficie a cada tubo y verter rapidamente en placas NZY de 90 mm. Asegurar una distribucion llana y uniforme antes de que el agar de superficie se endurezca.

15. Invertir las placas e incubar a 37°C durante la noche.

16. Contar las colonias y calcular el tftulo del patron de la biblioteca (en unidades de formacion de placa (pfu) por pL). Seleccion de microtitulacion lambda para las amilasas

Preparacion

1. Preparar una cantidad suficiente de cultivo huesped XL 1-Blue MRF', como se describio anteriormente, para la cantidad de seleccion planificada. Un cultivo de 100 mL suele ser suficiente para seleccionar 2-3 bibliotecas.

2. Autoclavar varias botellas compatibles con el dispensador QFill2. Estas son las botellas de Corning de boca ancha, de 250 mL que contienen un anillo de sellado alrededor del borde.

3. Asegurese de que haya suficiente cantidad de placas, agar de superficie, almidon BODIPY, solucion de almidon rojo, etc., disponibles para la seleccion.

4. Programar la operacion del robot el Dfa 2 con un representante de Automation.

Dfa 1

1. Marcar las placas de 1536 pozos (negras) con seleccion de biblioteca y el numero de placa. Las etiquetas adhesivas de tubo Tough-TagsMR, cortadas por la mitad a lo ancho, son ideales para marcar placas de 1536 pozos.

2. Calcular los volumenes de biblioteca, celulas huesped y medio NZY necesarios para la seleccion. Esto se hace facilmente con una hoja de calculo de Excel.

3. Combinar los volumenes calculados de biblioteca lambda y las celulas huesped OD5 en un frasco Corning esteril de boca ancha de 250 mL (que contiene un anillo de sellado).

4. Permitir que ocurra la adsorcion a 37°C durante 15 minutos.

5. Agregar el volumen calculado de medio NZY y mezclar bien. Esto se conoce como la suspension de medio de fago celular.

6. Realizar un tftulo concomitante combinando 50 pL de la suspension de medio de fago celular con 250 pL de celulas huesped OD1 en un tubo Falcon 2059, luego sembrar en placas con 9 mL de agar de superficie en una placa NZY de 150 mm. Incubar la placa de titulacion concomitante a 37°C durante la noche.

7. Cargar el dispensador con el resto de la suspension y disponer cada placa marcada de 1536 pozos con 4 pL por pozo. Si el dispensador deja burbujas de aire en algunos pozos, se pueden eliminar centrifugando las placas a 200 x g durante 1 minuto.

8. Agregar 0,5 pL de fago de control positivo a la posicion AD46 del pozo de al menos dos de las placas de ensayo. Utilizar un clon de lambda fuerte positivo para la amilasa para este proposito. Las versiones lambda de la SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 199 son buenas opciones para controles positivos.

9. Incubar las placas de ensayo a 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (>95%).

Dia 2

1. Contar las pfu en la placa de titulacion concomitante y determinar la densidad promedio de semillas por pozo (en pfu por pozo).

2. Pipetear al menos 2 placas de cada seleccion de biblioteca (preferiblemente las 2 que contienen controles positivos) de la siguiente manera:

a) Preparar 2 placas de alta densidad huesped para que actuen como una superficie sobre la cual pipetear: combinar 250 pL de celulas huesped OD1 con 2 mL de almidon rojo al 2% y sembrar en placa con 9 mL de agar de superficie en placas NZY de 150 mm. Sostener cada placa lo mas nivelada posible, ya que el agar de superficie se solidifica para producir un tono rojo uniforme en toda la placa.

b) Usando un pipeteador doble de 1536 posiciones esterilizado a la llama, replicar al menos 2 de las placas de seleccion en las placas de alta densidad huesped.

c) Colocar las placas receptoras pipeteadas en una campana de flujo laminar sin las tapas durante aproximadamente 15-30 minutos (para retirar el exceso de humedad).

d) Volver a colocar las tapas e incubar en forma invertida a 37°C durante la noche.

3. Preparar el regulador de sustrato de almidon 2X BODIPY de la siguiente manera:

a) Calcular el volumen total de solucion de regulador de sustrato 2X necesaria para todas las placas de seleccion con 4 pL por pozo (incluido cualquier volumen de espacio muerto adicional requerido por el dispensador) y medir esta cantidad de CAPS 100 mM pH 10,4 en un recipiente apropiado para el dispensador utilizado.

b) Recuperar suficientes tubos de 0,5 mg de almidon BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en la etapa a) anterior] a una concentracion final de 20-30 pg/mL.

c) Disolver cada tubo de 0,5 mg en 50 pL de DMSO a temperatura ambiente, protegido de la luz, con agitacion tipo vortice frecuente. Esto lleva mas de 15 minutos; algunos lotes de produccion de almidon BODIPY se disuelven mejor que otros.

d) Agregar 50 pL de regulador CAPS 100 mM pH 10,4 a cada tubo y mezclar mediante agitacion tipo vortice. e) Reunir el contenido de todos los tubos y eliminar los agregados no disueltos centrifugando durante 1 minuto a velocidad maxima en una microcentrifuga.

f) Agregar el sobrenadante al resto del bufer CAPS 100 mM medido en la etapa a) anterior.

g) Proteger el regulador de sustrato 2X de la luz envolviendolo en papel de aluminio.

4. Llevar las placas y el regulador de sustrato a la sala de automatizacion y programar el robot con los siguientes parametros:

a) dispensar 4 pL de regulador de sustrato por pozo

b) primera lectura 1 hora despues de agregar el sustrato, segunda lectura a las 9 horas, y tercera lectura a las 17 horas; con incubacion a 37°C entre lecturas.

c) filtro de excitacion: 485 nm; filtro de emision: 535 nm

d) fijar la ganancia del Spectrafluor en 70, o la ganancia optima para el lote del regulador de sustrato 2X preparado. e) garantizar que la incubadora utilizada protegera las placas de ensayo de la luz.

Dia 3

1. Revisar las placas pipeteadas en busca de claros en el cesped bacteriano en todas las posiciones correspondientes a los pozos en la placa de ensayo asociada. Tambien revisar los claros en el almidon rojo en cualquiera de las posiciones de las puntas. Si se utilizaron placas con controles positivos para el pipeteo, deberia poder observarse una gran zona clara en el fondo rojo. Tenga cuidado con los contaminantes que tambien forman zonas claras en el almidon rojo (vease el comentario "Contaminants That Form Clearing Zones in Red Starch" al final del Ejemplo 7).

2. Identificar los aciertos putativos del archivo de datos producido por el ordenador del robot. El programa KANAL producido por Engineering simplifica el analisis de datos. Como regla general, un acierto putativo se caracteriza como un pozo que tiene una intensidad de senal que aumenta al menos 1,5 veces sobre el fondo.

3. Para cada putativo, retire 2 pL del pozo y anadalo a un tubo que contenga 500 pL de regulador SM y 50 pL de CHCl3. Agitar en forma de vortice para mezclar y almacenar a 4°C. Esta solucion se denominara en adelante como el stock 4e-3. Las placas de seleccion originales deben almacenarse a 4°C, protegidas de la luz, al menos hasta que se hayan completado los desgloses.

Este es el metodo recomendado para romper los aciertos putativos. Es un ensayo en fase liquida que se basa en la confirmacion de la actividad en el almidon BODIPY. Alternativamente, los aciertos putativos se pueden colocar directamente en placas de fase solida que contienen almidon rojo, de manera que se examinen 2.000-3.000 pfu por acierto para las zonas claras. Sin embargo, la incapacidad para observar las zonas claras en el almidon rojo no es necesariamente una indicacion de que un acierto putativo fue un falso positivo. Luego, se debera analizar utilizando el formato en el que se identifico originalmente (es decir, en fase liquida utilizando almidon BODIPY como sustrato). Ademas, los positivos muy debiles se identifican mas facilmente utilizando el metodo que se detalla a continuacion. Dia 1

1. En un tubo conico esteril de 50 mL, combinar 0,5 mL de celulas huesped OD5 con 45,5 mL de NZY. Esto se denominara como la suspension del medio huesped.

2. Para cada acierto putativo que se analiza, colocar alicuotas de 1 mL de medio huesped en cada uno de los tres tubos de microcentrifuga esteriles.

3. Configurar el pipeteador manual de 12 canales en modo de dispensacion multiple con un tamano de alicuota de 20 pL y un numero de alicuota de 2x. Montar la pipeta manual con un juego limpio de puntas esteriles.

4. Verter aproximadamente 1 mL de suspension de medio huesped en una nueva cubeta de solucion esteril y cargar la pipeta manual multicanal.

5. Dispensar 20 pL por pozo en la ultima fila (fila P) de una placa negra de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos). Esta fila se usara mas adelante para los controles.

6. Expulsar el liquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie de la cubeta y presionar el boton REINICIO en el pipeteador manual. Colocar el pipeteador manual de manera que se evite la contaminacion de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto.

7. Verter el resto del fluido en la cubeta en un contenedor de desechos (como un vaso de precipitados) teniendo cuidado de evitar la contaminacion por salpicaduras.

8. Para el primer putativo que se analizara, tomar 111 pL del patron 4e-3 (vease el Dia 2 en la Seleccion de microtitulacion lambda para amilasas) y agregar al primero en un conjunto de tres tubos que contienen 1 mL de suspension de medio huesped (etapa 2). Agitacion tipo vortice para mezcla. Esta es la dilucion A.

9. Tomar 111 pL de Dilucion A y agregar al siguiente tubo del conjunto. Agitacion tipo vortice para mezclar. Esta es la dilucion B.

10. Tomar 111 pL de Dilucion B y agregar al ultimo tubo del conjunto. Agitacion tipo vortice para mezclar. Esta es la dilucion C. Ahora deben tenerse tres diluciones de fagos, en donde las concentraciones de cada una difieren en un factor de 10.

11. Verter los contenidos de la dilucion C (la mas diluida de las 3 muestras) en la cubeta de la solucion y cargar la pipeta manual multicanal.

12. Dispensar 20 pL por pozo en la primera fila de la placa de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos).

13. Expulsar el liquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie de la cubeta y presionando el boton REINICIO en la pipeta manual. Colocar el pipeteador manual de manera que se evite la contaminacion de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto.

14. Vaciar la cubeta como se describio anteriormente.

15. Verter el contenido de Dilucion B en la misma cubeta y cargar la pipeta manual multicanal.

16. Dispensar 20 pL por pozo en la segunda fila de la placa de 384 pozos.

17. Realizar las etapas 13-16 de manera similar para dispensar la dilucion A en la tercera fila de la placa.

18. Despues de que las tres diluciones se hayan distribuido en las primeras 3 filas de la placa, desechar todas las puntas y la cubeta de la solucion en el contenedor de desechos de riesgo biologico.

19. Monta el pipeteador manual con un juego limpio de puntas esteriles y abrir una nueva cubeta de solucion esteril.

20. Repetir las etapas 8-19 para cada acierto putativo restante, utilizando las filas restantes en la placa hasta la fila O. Se pueden analizar cinco aciertos putativos en una placa de 384 pozos, con la ultima fila (fila P) reservada para los controles.

21. Agregar 0,5 pL de cada control a un pozo separado. Usar al menos 2-3 controles separados, preferiblemente que cubran un intervalo de actividad.

22. Incubar las placas de ensayo a 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (>95%).

Dia 2

1. Pipetear todas las placas con desprendimiento sobre un cesped huesped con almidon rojo usando el mismo metodo descrito para el Dia 2 en la Seleccion de microtitulacion lambda para las amilasas, excepto porque se utiliza un pipeteador de 384 posiciones.

2. Preparar el regulador de sustrato de almidon BODIPY 2X de la siguiente manera:

a) Calcular el volumen total de solucion de regulador de sustrato 2X necesaria para todas las placas con desprendimiento con 20 pL por pozo (incluido cualquier volumen de espacio muerto adicional requerido por el dispensador) y medir esta cantidad de CAPS 100 mM pH 10,4 en un recipiente apropiado para el dispensador utilizado. b) Recuperar suficientes tubos de 0,5 mg de almidon BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en la etapa a) anterior] a una concentracion final de 20-30 pg/mL.

c) Disolver cada tubo de 0,5 mg en 50 pL de DMSO a temperatura ambiente, protegido de la luz, con agitacion tipo vortice frecuente. Esto toma mas de 15 minutos; algunos lotes de produccion de almidon BODIPY se disuelven mejor que otros.

d) Agregar 50 pL de regulador CAPS 100 mM pH 10,4 a cada tubo y mezclar mediante agitacion tipo vortice. e) Reunir el contenido de todos los tubos y eliminar los agregados no disueltos centrifugando durante 1 minuto a la velocidad maxima en una microcentrifuga.

f) Agregar el sobrenadante al resto del regulador CAPS 100 mM medido en la etapa a) anterior.

3. Dispensar 20 pL por pozo en todas las placas con desprendimiento.

4. Envolver todas las placas en papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 6 horas.

5. Leer cada placa en el Spectrafluor con la siguiente configuracion:

a) lectura de fluorescencia (filtro de excitacion: 485 nm; filtro de emision: 535 nm)

b) definicion de la placa: negra de 384 pozos

c) leer desde la parte superior

d) ganancia optima

e) numero de destellos: 3

6. En la hoja de calculo de Excel resultante, trazar las 3 filas de cada putativo en un grafico separado y verificar la actividad. Asegurese de que los controles positivos produzcan senales sobre el fondo.

7. Para cada putativo que parece tener una senal real entre los pozos, recolectar una muestra de un pozo positivo de la siguiente manera:

a) Seleccionar un pozo positivo de una fila que represente la dilucion inicial mas alta.

b) Transferir 2 pL desde ese pozo a un tubo que contiene 500 pL de SM y 50 pL de CHCI3. Esto se conoce como el patron de desprendimiento.

c) Almacenar a 4°C.

8. Usando los metodos descritos anteriormente, sembrar en placa aproximadamente 10 pL de cada patron de desprendimiento en placas NZY de 150 mm con almidon rojo. El objetivo es obtener varias (al menos 20) colonias bien separadas de las cuales se pueden remover los aislamientos.

Dia 3

1. Verificar que las placas pipeteadas tengan una incidencia aceptable de claros en el cesped bacteriano correspondiente a los pozos en la placa de ensayo asociada. Tambien revisar los claros en el almidon rojo en los controles positivos y en los putativos probados. Tener cuidado con los contaminantes que tambien forman zonas claras en el almidon rojo (ver mas abajo).

2. A partir de las placas de fase solida que contienen diluciones de los patrones de desprendimiento, remover varias colonias aisladas, cada una en 500 pL de SM con 50 pL de CHCh. Esto se conoce como el patron aislado.

3. Los patrones aislados se pueden probar individualmente con almidon BODIPY utilizando los metodos descritos anteriormente. Esta etapa se puede omitir si la colonia que se removio en la etapa 2 produjo una zona clara en el fondo de almidon rojo. Los patrones aislados se probaron individualmente en almidon BODIPY utilizando los metodos descritos anteriormente. Sin embargo, esta etapa se puede omitir si la colonia que se removio en la etapa 2 produjo una zona clara en el fondo de almidon rojo.

Excisiones

Dia 1

1. En un tubo Falcon 2059, mezclar 200 pL de huesped OD1 XL1 -Blue MRF ', 100 pL de patron aislado lambda y 1 pL de patron de fago ExAssist.

2. Incubar en un agitador a 37°C durante 15 minutos.

3. Anadir 3 mL de medio NZY.

4. Incubar en un agitador a 30°C durante la noche.

Dia 2

1. Calentar el tubo de escision a 70°C durante 20 minutos.

2. Centrifugar a 1000 x g durante 10 minutos.

3. En un tubo Falcon 2059, combinar 50 pL de sobrenadante con 200 pL de huesped EXP505 OD1.

4. Incubar en agitador a 37°C durante 15 minutos.

5. Anadir 300 pL de medio SOB.

6. Incubar en un agitador a 37°C durante 30-45 minutos.

7. Sembrar en placa 50 pL en una placa grande LBKan50 usando perlas de vidrio esteriles. Si las placas estan "secas", se puede agregar medio SOB adicional para ayudar a desembolsar las celulas.

8. Incubar la placa a 30°C durante al menos 24 horas.

9. Cultivar un aislado para secuenciacion y/o RFLP.

El crecimiento a 30°C reduce el numero de copias del plasmido y se utiliza para mitigar la toxicidad aparente de algunos clones de amilasa.

Contaminantes que forman zonas claras en almidon rojo

Cuando se usa almidon rojo en un medio solido para analizar la actividad de la amilasa en el fago, es comun ver unidades formadoras de colonias contaminantes (cfu) que forman zonas claras en el almidon rojo. Para las placas pipeteadas, es importante distinguir los clones de fagos positivos a la amilasa de estos contaminantes cuando se alinean con una posicion particular del pozo. La fuente de los microbios contaminantes es, presumiblemente, la solucion patron de almidon rojo al 2%, que no se puede esterilizar mediante autoclave o filtrado despues de la preparacion. Se piensa que son organismos oportunistas que sobreviven metabolizando el almidon rojo. Para reducir estos contaminantes, usar una tecnica esteril cuando prepare soluciones de almidon rojo al 2% y almacenar los patrones ya sea a 4°C o sobre hielo.

Ejemplo 8: Analisis bioinformatico

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion, por ejemplo, mediante analisis bioinformatico.

Se realizo un analisis bioinformatico inicial con secuencias conocidas de alfa amilasa hipertermofila. La Figura 14a muestra una alineacion de las secuencias, algunas de las cuales se han depositado en la base de datos del NCBI. Este analisis revelo la posibilidad de disenar cebadores degenerados para realizar la PCR del gen completo menos su secuencia senal (vease la Figura 14a), lo que produce amilasas alfa de longitud completa potencialmente novedosas de una biblioteca.

Las siguientes bibliotecas se seleccionaron por PCR a partir de ADN genomico:

Tabla 6:

La Figura 14b muestra una alineacion de las secuencias identificadas y la Tabla 7, ilustrada en la Figura 18, enumera sus porcentajes relativos de identidades.

La identidad de los aminoacidos varia de aproximadamente el 85-98% de identidad. Por consiguiente, estas secuencias son utiles en la transposicion de genes como se describe en el presente documento.

La Figura 14c muestra la alineacion de acidos nucleicos de las secuencias de polipeptidos correspondientes anteriores. La expresion de estas amilasas en el vector de expresion pSE420 y la linea de celulas huesped XL1 -Blue mostro que 1703 y 1706 tienen actividad de amilasa.

Ejemplo 9: Caracterizacion del pH optimo de la biblioteca 63 GP-1 alfa-amilasa y determinacion de actividad especifica

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion, por ejemplo, por medio de la actividad de alfa-amilasa, pH optimo y determinacion de actividad especifica.

En los experimentos iniciales, la SEQ ID NO: 81 de Thermococcus demostro que era eficaz tanto en la licuefaccion de almidon para la molienda humeda de maiz como para el desencolado de textiles. Esta enzima tiene un pH optimo de 4,5 a 5,0. A este pH mas bajo, es posible usar poco o ningun calcio, lo que reduce los costes operativos generales y la formacion de menos subproductos. Ademas, a este bajo pH, hay una disminucion en el uso de productos quimicos y la carga de intercambio ionico. El estandar industrial de amilasa de B. licheniformis es inferior al optimo tanto en termoestabilidad como en pH optimo. La amilasa 63GP-1 tiene una mayor actividad especifica de aplicacion en comparacion con la amilasa de B. licheniformis y, por lo tanto, se requiere mucho menos enzima para hidrolizar una tonelada de almidon (se pueden usar hasta 20 veces menos enzima).

El pH optimo para la hidrolisis del almidon se determino haciendo reaccionar 50 pL del GP-1,0,35 U/mL, con 100 mL de solucion de almidon soluble al 1% (0,0175 U/g de almidon) durante 30 minutos a 95°C. Los extremos reductores generados en la solucion de almidon licuado se midieron mediante el ensayo de neocuproina, descrito en el presente documento. El porcentaje de hidrolisis del almidon de maiz se determino midiendo el numero de extremos reductores de azucar producidos con el ensayo de neocuproina. Se pesaron setenta gramos de solucion reguladora (pH 4-7) y se agregaron 100 ppm de calcio. Se mezclaron treinta gramos de almidon de maiz en la solucion reguladora para formar una suspension de almidon. Se anadio la enzima y los recipientes se sellaron e incubaron a 95°C durante 30 minutos con una velocidad de calentamiento inicial de 6°C por minuto. Se extrajo una muestra de 1 mL de los vasos de reaccion y se analizo mediante el ensayo de neocuproina. El optimo para GP-1 fue entre pH 4,5 y 5, mientras que la amilasa comercial de B. licheniformis se realizo de manera optima a un pH de aproximadamente 6.0.

Ejemplo 10: Reensamblaje de ligacion de amilasa

El siguiente ejemplo describe, entre otros, ejemplos de metodos para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion, por ejemplo, mediante los ensayos descritos a continuacion.

Ensayo utilizando RBB-almidon

Se anadieron 75 qL de sustrato de RBB- almidon (almidon de maiz insoluble RBB al 1% en regulador NaAc 50 mM, pH = 4,5) en cada pozo de una nueva placa de 96 pozos (fondo en V). Cinco microlitros de lisado de enzima se transfirieron a cada pozo con sustrato utilizando Biomek o Zymark. Las placas se sellaron con cinta de sellado de aluminio y se agitaron brevemente en el agitador. Las placas se incubaron a 90°C durante 30 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 a 10 minutos. Se agregaron cien microlitros de etanol al 100% a cada pozo, las placas se sellaron y se agitaron brevemente en el agitador. Las placas se centrifugaron a continuacion a 4000 rpm durante 20 minutos utilizando una centrifuga de mesa. Se transfirieron 100 qL del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos (fondo plano) de Biomek y se leyo a una OD595. Controles: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79.

Ensayo utilizando FITC-almidon

Se anadieron 50 qL de sustrato (0,01% de FITC-almidon en regulador NaAc 100 mM, pH = 4,5) en cada pozo de una nueva placa de 384 pozos. Se transfirieron 5 qL de lisado de enzima a cada pozo con sustrato y se incubo la placa a temperatura ambiente durante la noche. El cambio de polarizacion del sustrato, excitacion 485 nm, emision 535 nm, se leyo para cada pozo. Controles: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79. Preferiblemente, se utilizan placas de 96 pozos para todos los ensayos.

Confirmacion de nuevos clones activos

Cada clon positivo de la seleccion se cultivo y se indujo utilizando un protocolo estandar. Cada clon se examino para determinar el crecimiento (es decir, la densidad celular a lo largo del tiempo), la actividad a nivel celular (ensayo de RBB-almidon y ensayo de licuefaccion), expresion (gel de proteina) y solubilidad de la proteina (mediante analisis por microscopio). Los nuevos clones elevados confirmados fueron transferidos para la fermentacion.

Ejemplo 11: Ejemplo de protocolo para licuar almidon y medir resultados

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de protocolo para licuar almidon utilizando amilasas seleccionadas de la divulgacion.

Las amilasas que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 4 demostraron actividad sobre almidon licuado a pH 4,5 o 6,5 usando las condiciones de reaccion que se muestran a continuacion.

Condiciones de reaccion: PO4100 mM pH 6,5, almidon licuado al 1% (p/p) DE 12 a 55°C. Se realizaron ensayos de TLC y HPLC para verificar la actividad. Los datos de ambos ensayos mostraron que los clones estaban activos.

Los perfiles de pH para las amilasas que tienen una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 10 se realizaron utilizando un regulador de fosfato con pH de 3,0 a 6,5, a 55°C. A partir de la cantidad de hidrolisis observable, se podria decir visualmente que los clones fueron mas activos a ciertos valores de pH que a otros valores en las condiciones de reaccion indicadas anteriormente:

SEQ ID NO: 4 - activa de pH 5,0 a 6,5

SEQ ID NO: 10 - activa de pH 4,5 a 6,5

Un ejemplo de protocolo para la sacarificacion de almidon licuado a pH 6,5:

• Ajustar el pH del almidon licuado al pH en el que se realizara la sacarificacion o sacarificaciones). Licuar el almidon en regulador de acetato de sodio 100 mM, pH 4,5 con sales de fosfato de sodio 100 mM agregadas, de modo que antes de la sacarificacion, el pH podria ajustarse a pH 6,5. •

• Pesar muestras de 5 gramos de almidon licuado en botellas taradas.

• Utilizar Optidex L-400 al 0,04% (p/p) o aproximadamente 400 mL de patron diluido de 1-10 de Optidex L-400 por cada 100 gramos de almidon licuado.

• Calcular los miligramos de Optidex L-400 contenidos en los 400 mL del patron diluido 1-10 de Optidex L-400. A continuacion, calcular el volumen de lisados necesarios para obtener la misma concentracion de enzima que el Optidex L-400.

• Agregar enzimas a las muestras de almidon licuado e incubar a la temperatura deseada (50°C). Despues de 18 horas, determinar DE y preparar una muestra para analisis de HPLC.

Un ejemplo para determinacion de DE:

Ejemplo de ensayo de neocuproina:

Se anadio una muestra de 100 mL a 2,0 mL de solucion A de neocuproina (40 g/L de carbonato de sodio, 16 g/L de glicina, 0,45 g/L de sulfato de cobre). A esto se agregaron 2,0 mL de solucion B de neocuproina (1,2 g/L de clorhidrato de neocuproina, Sigma N-1626). Los tubos se mezclaron y se calentaron en un bano de agua hirviendo durante 12 minutos; se enfrio, se diluyo hasta un volumen de 10 mL con agua desionizada y la OD se leyo a 450 nm en el espectrofotometro. El equivalente de glucosa en la muestra se extrapolo a partir de la respuesta de un estandar de glucosa de 0,2 mg/mL simultaneamente.

Ejemplo de analisis de HPLC:

Los perfiles de carbohidratos de sacarificacion se miden por HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-87A en forma de plata, 80°C) utilizando deteccion por indice de refraccion. La fase movil se filtra en agua Millipore utilizada a un caudal de 0,7 mL/min. Las muestras de sacarificacion se diluyen 1 -10 con agua desionizada acidificada (5 gotas de HCl 6 M en 200 mL de agua desionizada) luego se filtran a traves de un filtro de jeringa de 0,45 pm. El volumen de inyeccion es de 20 pL.

Ejemplo de TLC:

Los productos de reaccion fueron w/d en puntos de tiempo de una hora y se colocaron y secaron los puntos en una placa de TLC. La placa se desarrollo luego en una relacion 10:90 de agua:isopropanol y se visualizo con una tincion de vainillina o con una tincion CAM y luego se calento para mostrar los azucares reducibles. El almidon licuado se hidrolizo parcialmente a glucosa en los casos en que se observo actividad.

Ejemplo 12: Licuefaccion de almidon utilizando amilasas de la divulgacion

Este ejemplo describe un ejemplo de metodo de la divulgacion para licuar almidon utilizando amilasas de la divulgacion.

El concentrado de amilasa se preparo a partir de caldos de fermentacion mediante tratamiento termico, lavado de celulas, extraccion alcalina utilizando microfiltracion y ultrafiltracion (48% de rendimiento total). El concentrado de UF se neutralizo con acido acetico y se formulo con glicerol al 30% a pH 4,5. El nivel de actividad de la formulacion en suspension fue representativo de un producto comercial (120 U1/g - 0,5 kg/tonelada de almidon).

Ensayo estandar de actividad de amilasa

Se coloco una cubeta de 1 mL que contenia 950 pL de MOPS 50 mM pH 7,0 que contenia PNP-a-D-hexa ( ^ 4)-glucopiranosido 5 mM en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotometro Beckman DU-7400 precalentado a 80°C. Se hizo un blanco espectrofotometrico a 405 nm y se agregaron 50 pL de la solucion de enzima a la cubeta, se mezclo bien y se controlo el aumento de la OD405nm durante un intervalo de un minuto. La tasa de AOD405nm/rnin se convirtio en una unidad estandar de pmol/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 pL de 1 pmol/mL de PNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH 7,0, 80°C. Una unidad Diversa estandar de alfa amilasa termoestable (DTAA) es igual a la cantidad de enzima que catalizara la liberacion de 1 pmol/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Ensayo estandar de actividad de glucoamilasa

Se coloco una cubeta de 1 mL que contenia 950 pL de MOPS 50 mM, pH 7,0, que contenia pNP-a-D-glucopiranosido 5 mM, en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotometro Beckman DU-7400 precalentado a 60°C. Se hizo un blanco espectrofotometrico a 405 nm y se agregaron 50 pL de la solucion de enzima a la cubeta, se mezclo bien y se controlo el aumento de la OD405nm durante un intervalo de un minuto. La tasa de AOD405nm/rnin se convirtio en una unidad estandar de pmoles/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 pL de 1 pmol/mL de pNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH 7,0, 60°C. Una unidad Diversa estandar de glucoamilasa (DGA) es igual a la cantidad de enzima que catalizara la liberacion de 1 pmol/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Determinacion del equivalente de dextrosa

El metodo de neocuproina se uso para medir el DE. Las muestras seleccionadas se midieron tanto mediante el procedimiento de la divulgacion como por un analista de GPC utilizando el procedimiento de Fehling para GPC.

Ensayo de neocuproina

Se anadio una muestra de 100 pL a 2,0 mL de solucion A de neocuproina (40 g/L de carbonato de sodio, 16 g/L de glicina, 0,45 g/L de sulfato de cobre). A esto se agregaron 2,0 mL de solucion B de neocuproina (1,2 g/L de clorhidrato de neocuproina, Sigma N-1626). Los tubos se mezclaron y se calentaron en un bano de agua hirviendo durante 12 minutos; se enfriaron, diluyeron hasta un volumen de 10 mL con agua desionizada y la lectura de OD a 450 nm en el espectrofotometro. El equivalente de glucosa en la muestra se extrapola a partir de la respuesta de un analisis estandar de glucosa de 0,2 mg/mL simultaneamente.

La muestra de almidon se diluye aproximadamente 1 a 16 con agua desionizada con la dilucion exacta registrada. Diez mililitros de la muestra diluida se agregaron a 20 mL de agua desionizada. Se anadieron diez mililitros de solucion A y B de Fehling al almidon diluido. La muestra ebullo durante 3 minutos y se enfrio en hielo. Se agregaron diez mililitros de KI al 30% y 10 mL de H2SO46N. La solucion se valoro frente a tiosulfato de sodio 0,1N. El volumen de titulador se registra y se utiliza para calcular el DE.

Determinacion de almidon residual

Las muestras posteriores a la sacarificacion se verificaron en busca de almidon residual utilizando el procedimiento de yodo de Staley.

Se pesaron veinte gramos de muestra en una placa de pesaje grande. Se agregan 45 pL de solucion de yodo a la placa de pesaje y la solucion de almidon se mezcla bien. El color azul oscuro indica la presencia de almidon, un azul verde claro indica un almidon ligero, verde claro indica un rastro de almidon y amarillo rojo, ausencia de almidon. La solucion de yodo se prepara disolviendo 21,25 gramos de yodo y 40,0 gramos de yoduro de potasio en un litro de agua.

Perfil de oligosacaridos

Los perfiles de hidratos de carbono de licuefaccion y sacarificacion se midieron por HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-87C en forma de calcio, 80°C) utilizando la deteccion por indice de refraccion.

Cromatografia de permeacion en gel

La distribucion del peso molecular se determino por cromatografia en una columna PL Aquagel-OH con deteccion de masa por indice de refraccion (Waters Modelo 2410). Se utilizo un detector Viscotek Modelo T60 para mediciones continuas de viscosidad y dispersion de luz.

Electroforesis capilar

Sistema de glicoproteinas Beckman Coulter P/ACE MDQ: separacion de oligosacaridos derivatizados con APTS en un capilar de silice fundida: deteccion mediante fluorescencia inducida por laser.

Licuefaccion primaria

El almidon de linea directamente del proceso de GPC se bombea a un tanque de alimentacion de 60 litros donde el pH, DS (solidos secos) y el nivel de calcio se pueden ajustar antes de la licuefaccion. La amilasa se anade a la suspension. La suspension de DS al 32% se bombea a 0,7 litros/minuto mediante una bomba de desplazamiento positivo al chorro, una camara de mezcla presurizada donde la suspension de almidon se calienta instantaneamente a mas de 100°C mediante inyeccion de vapor. El almidon licuado parcialmente gelatinizado se bombea a traves de una red de tuberias (aun bajo presion) para proporcionar el tiempo de permanencia deseado (5 minutos) a la temperatura. La presion se libera en un deposito separador y se pueden tomar muestras. Las muestras fueron tomadas por duplicado.

Licuefaccion secundaria

El almidon licuado se recogio en botellas de vidrio de un litro y se mantuvo en un bano de agua a 95°C durante 90 minutos.

Sacarificacion

El almidon licuado se enfrio a 60°C, el pH se ajusto a 4,5 y las muestras se trataron con glucoamilasa. El progreso de la sacarificacion se controlo a lo largo del tiempo mediante HPLC.

Sacarificacion

Los jarabes licuados producidos con cada amilasa se ajustaron hasta aproximadamente pH 2,5 con HCl 6N inmediatamente despues de la licuefaccion secundaria de 90 minutos para inactivar cualquier amilasa residual. Los jarabes se ajustaron luego a pH 4,5, se colocaron en un bano de agua a 60°C y se sacarificaron con tres niveles de glucoamilasa. El grado de la sacarificacion se controlo mediante HPLC en puntos de tiempo de 18-88 horas.

Los jarabes licuados se sacarificaron con la dosis estandar - 0,04% de una glucoamilasa de doble concentracion, y dos dosis mas bajas (50% y 25%) para monitorear cualquier diferencia en el progreso de la sacarificacion.

Progreso de la sacarificacion: % de desarrollo de dextrosa en funcion del tiempo glucoamilasa al 0,04%

Progreso de la sacarificacion: % de desarrollo de dextrosa en funcion del tiempo: glucoamilasa al 0,02%

Perfil de azucar posterior a la sacarificacion.

En estos estudios y en todos los estudios de sacarificacion anteriores, el nivel final de glucosa alcanzado despues de la sacarificacion por amilasas de la divulgacion y B. licheniformis en jarabes licuados es esencialmente identico. El nivel DP2 (maltosa) tambien es similar. Estos fragmentos grandes son sustratos pobres para la glucoamilasa y tienden a convertirse lentamente, en todo caso, en fragmentos mas pequenos y, en ultima instancia, glucosa.

Distribucion de peso molecular

La distribucion de peso molecular de los jarabes licuados para los DE de 12 y 18 por los ejemplos de amilasas de la divulgacion SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 437, y Bacillus licheniformis comercial y Bacillus stearothermophilus comercial, se midieron mediante cromatografia de permeacion de gel usando deteccion por Indice de refraccion, dispersion de luz y viscosidad. Tanto las amilasas de B. licheniformis y B. stearothermophilus generan una distribucion bimodal: el pico principal centrado en 2.000, un pico secundario de 32.000 con un hombro que se extiende mas alla del intervalo de 160.000. El pico de peso molecular mas bajo representa aproximadamente el 60% de la masa total de la muestra. Los ejemplos de amilasas de la divulgacion muestran un pico unico en 2.000 con muy poco por arriba de 30.000.

HPLC

Los jarabes con DE 12 y 18 producidos por los ejemplos de amilasas de la divulgacion SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 437 y amilasas comerciales de Bacillus licheniformis y Bacillus stearothermophilus se analizaron por HPLC. Ambas tecnicas producen huellas dactilares caracteristicas de cada clase de amilasa; los patrones de oligosacaridos son diferentes para amilasa de B. licheniformis frente a amilasa de B. stearothermophilus frente a ejemplos de amilasas de la divulgacion. Los jarabes licuados de la divulgacion (por ejemplo, los jarabes preparados por los metodos de la divulgacion y/o preparados por enzimas de la divulgacion) muestran evidencia de una mayor ramificacion en los oligosacaridos. La HPLC solo resuelve los oligosacaridos en el intervalo <DP15; los fragmentos mas grandes no son visibles en estas tecnicas. Se sabe que las amilasas de Bacillus licuan el almidon de una manera tal que la fraccion de amilopectina se hidroliza menos extensivamente que la fraccion de amilosa. Estos fragmentos de amilopectina > DP30 estan contenidos en la fraccion de alto peso molecular centrada en 32.000 y, en consecuencia, se observa poca evidencia de ramificacion en los analisis de HPLC de los jarabes licuados de Bacillus. Los oligosacaridos <DP15 de las amilasas de la divulgacion contienen fragmentos de amilosa y amilopectina.

Ejemplo 13: Licuefaccion de almidon en condiciones acidas utilizando amilasas de la divulgacion.

La divulgacion proporciona metodos para licuar almidon usando amilasas de la divulgacion, incluyendo amilasas activas en condiciones acidas, por ejemplo, entre aproximadamente pH 4,0 y 5,0, por ejemplo, pH 4,5. La conversion del almidon en glucosa se puede catalizar mediante la accion de la secuencia de dos enzimas: alfa-amilasas de la divulgacion para licuar el almidon (por ejemplo, la hidrolisis de polimeros de glucosa de alto peso molecular en oligosacaridos que consisten en 2 a 20 unidades de glicosa, tipicamente un equivalente de dextrosa de 10 a 12, por una amilasa de la divulgacion), seguida de sacarificacion con una glicoamilasa (que puede ser una glicoamilasa de la divulgacion). En un aspecto, el procesamiento se realiza en una planta de molienda humeda de maiz que produce una suspension de almidon con un pH de aproximadamente 4,0 a 4,5. En un aspecto, el pH aumenta, por ejemplo, de 5,8 a 6,0 antes de la licuefaccion para acomodar una alfa amilasa con una actividad y estabilidad de pH bajos (que puede ser una alfa amilasa de la divulgacion). En un aspecto, las amilasas de la divulgacion pueden licuar almidon a pH 4,5 para equivalentes de dextrosa que varian de 12 a 18; en un aspecto, usando alfa amilasas de la divulgacion a niveles de aproximadamente 3 a 6 gramos por tonelada de almidon. En este aspecto, el uso de alfa amilasas de la divulgacion permite que la licuefaccion de almidon se lleve a cabo a pH 4,5.

En un aspecto, la licuefaccion del almidon se lleva a cabo a pH 4,5 durante 5 minutos a una temperatura de 105°C hasta 90 minutos a 95°C usando amilasas de la divulgacion. La cantidad de enzima se ajusto para ajustar una DE objetivo de 12 a 15 despues de la licuefaccion. En un aspecto, el almidon licuado luego se sacarifica con una glucoamilasa, por ejemplo, una glucoamilasa de Aspergillus, durante aproximadamente 48 horas a aproximadamente pH 4,5 y 60°C. Si el jarabe sacarificado no contenia al menos un 95% de glucosa, el DE de la licuefaccion objetivo se elevo y la sacarificacion se repitio hasta que la licuefaccion finalmente produjo un jarabe sacarificado que contenia mas del 95% de glucosa. La proteina amilasa requerida para producir una materia prima licuada adecuada para la sacarificacion se determino mediante PAGE.

Ejemplo 14: Licuefaccion de almidon utilizando amilasas de la divulgacion

Este ejemplo describe un ejemplo de metodo para licuar almidon usando amilasas de la divulgacion y caracteriza patrones de oligosacaridos de licuefaccion de los ejemplos de enzimas de la divulgacion SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 437 (codificadas por la SEQ ID NO: 436) frente a amilasas comerciales de Bacillus licheniformis y Bacillus stearothermophilus. Estos resultados comparan el progreso de la sacarificacion y los niveles finales de dextrosa de los jarabes generados por las enzimas de la divulgacion y las amilasas comerciales.

Tres enzimas comerciales, Genencor, Spezyme AA y otras dos requirieron mas del doble de la dosis recomendada para alcanzar el equivalente de dextrosa (DE) objetivo. El equivalente de dextrosa (DE) es el estandar de la industria para medir la concentracion de azucares reductores totales, calculada como D-glucosa con base en el peso seco. El almidon granulado no hidrolizado tiene un DE de practicamente cero, mientras que el DE de D-glucosa se define como 100.

Estos resultados confirman el efecto de "doble dosis" para todas las amilasas de Bacillus y dan mas credibilidad a la propuesta de que la dosis observada para la SEQ ID NO: 437 en los ensayos tambien es el doble del valor que se requeriria en condiciones mas normales. La dosis "normal" proyectada, 60-70 Unidades/kilo de almidon a pH 4,5 para alcanzar un DE 19, es consistente con los datos de licuefaccion del laboratorio.

El patron de oligosacarido generado por las amilasas de la divulgacion es diferente de los perfiles de Bacillus. La distribucion de pesos moleculares para las amilasas de Bacillus (cromatografia de permeacion en gel con deteccion por dispersion de luz y viscosidad) es bimodal con una fraccion sustancial en el intervalo de peso molecular muy alto (> 300.000) incluso en un DE 18. La SEQ ID NO: 437 con un DE 18 exhibe una distribucion uniforme con nada mas que 20.000. Esto es consistente con la menor viscosidad para los jarabes de la divulgacion (por ejemplo, los jarabes preparados por los metodos de la invencion, o los preparados usando las enzimas de la invencion). Los perfiles DP (grados de polimerizacion) medidos por HPLC tambien reflejan esta diferencia en el patron de accion.

En este estudio, asi como en los estudios previos, el nivel final de glucosa despues de la sacarificacion de las amilasas de los jarabes licuados de la divulgacion frente a los jarabes de Bacillus fue el mismo para ambos casos. Sin embargo, los datos de sacarificacion de, por ejemplo, estudios de GPC, confirman que los residuos sin dextrosa para las amilasas de la divulgacion son diferentes de los jarabes de amilasa de Bacillus. Aunque los niveles de dextrosa y maltosa son esencialmente los mismos para ambos, las amilasas de la divulgacion tienen una mayor fraccion de DP3 mayor pero una menor cantidad de "mas altos" en comparacion con la enzima de Bacillus. Consistente con la ausencia de fragmentos de alto peso molecular despues de la licuefaccion, los jarabes posteriores a la sacarificacion de la divulgacion tienen un contenido mas bajo de la fraccion >DP7.

El concentrado de amilasa de la SEQ ID NO: 437 se preparo a partir de caldos de fermentacion mediante tratamiento termico, lavado de celulas, extraccion alcalina usando microfiltracion y ultrafiltracion (48% de rendimiento total). El concentrado de UF se neutralizo con acido acetico y se formulo con glicerol al 30% a pH 4,5. El nivel de actividad de la formulacion en suspension era representativo de un producto comercial (120 U1/g - 0,5 kg/tonelada de almidon).

Ejemplo 15: Amilasas alcalinas para aplicaciones de lavado de ropa y lavado automatico de vajillas

En un aspecto, la divulgacion proporciona detergentes que comprenden amilasas de la divulgacion, incluidas las amilasas activas en condiciones alcalinas, y los metodos de preparacion y uso de las mismas.

Se compararon tres enzimas amilasas estables en medio alcalino de la divulgacion y superaron a una enzima de referencia comercial con respecto a caracteristicas importantes en aplicaciones de lavado de ropa y lavado automatico de vajillas (ADW):

° La amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) supero a la enzima de referencia comercial purificada en la prueba de lavado ADW en portaobjetos recubiertos con almidon y fue muy resistente al peroxido de hidrogeno.

° La amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 210 (codificada por la SEQ ID NO: 209) y la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) supero la enzima de referencia comercial purificada en presencia de una formulacion para lavado de ropa/ADW utilizando un sustrato soluble.

° En presencia de quelantes, la amilasa que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO: 438) fue muy estable y la amilasa que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 441 (codificada por la SEC. ID. ID NO: 440) fue moderadamente estable.

° La amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 210 (codificada por la SEQ ID NO: 209) y la amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) y la amilasa que tiene una la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 441 (codificada por la SEQ ID NO: 440) tiene un pH optimo muy alcalino en el intervalo de pH 10 a 11. La amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 445 (codificada por la SEC) ID NO: 444) y que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO: 438) tienen un pH optimo alrededor de 8 aunque retiene una actividad significativa a pH 10.

° La amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 441 (codificada por la SEQ ID NO: 440) y que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO: 438) era termofila, con el mejor rendimiento de 65°C a 70°C.

Caracterizacion bioquimica

Cinco amilasas de la divulgacion, tres con pH optimo alcalino, se caracterizaron por pH optimo y temperatura optima, como se describe en la Tabla 1. "SEQ ID NOS: 209, 210" se refiere a una amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 110, codificada por la SeQ ID NO: 209, etc.

Tabla 1

Los perfiles de pH para las amilasas de la divulgacion comparados con la enzima de referenda actualmente utilizada en un producto comercial para lavado de ropa/ADW se presentan en la Figura 1. Todas las enzimas de la divulgacion demostraron una actividad optima entre pH 8 y 10, mientras que la enzima de referencia comercial fue mas activa a un pH inferior a 8 y tuvo solo actividad residual a pH 10. La Figura 19 muestra el perfil de pH de las amilasas analizadas de la divulgacion y la enzima de referencia comercial. La proteina purificada se anadio a los reguladores del pH indicado que contiene el sustrato soluble y se midio la actividad. Las tasas iniciales se calcularon a lo largo de 10 minutos y se convirtieron en un porcentaje de la tasa maxima.

Los perfiles de temperatura de las enzimas de la divulgacion se presentan en la Figura 20. T res fueron las mas activas entre las temperaturas de 45°C y 55°C, mientras que la amilasa que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 441 (codificada por la s Eq ID NO: 440) (“SEQ ID NOS: 440, 441") y las SEQ ID NOS: 438, 439 tuvieron una actividad optima entre 60°C y 70°C. La Figura 20 muestra los perfiles de actividad de temperatura de las amilasas probadas de la divulgacion. La actividad de la proteina purificada se midio a pH 10 (SEQ ID NOS: 209, 210, SEQ ID NOS: 211, 212, SEQ ID NO: 440, 441) o pH 8 (SEQ ID NOS: 444, 445, SEQ ID NOS: 438, 439) a la temperatura indicada. La actividad se midio mediante un ensayo de azucar reductor o controlando la fluorescencia a 520 nm (excitacion A 485 nm) cuando se uso almidon BODIPY. Las tasas iniciales se calcularon y se convirtieron en un porcentaje de la tasa maxima.

Prueba de aplicacion

Los experimentos se disenaron para evaluar la actividad y la estabilidad de las amilasas alcalinas probadas de la divulgacion en formulaciones de lavado de ropa/ADW y con los componentes individualmente. Las Figuras 21, 22 y 23 presentan los resultados de los experimentos usando un sustrato de almidon soluble. La Figura 24 presenta los resultados utilizando un sustrato solido: los portaobjetos con recubrimiento de almidon estandar de la industria.

La amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO: 438) ("SEQ ID NOS>: 438, 439") fue muy resistente al quelante EDTA (Figura 21) y la SEQ ID NOS: 211, 212 mostraron una resistencia significativa al peroxido de hidrogeno (Figura 22). Por el contrario, la enzima de referencia comercial no era funcional en presencia de ninguno de los componentes en las condiciones de los experimentos. En presencia de la formulacion completa para lavado de ropa/ADW, SEQ ID NOS: 209, 210 y SEQ ID NOS: 211, 212 fueron mucho mas activos en el sustrato soluble que la enzima de referencia comercial (Figura 23).

La Figura 21 muestra la actividad enzimatica en presencia de EDTA. Las proteinas purificadas se incubaron a 50°C en presencia o ausencia de EDTA 5 mM durante el tiempo indicado, despues de lo cual se midio la actividad residual de la amilasa utilizando un sustrato soluble. La actividad en presencia de EDTA se expresa como el % de actividad en ausencia de quelante. La Figura 22 muestra la actividad enzimatica en presencia de peroxido hidroxido. Las proteinas purificadas se incubaron a 50°C en presencia o ausencia de H2O21 M durante el tiempo indicado despues del cual se midio la actividad de amilasa utilizando almidon soluble. La actividad en presencia de peroxido hidroxido se presenta como el % de actividad en ausencia de H2O2. La Figura 23 muestra la actividad de la enzima en la solucion de ADW (agua destilada, solucion de endurecimiento, blanqueador, quelantes, surfactantes) con sustrato soluble (almidon BODIPY). Las proteinas purificadas reaccionaron con el almidon soluble a 40°C en presencia de una formulacion para lavado de ropa/ADW. Las tasas iniciales se calcularon durante 5 minutos y se expresaron como unidades fluorescentes (FU)/s por ng de proteina.

Los ejecutantes principales que surgieron de las pruebas en sustrato soluble fueron la amilasa que tienen una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 210 (codificada por la SEQ ID NO: 209) (“SEQ ID NOS: 209, 210") y la SEQ ID NOS: 211, 212. Estas amilasas, junto con las SEQ ID NOS: 440, 441, se compararon con la enzima de referencia comercial en el ensayo de lavado estandar de la industria en los portaobjetos recubiertos con almidon. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 24. La enzima que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) supero sistematicamente a la enzima de referencia purificada en esta prueba, aunque la enzima de referencia formulada mostro un mejor desempeno. La naturaleza de la formulacion comercial de referencia es desconocida, pero la enzima de referencia purificada mostro un aumento doble de la actividad en presencia de albumina de suero bovino (BSA). La Figura 24 muestra los resultados de las pruebas de lavado con portaobjetos recubiertos con almidon. Las proteinas purificadas se incubaron con portaobjetos a 50°C durante 30 minutos en presencia de una solucion de ADW (agua destilada, solucion de endurecimiento acuosa, blanqueador, quelantes, surfactantes). La eliminacion del almidon se midio comparando la perdida de peso despues del tratamiento con enzimas con el peso inicial del portaobjetos.

Resumen de la caracterizacion de las amilasas que sirven como ejemplo

El gen que codifica la amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) (“SEQ ID NOS: 211, 212") se aislo de una biblioteca ambiental recopilada de un biotopo con un pH de 11,0 y una temperatura de 41°C. La amilasa codificada por este gen pertenece a la familia I y no contiene ningun dominio de enlace de almidon/carbohidrato conocido. La proteina se ha expresado con y sin una etiqueta de histidina C-terminal, y en un huesped no glicosilante y glicosilante. La enzima expresada en todas estas combinaciones de etiquetas Huesped/His tiene un pH optimo alrededor de 10 y una temperatura optima alrededor de 50°C (experimentos representados por las Figuras 19 y 20). La enzima expresada en el huesped de glicosilacion con una etiqueta His se uso para los experimentos representados por las Figuras 21 a 24. La presencia de la etiqueta His no parece afectar la actividad especifica, sin embargo, la glicosilacion parece dar como resultado una actividad especifica ligeramente mas baja que la que no tiene glicosilacion.

En resumen:

• El mejor desempeno en estos ensayos de aplicacion fue la amilasa que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) ("SEQ ID NOS: 211,212").

• Los valores optimos de pH y temperatura de las SEQ ID NOS: 211,212 cumplen con los requisitos para aplicaciones de lavado de ropa/ADW y las SEQ ID NOS: 211,212, con una formulacion adecuada, deben exceder el rendimiento de la enzima de referencia comercial.

Ejemplo 16: Identificacion y caracterizacion de una glucoamilasa termoestable

El siguiente ejemplo describe la identificacion y caracterizacion de un ejemplo de amilasa termoestable de la divulgacion que tiene actividad de glucoamilasa.

Extraccion de acido nucleico: el hongo filamentoso Thermomyces lanuginosus ATCC 200065 se cultivo en cultivo liquido en medio de dextrosa de patata (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ). Se recogio biomasa y se aislo ADN genomico de alto peso molecular utilizando el kit Maxi de plantas DNEASYMR (DNeasy) (Qiagen, Valencia, CA) utilizando protocolos estandar. El ARN total tambien se aislo utilizando el Kit Mini de Plantas RNEASYMR (RNeasy) (Qiagen) usando protocolos estandar.

Construccion de la biblioteca: el ADN genomico de Thermomyces fue parcialmente digerido con enzimas de restriccion y los fragmentos entre 1-10 kb se purificaron para la construccion de una biblioteca del genoma. Los fragmentos se ligaron en el vector Lambda Zap ExpressMR (Stratagene, San Diego, CA) y se empacaron en fagos infectables de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Seleccion de la biblioteca: la biblioteca lambda anterior se uso para infectar celulas XL1 Blue MRF' (Stratagene) en agar de superficie. Se agregaron aproximadamente 50.000 pfu de fagos a 600 pL de celulas OD600 = 1. La mezcla se incubo a 37°C durante 15 minutos en un bano de agua y luego se anadio a 6 mL de agar de superficie al 0,7% fundido y se coloco en placas de agar NZY. La placa se incubo luego durante la noche a 39°C. Se coloco un circulo de nailon (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea Suiza) sobre el cesped de colonias resultantes y se levanto con una parte del fago adherido al nailon. El nailon se sumergio en NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante 2 minutos, NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M a pH 7,6 durante 5 minutos y 2X SSC, Tris 0,2 M a pH 7,6 durante 30 segundos. El filtro de nailon se entrecruzo luego por UV en un entrecruzador Stratagene.

Se genero un fragmento de PCR de 639 pb del gen de glucoamilasa de Aspergillus niger a partir del ADN genomico de Aspergillus para uso como sonda. Los cebadores (5'-GCGACCTTGGa Tt CATGGTTGa Gc AAC-3') (SEQ ID NO: 595) y 5'-CACAATAGAGACGAAGCCATCGGCGAA-3') (SEQ ID NO: 596) se usaron en la reaccion de PCr que utilizo el kit de PCR Expand High FidelityMR (Roche) utilizando 30 ciclos de 95°C durante 20 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto en un termociclador. Este fragmento de PCR esta compuesto por los exones 1-4 del gen de glucoamilasa de Aspergillus. El fragmento de PCR aislado se preparo como una sonda radioactiva utilizando el Kit Prime ItMR (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los filtros de la biblioteca se lavaron en una solucion de prehibridacion (DIG Easy HybMR, Roche) durante dos horas a 42°C en un horno de hibridacion (Robbins). La sonda se agrego a 15 mL de DIG Easy HybMR fresco y se uso para reemplazar la solucion de prehibridacion. El filtro se lavo con sonda durante la noche a 45°C. Luego se retiro la sonda y el filtro se lavo una vez con 2X SSC, SDS al 0,1% durante 15 minutos, y dos veces con 0,1X SSC, SDS al 0,1% durante 15 minutos cada vez. El filtro de nailon se expuso luego a una pelicula de rayos X durante la noche a -80°C. Luego del desarrollo, se utilizaron los puntos de hibridacion en la pelicula de rayos X para identificar los clones de la placa original. Se tomo un tapon de agar de la placa donde las manchas se alinearon y se suspendieron en regulador SM para liberar el fago en solucion. De este modo, se aislaron varias colonias aisladas correspondientes a fragmentos genomicos Thermomyces que contenian todo o parte del gen de la glucoamilasa.

Se anadieron 100 pL de patron de fagos aislados a 200 pL de celulas XL-1 Blue MRF' (Stratagene) y 1 pL de fago auxiliar ExAssistMR (Stratagene). La mezcla se incubo a 37°C durante 15 minutos y se agregaron 3 mL de medio 2X YT. Esto se incubo luego a 37°C con agitacion durante 2,5 horas. La mezcla se calento luego durante 20 minutos a 70°C y se enfrio en hielo. Se retiraron 100 pL de la mezcla y se anadieron a 200 pL de celulas SOLR (Stratagene) y se incubaron a 37°C durante 15 minutos. Se sembraron en placa de LB 50 pL de kanamicina (50 pg/mL) y se incubaron durante la noche a 37°C. Las colonias resultantes contienen fragmentos genomicos clonados en el plasmido pBK-CMV.

Secuenciacion: la secuenciacion de ADN en clones candidatos se realizo con el kit de secuenciacion BigDye Terminator Cycle version 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un analizador de ADN 3700 DNA AnalyzerMR (Applied Biosystems) utilizando protocolos del fabricante. Se identifico un clon genomico con un inserto de 4,1 kb que contenia todo el gen de glucoamilasa y la secuencia de flanqueo, como se expone en la SEQ ID NO: 587. Los intrones potenciales se identificaron al comparar esta secuencia con las secuencias de consenso para los intrones en Aspergillus. La secuencia de nucleotidos de Thermomyces lanuginosus tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteina de 617 aminoacidos, interrumpida por cuatro intrones de 64 pb, 61 pb, 80 pb y 57 pb respectivamente.

Sintesis de ADNc: los cebadores 5'-ATGTTATTCCAACCGACTTTGTGCGC-3' (SEQ ID NO: 597) y 5'-TCATCGCCACCAAGAATTCACGGTG-3' (SEQ ID NO: 598) se utilizaron en una reaccion de sintesis de ADNc usando un kit de RT-PCR ThermoscriptMR (Invitrogen) utilizando los protocolos del fabricante. La plantilla para la sintesis era ARN total aislado de celulas de Thermomyces lanuginosus que se cultivaron en medio de dextrosa de patata (Difco). Se aislo un fragmento de 1854 pb de la reaccion, se clono y se secuencio, con la secuencia de acido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 593.

Clonacion de la expresion: los cebadores se disenaron para la sobreexpresion de la glucoamilasa de Thermomyces en el huesped Pichia pastoris. Los cebadores 5'-GTCTCGAGAAAAGAGCAACGGGCTCGCTCGAC-3' (SEQ ID NO: 599) y 5'-GTTCTAGATCATCGCCACCAAGAATTCACGGT-3' (SEQ ID NO: 600) se utilizaron para generar un fragmento de PCR utilizando el clon de ADNc como una plantilla usando 30 ciclos de 95°C durante 20 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 2 minutos, utilizando el kit de PCR Expand High FidelityMR (Roche) y los protocolos del fabricante. El fragmento de PCR se digirio con las enzimas de restriccion Xho I y Xba I y se ligo en los sitios de restriccion correspondientes del plasmido pPIC Z alfa (Invitrogen). El constructo se transformo en la cepa X-33 de Pichia pastoris (Invitrogen) donde el constructo se integra de manera estable en el cromosoma de Pichia. La seleccion se baso en la resistencia a la Zeocina. Este constructo se diseno de tal manera que el clon de Pichia se puede inducir con metanol para secretar la glucoamilasa madura de Thermomyces en el medio.

Se inoculo un cultivo de 1 litro del clon de expresion de Pichia con un cultivo iniciador durante la noche en BMGY y se cultivo durante la noche a 30°C en un matraz de agitacion. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion al dia siguiente y se resuspendieron en 1 litro de BMMY. Las celulas se cultivaron a 30°C en un matraz de agitacion durante 3 dias con metanol anadido hasta 0,5% final cada 24 horas. Los medios que contenian la enzima glucoamilasa expresada se recolectaron y probaron en un ensayo de actividad de glucoamilasa y se sometio a electroforesis SDS PAGE utilizando protocolos estandar para determinar el tamano de la proteina.

Se disenaron tambien cebadores para la sobreexpresion del gen de glucoamilasa de Thermomyces en Escherichia coli los cebadores (SEQ ID NO: 601) 5'-GTCCATGGCAACGGGCTCGCTCGAC-3' y (SEQ ID NO: 602) 5' GTTCTAGATCATCGCCACCAAGAATTCACGGT-3' se utilizaron para generar un producto de PCR como antes, a partir de la plantilla de ADNc. El fragmento de PCR se digirio con las enzimas de restriccion Nco I y Xba I y se ligo en los sitios de restriccion correspondientes del plasmido pSE420 (Invitrogen). El constructo se transformo en la cepa XL-1 Blue MR de Escherichia coli (Stratagene). La seleccion para el plasmido se baso en la resistencia a la ampicilina. El gen de la glucoamilasa esta bajo el control del promotor lac-z en este vector plasmidico y se induce con IPTG (isopropiltio-galactopiranosido). El constructo se diseno de tal manera que el gen de la glucoamilasa madura se expresara dentro de las celulas de Escherichia y contendra un residuo extra de metionina en el extremo N-terminal.

Ensayo estandar: se anadieron alicuotas de enzimas a una solucion de regulador 5 mM, maltooligosacaridos 3 mM (Sigma, M-3639) en un bano de agua. Se extrajeron alicuotas de 100 gL en los puntos tiempo para 200 gL de reactivo de glucosa oxidasa (Sigma, GAGO-20) y se incubaron a 37°C, 30 min. La reaccion se detuvo con la adicion de acido sulfurico 12 N y se determino la absorbancia a 540 nm. La version de longitud completa de la enzima (SEQ ID NO: 594) se probo para el pH, la temperatura y la utilizacion del sustrato. Como se indica a continuacion, los datos demostraron que el pH optimo esta alrededor de pH 5,5. Los datos demostraron que la enzima (SEQ ID NO: 8) es estable a 70°C con una rapida perdida de actividad irreversible entre 70°C y 75°C. Los datos demostraron que la enzima (SEQ ID NO: 594) hidroliza los oligosacaridos hasta maltosa, siendo la tasa de hidrolisis mayor para sacaridos mas largos. La tasa de escision de enlaces 1,6 es mucho mas lenta que 1,4 como se observa en el sustrato de panosa que tiene un enlace 1,6 en el extremo no reductor. La version del dominio catalitico parece ser menos termoestable. La enzima (SEQ ID NO: 594) tiene una buena tasa de hidrolisis a 50°C pero parece morir a 70°C.

Ensayo de actividad: la actividad enzimatica (SEQ ID NO: 594) se midio mediante la liberacion de glucosa libre a partir de un sustrato de oligodextrina. La glucosa liberada se oxido luego en una reaccion acoplada que dio como resultado un producto coloreado. Una alicuota de enzima (SEQ ID NO: 594) agregada a la solucion de regulador 5 mM, maltooligosacaridos 3 mM (Sigma, M-3639) en un bano de agua. Se extrajeron alicuotas de 100 gL en los puntos de tiempo para 200 gL de reactivo de glucosa oxidasa (Sigma, GAGO-20) y se incubaron a 37°C, 30 min. La reaccion se detuvo con la adicion de acido sulfurico 12 N y se determino la absorbancia a 540 nm. Los puntos de tiempo se graficaron para determinar la velocidad relativa de la reaccion.

Perfil de pH: Se utilizo un regulador de acetato (pH 4,0, 4,5, 5,0 y 5,4) asi como un regulador de fosfato (pH 6,2, 7,0, 8,1) en un ensayo de actividad para determinar la velocidad relativa de la glucoamilasa (SEQ ID NO: 594) a cada pH. Las tasas fueron luego graficadas, como se ilustra en la Figura 5. La enzima (SEQ ID NO: 594) parece tener una actividad maxima alrededor de pH 5,5.

Perfil de temperatura: la velocidad relativa de la enzima (SEQ ID NO: 594) a varias temperaturas (50°C, 60°C, 70°C, 80°C y 85°C) se determino en un regulador de acetato pH 5,3. Las tasas se representan en la Figura 6. La enzima (SEQ ID NO: 594) parece tener una actividad maxima a 70°C, por encima de la cual hay una rapida perdida de actividad.

Datos de estabilidad con la temperatura: se anadio enzima (SEQ ID NO: 594) a un regulador de acetato 5 mM a la temperatura indicada. Las partes alicuotas de enzima (SEQ ID NO: 594) se removieron en hielo a intervalos de 4 minutos. Las alicuotas se analizaron para determinar la actividad sobre el sustrato durante 20 minutos a 70°C, y los datos se ilustran en la Figura 7.

Utilizacion del sustrato: las dextrinas maltosa (G2), maltotriosa (G3), panosa (Pan), maltotetraosa (G4) y maltoheptaosa (G7) se sustituyeron por malto-oligosacaridos en el ensayo de actividad para probar la utilizacion del sustrato de la glucoamilasa (SEQ ID NO: 594). La tasa de liberacion de glucosa para diversos sustratos probados en regulador de acetato 5 mM, 70°C. Sustratos sometidos a prueba: maltosa, maltotriosa, panosa, maltotetraosa y maltoheptaosa, todos a 3 mM. El ensayo se represento en la Figura 8. Luego, la enzima (SEQ ID NO: 594) fue capaz de hidrolizar dextrinas de cadena lineal (enlaces 1,4) hasta maltosa con una tasa mas alta para las dextrinas mas largas. La enzima (SEQ ID NO: 594) demostro una baja actividad en los enlaces 1,6, como lo demuestra el sustrato panosa.

Ejemplo 17: Ensayo de actividad de glucoamilasa: ensayo de extremos reductores de BCA

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion, por ejemplo, mediante un ensayo de extremos reductores de BCA. La actividad de la glucoamilasa se puede determinar utilizando la siguiente metodologia.

1. Preparar 2 soluciones de sustrato, de la siguiente manera:

a) solucion de almidon soluble al 2% (patata) pH 8 disolviendo 2 g de almidon de patata en 100 mL de fosfato de sodio 100 mM pH 8).

b) solucion de almidon soluble al 2% (patata) pH 10, disolviendo 2 g de almidon de patata en 100 mL de carbonato de sodio 100 mM.

2. Preparar la Solucion A a partir de 64 mg/mL de carbonato de sodio monohidrato, 24 mg/mL de bicarbonato de sodio y 1,95 mg/mL de BCA (sal disodica de 4,4'-dicarboxi-2,2'-biquinolina (Sigma Chemical cat. # D-8284)). Agregado por encima a dH2O.

4. Preparar un reactivo de trabajo de una relacion 1:1 de soluciones A y B.

5. Preparar una solucion estandar de maltosa de maltosa 10 mM en dH2O, en donde la maltosa 10 mM se combina en almidon soluble al 2% al pH deseado hasta una concentracion final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 pM. La curva estandar se generara para cada conjunto de puntos de tiempo. Dado que la curva se determina agregando 10 pL de los estandares al reactivo de trabajo, se elabora en 0, 1,2, 3, 4, 6 nmoles de maltosa.

6. Colocar una alicuota de 1 mL de la solucion de sustrato en tubos de microcentrifuga, equilibrar hasta la temperatura deseada (5 min) en un bloque de calentamiento o en un bano de agua caliente. Anadir 50 pL de solucion de enzima en el interior de la tapa del tubo.

7. Mientras la solucion se equilibra, mezclar 5 mL de ambas soluciones A y B. Colocar alicuotas de 100 pL en una placa de PCR de 96 pozos. Colocar la placa en el hielo.

8. Despues de 5 minutos de equilibrio de temperatura, colocar la tapa en los tubos, invertir y agitar 3 veces. Inmediatamente colocar alicuotas de 10 pL en una placa como t = 0 (punto de tiempo cero). Dejar la mezcla de enzimas en el bloque de calentamiento y colocar alicuotas de 10 pL en cada punto de tiempo deseado (por ejemplo, 0, 5, 10,15, 20, 30 minutos).

9. Asegurarse que 12 pozos queden vacios (solo alicuotas de reactivos de trabajo) para la adicion de 10 pL de estandares, para la curva estandar.

10. Cuando se hayan recolectado todos los puntos de tiempo y se hayan agregado los estandares, cubrir la placa y calentar a 80°C durante 35 min. Enfriar la placa sobre hielo durante 10 min. Anadir 100 pL de H2O a todos los pozos. Mezclar y colocar alicuotas de 100 pL en una placa de 96 pozos de fondo plano y leer la absorbancia a 560 nm.

11. Poner en cero los puntos de tiempo de cada muestra contra su propio t = 0 (restar el valor promedio de A560 a t = 0 de otros valores promedio de A560). Convertir el A560(experimental) a pmoles (Dividir A560(experimentai) por la pendiente de la curva estandar (A560/pmoles). Generar una pendiente de los puntos de tiempo y los pmoles (en pmoles/min), multiplicar por 100 (ya que el valor de pmoles solamente cuenta para los 10 pL utilizados en el ensayo, no la cantidad obtenida en la reaccion de 1 mL. Para obtener la actividad especifica, divida la pendiente (en pmoles/min) por los mg de proteina. Todos los puntos deben realizarse como minimo por duplicado, siendo tres lo mejor. Dividir la concentracion de proteina (mg/mL) por cualquier dilucion para obtener los mg utilizados en el ensayo. Dividir la pendiente anterior por los mg utilizados en el ensayo para obtener una actividad especifica. Vease, por ejemplo, Wong (2000) J. Agric. Food Chem. 48: 4540-4543; Fox (1991) Anal. Biochem. 195, 93-96.

Ejemplo 18: Deteccion de la actividad de glucoamilasa

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion. La actividad de la glucoamilasa de los clones puede evaluarse mediante una serie de metodos conocidos en la tecnica. La siguiente es la metodologia general que se puede utilizar.

El numero de colonias seleccionadas, por placa, puede ser de aproximadamente 10.000 pfu. Para cada biblioteca de ADN: se pueden seleccionar aproximadamente 50.000 colonias por biblioteca aislada y 200.000 colonias por biblioteca no aislada, dependiendo del titulo de pfu para el lisado amplificado A Zap Express.

Determinacion del titulo de la biblioteca Lambda

8) pL del patron de la biblioteca amplificada Lambda Zap Express anadidos a 600 pL de celulas MRF' de E. Coli (OD600 = 1.0). Para diluir el patron de Mr F', se utiliza MgSO410 mM.

9) Incubar a 37°C durante 15 minutos.

10) T ransferir la suspension a 5-6 mL de agar de superficie NZY a 50°C y mezclar suavemente.

11) Verter inmediatamente la solucion de agar en una placa de medio NZY grande (150 mm).

12) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la placa.

13) Incubar la placa a 39°C durante 8-12 horas.

14) el numero de colonias es aproximado. Se determino el titulo de fagos para obtener 10.000 pfu/placa. Diluir una alicuota de fago de biblioteca con regulador SM si es necesario.

Seleccion del sustrato

13) Anadir Lambda Zap Express (50.000 pfu) de la biblioteca amplificada a 600 pL de celulas MRF' de E. Coli (OD600 = 1.0). Para bibliotecas que no sean para el medio ambiente, preparar 4 tubos (50.000 pfu por tubo).

14) Incubar a 37°C durante 15 minutos.

15) Mientras se incuban la suspension de fagos/celulas, se agrega 1,0 mL de sustrato de almidon rojo (1,2% p/v) a 6,0 mL de agar de superficie NZY a 50°C y se mezclan completamente. Mantener la solucion a 50°C hasta que sea necesario.

16) Transferir 1/5 (10.000 pfu) de la suspension celular a la solucion de sustrato/agar de superficie y mezclar suavemente.

17) Verter inmediatamente la solucion en una placa de medio NZY grande (150 mm).

18) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la placa.

19) Repetir los procedimientos 4-6 cuatro veces para el resto de la suspension celular (1/5 de la suspension cada vez).

20) Incubar las placas a 39°C durante 8-12 horas.

21) Observar las placas para zonas claras (halos) alrededor de las colonias.

22) Las colonias con halos se extraen del agar y se transfieren a un microtubo esteril. Una punta de pipeta de 200 pL de gran calibre funciona bien para retirar (remover) el tapon de agar que contiene la colonia deseada.

23) Los fagos se resuspenden en 500 pL de regulador SM. Se agregan 20 pL de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional.

24) La suspension de fagos pura se incuba a temperatura ambiente durante 4 horas o toda la noche antes de la siguiente etapa.

Aislamiento de clones puros

12) Se agregan 10 pL de la suspension de fagos resuspendida a 500 pL de celulas MRF' de E. Coli (OD600 = 1,0).

13) Incubar a 37°C durante 15 minutos.

14) Mientras se incuba la suspension de fagos/celulas, se agrega 1 mL del sustrato de almidon rojo (1,2% p/v) a 6,0 mL de agar de superficie NZY a 50°C y se mezcla completamente. Mantener la solucion a 50°C hasta que sea necesario.

15) Transferir la suspension celular a la solucion de agar de superficie/sustrato y mezclar suavemente.

16) Verter la solucion inmediatamente en una placa de medio NZY grande (150 mm).

17) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la placa.

18) Incubar la placa a 39°C durante 8-12 horas.

19) Observar las placas para zonas claras (halo) alrededor de una colonia unica (clon puro). Si no se puede aislar una sola colonia, ajustar el titulo y sembrar nuevamente en placa la suspension de fagos.

20) La colonia unica con halo se remueve del agar y se transfiere a un microtubo esteril. Una punta de pipeta de 200 pL de gran calibre funciona bien para retirar (remover) el tapon de agar que contiene la colonia deseada. Para amplificar el titulo, remover 5 colonias activas individuales en un microtubo.

21) Los fagos se resuspenden en 500 pL de regulador SM. Se agregan 20 pL de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional.

22) Se incuba la suspension de fagos pura a temperatura ambiente durante 4 horas o toda la noche antes de la siguiente etapa. La suspension de fagos pura se almacena a -80°C agregando DMSO a la suspension de fagos (7% v/v).

Excision del clon puro.

17) Se agregan 100 pL de suspension de fago puro a 200 pL a celulas MRF' de E. Coli (OD600 = 1.0). A esta, se agrega 1,0 pL del fago auxiliar ExAssist (> 1 x 106 pfu/mL; Stratagene). Usar el tubo Falcon 2059 para la excision. 18) La suspension se incuba a 37°C durante 15 minutos.

19) Se agregan 3,0 mL de 2 x YT media a la suspension celular.

20) Incubar a 30°C durante al menos 6 horas o toda la noche mientras se agita.

21) Transferir el tubo a 70°C durante 20 minutos. La suspension de fagemidos se puede almacenar a 4°C durante 1 a 2 meses.

22) 100 pL de suspension de fagemidos transferidos a un microtubo que contiene 200 pL de celulas Exp 505 de E. coli (OD600 = 1,0).

23) Incubar la suspension a 37°C durante 15 minutos.

24) Agregar 300 pL de SOB a la suspension.

25) Incubar la suspension a 37°C durante 30 a 45 minutos.

26) Transferir 100 pL de suspension a una placa de medio LB pequena (90 mm) que contiene Kanamicina (medio LB con Kanamicina 50 pg/mL) para bibliotecas de ADN Zap Express o Ampicilina (medio LB con kanamicina 100 pg/mL) para bibliotecas de ADN de Zap II.

27) Transferir el resto de la suspension a otra placa de medio LB pequena.

28) Usar perlas de vidrio esteriles para distribuir uniformemente la suspension en la placa.

29) Incubar las placas a 30°C durante 12 a 24 horas.

30) Observar las colonias en las placas.

31) Inocular una colonia unica en medio liquido LB que contenga antibioticos adecuados e incubar a 30°C durante 12 a 24 horas.

32) El patron de glicerol se puede preparar agregando glicerol al 80% en cultivo liquido (15% v/v) y almacenar a -80°C. Verificacion de actividad

7) Transferir 50 pL de cultivo liquido a un microtubo. Agregar 500 pL de Amilopectina Azure al 8% de pH7 en el mismo tubo. Preparar 2 tubos para cada clon.

8) Probar la actividad a 50°C durante 3 horas y durante la noche. Utilizar un regulador de pH 7 como control.

9) Enfriar la muestra de prueba en un bano de agua con hielo durante 5 minutos.

10) Agregar 750 pL de etanol y mezclar bien.

11) Centrifugar a 13.000 rpm (16.000 g) durante 5 minutos.

12) Medir el OD del sobrenadante a 595nm.

Analisis de RFLP

13) Transferir 1,0 mL de cultivo liquido a un microtubo esteril.

14) Centrifugar a 13.200 rpm (16.000 g) durante 1 minuto.

15) Desechar el sobrenadante. Agregar otro 1,0 mL de cultivo liquido en el mismo microtubo esteril.

16) Centrifugar a 13.200 rpm (16.000 g) durante 1 minuto.

17) Desechar el sobrenadante.

18) Seguir el protocolo del kit mini de centrifugacion QIAprep para el aislamiento del plasmido.

19) Verificar la concentracion de ADN usando BioPhotometer.

20) Usar Sac I y Kpn I para la primera digestion doble. Incubar a 37°C durante 1 hora.

21) Usar Pst I y Xho I para la segunda digestion doble. Incubar a 37°C durante 1 hora.

22) Anadir el colorante de carga en la muestra digerida.

23) Correr la muestra digerida en un gel de agarosa al 1,0% durante 1-1,5 horas a 120 voltios.

24) Ver el gel con el formador de imagenes en gel. Todos los clones con un patron de digestion diferente se enviaran para el analisis de secuencia.

Ejemplo 19: Ensayo para glucoamilasas

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de metodo para determinar si un polipeptido esta dentro del alcance de la invencion.

Preparacion de cultivos huesped

5. Iniciar un cultivo durante la noche de celulas huesped XL1 -Blue MRF'. Usar una sola colonia de una placa sembrada en estrias para inocular 10 mL de LB suplementado con 20 pg/mL de tetraciclina. Cultivar por la noche el cultivo agitando a 37°C durante al menos 16 horas.

6. Usar la tecnica aseptica, para inocular 100 mL de cultivo fresco del dia LBTet con el huesped XL1-Blue MRF' del cultivo LBTet durante la noche.

7. Cultivar en un agitador a 37°C hasta que la OD alcance 0,75 - 1,0.

8. Precipitar las celulas huesped a 1000 x g durante 10 minutos y resuspender suavemente en MgSO410 mM a OD5.

9. Diluir una pequena cantidad de celulas huesped hasta OD1 para utilizarlas en titulacion y pipeteo.

10. Las preparaciones de huesped se pueden usar por hasta 1 semana cuando se almacenan en hielo o a 4°C. - Para acortar el tiempo de crecimiento para el cultivo de dia, usar 12X, la concentracion habitual de Tet en LB (12X = 10 pg/mL), u omitir el antibiotico por completo.

Titulacion de bibliotecas lambda

11. Colocar tres tubos de microcentrifuga esteriles en un estante.

12. Colocar alicuotas de 995 pL de celulas huesped preparadas en un tubo y 45 pL de celulas huesped OD1 preparadas en cada uno de los dos tubos restantes.

13. Agregar 5 pL de la biblioteca lambda al tubo que contiene 995 pL de celulas huesped y mezclar mediante agitacion tipo vortice. Esto resulta en un factor de dilucion de 200.

14. Preparar diluciones de 1/2.000 y 1/20.000 agregando consecutivamente 5 pL de la dilucion previa a los dos tubos restantes que contienen 45 pL de celulas huesped preparadas. Mezclar mediante agitacion tipo vortice despues de cada dilucion.

15. Permitir que los fagos se adsorban al huesped incubandolos a 37°C durante 15 minutos.

16. Mientras tanto, pipetear 100 pL de celulas huesped OD1 preparadas en cada uno de los tres tubos Falcon 2059.

17. Agregar 5 pL de cada dilucion a un tubo 2059 separado que contiene celulas huesped.

18. Sembrar en placa cada uno agregando 3 mL de agar de superficie a cada tubo y verter rapidamente en placas NZY de 90 mm. Asegurar una distribucion llana y uniforme antes de que el agar de superficie se endurezca.

19. Invertir las placas e incubar a 37°C durante la noche.

20. Contar las colonias y calcular el titulo del patron de la biblioteca (en unidades de formacion de placa (pfu) por pL). Seleccion de microtitulacion lambda para las glucoamilasas

Preparacion

5. Preparar una cantidad suficiente de cultivo huesped XL 1-Blue MRF', como se describio anteriormente, para la cantidad de seleccion planificada. Un cultivo de 100 mL suele ser suficiente para seleccionar 2-3 bibliotecas.

6. Autoclavar varias botellas compatibles con el dispensador QFill2. Estas son las botellas de Corning de boca ancha, de 250 mL que contienen un anillo de sellado alrededor del borde.

7. Asegurese de que haya suficiente cantidad de placas, agar de superficie, almidon BODIPY, solucion de almidon rojo, etc., disponibles para la seleccion.

8. Programar la operacion del robot el Dia 2 con un representante de Automation.

Dia 1

10. Marcar las placas de 1536 pozos (negras) con seleccion de biblioteca y el numero de placa. Las etiquetas adhesivas de tubo Tough-TagsMR, cortadas por la mitad a lo ancho, son ideales para marcar placas de 1536 pozos.

11. Calcular los volumenes de biblioteca, celulas huesped y medio NZY necesarios para la seleccion. Esto se hace facilmente con una hoja de calculo de Excel.

12. Combinar los volumenes calculados de biblioteca lambda y las celulas huesped OD5 en un frasco Corning esteril de boca ancha de 250 mL (que contiene un anillo de sellado).

13. Permitir que ocurra la adsorcion a 37°C durante 15 minutos.

14. Agregar el volumen calculado de medio NZY y mezclar bien. Esto se conoce como la suspension de medio de fago celular.

15. Realizar un titulo concomitante combinando 50 pL de la suspension de medio de fago celular con 250 pL de celulas huesped OD1 en un tubo Falcon 2059, luego sembrar en placas con 9 mL de agar de superficie en una placa NZY de 150 mm. Incubar la placa de titulacion concomitante a 37°C durante la noche.

16. Cargar el dispensador con el resto de la suspension y disponer cada placa marcada de 1536 pozos con 4 pL por pozo. Si el dispensador deja burbujas de aire en algunos pozos, se pueden eliminar centrifugando las placas a 200 x g durante 1 minuto.

17. Agregar 0,5 gL de fago de control positivo a la posicion AD46 del pozo de al menos dos de las placas de ensayo. Utilizar un clon de lambda fuerte positivo para la amilasa para este proposito. Las versiones lambda de la SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 199 son buenas opciones para controles positivos.

18. Incubar las placas de ensayo a 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (>95%).

Dia 2

21. Contar las pfu en la placa de titulacion concomitante y determinar la densidad promedio de semillas por pozo (en pfu por pozo).

22. Pipetear al menos 2 placas de cada seleccion de biblioteca (preferiblemente las 2 que contienen controles positivos) de la siguiente manera:

a) Preparar 2 placas de alta densidad huesped para que actuen como una superficie sobre la cual pipetear: combinar 250 gL de celulas huesped OD1 con 2 mL de almidon rojo al 2% y sembrar en placa con 9 mL de agar de superficie en placas NZY de 150 mm. Sostener cada placa lo mas nivelada posible, ya que el agar de superficie se solidifica para producir un tono rojo uniforme en toda la placa.

23. Preparar el regulador de sustrato de almidon 2X BODIPY de la siguiente manera:

a) Calcular el volumen total de solucion de regulador de sustrato 2X necesaria para todas las placas de seleccion con 4 gL por pozo (incluido cualquier volumen de espacio muerto adicional requerido por el dispensador) y medir esta cantidad de CAPS 100 mM pH 10,4 en un recipiente apropiado para el dispensador utilizado.

b) Recuperar suficientes tubos de 0,5 mg de almidon BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en la etapa a) anterior] a una concentracion final de 20-30 gg/mL.

c) Disolver cada tubo de 0,5 mg en 50 gL de DMSO a temperatura ambiente, protegido de la luz, con agitacion tipo vortice frecuente. Esto lleva mas de 15 minutos; algunos lotes de produccion de almidon BODIPY se disuelven mejor que otros.

d) Agregar 50 gL de regulador CAPS 100 mM pH 10,4 a cada tubo y mezclar mediante agitacion tipo vortice. e) Reunir el contenido de todos los tubos y eliminar los agregados no disueltos centrifugando durante 1 minuto a velocidad maxima en una microcentrifuga.

24. Llevar las placas y el regulador de sustrato a la sala de automatizacion y programar el robot con los siguientes parametros:

a) dispensar 4 gL de regulador de sustrato por pozo

c) filtro de excitacion: 485 nm; filtro de emision: 535 nm

Dia 3

4. Revisar las placas pipeteadas en busca de claros en el cesped bacteriano en todas las posiciones correspondientes a los pozos en la placa de ensayo asociada. Tambien revisar los claros en el almidon rojo en cualquiera de las posiciones de las puntas. Si se utilizaron placas con controles positivos para el pipeteo, deberia poder observarse una gran zona clara en el fondo rojo. Tenga cuidado con los contaminantes que tambien forman zonas claras en el almidon rojo (vease el comentario "Contaminants That Form Clearing Zones in Red Starch" al final del Ejemplo 7).

5. Identificar los aciertos putativos del archivo de datos producido por el ordenador del robot. El programa KANAL producido por Engineering simplifica el analisis de datos. Como regla general, un acierto putativo se caracteriza como un pozo que tiene una intensidad de senal que aumenta al menos 1,5 veces sobre el fondo.

6. Para cada putativo, retire 2 pL del pozo y anadalo a un tubo que contenga 500 pL de regulador SM y 50 pL de CHCl3. Agitar en forma de vortice para mezclar y almacenar a 4°C. Esta solucion se denominara en adelante como el stock 4e-3. Las placas de seleccion originales deben almacenarse a 4°C, protegidas de la luz, al menos hasta que se hayan completado los desgloses.

25. En un tubo conico esteril de 50 mL, combinar 0,5 mL de celulas huesped OD5 con 45,5 mL de NZY. Esto se denominara como la suspension del medio huesped.

26. Para cada acierto putativo que se analiza, colocar alicuotas de 1 mL de medio huesped en cada uno de los tres tubos de microcentrifuga esteriles.

27. Configurar el pipeteador manual de 12 canales en modo de dispensacion multiple con un tamano de alicuota de 20 pL y un numero de alicuota de 2x. Montar la pipeta manual con un juego limpio de puntas esteriles.

28. Verter aproximadamente 1 mL de suspension de medio huesped en un nueva cubeta de solucion esteril y cargar la pipeta manual multicanal.

29. Dispensar 20 pL por pozo en la ultima fila (fila P) de una placa negra de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos). Esta fila se usara mas adelante para los controles.

30. Expulsar el liquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie de la cubeta y presionar el boton REINICIO en el pipeteador manual. Colocar el pipeteador manual de manera que se evite la contaminacion de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto.

31. Verter el resto del fluido en la cubeta en un contenedor de desechos (como un vaso de precipitados) teniendo cuidado de evitar la contaminacion por salpicaduras.

32. Para el primer putativo que se analizara, tomar 111 pL del patron 4e-3 (vease el Dia 2 en la Seleccion de microtitulacion lambda para amilasas) y agregar al primero en un conjunto de tres tubos que contienen 1 mL de suspension de medio huesped (etapa 2). Agitacion tipo vortice para mezcla. Esta es la dilucion A.

33. Tomar 111 pL de Dilucion A y agregar al siguiente tubo del conjunto. Agitacion tipo vortice para mezclar. Esta es la dilucion B.

34. Tomar 111 pL de Dilucion B y agregar al ultimo tubo del conjunto. Agitacion tipo vortice para mezclar. Esta es la dilucion C. Ahora deben tenerse tres diluciones de fagos, en donde las concentraciones de cada una difieren en un factor de 10.

35. Verter los contenidos de la dilucion C (la mas diluida de las 3 muestras) en la cubeta de la solucion y cargar la pipeta manual multicanal.

36. Dispensar 20 pL por pozo en la primera fila de la placa de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos).

37. Expulsar el liquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie de la cubeta y presionando el boton REINICIO en la pipeta manual. Colocar el pipeteador manual de manera que se evite la contaminacion de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto.

38. Vaciar la cubeta como se describio anteriormente.

39. Verter el contenido de Dilucion B en la misma cubeta y cargar la pipeta manual multicanal.

40. Dispensar 20 pL por pozo en la segunda fila de la placa de 384 pozos.

41. Realizar las etapas 13-16 de manera similar para dispensar la dilucion A en la tercera fila de la placa.

42. Despues de que las tres diluciones se hayan distribuido en las primeras 3 filas de la placa, desechar todas las puntas y la cubeta de la solucion en el contenedor de desechos de riesgo biologico.

43. Monta el pipeteador manual con un juego limpio de puntas esteriles y abrir una nueva cubeta de solucion esteril.

44. Repetir las etapas 8-19 para cada acierto putativo restante, utilizando las filas restantes en la placa hasta la fila O. Se pueden analizar cinco aciertos putativos en una placa de 384 pozos, con la ultima fila (fila P) reservada para los controles.

45. Agregar 0,5 pL de cada control a un pozo separado. Usar al menos 2-3 controles separados, preferiblemente que cubran un intervalo de actividad.

46. Incubar las placas de ensayo a 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (>95%).

Dia 2

47. Pipetear todas las placas con desprendimiento sobre un cesped huesped con almidon rojo usando el mismo metodo descrito para el Dia 2 en la Seleccion de microtitulacion lambda para las amilasas, excepto porque se utiliza un pipeteador de 384 posiciones.

48. Preparar el regulador de sustrato de almidon BODIPY 2X de la siguiente manera:

49. Dispensar 20 pL por pozo en todas las placas con desprendimiento.

50. Envolver todas las placas en papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 6 horas.

51. Leer cada placa en el Spectrafluor con la siguiente configuracion:

b) definicion de la placa: negra de 384 pozos

c) leer desde la parte superior

d) ganancia optima

e) numero de destellos: 3

52. En la hoja de calculo de Excel resultante, trazar las 3 filas de cada putativo en un grafico separado y verificar la actividad. Asegurese de que los controles positivos produzcan senales sobre el fondo.

53. Para cada putativo que parece tener una senal real entre los pozos, recolectar una muestra de un pozo positivo de la siguiente manera:

b) Transferir 2 pL desde ese pozo a un tubo que contiene 500 pL de SM y 50 pL de CHCh. Esto se conoce como el patron de desprendimiento.

c) Almacenar a 4°C.

54. Usando los metodos descritos anteriormente, sembrar en placa aproximadamente 10 pL de cada patron de desprendimiento en placas NZY de 150 mm con almidon rojo. El objetivo es obtener varias (al menos 20) colonias bien separadas de las cuales se pueden remover los aislamientos.

Dia 3

55. Verificar que las placas pipeteadas tengan una incidencia aceptable de claros en el cesped bacteriano correspondiente a los pozos en la placa de ensayo asociada. Tambien revisar los claros en el almidon rojo en los controles positivos y en los putativos probados. Tener cuidado con los contaminantes que tambien forman zonas claras en el almidon rojo (ver mas abajo).

56. A partir de las placas de fase solida que contienen diluciones de los patrones de desprendimiento, remover varias colonias aisladas, cada una en 500 pL de SM con 50 pL de CHCh. Esto se conoce como el patron aislado.

57. Los patrones aislados se pueden probar individualmente con almidon BODIPY utilizando los metodos descritos anteriormente. Esta etapa se puede omitir si la colonia que se removio en la etapa 2 produjo una zona clara en el fondo de almidon rojo. Los patrones aislados se probaron individualmente en almidon BODIPY utilizando los metodos descritos anteriormente. Sin embargo, esta etapa se puede omitir si la colonia que se removio en la etapa 2 produjo una zona clara en el fondo de almidon rojo.

Excisiones

Dia 1

58. En un tubo Falcon 2059, mezclar 200 pL de huesped OD1 XL1 -Blue MRF ', 100 pL de patron aislado lambda y 1 pL de patron de fago ExAssist.

59. Incubar en un agitador a 37°C durante 15 minutos.

60. Anadir 3 mL de medio NZY.

61. Incubar en un agitador a 30°C durante la noche.

Dia 2

10. Calentar el tubo de escision a 70°C durante 20 minutos.

11. Centrifugar a 1000 x g durante 10 minutos.

12. En un tubo Falcon 2059, combinar 50 pL de sobrenadante con 200 pL de huesped EXP505 OD1.

13. Incubar en agitador a 37°C durante 15 minutos.

14. Anadir 300 pL de medio SOB.

15. Incubar en un agitador a 37°C durante 30-45 minutos.

16. Sembrar en placa 50 pL en una placa grande LBKan50 usando perlas de vidrio esteriles. Si las placas estan "secas", se puede agregar medio SOB adicional para ayudar a desembolsar las celulas.

17. Incubar la placa a 30°C durante al menos 24 horas.

18. Cultivar un aislado para secuenciacion y/o RFLP.

Contaminantes que forman zonas claras en almidon rojo

Ensayo utilizando RBB-almidon

Se puede agregar 75 pL de sustrato de RBB-almidon (almidon de maiz insoluble en RBB al 1% en regulador NaAc 50 mM, pH = 4,5) en cada pozo de una nueva placa de 96 pozos (fondo en V). Se pueden transferir cinco microlitros de lisado de enzimas a cada pozo con el sustrato utilizando Biomek o Zymark. Las placas se pueden sellar con cinta de sellado de aluminio y agitar brevemente en el agitador. Las placas pueden incubarse a 90°C durante 30 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 a 10 minutos. Se agregan cien microlitros de etanol al 100% a cada pozo, las placas se sellan y se agitan brevemente en el agitador. Luego, las placas se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos utilizando una centrifuga de mesa. Se transfieren 100 pL del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos (fondo plano) mediante Biomek y se lee a OD595.

Ensayo utilizando FITC-almidon

Anadir 50 pL de sustrato (FITC-almidon al 0,01% en regulador NaAc 100 mM, pH = 4,5) en cada pozo de una nueva placa de 384 pozos. Se transfieren 5 pl de lisado de enzima a cada pozo con sustrato e incube la placa a temperatura ambiente durante la noche. El cambio de polarizacion del sustrato, excitacion 485 nm, emision 535 nm, se lee para cada pozo. Se pueden usar placas de 96 pozos para todos los ensayos.

Ejemplo 20: Ejemplo de protocolo para licuar almidon y medir resultados

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de protocolo para licuar almidon. Condiciones de reaccion: PO4100 mM pH 6,5, almidon licuado al 1% (p/p) de DE 12 a 55°C. Se pueden realizar ensayos de TLC y HPLC para verificar la actividad.

Un ejemplo de protocolo para la sacarificacion de almidon licuado a pH 6,5:

• Ajustar el pH del almidon licuado al pH en el que se realizara la sacarificacion o sacarificaciones). Licuar el almidon en regulador de acetato de sodio 100 mM, pH 4,5 con sales de fosfato de sodio 100 mM agregadas, de modo que antes de la sacarificacion, el pH podria ajustarse a pH 6,5.

• Pesar muestras de 5 gramos de almidon licuado en botellas taradas.

Un ejemplo para determinacion de DE:

Ejemplo de ensayo de neocuproina:

Ejemplo de analisis de HPLC:

Los perfiles de carbohidratos de sacarificacion se miden por HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-87A en forma de plata, 80°C) utilizando deteccion por indice de refraccion. La fase movil se filtra en agua Millipore utilizada a un caudal de 0,7 mL/min. Las muestras de sacarificacion se diluyen 1-10 con agua desionizada acidificada (5 gotas de HCl 6 M en 200 mL de agua desionizada) luego se filtran a traves de un filtro de jeringa de 0,45 pm. El volumen de inyeccion es de 20 pL.

Ejemplo de TLC:

Ejemplo 21: Licuefaccion de almidon utilizando glucoamilasas

Este ejemplo describe un ejemplo de metodo de la divulgacion para licuar almidon utilizando glucoamilasas de la divulgacion. El concentrado de glucoamilasa se preparo a partir de caldos de fermentacion mediante tratamiento termico, lavado de celulas, extraccion alcalina utilizando microfiltracion y ultrafiltracion (48% de rendimiento total). El concentrado de UF se neutralizo con acido acetico y se formulo con glicerol al 30% a pH 4,5. El nivel de actividad de un producto comercial puede ser aproximadamente 120 U1/g - 0,5 kg/tonelada de almidon.

Ejemplo de ensayo de actividad de glucoamilasa

Se coloco una cubeta de 1 mL que contenia 950 pL de MOPS 50 mM pH 7,0 que contenia PNP-a-D-hexa(^ 4)-glucopiranosido 5 mM en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotometro Beckman DU-7400 precalentado a 80°C. Se hizo un blanco espectrofotometrico a 405 nm y se agregaron 50 pL de la solucion de enzima a la cubeta, se mezclo bien y se controlo el aumento de la OD405nm durante un intervalo de un minuto. La tasa de AOD405nm/rnin se convirtio en una unidad estandar de pmol/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 pL de 1 pmol/mL de PNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH 7,0, 80°C. Una unidad Diversa estandar de alfa amilasa termoestable (DTAA) es igual a la cantidad de enzima que catalizara la liberacion de 1 pmol/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Ensayo estandar de actividad de glucoamilasa

Se coloco una cubeta de 1 mL que contenia 950 pL de MOPS 50 mM, pH 7,0, que contenia pNP-a-D-glucopiranosido 5 mM, en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotometro Beckman DU-7400 precalentado a 60°C. Se hizo un blanco espectrofotometrico a 405 nm y se agregaron 50 pL de la solucion de enzima a la cubeta, se mezclo bien y se controlo el aumento de la OD405nm durante un intervalo de un minuto. La tasa de AOD405nm/min se convirtio en una unidad estandar de pmoles/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 pL de 1 pmol/mL de pNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH 7,0, 60°C. Una unidad Diversa estandar de glucoamilasa (DGA) es igual a la cantidad de enzima que catalizara la liberacion de 1 pmol/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Determinacion del equivalente de dextrosa

Ensayo de neocuproina

Determinacion de almidon residual

Perfil de oligosacaridos

Cromatografia de permeacion en gel

Electroforesis capilar

Licuefaccion primaria

El almidon de linea directamente del proceso de GPC se bombea a un tanque de alimentacion de 60 litros donde el pH, DS (solidos secos) y el nivel de calcio se pueden ajustar antes de la licuefaccion. La glucoamilasa se anade a la suspension. La suspension de DS al 32% se bombea a 0,7 litros/minuto mediante una bomba de desplazamiento positivo al chorro, una camara de mezcla presurizada donde la suspension de almidon se calienta instantaneamente a mas de 100°C mediante inyeccion de vapor. El almidon licuado parcialmente gelatinizado se bombea a traves de una red de tuberias (aun bajo presion) para proporcionar el tiempo de permanencia deseado (5 minutos) a la temperatura. La presion se libera en un deposito separador y se pueden tomar muestras. Las muestras fueron tomadas por duplicado.

Licuefaccion secundaria

Sacarificacion

Los jarabes licuados producidos con cada glucoamilasa se ajustaron hasta aproximadamente pH 2,5 con HCl 6N inmediatamente despues de la licuefaccion secundaria de 90 minutos para inactivar cualquier glucoamilasa residual. Los jarabes se ajustaron luego a pH 4,5, se colocaron en un bano de agua a 60°C y se sacarificaron con tres niveles de glucoamilasa. El grado de la sacarificacion se controlo mediante HPLC en puntos de tiempo de 18-88 horas.

Ejemplo 22: Licuefaccion de almidon a pH 4,5 usando glucoamilasas

La conversion del almidon en glucosa puede catalizarse por la accion de la secuencia de dos enzimas: amilasas (por ejemplo, alfa-amilasas), incluidas las enzimas de la divulgacion, para licuar el almidon (por ejemplo, la hidrolisis de polimeros de glucosa de alto peso molecular) hasta oligosacaridos que consisten en 2 a 20 unidades de glicosa, tipicamente un equivalente de dextrosa de 10 a 12, por una glucoamilasa de la divulgacion), seguido de sacarificacion con una glucoamilasa (que puede ser una glucoamilasa de la divulgacion, por ejemplo, SEQ ID NO: 594). En un aspecto, el procesamiento se realiza en una planta de molienda humeda de maiz que produce una suspension de almidon con un pH de aproximadamente 4,0 a 4,5. En un aspecto, el pH se eleva, por ejemplo, a 5,8 a 6,0 antes de la licuefaccion para acomodar una glucoamilasa con una actividad y estabilidad de pH bajo. En un aspecto, las glucoamilasas de la divulgacion pueden licuar almidon a pH 4,5 hasta equivalentes de dextrosa que varian de 12 a 18; en un aspecto, usando glucoamilasas de la divulgacion a niveles de aproximadamente 3 a 6 gramos por tonelada de almidon. En este aspecto, el uso de glucoamilasas de la divulgacion permite que la licuefaccion de almidon se lleve a cabo a pH 4,5.

En un aspecto, la licuefaccion del almidon se realiza a pH 4,5 durante 5 minutos a 105°C a 90 minutos a 95°C utilizando glucoamilasas de la divulgacion. La cantidad de enzima se ajusta con el fin de ajustar un DE objetivo de 12 a 15 despues de la licuefaccion. En un aspecto, el almidon licuado luego se sacarifica con una glucoamilasa, por ejemplo, una glucoamilasa de Aspergillus, durante aproximadamente 48 horas a aproximadamente pH 4,5 y 60°C. Si el jarabe sacarificado no contenia al menos un 95% de glucosa, el DE de la licuefaccion objetivo se eleva y la sacarificacion se repite hasta que la licuefaccion eventualmente produjera un jarabe sacarificado que contiene mas del 95% de glucosa. La proteina glucoamilasa requerida para producir una materia prima licuada adecuada para la sacarificacion se determina mediante PAGE.

Se han descrito una serie de realizaciones de la invencion. Sin embargo, se entendera que se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del espiritu y alcance de la invencion. Por consiguiente, otras realizaciones estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un acido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 617, en la que el acido nucleico codifica un polipeptido que tiene actividad de glucano alfa maltotetrahidrolasa.

2. Un casete de expresion que comprende un acido nucleico que comprende una secuencia como se expone en la reivindicacion 1.

3. Un vector que comprende un acido nucleico que comprende una secuencia como se expone en la reivindicacion 1.

4. Un polipeptido aislado o recombinante que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 618, en el que el polipeptido tiene actividad glucano alfa maltotetrahidrolasa.

5. Un polipeptido aislado o recombinante que comprende un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4 y que carece de una secuencia senal.

6. Un polipeptido aislado o recombinante que comprende un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4 y que tiene una secuencia senal heterologa.

7. Un metodo para producir un polipeptido recombinante que comprende: (a) proporcionar un acido nucleico unido operativamente enlazado a un promotor, en el que el acido nucleico comprende una secuencia como se expone en la reivindicacion 1; y (b) expresar el acido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresion del polipeptido, produciendo asi un polipeptido recombinante.

8. Un metodo para hidrolizar un almidon que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4;

(b) proporcionar una composicion que comprende un almidon; y

(c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipeptido hidroliza al almidon.

9. Una composicion detergente que comprende un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4.

10. Un pienso o un alimento que comprende un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4.

11. Un metodo para producir un jarabe con alto contenido de maltosa o alto contenido de glucosa que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4;

(b) proporcionar una composicion que comprende un almidon; y

(c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y el almidon de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipeptido de la etapa (a) puede hidrolizar la composicion de la etapa (b), produciendo asi un jarabe con alto contenido de maltosa o un alto contenido de glucosa.

12. Un metodo para mejorar el flujo de los fluidos de produccion que contienen almidon que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4;

(b) proporcionar un fluido de produccion que comprende un almidon; y

(c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) y el fluido de produccion de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipeptido puede hidrolizar al almidon en el fluido de produccion, mejorando asi su flujo al disminuir su densidad.

13. Una composicion anti-envejecimiento que comprende un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4.

14. Un metodo para prevenir el envejecimiento de un producto horneado que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4;

(b) proporcionar una composicion usada para hornear que comprende un almidon;

(c) combinar el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipeptido puede hidrolizar el almidon en la composicion utilizada para hornear, evitando asf el envejecimiento del producto horneado.

15. El metodo como se expone en la reivindicacion 14, en el que el producto horneado es un pan o un producto de panaderfa.

16. Un metodo para elaborar cerveza o producir alcohol que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4;

(b) proporcionar una composicion usada para elaborar cerveza o en la produccion de alcohol que comprende un almidon;

(c) combinar el polipeptido de la etapa (a) con la composicion de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipeptido puede hidrolizar el almidon en la composicion utilizada para la elaboracion de cerveza o la produccion de alcohol.

17. Un fluido de perforacion de pozo petrolero que comprende un polipeptido como se expone en la reivindicacion 4.