DE60124080T2 - Verbindungen und verfahren zur behandlung der alzheimerschen krankheit - Google Patents

Verbindungen und verfahren zur behandlung der alzheimerschen krankheit Download PDF

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Description

  • RÜCKVERWEISUNG AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht die Erfindungspriorität unter 35 U.S.C §119(e) aus der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/191,528, die am 23. März 2000 eingereicht wurde.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung schafft Verbindungen und Zusammensetzungen für die Hemmung der durch δ-Secretase vermittelten Spaltung von Beta-Amyloid-Vorstufenprotein. Insbesondere betrifft die Erfindung den Einsatz von Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung zur Hemmung der Produktion von Beta-Beta-Amyloidpeptid und zur Behandlung oder Verhinderung einer durch Ablagerungen von Beta-Beta-Amyloidpeptid gekennzeichneten Erkrankung. Insbesondere schafft die Erfindung Verbindungen und Zusammensetzungen für die Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist eine degenerative Gehirnerkrankung, die sich klinisch darstellt durch fortschreitenden Verlust von Gedächtnis, Wahrnehmung, logischem Denken, Urteilsvermögen und Gemütsstabilität, der allmählich zu einem weitgehenden geistigen Abbau und schließlich zum Tode führt. Patienten mit AD zeigen charakteristische Beta-Amyloid-Ablagerungen in dem Gehirn (Beta-Amyloid-Plaques) und in Gehirnblutgefäßen (Beta-Amyloid-Angiopathie) sowie neurofibrilläre Verwicklungen. Bei der Autopsie von AD-Patienten werden diese Schädigungen im Allgemeinen in großer Zahl in Bereichen des menschlichen Gehirns gefunden, die für die Gedächtnis- und Wahrnehmungsfunktion wichtig sind. In kleineren Zahlen werden sie in den Gehirnen der meisten gealterten Menschen gefunden, die keine klinischen Symptome der AD zeigen. Beta-Amyloid-Plaques und Beta-Amyloid-Angiopathie kennzeichnet auch die Gehirne von Patienten mit Downschem Syndrom (Trisomie 21) und angeborener Cerebralhämorrhagie mit Beta-Amyloidose des Dutch-Typs und anderen solchen Krankheiten.
  • Beta-Amyloid-Plaques sind ein definierendes Merkmal der Alzheimerschen Krankheit, von denen man jetzt annimmt, dass sie eine ursächliche Vorstufe oder ein Faktor bei der Entwicklung der Krankheit sind. Beta-Amyloid-Plaques bestehen überwiegend aus Beta-Amyloid-Beta-Peptid (Aβ, auch manchmal als βA4 bezeichnet).
  • Mehrere Isotypen von APP sind bisher bekannt, darunter „normales" APP-695, APP-751 und APP770, die eine Sequenz von 695, 751 bzw. 770 Aminosäuren haben. Die Identifizierung von Mutationen in dem Beta-Amyloid-Vorstufenprotein-Gen, die familiäres frühes Einsetzen von Alzheimerscher Krankheit verursachen, implizieren einen Beta-Amyloid-Stoffwechsel in der Pathologie der Krankheit. Diese berichteten Mutationen umfassen die doppelte Schwedische Mutation (SW), bei der Lys595 und Met596 zu Asp595-Leu596 wechseln, und Mutationen, bei denen Val717 zu Gly, Ile oder Phe wechselt.
  • Aβ-Peptid leitet sich durch Proteolyse des Beta-Amyloid-Vorstufenproteins (APP) ab und besteht aus 39–42 Aminosäuren. Mehrere Proteasen, die Sekretasen genannt werden, sind bei dem Processing von APP beteiligt. Die Abscheidung von Aβ in Gehirnbereichen, die für Wahrnehmungsaktivitäten verantwortlich sind, ist ein Hauptfaktor bei der Entwicklung von AD. Eine Spaltung von APP an dem N-Terminus des βA4-Peptids durch β-Sekretase und an dem C-Terminus durch eine oder mehrere γ-Sekretasen stellt den beta-amyloidogenen Weg dar, d. h. den Weg, durch den Aβ gebildet wird. Die Spaltung von APP durch α-Sekretase und die gleiche oder eine andere γ-Sekretase bildet α-sAPP, eine sezernierte Form von APP, die keine Bildung von Beta-Amyloid-Plaque zur Folge hat. Dieser andere α-sAPP-Weg schließt die Bildung von Aβ-Peptid aus. Es wurde vorgeschlagen, dass sich Aβ als Ergebnis des Processings von APP durch β-Sekretase ansammelt, und dass daher die Hemmung der Aktivität dieses Enzyms für die Behandlung von Alzheimerscher Krankheit erwünscht ist. Das in-vivo-Processing von APP an der β-Sekretasestelle ist vermutlich der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Aβ-Produktion und ist daher ein therapeutisches Ziel für die Behandlung von AD; (siehe z. B. Sabbagh et al., 1997, Alz. Dis. Rev. 3: 1–19). Eine Beschreibung des proteo lytischen Processing von APP-Fragmenten ist z. B. zu finden in den US-Patenten Nr. 5,441,870, 5,721,130 und 5,942,400.
  • Mehrere Nachweislinien zeigen an, dass eine fortschreitende cerebrale Ablagerung bestimmter beta-amyloidogener Peptide, β-Amyloidpeptide, (Aβ) eine Samenrolle bei der Pathogenese von AD spielen und wahrnehmbaren Symptomen um Jahre oder Dekaden vorausgehen, siehe z. B. Selkoe, 1991, Neuron 6: 487. Kürzlich wurde gezeigt, dass Aβ aus in Kultur gezüchteten Nervenzellen freigesetzt wird und in cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) von normalen Patienten und Patienten mit Alzheimerscher Krankheit anwesend ist, siehe z. B. Seubert et al., 1992, Nature 359: 325–327.
  • Eine Aspartylprotease wurde als das Enzym identifiziert, das für das Processing von APP an der Stelle der β-Sekretase-Spaltung verantwortlich ist. Das β-Sekretaseenzym wurde unter unterschiedlicher Nomenklatur beschrieben, darunter BACE und Asp.; siehe z. B. Sindha et al., 1999, Nature 402: 537–554 (S. 501) und veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 00/17369 (hAsp2a und hAsp2b).
  • Gegenwärtig gibt es keine wirksamen Behandlungen zum Anhalten, Verhindern oder Umkehren des Fortschritts der Alzheimerschen Krankheit. Daher besteht ein dringender Bedarf an pharmazeutischen Mitteln, die den Fortschritt der Alzheimerschen Krankheit verlangsamen und/oder ihn in erster Linie verhindern können.
  • Verbindungen, die wirksame Hemmer von β-Sekretase sind, die die durch β-Sekretase vermittelte Spaltung von APP hemmen, wirksame Hemmer der Aβ-Produktion sind und/oder die Beta-Amyloid-Beta-Abscheidungen oder -Plaques wirksam reduzieren, werden für die Behandlung und Verhinderung von Krankheit benötigt, die wie AD durch Beta-Amyloid-Beta-Abscheidungen oder -Plaques charakterisiert sind.
  • 5-Amino-6-cyclohexyl-4-hydroxy-hexanamid-derivate sind in US 5703129 beschrieben. Es ist angegeben, dass man erwartet, dass diese Verbindungen bei der Behandlung von Patienten wirksam sind, die an Zuständen oder Krankheiten leiden oder für diese empfänglich sind, die mit Ansammlung von Beta-Amyloid-Protein im Gehirn verbunden sind.
  • SUMMARISCHER ABRISS DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung schafft Verbindungen und Zusammensetzungen zur Hemmung der durch β-Sekretase vermittelten Spaltung von Beta-Amyloid-Vorstufenprotein. Insbesondere sind die Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung wirksam zur Behandlung von Menschen, die Alzheimersche Krankheit haben, zur Unterstützung der Verhinderung oder Verzögerung des Einsetzens von Alzheimerscher Krankheit, zur Behandlung von Patienten mit geringer Wahrnehmungsbeeinträchtigung (MCI) und zur Verhinderung oder Verzögerung des Einsetzens der Alzheimerschen Krankheit bei jenen, die von MCI zur AD fortschreiten würden, zur Behandlung des Downschen Syndroms, zur Behandlung von Menschen, die angeborene Cerebralhämorrhagie mit Beta-Amyloidose des Dutch-Typs haben, zur Behandlung cerebraler Beta-Amyloid-Angiopathie und zur Verhinderung ihrer potentiellen Konsequenzen, d. h. einzelner oder wiederkehrender lobärer Blutungen, zur Behandlung anderer degenerativer Demenzen einschließlich Demenzen gemischten vasculären und degenerativen Ursprungs, von Demenz in Verbindung mit Parkinsonscher Krankheit, Demenz in Verbindung mit progressiver supranukleärer Paralyse, Demenz in Verbindung mit basaler Cortexdegeneration, diffusem Levis-Körpertyp der Alzheimerschen Krankheit.
  • Die inhibitorischen Aktivitäten der Verbindungen der Erfindung können z. B. mit einem oder mehreren Tests demonstriert werden, die hier oder im Stand der Technik beschrieben sind.
  • Nach der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung geschaffen von der Formel
    Figure 00040001
    oder ihr pharmazeutisch zulässiges Salz, in der
    R1 ist.
    • (I) C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem, zwei oder drei C1-C3-Alkyl, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH2, -C≡N, -CF3 oder -N3 substituiert ist,
    • (II) -(CH2)1-2-S-CH3,
    • (III) -CH2-CH2-S-CH3,
    • (IV) -CH2-(C2-C6-Alkenyl), das unsubstituiert oder durch ein -F substituiert ist,
    • (V) -(CH2)0-3-(R1-Aryl), worin R1-Aryl Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, Indanyl, Indenyl, Dihydronaphthyl, Tetralinyl ist, das unsubstituiert oder an dem Arylring unabhängig mit einem oder zwei C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    R2 ist:
    • (I) -H,
    • (II) C1-C6-Alkyl oder
    • (III) -(CH2)0-4-R2-1, worin R2-1 (C3-C8)Cycloalkyl, R1-Aryl ist, worin R1-Aryl wie oben definiert ist,
    RN-1 Phenyl ist, das mit einem, zwei drei oder vier R100 unabhängig substituiert ist, wobei R100 ist
    • (1) C1-C6-Alkyl,
    • (2) -F, -Cl, -Br oder -I,
    • (3) -OH,
    • (4) -NO2,
    • (5) -CO-OH,
    • (6) -C≡N,
    • (7) -CO-NRN-2RN-3, worin RN-2 und RN-3 gleich oder verschieden sind und
    • (a) -H
    • (b) -C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem -OH oder -NH2 substituiert ist,
    • (c) -C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem bis drei -F, -Cl, -Br oder -I substituiert ist,
    • (d) -C3-C7-Cycloalkyl,
    • (e) -(C1-C2-Alkyl)-(C3-C7-Cycloalkyl),
    • (f) -(C1-C6-Alkyl)-O-(C1-C3-alkyl),
    • (g) -C1-C6-Alkenyl mit einer oder zwei Doppelbindungen,
    • (h) -C1-C6-Alkynyl mit einer oder zwei Dreifachbindungen,
    • (i) -C1-C6-Alkylkette mit einer Doppelbindung und einer Dreifachbindung sind,
    • (8) -CO-(C3-C12-Alkyl),
    • (9) -CO-(C3-C6-Cycloalkyl),
    • (11) -CO-R1-Heterocyclus, worin R1-Heterocyclus Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl-S-oxid, Thiomorpholinyl-S,S-dioxid, Piperazinyl, Homopiperazinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydrapyranyl, Piperidinyl, Tetrahydrofuranyl oder Tetrahydrothiophenyl ist, worin die R1-Heterocyclus-Gruppe durch irgendein Atom der R1-Heterocyclus-Muttergruppe gebunden ist, das durch Wasserstoff substituiert ist, so dass die neue Bindung an die R1-Heteroaryl-Gruppe das Wasserstoffatom und seine Bindung ersetzt, wobei der Heterocyclus unsubstituiert oder mit einem oder zwei =O, C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    • (12) -CO-RN-4, worin RN-4 Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl oder Pyrrolidinyl ist, worin jede Gruppe unsubstituiert oder mit einem oder zwei C1-C3-Alkyl substituiert ist,
    • (13) -CO-O-RN-5, worin RN-5 ist:
    • (a) -C1-C6-Alkyl oder
    • (b) -(CH2)0-2(R1-Aryl), worin R1-Aryl wie oben definiert ist,
    • (14) -SO2-NRN-2RN-3, worin RN-2 und RN-3 wie oben definiert sind,
    • (15) -SO-(C1-C8-Alkyl),
    • (16) -SO2-(C3-C12-Alkyl),
    • (17) -NH-CO-O-RN-5, worin RN-5 wie oben definiert ist,
    • (18) -NH-CO-N(C1-C3-Alkyl)2,
    • (19) -N-CS-N(C1-C3-Alkyl)2,
    • (20) -N(C1-C3-Alkyl)-CO-RN-5, worin RN-5 wie oben definiert ist,
    • (21) -NRN-2RN-3, worin RN-2 und RN-3 gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert sind,
    • (22) -RN-4, worin RN-4 wie oben definiert ist,
    • (23) -O-CO-(C1-C6-Alkyl),
    • (24) -O-CO-N-(C1-C3-Alkyl)2,
    • (25) -O-CS-N-(C1-C3-Alkyl)2,
    • (26) -O-(C1-C6-Alkyl),
    • (27) -O-(C2-C5-Alkyl)-COOH,
    • (28) -S-(C1-C6-Alkyl),
    • (29) C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit 1, 2, 3, 4 oder 5 -F substituiert ist,
    • (30) -O-(C1-C6-Alkyl), das unsubstituiert oder mit 1, 2, 3, 4 oder 5 -F substituiert ist, oder
    • (31) -O-φ sind,
    Ra ist Wasserstoff oder C1-C6-Alkyl,
    RC ist
    • (1) RCH, wo RCH Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl-S-oxid, Thiomorpholinyl-S,S-dioxid, Piperazinyl, Homopiperazinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydropyranyl, Piperidinyl, Tetrahydrofuranyl oder Tetrahydrothiophenyl ist, von denen jedes wahlweise mit Oxo, C1-C3-Alkyl, CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    • (2) RCY, wo RCY Pyridinyl, Pyrimidinyl, Chinolinyl, Indenyl, Indanyl, Benzothiophenyl, Indolyl, Indolinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Isoindolyl, Isochinolyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Phthalazinyl, Iidazolyl, Isoxazolyl, Pyrazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Indolizinyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzimidazolyl, Benzofuranyl, Furanyl, Thienyl, Pyrrolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, 1,4-Benzodioxanyl, Purinyl, Oxazolopyridinyl, Imidazopyridinyl, Isothiazolyl, Naphthyridinyl, Cinnolinyl, Carbazolyl, β-Carbolinyl, Isochromanyl, Chromanyl, Furanzanyl, Tetrahydroisochinolin, Isoindolinyl, Isobenzotetrahydrofuranyl, Isobenzotetrahydrothienyl, Isobenzothiophenyl, Benzoxazolyl oder Pyridopyridinyl ist, von denen jedes wahlweise mit C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br oder -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    • (3) -(C1-C10)Alkyl-RCH,
    • (4) -(C1-C10)Alkyl-RCY oder
    • (5) -(C1-C10)Alkyl-K1-3, worin
    • (A) die Alkylkette unsubstituiert oder mit einem -OH substituiert ist,
    • (B) die Alkylkette unsubstituiert oder mit einem C1-C6-Alkoxy substituiert ist, das unsubstituiert oder mit 1–5 -F substituiert ist,
    • (D) die Alkylkette unsubstituiert oder mit 1–5 -F substituiert ist,
    • (F) jedes K ist:
    • (1) H,
    • (2) C1-C3-Alkyl,
    • (3) C1-C3-Alkoxy,
    • (4) C1-C3-Alkylthioxy,
    • (5) C1-C6-Alkylacylamino,
    • (6) C1-C6-Alkylacyloxy,
    • (7) Amido,
    • (8) C1-C6-Alkylamino,
    • (9) Phenylamino,
    • (10) Carbamyl,
    • (11) Carboxyl,
    • (12) Carboxy(C2-C5)alkoxy,
    • (13) Carboxy(C2-C5)alkylthioxy,
    • (16) Amino, das unsubstituiert oder mit (C1-C6)-Alkyl substituiert ist,
    • (17) Hydroxyl oder
    • (18) Carboxymethylester.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei einer Methode zur Behandlung eines Patienten mit einer Krankheit oder einem Zustand oder zur Verhinderung, dass der Patient eine Krankheit oder einen Zustand bekommt, die bzw. der ausgewählt ist unter Alzheimerscher Krankheit, schwacher Wahrnehmungsbeeinträchtigung, Downschem Syndrom, angeborener Cerebralhämorrhagie mit Amyloidose des Dutch-Typs, cerebraler Amyloid-Angiopathie, degenerativer Demenz, diffuser Lewy-Körpertyp der Alzheimerschen Krankheit oder zentralen oder peripheren Amyloid-Erkrankungen, wobei der Patient einer solchen Behandlung bedarf.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Anwendung der oben definierten Verbindung und ihrer pharmazeutisch zulässigen Salze für die Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung oder Verhinderung der Alzheimerschen Krankheit.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DES VERFAHRENS ZUR HERSTELLUNG DER VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung schafft Hydroxyethylen-Verbindungen, die zur Behandlung und Verhinderung der Alzheimerschen Krankheit nützlich sind. Die Anti-Alzheimer-Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch den Fachleuten gut bekannte Verfahren aus den Fachleuten bekannten Ausgangsverbindungen hergestellt. Die Verfahrenschemie ist den Fachleuten gut bekannt. Das geläufigste Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird in Tafel A definitionsgemäß angegeben. Während das Verfahren unter Bezugnahme auf einige Verbindungen beschrieben wird, die nicht unter den Umfang der Ansprüche fallen, wird die Diskussion hier so gehalten, dass das Verständnis des Verfahrens weiter erleichtert wird.
  • Die Chemie ist kompliziert und beinhaltet summarisch die Stufen des N-Schutzes eines Aminosäure(I)-Ausgangsmaterials zur Herstellung der entsprechenden geschützten Aminosäure (II), Aminodehydroxylierung der geschützten Aminosäure (II) mit dem geeigneten Amin in Gegenwart eines Kupplungsmittels, um das entsprechende geschützte Amid (III) herzustellen, Reduktion des geschützten Amids zu dem entsprechenden Aldehyd (IV), Bildung des endständigen Olefins wie beschrieben (V), Persäureepoxidierung des Olefins (V), um das entsprechende Epoxid (VI) herzustellen, Öffnung des Epoxids (VI) mit einem Amid (VII), um den entsprechenden geschützten Alkohol (VIII) herzustellen, Cyclisierung des geschützten Alkohols (VIII), um das geschützte Lacton (IX) herzustellen, aus dem dann die Stickstoff-Schutzgruppe entfernt wird, um das entsprechende Amin (X) herzustellen, das dann mit einem amidbildenden Mittel von z. B. der Formel (RN-1-XN)2O oder RN-1-XN-X2 oder RN-1-XN-OH umgesetzt wird, um das Lacton (XI) herzustellen, Öffnung des Lactons (XI) mit einem C-endständigen Amin RC-NH2, um die Anti-Alzheimer-Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung herzustellen. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Reaktionen alle in der organischen Chemie gut bekannt sind. Ein in der Technik versierter Chemiker, der die chemische Struktur der biologisch aktiven Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung kennt, wäre in der Lage, diese Verbindungen ohne jede weitere Information nach bekannten Verfahren aus bekannten Ausgangsstoffen herzustellen. Die Erläuterung weiter unten ist daher nicht nötig, sondern wird als hilfreich für die Fachleute erachtet, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung herzustellen wünschen.
  • Das Gerüst der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist eine Hydroxyethylen-Molekülgruppe. Sie kann leicht nach Verfahren hergestellt werden, die in der Literatur beschrieben und den Fachleuten bekannt sind; z. B. Henning, R. „Synthetische Wege zu verschiedenen Klassen von Naturprodukten und ihren Analogen. Synthese isosterischer Hydroxyethylen-Dipeptide", in Organic Synthesis Highlights II; VCH: Weinheim, Deutschland, 1995; S. 251–259, wo Verfahren zur Herstellung von Verbindungen des Hydroxyethylentyps beschrieben sind.
  • TAFEL A, wie sie hier bezeichnet ist, gibt ein bei der vorliegenden Erfindung benutztes allgemeines Verfahren zur Herstellung der geeignet substituierten Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung an. Die Anti-Alzheimer-Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden ausgehend von der entsprechenden Aminosäure (I) hergestellt. Die Aminosäuren (I) sind den Fachleuten bekannt oder können leicht aus bekannten Verbindungen durch in der Fachwelt bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben wenigstens drei enantiomere Zentren, die acht Enantiomere ergeben, wobei die S,S,R-Stereochemie bevorzugt wird. Das erste dieser enantiomeren Zentren leitet sich von dem Aminosäure-Ausgangsmaterial (I) ab. Bevorzugt erhält oder produziert man kommerziell das gewünschte Enantiomer (S) anstatt eines enantiomerisch unreinen Gemisches, aus dem man dann das gewünschte Enantiomer (S) abtrennen muss. Vorzugsweise beginnt man das Verfahren mit enantiomerisch reiner (S)-Aminosäure (I) der gleichen Konfiguration wie der des Hydroxyethylen-Produkts. Für die Aminosäuren (I) ist R1:
    • (I) C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem, zwei oder drei C1-C3-Alkyl, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH2, -C≡N, -CF3 oder -N3 substituiert ist,
    • (II) -(CH2)1-2-S-CH3,
    • (III) -CH2-CH2-S-CH3,
    • (IV) -CH2-(C2-C6-Alkenyl), das unsubstituiert oder durch ein -F substituiert ist,
    • (V) -(CH2)0-3-(R1-Aryl), worin R1-Aryl Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, Indanyl, Indenyl, Dihydronaphthyl, Tetralinyl ist, das unsubstituiert oder unabhängig an dem Arylring mit einem oder zwei C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist.
  • Die erste Stufe des Verfahrens besteht darin, die freie Aminogruppe der (S)-Aminosäure (I) nach dem Fachmann bekannten Verfahren mit einer Amino-Schutzgruppe zu schützen, um die (S)-geschützte Aminosäure (II) herzustellen. Amino-Schutzgruppen sind den Fachleuten bekannt, siehe z. B. „Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, N. Y., 2. Auflage, 1991, Kapitel 7; „Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N. Y., 1973, Kapitel 2. Die Funktion der Amino-Schutzgruppe besteht darin, die freie Aminofunktion (-NH2) während der folgenden Reaktionen mit der (S)-Aminosäure (I) zu schützen, die nicht gut verlaufen würden, weil die Aminogruppen reagieren und in einer Weise funktionalisiert würden, die nicht im Einklang mit der Notwendigkeit ist, für nachfolgende Reaktionen frei zu sein, oder weil die freie Aminogruppe bei der Reaktion stören würde. Wenn die Amino-Schutzgruppe nicht länger benötigt wird, wird sie durch den Fachleuten bekannte Verfahren entfernt. Nach Definition muss die Amino-Schutzgruppe durch den Fachleuten bekannte Verfahren leicht entfernbar sein, wie den Fachleuten bekannt ist. Geeignete Amino-Schutzgruppen sind t-Butoxy-carbonyl, Benzyloxycarbonyl, Formyl, Trityl, Phthalimido, Trichloroacetyl, Chloroacetyl, Bromoacetyl, Iodoacetyl, 4-Phenylbenzyloxycarbonyl, 2-Methylbenzyloxycarbonyl, 4-Ethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Fluorobenzyloxycarbonyl, 4-Chlorobenzyloxycarbonyl, 3-Chlorobenzyloxycarbonyl, 2-Chlorobenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorobenzyloxycarbonyl, 4-Bromobenzyloxycarbonyl, 3-Bromobenzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Cyanobenzyloxycarbonyl, 2-(4-Xenyl)isopropoxycarbonyl, 1,1-Diphenyleth-1-yloxycarbonyl, 1,1-Diphenylprop-1-yloxycarbonyl, 2-Phenylprop-2-yloxycarbonyl, 2-(p-toluyl)prop-2-yloxycarbonyl, Cyclopentanyloxycarbonyl, 1-Methylcyclopentanyloxycarbonyl, Cyclohexanyloxycarbonyl, 1-Methylcyclohexanyloxycarbonyl, 2-Methylcyclohexanyloxycarbonyl, 2-(4-Toluylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(Methylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(Triphenylphosphino)ethoxycarbonyl, Flurenylmethoxycarbonyl, 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 1-(Trimethylsilylmethyl)prop-1-enyloxycarbonyl, 5-Benzisoxazoylmethoxycarbonyl, 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichloroethoxycarbonyl, 2-Ethynyl-2-propoxycarbonyl, Cyclopropylmethoxycarbonyl, 4-(Decyloxyl)-benzyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, -Phenyl-C(=N)-H und 1-Piperidyloxycarbonyl. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe t-Butoxycarbonyl (BOC) und Benzyloxycarbonyl (CBZ); bevorzugter ist es, dass die Schutzgruppe t-Butoxycarbonyl ist. Der Fachmann kennt die bevorzugten Verfahren der Einführung einer t-Butoxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe und kann zur Anleitung zusätzlichen Rat finden bei T. W. Green und P. G. M. Wuts in „Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 2. Auflage, 1991, S. 327–335.
  • Die (S)-geschützte Aminosäure (II) wird zu der entsprechenden (S)-geschützten Amid-Verbindung (III) durch Maßnahmen umgesetzt, die den Fachleuten für die Herstellung eines Amids aus einer Carbonsäure und einem Amin oder Hydroxylamin bekannt sind. Die Maßnahmen und Reaktionsbedingungen zur Herstellung der (S)-geschützten Amid-Verbindung (III) sind z. B. die Anwendung eines Kupplungsmittels, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, 1,1-Carbonyldiimidazol, POCl3, TiCl4, SO2ClF, Benzotriazol-1-yl-diethylphosphat oder N,N,N',N'-Tetramethyl(succinimido)uroniumtetrafluoroborat in Gegenwart eines Amins oder Hydroxylamins. 1,1-Carbonyldiimidazol ist ein bevorzugtes Kupplungsmittel, und N-Methyl-O-methylhydroxylamin ist ein bevorzugtes Hydroxylamin. Die Reaktion wird durchgeführt während einer Zeitdauer zwischen einer Stunde und drei Tagen bei Temperaturen in dem Bereich von –78° bis zu erhöhten Temperaturen bis zu dem Rückflusspunkt des benutzten Lösungsmittels. Vorzugsweise wird die Reaktion zwischen 0° und 50° durchgeführt.
  • Die (S)-geschützte Amid-Verbindung (III) wird dann durch in der Technik bekannte Mittel zur Reduktion eines Amids aus dem entsprechenden Aldehyd reduziert, wobei sich der entsprechende Aldehyd (IV) ergibt. Die Mittel und Reaktionsbedingungen zur Reduktion der (S)-geschützten Amid-Verbindung (III) zu dem entsprechenden Aldehyd (IV) sind z. B. Natriumborhydrid, Lithiumborhydrid, Boran, Diisobutylaluminiumhydrid und Lithiumaluminiumhydrid. Lithiumaluminiumhydrid ist das bevorzugte Reduktionsmittel. Die Reduktionen werden während einer Zeit zwischen einer Stunde und drei Tagen bei Temperaturen in dem Bereich von –78° bis Raumtemperatur durchgeführt. Vorzugsweise wird die Reduktion zwischen –20° und Raumtemperatur durchgeführt. Die bevorzugte Kombination der benötigten Reduktionsmittel und Reaktionsbedingungen sind den Fachleuten bekannt, siehe z. B. Larock, R. C. in „Comprehensive Organic Transformations", VHC Publishers, 1989.
  • Das Aldehyd (IV) wird durch bekannte Maßnahmen zu dem entsprechenden Olefin (V) umgesetzt. Ein Beispiel einer solchen Reaktion ist die Reaktion des Aldehyds (IV) mit einem Phosphorylid zu dem gewünschten Olefin. Solche Phosphorylide umfassen Methyltriphenylphosphoniumbromid. Die Reaktionsbedingungen umfassen Temperaturen in dem Bereich von –100° bis zu der Rückflusstemperatur des benutzten Lösungsmittels; bevorzugte Temperaturbereiche liegen zwischen –100° und 0°.
  • Persäure-epoxidation des Olefins (V) liefert das Epoxid (VI). Andere Verfahren für die Umsetzung eines Olefins zu einem Epoxid sind den Fachleuten bekannt. Die Maßnahmen zur Herstellung des Epoxids (VI) sind z. B. die Verwendung einer Persäure, wie z. B. Peressigsäure, Perbenzoesäure, Trifluorperessigsäure, 3,5-Dinitroperoxybenzoesäure und m-Chlorperbenzoesäure.
  • Das Epoxid (VI) wird dann mit dem geeigneten Amid (VII) durch den Fachleuten bekannte Maßnahmen umgesetzt, die das Epoxid öffnen, um den gewünschten entsprechenden geschützten Alkohol (VIII) zu bilden. Die Reaktion des Epoxids (VI) mit dem Amid (VII) erzeugt ein Gemisch von Enantiomeren. Dieses enantiomerische Gemisch wird dann durch den Fachleuten bekannte Maßnahmen getrennt, etwa durch selektive Tieftemperatur-Umkristallisation oder chromatographische Trennung, insbesondere durch HPLC unter Benutzung von im Handel erhältlichen chiralen Kolonnen. Das Enantiomer, das in dem übrigen Teil des Verfahrens der TAFEL A eingesetzt wird, ist der (S,S,R)-Alkohol (VIII).
  • Der geschützte Alkohol (VIII) wird durch den Fachleuten bekannte Maßnahmen zu dem entsprechenden geschützten Lacton (IX) umgesetzt. Eine bevorzugte Maßnahme ist die durch Umsetzung mit einem sauren Katalysator, z. B. ohne Beschränkung hierauf mit p-Toluolsulfonsäure und dergleichen. Die Reaktionen werden bei Temperaturen in dem Bereich von –78° bis zu der Rückflusstemperatur des benutzten Lösungsmittels durchgeführt; die bevorzugten Temperaturbereiche sind in dem Bereich zwischen 0° und 50°.
  • Die Amin-Molekülgruppe des geschützten Lactons (IX) wird zu dem entsprechenden Amin (X) durch Maßnahmen entschützt, die den Fachleuten zur Entfernung von Amin-Schutzgruppen bekannt sind. Geeignete Maßnahmen zur Entfernung der Amin-Schutzgruppe hängen von der Art der Schutzgruppe ab. Fachleute, die die Natur einer bestimmten Schutzgruppe kennen, wissen, welches Reagenz für ihre Entfernung bevorzugt wird. Die bevorzugte Schutzgruppe BOC wird z. B. vorzugsweise dadurch entfernt, dass man das geschützte Lacton (IX) in einem Trifluoressigsäure/Dichlormethan-Gemisch löst. Wenn die Auflösung beendet ist, werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das entsprechende Lacton (als das entsprechende Salz, d. h. das trifluoressigsaure Salz) zu ergeben, das ohne weitere Reinigung verwendet wird. Falls gewünscht, kann das Lacton jedoch durch bekannte Maßnahmen weiter gereinigt werden, wie z. B. durch Umkristallisation. Falls die Nicht-Salzform gewünscht wird, kann diese ebenfalls durch bekannte Maßnahmen erhalten werden, wie z. B. durch Herstellung der freien Aminbase über die Behandlung des Salzes unter milden basischen Bedingungen. Weitere Entschützungsbedingungen für BOC und andere Schutzgruppen sind zu finden in T. W. Green und P. G. M. Wuts in „Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991, S. 309 und folgende. Chemisch geeignete Salze sind Trifluoracetat und das Anion von Mineralsäuren, wie Chlorid, Sulfat, Phosphat; bevorzugt ist Trifluoracetat.
  • Das Amin (X) wird dann mit einem geeigneten substituiertes Amin bildenden Mittel, wie Anhydrid, Acylhalogenid oder Säure der Formel (RN-1-XN)2O oder RN-1-XN-X2 oder RN-1-XN-OH, durch den Fachleuten bekannte Stickstoff-Acylierungsmittel, um das entsprechende Lacton (XI) zu bilden. Stickstoff-Acylierungsbedingungen für die Umsetzung des Amins (X) mit einem Amid bildenden Mittel zur Herstellung des entsprechenden Lactons (XI) sind den Fachleuten bekannt und zu finden in R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH-Publishers, 1989, S. 981, 979 und 972.
  • RN-1 ist Phenyl, das mit einem, zwei drei oder vier R100 unabhängig substituiert ist, wobei R100 ist
    • (1) C1-C6-Alkyl,
    • (2) -F, Cl, -Br oder -I,
    • (3) -OH,
    • (4) -NO2,
    • (5) -CO-OH,
    • (6) -C≡N,
    • (7) -CO-NRN-2RN-3 worin RN-2 und RN-3 gleich oder verschieden sind und
    • (a) -H
    • (b) -C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem -OH oder -NH2 substituiert ist,
    • (c) -C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem bis drei -F, -Cl, -Br oder -I substituiert ist,
    • (d) -C3-C7-Cycloalkyl,
    • (e) -(C1-C2-Alkyl)-(C3-C7-Cycloalkyl),
    • (f) -(C1-C6-Alkyl)-O-(C1-C3-alkyl),
    • (g) -C1-C6-Alkenyl mit einer oder zwei Doppelbindungen,
    • (h) -C1-C6-Alkynyl mit einer oder zwei Dreifachbindungen,
    • (i) -C1-C6-Alkylkette mit einer Doppelbindung und einer Dreifachbindung sind,
    • (8) -CO-(C3-C12-Alkyl),
    • (9) -CO-(C3-C6-Cycloalkyl),
    • (11) -CO-R1-Heterocyclus, worin R1-Heterocyclus Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl-S-oxid, Thiomorpholinyl-S,S-dioxid, Piperazinyl, Homopiperazinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydropyranyl, Piperidinyl, Tetrahydrofuranyl oder Tetrahydrothiophenyl ist, worin die R1-Heterocyclus-Gruppe durch irgendein Atom der R1-Heterocyclus-Muttergruppe gebunden ist, das durch Wasserstoff substituiert ist, so dass die neue Bindung an die R1-Heteroaryl-Gruppe das Wasserstoffatom und seine Bindung ersetzt, wobei der Heterocyclus unsubstituiert oder mit einem oder zwei =O, C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    • (12) -CO-RN-4, worin RN-4 Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl oder Pyrrolidinyl ist, worin jede Gruppe unsubstituiert oder mit einem oder zwei C1-C3-Alkyl substituiert ist,
    • (13) -CO-O-RN-5, worin RN-5 ist
    • (a) -C1-C6-Alkyl oder
    • (b) -(CH2)0-2-(R1-Aryl), worin R1-Aryl wie oben definiert ist,
    • (14) -SO2-NRN-2RN-3, worin RN-2 und RN-3 wie oben definiert sind,
    • (15) -SO-(C1-C8-Alkyl),
    • (16) -SO2-(C3-C12-Alkyl),
    • (17) -NH-CO-O-RN-5, worin RN-5 wie oben definiert ist,
    • (18) -NH-CO-N(C1-C3-Alkyl)2,
    • (19) -N-CS-N(C1-C3-Alkyl)2,
    • (20) -N(C1-C3-Alkyl)-CO-RN-5, RN-5 wie oben definiert ist,
    • (21) -NRN-2RN-3, worin RN-2 und RN-3 gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert sind,
    • (22) -RN-4, wo RN-4 wie oben definiert ist,
    • (23) -O-CO-(C1-C6-Alkyl),
    • (24) -O-CO-N-(C1-C3-Alkyl)2,
    • (25) -O-CS-N-(C1-C3-Alkyl)2,
    • (26) -O-(C1-C6-Alkyl),
    • (27) -O-(C2-C5-Alkyl)-COOH,
    • (28) -S-(C1-C6-Alkyl),
    • (29) C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit 1, 2, 3, 4 oder 5 -F substituiert ist,
    • (30) -O-(C1-C6-Alkyl), das unsubstituiert oder mit 1, 2, 3, 4 oder 5 -F substituiert ist, oder
    • (31) -O-φ.
  • Die Stickstoff-Acylierung primärer Amine zur Herstellung sekundärer Amine ist eine der ältesten bekannten Reaktionen. Die Amid bildenden Mittel (RN-1-XN)2O oder RN-1-XN-X2 oder RN-1-XN-OH sind den Fachleuten bekannt und im Handel erhältlich oder sie können leicht aus bekannten Ausgangsmaterialien durch in der Literatur bekannte Verfahren hergestellt werden. X2 umfasst -Cl, -Br; X2 ist vorzugsweise -Cl. Vorzugsweise wird ein Isophthalsäure-Acylierungsmittel der Formel RN-2RN-3N-CO-Φ-CO- oder ein Methylisophthalsäure-Acylierungsmittel RN-2RN-3N-CO-(CH3-)Φ-CO- eingesetzt, wobei die Substitution 5-Methyl-1,3-isophthalsäure ist. Die bevorzugtere 5-Methyl-1,3-Isophthalsäure ist 3-[(N,N,-Dipropylamino)carbonyl]-5-methylbenzoesäure. Diese Verbindungen werden vorzugsweise wie folgt hergestellt. Ein Ester, vorzugsweise der Methylester des Isophthalats oder 5-Methyl-1,3-Isophthalsäuremethylester wird in einem THF/DMF-Gemisch gelöst. Dann wird bei 0–100° 1,1'-Carbonyldiimidazol zugesetzt. Dann wird das gewünschte Amin (H-NRN-2RN-3) zugesetzt. Nach Rührung bei 0–100° wird das Reaktionsgemisch zwischen einer gesättigten wässrigen Lösung mit einem pH von 3 bis 9 und einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel verteilt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und noch zweimal mit dem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und dann mit einer wässrigen Lösung gewaschen und getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung von Lösungsmitteln durch verminderten Druck ergibt einen rohen Ester des gewünschten RN-2RN-3N-CO-Φ-CO-O-CH3 oder ein Methylisophthalsäure-Acylierungsmittel RN-2RN-3N-CO-(CH3-)Φ-CO-O-CH3. Die Reinigung des Esters kann durch Chromatographie auf Silicagel unter Elution mit einem geeigneten Lösungsmittel erfolgen. Der Isophthalatester oder Methylisophthalatester des Monoalkyl- oder Dialkylamids wird dann mit einer wässrigen Lösung einer Base wie etwa Alkalihydroxid in einer minimalen Menge THF/Methanol/Wasser behandelt und bei 20–70° unter Überwachung gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, und anschließend wird zwischen Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel verteilt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und wieder mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die wässrige Phase wird dann auf pH ≤ 3 angesäuert. Das erhaltene Gemisch wird dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Diese vereinigten organischen Extrakte werden dann getrocknet. Das Trocknungsmittel wird durch Filtration entfernt und das organische Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt, um ein Rohprodukt zu bilden. Das rohe Mono- oder Dialkylamidisophthalat/Methylisophthalat wird als solches in der nächsten Reaktion mit dem Amin (X) benutzt, um das Lacton (XI) herzustellen.
  • Wenn es gewünscht wird, ein primäres Amid (RN-2 und RN-3N sind beide -H) herzustellen, wird die folgende Arbeitsweise bevorzugt. Ein Isophthalatester oder 5-Methyl-1,3-isophtalsäuremethylester wird in einem THF/DMF-Gemisch gelöst. Dann wird CDI bei 0–100° zugesetzt. Ammoniakgas wird dann unter Überwachung in das Gemisch eingeblasen. Das Reaktionsgemisch wird für die Dauer der Ammoniakzugabe auf 0° gekühlt. Das Reaktionsgemisch wird unter einem Ballon von Ammoniak bei 0–100° unter Überwachung der Rührung überlassen. Das Reaktionsgemisch wird zwischen einer wässrigen Lösung mit einem pH von 3 bis 9 und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel verteilt. Die Phasen werden getrennt, und die wässrige Phase wird zweimal mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit einer wässrigen Lösung gewaschen und getrocknet. Die Lösungsmittelentfernung unter vermindertem Druck ergibt rohen gewünschten Ester H2N-CO-Φ-CO-O(Alkyl) oder ein Methylisophthalsäure-Acylierungsmittel H2N-CO-(CH3-)Φ-CO-O(Alkyl). Die Reinigung des rohen Esters kann durch Chromatographie auf Silicagel unter Elution im Isopropanol/Chloroform erfolgen. Der Isophthalatester oder Methylisophthalatester des primären Amids wird dann mit einer wässrigen Lösung einer Base wie Alkalihydroxid in einer minimalen Menge THF/Methanol/Wasser behandelt und unter Überwachung bei 0–100° gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, und anschließend wird zwischen Wasser und einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel verteilt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und erneut mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die wässrige Phase wird dann bis pH ≤ 3 angesäuert. Das erhaltene Gemisch wird dann dreimal mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Diese vereinigten organischen Extrakte werden getrocknet, und das organische Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt, um ein Rohprodukt zu ergeben. Das primäre Amid- Isopthalat/Methylisopthalat wird als solches in der nächsten Reaktion mit (X) zur Herstellung von (XI) eingesetzt.
  • Wenn man wünscht, dass das Amin cyclisiert wird zu einer Gruppe, wie Morpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl und Pyrrolindinyl usw., wird die folgende Arbeitsweise befolgt. Ein Ester von Isophthalat oder 5-Methyl-1,3-isophthalsäuremethylester wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst, und eine katalytische Menge DMF wird zugesetzt. Das Gemisch wird auf –20° bis unterhalb Raumtemperatur abgekühlt, und dann wird Oxalylchlorid zugesetzt. Das Gemisch wird unter Überwachung gerührt, und die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt. Das Säurechlorid wird unter Vakuum über Nacht stehen gelassen. Das rohe Säurechlorid wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst und auf –20° bis unterhalb Raumtemperatur abgekühlt, bevor das cyclische Amin und N-Methylpiperidin zugesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird bei –20°C bis unterhalb Raumtemperatur unter Überwachung gerührt, bevor die Lösungsmittel entfernt werden. Der Rückstand wird mit Wasser und mit Wasser unmischbarem organischem Lösungsmittel verdünnt, und die Phasen werden getrennt. Die wässrige Phase wird weitere zweimal mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte werden mit einer wässrigen Lösung gewaschen und getrocknet. Die Lösungsmittelentfernung unter vermindertem Druck ergibt das Rohprodukt. Das rohe cyclische Amid wird dann mit einer wässrigen Base wie Alkalihydroxid in einer minimalen Menge THF/Methanol/Wasser behandelt und über Nacht bei 0–100° gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, und anschließend wird zwischen Wasser und einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel verteilt. Die wässrige Phase wird wieder mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Wasserentfernung aus der wässrigen Phase unter vermindertem Druck ergibt das gewünschte cyclische Amidprodukt.
  • Das Lacton (XI) kann dann mit dem geeigneten substituierten C-endständigen Amin RC-NH2 durch den Fachleuten bekannte Maßnahmen umgesetzt werden, die das Lacton zu dem gewünschten Hydroxyethylen-Endprodukt (XII) öffnen. Die substituierten C-endständigen Amine RC-NH2 dieser Erfindung sind im Handel erhältlich oder den Fachleuten bekannt und können aus bekannten Verbindungen leicht hergestellt werden. RC umfasst:
    • (1) RCH, wo RCH Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl-S-oxid, Thiomorpholinyl-S,S-dioxid, Piperazinyl, Homopiperazinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydropyranyl, Piperidinyl, Tetrahydrofuranyl oder Tetrahydrothiophenyl ist, von denen jedes wahlweise mit Oxo, C1-C3-Alkyl, CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    • (2) RCY, wo RCY Pyridinyl, Pyrimidinyl, Chinolinyl, Indenyl, Indanyl, Benzothiophenyl, Indolyl, Indolinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Isoindolyl, Isochinolyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Phthalazinyl, Iidazolyl, Isoxazolyl, Pyrazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Indolizinyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzimidazolyl, Benzofuranyl, Furanyl, Thienyl, Pyrrolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, 1,4-Benzodioxanyl, Purinyl, Oxazolopyridinyl, Imidazopyridinyl, Isothiazolyl, Naphthyridinyl, Cinnolinyl, Carbazolyl, β-Carbolinyl, Isochromanyl, Chromanyl, Furanzanyl, Tetrahydroisochinolin, Isoindolinyl, Isobenzotetrahydrofuranyl, Isobenzotetrahydrothienyl, Isobenzothiophenyl, Benzoxazolyl und Pyridopyridinyl ist, von denen jedes wahlweise mit C1-C3-Alkyl, CF3, -F, -Cl, -Br oder -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist,
    • (3) -(C1-C10)Alkyl-RCH,
    • (4) -(C1-C10)Alkyl-RCY oder
    • (5) -(C1-C10)Alkyl-K1-3, worin
    • (A) die Alkylkette unsubstituiert oder mit einem -OH substituiert ist,
    • (B) die Alkylkette unsubstituiert oder mit einem C1-C6-Alkoxy substituiert ist, das unsubstituiert oder mit 1–5 -F substituiert ist,
    • (D) die Alkylkette unsubstituiert oder mit 1–5 -F substituiert ist,
    • (F) jedes K ist:
    • (1) H,
    • (2) C1-C3-Alkyl,
    • (3) C1-C3-Alkoxy,
    • (4) C1-C3-Alkylthioxy,
    • (5) C1-C6-Alkylacylamino,
    • (6) C1-C6-Alkylacyloxy,
    • (7) Amido,
    • (8) C1-C6-Alkylamino,
    • (9) Phenylamino,
    • (10) Carbamyl,
    • (11) Carboxyl,
    • (12) Carboxy(C2-C5)alkoxy,
    • (13) Carboxy(C2-C5)alkylthioxy,
    • (16) Amino, das unsubstituiert oder mit (C2-C6)-Alkyl substituiert ist,
    • (17) Hydroxyl oder
    • (18) Carboxymethylester.
  • Geeignete Reaktionsbedingungen für die Öffnung des Lactons (XI) zur Herstellung des gewünschten Hydroxyethylen-Endprodukts (XII) umfassen die der durch AlMe3 vermittelten Kupplungsreaktion, die in dem Literaturverfahren von S. F. Martin et al., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 1517–1520 beschrieben ist. Wenn das substituierte C-endständige Amin ein 1-Amino-3,5-cis-dimethylcyclohexyldicarboxylat ist, wird es vorzugsweise wie folgt hergestellt. Zu Dimethyl-5-isophthalat in Essigsäure und Methanol wird in einer Hochdruckflasche Rhodium in Aluminiumoxid zugesetzt. Die Flasche wird mit Wasserstoff bei 55 psi gesättigt und eine Woche geschüttelt. Das Gemisch wird dann durch eine dicke Celitkuchenschicht filtriert und dreimal mit Methanol gespült, die Lösungsmittel werden (mit Wärme) unter vermindertem Druck entfernt, um ein Konzentrat zu ergeben. Das Konzentrat wird mit Ether verrieben und wieder filtriert, um das gewünschte C-endständige Amin zu ergeben. Wenn das substituierte C-endständige Amin 1-Amino-3,5-cis-dimethoxycyclohexan ist, erfolgt die Herstellung vorzugsweise nach der obigen allgemeinen Arbeitsweise ohne wesentliche Veränderungen, jedoch ausgehend von 3,5-Dimethoxyanilin. Wenn das substituierte C-endständige Amin eine Aminomethylgruppe ist, bei der der Substituent an der Methylgruppe eine Arylgruppe ist, z. B. NH2-CH2-RC-Aryl, und NH2-CH2-RC-Aryl im Handel nicht verfügbar ist, wird es vorzugsweise wie folgt hergestellt. Ein geeignetes Ausgangsmaterial ist die (geeignet substituierte) Aralkylverbindung. Die erste Stufe ist die Bromierung des Alkylsubstituenten nach den Fachleuten bekannten Verfahren, siehe z. R. C. Larock in „Comprehensive Organic Transformations", VCH-Publishers, 1989, S. 313. Dann wird das Alkylhalogenid mit Azid umgesetzt, um das Aryl-(Alkyl)-azid herzustellen. Zuletzt wird das Azid zu dem entsprechenden Amin durch Wasserstoff/Katalysator reduziert, um das C-endständige Amin der Formel NH2-CH2-RC-Aryl zu ergeben.
  • Die TAFEL B, wie Sie hier definiert wird, gibt ein Verfahren zur Herstellung des Amids (VII) an. Die Herstellung des Amids (VIII) beginnt mit der Umsetzung eines geeigneten Aminoindanols (XIV) mit einem geeigneten Halogenketon (XII), um das Hydroxyindan (XV) zu liefern. Das Aminoindanol (XIV) und Halogenketon (XII) sind den Fachleuten bekannt oder können aus bekannten Verbindungen durch den Fachleuten bekannte Verfahren leicht hergestellt werden. Der X-Substituent des Halogenketons ist typischerweise F, Cl, Br oder I. X ist vorzugsweise Cl. Für das Aminohalogenketon (XII) ist R2:
    • (I) -H,
    • (II) C1-C6-Alkyl oder
    • (III) -(CH3)0-4-R2-1, worin R2-1 (C3-C6)Cycloalkyl, R1-Aryl ist, wobei R1-Aryl wie oben definiert ist.
  • Bestimmte Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine Säurefunktion, die mit einer Base Additionssalze bilden kann. Ferner enthalten bestimmte Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine basische Funktion, die zur Bildung von Säure-Additionssalzen befähigt ist. Bestimmte Hydroxyethylen-Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind z. B. Amine und bilden als solche Salze, wenn Sie mit Säuren umgesetzt werden. Pharmazeutisch zulässige Salze werden gegenüber den entsprechenden Hydroxyethylen-Verbindungen der vor liegenden Erfindung bevorzugt, da sie Verbindungen ergeben, stärker wasserlöslich, beständig und/oder kristalliner sind. Pharmazeutisch zulässige Salze sind jedes Salz, das die Aktivität der Mutterverbindung beibehält und keine gesundheitschädlichen oder unerwünschten Wirkungen auf den Patienten, dem es verabreicht wird, und in dem Zusammenhang, in dem es verabreicht wird, hat. Pharmazeutisch zulässige Salze umfassen Salze anorganischer und organischer Säuren. Die bevorzugten pharmazeutisch zulässigen Salze umfassen Salze der folgenden Säuren: Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff, Jodwasserstoff, Salpeter, Schwefel, Phosphor, Zitronen, Methansulfon, CH3-(CH2)n1-COOH, worin n1 0 bis 4 ist, HOOC-(CH2)n1-COOH, worin n1 wie oben definiert ist, HOOC-CH=CH-COOH und φ-COOH. Pharmazeutisch zusätzliche Salze umfassen ferner Salze der folgenden Basen: Triethanolamin, N-Methylglucamin, Diethanolamin, Ethanolamin, tris(Hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Ammoniak und Carbonat-, Bicarbonat-, Phosphonat- oder Hydroxidsalze eines Alkali- oder Erdalkalimetalls. Zu anderen zulässigen Salzen siehe Int. J. Pharm., 33, 201–217 (1986).
  • Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind:
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(piperidin-1-carbonyl)-hexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(2-morpholin-4-yl-ethylcarbamoyl)-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-carbamoyl)-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-methyl-5-morpholin-4-yl-5-oxo-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-4-(R)-[(furan-2-ylmethyl)-carbamoyl]-2-(S)-hydroxypentyl)-5-methyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-isobutylcarbamoyl-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    3-[6-(3,5-Difluorophenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoylbenzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxyhexanoylamino]-propionsäure;
    8-[6-(3,5-Difluorophenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoylbenzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxyhexanoylamino]-octansäure;
    8-[6-(3,5-Difluorophenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoylbenzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxyhexanoylamino]-octansäuremethylester;
    N-[4-(R)-Butylcarbamoyl-1-(S)-(3,5-difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxyhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-isobutylcarbamoylhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[4-(R)-Benzylcarbamoyl-1-(S)-(3,5-difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxyhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[4-(R)-(Cyclohexylmethyl-carbamoyl)-1-(S)-(3,5-difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxyhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid;
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(piperidin-1-carbonyl)-hexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid; oder
    N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-4-(R)-(2-dimethylaminoethylcarbamoyl)-2-(S)-hydroxyhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid.
  • Die Hydroxyethylenverbindungen der vorliegenden Erfindung und deren pharmazeutisch zulässige Salze sind anwendbar zur Behandlung von Menschen, die an der Alzheimerschen Krankheit leiden.
  • Bei der Behandlung dieser Krankheit können die Verbindungen der Erfindung alleine oder in Kombination angewendet werden, wie es für den Patienten am besten ist.
  • Mit Bezug auf diese Krankheiten bedeutet die Bezeichnung „Behandlung", dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei Menschen mit existierender Erkrankung eingesetzt werden können. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verzögern oder verlangsamen den Fortschritt der Erkrankung und geben dadurch der einzelnen Person eine nützlichere Lebenszeitspanne.
  • Die Bezeichnung „Verhinderung" bedeutet, dass bei Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen an Personen, die jetzt die Krankheit nicht haben, sie aber normalerweise bekommen würden oder einem erhöhten Risiko für diese Krankheit ausgesetzt sind, die Krankheit nicht bekommen werden. Ferner umfasst „Verhinderung" auch die Verzögerung der Entwicklung der Erkrankung bei einer Person, die schließlich die Krankheit bekommt oder dem Risiko der Krankheit ausgesetzt wäre. Durch Verzögerung des Einsetzens der Erkrankung haben die erfindungsgemäßen Verbindungen verhindert, dass der Einzelne die Krankheit während der Zeitperiode bekommt, in der er normalerweise die Krankheit bekommen hätte, oder die Verbindungen verringern die Geschwindigkeit der Entwicklung der Erkrankung oder ihrer Wirkungen lediglich durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen bis zu der Zeit, wo die Person schließlich die Krankheit bekommt. Verhinderung umfasst auch die Verabreichung der Verbindungen der Erfindung an solche Personen, von denen man annimmt, dass sie infolge der Familiengeschichte und/oder der Anwesenheit eines oder mehrerer biologischer Marker für die Krankheit, wie einer bekannten genetischen APP-Mutation, oder durch Analyse von APP-Spaltprodukten in Körpergeweben oder -flüssigkeiten für die Krankheit empfänglich sind.
  • Bei der Behandlung oder Verhinderung der Krankheit werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die therapeutisch wirksame Menge variiert in Abhängigkeit von der besonderen angewendeten Verbindung und dem Verabreichungsweg, wie den Fachleuten bekannt ist.
  • Bei Behandlung eines Patienten mit Alzheimerscher Krankheit kann ein Arzt Verbindungen der vorliegenden Erfindung sofort verabreichen und zeitlich unbegrenzt damit fortfahren.
  • Bei der Behandlung von Patienten, die gegenwärtig nicht die Alzheimersche Krankheit haben, aber vermutlich einem wesentlichen Risiko für Alzheimersche Krankheit ausgesetzt sind, sollte der Arzt die Behandlung beginnen, wenn der Patient zuerst frühe Vor-Alzheimersche Symptome hat, wie Gedächtnis- oder Wahrnehmungsprobleme in Verbindung mit dem Altwerden. Ferner gibt es einige Patienten, bei denen durch den Nachweis des genetischen Markers APOE4 oder anderer biologischer Indikatoren, die Alzheimersche Krankheit voraussagen, Alzheimer diagnostiziert sein kann. Obgleich der Patient in diesen Fällen keine Symptome der Erkrankung zeigt, kann die Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung begonnen werden, bevor Symptome erscheinen, und die Behandlung kann unbegrenzt fortgesetzt werden, um den Beginn der Krankheit zu verhindern oder zu verzögern.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können oral, parenteral (IV, IM, depo-IM, SQ und depo-SQ), sublingual, intranasal (Inhalation), intrathekal, örtlich und rektal verabreicht werden. Die Erfindung hier sind die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Den Fachleuten bekannte Dosierungsformen eignen sich für die Verabreichung der neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
  • Verbindungen der vorliegenden Erfindung können enteral oder parenteral verabreicht werden. Bei oraler Verabreichung können Verbindungen der vorliegenden Erfindung in zur oralen Verabreichung üblichen Dosierungsformen verabreicht werden, wie den Fachleuten bekannt ist. Diese Dosierungsformen umfassen die gewöhnlichen Dosierungsformen von Tabletten und Kapseln in fester Einheit sowie flüssige Dosierungsformen, wie Lösungen, Suspensionen und Elixiere. Wenn feste Dosierungsformen eingesetzt werden, sind sie bevorzugt von der Art mit nachhaltiger Freigabe, so dass die Verbindungen der Erfindung nur einmal oder zweimal täglich verabreicht werden müssen.
  • Die oralen Dosierungsformen werden dem Patienten ein-, zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise dreimal oder weniger, insbesondere einmal oder zweimal täglich verabreicht. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise daher in oraler Dosierungsform verabreicht. Unabhängig von der benutzten oralen Dosierungsform wird diese vorzugsweise so ausgebildet, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegen die saure Umgebung des Magens geschützt sind. Mit Schutzhülle versehene Tabletten sind den Fachleuten bekannt. Ferner sind den Fachleuten auch Kapseln bekannt, die mit Kügelchen gefüllt sind, die zum Schutz gegen den sauren Mageninhalt beschichtet sind. Bei oraler Verabreichung beträgt die therapeutisch wirksame Menge etwa 0,1 mg/Tag bis etwa 1000 mg/Tag. Die orale Dosis beträgt vorzugsweise etwa 1 mg/Tag bis etwa 100 mg/Tag. Die orale Dosis beträgt insbesondere etwa 5 mg/Tag bis etwa 50 mg/Tag. Während ein Patient mit einer Dosis beginnen kann, kann die Dosis mit der Zeit verändert werden, wenn sich der Zustand des Patienten ändert.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Vorteil in einer Formulierung als Nanokristalldispersion zugeführt werden. Die Zubereitung solcher Formulierungen ist in US-Patent 5,145,684 beschrieben. Nanokristalline Dispersionen von z. B. HIV-Proteasehemmern und ihre Anwendungsmethode sind in US-Patent 6,045,829 beschrieben. Die nanokristallinen Formulierungen ergeben typischerweise eine größere Bioverträglichkeit von Arzneimittelverbindungen.
  • Die Verbindungen der Erfindung können ferner parenteral verabreicht werden. Bei parenteraler Verabreichung können sie IV, IM, depo-IM, SC oder depo-SC verabreicht werden. Bei parenteraler Verabreichung sollten die Hydroxyethylenverbindungen der Formel (XII) eine therapeutisch wirksame Menge von etwa 0,5 bis etwa 100 mg/Tag, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 mg täglich liefern. Wenn eine depo-Formulierung zur Injektion einmal im Monat oder einmal alle zwei Wochen angewendet wird, sollte die Dosis etwa 0,5 mg/Tag bis etwa 50 mg/Tag sein, oder bei einer monatlichen Menge sollte die Dosis für einen Monat etwa 15 mg bis etwa 1500 mg betragen. Wegen der Vergesslichkeit der Patienten mit Alzheimerscher Krankheit wird es bevorzugt, dass die parenterale Dosierungsform eine depo-IM-Injektion ist.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können sublingual verabreicht werden. Bei sublingualer Verabreichung sollten die Verbindungen ein- bis viermal täglich in der gleichen Menge wie für IM-Verabreichung gegeben werden.
  • Die Verbindungen können intranasal gegeben werden. Bei Verabreichung auf diesem Weg sind die geeigneten Dosierungsformen ein Nasenspray oder ein trockenes Pulver, wie den Fachleuten bekannt ist. Die Dosierung der Verbindungen für intranasale Verabreichung ist die gleiche wie für IM-Verabreichung.
  • Die Verbindungen können intrathekal gegeben werden. Bei Verabreichung auf diesem Weg kann die geeignete Dosierungsform eine parenterale Dosierungsform sein, wie den Fachleuten bekannt ist. Die Dosierung der Verbindungen für intrathekale Verabreichung ist die gleiche wie für IM-Verabreichung.
  • Die Verbindungen können örtlich verabreicht werden. Bei diesem Verabreichungsweg ist die geeignete Dosierungsform eine Creme, eine Salbe oder ein Pflaster. Wegen der zu verabreichenden Menge der Verbindungen wird das Pflaster bevorzugt. Ferner können zwei oder mehr Pflaster nötig sein. Bei örtlicher Verabreichung ist die Dosierung etwa 0,5 mg/Tag bis etwa 200 mg/Tag. Die Menge, die durch ein Pflaster zugeführt werden kann, ist jedoch begrenzt. Daher können zwei oder mehr Pflaster erforderlich sein. Die Anzahl und Größe der Pflaster ist nicht wesentlich; wichtig ist, dass eine therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen zugeführt wird, wie den Fachleuten bekannt ist.
  • Die Verbindungen können rektal durch Zäpfchen verabreicht werden, wie den Fachleuten bekannt ist. Bei Verabreichung durch Zäpfchen ist die therapeutisch wirksame Menge etwa 0,5 mg bis etwa 500 mg.
  • Die Verbindungen können durch Implantate verabreicht werden, wie den Fachleuten bekannt ist. Bei Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung durch Implantat ist die therapeutisch wirksame Menge die gleiche wie für die Depotverabreichung.
  • Bei einer bestimmten gegebenen Verbindung und einer gewünschten Dosierungsform würde der Fachmann die Zubereitung der geeigneten Dosierungsform für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung kennen.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in der gleichen Weise auf den gleichen Verabreichungswegen unter Benutzung der gleichen pharmazeutischen Dosierungsformen und nach dem gleichen Dosierungsplan eingesetzt zur Behandlung von Patienten mit MCI (schwache Wahrnehmungsstörung) und zur Verhinderung oder Verzögerung des Beginns der Alzheimerschen Krankheit bei jenen Personen, die von MCI zu Alzheimer fortschreiten, zur Behandlung des Downschen Syndroms, für die Behandlung von Menschen, die angeborene cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose des Dutch-Typs haben, zur Behandlung cerebraler Amyloidangiopathie und Verhinderung ihrer potentiellen Folgen, nämlich einzelner und wiederkehrender lobärer Hämorrhagien, zur Behandlung anderer degenerativer Demenzen einschließlich Demenzen gemischten vaskulären und degenerativen Ursprungs, einer Demenz in Verbindung mit Parkinsonscher Krankheit, Demenz in Verbindung mit progressiver supranukleärer Paralyse, Demenz in Verbindung mit basaler Cortexdegeneration und Alzheimerscher Krankheit des diffusen Lewy-Körpertyps. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können miteinander und mit anderen Mitteln eingesetzt werden, die zur Behandlung oder Verhinderung der Alzheimerschen Krankheit dienen. Diese Mittel umfassen Gamma-Sekretasehemmer, Anti-Amyloid-Vakzine und pharmazeutische Mittel, wie Donepezil-Hydrochlorid (ARICEPT®-Tabletten), Tacrin-Hydrochlorid(COGNEX®-Kapseln) oder andere Acetylcholinesterase-Hemmer und direkte oder indirekte neurotrope Mittel der Zukunft.
  • HEMMUNG DER APP-SPALTUNG
  • Die Verbindungen der Erfindung hemmen die Spaltung von APP an der β-Sekretase-Spaltungsstelle Met595-Asp695 für die APP695-Isoform. Ohne Festlegung auf eine bestimmte Theorie hemmt die Hemmung der β-Sekretase-Aktivität vermutlich die Produktion von Beta-Amyloid-Beta-Peptid (Aβ). Die Hemmaktivität wird durch einen von verschiedenen Hemmtests demonstriert, wobei die Spaltung eines APP-Substrats in Anwesenheit eines β-Sekretaseenzyms in Gegenwart der Hemmverbindung unter Bedingungen analysiert wird, die normalerweise ausreichen, eine Spaltung an der β-Sekretase-Spaltungsstelle zu ergeben. Eine Verringerung der APP-Spaltung an der β-Sekretase-Spaltungsstelle im Vergleich mit einer unbehandelten oder inaktiven Kontrollprobe steht korreliert mit der Hemmaktivität. Testsysteme, die benutzt werden können, um die Wirksamkeit der Verbindungshemmer der Erfindung zu zeigen, sind bekannt. Typische Testsysteme sind z. B. in US-Patent-Nr. 5,942,400 beschrieben.
  • Die enzymatische Aktivität von β-Sekretase und die Produktion von Aβ kann in vitro oder in vivo unter Benutzung natürlicher, mutierter und/oder synthetischer APP-Substrate, eines natürlichen, mutierten und/oder synthetischen Enzyms und der Testverbindung analysiert werden. Die Analyse kann Primär- oder Sekundärzellen, die native, mutierte und/oder synthetische APP exprimieren, und Enzym umfassen, oder sie kann transgene Tiermodelle benutzen, die das Substrat und Enzym exprimieren. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität kann durch Analyse eines oder mehrerer der Spaltprodukte erfolgen, z. B. durch Immuntest, fluorometrischen oder chromogenen Tests, HPLC oder andere Nachweismethoden. Hemmverbindungen werden auf Grund ihrer Fähigkeit bestimmt, die Menge des gebildeten β-Sekretase-Spaltprodukts im Vergleich zu einer Kontrollprobe zu verringern, bei der die durch β-Sekretase vermittelte Spaltung in dem Reaktionssystem in Abwesenheit von Hemmverbindungen beobachtet und gemessen wird.
  • β-Sekretase
  • Verschiedene Formen das β-Sekretaseenzyms sind bekannt und für die Prüfung der Enzymaktivität und Hemmung der Enzymaktivität verfügbar und nützlich. Diese Formen umfassen native, rekombinante und synthetische Formen des Enzyms. In den veröffentlichen PCT-Patentanmeldungen WO 98/22597 und WO 00/17369 wurden z. B. menschliches ASP2a und Asp2b sowie synthetische Formen des Enzyms charakterisiert.
  • Die Verbindungen der Erfindung hemmen 50% der enzymatischen β-Sekretase-Aktivität bei einer Konzentration von etwa 0,1 nM bis etwa 200 μM, vorzugsweise bei einer Konzentration von etwa 10 nM bis etwa 100 μM, bevorzugter von etwa 100 nM bis etwa 50 μM und insbesondere von etwa 1 μM bis etwa 10 μM.
  • APP-Substrat
  • Prüfungen, die die Hemmung der durch β-Sekretase vermittelten Spaltung von APP demonstrieren, können alle bekannten Formen von APP benutzen, darunter den „normalen" Isotyp der 695-Aminosäure, der von Kang et al. beschrieben wurde in Nature, 1987, 325: 733–6, den Isotyp der 770-Aminosäure, beschrieben von Kitaguchi et al., Nature, 1981, 331: 530–532, und Varianten, wie die Swedish Mutation (KM670-1NL)(APP-SW), die London Mutation (V7176F) und andere. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,766,846 und auch Hardy, Nature Genet., 1992, 1: 233–234 zu einem Überblick bekannter Mutationsvarianten. Weitere brauchbare Substrate sind die zweibasische Aminosäuremodifizierung APP-KK, die z. B. beschrieben ist in WO 00/17369, APP-Fragmente und synthetische Peptide mit der β-Sekretase-Spaltungsstelle, Wildtyp (WT) oder mutierte Form, z. B. SW, wie z. B. in US-Patent Nr. 5,942,400 beschrieben ist.
  • Das APP-Substrat kann auch ein Fusionspeptid sein, das aus einem Peptid mit der β-Sekretase-Spaltungsstelle gebildet ist, das mit einem Peptid verschmolzen ist, das eine für die enzymatische Prüfung nützliche charakteristische Eigenschaft, z. B. Isolierungs- und/oder Nachweiseeigenschaft, verleiht.
  • Eine nützliche Prüfung benutzt ein Fusionspeptid mit einem Maltose-Bindungsprotein (MBP), das mit den C-terminalen 125-Aminosäuren von APP-SW fusioniert ist. Der MBP-Teil wird durch Anti-MBP-Einfang-Antikörper auf einem Prüfsubstrat eingefangen. Die Inkubation des eingefangen Fusionsproteins in Gegenwart von β-Sekretase führt zur Spaltung des Substrats an der β-Sekretase-Spaltungsstelle. Die Analyse der Spaltaktivität kann z. B. durch Immuntest der Spaltprodukte erfolgen. Ein solcher Immuntest weist z. B. unter Benutzung des Antikörpers SW192 ein einmal vorhandenes Epitop nach, das an dem Carboxyterminus des gespaltenen Fusionsproteins exponiert ist. Diese Prüfung ist z. B. beschrieben in US-Patent Nr. 5,942,400.
  • Zellprüfung
  • Zellen, die ein APP-Substrat und eine aktive β-Sekretase exprimieren, können in Gegenwart eines Verbindungshemmers inkubiert werden, um die Hemmung der enzymatischen Aktivität im Vergleich zu einer Kontrollprobe zu zeigen. Die Aktivität von β-Sekretase kann durch Analyse eines oder mehrerer APP-Spaltprodukte gemessen werden. Eine Zellhemmung von Aktivität der β-Sekretase würde z. B. erwartungsgemäß die Freisetzung des Spaltprodukts Aβ herabsetzen.
  • Menschliche Zellstämme, die normalerweise Aβ aus APP bilden, schaffen ein brauchbares Mittel, um Hemmaktivitäten der Verbindungen der Erfindung zu untersuchen. Die Produktion und Freisetzung von Aβ und/oder anderen Spaltprodukten in das Kulturmedium kann z. B. durch Immuntest, wie Western-Blot oder enzymgekoppelte Immunbestimmung (EIA oder ELISA) gemessen werden.
  • Primäre Nervenzellkulturen aus menschlichem Gehirn oder aus Gehirngewebe, das aus transgenen Tieren erhalten wurde, die APP, insbesondere menschliches APP exprimieren und APP zu nachweisbarem Aβ verarbeiten können, sind ebenfalls brauchbare Zellen zur Untersuchung der β-Sekretase-Spaltaktivität. Primäre menschliche Nervenzellkulturen von menschlichen embryonalen Geweben z. B. exprimieren endogene β-Sekretase und endogenes APP. Die enzymatische Aktivität wird in Gegenwart der Hemmverbindung untersucht, und die Spaltprodukte, wie Aβ, werden gemessen. Ein anderes brauchbares primäres Zellkultursystem benutzt Zellen vom Hirngewebe transgener Mäuse, z. B. von PD-APP-Mäusen, die ein transgenes APP mit einer Mutation an V717 oder mit der Schwedischen Mutation exprimieren.
  • Obgleich Nerven- und Nichtnervenzellen Aβ bilden und freisetzen, sind die Werte der endogenen β-Sekretase-Aktivität gering und oft durch EIA schwierig nachzuweisen. Die Benutzung von Zellarten, die bekanntlich erhöhte β-Sekretase-Aktivität, verstärkte Verarbeitung von APP zu Aβ und/oder verstärkte Produktion von Aβ haben, wird daher bevorzugt. Zum Beispiel ergibt die Transfektion von Zellen mit der Schwedischen Mutierten Form von APP(APP-SW), mit APP-KK oder mit APP-SW-KK Zellen mit verstärkter β-Sekretase-Aktivität, die Aβ-Mengen produzieren, die leicht gemessen werden können.
  • Antikörper
  • Charakteristische Produkte der APP-Spaltung können durch Immuntest mit verschiedenen Antikörpern gemessen werden, wie z. B. in Pirttila et al., 1999, Neuro. Lett. 249: 21–4 und in US-Patent Nr. 5,612,486 beschrieben ist. Brauchbare Antikörper zum Nachweis von Aβ sind z. B. der monoklonale Antikörper 6E10 (Senetek, St. Louis, MO), der ein Epitop an Aminosäuren 1–16 des Aβ-Peptids spezifisch erkennt, Antikörper 162 und 164 (New York State Institute for Basic Research, Staten Island, NY), die für hAβ 1–40 bzw. 1–42 spezifisch sind. Wie oben diskutiert wurde, ist ein anderer brauchbarer Antikörper SW192, der ein Epitop erkennt, das nach durch β-Sekretase vermittelter APP-SW-Spaltung auf dem C-terminalen Spaltfragment freigelegt wurde.
  • Tiermodelle
  • Tiermodelle, die zum Test der Verbindungen der Erfindung nützlich sind, sind jene, die erhöhte Aβ-Werte exprimieren und eine erhöhte Menge von Aβ-Abscheidungen und/oder eine vergrößerte Anzahl oder Größe von Beta-Amyloid-Plaques im Vergleich zu Kontrolltieren zeigen. Diese Tiermodelle umfassen transgene Säuger. Geeignete transgene Tiere sind Nager, die mit einem veränderten oder modifizierten APP transformiert sind, das in dem Tier eine gemessene Aβ-Menge zur Folge haben, die größer ist als die, welche in einer nichttransformierten Kontrollprobe produziert wird. Beispiele geeigneter transgener Tiermodelle sind eine mit APP-SW transformierte Maus, die z. B. in den US-Patenten Nr. 5,877,399, 5,612,486 und 5,850,003 beschrieben ist. Andere geeignete Tiere sind mit V717 APP transformiert, wie z. B. in US-Patent Nr. 5,877,015 und in Ganes et al., 1995, Nature 373: 523 beschrieben ist.
  • Die APP-Spaltung an der β-Sekretase-Spaltstelle kann in diesen Tieren durch Messung von Spaltfragmenten in den Gehirngeweben des Tieres und möglicherweise in Cerebralflüssigkeiten sowie durch Analyse von Beta-Amyloid-Plaques und Feststellung von Nekrose in den Gehirngeweben des Tieres analysiert werden.
  • Bei Berührung eines APP-Substrats mit einem β-Sekretase-Enzym in Gegenwart einer Hemmverbindung der Erfindung und unter ausreichenden Bedingungen für die enzymatisch vermittelte Spaltung von APP und/oder Freisetzung von Aβ aus dem Substrat reduzieren die Verbindungen der Erfindung in wirksamer Weise die durch β-Sekretase vermittelte APP-Spaltung an der β-Sekretase-Spaltstelle und/oder die freigesetzten Mengen an Aβ. Wenn diese Berührung durch die Verabreichung der Hemmverbindungen der Erfindung an ein Tiermodell erfolgt wie z. B. oben beschrieben ist, haben die Verbindungen die Wirkung, Aβ-Abscheidung im Gehirngewebe des Tieres zu verringern und die Anzahl und/oder Größe von Beta-Amyloid-Plaques zu verringern. Wenn diese Verabreichung an einen menschlichen Patienten erfolgt, haben die Verbindungen die Wirkung, den durch erhöhte Aβ-Mengen gekennzeichneten Fortschritt der Krankheit zu hemmen oder zu verlangsamen, den Fortschritt der Alzheimerschen Krankheit in dem Patienten zu verlangsamen und/oder das Einsetzen oder die Entwicklung von Alzheimerscher Krankheit bei einem Patienten mit Risiko für die Krankheit zu verhindern.
  • Testsysteme
  • Tests zur Bestimmung von APP-Spaltung an der β-Sekretase-Spaltungsstelle sind in der Technik bekannt. Beispielhafte Tests sind z. B. beschrieben in den US-Patenten Nr. 5,744,346 und 5,942,400 und in den Beispielen unten.
  • Zellfreie Tests
  • Beispielhafte Tests, die zur Demonstrierung der Hemmaktivität der Verbindungen der Erfindung dienen können, sind z. B. beschrieben in WO 00/17369 und US-Patent Nr. 5,942,400. Diese Tests können in zellfreien Inkubationen oder in zellulären Inkubationen unter Benutzung von eine β-Sekretase exprimierenden Zellen und eines APP-Substrats mit einer β-Sekretase-Spaltungsstelle durchgeführt werden.
  • Ein APP-Substrat, das die β-Sekretase-Spaltungsstelle von APP enthält, z. B. ein vollständiges APP oder als Variante ein APP-Fragment oder ein rekombinantes oder synthetisches APP-Substrat mit der Aminosäuresequenz KM-DA oder NL-DA wird unter für die Spaltungsaktivität des Enzyms der geeigneten Inkubationsbedingungen in Gegenwart eines β-Sekretase-Enzyms inkubiert, z. B. von menschlichem (h) Asp2a, hAsp2b, eines Fragments davon oder einer synthetischen oder rekombinanten Polypeptid-Variante von hAsp2a oder hAsp2b mit β-Sekretase-Aktivität und Wirksamkeit, die β-Sekretase-Spaltungsstelle von APP zu spalten. Geeignete Substrate umfassen wahlweise Derivate, die Fusionsproteine oder Peptide sein können, die das Substratpeptid und eine Modifikation enthalten, die die Reinigung oder den Nachweis des Peptids oder seiner β-Sekretase-Spaltungsprodukte erleichtern. Brauchbare Modifizierungen sind der Einbau eines bekannten antigenen Epitops für die Antikörperbindung, die Einkopplung eines Markers oder einer nachweisbaren Molekülgruppe, die Einkopplung eines Bindungssubstrats und dergleichen.
  • Geeignete Inkubationsbedingungen für einen zellfreien in-vitro-Test sind z. B.: Etwa 200 nM–10 μM Substrat, etwa 10–200 pM Enzym und etwa 0,1 nM–10 μM Hemmerverbindung in wässriger Lösung bei einem ungefähren pH von 4–7 bei etwa 37°C für eine Zeitdauer von etwa 10 Minuten bis 3 Stunden. Diese Inkubationsbedingungen sind nur beispielhaft und können variiert werden, wie es für die besonderen Testbestandteile und/oder das gewünschte Messsystem erforderlich ist. Die Optimierung der Inkubationsbedingungen für die bestimmten Testbestandteile sollte das benutzte spezifische β-Enzym und sein pH-Optimum, etwaige zusätzliche Enzyme und/oder Marker, die in dem Test benutzt werden können, und dergleichen berücksichtigen. Diese Optimierung ist Routinesache und wird keine übermässigen Versuche erfordern.
  • Zelltests
  • Zahlreiche Tests auf Zellbasis analysieren die β-Sekretase-Aktivität und/oder das Processing von APP zur Freisetzung von Aβ. Bei einer Ausführungsform werden Zellen eingesetzt, die natürlicherweise β-Sekretase exprimieren. Bei einer Alternative werden Zellen modifiziert, um eine rekombinante β-Sekretase, z. B. hAsp2a, hAsp2b, oder eine rekombinante oder synthetische Enzymvariante zu exprimieren, wie oben diskutiert wurde.
  • Das APP-Substrat kann dem Kulturmedium zugesetzt oder in den Zellen exprimiert werden. Zellen, die natürlicherweise APP, variierte oder mutierte APP-Formen exprimieren, oder Zellen, die zur Expression eine Isoform von APP, mutiertem oder variiertem APP, rekombinantem oder synthetischem APP, APP-Fragment transformiert sind, oder synthetisches APP-Peptid oder Fusionsprotein, das die β-Sekretase-APP-Spaltungsstelle enthält, können verwendet werden, vorausgesetzt, dass das exprimierte APP mit dem Enzym in Berührung kommen kann und die enzymatische Spaltungsaktivität analysiert werden kann.
  • Die Berührung eines APP-Substrats mit einem β-Sekretase-Enzym in der Zelle und in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmerverbindung der Erfindung kann benutzt werden, um die Hemmaktivität zu demonstrieren. Wie oben für nichtzelluläre Test diskutiert wurde, kann die durch Spaltung des APP-Substrats und Nachweis von Fragmenten und/oder Markern gemessene β-Sekretase-Aktivität oder -Funktion zahlreiche Formen annehmen. Der Test in Gegenwart einer brauchbaren Hemmverbindung ergibt vorzugsweise wenigstens etwa 30%, insbesondere wenigstens etwa 50% Hemmung der Enzymaktivität im Vergleich zu einer ungehemmten Kontrollprobe.
  • Bei diesen Tests werden z. B. APP und β-Sekretase exprimierende Zellen in einem Kulturmedium unter Bedingungen inkubiert, die Processing des APP durch das Enzym und Aβ-Freigabe in das Medium und Ansammlung anderer APP-Fragmente in den Zell-Lysaten erlauben. Die Hemmaktivität der Verbindungen der Erfindung kann durch Inkubation der Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit der Verbindung gezeigt werden. Wenn man die Zellen der Hemmerverbindung aussetzt, wird die in das Medium freigesetzte Aβ-Menge und/oder die Menge der CTF99-Fragmente des APP in den Zell-Lysaten im Vergleich zu der Kontrollprobe reduziert. Die Spaltprodukte von APP können z. B. durch Immunreaktionen mit spezifischen Antikörpern analysiert werden, wie oben diskutiert wurde.
  • Bevorzugte Zellen für die Analyse der β-Sekretase-Aktivität sind primäre menschliche Nervenzellen, primäre transgene Tiernervenzellen, wobei das Transgen APP ist, und andere Zellen, wie jene eines stabilen 293-Zellstamms, der APP, z. B. APP-SW exprimiert. Bei dem Zelltest werden Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit des Hemmers unter Bedingungen inkubiert, die für die Aktivität des β-Sekretase-Enzyms an seiner Spaltungsstelle auf. dem APP-Substrat geeignet sind. Der Zellüberstand wird geerntet und z. B. unter Benutzung des Immuntests auf Spaltfragmente analysiert.
  • In-vivo-Tests: Tiermodelle
  • Verschiedene Tiermodelle können dazu dienen, β-Sekretase-Aktivität und/oder APP-Processing zur Aβ-Freigabe zu analysieren, wie oben beschrieben wurde. Beispielsweise können transgene Tiere, die APP-Substrat exprimieren, und β-Sekretase- Enzym benutzt werden, um die Hemmaktivität der Verbindungen der Erfindung aufzuzeigen. Bevorzugt sind Tiere, die mit der Pathophysiologie der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung stehende Eigenschaften zeigen. Bestimmte transgene Tiermodelle für die Alzheimersche Krankheit wurden beschrieben, z. B. in den US-Patenten Nr. 5,877,399, 5,612,486, 5,387,742, 5,720,936 und 5,811,633.
  • Die hier beschriebene Verabreichung der Hemmerverbindungen der Erfindung an transgene Mäuse liefert eine andere Methode, um die Hemmaktivität der Hemmerverbindungen zu demonstrieren. Die Verabreichung der Hemmerverbindung in einem pharmazeutisch wirksamen Träger auf einem Verabreichungsweg, auf dem eine geeignete therapeutische Menge das Zielgewebe erreicht, wird bevorzugt. Die Hemmung der durch β-Sekretase vermittelten APP-Spaltung und der Aβ-Freisetzung kann durch Analyse der Spaltprodukte in den Körperflüssigkeiten oder Geweben des Tieres gemessen werden. Die Analyse von Gehirngeweben auf Aβ-Abscheidungen oder -Plaques wird ebenfalls durchgeführt.
  • Es sollte dem Fachmann klar sein, dass die genaue Dosierung und Häufigkeit der Verabreichung abhängen wird von den bestimmten verabreichten Hydroxyethylen-Verbindungen der Formel (XII), dem speziellen behandelten Zustand, der Ernsthaftigkeit des behandelten Zustands, dem Alter, Gewicht, dem allgemeinen körperlichen Zustand des einzelnen Patienten und der anderen ärztlichen Behandlung, der der Patient unterzogen wird, wie den mit der Verabreichung befassten, fachkundigen Ärzten bekannt ist.
  • DEFINITIONEN UND REGELN
  • Die folgenden Definitionen und Erläuterungen beziehen sich auf die Fachausdrücke, wie sie in diesem gesamten Dokument einschließlich der Beschreibung und der Ansprüche gebraucht werden.
  • I. REGELN FÜR FORMELN UND DEFINITIONEN VON VARIABLEN
  • Die chemischen Formeln, die verschiedene Verbindungen oder Molekülfragmente in der Beschreibung und den Ansprüchen dargestellen, können neben ausdrücklich definierten Strukturmerkmalen variable Substituenten enthalten. Diese variablen Substituenten sind durch einen Buchstaben oder einen Buchstaben mit folgendem tiefgestelltem Zahlenindex identifiziert, z. B. „Zi" oder „Ri", worin „i" eine ganze Zahl ist. Diese variablen Substituenten sind einwertig oder zweiwertig, d. h. sie stellen eine Gruppe dar, die durch eine oder zwei chemische Bindungen an der Formel hängt. Eine Gruppe Zi würde z. B. eine zweiwertige Variable darstellen, wenn sie an der Formel CH3-C(=Zi)H hängt. Die Gruppen Ri und Rj würden einwertige variable Substituenten darstellen, wenn sie an der Formel CH3-CH2-C(Ri)(Rj)H2 hängen. Wenn chemische Formeln geradlinig gezeichnet sind, wie die oben, sind in Klammern enthaltene variable Substituenten an das Atom unmittelbar zur Linken des in Klammern enthaltenen variablen Substituenten gebunden. Wenn zwei oder mehr aufeinanderfolgende variable Substituenten in Klammern stehen, ist jeder der aufeinanderfolgenden variablen Substituenten an das unmittelbar vorhergehende Atom zur Linken gebunden, das nicht in Klammern steht. Somit sind in der obigen Formel Ri und Rj an das vorhergehende Kohlenstoffatom gebunden. Für jedes Molekül mit einem festgesetzten Nummerierungssystem der Kohlenstoffatome, wie bei Steroiden, sind diese Kohlenstoffatome als Ci bezeichnet, wobei „i" eine ganze Zahl entsprechend der Kohlenstoffatomzahl ist. C6 stellt z. B. die Stellung oder Kohlenstoffatomzahl 6 in dem Steroidkern dar, wie er herkömmlicherweise von Fachleuten auf dem Gebiet der Stereoidchemie bezeichnet wird. Ebenso bedeutet „R6" einen variablen (einwertigen oder zweiwertigen) Substituenten in der C6-Stellung.
  • Geradlinig gezeichnete chemische Formeln oder Teile davon bedeuten Atome in einer linearen Kette. Das Symbol „-" bedeutet im Allgemeinen eine Bindung zwischen zwei Atomen in der Kette. So bedeutet CH3-O-CH2-CH(Ri)-CH3 eine 2-substituierte 1-Methoxypropan-Verbindung. In ähnlicher Weise bedeutet das Symbol „=" eine Doppelbindung, z. B. in CH2=C(Ri)-O-CH3, und das Symbol „≡" bedeutet eine Dreifachbindung, z. B. HC≡C-CH(Ri)-CH2-CH3. Carbonylgruppen werden in einer von zwei Möglichkeiten dargestellt: -CO- oder -C(=O)-, wobei die erstere wegen der Einfachheit bevorzugt wird.
  • Eine starre cyclische (Ring)struktur für alle Verbindungen legt für an jedem Kohlenstoffatom der starren cyclischen Verbindung hängende Substituenten eine Ausrichtung zu der Ringebene fest. Für gesättigte Verbindungen, die zwei Substituenten an einem Kohlenstoffatom haben, das Teil eines Ringsystems ist, -C(X1)(X2)-, können die zwei Substituenten relativ zu dem Ring in einer axialen oder äquatorialen Position sein und zwischen axial/äquatorial wechseln. Die Lage der zwei Substituenten relativ zu dem Ring und zueinander bleibt jedoch fixiert. Während jeder Substituent gelegentlich in der Ringebene (äquatorial) anstatt über oder unter der Ebene (axial) liegen kann, ist ein Substituent immer über dem anderen. Bei chemischen Strukturformeln, die diese Verbindungen abbilden, wird ein Substituent (X1), der „unter" einem anderen Substituenten (X2) ist, als in der Alpha(α)-Konfiguration befindlich identifiziert und durch eine unterbrochende, gestrichelte oder gepunktete Linie zu dem Kohlenstoffatom, d. h. durch das Symbol „---" oder „..." identifiziert. Der entsprechende Substituent, der „über" (X2) dem anderen (X1) hängt, wird als in der Beta(β)-Konfiguration befindlich identifiziert und durch eine ununterbrochene Linienverbindung mit dem Kohlenstoffatom bezeichnet.
  • Wenn ein variabler Substituent zweiwertig ist, können in der Definition der Variablen die Valenzen zusammen oder getrennt genommen werden oder beides. Eine variable Ri, die an einem Kohlenstoffatom hängt, wie -C(=Ri)-, kann z. B. zweiwertig sein und als Oxo oder Keto (so eine Carbonylgruppe(-CO-) bilden) oder als zwei separat angehängte, einwertige, variable Substituenten α-Ri-j und β-Ri-k definiert sein. Wenn eine zweiwertige Variable Ri nach Definition aus zwei einwertigen variablen Substituenten besteht, wird die zweiwertige Variable regelmäßig in der Form „α-Ri-j:β-Ri-k" oder einer Variante davon definiert. In diesem Fall sind α-Ri-j und β-Ri-k an das Kohlenstoffatom angehängt, um -C(α-Ri-j)(β-Ri-k)- zu ergeben. Wenn z. B. die zweiwertige Variable R6 ist, ist -C(=R6)- als aus zwei einwertigen variablen Substituenten bestehend definiert, die α-R6-1:β-R6-2, ... α-R6-9:β-R6-10, usw. sind und somit -C(α-R6-1)(β-R6-2)-, ... -C(α-R6-9)(β-R6-10)-, usw. ergeben. Desgleichen sind für die zweiwertige Variable R11, -C(=R11)-, die einwertigen variablen Substituenten α-R11-1:β-R11-2. Bei einem Ringsubstituenten, für den keine separate α- und β-Orientierung existiert (z. B. wegen der Anwesenheit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in dem Ring), und für einen Substituenten mit Bindung an ein Kohlenstoffatom, das nicht Teil eines Ringes ist, findet die obige Regel ebenfalls Anwendung, jedoch werden die Bezeichnungen α und β weggelassen.
  • So wie eine zweiwertige Variable als zwei separate einwertige variable Substituenten definiert werden kann, können zwei separate einwertige variable Substituenten zusammen definiert werden, um eine zweiwertige Variable zu bilden. In der Formel -C1(Ri)H-C2(Rj)H- (C1 und C2 definieren willkürlich ein erstes bzw. zweites Kohlenstoffatom) kann z. B. Ri und Rj so definiert werden, dass sie zusammengenommen (1) eine zweite Bindung zwischen C1 und C2 bilden oder (2) eine zweiwertige Gruppe, wie Oxa (-O-) bilden und die Formel dadurch ein Epoxid beschreibt. Wenn Ri und Rj zusammengenommen ein komplexeres Gebilde, wie die Gruppe -X-Y- bilden, ist die Orientierung des Gebildes so, dass in der obigen Formel C1 an X und C2 an Y gebunden sind. So bedeutet die Bezeichnung „... Ri und Rj bilden zusammengenommen -CH2-CH2-O-CO- ..." nach Konvention ein Lacton, in dem das Carbonyl an C2 gebunden ist. Die Bezeichnung „... Rj und Ri bilden zusammengenommen -CO-O-CH2-CH2-" bedeutet nach Übereinkunft ein Lacton, in dem das Carbonyl an C1 gebunden ist.
  • Der Umfang an Kohlenstoffatomen variabler Substituenten ist in einer von zwei Möglichkeiten angegeben. Die erste Methode benutzt ein Präfix zu dem Gesamtnamen der Variablen, wie etwa „C1-C4", in dem „1" und „4" ganze Zahlen sind, die die Mindest- und Höchstzahl der Kohlenstoffatome in der Variablen bedeuten. Das Präfix ist in der Variablen durch einen Zwischenraum getrennt. „C1-C4-Alkyl" z. B. stellt Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar (einschließlich ihrer isomeren Formen, wenn nicht eine ausdrückliche Angabe des Gegenteils angegeben ist). Immer wenn dieses einzelne Präfix angegeben ist, bezeichnet es den gesamten Umfang an Kohlenstoffatomen der definierten Variablen. Somit beschreibt C2-C4-Alkoxycarbonyl eine Gruppe CH3-(CH2)n-O-CO-, worin n null, eins oder zwei ist. Nach der zweiten Methode wird der Kohlenstoffatomgehalt nur jedes Teils der Definition getrennt dadurch angegeben, dass man die „Ci-Cj"-Bezeichnung in Klammern unmittelbar (kein Zwischenraum) vor den Teil der Definition setzt, der definiert wird. Durch diese wahlfreie Übereinkunft hat (C1-C3)Alkoxycarbonyl die gleiche Bedeutung wie C2-C4-Alkoxycarbonyl, weil sich das „C1-C3" nur auf den Kohlenstoffatomgehalt der Alkoxygruppe bezieht. Während C2-C6-Alkoxyalkyl und (C1-C3)Alkoxy(C1-C3)alkyl Alkoxyalkylgruppen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen definieren, unterscheiden sich die zwei Definitionen ebenso, da die erstere Definition dem Alkoxy- oder Alkylteil alleine den Umfang von 4 oder 5 Kohlenstoffatomen zuordnet, während die letztere Definition jede dieser beiden Gruppen auf drei Kohlenstoffatome beschränkt.
  • Wenn die Ansprüche einen ziemlich komplexen (cyclischen) Substituenten enthalten, wird an dem Ende der Umschreibung/Bezeichnung jenes einzelnen Substituenten eine Angabe in (Klammern) stehen, die mit dem gleichen Namen/der gleichen Bezeichnung in einer der Tafeln korrespondiert, die ebenfalls die chemische Strukturformel jenes speziellen Substituenten angibt.
  • Es ist zu bemerken, dass die Angabe von Zahlenbereichen durch Endpunkte alle Zahlen und Bruchteile umfasst, die in den Bereich fallen (1 bis 5 z. B. umfasst 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4 und 5).
  • Es ist zu bemerken, dass „ein" hier so benutzt wird, dass es Einzahl und Mehrzahl umfasst.
  • Die hier benutzten allgemeinen Definitionen haben im Rahmen der vorliegenden Erfindung die folgenden Bedeutungen.
  • II. DEFINITIONEN
  • Alle Temperaturen sind in °Celsius.
  • TLC bezeichnet Dünnschichtchromatographie.
  • psi bezeichnet Pfund/Zoll2.
  • HPLC bezeichnet Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie.
  • THF bezeichnet Tetrahydrofuran.
  • DMF bezeichnet Dimethylformamid.
  • EDC bezeichnet Ethyl-1-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid oder 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid.
  • NBS bezeichnet N-Bromsuccinimid.
  • TEA bezeichnet Triethylamin.
  • BOC bezeichnet 1,1-Dimethylethoxycarbonyl oder t-Butoxycarbonyl, -CO-O-C(CH3)3.
  • CBZ bezeichnet Benzyloxycarbonyl, -CO-O-CH2-φ.
  • TFA bezeichnet Trifluoressigsäure, CF3-COOH.
  • CDI bezeichnet 1,1'-Carbonyldiimidazol.
  • Salzlösung bezeichnet eine wässrige gesättigte Natriumchloridlösung.
  • Chromatographie (Kolonnen- und Kurzwegchromatographie) bezieht sich auf die Reinigung/Trennung von Verbindungen, ausgedrückt als (Träger, Elutionsmittel). Es ist verständlich, dass die geeigneten Fraktionen vereinigt und konzentriert werden, um die gewünschte(n) Verbindung(en) zu ergeben.
  • CMR bezieht sich auf magnetische C-13-Resonanzspektroskopie, chemische Verschiebungen sind in ppm(δ) unterhalb von TMS angegeben.
  • NMR bezeichnet kernmagnetische (proton)magnetische Resonanzspektroskopie, chemische Verschiebungen sind in ppm(d) unterhalb von TMS angegeben.
  • -Φ bezeichnet Phenyl (C6H5).
  • MS bezeichnet Massenspektrometrie, ausgedrückt als m/e, m/z oder Masse/Ladung-Einheit. MH+ bezieht sich auf das positive Ion eines Mutterelements plus ein Wasserstoffatom. EI bezeichnet Elektronenstoß. CI bezeichnet chemische Ionisierung. FAB bezeichnet Bombardement durch schnelle Atome.
  • HRMS bezeichnet hochauflösende Massenspektrometrie.
  • Ether bedeutet Diethylether.
  • „APP", Amyloid-Vorstufenprotein, ist definiert als irgendein APP-Polypeptid einschließlich APP-Varianten, -Mutationen und -Isoformen, wie sie z. B. in US-Patent Nr. 5,766,846 beschrieben sind.
  • „Aβ", Beta-Amyloid-Beta-Peptid, ist als irgendein Peptid definiert, das aus einer durch β-Sekretase vermittelten Spaltung von APP resultiert, einschließlich Peptiden mit 39, 40, 41, 42 und 43 Aminosäuren, und schließlich von der β-Sekretase-Spaltungsstelle zu Aminosäuren 39, 40, 41, 42 oder 43 erstreckt.
  • „β-Sekretase" ist ein Aspartylprotease, die eine APP-Spaltung an dem aminoterminalen Ende von Aβ vermittelt. Menschliche β-Sekretase ist z. B. in WO 00/17369 beschrieben.
  • Eine Verbindung der Erfindung ist irgendeine hier beschriebene Verbindung mit Hemmaktivität gegen ein β-Sekretase-Enzym, gegen die Bildung von Aβ, gegen die Bildung von Beta-Amyloid-Abscheidungen oder -Plaques oder gegen die Entwicklung oder das Fortschreiten einer neurodegenerativen Erkrankung, wie der Alzheimerschen Krankheit, gemessen z. B. durch einen oder mehrere der hier beschriebenen Tests.
  • Pharmazeutisch zulässig bezieht sich auf jene Eigenschaften und/oder Substanzen, die von einem pharmakologischen/toxikologischen Gesichtspunkt für den Patienten akzeptabel sind und unter einem physikalischen/chemischen Gesichtspunkt bezüglich Zusammensetzung, Formulierung, Beständigkeit, Patientenakzeptanz und Bioverfügbarkeit für den herstellenden pharmazeutischen Chemiker akzeptabel sind.
  • Wenn Lösungsmittelpaare verwendet werden, sind die benutzten Lösungsmittelverhältnisse Volumen/Volumen (Vol./Vol.).
  • Wenn die Löslichkeit eines Feststoffs in einem Lösungsmittel benutzt wird, ist das Verhältnis des Feststoffs zu dem Lösungsmittel Gewicht/Volumen (Gew./Vol.).
  • BOP bezeichnet Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat.
  • TBDMSCl bezieht sich auf t-Butyldimethylsilylchlorid.
  • TBDMSOTf bezieht sich auf t-Butyldimethylsilyltrifluosulfonsäureester.
  • Trisomy 21 bezieht sich auf das Downsche Syndrom.
    • Ac
    = Acetyl (Methylcarbonyl)
    aq.
    = wässrig
    bd
    = Breitdublett
    bs
    = Breitsingulett
    c
    = Konzentration (g/ml)
    cc
    = Kubikzentimeter
    d
    = Dublett
    DCM
    = Dichlormethan = Methylenchlorid = CH2Cl2
    de
    = diastereomerer Überschuss
    EDTA
    = Ethylendiamintetraessigsäure
    eq.
    = Äquivalente
    EtOAC
    = Ethylacetat
    EtOH
    = Ethanol
    g
    = Gramm
    HOBT
    = 1-Hydroxybenzotriazol
    h
    = Stunde
    IC50
    = Hemmkonzentration einer Verbindung, die die Enzymaktivität um die Hälfte reduziert.
    iso
    = eine Alkylkette mit einer endenden 2-Methylpropylgruppe, d. h. -CH(CH3)2.
    IM
    = intramuskulär
    IV
    = intravenös
    SC
    = subkutan
    L
    = Liter
    LDA
    = Lithiumisopropylamid
    sm
    = Multiplett
    max
    = maximal
    mg
    = Milligramm
    ml
    = Mililiter
    mm
    = Millimeter
    mM
    = Millimolar
    mmol
    = Millimol
    mp
    = Schmelzpunkt
    MeOH
    = Methanol
    meq
    = Milliäquivalent
    MsOH
    = Methansulfonsäure
    n
    = normal, d. h. unverzweigt, z. B. n-Pr ist -CH2-CH2-CH3
    N
    = normal
    ng
    = Nanogramm
    nm
    = Nanometer
    OD
    = optische Dichte
    PEPC
    = 1-(3-(1-pyrrolidinyl)propyl)-3-ethylcarbodiimid
    pg
    = Picogramm
    pM
    = Picomolar
    Rf
    = Verhältnis der Bewegung einer Substanz auf einem Dünnschichtchromatogramm im Vergleich zu der Bewegung der Lösungsmittelfront.
    δ
    = Messeinheiten in der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie, die relativ zu einem Standard, z. B. Tetramethylsilan sind.
    q
    = Quartett
    quint.
    = Quintett
    rpm
    = Umdrehungen je Minute
    s
    = Singlett
    t
    = Triplett
    t oder tert
    = tertiär in einer Alkylkette, z. B. t-Butyl ist -C(CH3)3.
    μl
    = Mikroliter
    μM
    = Mikromolar (ein Konzentrationsausdruck in Mikromolen/Liter)
    UV
    = ultraviolett
  • Wenn nichts anderes angegeben ist, können alle Reste funktioneller Gruppen (z. B. Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, cyclisches Heteroaryl, Heterocyclus usw.) substituiert oder unsubstituiert sein. Substituierte funktionelle Gruppenreste können mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, wenn nichts anderes angegeben ist. Geeignete Substituenten für substituierte funktionelle Gruppenreste umfassen im Allgemeinen Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Alkylaryl, Arylalkoxy und dergleichen. Es ist verständlich, dass die Terminologie „X"-Rest, der durch ein Y substituiert ist" den „X"-Rest umfasst, der durch zwei oder mehr „Y" substituiert ist, wenn nichts anderes angegeben ist.
  • „Alkyl" bezieht sich auf lineare oder verzweigte, gesättigte, aliphatische Kohlenwasserstoffreste, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Octyl, Isopropyl, tert.-Butyl, sec-Pentyl und dergleichen.
  • „Cycloalkyl" bezieht sich auf cyclische aliphatische Kohlenwasserstoffreste, wie z. B. 3- bis 8-gliedrige Kohlenwasserstoffringe (z. B. Cyclohexyl oder Cyclopentyl), bicyclische 4- bis 10-gliedrige Kohlenwasserstoff-Ringsysteme und tricyclische 8- bis 14-gliedrige Kohlenwasserstoff-Ringsysteme. Monocyclische Cycloalkylgruppen umfassen z. B. Cyclohexan und Cyclopentan. Multicyclische Cycloalkylgruppen umfassen z. B. Cyclohexyl, Cyclopentyl und 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl.
  • „Heterocyclus" bezieht sich auf cyclische, nichtaromatische Reste, die wenigstens zwei Kohlenstoffatome und ein bis drei unter O, N und S ausgewählte Heteroatome als Glieder wenigstens eines Ringes enthalten. Beispiele dieser Reste sind 3- bis 8-gliedrige Ringe, bicyclische 4- bis 10-gliedrige Ringsysteme und tricyclische 8- bis 14-gliedrige Ringsysteme, wobei wenigstens ein Ring (und in einigen Fällen alle Ringe) jedes dieser Beispiele 1 bis 3 unter O, N und S ausgewählte Heteroatome als Ringglieder enthält. Monocyclische heterocyclische Gruppen sind z. B. Morpholinyl, Piperazinyl und Tetrahydrofuranyl. Multicyclische heterocyclische Gruppen sind z. B. Decahydrochinolin, Cyclohexenoxid und 3-Amino-3-Azabicyclo[3.3.0]octan.
  • „Alkylen" bezieht sich auf zweiwertige, lineare oder verzweigte, gesättige, aliphatische Kohlenwasserstoffreste, wie z. B. Methylen, Ethylen, Propylen, Butylen, Octylen, Isopropylen, tert.-Butylen, sec.-Pentylen und dergleichen.
  • „Alkenyl" bezieht sich auf lineare oder verzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffreste mit wenigstens einer Doppelbindung, wie z. B. Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Methyl-1-Propenyl und dergleichen.
  • „Alkynyl" bezieht sich auf lineare oder verzweigte, aliphatische Kohlenwasserstoffreste mit wenigstens einer Dreifachbindung, wie z. B. Ethynyl(Acetyl), 1-Propynyl, 2-Propynyl, 1-Butynyl und dergleichen.
  • „Aryl" bezieht sich auf cyclische aromatische Kohlenwasserstoffreste mit einem einzigen Ring, wie Phenyl, mit mehreren Ringen, wie Biphenyl, und mit mehreren kondensierten Ringen, wie Naphthyl und Anthryl. Monocyclische Arylgruppen umfassen z. B. Phenyl. Monocyclische Arylgruppen umfassen z. B. Naphthyl und Anthryl.
  • „Amin" umfasst primäre, sekundäre und tertiäre Amine, die gerad- oder verzweigtkettig sein können oder im Falle sekundärer und tertiärer Amine in Ringen (z. B. Morpholin und Piperazin) vorliegen können.
  • „Heteroaryl" bezieht sich auf cyclische aromatische Ringe mit 1 bis 4 unter S, O und N ausgewählten Heteroatomen sowie aromatischen, 7- bis 10-gliedrigen, organischen, beständigen, bicyclischen Ringen mit 1 bis 5 unter S, O und N ausgewählten Heteroatomen. Beispiele dieser Reste sind 3- bis 8-gliedrige Ringe, bicyclische 4- bis 10-gliedrige Ringsysteme und tricyclische 8- bis 14-gliedrige Ringsysteme, in denen wenigstens ein Ring (und in manchen Fällen alle Ringe) eines dieser Beispiele 1 bis 3 unter O, N und S ausgewählte Heteroatome als Ringglieder enthält.
  • „Acyloxy" bezieht auf die Gruppen R-C(O)O-, substituiertes R-C(O)O-, Cycloalkyl-C(O)O-, Aryl-C(O)O- und Heterocyclus-C(O)O, worin R = Alkyl, und Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und heterocyclisch wie hier an anderer Stelle definiert sind.
  • „Acylamino" bezieht auf die Gruppen R-C(O)N-, substituiertes R-C(O)N-, Cycloalkyl-C(O)N-, Aryl-C(O)N- und Heterocyclus-C(O)N-, worin R = Alkyl, und Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und heterocyclisch wie hier an anderer Stelle definiert sind.
  • „Amid" und „Amido" beziehen sich auf eine funktionelle Gruppe mit einem Kohlenstoffatom mit Doppelbindung an ein Sauerstoffatom und ferner Einfachbindung an ein Stickstoffatom [-C(O)-N]-. „Primäres" Amid beschreibt eine unsubstituierte Amidgruppe [-C(O)-NH2]. „Sekundäre" und „tertiäre" Amide sind Amide, in denen Stickstoff mit ein bzw. zwei Nichtwasserstoff-Gruppen substituiert ist. Die Bezeichnung „Lactam" bezieht sich auf ein cyclisiertes Amid, d. h. ein sekundäres oder tertiäres Amid, in dem die Carbonylgruppe und das Stickstoffatom benachbarte Glieder eines Ringes sind.
  • „Halogen" bezieht sich auf Fluor-, Chlor-, Brom- und Jodreste.
  • „Lacton" bezieht sich auf cyclisierte Ester einer Carbonsäure.
  • „Thio" bezieht sich auf den Ersatz von Sauerstoff durch Schwefel in einem definierten Rest. Beispiele einer Thioverbindung sind Alkylthiooxyverbindungen (z. B. Alkyl-S-).
  • „Thioxyalkyl" bezieht sich auf den zweiwertigen Rest -S-Alkyl-, worin Alkyl wie oben definiert ist. Beispiele von Thioxyalkyl-Molekülgruppen sind Alkyl-S-Alkyl-Molekülgruppen, wie CH3-S-CH2-CH2-.
  • „Alkoxy" bezieht sich auf den Rest -O-Alkyl, wobei Alkyl wie oben definiert ist. Alkoxygruppen sind z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isoproproxy und dergleichen.
  • „Arylalkyl" und „Aralkyl" bezieht sich einen Alkylrest, der mit einem Aryl substituiert ist.
  • „Alkylaryl" bezieht sich auf einen Arylrest, der mit einem Alkyl substituiert ist.
  • Alle die Bezeichnungen „Carboxyl", „Carbonsäure", „Carboxylat" und „Carbamoyl" sind Bezeichnungen, die sich auf funktionelle Grupppen beziehen, die ein Kohlenstoffatom mit Doppelbindung an ein Sauerstoffatom [C=O, auch ein Acyl oder eine Carbonylgruppe genannt und in linearer Aufzeichnung als -C(O)- dargestellt] und zusätzlich mit Einfachbindung an ein anderes Sauerstoffatom [-C(O)-O-] enthält und im Falle von Carbamoyl ferner ein Stickstoffatom an den Carbonylkohlenstoff gebunden ist, um -N-C(O)-O- zu ergeben. Carboxyl, Carboxylat und Carbamat umfassen die entsprechenden pharmazeutisch zulässigen C1-C6-Alkyl- und C6-C10-Arylester und sekundäre und tertiäre Amide.
  • Kombinationen dieser Bezeichnungen für funktionelle Gruppenreste werden ebenfalls benutzt. Das letzte Glied in der Bezeichnung enthält typischerweise den Rest, der an die übrige chemische Struktur bindet. Beispielsweise bezieht sich „Haloalkyl" auf einen mit einem Halogen substituierten Alkylrest, „Cycloalkylalkyl" bezieht sich auf einen mit einem Cycloalkyl substituierten Alkylrest, und „Alkylcycloalkyl" bezieht sich auf einen Cycloalkylrest, der mit einem Alkyl substituiert ist.
  • Tafel A
    Figure 00500001
  • Tafel A (Fortsetzung)
    Figure 00510001
  • Tafel A (Fortsetzung)
    Figure 00520001
  • Tafel B
    Figure 00530001
  • BEISPIELE
  • Ohne weitere Ausführung wird angenommen, dass ein Fachmann mit Benutzung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollen Umfang in die Praxis umsetzen kann. Die folgenden detaillierten Beispiele beschreiben, wie die verschiedenen Verbindungen herzustellen und/oder die verschiedenen Prozesse der Erfindung durchzuführen sind, und sollen nur als Erläuterung und nicht als Einschränkung der vorhergehenden Offenbarung in irgendeiner Weise ausgelegt werden. Die Fachleute kennen ohne weiteres geeignete Abänderungen der Arbeitsweisen hinsichtlich der Reaktionsteilnehmer und der Reaktionsbedingungen und -techniken.
  • Präparate der neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung unter Benutzung der Hydroxyethylen-Isosteren sind in den folgenden Beispielen erläutert.
  • Die nicht in den Anspruchsumfang fallenden Beispiele werden zu Informationszwecken beibehalten.
  • Syntheseverfahren
  • Die folgenden Reaktionsschemata erläutern in den Beispielen 1–13 Verfahren des Aufbaus der Hydroxyethylendipeptid-Isosteren. Bei diesen Reaktionen können veränderte Ausgangsmaterialien verwendet werden, um Hydroxyethylenkerne mit anderen Seitenkettengruppen herzustellen. Substitutionen verfügbarer Ausgangsmaterialien zur Bildung der gewünschten Seitenkettenvarianten werden dem Fachmann geläufig sein. Schema I Synthese einer für C-terminale Kupplung geeigneten, geschützten Hydroxyethylen-Molekülgruppe
    Figure 00550001
    • * Verfahren zur Herstellung von 1-Brom-5-methylhex-2-en:
      Figure 00550002
  • Alternativ können Hydroxyethylene durch das unten beschriebene Verfahren hergestellt werden. Die Synthese des Ausgangsmaterials Boc-3,5-difluorphenylalanin-threo-epoxid wurde aus der Arbeitsweise von Luly, JR et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 1487–1492 für die Synthese von Boc-Phenylalanin-threo-epoxid (Schema II) angepasst. Das benutzte Ausgangsmaterial zur Herstellung von Boc-3,5-difluorphenylalanin-threo-epoxid war Boc-geschütztes 1-3,5-Difluorphenylalanin, das von Synthetech, Inc. (1290 Industrial Way, P. O. Box 646, Albany, OR 97321 USA) erhältlich ist.
  • Schema II Bildung einer repräsentativen chiralen Epoxid-Vorstufe
    Figure 00560001
  • Die chirale Aminsynthese, die einleitende Alkylierungsstufe und weitere Verarbeitung zu dem Lacton wurden auf der Grundlage von Literaturverfahren wie folgt durchgeführt: Dragovich P. S. et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 1203–1222 Askin D., et al., J. Org. Chem. 1992, 57, 2771–2773. Die Spaltung der Boc-Schutzgruppe und anschließende Kupplung der Säure erfolgte nach den unten angegebenen Arbeitsverfahren zur Schutzaufhebung des Amins und EDC-Kupplung. Die Ringöffnung des Lactons zu dem Endprodukt erfolgte unter Benutzung einer durch AlMe3 vermittelten Kupplungsstufe nach dem Literaturverfahren von S. F. Martin et al., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 1517–1520.
  • Entfernung einer Boc-Schutzgruppe von einem geschützten Amin zur Erzeugung des freien Amins:
  • Das Boc-geschützte Alpha-Aminolacton-Zwischenprodukt des Schemas I oder II wurde in einer Trifluoressigsäure/Dichlormethan-(1/1)-Lösung gelöst. Die Reaktion wurde durch TLG überwacht, um den Zeitpunkt des Verbrauchs des Ausgangsmaterials festzulegen, an dem die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt wurden, um das freie Amin zu bilden, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • Kupplung von entschütztem Amin mit einer ausgewählten N-terminalen Kappungsgruppe:
  • 2-(N,N-Dipropyl)amidobenzoesäure (1,0 Äquiv.) wurde z. B. in 30 ml trockenem Dichlormethan gelöst, dann wurden HOBT (2,0 Äquiv.) funktionalisiertes α-Aminolacton aus der Stufe oben (1,0 Äquiv.) und TEA (5 Äquiv.) zugesetzt, und alles wurde 20 Minuten gerührt. EDC (1,2 Äquiv.) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann Wasser verdünnt und mit EtOAc (3×) extrahiert. Die organischen Schichten wurden mit wässriger Zitronensäure (2×), gesättigtem NaHCO3 (2×), Salzlösung gewaschen, dann über MgSO4 getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das Produkt dieser Stufe kann dann einer Lactonring-Aminolyse unterworfen werden, um die gewünschte Amidbindung zu bilden. Tabelle 1 Ergebnisse eines Enzym-Hemmungstests für Strukturen mit dem Peptidgerüst
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    • * Testverfahren ist in dem Beispiel 70 beschrieben
  • Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00600001
  • Beispiel 1
  • Diese Verbindung wurde hergestellt unter Verwendung des nach Schema I hergestellten, Amino- und Hydroxy-geschützten Hydroxyethylens. Die Verbindung wurde hergestellt nach harz-gestützten Standard-Peptidsyntheseverfahren unter Benutzung von Standard-HOBt, EDC-Kupplungsverfahren, die unter Schema II beschrieben sind. Boc-Phe wurde zu dem Harzträger verestert. Die Boc-Schutzgruppe wurde von dem Phe durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan (TFA/DCM) entfernt, und dann wurde mit Boc-Glu (Monoester) gekuppelt, wie oben beschrieben wurde. Der Cyclus der Amino-Schutzaufhebung und HOBt/EDC-Kupplung wurde mit Boc-Ala, dann mit der geschützten Hydroxyethylen-Molekülgruppe des Schemas I und dann mit Boc-Met und schließlich Ac-Val wiederholt. Der Glutamylester wurde durch LiOH-Hydrolyse entfernt. Die Silylgruppe wurde von der Hydroxylfunktion durch Behandlung mit tetra-t-Butylammoniumfluorid [(t-Bu)4NF] in THF entfernt.
  • Figure 00610001
  • Beispiel 2
  • p-Aminomethylbenzoesäuremethylester (im Handel erhältlich) wurde mit der Hydroxyethylen-Molekülgruppe des Schemas I unter Benutzung einer EDC/HOBt-Standardkupplung gekuppelt. Die Boc-Schutzgruppe wurde von dem N-Terminal entfernt und anschließend mit Boc-Val-Met gekuppelt. Der Methylester wurde wie oben beschrieben hydrolysiert, und die Silylgruppe wurde von der Hydroxylfunktion durch Behandlung mit tetra-t-Butylammoniumfluorid [(t-Bu)4NF] in THF entfernt.
  • Figure 00610002
  • Beispiel 3
  • Die Hydroxyethylen-Molekülgruppe des Schemas I wurde mit dem Dimethylester des 3,5-Dicarboxycyclohexylamins gekuppelt, der wie in Schema VIA hergestellt war. Dieses Zwischenprodukt wurde seinerseits an dem N-Terminal mit TFA/DCM entschützt und dann mit der Alpha-Hydroxy-Naphthylessigsäure gekuppelt. Die Methylester wurden mit LiOH hydrolysiert, und dann wurde die Silylgruppe von der Hydroxylfunktion durch Behandlung mit tetra-t-Butylammoniumfluorid [(t-Bu)4NF] in THF entfernt.
  • Figure 00620001
  • Beispiel 4
  • Das nach Schema I hergestellt geschützte Hydroxyethylen wurde mit dem Dimethylester des 3,5-Dicarboxycyclohexylamins (Schema VIA) gekuppelt. Der Diester wurde mit LiOH hydrolysiert, und die Silyl-Schutzgruppe wurde durch Behandlung mit tetra-t-Butylammoniumfluorid [(t-Bu)4NF] in THF entfernt.
  • Figure 00620002
  • Beispiel 5
  • (Diastereomerisch an dem α-Hydroxy-Naphthylacetyl)
  • Die Hydroxyethylen-Molekülgruppe des Schemas I wurde mit dem Methyl-3-(1-aminopropyl)-4-benzoat (im Handel erhältlich) gekuppelt. Dieses Zwischenprodukt wurde seinerseits an dem N-Terminus mit TFA/DCM (1:1) entschützt und dann mit der alpha-Hydroxy-naphthylessigsäure gekuppelt. Der Methylester wurde mit LiOH hydrolysiert, und dann wurde die Silylgruppe von der Hydroxylfunktion durch Behandlung mit tetra-t-Butylammoniumfluorid [(t-Bu)4NF] in THF entfernt.
  • Figure 00630001
  • Beispiel 6
  • Dieses Pentapeptid-Isostere wurde hergestellt, um die Wirksamkeit der α-Hydroxy-naphthylessigsäure als eine in einer Oligopeptidsequenz peptidomimetische, N-terminale Gruppe zu testen, die gute Aktivität (siehe Beispiel 1) zeigte. Die Hydroxyethylen-Molekülgruppe wurde nach dem Verfahren des Schemas I hergestellt. Die harzgestützte Synthese wurde zur Herstellung des Moleküls benutzt durch Bindung von Boc-Phg an einen Harzträger und dann sequenziellen Aufbau durch Entfernung der Boc-Schutzgruppe und HOBt/EDC-Kupplung ihrerseits mit Glutaminsäuremethylester, Valin, das Hydroxyethylen-Isostere des Schemas I und schließlich mit α-Hydroxy-naphthylessigsäure. Das Produkt wurde dann von dem festen Träger abgespalten, und die Schutzgruppen wurden entfernt, wie in den Beispielen oben beschrieben wurde.
  • Figure 00630002
  • Die Herstellung der Beispiele 1–6, wie sie oben in Tabelle I beschrieben wurde, ist in Schema I skizziert.
  • Beispiel 7
  • Nachdem die C-terminale Kupplung wie oben beschrieben durchgeführt war, wurde das Lacton bei Rückflusstemperaturen mit 3,5-Dimethylcyclohexylamin in Gegenwart von AlMe3 und einem geeigneten organischen Lösungsmittel der Aminolyse unterworfen, um die gegenständliche Verbindung herzustellen.
  • Figure 00640001
  • Beispiel 8
  • Nachdem die C-terminale Kupplung wie oben beschrieben durchgeführt war, wurde das Lacton bei Rückflusstemperaturen mit 6-Aminohexansäure in Gegenwart von AlMe3 und einem geeigneten organischen Lösungsmittel der Aminolyse unterworfen, um die gegenständliche Verbindung herzustellen.
  • Figure 00640002
  • Beispiel 9
  • Nachdem die C-terminale Kupplung wie oben beschrieben durchgeführt war, wurde das Lacton bei Rückflusstemperaturen mit 8-Aminooctansäure in Gegenwart von AlMe3 und einem geeigneten organischen Lösungsmittel der Aminolyse unterworfen und dann in MeOH gelöst und mit HCl behandelt, um den gewünschten Methylester zu bilden.
  • Figure 00650001
  • Beispiel 10
  • Nachdem die C-terminale Kupplung wie oben beschrieben durchgeführt war, wurde das Lacton bei Rückflusstemperaturen mit 4-Carboxycyclohexylmethylamin in Gegenwart von AlMe3 und einem geeigneten organischen Lösungsmittel der Aminolyse unterworfen, um die gegenständliche Verbindung herzustellen.
  • Figure 00650002
  • Beispiel 11
  • Die gegenständliche Verbindung wurde wie in Beispiel 10 hergestellt mit der Ausnahme, dass in der ersten Stufe der Herstellung des chiralen Oxazolidin-Zwischenprodukts n-Butanoylchlorid durch 3-Phenylpropionylchlorid (Aldrich Chemical) ersetzt wurde.
  • Figure 00650003
  • Beispiel 12
  • Die gegenständliche Verbindung wurde wie in Beispiel 10 hergestellt mit der Ausnahme, dass in der ersten Stufe der Herstellung des chiralen Oxazolidin-Zwischenprodukts n-Butanoylchlorid durch n-Pentanoylchlorid (Aldrich Chemical) ersetzt wurde.
  • Figure 00660001
  • Beispiel 13
  • Die gegenständliche Verbindung wurde wie in Beispiel 10 hergestellt mit der Ausnahme, dass in der ersten Stufe der Herstellung des chiralen Oxazolidin-Zwischenprodukts n-Butanoylchlorid durch n-Propionylchlorid ersetzt wurde.
  • Figure 00660002
  • Die in den Beispielen 14–22 angegebenen Verbindungsformeln entsprechend denen, die in TAFEL A aufgeführt sind. Die folgenden Beispiele beziehen sich ferner auf jene Verbindungen in der TAFEL A, bei denen R1 = -(CH2)-3,5-Difluorbenzyl, R2 = Et, RN = N',N'-Dipropylisophthalamid, RC = anti-4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure und die Schutzgruppe ist Boc. Die Identität des R2-Substituenten wird durch das Ausgangsmaterial (nämlich Verbindungen der Formel (XIII)) bestimmt, das bei der Synthese des Zwischenprodukts (VII) benutzt wurde, wie in TAFEL B skizziert ist. Das nach TAFEL B hergestellte Zwischenprodukt (VII) wird dann durch Umsetzung mit Epoxid (XI) in das Syntheseschema für die Herstellung von Hydroxyethylen-Verbindungen der Formel (XII) eingebaut, wie in TAFEL A skizziert ist.
  • Beispiel 14
  • (L)-[2-(3,5-Difluorphenyl)-1-(methoxymethylcarbamoyl)-ethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (III)
  • (L)-2-tert.-Butoxycarbonylamino-3-(3,5-difluorphenyl)-propionsäure (Synthetech Inc., II, 2,66 g, 8,83 mmol) wurde in einem Gemisch aus trockenem THF (5 ml) und trockenem DMF (2 ml) bei Raumtemperatur gelöst. 1,1-Carbonyldiimidazol (1,71 g, 10,6 mmol) wurden der Lösung in einer Portion zugesetzt. Nach Beendigung der Gasentbindung wurde durch eine Spritze bei Raumtemperatur eine Lösung von N-Methyl-O-methylhydroxylamin-Hydrochlorid (0,955 g, 9,79 mmol) und Diisopropylethylamin (1,6 ml, 9,19 mmol) in DMF (4 ml) zugesetzt. Dieses wurde bei Raumtemperatur 17 h gerührt, worauf das Reaktionsgemisch mit 10% Zitronensäure abgeschreckt wurde. Das Gemisch wurde mit EtOAc extrahiert. Der organische Extrakt wurde gewaschen (gesättigtes NaHCO3, gesättigtes NaCl), getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kurzwegchromatographie (Elution mit 30% EtOAc/Hexane) gereinigt, um ein Öl als Produkt zu ergeben: M + Na+ 367,1.
  • Beispiel 15
  • (L)-[1-(3,5-Difluorbenzyl)-2-oxoethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (IV)
  • (L)-[2-(3,5-Difluorphenyl)-1-(methoxymethylcarbamoyl)-ethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (III, 2,56 g) wurde in trockenem THF (50 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Diesem Gemisch wurde im Verlauf von 5 Minuten Lithiumaluminiumhydrid-Pulver (285 mg) in Anteilen zugesetzt. Die resultierende Suspension wurde 1 h bei 0°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C durch langsame Zugabe gesättigter Zitronensäure abgeschreckt, bis die Gasentbindung beendet war, mit anschließender tropfenweiser Zugabe von wässriger 10%-iger Zitronensäure (30 ml). Dies überließ man dann der Erwärmung auf Raumtemperatur. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Et2O extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen (gesättigtes NaHCO3, gesättigtes NaCl), getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck zu einem Feststoff konzentriert, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • Beispiel 16
  • (L)-[1-(3,5-Difluorbenzyl)-allyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (V)
  • Kaliumhydrid (35%ige Suspension in Mineralöl, 1,76 g) wurde in einem Gemisch aus trockenem THF (20 ml) und DMSO (4 ml) suspendiert und auf 0°C abgekühlt. Durch eine Spritze wurde 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan (4,0 ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde 45 Minuten bei 0°C gerührt. Methyltriphenylphosphoniumbromid (5,57 g) wurde zugesetzt, und die resultierende gelbe Trübe wurde 1 h bei 0°C gerührt, worauf das Gemisch auf –78°C abgekühlt wurde. Eine Lösung von (L)-[1-(3,5-Difluorbenzyl)-2-oxoethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (IV, 2,2 g) in THF (15 ml) wurde durch eine Kanüle bei –78°C zugesetzt. Die resultierende Suspension wurde 15 Min bei –78°C gerührt und dann 16 Stunden der Erwärmung auf Raumtemperatur überlassen. MeOH (2 ml) und halbgesättigte Natriumbicarbonatlösung (100 ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde mit EtOHC (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen (Wasser, gesättigte NaCl), getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kurzwegchromatographie (10–20% Et2O/Hexane) gereinigt, um einen Feststoff als Produkt zu ergeben: M + Na+ 306,1.
  • Beispiel 17
  • (1S,2R)-[2-(3,5-Difluorphenyl)-1-oxiranylethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (VI)
  • (L)-[1-(3,5-Difluorbenzyl)allyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (V, 3,3 g) wurde in CH2Cl2 (130 ml) gelöst, und m-Chlorperbenzoesäure (50–55% rein, 16,0 g) wurde bei Raumtemperatur unter Rührung zugesetzt. Nach 23 h wurde das Reaktionsgemisch mit Et2O verdünnt, gewaschen (10% Na2SO3, gesättigtes NaHCO3, gesättigtes NaCl), getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck zu einem Feststoff konzentriert: M + Na+ 322,1.
  • Beispiel 18
  • (1S,2S,4R)-[1-(3,5-Difluorbenzyl)-4-((3aS,8aR)-2,2-dimethyl-8,8a-dihydro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-carbonyl)-2-hydroxyhexyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (VIII)
  • (1S,2S)-[2-(3,5-Difluorphenyl)-1-oxiranylethyl]- Carbaminsäure-tert.-butylester (VI, 113 mg) und 1-((3aS,8aR)-2,2-Dimethyl-8,8a-dihydro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-yl)-butan-1-on (VII, 94 mg) wurden in trockenem THF (3 ml) vereinigt und auf –78°C abgekühlt. Dieser Lösung wurde über 5 Minuten BuLi (2,5 M in Hexanen, 0,32 ml) zugesetzt, worauf die Lösung 1,5 h der Erwärmung auf 0°C überlassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 0,5 N HCl (4 ml) und 1:1 EtOAc/Hexanen (2 × 4 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kurzwegchromatographie (20–30% EtOAc/Hexane) zu einem Öl gereinigt: MH+ 559,1.
  • Beispiel 19
  • [2-(3,5-Difluorphenyl)-1-(S)-(4-(R)-ethyl-5-oxo-tetrahydrofuran-2-(S)-yl)-ethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (IX)
  • (1S,2S,4R)-[1-(3,5-Difluorbenzyl)-4-((3aS,8aR)-2,2-dimethyl-8,8a-dihydro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-carbonyl)-2-hydroxyhexyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (VIII, 60 mg) wurde in 5:1 Toluol/CH2Cl2 (3 ml) gelöst, und p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (23 mg) wurde zugesetzt. Dieses wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann filtriert und zwischen halbgesättigtem NaHCO3 (3 ml) und 1:1 EtOAC/Hexanen (2 × 3 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Die Kurzwegchromatographie des Rückstands ergab das gewünschte Produkt als einen Feststoff: MH+ 370,2.
  • Beispiel 20
  • 5S-[1S-Amino-2-(3,5-difluorphenyl)ethyl]-3R-ethyldihydrofuran-2-on (X)
  • [2-(3,5-Difluorphenyl)-1-(S)-(4-(R)-ethyl-5-oxo-tetrahydrofuran-2-(S)-yl)-ethyl]-carbaminsäure-tert.-butylester (IX, 313 mg) wurde bei Raumtemperatur in CH2Cl2 (1 ml) gelöst, worauf CF3COOH (1 ml) zugesetzt wurde. Dies wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Dieses Produkt wurde in der nächsten Reaktion ohne weitere Reinigung eingesetzt.
  • Beispiel 21
  • N-{2-(3,5-Difluorphenyl)-(1S,2S,4R)-[1-(4-ethyl-5-oxotetrahydrofuran-2-yl)]ethyl}-N',N'-dipropylisophthalamid (XI)
  • 5S-[1S-Amino-2-(3,5-difluorphenyl)ethyl]-3R-ethyldihydrofuran-2-on (X, 228 mg theoretisch) wurde in trockenem DMF (2 ml) bei 0°C mit Triethylamin (0,7 ml) vereinigt. N,N-Dipropylisophthalaminsäure (242 mg) wurde zugesetzt und gelöst. 1-Hydroxybenzotriazol (224 mg) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (320 mg) wurden nacheinander zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 0°C gerührt und dann 4 Stunden der Erwärmung auf Raumtemperatur überlassen. Das Gemisch wurde dann mit 10% Zitronensäure verdünnt und mit EtOAC 3× extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen (gesättigtes NaHCO3, gesättigtes NaCl), getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kurzwegchromatographie (Elution mit 50% EtOAc/Hexanen) gereinigt, um einen Feststoff zu ergeben: MH+ 501,3.
  • Beispiel 22
  • 4-(anti)-{[6-(3,5-Difluorphenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoylbenzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxyhexanoylamino]-methyl}cyclohexancarbonsäure (XII)
  • Anti-4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure (57 mg) wurde in 1,2-Dichlorethan (2 ml) suspendiert und auf 0°C abgekühlt. Trimethylaluminium (2,0 M in Toluol, 0,21 ml) wurde zugesetzt und anschließend wurde eine Lösung von N-{2-(3,5-Difluorphenyl)-(1S,2S,4R)-[1-(4-ethyl-5-oxotetrahydrofuran-2-yl)]ethyl}-N',N'-dipropylisophthalamid (XI, 30 mg) in 1,2-Dichlorethan (1 ml) zugesetzt. Dies wurde dann 1,5 h zum Rückfluss erhitzt, worauf das Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und mit 3 N HCl (2 ml) abgeschreckt wurde. Die Trübe wurde 30 Min bei 0°C gerührt und dann mit 3 × 5 ml 10% iPrOH/CHCl3 extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kurzwegchromatographie (Elution mit 5–10% MeOH/CH2Cl2) gereinigt, um einen Feststoff zu ergeben: MH+ 658,4.
  • Die in den Beispielen 23–34 angegebenen Verbindungsformeln entsprechen denen, die in TAFEL B aufgeführt sind. Ferner beziehen sich die folgenden Beispiele auf die Verbindungen, die in TAFEL B, R2 = Et, angegeben sind.
  • Beispiel 23
  • N-(1S,2R)-(2-Hydroxyindan-1-yl)-butyramid (XV)
  • (1S,2R)-cis-1-Amino-2-indanol (XIV, 1,5 g) wurde mit Triethylamin (1,5 ml) in trockenem THF (45 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Durch eine Spritze wurde Butyrylchlorid (XIII, 1,05 ml) zugesetzt, und die resultierende Lösung wurde 20 Minuten bei 0°C gerührt, worauf das Reaktionsgemisch zwischen halbgesättigtem NH4Cl (45 ml) und EtOAC (2 × 45 ml) verteilt wurde. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um einen Feststoff zu ergeben, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktion eingesetzt wurde.
  • Beispiel 24
  • 1-((3aS,8aR)-2,2-Dimethyl-8,8a-dihydro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-yl)-butan-1-on (VII)
  • N-(1S,2R)-(2-Hydroxyindan-1-yl)-butyramid (XV, 2,2 g) und 2-Methoxypropen (5 ml) wurden bei Raumtemperatur mit CH2Cl2 (70 ml) vereinigt, und Methansulfonsäure (0,05 ml) wurde zugesetzt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zwischen halbgesättigtem NaHCO3 (30 ml) und CH2Cl2 (2 × 30 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um als Produkt ein Öl zu ergeben: MH+ 260,1.
  • Die nachfolgend angegebenen Beispiele 25–30 beziehen sich auf die Synthese für N-terminale Kappungsgruppen.
  • Beispiel 25
  • Hydroxylierte und benzylierte N-terminale Kappungsgruppen
  • Die Herstellung hydroxylierter und benzylierter N-terminaler Kappungsgruppen aus aromatischen Essigsäure-Ausgangsmaterialien ist unten in Schema III dargestellt. Moersch, GW und Zwiesler, ML (Synthesis, 1971, 647–648, Hinweis 1 in Schema III) zeigen eine Synthese, die für die Herstellung einer Kappungsgruppe mit N-terminaler Arylalkylhydroxycarbonsäure nützlich ist. Die Arbeitsweise ergibt hier eine α-Hydroxylierung von 1-Naphthylessigsäure unter Benutzung von Lithiumdiethylamin und Sauerstoff. Hon, Yung-Son, Chang, Rong-Chi, Chau, Tay-Yuan (Heterocycles, 1990, Band 31, Nr. 10, 1745–1750, Hinweis 2 in Schema III) zeigen eine Synthese des entsprechenden Benzylethers aus dem α-Hydroxyaromaten durch Veresterung der Carboxyfunktion und Veretherung mit Benzylbromid. Die α-Hydroxysäure oder das Benzylether-Derivat ist für eine N-terminale Kappung geeignet.
  • Schema III
    Figure 00720001
  • Beispiel 26 Herstellung von Carboxybenzamiden: Schema IVA
    Figure 00730001
  • Methylisophthalat (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) (1 Äquiv., 11,1 mmol) wurde in 50:50 THF:DMF (20 ml) bei Umgebungstemperatur vor der Zugabe von 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) (1,2 Äquiv., 13,3 mmol) gelöst. Nach Zugabe von CDI wurde Gasentwicklung (CO2) beobachtet. Nachdem die Gasentwicklung nachließ (etwa nach 1 Minute oder weniger) wurde das Amin (1,2 Äquiv., 13,3 mmol) zugesetzt. Nach 12 h Rührung bei Umgebungstemperatur wurde das Reaktionsgemisch zwischen gesättigtem wässrigem NH4Cl und Ethylacetat verteilt, und die wässrige Schicht wurde noch zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden dann mit gesättigten wässrigen Lösungen von NaHCO3 und NaCl gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 oder NaSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab den rohen weißen Feststoff oder ein klares Öl. Falls nötig wurde die Reinigung dieser Verbindungen durch Chromatographie auf Silikagel mit 30–40% Ethylacetat in Hexanen erreicht.
  • Das Methylisophthalat-monoalkylamid oder -dialkylamid wurde dann mit LiOH × H2O (3 Äquiv., 33,3 mmol) in einer minimalen Menge von THF:MeOH:H2O im Verhältnis 1:2:1 behandelt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Nach 12 h wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, anschließend wurde zwischen H2O und Ethylacetat verteilt. Wenn Emulsionen die Trennung der beiden Schichten verhinderten, wurde eine kleine Menge Salzlösung zugesetzt, um die Trennung zu unterstützen. Die wässrige Schicht wurde nochmals mit Ethylacetat extrahiert (um jegliches nicht umgesetztes Ausgangsmaterial zu entfernen). Die wässrige Schicht wurde dann mit konzentrierter HCl bis pH ≤ 3 angesäuert. Die so erhaltene trüb-weiße saure wässrige Lösung wurde dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Diese vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem MgSO4 oder NaSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab einen Feststoff. Das Mono- oder Dialkylamid-Isophthalat wurde roh in der nächsten Reaktion eingesetzt.
  • Beispiel 27 Herstellung von Carboxybenzamiden: Schema IVB
    Figure 00740001
  • Methylisophthalat (1 Äquiv., 11,1 mmol) wurde bei Umgebungstemperatur vor der Zugabe von 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) (1,2 Äquiv., 13,3 mmol) in 50:50 THF:DMF (20 ml) gelöst. Nach Zugabe des CDI wurde Gasentwicklung (CO2) beobachtet. Nachdem die Gasentwicklung nachgelassen hatte (etwa 1 Minute oder weniger) wurden das in DMF gelöste Amin (1,2 Äquiv., 13,3 mmol) und Diisopropylethylamin (1,2 Äquiv., 13,3 mmol) zugesetzt. Nach 12 h Rührung bei Umgebungstemperatur wurde das Reaktionsgemisch zwischen gesättigtem wässrigem NH4Cl und Ethylacetat verteilt, und die wässrige Schicht wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden dann mit gesättigten wässrigen Lösungen von NaHCO3 und NaCl gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 oder NaSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab einen Feststoff oder ein Öl. Die Reinigung dieser Verbindungen wurde nötigenfalls durch Chromatographie auf Silikagel mit 30–40% Ethylacetat in Hexanen erreicht.
  • Das Methylisophthalat-monoalkylamid oder -dialkylamid (1 Äquiv., 11,1 mmol) wurde dann mit LiOH × H2O (3 Äquiv., 33,3 mmol) in einer minimalen Menge von THF:MeOH:H2O im Verhältnis 1:2:1 behandelt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Nach 12 h wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, anschließend wurde zwischen H2O und Ethylacetat verteilt. Wenn Emulsionen die Trennung der beiden Schichten verhinderten, wurde eine kleine Menge Salzlösung zugesetzt, um die Trennung zu unterstützen. Die wässrige Schicht wurde nochmals mit Ethylacetat extrahiert (um jegliches nicht umgesetztes Ausgangsmaterial zu entfernen). Die wässrige Schicht wurde dann mit konzentrierter HCl bis pH ≤ 3 angesäuert. Die so erhaltene trüb-weiße saure wässrige Lösung wurde dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Diese vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem MgSO4 oder NaSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab einen Feststoff. Das Mono- oder Dialkylamid-Isophthalat wurde roh in der nächsten Reaktion eingesetzt.
  • Beispiel 28 Herstellung von primärem Amid Schema IVC
    Figure 00750001
  • Methylisophthalat (1 Äquiv., 11,1 mmol) wurde bei Umgebungstemperatur vor der Zugabe von 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) (1,2 Äquiv., 13,3 mmol) in THF:DMF 50:50 (20 ml) gelöst. Nach Zugabe von CDI wurde eine Gasentwicklung (CO2) beobachtet. Nach 5 Minuten wurde Ammoniakgas 1 h lang durch eine Spritzennadel in die Lösung eingeperlt. Da sich das Reaktionsgemisch infolge einer Exothermie erwärmte, wurde es für die Dauer der Stunde auf 0°C abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht unter einem Ammoniakballon der Rührung überlassen. Nach 12 h wurde das Reaktionsgemisch zwischen gesättigtem wässrigem NH4Cl und Ethylacetat verteilt, und die wässrige Schicht wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden dann mit gesättigten wässrigen Lösungen von NaHCO3 und NaCl gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 oder NaSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab einen Feststoff oder ein Öl. Die Reinigung durch Chromatographie auf Silikagel mit 5% Isopropanol in Chloroform ergab das gewünschte primäre Amid.
  • Das primäre Methylisophthalatamid (7,26 mmol) wurde dann mit LiOH × H2O (3 Äquiv., 21,8 mmol) in einer minimalen Menge THF:MeOH:H2O 1:2:1 behandelt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Nach 12 h wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt und anschließend wurde zwischen H2O und Ethylacetat verteilt. Die wässrige Schicht wurde erneut mit Ethylacetat extrahiert (um jegliches nicht umgesetztes Ausgangsmaterial zu entfernen). Die wässrige Schicht wurde dann mit konzentrierter HCl bis pH ≤ 3 angesäuert. Die so erhaltene trüb-weiße saure wässrige Lösung wurde dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Diese vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem MgSO4 oder NaSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergaben einen Feststoff. Das Mono- oder Dialkylamid des Isophthalats wurde roh in der nächsten Reaktion eingesetzt.
  • Beispiel 29 Herstellung von heterocyclischen Amiden
    Figure 00760001
  • Schema IVD
  • Methylisophthalat (1,2 Äquiv., 2,78 mmol) wurde in trockenem CH2Cl2 und drei Tropfen DMF (katalytisch) gelöst. Die Lösung wurde vor der tropfenweisen Zugabe von Oxalylchlorid (2 Äquiv., 4,63 mmol) auf 0°C abgekühlt. Das Gemisch wurde 1 h bei 0°C gerührt. Das Gemisch löste sich durchaus nicht. Nach 1 h wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Säurechlorid wurde über Nacht unter Vakuum belassen.
  • Das rohe Säurechlorid (1 Äquiv., 2,78 mmol) wurde in trockenem CH2Cl2 gelöst und vor der Zugabe von NEt3 (5 Äquiv., 11,6 mmol) und N-Methylpiperidin (6 Äquiv., 13,9 mmol) auf 0°C abgekühlt. Die Reaktion wurde 2 h bei 0°C gerührt, bevor die Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurden. Der Rückstand wurde mit H2O und Ethylacetat verdünnt, und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde noch zweimal mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Extrakt wurden mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Die Filtration des Trocknungsmittels und die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab das rohe Produkt.
  • Das rohe Amid (1 Äquiv., 2,19 mmol) wurde dann mit LiOH·H2O (1 Äquiv., 2,19 mmol) in einer minimalen Menge THF:MeOH:H2O 1:2:1 behandelt und bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Nach 12 h wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und anschließend wurde zwischen H2O und Ethylacetat verteilt. Die wässrige Schicht wurde erneut mit Ethylacetat extrahiert (um jegliches nicht umgesetztes Ausgangsmaterial zu entfernen). Die Entfernung von H2O aus der wässrigen Schicht im Vakuum ergab einen Feststoff.
  • Beispiel 30 Herstellung aromatischer α-Hydroxysäuren (dargestellt durch die Herstellung mit α-Hydroxy-α-(2-biphenyl)essigsäure) Schema V
    Figure 00770001
  • Eine Lösung von CH2Cl2 (25 ml) und Oxalylchlorid (2 ml, 21,16 mmol) wurde in einen unter Stickstoff erhaltenen 100-ml-Rundkolben gegeben. Die Oxalylchloridlösung wurde bei –50 bis –60°C gerührt. Me2SO (2,5 ml, 35, 82 mmol) wurde in CH2Cl2 (5 ml) gelöst. Das Me2SO wurde der gerührten Oxalylchlorid-Lösung bei –50 bis –60°C tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Min gerührt, und der 2-Phenylbenzylalkohol (16,28 mmol in 10 ml CH2Cl2) wurde innerhalb 5 Min zugesetzt; die Rührung wurde weitere 60 Min fortgesetzt. TEA (11,30 ml, 81,4 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 60 Min gerührt und dann der Erwärmung auf Raumtemperatur überlassen. Dann wurde Wasser (60 ml) zugesetzt, und die wässrige Schicht wurde mit zusätzlichem CH2Cl2 (60 ml) rückextrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaCl-Lösung (120 ml) gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Die filtrierte Lösung wurde in einem Drehverdampfer zur Trocknung konzentriert. Das Öl wurde auf Silikagel (Hexane:EtOAc 98:2) chromatographiert, um 1 ergeben.
  • Ein Gemisch aus 5,46 mmol des aromatischen Aldehyds (1) in 10 ml CHCl3 und β-Cyclodextrinen (CDs) (0,11 mmol) und Triethylbenzylammoniumchlorid (TEBA) (0,273 mmol) in einem mit einem Magnetrührer und Tropftrichter ausgestatteten Kolben wurde 20 Minuten bei 50°C gerührt. Dann wurden dem Kolben unter Rührung tropfenweise 10 g Natriumhydroxid in 10 ml Wasser gelöst zugesetzt. Nach Beendigung dieser Zugabe wurde die Reaktion 8 h fortgesetzt, wobei die Temperatur bei 50°C gehalten wurde. Dann wurde genug destilliertes Wasser zugegeben, um den während der Reaktion gebildeten Niederschlag aufzulösen, und die resultierende Lösung wurde intensiv mit Ether gewaschen, mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 eingestellt und mit 3 × 30 ml Ether extrahiert. Der Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, dann zur Trocknung eingedampft, und der verbleibende Niederschlag wurde der Säulenchromatographie auf Silikagel mit DCM:MeOH:AcOH (95:5:1) unterworfen, um 2 zu ergeben.
  • Die nachfolgend angegebenen Beispiele 31 und 32 beziehen sich auf die Synthese N-terminaler Kappunqsgruppen.
  • Beispiel 31
  • 1-Amino-3,5-cis,cis-dimethyl-cyclohexyldicarboxylat
  • Zu 10 g (47,85 mmol) Dimethyl-5-isophthalat in 25 ml Essigsäure und 50 ml Methanol wurden 5 g 5% Rhodium in Aluminiumoxid in einer Hochdruckflasche zugesetzt, die mit Wasserstoff von 55 psi gesättigt und eine Woche lang geschüttelt wurde.
  • Schema VIA
    Figure 00790001
  • Das Gemisch wurde dann durch eine dicke Celitkuchenschicht filtriert und dreimal mit Methanol gespült. Die Lösungsmittel wurden konzentriert, und der rohe Feststoff wurde mit Diethylether verrieben und erneut filtriert. Er ergab 1-Amino-3,5-cis,cis-dimethyl-cyclohexyldicarboxylat; die Umkehrphasen-HPLC zeigte eine Reinheit von 94,4%.
  • Beispiel 32
  • 1-Amino-3,5-cis,cis-dimethoxycyclohexan
  • 10 g (65,36 mmol) 3,5-Dimethoxyanilin wurden wie in der obigen Arbeitsweise beschrieben umgesetzt und ergaben 1-Amino-3,5-cis,cis-dimethoxycyclohexan.
  • Schema VIB
    Figure 00800001
  • Bei Verfolgung der in den Beispielen 14–22 skizzierten allgemeinen Arbeitsweise mit unwesentlichen Veränderungen wurden die folgenden Austauschamine der Formel (XII) erhalten. Diese Austauschamine der Formel (XII) sind in den Tabellen 2, 3 und 4 als Beispiele aufgeführt.
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Beispiel 69
  • Benzyl(1S)-2-(3,5-Difluorphenyl)-1-[(2R)-oxiranyl]ethylcarbamat (VI)
  • Nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 17 und ohne wesentliche Änderungen, aber ausgehend von dem Alkohol (IV) Benzyl(1S,2R)-3-chlor-1(3,5-difluorbenzyl)-2-hydroxypropylcarbamat wurde die Titelverbindung erhalten.
  • Beispiel 70
  • Enzym-Hemmtest
  • Die Verbindungen der Erfindung wurden unter Benutzung des MBP-C125-Tests auf Hemmaktivität analysiert. Dieser Test bestimmt die relative Hemmung der β-Sekretase-Spaltung eines APP-Substratmodells MPB-C125SW durch die getesteten Verbindungen im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollprobe. Eine detaillierte Beschreibung der Testparameter ist z. B. zu finden in US-Patent Nr. 5,942,400. Das Substrat ist kurz gesagt ein Fusionspeptid, das aus Malose-Bindungsprotein (MBP) und den carboxyterminalen 125 Aminosäuren von APP-SW, der Schwedischen Mutation gebildet wurde. Menschliche Gehirn-β-Sekretase wurde aus partiell gereinigtem, konzentriertem, menschlichen Gehirngewebe wie in Sindha et al., 1999, Nature 402: 537–554 beschrieben hergestellt und in 0,20% Triton gehalten. Alternativ wurde rekombinantes Enzym voller Länge (Aminosäuren 1–501) auf das transgene Enzym exprimierenden 293 Zellen präpariert.
  • Hemmdaten erhielt man aus einer ELISA, die einen auf vorbeschichteten und blockierten Hochbindungsplatten mit 96 Vertiefungen abgeschiedenen Anti-MBP-Einfang-Antikörper benutzt mit nachfolgender Inkubation mit verdünntem Überstand der Enzymreaktion, Inkubation mit dem Anti-SW192-spezifischen, biotinyliertem Reporterantikörper und Inkubation mit Streptavidin/alkalischer Phosphatase. Die Spaltung des intakten MBP-C125SW-Fusionsproteins führt zur Erzeugung eines abgeschnittenen, aminoterminalen Fragments mit an dem Carboxy-Terminus exponierten neuen SW-192-Antikörper-positiven Epitop. Der Nachweis erfolgte durch ein Fluoreszenzsubstratsignal auf Spaltung durch die Phosphatase. ELISA wies nur eine Spaltung nach, die an der APP-SW751-Mutationsstelle des Substrats auf Leu 596 folgte.
  • Die Verbindungen wurden in einer Verdünnungsreihe 1:1 auf eine Sechs-Punkt-Konzentrationskurve (zwei Vertiefungen je Konzentration) verdünnt, die eine Reihe der 96-Platte je getestete Verbindung erforderte.
  • Arbeitsweise:
  • Jede der Testverbindungen wurde in eine Ampulle eingewogen und DMSO wurde zugesetzt, um eine 10 mM-Lösung zu bilden. Um eine Endkonzentration der Verbindung von 200 μM an dem hohen Punkt einer Sechs-Punkt-Verdünnungskurve zu erhalten, wurden 100 μl der 10 mM-Lösung der Vertiefung Cl einer V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Fünfzig μl DMSO wurden ungeradzahligen Vertiefungen der Reihe C über die Platte zugesetzt, und es wurde seriell 1:1 verdünnt. 10 μl jeder Verdünnung wurden jeder der beiden Vertiefungen auf Reihe C einer entsprechenden V-Bodenplatte zugesetzt, der vorher 190 μl einer 52 mM NaOAc/7,9% DMSO, pH 4,5, zugesetzt wurden. Die mit NaOAc verdünnte Verbindungsplatte wurde auf Pellet-Fällmittel herabgedreht, und 20 μl/Vertiefung wurden auf eine entsprechende Flachbodenplatte übertragen, der 30 μl eiskaltes Enzymsubstrat-Gemisch (2,5 μl MBP-C125SW-Substrat, 0,03 μl Enzym und 24,5 eiskaltes 0,09% TX100 je 30 μl) zugesetzt wurden. Die Verbindungskonzentration in dem fertigen Enzymreaktionsgemisch war somit 50× kleiner als die Ausgangskonzentration. Das fertige Reaktionsgemisch von 200 μM Verbindung für den höchsten Kurvenpunkt befand sich in 5% DMSO, 20 mM NaAc, 0,06% TX100 bei pH 4,5. Die Enzymreaktion wurde durch Erwärmung der Platten auf 37°C gestartet. Nach 90 Minuten bei 37°C wurden je Vertiefung 200 μl kaltes Probenverdünnungsmittel zugesetzt, um die Reaktion anzuhalten, und 20 μl/Vertiefung wurden auf eine entsprechende Anti-MBP-Antikörperbeschichtete ELISA-Einfangplatte übertragen, die 80 μl/Vertiefung Probenverdünnungsmittel enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4°C inkubiert, und die ELISA wurde am nächsten Tag nach 2 h Inkubation mit Anti-192SW- Antikörper und nachfolgend mit Streptavidin-AP-Konjugat und Fluoreszenzsubstrat entwickelt. Das Signal wurde auf einem Fluoreszenzplattenleser gelesen.
  • Ergebnisse:
  • Die relative Hemmpotenz der Verbindung wurde bestimmt durch Berechnung der Konzentration der Verbindung, die im Vergleich zu dem Enzymreaktionssignal in den Kontrollvertiefungen ohne zugesetzte Verbindung eine 50%-ige Verringerung des festgestellten Signals (IC50) zeigte.
  • Zwecks Klassifizierung der Hemmeraktivitäten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in den Datentabellen dieser Beschreibung angegeben sind, wurden die Hemmeraktivitäten nach ihren IC50-Konzentrationen in der folgenden Reihenfolge eingestuft:
    Gruppe I: Verbindungen mit einem IC50 von weniger als 10 μM;
    Gruppe II: Verbindungen mit einem IC50 von 10 μM bis einschließlich 100 μM;
    Gruppe III: Verbindungen mit einem IC50 von 100 μM bis einschließlich 200 μM;
    Gruppe IV: Verbindungen mit einem IC50 von mehr als 200 μM.
  • Beispiel 71
  • Zellfreier Hemmungstest unter Benutzung von APP-KK
  • Das synthetische APP-Stubstrat Biotin-KVEANY-EVEGERC(Oregon grün)KK, das N-terminales Biotin hatte und durch kovalente Bindung von Oregon-grün an dem Cis-Rest fluoreszierend gemacht worden war, wurde verwendet. Das N-terminale Biotin diente zur Verankerung des Peptids an einer Substrat-Testplatte. Die Inkubation erfolgte unter den folgenden Bedingungen: 10 μM APP-Substrat; 50 nM Enzym (hAsp2a), pH 4,5, 37°C, 2 Stunden. Die Aktivität des β-Sekretase-Enzyms wird als der Verlust des Oregon-grün-Fluorophors nachgewiesen, das bei Spaltung des Substrats auf der entgegengesetzten Seite der Spaltungsstelle von dem Biotinanker freigesetzt wird.
  • Die Inkubation bei Anwesenheit oder Abwesenheit des Verbindungshemmers zeigt die spezifische Hemmung der enzymatischen Spaltung des APP-Substrats durch β-Sekretase.
  • Beispiel 72
  • β-Sekretase-Hemmung: P26-P4'SW-Test
  • Das Substrat P26-P4'SW ist ein Peptid der Sequenz:
    (Biotin)CGGADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNLDAEF(SEQ. ID. NR.: 1)
  • Das Standard P26-P1 hat die Sequenz:
    (Biotin)CGGADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNL(SEQ. ID. NR.: 2)
  • Peptide wurden von Anaspec, Inc., (San Jose, CA) durch Festphasensynthese mit Boc-Aminosäuren hergestellt. Biotin wurde nach der Peptidsynthese von Anaspec, Inc. unter Benutzung von EZ-Link-Iodacetyl-LC-Biotin (Pierce) an das terminale Cysteinsulfhydryl angekuppelt. Peptide werden als 0,8–1,0 mM Vorräte in 5 mM Tris aufbewahrt, wobei der pH mit Natriumhydroxid auf etwa neutral (pH 6,5–7,5) eingestellt war.
  • Für den Enzymtest kann die Substratkonzentration von 0 bis 200 μM variieren. Insbesondere zur Prüfung von Verbindungen auf Hemmaktivität kann die Substratkonzentration 1,0 μM sein. Die zu prüfenden Verbindungen werden in DMSO zugesetzt bei einer DMSO-Endkonzentration von 5%. Bei diesen Versuchen bekommen die Kontrollproben auch 5% DMSO. Die Enzymkonzentration wird variiert, um Produktkonzentrationen in dem linearen Bereich der ELISA-Bestimmung zu ergeben (125–2000 pM nach Verdünnung).
  • Diese Bestandteile werden bei 1 bis 3 Stunden bei 37°C in 20 mM Natriumacetat, pH 4,5, 0,06% Triton X-100 inkubiert. Die Proben werden in Probenverdünnungsmittel (z. B. 145,4 mM Natriumchlorid, 9,51 mM Natriumphosphat, 7,7 mM Natriumazid, 0,05% Triton X-405, 6 g/l Rinderserumalbumin, pH 7,4) 5-fach verdünnt, um die Reaktion abzuschrecken, und dann für die ELISA nötigenfalls weiter verdünnt.
  • Für die ELISA werden Testplatten Costar High Binding mit 96-Vertiefungen (Corning, Inc., Corning, NY) mit monoklonalem Antikörper SW 192 aus Klon 16A7 oder einem Klon ähnlicher Affinität beschichtet. Die Standards P26-P1 werden im Probenverdünnungsmittel auf eine Endkonzentration von 0 bis 2 nM verdünnt. Die verdünnten Proben und Standards (100 μl) werden 24 Stunden bei 4°C auf den SW192-Platten inkubiert. Die Platten werden 4× in TTBS-Puffer (150 mM Natriumchlorid, 25 mM Tris, 0,05% Tween 20, pH 7,5) gewaschen, dann mit 0,1 ml/Vertiefung Streptavidin-Alkaliphosphat (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) inkubiert, das in Probenverdünnungsmittel 1:3000 verdünnt war. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte 4× in TTBS gewaschen und mit Fluoreszenzsubstratlösung A (31,2 g/l 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 30 mg/l, mit HCl auf pH 9,5 eingestellt) inkubiert. Die Fluoreszenzwerte werden nach 30 Minuten abgelesen.
  • Verbindungen, die wirksame Hemmer der β-Sekretase-Aktivität sind, zeigen im Vergleich zu einer Kontrollprobe eine verminderte Spaltung.
  • Beispiel 36
  • Tests unter Benutzung synthetischer Oligopeptid-Substrate
  • Es werden synthetische Oligopeptide hergestellt, die die bekannte Spaltungsstelle der β-Sekretase und wahlweise nachweisbare Markierungen, wie fluoreszierende oder chromogene Molekülgruppen enthalten. Beispiele dieser Peptide sowie ihre Herstellungs- und Nachweisverfahren sind in dem erteilten US-Patent Nr. 5,942,400 beschrieben, das hier durch Bezugnahme eingefügt wird. Spaltprodukte können durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Fluoreszenz- oder Chromogennachweisverfahren nachgewiesen werden, die für den Peptidnachweis nach in der Technik bekannten Verfahren geeignet sind.
  • Ein solches Peptid hat z. B. die Sequenz SEVNL DAEF (SEQ. ID. NR.: 3), und die Spaltungsstelle ist zwischen den Resten 5 und 6. Ein anderes bevorzugtes Substrat hat die Sequenz ADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNLDAE F (SEQ. ID. NR.: 4), und die Spaltungsstelle ist zwischen den Resten 26 und 27.
  • Diese synthetischen APP-Substrate werden in Gegenwart von β-Sekretase unter Bedingungen inkubiert, die für die durch β-Sekretase vermittelte Spaltung des Substrats ausreichend sind. Der Vergleich der Spaltungsergebnisse in Gegenwart der Hemmerverbindung mit den Ergebnissen für eine Kontrollprobe ergibt ein Maß der Hemmeraktivität der Verbindung.
  • Beispiel 73
  • Hemmung der β-Sekretase-Aktivität – Zelltest
  • Ein beispielhafter Test zur Analyse der Hemmung der β-Sekretase-Aktivität benutzt die menschliche embryonale Nieren-Zelllinie HEKp293 (ATCC Accession No. CRL-1573), die stabil mit APP751 transfiziert ist, das die natürlich vorkommende Doppelmutation Lys651Met52 zu Asn651Leu652 (für APP751 nummeriert) enthält, die allgemein die Schwedische Mutation genannt wird und eine Aβ-Überproduktion zeigt (Citron et al., 1992, Nature, 360: 672–674). Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen und in dem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma D-6546) mit 10% fötalem Rinderserum plattiert. Nach Erstellung der Zellen (1 Tag nach Plattierung) wurden diese in Anwesenheit/Abwesenheit der Hemmerverbindung (verdünnt in DMSO) bei der gewünschten Konzentration, im Allgemeinen von 0,25 bis 5,0 μg/ml und bei einer DMSO-Endkonzentration in dem Bereich von 0,1 bis 0,5% inkubiert. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wird das Medium von den Zellen abgesaugt und für weitere 2 Stunden Inkubation durch frische Verbindung ersetzt. Am Ende der Behandlungsperiode wird jede Zellplatte bei Raumtemperatur 5 Minuten bei 1100 UpM zentrifugiert. Das konditionierte Medium wird auf β-Sekretase-Aktivität durch Analyse der Freisetzung des Peptidfragments Aβ in das Kulturmedium durch Immuntest analysiert. Unter Benutzung spezifischer Antikörper zum Nachweis von Spaltprodukt, z. B. Aβ, wird die enzymatische Aktivität in Anwesenheit und Abwesenheit der Verbindungshemmer gemessen, um die spezifische Hemmung der durch β-Sekretase vermittelten Spaltung des APP-Substrats zu demonstrieren.
  • Beispiel 74
  • Hemmung der β-Sekretase-Aktivität in primären Nervenzellen und menschlichem, fötalem Gehirngewebe
  • Die Hemmung der β-Sekretase-Aktivität in primären Nervenzellen bei Mäusen und in fötalem Gehirngewebe bei Menschen wird wie folgt geprüft.
  • Medienherstellung
  • Mäusenervenmedien ohne KCl wird mit dem folgenden ergänzt: 25 ml fötales Rinderserum (FBS, Sigma F-2422 oder JRH Biosciences, 12103-78P), das 1 Stunde bei 56°C inaktiviert wurde und 25 ml Changs Ergänzung (Irvine Scientific C104). Die Endkonzentrationen in 500 ml Mäusenervenmedium ohne KCl sind 5% FBS, 5% Changs Ergänzung.
  • Menschliches Nervenmedium ohne KCl wird wie folgt ergänzt: 10 ml eines 50fachen Vorrats an B27-Lösung (Gibco 17504-036). Die Endkonzentration in 500 ml menschlichem Nervenmedium ohne KCl ist 1 × B27.
  • Herstellung von Zellkultur-Platten
  • Polyethylen(PEI)-Lösung (50% Gew./Vol., das von Sigma, P-3143 erhalten wurde) wird 1:10 mit Wasser von Gewebekulturqualität verdünnt, um eine 5%ige (Gew./Vol.) verdünnte Lösung zu ergeben. Die verdünnte PEI-Lösung wird dann unter Benutzung eines Filters von 0,45 μm filtersterilisiert. Das filtersterilisierte PEI wird 1:100 mit Natriumborat-Puffer (150 mM, pH 8,5, steril) weiter verdünnt, um eine 0,05%ige (Gew./Vol.) Arbeitslösung zu ergeben.
  • Die Zellkulturplatten (24-Vertiefungen, Flachboden, Corning 25820, oder 6-Vertiefungen, Flachboden, Corning 25810) werden wie folgt für die Kultur präpariert. PEI-Arbeitslösung wird in einer Menge von 300 μl/Vertiefung bei Platten mit 24 Vertiefungen oder 1,5 ml/Vertiefung bei Platten mit 6 Vertiefungen zugesetzt, um mit etwa 80 μg/cm2 zu beschichten. Die beschichteten Platten werden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden die Platten abgesaugt, und zweimal mit 500 μl/Vertiefung (für Platten mit 24 Vertiefungen) oder mit 2,5 ml/Vertiefung (für Platten mit 6 Vertiefungen) PBS gewaschen (1× phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,5, steril). Die Platten werden dann abgesaugt und wenigstens eine Stunde bei 37°C mit Neuronalmedium ohne KCl plus 10% PBS (500 μl/Vertiefung, 24 Vert.; oder 2,5 ml/Vertiefung, 6-Vert.) inkubiert. Nach der Inkubation können die Platten unmittelbar verwendet oder bis zu eine Woche bei 37°C unter sterilen Bedingungen aufbewahrt werden (das Medium sollte vor der Beimpfung verworfen werden).
  • Herstellung von PDAPP-Mäusecortexkulturen
  • Weibliche Mäuse des Wildtyps, Swiss Webster, werden mit homozygoten männlichen PDAPP-Mäusen gepaart. Sechzehn bis Siebzehn Tage nach der Paarung werden die trächtigen weiblichen Tiere durch Kohlendioxid-Erstickung getötet. Die Föten werden unter sterilen Bedingungen entfernt und enthauptet. Das fötale Gehirn wird entfernt, und die Hirnrinden werden unter Benutzung eines Seziermikroskops von dem übrigen Gehirngewebe abgeschnitten. Die Rindengewebe werden auf eine Gewebekulturschale von 35 mm (Corning 25000) übertragen, die eiskalte, gepufferte Hanks-Salzlösung (HBSS, Sigma H9269) enthielt.
  • Das Rindengewebe von 10 Mäusegehirnen wurde durch Überführung in ein konisches Polypropylenrohr (Falcon 2070) von 50 ml vereinigt und 2× mit 25 ml kalter HBSS gewaschen. Die Gewebe werden in 5 ml kalter CMF HBSS (calcium- und magnesiumfreie HBSS, Sigma H-9394) plus 0,5 ml DNase-Vorratslösung (Sigma D-4527, 1 mg/ml in CMF HBSS) wieder suspendiert, um eine DNase-Endkonzentration von etwa 100 μg/ml zu ergeben. Das Gewebe wird mit einer 5 ml-Pipette pulverisiert, bis die Suspension homogen wird (etwa 20–30 Mal). Die Zellsuspension wird in einer klinischen Zentrifuge 3 Minuten bei etwa 600 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 2,5 ml Trypsin-EDTA (1× Trypsin-EDTA, Sigma T-3924) erneut suspendiert und 5 Minuten bei 37°C inkubiert.
  • Neuronalmedium plus 10% FBS (Sigma F-2422 oder JRH Biosciences 12103-78P) werden in einer Menge von 10 ml zu 1 ml DNase-Vorratslösung zugesetzt. Die Lösung wird schwach gerührt und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellsuspension wird durch Hindurchgehen durch ein steriles Nylonsieb (100 μm Porengröße, Falcon 2360) filtriert. Das Filtrat wird in einer klinischen Zentrifuge 3 Minuten bei etwa 600 × g zentrifugiert.
  • Das Zellpellet wird gewonnen und erneut in 5 ml vollständigem Mausmedium suspendiert, das wie oben beschrieben hergestellt wurde. Die Zellen werden mit einem Hämacytometer durch Mischen von 50 μl Zellsuspension mit 450 μl Trypanblau-Lösung (0,4%, Sigma T-8154) gezählt. Die Zellen werden mit Mausmedium auf 1,2 × 106 Zellen/ml verdünnt. Die Zellen werden dann zu 0,5 ml/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert, die mit PEI beschichtet waren und wie oben hergestellt wurden. Die Kulturen wurden zweimal je Woche durch vollständigen Medienaustausch gefüttert.
  • Herstellung menschlicher fötaler Cortexkulturen
  • Menschliches fötales Gehirngewebe wird von Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA) erhalten. Das fötale Gehirngewebe wird unmittelbar nach dem Ernten verwendet, und die Arbeit wird in einer Schutzhaube Klasse II durchgeführt. Das Gewebe wird dadurch verarbeitet, dass man die Hirnrinde identifiziert und alle Hirnhautspuren mit einer sterilen Pinzette entfernt.
  • Die Cortexgewebe werden durch Übertragung in ein konisches Rohr von 50 ml vereinigt. Das vereinigte Cortexgewebe wird dann zweimal mit 25 ml kalter HBSS gewaschen. Die Gewebe werden dann erneut in 10 ml kalter CMF-HBSS (Sigma H-9394) und 1 ml DNase-Vorratslösung (Sigma D-4527) suspendiert, um eine DNase-Endkonzentration von etwa 100 μg/ml zu ergeben. Das Gewebe wird mit einer 10 ml Pipette pulverisiert, bis die Suspension homogen wird (etwa 20–30 Mal). Die Zellsuspension wird drei Minuten bei etwa 600 × g in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 10 ml Trypsin-EDTA (1× Trypsin EDTA, Sigma T-3924) erneut suspendiert und 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Neuronalmedium und 10% FBS werden in einer Menge von 10 ml auf 1 ml DNase-Vorratslösung zugegeben. Die Lösung wird schwach gemischt und drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Zellsuspension wird dann durch ein steriles Nylonsieb (wie oben beschrieben) filtriert. Das Filtrat wird dann wie oben zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 5 ml menschlichem Medium (wie oben beschrieben hergestellt) erneut suspendiert. Die Zellen werden mit einem Hämacytometer durch Mischen von 50 μl Zellsuspension mit 450 μl Trypanblau-Lösung gezählt. Die Zellen werden mit vollständigem Medium (wie oben beschrieben hergestellt) auf 1,2 × 106 Zellen/ml verdünnt. Die Zellsuspension wird dann zu 2 ml/Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert, die wie oben beschrieben mit PEI beschichtet waren.
  • Die Zellen werden in der ersten Woche nicht gestört. Nach dieser Zeit werden die Kulturen zweimal je Woche durch vollständigen Medienaustausch gefüttert.
  • Neuronalkultur – Aβ-Tests
  • Reife Kulturen werden mit 300 μl/Vertiefung (Mäuse) oder 750 μl/Vertiefung (Mensch) frischem Medium 24 h inkubiert, um Aβ-Basiswerte zu generieren. Die konditionierten Medien werden gesammelt und bis zur Prüfung bei –20°C aufbewahrt.
  • Die Kulturen werden dann 24 Stunden mit 300 μl/Vertiefung (Maus) oder 750 μl/Vertiefung (Mensch) frischen Medien behandelt, die die Verbindung in dem gewünschten Konzentrationsbereich enthalten. Die konditionierten Medien werden gesammelt und bis zum Test bei –20°C aufbewahrt.
  • Für Aβ-Gesamtmessungen und Aβ1-42-Messungen werden 100 μl/Vertiefung durch ELISA analysiert. Die Hemmung der Produktion von Gesamt-Aβ und Aβ1-42 wird durch die Differenz zwischen den Aβ-Werten für die Verbindungsbehandlung und für Basisperioden bestimmt. Dosis-Reaktionskurven werden als Prozent Hemmung gegen Konzentration der Verbindung dargestellt.
  • Am Ende dieser Behandlungsperiode wird die Zellvermehrungsfähigkeit durch MTT-Cytotoxizitätsprüfung getestet. Nachdem von den Zellplatten für die Aβ-Messung durch ELISA das konditionierte Medium entfernt ist, werden allen Vertiefungen 25 μl MTT-Vorrat (Sigma M-5655 bei 5 mg/ml in 1 × PBS, aliquotiert und bei –20°C aufbewahrt) zugesetzt. Die Zellplatten werden 1 Stunde in einem CO2-Inkubator bei 37°C inkubiert. MTT-Lysepuffer wird jeder Vertiefung in einer Menge von 125 μl zugesetzt, und die Platten werden über Nacht bei niedriger Einstellung auf einen Titerplattenschüttler gesetzt. Die Platten werden in einem Mikroplattenleser bei 562–650 nm abgelesen. Die Zelllebensfähigkeit wird als Prozent der optischen Dichte (OD) der Kontrollzellen berechnet.
  • Beispiel 75
  • Hemmung der β-Sekretase in Tiermodellen der Alzheimerschen Krankheit
  • Verschiedene Tiermodelle können benutzt werden, um auf Hemmung der β-Sekretase-Aktivität zu prüfen. Beispiele von bei der Erfindung brauchbaren Tiermodellen sind ohne Beschränkung hierauf Maus, Meerschweinchen und dergleichen. Die benutzten Tiere können Wildtyp-, transgenes oder Nullmutationmodell sein. Beispiele transgener, nichtmenschlicher Säugermodelle sind in den US-Patenten Nr. 5,912,410 und 5,811,633 beschrieben. Ferner können Säugermodelle Mutationen in APP exprimieren, wie APP695-SW und dergleichen, wie hier beschrieben wurde.
  • Den Tieren wird eine Menge der Hemmerverbindung verabreicht, die in geeigneter Weise in PBS formuliert ist. Die Kontrolltiere sind unbehandelt oder mit einer inaktiven Verbindung behandelt. Die Verabreichung wird täglich für eine Zeitdauer von Tagen wiederholt. Beginnend mit dem Tage Null wird Gehirngewebe oder -flüssigkeit aus den ausgewählten Tieren entnommen und unter Benutzung spezifischer Antikörper für Aβ auf die Anwesenheit von APP-Spaltungspeptiden einschließlich Aβ analysiert. Am Ende der Testperiode werden die Tiere getötet, und Gehirngewebe oder -flüssigkeit werden auf Anwesenheit von Aβ und/oder β-Amyloid-Plaques analysiert. Das Gewebe wird auch auf Nekrose analysiert.
  • Tiere, denen die Hemmerverbindung verabreicht wurde, zeigen erwartungsgemäß im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen verringertes Aβ in Gehirngeweben und -flüssigkeiten und verringerte β-Amyloid-Plaques im Gehirngewebe.
  • Beispiel 76
  • Hemmung der Aβ-Produktion in menschlichen Patienten
  • Patienten, die an Alzheimerscher Krankheit (AD) leiden, zeigen in dem Gehirn eine erhöhte Aβ-Menge. Alzheimer Patienten wird eine Menge der in PBS verdünnten Hemmerverbindung verabreicht. Die Verabreichung wird für die Dauer der Testperiode täglich wiederholt. Beginnend mit dem Tag 0 werden einmal je Woche Wahrnehmungs- und Gedächtnistests durchgeführt.
  • Patienten, denen die Hemmerverbindungen verabreicht werden, zeigen erwartungsgemäß Wahrnehmungs- und Gedächtnisbewertungen, die sich im Vergleich mit unbehandelten Patienten erwartungsgemäß verlangsamen und/oder stabilisieren.
  • Beispiel 77
  • Verhinderung der Aβ-Produktion in Patienten mit Risiko für Alzheimersche Krankheit
  • Patienten, die für Alzheimersche Krankheit empfänglich oder für die Entwicklung von Alzheimer gefährdet sind, werden durch Erkennung eines familiären Erbgutmusters, z. B. der Anwesenheit der Schwedischen Mutation, und/oder durch Überwachung diagnostischer Parameter identifiziert. Patienten, die für die Entwicklung von Alzheimerscher Krankheit prädisponiert oder gefährdet sind, wird eine Menge der in PBS verdünnten Inhibitorverbindung verabreicht. Die Verabreichung wird für die Dauer der Testperiode täglich wiederholt. Beginnend mit dem Tage 0 werden einmal pro Monat Wahrnehmungs- und Gedächtnisprüfungen vorgenommen.
  • Patienten, denen die Inhibitorverbindungen verabreicht wurden, lassen Wahrnehmungs- und Gedächtnis Bewertungen erwarten, die erwartungsgemäß im Vergleich mit unbehandelten Patienten stabil bleiben.
  • Diese Erfindung wurde mit Bezug auf verschiedene spezifische Beispiele und Ausführungsformen beschrieben.

Claims (5)

  1. Verbindung der Formel
    Figure 01000001
    oder ihr pharmazeutisch zulässiges Salz, in der R1 ist: (I) C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem, zwei oder drei C1-C3-Alkyl, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH2, -C≡N, -CF3 oder -N3 substituiert ist, (II) -(CH2)1-2-S-CH3, (III) -CH2-CH2-S-CH3, (IV) -CH2-(C2-C6-Alkenyl), das unsubstituiert oder durch ein -F substituiert ist, (V) -(CH2)0-3-(R1-Aryl), wo R1-Aryl Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, Indanyl, Indenyl, Dihydronaphthyl, Tetralinyl ist, das unsubstituiert oder an dem Arylring unabhängig mit ein oder zwei C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist, R2 ist (I) -H, (II) C1-C6-Alkyl oder (III) -(CH2)0-4-R2-1, worin R2-1 (C3-C8)Cycloalkyl, R1-Aryl, worin R1-Aryl, wie oben definiert ist, RN-1 Phenyl ist, das mit einem, zwei, drei oder vier R100 unabhängig substituiert ist, wobei R100 ist (1) C1-C6-Alkyl, (2) -F, -Cl, -Br oder -I, (3) -OH, (4) -NO2, (5) -CO-OH, (6) -C≡N, (7) -CO-NRN-2RN-3 worin RN-2 und RN-3 gleich oder verschieden sind und (a) -H, (b) -C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem -OH oder -NH2 substituiert ist, (c) -C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit einem bis drei -F, -Cl, -Br oder -I substituiert ist, (d) -C3-C7-Cycloalkyl, (e) -(C1-C2-Alkyl)-(C3-C7-Cycloalkyl), (f) -(C1-C6-Alkyl)-O-(C1-C3-alkyl), (g) -C1-C6-Alkenyl mit einer oder zwei Doppelbindungen, (h) -C1-C6-Alkynyl mit einer oder drei Dreifachbindungen, (i) -C1-C6-Alkylkette mit einer Doppelbindung und einer Dreifachbindung, (8) -CO-(C3-C12-Alkyl), (9) -CO-(C3-C6-Cycloalkyl), (11) -CO-R1-Heterocyclus, worin R1-Heterocyclus Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl-S-oxid, Thiomorpholinyl-S,S-dioxid, Piperazinyl, Homopiperazinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydropyranyl, Piperidinyl, Tetrahydrofuranyl oder Tetrahydrothiophenyl, worin die R1-Heterocyclus-Gruppe durch irgendein Atom der R1-Heterocyclus-Muttergruppe gebunden ist, das durch Wasserstoff substituiert ist, so daß die neue Bindung an die R1-Heteroaryl-Gruppe das Wasserstoffatom und seine Bindung ersetzt, wobei der Heterocyclus unsubstituiert oder mit einem oder zwei =O, C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, C1-C3-Alkoxy, -OCF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist, (12) -CO-RN-4, worin RN-4 Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl oder Pyrrolidinyl ist, worin jede Gruppe unsubstituiert oder mit einem oder zwei C1-C3-Alkyl substituiert ist, (13) -CO-O-RN-5, worin RN-5 ist (a) C1-C6-Alkyl oder (b) -(CH2)0-2-(R1-Aryl), worin R1-Aryl wie oben definiert ist, (14) -SO2-NRN-2RN-3, worin RN-2 und RN-3 wie oben definiert sind, (15) -SO-(C1-C8-Alkyl), (16) -SO2-(C3-C12-Alkyl), (17) -NH-CO-O-RN-5, worin RN-5 wie oben definiert ist, (18) -NH-CO-N(C1-C3-Alkyl)2, (19) -N-CS-N(C1-C3-Alkyl)2, (20) -N(C1-C3-Alkyl)-CO-RN-5, worin RN-5 wie oben definiert ist, (21) -NRN-2RN-3, worin RN-2 und Rn-3 gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert sind, (22) -RN-4, wo RN-4 wie oben definiert ist, (23) -O-CO-(C1-C6-Alkyl), (24) -O-CO-N(C1-C3-Alkyl)2, (25) -O-CS-N(C1-C3-Alkyl)2, (26) -O-(C1-C6-Alkyl), (27) -O-(C2-C5-Alkyl)-COOH, (28) -S-(C1-C6-Alkyl), (29) C1-C6-Alkyl, das unsubstituiert oder mit 1, 2, 3, 4 oder 5 -F substituiert ist, (30) -O-(C1-C6-Alkyl), das unsubstituiert oder mit 1, 2, 3, 4 oder 5 -F substituiert ist, oder (31) -O-φ, Ra ist Wasserstoff oder C1-C6-Alkyl, RC ist: (1) RCH, wo RCH Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiomorpholinyl-S-oxid, Thiomorpholinyl-S,S-dioxid, Piperazinyl, Homopiperazinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydropyranyl, Piperidinyl, Tetrahydrofuranyl oder Tetrahydrothiophenyl ist, von denen jedes wahlweise mit Oxo, C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br oder -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist, (2) RCY, wo RCY Pyridinyl, Pyrimidinyl, Chinolinyl, Indenyl, Indanyl, Benzothiophenyl, Indolyl, Indolinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Isoindolyl, Isochinolyl, Chiazolinyl, Chinoxalinyl, Phthalazinyl, Iidazolyl, Isoxazolyl, Pyrazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Indolizinyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzimidazolyl, Benzofuranyl, Furanyl, Thienyl, Pyrrolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl, Triazolyl Tetrazolyl, 1,4-Benzodioxanyl, Purinyl, Oxazolopyridinyl, Imidazopyridinyl, Isothiazolyl, Naphthyridinyl, Cinnolinyl, Carbazolyl, β-Carbolinyl, Isochromanyl, Chromanyl, Furazanyl, Tetrahydroisochinolin, Isoindolinyl, Isobenzotetrahydrofuranyl, Isobenzotetrahydrothienyl, Isobenzothiophenyl, Benzoxazolyl oder Pyridopyridinyl ist, von denen jedes wahlweise mit C1-C3-Alkyl, -CF3, -F, -Cl, -Br oder -I, C1-C3-Alkoxy, -O-CF3, -NH2, -OH oder -C≡N substituiert ist, (3) -(C1-C10)Alkyl-RCH, (4) -(C1-C10)Alkyl-RCY oder (5) -(C1-C10)Alkyl-K1-3, worin (A) die Alkylkette unsubstituiert oder mit einem -OH substituiert ist, (B) die Alkylkette unsubstituiert oder mit einem C1-C6-Alkoxy substituiert ist, das unsubstituiert oder mit 1–5 -F substituiert ist, (D) die Alkylkette unsubstituiert oder mit 1–5 -F substituiert ist, (F) jedes K ist: (1) H, (2) C1-C3-Alkyl, (3) C1-C3-Alkoxy, (4) C1-C3-Alkylthioxy, (5) C1-C6-Alkylacylamino, (6) C1-C6-Alkylacyloxy, (7) Amido, (8) C1-C6-Alkylamino, (9) Phenylamino, (10) Carbamyl, (11) Carboxyl, (12) Carboxy(C2-C5)alkoxy, (13) Carboxy(C2-C5)alkylthioxy, (16) Amino, das unsubstituiert oder mit C1-C6-Alkyl substituiert ist, (17) Hydroxyl oder (18) Carboxymethylester.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, die N-[1-(S)-(3,5-Difluoro-benzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(piperidin-1-carbonyl)-hexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[1-(S)-(3,5-Difluoro-benzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(2-morpholin-4-yl-ethylcarbamoyl)-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[1-(S)-(3,5-Difluoro-benzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-[(tetrahydrofuran-2-ylmethyl)-carbamoyl]-pentyl)-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[1-(S)-(3,5-Difluoro-benzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-methyl-5-morpholin-4-yl-5-oxo-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[1-(S)-(3,5-Difluoro-benzyl)-4-(R)-[(furan-2-ylmethyl)-carbamoyl]-2-(S)-hydroxy-pentyl)-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid ist.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 in Kombination mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger.
  4. Verwendung der Verbindung des Anspruchs 1 oder 2 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Heilmittels für die Behandlung oder Verhinderung der Alzheimerschen Krankheit.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, die N-[1-(S)-(3,5-Difluoro-benzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-isobutylcarbamoyl-pentyl]-5-methyl-N,N-dipropyl-isophthalamid, 3-[6-(3,5-Difluorophenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoylbenzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxyhexanoylamino]-propionsäure, 8-[6-(3,5-Difluorophenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoylbenzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxyhexanoylamino]-octansäure, 8-[6-(3,5-Difluorophenyl)-5-(S)-(3-dipropylcarbamoyl-benzoylamino)-2-(R)-ethyl-4-(S)-hydroxy-hexanoylamino]-octansäuremethylester, N-[4-(R)-Butylcarbamoyl-1-(S)-(3,5-difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxyhexyll-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-isobutylcarbamoyl-hexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[4-(R)-Benzylcarbamoyl-1-(S)-(3,5-difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxyhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[4-(R)-(Cyclohexylmethyl-carbamoyl)-1-(S)-(3,5-difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxyhexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid, N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-2-(S)-hydroxy-4-(R)-(piperidin-1-carbonyl)-hexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid oder N-[1-(S)-(3,5-Difluorobenzyl)-4-(R)-(2-dimethylamino-ethylcarbamoyl)-2-(S)-hydroxy-hexyl]-N,N-dipropyl-isophthalamid ist.
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