ES2275675T3 - Compuestos y metodos para tratar la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Compuestos y metodos para tratar la enfermedad de alzheimer. Download PDF

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Abstract

Compuesto de **fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en el que R1 es: (I) alquilo C1-C6, sustituido o no sustituido con uno, dos o tres alquilo C1-C3, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH2, -C=N, -CF3, o -N3, (II) -(CH2)1-2-S-CH3, (III) -CH2-CH2-S-CH3, (IV) -CH2-(alquenilo C2-C6) sustituido o no sustituido por un -F, (V) -(CH2)0-3-(R1-arilo) en el que R1-arilo es fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, indanilo, indenilo, dihidronaftilo, tetralinilo no sustituido o sustituido independientemente en el anillo de arilo con uno o dos de alquilo C1-C3, -CF3, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C1-C3, -O-CF3, -NH2, -OH, o -C=N; R2 es: (I) -H, (II) alquilo C1-C6, o (III) -(CH2)0-4-R2-1 en el que R2-1 es cicloalquilo (C3-C6), R1-arilo en el que R1-arilo es según se definió anteriormente; RN-1 es fenilo que está sustituido independientemente con uno, dos, tres o cuatro de R100 en el que R100 es (1) alquilo C1-C6, (2) -F, -Cl, -Br, o -I, (3) -OH, (4) -NO2, (5) -CO-OH, (6) -C=N, (7) -CO-NRN-2RN-3 en el que RN-2y RN-3 son iguales o diferentes y son: (a) -H, (b) -alquilo C1-C6 no sustituido o sustituido con un -OH o -NH2, (c) -alquilo C1-C6 no sustituido o sustituido con de uno a tres -F, -Cl, -Br, o -I, (d) -cicloalquilo C3-C7, (e) -(alquil C1-C2)-(cicloalquilo C3-C7), (f) -(alquil C1-C6)-O-(alquilo C1-C3), (g) -alquenilo C1-C6 con uno o dos dobles enlaces, (h) -alquinilo C1-C6 con uno o dos triples enlaces, (i) cadena de alquilo C1-C6 con un doble enlace y un triple enlace, (8) -CO-(alquilo C3-C12), (9) -CO-(cicloalquilo C3-C6).

Description

Compuestos y métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la invención según 35 U.S.C. \NAK 119(e) de la solicitud provisional de la solicitud de los EE.UU. número 60/191.528, presentada el 23 de marzo de 2000.
Campo de la invención
La presente invención proporciona compuestos y composiciones para inhibir la escisión mediada por \vartheta-secretasa de la proteína precursora de beta-amiloide. Más particularmente, la invención se refiere al uso de los compuestos y las composiciones de la invención para inhibir la producción de beta-péptido beta-amiloide y para tratar o prevenir la enfermedad caracterizada por los depósitos de beta-péptido beta-amiloide. Más particularmente, la invención proporciona compuestos y composiciones para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno cerebral degenerativo que se presenta clínicamente mediante pérdida progresiva de memoria, cognición, razonamiento, juicio, y estabilidad emocional, que conduce gradualmente a un deterioro mental profundo y en última instancia, a la muerte. Los individuos con EA presentan en el cerebro depósitos característicos de beta-amiloide (placas de beta-amiloide) y en los vasos sanguíneos cerebrales (angiopatía beta-amiloide) así como marañas neurofibrilares. En la autopsia de pacientes con EA, se encuentra gran número de estas lesiones en áreas del cerebro humano importantes para la memoria y la función cognitiva. Se encuentran números menores en los cerebros de la mayoría de los seres humanos ancianos que no muestran síntomas clínicos de EA. Las placas de beta-amiloide y la angiopatía beta-amiloide también caracterizan los cerebros de los individuos con síndrome de Down
(trisomía 21) y hemorragia cerebral hereditaria con beta-amiloidosis de tipo holandés, y otros trastornos de este tipo.
Las placas de beta-amiloide son una característica que define la EA, ahora se cree que es un factor o precursor causante del desarrollo de la enfermedad. Las placas de beta-amiloide se componen predominantemente de beta-péptido beta-amiloide (A\beta, algunas veces también designado como b\beta4).
Hasta la fecha se conocen varios isotipos de APP, que incluyen APP-695 "normal", APP-751, y APP770, que tienen una secuencia de 695, 751, y 770 aminoácidos, respectivamente. La identificación de mutaciones en el gen de la proteína precursora de beta-amiloide, que origina la EA familiar de aparición temprana, implica el metabolismo de beta-amiloide en la patología de la enfermedad. Mutaciones notificadas de este tipo incluyen la doble mutación
sueca (SW), que transforma Lys^{595} y Met^{596} en Asp^{595}-Leu^{596}, y mutaciones que modifican Val^{717} en Gly, Ile, o Phe.
El péptido A\beta proviene de la proteolisis de la proteína precursora de amiloide (APP) y se compone de 39-42 aminoácidos. Varias proteasas denominadas secretasas están implicadas en el procesamiento de APP. La deposición de A\beta en áreas del cerebro responsables de las actividades cognitivas es un factor principal para el desarrollo de la EA. La escisión de APP en el extremo N-terminal del péptido \betaA4 por \beta-secretasa y en el extremo C-terminal por una o más \gamma-secretasas constituye la ruta beta-amiloidogénica, es decir, la ruta mediante la cual se forma A\beta. La escisión de APP por \alpha-secretasa y la misma o una \gamma-secretasa diferente produce \alpha-sAPP, una forma secretada de APP que no da como resultado la formación de placas de beta-amiloide. Esta ruta alternativa de \alpha-sAPP impide la formación de péptido A\beta. Se ha propuesto que A\beta se acumula como resultado del procesamiento de APP por \beta-secretasa, y que por lo tanto la inhibición de la actividad de esta enzima es deseable para el tratamiento de la EA. Se cree que el procesamiento in vivo de APP en el sitio de \beta-secretasa es la etapa limitante de la velocidad en la producción de A\beta, y por tanto es una diana terapéutica para el tratamiento de la EA. Véase, por ejemplo, Sabbagh y cols., 1997, Alz. Dis. Rev. 3:1-19). Puede encontrarse una descripción de los fragmentos del procesamiento proteolítico de APP, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. números 5.441.870, 5.721.130, y 5.942.400.
Varias líneas de evidencia indican que la deposición cerebral progresiva de péptidos beta-amiloidogénicos particulares, péptidos \beta-amiloides, (A\beta), desempeña un papel fundamental en la patogenia de la EA y puede preceder a los síntomas cognitivos en años o décadas. Véase, por ejemplo, Selkoe, 1991, Neuron 6:487. Recientemente, se ha mostrado que A\beta se libera de las células neuronales que crecen en cultivo y está presente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) tanto de individuos normales como pacientes con EA. Véase, por ejemplo, Seubert y cols., 1992, Nature 359:325-327.
Se ha identificado una aspartil proteasa como la enzima responsable del procesamiento de APP en el sitio de escisión por \beta-secretasa. La enzima \beta-secretasa se ha descrito usando nomenclatura variada, incluyendo BACE (Beta Amyloid Cleaving Enzyme, enzima \beta-amiloide de escisión) y Asp. Véase, por ejemplo, Sindha y cols., 1999, Nature 402:537-554 (pág. 501) y la solicitud publicada PCT WO00/17369 (hAsp2a y hAsp2b).
En la actualidad, no existen tratamientos eficaces para detener, prevenir o revertir la progresión de la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, hay una necesidad urgente de agentes farmacéuticos que puedan ralentizar la progresión de la enfermedad de Alzheimer y/o en primer lugar, prevenirla.
Son necesarios compuestos que sean inhibidores eficaces de \beta-secretasa, que inhiban la escisión mediada por \beta-secretasa de APP, que sean inhibidores eficaces de la producción de A\beta y/o sean eficaces para reducir las placas o beta-depósitos de beta-amiloide para el tratamiento o la prevención de la enfermedad caracterizada por placas o beta-depósitos de beta-amiloide, tales como la EA.
Se describen derivados de 5-amino-6-ciclohexil-4-hidroxihexanamida en el documento US 5703129. Como es de esperar, se indica que estos compuestos son eficaces en el tratamiento de pacientes que padecen o son propensos a estados o trastornos relacionados con la acumulación en el cerebro de proteína beta-amiloide.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona compuestos y composiciones para inhibir la escisión mediada por \beta-secretasa de la proteína precursora de beta-amiloide. Más particularmente, los compuestos y composiciones de la invención son eficaces para tratar seres humanos que padecen la enfermedad de Alzheimer, para ayudar a prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer, para tratar a los pacientes con deterioro cognitivo leve (DCL) y prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer en los que avanzarían desde DCL hasta EA, para tratar el síndrome de Down, para tratar seres humanos que padecen hemorragia cerebral hereditaria con beta-amiloidosis de tipo holandés, para tratar la angiopatía beta-amiloide cerebral y prevenir sus posibles consecuencias, es decir, hemorragias lobulares única y recurrente, para tratar otras demencias degenerativas, incluyendo demencias de origen vascular y degenerativo mixto, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson, demencia asociada con parálisis supranuclear progresiva, demencia asociada con degeneración cortico-basal, tipo con cuerpos de Lewy difusos de la enfermedad de Alzheimer.
Se pueden demostrar las actividades inhibidoras de los compuestos de la invención, por ejemplo, usando uno o más de los ensayos descritos en el presente documento o en la técnica anterior. Según la presente invención se proporciona un compuesto A de fórmula
1
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
R_{1} es:
(I) alquilo C_{1}-C_{6}, no sustituido o sustituido con uno, dos o tres alquilo C_{1}-C_{3}, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH_{2}, -C\equivN, -CF_{3}, o -N_{3},
(II) -(CH_{2})_{1-2}-S-CH_{3},
(III) -CH_{2}-CH_{2}-S-CH_{3},
(IV) -CH_{2}-(alquenilo C_{2}-C_{6}) no sustituido o sustituido por un -F,
(V) -(CH_{2})_{0-3}-(R_{1-arilo}) en el que R_{1-arilo} es fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, indanilo, indenilo, dihidronaftilo, tetralinilo no sustituido o sustituido independientemente en el anillo de arilo con uno o dos de alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
R_{2} es:
(I) -H,
(II) alquilo C_{1}-C_{6}, o
(III) -(CH_{2})_{0-4}-R_{2-1} en el que R_{2-1} es cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), R_{1-arilo} en el que R_{1-arilo} es según se definió anteriormente;
R_{N-1} es fenilo que está sustituido independientemente con uno, dos, tres o cuatro de R_{100} en el que R_{100} es
(1)
alquilo C_{1}-C_{6},
(2)
-F, -Cl, -Br, o -I,
(3)
-OH,
(4)
-NO_{2},
(5)
-CO-OH,
(6)
-C\equivN,
(7)
-CO-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} son iguales o diferentes y son:
(a)
-H,
(b)
-alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con un -OH o -NH_{2},
(c)
-alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con de uno a tres -F, -Cl, -Br, o -I,
(d)
-cicloalquilo C_{3}-C_{7},
(e)
-(alquil C_{1}-C_{2})-(cicloalquilo C_{3}-C_{7}),
(f)
-(alquil C_{1}-C_{6})-O-(alquilo C_{1}-C_{3}),
(g)
-alquenilo C_{1}-C_{6} con uno o dos dobles enlaces,
(h)
-alquinilo C_{1}-C_{6} con uno o dos triples enlaces,
(i)
cadena de alquilo C_{1}-C_{6} con un doble enlace y un triple enlace,
(8)
-CO-(alquilo C_{3}-C_{12}),
(9)
-CO-(cicloalquilo C_{3}-C_{6}),
(11)
-CO-R_{1-heterociclo} en el que R_{1-heterociclo} es morfolinilo, tiomorfolinilo, S-óxido de tiomorfolinilo, S,S-dióxido de tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, tetrahidrofuranilo, o tetrahidrotiofenilo, en el que el grupo R_{1-heterociclo} está unido mediante cualquier átomo del grupo R_{1-heterociclo} original sustituido por hidrógeno de tal forma que el nuevo enlace al grupo R_{1-heteroalilo} sustituye al átomo de hidrógeno y su enlace, en el que el heterociclo no está sustituido o está sustituido con uno o dos =O, alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -OCF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN,
(12)
-CO-R_{N-4} en el que R_{N-4} es morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, piperidinilo o pirrolidinilo en el que cada grupo no está sustituido o está sustituido con uno o dos alquilo C_{1}-C_{3},
(13)
-CO-O-R_{N-5} en el que R_{N-5} es:
(a)
alquilo C_{1}-C_{6}, o
(b)
-(CH_{2})_{0-2}-(R_{1-arilo}) en el que R_{1-arilo} es según se definió anteriormente,
(14)
-SO_{2}-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} son según se definieron anteriormente,
(15)
-SO-(alquilo C_{1}-C_{8}),
(16)
-SO_{2}-(alquilo C_{3}-C_{12}),
(17)
-NH-CO-O-R_{N-5} en el que R_{N-5} es según se definió anteriormente,
(18)
-NH-CO-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(19)
-N-CS-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(20)
-N(alquil C_{1}-C_{3})-CO-R_{N-5} en el que R_{N-5} es según se definió anteriormente,
(21)
-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} pueden ser iguales o diferentes y son según se definieron anteriormente,
(22)
-R_{N-4} en el que R_{N-4} es según se definió anteriormente,
(23)
-O-CO-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(24)
-O-CO-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(25)
-O-CS-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(26)
-O-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(27)
-O-(alquil C_{2}-C_{5})-COOH,
(28)
-S-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(29)
alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1, 2, 3, 4, o 5 -F,
(30)
-O-(alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1, 2, 3, 4, o 5 -F, o
(31)
-O-\varphi;
R_{a} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6};
R_{C} es
(1) R_{CH} en el que R_{CH} es morfolinilo, tiomorfolinilo, S-óxido de tiomorfolinilo, S,S-dióxido de tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, tetrahidrofuranilo, o tetrahidrotiofenilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con oxo, alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br o -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
(2) R_{CY} en el que R_{CY} es piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, indenilo, indanilo, benzotiofenilo, indolilo, indolinilo, piridazinilo, pirazinilo, isoindolilo, isoquinolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, indazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, indolizinilo, indazolilo, benzotiazolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, 1,4-benzodioxanilo, purinilo, oxazolopiridinilo, imidazopiridinilo, isotiazolilo, naftiridinilo, cinolinilo, carbazolilo, \beta-carbolinilo, isocromanilo, cromanilo, furazanilo, tetrahidroisoquinolina, isoindolinilo, isobenzotetrahidrofuranilo, isobenzotetrahidrotienilo, isobenzotiofenilo, benzoxazolilo, o piridopiridinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, o I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
(3) alquil (C_{1}-C_{10})-R_{CH};
(4) alquil (C_{1}-C_{10})-R_{CY}; o
(5) alquil (C_{1}-C_{10})-K_{1-3} en el que:
(A)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con un -OH,
(B)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con un alcoxilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1-5 -F,
(D)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con 1-5 -F
(F)
cada K es:
(1)
H,
(2)
alquilo C_{1}-C_{3},
(3)
alcoxilo C_{1}-C_{3},
(4)
alquiltioxilo C_{1}-C_{3},
(5)
alquilacilamino C_{1}-C_{6},
(6)
alquilaciloxilo C_{1}-C_{6},
(7)
amido
(8)
alquilamino C_{1}-C_{6}
(9)
fenilamino,
(10)
carbamilo
(11)
carboxilo
(12)
carboxialcoxilo (C_{2}-C_{5}),
(13)
carboxialquiltioxilo (C_{2}-C_{5}),
(16)
amino no sustituido o sustituido con alquilo C_{1}-C_{6},
(17)
hidroxilo, o
(18)
éster carboxi-metílico.
Los compuestos de la presente invención son útiles en un método de tratamiento de un paciente que tiene, o en la prevención de que un paciente llegue a tener una enfermedad o estado seleccionado de enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés, angiopatía amiloide cerebral, demencia degenerativa, tipo con cuerpos de Lewy difusos de la enfermedad de Alzheimer o enfermedades amiloides centrales o periféricas y pacientes que necesiten de un tratamiento de este tipo.
La presente invención se refiere también al uso del compuesto definido anteriormente y de sales farmacéuticamente aceptables del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer.
Descripción detallada del procedimiento para preparar los compuestos de la invención
La presente invención proporciona compuestos de hidroxietileno que son útiles en el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Alzheimer. Los compuestos de hidroxietileno contra la enfermedad de Alzheimer de la presente invención se preparan mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de compuestos de partida conocidos para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen bien la química de procesos. El procedimiento más general para preparar los compuestos de la presente invención se expone en el diagrama A, según se define en él. Mientras que el procedimiento se describe con referencia a algunos compuestos que no están dentro del alcance de las reivindicaciones, el presente documento contiene su discusión para facilitar más la comprensión del procedimiento.
La química es sencilla y en resumen implica las etapas de protección del N de un material de partida de aminoácido (I) para producir el correspondiente aminoácido protegido (II), la amino-deshidroxilación del aminoácido protegido (II) con la amina apropiada en presencia de un agente de acoplamiento para producir la correspondiente amida protegida (III), reducción de la amida protegida al correspondiente aldehído (IV), formación de la olefina terminal (V) según se describe, epoxidación con perácido de la olefina (V) para producir el correspondiente epóxido (VI), apertura del epóxido (VI) con una amida (VII) para producir el correspondiente alcohol protegido (VIII), ciclación del alcohol protegido (VIII) para producir la lactona protegida (IX) de la que se elimina el grupo protector de nitrógeno para producir la correspondiente amina (X), que se hace reaccionar después con una agente de formación de amida de fórmula (R_{N-1}-X_{N})_{2}O o R_{N-1}-X_{N}-X_{2} o R_{N-1}-X_{N}-OH, por ejemplo, para producir la lactona (XI), apertura de la lactona (XI) con una amina C-terminal, RC-NH_{2} para producir los compuestos de hidroxietileno contra la enfermedad de Alzheimer de la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que estas reacciones se conocen bien en química orgánica. Un químico experto en la técnica, que conoce la estructura química de los compuestos de hidroxietileno biológicamente activos de la presente invención, podría prepararlos mediante métodos conocidos a partir de materiales de partida sin información adicional. La explicación a continuación, por tanto, no es necesaria, pero se considera de ayuda para los expertos en la técnica que deseen preparar los compuestos de la presente invención.
La estructura principal de los compuestos de la presente invención es un resto de hidroxietileno. Puede prepararse fácilmente mediante métodos descritos en la bibliografía y conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, Henning, R. "Synthetic Routes to Different Classes of Natural Products and Analogs Thereof. Synthesis of Hydroxyethylene Isosteric Dipeptides". En Organic Synthesis Highlights II; VCH: Weinheim, Alemania, 1995; págs. 251-259 describe procedimientos para preparar compuestos del tipo de hidroxietileno.
El diagrama A, según se define en él, expone un método general usado en la presente invención para preparar los compuestos de hidroxietileno sustituidos de manera apropiada de la presente invención. Los compuestos de hidroxietileno contra la enfermedad de Alzheimer de la presente invención se preparan partiendo del correspondiente aminoácido (I). Los expertos en la técnica conocen bien los aminoácidos (I) que pueden prepararse fácilmente a partir de compuestos conocidos mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los compuestos de hidroxietileno de la presente invención tienen al menos tres centros enantioméricos que dan 8 enantiómeros, prefiriéndose la estereoquímica S, S, R. El primero de estos centros enantioméricos proviene del material de partida de aminoácido (I). Se prefiere obtener comercialmente o producir el enantiómero deseado (S) en lugar de producir una mezcla enantioméricamente impura y después tener que separar el enantiómero deseado (S). Se prefiere comenzar el procedimiento con el (S)-aminoácido (I) enantioméricamente puro de la misma configuración que la del producto de hidroxietileno. Para los aminoácidos (I), R_{1} es:
(I) alquilo C_{1}-C_{6}, no sustituido o sustituido con uno, dos o tres alquilo C_{1}-C_{3}, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH_{2}, -C\equivN, -CF_{3}, o -N_{3},
(II) -(CH_{2})_{1-2}-S-CH_{3},
(III) -CH_{2}-CH_{2}-S-CH_{3},
(IV) -CH_{2}-(alquenilo C_{2}-C_{6}) no sustituido o sustituido por un -F,
(V) -(CH_{2})_{0-3}-(R_{1-arilo}) en el que R_{1-arilo} es fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, indanilo, indenilo, dihidronaftilo, tetralinilo no sustituido o sustituido independientemente en el anillo arilo con uno o dos de alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
La primera etapa del procedimiento es proteger el grupo amino libre del (S)-aminoácido (I) con un grupo protector de amino para producir el aminoácido (S)-protegido (II) mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen bien los grupos protectores de amino. Véase, por ejemplo, "Protecting Groups in Organic Synthesis" John Wiley and sons, Nueva York, N.Y., 2ª ed., 1991, Capítulo 7; "Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, N.Y., 1973, Capítulo 2. La función del grupo protector de amino es proteger la funcionalidad amino libre (-NH_{2}) durante reacciones posteriores en el (S)-aminoácido (I) que no avanzarían bien, bien debido a que el grupo amino reaccionaría y se funcionalizaría de un modo que no concuerda con su necesidad de estar libre para reacciones posteriores, o bien el grupo amino libre interferiría en la reacción. Cuando ya no se necesita el grupo protector de amino, se elimina mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por definición, el grupo protector de amino debe ser fácilmente eliminable, tal como conocen los expertos en la técnica mediante métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. Grupos protectores de amino adecuados incluyen t-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, formilo, tritilo, ftalimido, tricloroacetilo, cloroacetilo, bromoacetilo, yodoacetilo, 4-fenilbenciloxicarbonilo, 2-metilbenciloxicarbonilo, 4-etoxibenciloxicarbonilo, 4-fluorobenciloxicarbonilo, 4-clorobenciloxicarbonilo, 3-clorobenciloxicarbonilo, 2-clorobenciloxicarbonilo, 2,4-diclorobenciloxicarbonilo, 4-bromobenciloxicarbonilo, 3-bromobenciloxicarbonilo, 4-nitrobenciloxicarbonilo, 4-cianobenciloxicarbonilo, 2-(4-xenil)isopropoxicarbonilo, 1,1-difenilet-1-iloxicarbonilo, 1,1-difenilprop-1-iloxicarbonilo, 2-fenilprop-2-iloxicarbonilo, 2-(p-toluil)prop-2-iloxicarbonilo, ciclopentaniloxicarbonilo, 1-metilciclopentaniloxicarbonilo, ciclohexaniloxicarbonilo, 1-metilciclohexaniloxicarbonilo, 2-metilciclohexaniloxicarbonilo, 2-(4-toluilsulfonil)-etoxicarbonilo, 2-(metilsulfonil)etoxicarbonilo, 2-(trifenilfosfino)etoxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 1-(trimetilsililmetil)prop-1-eniloxicarbonilo, 5-bencisoxazoilmetoxicarbonilo, 4-acetoxibenciloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, 2-etinil-2-propoxicarbonilo, ciclopropilmetoxicarbonilo, 4-(deciloxil)benciloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, -fenil-C(=N)-H, y 1-piperidiloxicarbonilo. Se prefiere que el grupo protector sea t-butoxicarbonilo (BOC) y benciloxicarbonilo (CBZ), se prefiere más que el grupo protector sea t-butoxicarbonilo. Un experto en la técnica entenderá los métodos preferidos de introducción de un grupo protector de t-butoxicarbonilo o benciloxicarbonilo y adicionalmente puede consultar T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 2ª ed., 1991, en 327-335 para orientación. El aminoácido (S)-protegido (II) se transforma en el correspondiente compuesto de amida (S)-protegida (III) por medios bien conocidos por los expertos en la técnica para la producción de una amida a partir de un ácido carboxílico y una amina o hidroxilamina. Los medios y condiciones de reacción para producir el compuesto de amida (S)-protegida (III) incluyen, por ejemplo, el uso de un agente de acoplamiento tal como, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, 1,1-carbonildiimidazol, POCl_{3}, TiCl_{4}, SO_{2}ClF, fosfato de benzotriazol-1-il-dietilo, o tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil(succinimido)uronio en presencia de una amina o hidroxilamina. 1,1-Carbonildiimidazol es un agente de acoplamiento preferido y N-metil-O-metilhidroxilamina es una hidroxilamina preferida. La reacción se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de entre 1 hora y 3 días a temperaturas que oscilan desde -78º hasta temperaturas elevadas hasta el punto de reflujo del disolvente empleado. Se prefiere llevar a cabo la reacción entre 0º y 50º.
El compuesto de amida (S)-protegida (III) se reduce después por medios bien conocidos para los expertos en la técnica para la reducción de una amida al correspondiente aldehído, proporcionando el correspondiente aldehído (IV). Los medios y las condiciones de reacción para reducir el compuesto de amida (S)-protegida (III) al correspondiente aldehído (IV) incluyen, por ejemplo, borohidruro de sodio, borohidruro de litio, borano, hidruro de diisobutilaluminio e hidruro de litio y aluminio. El hidruro de litio y aluminio es el agente reductor preferido. Las reducciones se llevan a cabo durante un periodo de tiempo de entre 1 hora y 3 días a temperaturas que oscilan desde -78º hasta temperatura ambiente. Se prefiere llevar a cabo la reducción entre -20º y temperatura ambiente. Los expertos en la técnica conocen la combinación preferida de agentes reductores y condiciones de reacción requeridas, véase, por ejemplo, Larock, R.C. in Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989.
El aldehído (IV) se transforma en la correspondiente olefina (V) por medios conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo de reacción de este tipo es la reacción del aldehído (IV) con un iluro de fósforo para producir la olefina deseada. Iluros de fósforo de este tipo incluyen bromuro de metiltrifenilfosfonio. Las condiciones de reacción incluyen temperaturas que oscilan desde -100º hasta la temperatura de reflujo del disolvente empleado; los intervalos de temperatura están entre -100º y 0º.
La epoxidación con perácido de la olefina (V) proporciona el epóxido (VI). Los expertos en la técnica conocen otros métodos para la conversión de una olefina en un epóxido. Los medios para producir el epóxido (VI) incluyen, por ejemplo, el uso de un perácido tal como, por ejemplo, ácido peracético, perbenzoico, ácido trifluoroperacético, ácido 3,5-dinitroperoxibenzoico, y ácido m-cloroperbenzoico.
Después se hace reaccionar el epóxido (VI) con la amida (VII) apropiada por medios conocidos por los expertos en la técnica que abren el epóxido para producir el correspondiente alcohol protegido (VIII) deseado. La reacción del epóxido (VI) con la amida (VII) produce una mezcla de enantiómeros. Después se separa esta mezcla enantiomérica por medios conocidos por los expertos en la técnica tales como recristalización selectiva a baja temperatura o separación cromatográfica, lo más preferiblemente mediante HPLC, empleando columnas quirales disponibles comercialmente. El enantiómero que se usa en el resto del procedimiento del diagrama A es el (S,S,R)-alcohol (VIII).
El alcohol protegido (VIII) se transforma en la correspondiente lactona (IX) por medios conocidos por los expertos en la técnica. Un medio preferido es mediante reacción con un catalizador ácido, por ejemplo, pero no se limita a, ácido p-toluenosulfónico y similares. Las reacciones se llevan a cabo a temperaturas que oscilan desde -78º hasta la temperatura de reflujo del disolvente empleado; los intervalos de temperatura preferidos están entre 0º y 50º.
El resto de amina o la lactona protegida (IX) se desprotege para dar la correspondiente amina (X) por medios conocidos por los expertos en la técnica para la eliminación del grupo protector de amina. El medio adecuado para la eliminación del grupo protector de amina depende de la naturaleza del grupo protector. Los expertos en la técnica, que conocen la naturaleza de un grupo protector específico, saben qué reactivo es preferible para su eliminación. Por ejemplo, se prefiere eliminar el grupo protector preferido, BOC, disolviendo la lactona protegida (IX) en una mezcla de ácido trifluoroacético/diclorometano. Cuando se termina, se eliminan los disolventes a presión reducida para dar la correspondiente lactona (como la correspondiente sal, es decir, sal del ácido trifluoroacético) que se usa sin purificación adicional. Sin embargo, si se desea, la lactona puede purificarse adicionalmente por medios bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, recristalización. Además, si se desea la forma que no es sal, puede obtenerse por medios conocidos por los expertos en la técnica, tales como por ejemplo, preparar la amina de base libre mediante tratamiento de la sal en condiciones básicas suaves. Pueden encontrarse condiciones adicionales para la desprotección de BOC y condiciones para la desprotección de otros grupos protectores en T.W. Green y P.G.M. Wuts en "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, 1991, pág. 309 y siguientes. Sales químicamente adecuadas incluyen trifluoroacetato, y el anión de ácidos minerales tales como cloruro, sulfato, fosfato; se prefiere trifluoroacetato.
La amina (X) reacciona después con un agente de formación de amida sustituido de forma apropiada tal como anhídrido, haluro de acilo, o ácido de fórmula (R_{N-1}-X_{N})_{2}O o R_{N-1}-X_{N}-X_{2} o R_{N-1}-X_{N}-OH por medios de acilación de nitrógeno conocidos por los expertos en la técnica para producir la correspondiente lactona (XI). Los expertos en la técnica conocen las condiciones de acilación de nitrógeno para la reacción de la amina (X) con un agente de formación de amida para producir la correspondiente lactona (XI) y pueden encontrarse en R.C. Larock en Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989, pág. 981, 979, y 972.
R_{N-1} es fenilo que está sustituido independientemente con uno, dos, tres o cuatro de R_{100} en el que R_{100} es
(1) alquilo C_{1}-C_{6},
(2) -F, -Cl, -Br, o -I,
(3) -OH,
(4) -NO_{2},
(5) -CO-OH,
(6) -C\equivN,
(7) -CO-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} son iguales o diferentes y son:
(a)
-H,
(b)
-alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con un -OH o -NH_{2},
(c)
-alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con de uno a tres -F, -Cl, -Br, o -I,
(d)
-cicloalquilo C_{3}-C_{7},
(e)
-(alquil C_{1}-C_{2})-(cicloalquilo C_{3}-C_{7}),
(f)
-(alquil C_{1}-C_{6})-O-(alquilo C_{1}-C_{3}),
(g)
- alquenilo C_{1}-C_{6} con uno o dos dobles enlaces,
(h)
- alquinilo C_{1}-C_{6} con uno o dos triples enlaces,
(i)
cadena de alquilo C_{1}-C_{6} con un doble enlace y un triple enlace,
(8) -CO-(alquilo C_{3}-C_{12}),
(9) -CO-(cicloalquilo C_{3}-C_{6}),
(11) -CO-R_{1-heterociclo} en el que R_{1-heterociclo} es morfolinilo, tiomorfolinilo, S-óxido de tiomorfolinilo, S,S-dióxido de tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, tetrahidrofuranilo, o tetrahidrotiofenilo, en los que el grupo R_{1-heterociclo} está unido mediante cualquier átomo del grupo R_{1-heterociclo} original sustituido por hidrógeno de tal forma que el nuevo enlace al grupo R_{1-heteroarilo} sustituye al átomo de hidrógeno y su enlace, en el que el heterociclo no está sustituido o está sustituido con uno o dos =O, alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -OCF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN,
(12) -CO-R_{N-4} en el que R_{N-4} es morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, piperidinilo o pirrolidinilo en el que cada grupo no está sustituido o está sustituido con uno o dos alquilo C_{1}-C_{3},
(13) -CO-O-R_{N-5} en el que R_{N-5} es:
(a)
alquilo C_{1}-C_{6}, o
(b)
-(CH_{2})_{0-2}-(R_{1-arilo}) en el que R_{1-arilo} es según se definió anteriormente,
(14) -SO_{2}-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} son según se definieron anteriormente,
(15) -SO-(alquilo C_{1}-C_{8}),
(16) -SO_{2}-(alquilo C_{3}-C_{12}),
(17) -NH-CO-O-R_{N-5} en el que R_{N-5} es según se definió anteriormente,
(18) -NH-CO-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(19) -N-CS-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(20) -N(alquil C_{1}-C_{3})-CO-R_{N-5} en el que R_{N-5} es según se definió anteriormente,
(21) -NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} pueden ser iguales o diferentes y son según se definieron anteriormente,
(22) -R_{N-4} en el que R_{N-4} es según se definió anteriormente,
(23) -O-CO-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(24) -O-CO-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(25) -O-CS-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(26) -O-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(27) -O-(alquil C_{2}-C_{5})-COOH,
(28) -S-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(29) alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1, 2, 3, 4, o 5 -F,
(30) -O-(alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1, 2, 3, 4, o 5 -F, o
(31)-O-\varphi;
La acilación de nitrógeno de aminas primarias para producir amidas secundarias es una de las reacciones conocidas más antiguas. Los expertos en la técnica conocen los agentes de formación de amida, (R_{N-1}-X_{N})_{2}O o R_{N-1}-X_{N}-X_{2} o R_{N-1}-X_{N}-OH y éstos están disponibles comercialmente o pueden prepararse fácilmente a partir de materiales de partida conocidos mediante métodos conocidos en la bibliografía. X_{2} incluye -Cl, -Br; se prefiere que X_{2} sea -Cl. Se prefiere usar un agente acilante de ácido isoftálico de fórmula R_{N-2}R_{N-3}N-CO-\phi-CO- o un agente acilante de ácido metilisoftálico R_{N-2}R_{N-3}N-CO-(CH_{3}-)\phi-CO- en el que la sustitución sea ácido 5-metil-1,3-isoftálico. El ácido 5-metil-1,3-isoftálico más preferido es ácido 3-[(N,N-dipropilamino)carbonil]-5-metilbenzoico. Estos compuestos se preparan preferiblemente tal como se expone a continuación. Se disuelve un éster, preferiblemente el éster metílico de isoftalato o 5-metil-1,3-isoftalato de metilo, en una mezcla de THF/DMF. Luego se añade 1,1'-carbonildiimidazol a 0-100º. A continuación se añade la amina deseada (H-NR_{N-2}R_{N-3}). Tras agitar a 0-100º, se reparte la mezcla de reacción entre una disolución acuosa saturada con un pH de 3 a 9 y un disolvente orgánico inmiscible en agua. La fase acuosa se separa y se extrae dos veces más con el disolvente orgánico. Los extractos orgánicos se combinan y se lavan después con una disolución acuosa y se secan. La filtración del agente desecante y la eliminación de los disolventes a presión reducida da éster bruto del deseado R_{N-2}R_{N-3}N-CO-\phi-CO-O-CH_{3} o un agente acilante de ácido metilisoftálico R_{N-2}R_{N-3}N-CO-(CH_{3}-)\phi-CO-O-CH_{3}. La purificación del éster puede lograse mediante cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un disolvente adecuado. El éster de isoftalato o el éster de metilisoftalato de la monoalquil o dialquilamida se trata después con una disolución acuosa de base tal como hidróxido alcalino en una cantidad mínima de THF/metanol/agua y se agita a 20-70º con monitorización. Los disolventes se eliminan a presión reducida y posteriormente se reparten entre agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua. La fase acuosa se separa y se extrae una vez más con un disolvente orgánico inmiscible en agua. Después se acidificó la fase acuosa hasta pH \leq 3. Luego, se extrajo la mezcla obtenida tres veces con acetato de etilo. Después se secaron estos extractos orgánicos combinados. Se elimina el agente desecante por filtración y el disolvente orgánico se elimina a presión reducida para dar el producto bruto. El isoftalato/metilisoftalato de mono o dialquilamida bruto se usa como tal en la siguiente reacción con la amina (X) para producir la lactona (XI).
Cuando se desea producir una amida primaria, R_{N-2} y R_{N-3} son ambos -H, se prefiere el siguiente procedimiento. Un éster de isoftalato o 5-metil-1,3-isoftalato de metilo se disuelve en una mezcla de THF/DMF. Luego se añade CDI a 0-100º. Después se burbujea gas amoniaco dentro de la mezcla con monitorización. La reacción se enfría hasta 0º durante la duración de la adición de amoniaco. La reacción se deja agitando bajo un globo de amoniaco a 0-100º con monitorización. La reacción se reparte entre una disolución acuosa con un pH de 3 a 9 y un disolvente orgánico inmiscible en agua. Las fases se separan y la fase acuosa se extrae dos veces más con un disolvente orgánico inmiscible en agua. Los extractos orgánicos se lavan con una disolución acuosa y se secan. La eliminación de disolventes a presión reducida da el éster bruto del deseado H_{2}N-CO-\phi-CO-O(alquilo) o un agente acilante de ácido metilisoftálico H_{2}N-CO-(CH_{3}-)\phi-CO-O(alquilo). La purificación del éster bruto puede lograse mediante cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con isopropanol/cloroformo. Luego se trata el éster de isoftalato o éster de metilisoftalato de la amida primaria con una disolución acuosa de base tal como hidróxido alcalino en una cantidad mínima de THF/metanol/agua y se agita a 0-100º con monitorización. Los disolventes se eliminan a presión reducida y posteriormente se reparten entre agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua. La fase acuosa se separa y se extrae una vez más con un disolvente orgánico inmiscible en agua. Luego se acidifica la fase acuosa hasta pH \leq 3. Luego se extrae la mezcla obtenida tres veces con un disolvente orgánico inmiscible en agua. Estos extractos orgánicos combinados se secan y el disolvente orgánico se elimina a presión reducida para dar el producto bruto. El isoftalato/metilisoftalato de amida primaria se usa como tal en la siguiente reacción (X) para producir (XI).
Se sigue el siguiente procedimiento cuando se desea que la amina se cicle para dar un grupo tal como morfolinilo, piperazinilo, piperidinilo y pirrolidinilo, etc. Se disuelve un éster de isoftalato o 5-metil-1,3-isoftalato de metilo en un disolvente orgánico adecuado y se añade una cantidad catalítica o DMF. La mezcla se enfría hasta -20º hasta por debajo de la t.a. y después se añade cloruro de oxalilo. La mezcla se agita con monitorización y los disolventes se eliminan a presión reducida. Se deja el cloruro de ácido a vacío durante la noche. Se disuelve el cloruro de ácido en un disolvente orgánico adecuado y se enfría hasta -20º hasta por debajo de la t.a. antes de la adición de la amina cíclica y de N-metilpiperidina. La mezcla de reacción se agita a -20º hasta por debajo de la t.a. con monitorización antes de eliminar los disolventes. Se diluye el residuo con agua y disolvente orgánico inmiscible en agua y se separan las fases. La fase acuosa se extrae dos veces más con disolvente orgánico inmiscible en agua, y los extractos orgánicos combinados se lavan con una disolución acuosa y se secan. La eliminación de los disolventes a presión reducida da el producto bruto. Luego se trata la amida cíclica cruda con una base acuosa tal como hidróxido alcalino en una cantidad mínima de THF/metanol/agua y se agita durante la noche a 0-100º. Los disolventes se eliminan a presión reducida y posteriormente se reparten entre agua y un disolvente orgánico inmiscible en agua. Se extrae la fase acuosa una vez más con un disolvente orgánico inmiscible en agua. La eliminación del agua de la fase acuosa a presión reducida da el producto de amida cíclica deseado.
Después, la lactona (XI) puede reaccionar con la amina C-terminal sustituida de manera apropiada, RC-NH_{2} por medios conocidos por los expertos en la técnica que abren la lactona para producir el producto final de hidroxietileno (XII) deseado. Las aminas C-terminales sustituidas de esta invención están disponibles comercialmente o se conocen por los expertos en la técnica y pueden prepararse fácilmente a partir de compuestos conocidos. R_{C} incluye:
(1) R_{CH} en el que R_{CH} es morfolinilo, tiomorfolinilo, S-óxido de tiomorfolinilo, S,S-dióxido de tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, tetrahidrofuranilo, o tetrahidrotiofenilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con oxo, alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br o -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
(2) R_{CY} en el que R_{CY} es piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, indenilo, indanilo, benzotiofenilo, indolilo, indolinilo, piridazinilo, pirazinilo, isoindolilo, isoquinolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, indazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, indolizinilo, indazolilo, benzotiazolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, 1,4-benzodioxanilo, purinilo, oxazolopiridinilo, imidazopiridinilo, isotiazolilo, naftiridinilo, cinolinilo, carbazolilo, \beta-carbolinilo, isocromanilo, cromanilo, furazanilo, tetrahidroisoquinolina, isoindolinilo, isobenzotetrahidrofuranilo, isobenzotetrahidrotienilo, isobenzotiofenilo, benzoxazolilo, o piridopiridinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, o I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
(3) -alquil(C_{1}-C_{10})-R_{CH};
(4) -alquil(C_{1}-C_{10})-R_{CY}; o
(5) -alquil(C_{1}-C_{10})-K_{1-3} en el que:
(A)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con un -OH,
(B)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con un alcoxilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1-5 -F,
(D)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con 1-5 -F
(F)
cada K es:
(1)
H,
(2)
alquilo C_{1}-C_{3},
(3)
alcoxilo C_{1}-C_{3},
(4)
alquiltioxilo C_{1}-C_{3},
(5)
alquilacilamino C_{1}-C_{6},
(6)
alquilaciloxilo C_{1}-C_{6},
(7)
amido
(8)
alquilamino C_{1}-C_{6}
(9)
fenilamino,
(10)
carbamilo
(11)
carboxilo
(12)
carboxilalcoxilo (C_{2}-C_{5}),
(13)
carboxilalquiltioxilo (C_{2}-C_{5}),
(16)
amino no sustituido o sustituido con alquilo C_{1}-C_{6},
(17)
hidroxilo, o
(18)
éster carboxi-metílico.
Condiciones de reacción adecuadas para abrir la lactona (XI) para producir el producto final de hidroxietileno (XII) deseado incluyen las de la reacción de acoplamiento mediada por AlMe_{3} descrita en el procedimiento de la bibliografía de S.F. Martin y cols., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 1517-1520. Cuando la amina C-terminal sustituida es un ciclohexildicarboxilato de 1-amino-3,5-cis-dimetilo se prepara preferiblemente tal como sigue. Se añade rodio en alúmina en una botella a alta presión, a 5-isoftalato de dimetilo en ácido acético y metanol. Se satura la botella con hidrógeno a 380 KPa y se agita durante una semana de tiempo. Luego se filtra la mezcla a través de una capa gruesa de torta de celite y se enjuaga con metanol tres veces, los disolventes se eliminan a presión reducida (con calor) para dar un concentrado. Se tritura el concentrado con éter y se filtra de nuevo para dar la amina C-terminal deseada. Cuando la amina C-terminal sustituida es 1-amino-3,5-cis-dimetoxiciclohexano es preferible seguir el procedimiento general anterior y realizar variaciones no críticas, pero partiendo de 3,5-dimetoxianilina. Cuando la amina C-terminal sustituida es un grupo aminometilo, en el que el sustituyente en el grupo metilo es un grupo arilo, por ejemplo NH_{2}-CH_{2}-R_{C-arilo}, y NH_{2}-CH_{2}-R_{C-arilo} no está disponible comercialmente, se prepara preferiblemente tal como sigue. Un material de partida adecuado es el compuesto de aralquilo (sustituido de manera apropiada). La primera etapa es la bromación del sustituyente de alquilo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, véase, por ejemplo R.C. Larock en Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989, pág. 313. A continuación, se hace reaccionar el haluro de alquilo con azida para producir la aril-(alquil)-azida. Por último, se reduce la azida a la correspondiente amina mediante hidrógeno/catalizador para dar la amina C-terminal de fórmula NH_{2}-CH_{2}-R_{C-arilo}.
El diagrama B, según se define en él, expone un procedimiento para la producción de la amida (VII). La preparación de la amida (VIII) comienza con la reacción de un amino-indanol (XIV) apropiado con una halocetona (XII) apropiada para proporcionar el hidroxi-indano (XV). Los expertos en la técnica conocen bien el amino-indanol (XIV) y la halocetona (XII), o pueden prepararse fácilmente a partir de compuestos conocidos mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. El sustituyente X de la halocetona es normalmente F, Cl, Br, o I. X es preferiblemente Cl. Para la amino-halocetona (XII), R_{2} es:
(I) -H,
(II) alquilo C_{1}-C_{6}, o
(III) -(CH_{2})_{0-4}-R_{2-1} en el que R_{2-1} es cicloalquilo(C_{3}-C_{6}), R_{1-arilo} en el que R_{1-arilo} es según se definió anteriormente.
Determinados compuestos de hidroxietileno de la presente invención contienen funcionalidad ácida que puede formar sales de adición de base. Además, determinados compuestos de hidroxietileno de la presente invención contienen funcionalidad básica que puede formar sales de adición de ácido. Por ejemplo, determinados compuestos de hidroxietileno de la presente invención son aminas y como tal forman sales cuando reaccionan con ácidos. Se prefieren sales farmacéuticamente aceptables más que los correspondientes compuestos de hidroxietileno de la presente invención ya que producen compuestos que son más solubles en agua, estables y/o más cristalinos. Sales farmacéuticamente aceptables son cualquier sal que conserva la actividad del compuesto original y no confiere ningún efecto perjudicial o no deseado al sujeto al que se administra y en el contexto en que se administra. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales tanto de ácidos inorgánicos como de ácidos orgánicos. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, cítrico, metanosulfónico, CH_{3}-(CH_{2})_{n1}-COOH en el que n_{1} es 0 a 4, HOOC-(CH_{2})n_{1}-COOH en el que n es según se definió anteriormente, HOOC-CH=CH-COOH, y \varphi-COOH. Adicionalmente, sales farmacéuticamente aceptables preferidas incluyen sales de las siguientes bases: trietanolamina, N-metilglucamina, dietanolamina, etanolamina, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), amoniaco, y carbonato, bicarbonato, fosfonato, o sales de hidróxido de un metal alcalino o alcalinotérreo. Para otras sales aceptables, véase Int. J. Pharm., 33, 201-217 (1986).
Compuestos preferidos de la presente invención son:
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-(piperidin-1-carbonil)-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-(2-morfolin-4-il-etilcarbamoil)-pentil]-5-metil-N,N-dipropil-
isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-[(tetrahidro-furan-2-ilmetil)-carbamoil]-pentil)-5-metil-N,N-
dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-metil-5-morfolin-4-il-5-oxo-pentil]-5-metil-N,N-dipropil-isof-
talamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-4-(R)-[(furan-2-ilmetil)-carbamoil]-2-(S)-hidroxi-pentil)-5-metil-N,N-dipropilisoftalamida.
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-isobutilcarbamoilpentil]-5-metil-N,N-dipropil-isoftalamida;
ácido 3-[6-(3,5-difluorofenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoilbenzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxihexanoilamino]-
propionico;
ácido 8-[6-(3,5-difluorofenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoilbenzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxihexanoilamino]-
octanoico;
éster metílico del ácido 8-[6-(3,5-difluoro-fenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoil-benzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxi-hexanoilamino]-octanoico;
N-[4-(R)-Butilcarbamoil-1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-isobutilcarbamoil-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[4-(R)-bencilcarbamoil-1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxihexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[4-(R)-(ciclohexilmetil-carbamoil)-1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-(piperidin-1-carbonil)-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida; o
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-4-(R)-(2-dimetilamino-etilcarbamoil)-2-(S)-hidroxi-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida.
Los compuestos de hidroxietileno de la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, son útiles para tratar seres humanos que padecen la enfermedad de Alzheimer.
Cuando se trata esta enfermedad, los compuestos de la presente invención pueden utilizarse o bien individualmente o bien en combinación según sea mejor para el paciente.
Con respecto a estas enfermedades, el término "tratar" significa que los compuestos de la presente invención pueden usarse en seres humanos con la enfermedad existente. Los compuestos de la presente invención retrasarán o ralentizarán la progresión de la enfermedad facilitando así al individuo una longevidad más útil.
El término "prevenir" significa que si los compuestos de la presente invención se administran a aquellos que no tienen ahora la enfermedad pero que normalmente enfermarían o correrían un mayor riesgo de tener la enfermedad, no enfermarán. Además, "prevenir" también incluye retrasar el desarrollo de la enfermedad en un individuo que en última instancia enfermaría o correría el riesgo de tener la enfermedad. Retrasando la aparición de la enfermedad, los compuestos de la presente invención han evitado que el individuo enferme durante el periodo en el que el individuo habría enfermado normalmente o reducido la tasa de desarrollo de la enfermedad o algunos de sus efectos si no hubiera sido por la administración de los compuestos de la presente invención hasta el momento en que el individuo enferma en última instancia. La prevención también incluye la administración de los compuestos de la invención a aquellos individuos que se cree que están predispuestos a la enfermedad debido a una historia familiar y/o debido a la presencia de uno o más marcadores biológicos para la enfermedad tal como una mutación genética conocida de APP o mediante análisis de los productos de escisión de APP en tejidos o líquidos corporales.
Al tratar o prevenir la enfermedad, se administran los compuestos de la presente invención en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del compuesto particular usado y de la vía de administración tal como conocen los expertos en la técnica.
Al tratar un paciente con la enfermedad de Alzheimer, un médico puede administrar compuestos de la presente invención inmediatamente y continuar indefinidamente.
Al tratar pacientes que actualmente no tienen la enfermedad de Alzheimer, pero que se cree que corren un riesgo sustancial de tener la enfermedad de Alzheimer, el médico debe iniciar el tratamiento cuando el paciente experimenta los síntomas tempranos previos al Alzheimer, tales como, problemas de memoria o cognitivos asociados con el envejecimiento. Además, hay algunos pacientes que pueden diagnosticarse con Alzheimer mediante la detección del marcador genético APOE4 u otros indicadores biológicos que pueden pronosticar la enfermedad de Alzheimer. En estas situaciones, aun cuando el paciente no tenga síntomas de la enfermedad, la administración de los compuestos de la presente invención puede iniciarse antes de que aparezcan y continuarse indefinidamente el tratamiento para prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía oral, vía parenteral (i.v., i.m., depósito i.m., s.c. y depósito s.c.), vía sublingual, vía intranasal (inhalación), vía intratecal, vía tópica y vía rectal. Aquí, la invención son los compuestos novedosos de la presente invención. Las formas farmacéuticas conocidas por los expertos en la técnica son adecuadas para la administración de los compuestos novedosos de la presente invención.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía enteral o por vía parenteral. Cuando se administran por vía oral, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en formas farmacéuticas habituales para la administración oral, como conocen bien los expertos en la técnica. Estas formas farmacéuticas incluyen las formas farmacéuticas unitarias sólidas habituales de comprimidos y cápsulas así como las formas farmacéuticas líquidas tales como disoluciones, suspensiones y elixires. Cuando se usan las formas farmacéuticas sólidas, se prefiere que sean del tipo de liberación sostenida, de modo que los compuestos de la presente invención sólo necesitan administrarse una o dos veces al día.
Las formas farmacéuticas orales se administran al paciente 1, 2, 3, ó 4 veces al día. Se prefiere que los compuestos de la presente invención se administren o bien tres o bien menos veces, más preferiblemente una o dos veces al día. Así, se prefiere que los compuestos de la presente invención se administren en forma farmacéutica oral. Se prefiere que se use la forma farmacéutica que se use, esté diseñada de modo que proteja los compuestos de la presente invención del entorno ácido del estómago. Los comprimidos con recubrimiento entérico se conocen bien por los expertos en la técnica. Además, también se conocen bien por los expertos en la técnica cápsulas rellenas con pequeñas esferas recubiertas para protegerlas del ácido del estómago. Cuando se administran por vía oral, la cantidad terapéuticamente eficaz es desde aproximadamente 0,1 mg/día hasta aproximadamente 1.000 mg/día. Se prefiere que la dosificación oral sea desde aproximadamente 1 mg/día hasta aproximadamente 100 mg/día. Se prefiere más que la dosificación oral sea desde aproximadamente 5 mg/día hasta aproximadamente 50 mg/día. Se entiende que aunque un paciente puede iniciar el tratamiento con una dosis, esa dosis puede tener que variarse con el tiempo a medida que cambia el estado del paciente.
Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse ventajosamente en una formulación de dispersión de nanocristales. La preparación de tales formulaciones se describe en el documento US 5.145.684. Y se describen dispersiones nanocristalinas de, por ejemplo, inhibidores de proteasas de VIH y su método de uso en el documento US 6.045.829. Las formulaciones nanocristalinas normalmente producen una biodisponibilidad superior de los compuestos farmacológicos.
Además, los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral. Cuando se administran por vía parenteral pueden administrarse i.v., i.m., depósito i.m., s.c. o depósito s.c. Cuando se administran por vía parenteral, los compuestos de hidroxietileno de fórmula (XII) deben suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/día, preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 mg al día. Cuando se utiliza una formulación de depósito para inyección una vez al mes o una vez cada dos semanas, la dosis debe ser de aproximadamente 0,5 mg/día a aproximadamente 50 mg/día o en una cantidad mensual, la dosis para un mes debe ser de desde aproximadamente 15 mg hasta aproximadamente 1.500 mg. Debido a la mala memoria de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer, se prefiere que la forma farmacéutica parenteral sea una inyección de depósito i.m.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía sublingual. Cuando se administran por vía sublingual, los compuestos deben administrarse de una a cuatro veces al día en la misma cantidad que para la administración i.m.
Los compuestos pueden administrarse por vía intranasal. Cuando se administran mediante esta vía de administración, las formas farmacéuticas apropiadas son un aerosol nasal o un polvo seco, tal como conocen los expertos en la técnica. La dosificación de los compuestos para la administración intranasal es la misma que para la administración i.m.
Los compuestos pueden administrarse por vía intratecal. Cuando se administran mediante esta vía de administración, la forma farmacéutica apropiada puede ser una forma farmacéutica parenteral tal como conocen los expertos en la técnica. La dosificación de los compuestos para la administración intratecal es la misma que para la administración i.m.
Los compuestos pueden administrarse por vía tópica. Cuando se administran mediante esta vía de administración, la forma farmacéutica apropiada es una crema, pomada o parche. Se prefiere el parche debido a la cantidad de los compuestos que es necesario administrar. Además, pueden necesitarse dos o más parches. Cuando se administran por vía tópica, la dosificación es desde aproximadamente 0,5 mg/día hasta aproximadamente 200 mg/día. Sin embargo, la cantidad que puede administrarse mediante un parche es limitada. Por tanto, pueden requerirse dos o más parches. El número y tamaño del parche no es importante, lo que es importante es que se administre una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos de la presente invención, tal como conocen los expertos en la técnica.
Los compuestos pueden administrarse por vía rectal mediante supositorio tal como conocen los expertos en la técnica. Cuando se administran mediante supositorio, la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 500 mg.
Los compuestos pueden administrarse mediante implantes tal como conocen los expertos en la técnica. Cuando se administra un compuesto de la presente invención mediante implante, la cantidad terapéuticamente eficaz es la misma que para la administración con depósito.
Dado un compuesto particular y una forma farmacéutica deseada, un experto en la técnica sabía cómo preparar la forma farmacéutica apropiada para los compuestos de la presente invención.
Los compuestos de la presente invención se usan de la misma manera, mediante las mismas vías de administración, usando las mismas formas farmacéuticas de dosificación y en el mismo programa de dosificación para tratar pacientes con DCL (deterioro cognitivo leve) y prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad de Alzheimer en aquellos que avanzarían desde DCL hasta EA, para tratar el síndrome de Down, para tratar seres humanos que padecen hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés, para tratar la angiopatía amiloide cerebral y prevenir sus posibles consecuencias, es decir, hemorragias lobulares única y recurrente, para tratar otras demencias degenerativas, incluyendo demencias de origen vascular y degenerativo mixto, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson, demencia asociada con parálisis supranuclear progresiva, demencia asociada con degeneración cortico-basal, tipo con cuerpos de Lewy difusos de la enfermedad de Alzheimer. Los compuestos de la presente invención pueden usarse unos con otros, o con otros agentes usados, para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer. Tales agentes incluyen inhibidores de la gamma-secretasa, vacunas anti-amiloide y agentes farmacéuticos tales como donepezilo clorhidrato (comprimidos ARICEPT®), tacrina clorhidrato (cápsulas COGNEX®) u otros inhibidores de la acetilcolina esterasa y con agentes neurotrópicos directos o indirectos futuros.
Inhibición de la escisión de APP
Los compuestos de la invención inhiben la escisión de APP en el sitio de escisión por \beta-secretasa, Met595-Asp596 para la isoforma APP695. Aunque no se desea restringirse a una teoría particular, se cree que la inhibición de la actividad \beta-secretasa inhibe la producción de beta-péptido beta-amiloide (A\beta). La actividad inhibidora se demuestra en uno de una variedad de ensayos de inhibición, mediante el cual se analiza la escisión de un sustrato de APP en presencia de una enzima \beta-secretasa, en presencia del compuesto inhibidor, en condiciones suficientes normalmente para dar como resultado la escisión en el sitio de escisión por \beta-secretasa. La reducción de escisión de APP en el sitio de escisión por \beta-secretasa comparado con un control no tratado o inactivo está correlacionado con la actividad inhibidora. Se conocen sistemas de ensayo que pueden usarse para demostrar la eficacia de los compuestos inhibidores de la invención. Se describen sistemas de ensayo representativos, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.942.400.
La actividad enzimática de la \beta-secretasa y la producción de A\beta pueden analizarse in vitro o in vivo, usando sustratos de APP naturales, mutados y/o sintéticos, enzima natural, mutada y/o sintética, y compuesto de prueba. Los análisis pueden implicar células primarias o secundarias que expresan APP y la enzima nativos, mutantes y/o sintéticos, o pueden usarse modelos de animales transgénicos que expresan el sustrato y la enzima. La detección de la actividad enzimática puede ser mediante el análisis de uno o más de los productos de escisión, por ejemplo, mediante inmunoensayo, ensayo fluorométrico o cromogénico, HPLC, u otros medios de detección. Los compuestos inhibidores se determinan como aquellos que tienen la capacidad para disminuir la cantidad de producto de escisión por \beta-secretasa producido en comparación con un control, en el que se observa y mide la escisión mediada por \beta-secretasa en el sistema de reacción en ausencia de los compuestos inhibidores.
\beta-secretasa
Se conocen diversas formas de la enzima \beta-secretasa, y están disponibles y son útiles para el ensayo de la actividad enzimática y la inhibición de la actividad enzimática. Estas incluyen formas nativas, recombinantes y sintéticas de la enzima. Se han caracterizado ASP2a y Asp2B, por ejemplo, en las solicitudes de patente PCT publicadas WO98/22597 y WO00/17369, así como formas sintéticas de la enzima.
Los compuestos de la invención inhiben el 50% de la actividad enzimática \beta-secretasa a una concentración de desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 200 \muM, preferiblemente a una concentración de desde aproximadamente 10 nM hasta aproximadamente 100 \muM, más preferiblemente desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 50 \muM, y lo más preferiblemente desde aproximadamente 1 \muM hasta aproximadamente 10 \muM.
Sustrato de APP
Los ensayos que demuestran que la inhibición de la escisión mediada por \beta-secretasa de APP pueden utilizar cualquiera de las formas conocidas de APP, incluyendo el isotipo "normal" de 695 aminoácidos descrito por Kang y cols., 1987, Nature 325:733-6, el isotipo de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi y cols., 1981, Nature 331:530-532, y variantes tales como la mutación sueca (KM670-1NL) (APP-SW), la mutación londinense (V7176F), y otras. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.766.846 y también Hardy, 1992, Nature Genet. 1:233-234, para una revisión de las mutaciones de variantes conocidas. Los sustratos útiles adicionales incluyen la modificación de aminoácido dibásico, APP-KK descrita, por ejemplo, en el documento WO 00/17369, fragmentos de APP, y péptidos sintéticos que contienen el sitio de escisión por \beta-secretasa, forma natural (WT, "wild type") o mutada, por ejemplo, SW, según se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.942.400.
El sustrato de APP también puede ser un péptido de fusión, formado de un péptido que tiene el sitio de escisión por \beta-secretasa fusionado a un péptido que confiere una característica útil para el ensayo enzimático, por ejemplo, propiedades de aislamiento y/o detección.
Un ensayo útil utiliza un péptido de fusión que tiene proteína de unión a maltosa (MBP) fusionada a los 125 aminoácidos del extremo C-terminal de APP-SW. La parte de MBP se captura sobre un sustrato de ensayo mediante un anticuerpo de captura anti-MBP. La incubación de la proteína de fusión capturada en presencia de la \beta-secretasa da como resultado la escisión del sustrato en el sitio de escisión por \beta-secretasa. El análisis de la actividad de escisión puede ser, por ejemplo, mediante inmunoensayo de los productos de escisión. Un inmunoensayo detecta un epítopo único expuesto en el extremo carboxilo-terminal de la proteína de fusión escindida, por ejemplo, usando el anticuerpo SW192. Este ensayo se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.942.400.
Ensayo celular
Pueden incubarse células que expresan un sustrato de APP y una \beta-secretasa activa en presencia de un compuesto inhibidor, para demostrar la inhibición de la actividad enzimática en comparación con un control. La actividad de la \beta-secretasa puede medirse mediante análisis de uno o más productos de escisión de APP. Por ejemplo, se esperaría que la inhibición celular de la actividad \beta-secretasa disminuyera la liberación del producto de escisión, A\beta.
Las líneas celulares humanas que normalmente procesan A\beta a partir de APP proporcionan un medio útil para someter a ensayo las actividades inhibidoras de los compuestos de la invención. Puede medirse la producción y liberación de A\beta y/u otros productos de escisión en el medio de cultivo, por ejemplo, mediante inmunoensayo, tal como inmunotransferencia de tipo Western o inmunoensayo ligado a enzimas (EIA o ELISA).
Los cultivos celulares de neuronas primarias de cerebro humano o de tejido cerebral obtenido de animales transgénicos que expresan APP, particularmente APP humana, y que puede procesar APP en A\beta detectable, son también células útiles para el ensayo de la actividad de escisión por \beta-secretasa. Por ejemplo, los cultivos celulares de neuronas humanas primarias derivados de tejidos embrionarios humanos expresan \beta-secretasa endógena y APP endógena. Se somete a ensayo la actividad enzimática en presencia del compuesto inhibidor, y se miden los productos de escisión, tales como A\beta. Otro sistema de cultivo celular primario útil emplea células derivadas de tejido cerebral de ratones transgénicos, por ejemplo, de ratones PD-APP que expresan una APP transgénica que tiene una mutación en V717 o la mutación sueca.
Aunque tanto las células neuronales como no neuronales procesan y liberan A\beta, los niveles de actividad de la \beta-endógena son bajos y a menudo es difícil de detectar mediante EIA. Por tanto, se prefiere el uso de los tipos de células que se sabe que tienen una actividad \beta-secretasa mejorada, un procesamiento mejorado de APP en A\beta, y/o una producción mejorada de A\beta. Por ejemplo, la transfección de células con la forma mutante sueca de APP (APP-SW); con APP-KK; o con APP-SW-KK proporciona células que tienen una actividad \beta-secretasa mejorada y que producen cantidades de A\beta que pueden medirse fácilmente.
Anticuerpos
Pueden medirse las características de los productos de la escisión de APP mediante inmunoensayo usando diversos anticuerpos, según se describe, por ejemplo, en Pirttila et. al., 1999, Neuro. Lett. 249:21-4, y en la patente de los EE.UU. número 5.612.486. Anticuerpos útiles para detectar A\beta incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 6E10 (Senetek, St. Louis, MO) que reconoce específicamente un epítopo en los aminoácidos 1-16 del péptido A\beta; anticuerpos 162 y 164 (Instituto de Investigación Básica del Estado de Nueva York, Staten Island, NY) que son específicos para hA\beta 1-40 y 1-42, respectivamente. Otro anticuerpo útil es SW192, según se trató anteriormente, que reconoce un epítopo no cubierto en el fragmento de escisión C-terminal tras la escisión de APP-SW mediada por la \beta-secretasa.
Modelos de animales
Los modelos de animales útiles en las pruebas de los compuestos de la invención incluyen aquellos que expresan niveles elevados de A\beta, lo que demuestra un aumento de la cantidad de depósitos de A\beta, y/o un aumento del número o tamaño de placas de beta-amiloide en comparación con los animales control. Tales modelos de animales incluyen mamíferos transgénicos. Los animales transgénicos adecuados incluyen roedores transformados con una variante o APP modificado que da como resultado una cantidad medida de A\beta en el animal que es superior que la producida en un control no transformado. Ejemplos de modelos de animales transgénicos adecuados incluyen un ratón transformado con APP-SW, descrito, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. números 5.877.399, 5.612.486, y 5.850.003. Otros animales adecuados se transforman con V717 APP, según se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.877.015, y en Ganes et. al., 1995, Nature 373:523.
La escisión de APP en el sitio de escisión por \beta-secretasa puede analizarse en estos animales mediante la medición de los fragmentos de escisión en los tejidos cerebrales del animal, y posiblemente los líquidos cerebrales, así como mediante el análisis de las placas de beta-amiloide y la evaluación de la necrosis en los tejidos cerebrales del animal.
Al poner en contacto un sustrato de APP con una enzima \beta-secretasa en presencia de un compuesto inhibidor de la invención y en condiciones suficientes para permitir la escisión mediada enzimáticamente de APP y/o la liberación de A\beta desde el sustrato, los de la invención son eficaces para reducir la escisión mediada por \beta-secretasa de APP en el sitio de escisión por \beta-secretasa y/o eficaces para reducir las cantidades liberadas de A\beta. Cuando tal puesta en contacto es la administración de los compuestos inhibidores de la invención a un modelo de animal, por ejemplo, según se describió anteriormente, los compuestos son eficaces para reducir la deposición de A\beta en los tejidos cerebrales del animal, y para reducir el número y/o tamaño de placas de beta-amiloide. Cuando tal administración es a un sujeto humano, los compuestos son eficaces para inhibir o ralentizar la progresión de la enfermedad caracterizada por un aumento de las cantidades de A\beta, para ralentizar la progresión de EA en el, y/o para prevenir la aparición o el desarrollo de EA en un paciente en riesgo de tener la enfermedad.
Sistemas de ensayo
Se conocen bien en la técnica los ensayos para determinar la escisión de APP en el sitio de escisión por \beta-secretasa. Se describen ensayos a modo de ejemplo, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. números 5.744.346 y 5.942.400, y se describen en los ejemplos más adelante.
Ensayos libres de células
Se describen ensayos a modo de ejemplo que pueden usarse para demostrar la actividad inhibidora de los compuestos de la invención, por ejemplo, en el documento WO00/17369 y la patente de los EE.UU. número 5.942.400. Tales ensayos pueden realizarse en incubaciones libres de células o en incubaciones celulares usando células que expresan una \beta-secretasa y un sustrato de APP que tiene un sitio de escisión por \beta-secretasa.
Se incuba un sustrato de APP que contiene el sitio de escisión por \beta-secretasa de APP, por ejemplo, una APP completa o una variante, un fragmento de APP, o una sustrato de APP recombinante o sintético que contiene la secuencia de aminoácidos: KM-DA o NL-DA, en presencia de una enzima \beta-secretasa, por ejemplo Asp2a humana (h), hAsp2b, un fragmento de las mismas, o una variante de polipéptido sintética o recombinante de hAsp2a o hAsp2b que tiene actividad \beta-secretasa y es eficaz para escindir el sitio de escisión por \beta-secretasa de APP, en condiciones de incubación adecuadas para la actividad de escisión de la enzima. Los sustratos adecuados incluyen opcionalmente derivados que pueden ser proteínas o péptidos de fusión que contienen el péptido sustrato y una modificación útil para facilitar la purificación o detección del péptido o sus productos de escisión por \beta-secretasa. Las modificaciones útiles incluyen la inserción de un epítopo antigénico conocido por la unión de anticuerpos; el enlace de un marcador o un resto detectable, el enlace de un sustrato de unión y similares.
Las condiciones de incubación adecuadas para un ensayo sin células in vitro incluyen, por ejemplo: sustrato aproximadamente 200 nM-10 \muM, enzima aproximadamente 10-200 pM, y compuesto inhibidor aproximadamente
0,1 nM-10 \muM, en disolución acuosa, a un pH aproximado de 4-7, a aproximadamente 37ºC, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 10 minutos a 3 horas. Estas condiciones de incubación son solamente a modo de ejemplo, y pueden variarse según se requiera para los componentes del ensayo particular y/o el sistema de medición deseado. La optimización de las condiciones de incubación para los componentes del ensayo particular debe tener en cuenta la b-enzima usada y su pH óptimo, cualquier enzima y/o marcador adicional que podría usarse en el ensayo, y similares. Tal optimización es rutinaria y no requerirá una experimentación excesiva.
Ensayos celulares
Numerosos ensayos basados en células para analizar la actividad \beta-secretasa y/o el procesamiento de APP para liberar A\beta. En una realización, se usan células que expresan de manera natural \beta-secretasa. Alternativamente, se modifican células para expresar una \beta-secretasa recombinante, por ejemplo, hAsp2a, hAsp2b, o una enzima de variante recombinante o sintética, según se trató anteriormente.
El sustrato de APP puede añadirse al medio de cultivo o expresarse en las células. Pueden usarse células que expresan de manera natural APP, formas de variante o mutantes de APP, o células transformadas para expresar una isoforma de APP, APP mutante o variante, APP recombinante o sintético, fragmento de APP, proteína de fusión o péptido de APP sintético que contiene el sitio de escisión de APP por \beta-secretasa, siempre que se permita que la APP expresada pueda entrar en contacto con la enzima y pueda analizarse la actividad de escisión enzimática.
El contacto de un sustrato de APP con una enzima \beta-secretasa dentro de la célula y en presencia o ausencia de un compuesto inhibidor de la invención puede usarse para demostrar la actividad inhibidora. La función o actividad \beta-secretasa, por ejemplo, según se mide mediante la escisión del sustrato de APP y la detección de fragmentos y/o marcadores, puede tomar numerosas formas, según se trató anteriormente para ensayos no celulares. Preferiblemente, el ensayo en presencia de un compuesto inhibidor útil proporciona al menos aproximadamente el 30%, lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 50% de inhibición de la actividad enzimática, comparado con un control no inhibido.
En tales ensayos, por ejemplo, se incuban las células que expresan APP y \beta-secretasa en un medio de cultivo, en condiciones que permiten el procesamiento de la APP por la enzima y la liberación de A\beta en el medio y la acumulación de otros fragmentos de APP en lisados celulares. La actividad inhibidora de los compuestos de la invención puede demostrarse incubando las células en presencia y ausencia del compuesto. Con la exposición de las células al compuesto inhibidor, la cantidad de A\beta liberado en el medio y/o la cantidad de fragmentos CTF99 de APP en los lisados celulares se reduce en comparación con el control. Los productos de escisión de APP pueden analizarse, por ejemplo, mediante reacciones inmunitarias con anticuerpos específicos, según se trató anteriormente.
Las células preferidas para el análisis de la actividad \beta-secretasa incluyen células neuronales humanas primarias, células neuronales animales transgénicas primarias, en las que el transgén es APP, y otras células tales como las de una línea celular 293 que expresa APP, por ejemplo, APP-SW. En el ensayo celular, se incuban células en presencia o ausencia del inhibidor, en condiciones adecuadas para determinar la actividad enzimática \beta-secretasa en su sitio de escisión en el sustrato de APP. Se recoge el sobrenadante celular, y se analiza para determinar los fragmentos de escisión, por ejemplo, mediante inmunoensayo.
Ensayos in vivo: modelos de animales
Pueden usarse diversos modelos de animales para analizar la actividad \beta-secretasa y/o el procesamiento de APP para liberar A\beta, según se describió anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse animales transgénicos que expresan sustrato de APP y enzima \beta-secretasa para demostrar la actividad inhibidora de los compuestos de la invención. Se prefieren animales que muestran características asociadas con la patofisiología de EA. Se han descrito ciertos modelos de animales transgénicos para EA, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. números: 5.877.399, 5.612.486, 5.387.742, 5.720.936, y 5.811.633.
La administración de los compuestos inhibidores de la invención a los ratones transgénicos descritos en el presente documento proporciona un método alternativo para demostrar la actividad inhibidora de los compuestos inhibidores. Se prefiere la administración del compuesto inhibidor en un vehículo farmacéuticamente aceptable y a través de una vía de administración que alcance el tejido diana y en una cantidad terapéutica apropiada. La inhibición de la escisión mediada por \beta-secretasa de APP y de la liberación de A\beta puede medirse mediante análisis de los productos de escisión en los líquidos o tejidos corporales del animal. También se realiza el análisis de los tejidos cerebrales para determinar las placas o depósitos de A\beta.
Será evidente para un experto en la técnica que la dosificación y la frecuencia exactas de administración dependerán de los compuestos de hidroxietileno particulares de fórmula (XII) administrados, el estado particular que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, la edad, peso, estado físico general del paciente particular, y otra medicación que el individuo pueda estar tomando tal como conocen bien los médicos que los administran, que son expertos en esta técnica.
Definiciones y convenciones
Las definiciones y explicaciones a continuación son para los términos tal como se usan en todo este documento completo incluyendo tanto la memoria descriptiva como las reivindicaciones.
I. Convenciones para fórmulas y definiciones de variables
Las fórmulas químicas que representan los diversos compuestos o fragmentos moleculares en la memoria descriptiva y las reivindicaciones pueden contener sustituyentes variables además de características estructurales definidas expresamente. Estos sustituyentes variables se identifican por una letra o una letra seguida por un subíndice numérico, por ejemplo, "Z_{1}" o "R_{i}" en el que "i" es un número entero. Estos sustituyentes variables son o bien monovalentes o bien bivalentes, es decir, representan un grupo unido a la fórmula mediante uno o dos enlaces químicos. Por ejemplo, un grupo Z_{1} representaría un radical bivalente si está unido a la fórmula CH_{3}-C(=Z_{1})H. Los grupos R_{i} y R_{j} representarían sustituyentes variables monovalentes si están unidos a la fórmula CH_{3}-CH_{2}-C(R_{i})(R_{j})H_{2}. Cuando las formulas químicas se dibujan de manera lineal, tal como las anteriores, los sustituyentes variables contenidos entre paréntesis están unidos al átomo inmediatamente a la izquierda del sustituyente variable encerrado entre paréntesis. Cuando dos o más sustituyentes variables consecutivos están encerrados entre paréntesis, cada uno de los sustituyentes variables consecutivos está unido al átomo inmediatamente precedente a la izquierda que no está encerrado entre paréntesis. Por tanto, en la fórmula anterior, tanto R_{i} como R_{j} están unidos al átomo de carbono precedente. Además, para cualquier molécula con un sistema establecido de numeración de los átomos de carbono, tal como los esteroides, estos átomos de carbono se designan como C_{i}, en el que "i" es el número entero correspondiente al número de átomos de carbono. Por ejemplo, C_{6} representa la posición 6 o el número de átomos de carbono en el núcleo del esteroide tal como se designaba tradicionalmente por los expertos en la técnica de la química de los esteroides. Asimismo, el término "R_{6}" representa un sustituyente variable (o bien monovalente o bien bivalente) en la
posición C_{6}.
Las fórmulas químicas o partes de las mismas dibujadas de manera lineal representan los átomos en una cadena lineal. El símbolo "-" representa, en general, un enlace entre dos átomos en la cadena. Por tanto, CH_{3}-O-CH_{2}-CH(R_{i})-CH_{3} representa un compuesto de 2-sustituido-1-metoxipropano. De manera similar, el símbolo "=" representa un doble enlace, por ejemplo, CH_{2}=C(R_{i})-OCH_{3}, y el símbolo "\equiv" representa un triple enlace, por ejemplo, HC\equivC-CH(R_{i})-CH_{2}-CH_{3}. Los grupos carbonilo se representan en cualquiera de dos maneras: -CO- o -C(=O)-, prefiriéndose la primera por simplicidad.
Una estructura cíclica (de anillo) rígida para cualquier compuesto en el presente documento define una orientación con respecto al plano del anillo para los sustituyentes unidos a cada átomo de carbono del compuesto cíclico rígido. Para compuestos saturados que tienen dos sustituyentes unidos a un átomo de carbono que es parte de un sistema cíclico, -C(X_{1})(X_{2})- los dos sustituyentes pueden estar en una posición o bien axial o bien ecuatorial con respecto al anillo y pueden cambiar entre axial / ecuatorial. Sin embargo, la posición de los dos sustituyentes con respecto al anillo y entre sí permanece fija. Mientras cualquier sustituyente a veces puede encontrarse en el plano del anillo (ecuatorial) en lugar de por encima o por debajo del plano (axial), un sustituyente está siempre por encima del otro. En fórmulas estructurales químicas que representan tales compuestos, se identificará un sustituyente (X_{1}) que está "por debajo" de otro sustituyente (X_{2}) como que está en la configuración alfa (\alpha) y se identifica mediante una unión con una línea quebrada, discontinua o de puntos al átomo de carbono, es decir, mediante el símbolo "- - -" o "...". El sustituyente correspondiente unido "por encima" (X_{2}) del otro (X_{1}) se identifica como que está en la configuración (\beta) y la unión al átomo de carbono se indica mediante una línea continua.
Cuando un sustituyente variable es bivalente, las valencias pueden tomarse juntas o por separado o ambas en la definición de la variable. Por ejemplo, una variable R_{i} unida a un átomo de carbono como -C(=Ri)- podría ser bivalente y definirse como oxo o ceto (formando así un grupo carbonilo (-CO-) o como dos sustituyentes variables monovalentes unidos por separado \alpha-R_{i-j} y \beta-R_{i-k}. Cuando se define que una variable bivalente, R_{i}, consiste en dos sustituyentes variables monovalentes, la convención usada para definir la variable bivalente es de la forma "\alpha-R_{i-j}:\beta-R_{i-k}" o alguna variante de la misma. En tal caso, tanto \alpha-R_{i-j} como \beta-R_{i-k} se unen al átomo de carbono para dar -C(\alpha-R_{i-j})
(\beta-R_{i-k})-. Por ejemplo, cuando la variable bivalente R_{6}, -C(=R_{6})- se define que consiste en dos sustituyentes variables monovalentes, los dos sustituyentes variables monovalentes son (\alpha-R_{6-1}:\beta-R_{6-2}, .... \alpha-R_{6-9}:\beta-R_{6-10}, etc., dando -C(\alpha-R_{6-1})(\beta-R_{6-2})-, .... -C(\alpha-R_{6-9})(\beta-R_{6-10})-, etc. Similarmente, para la variable bivalente R_{11}, -C(=R_{11})-, dos sustituyentes variables monovalentes son \alpha-R_{11-1}:\beta-R_{11-2}. Para un sustituyente de anillo para el que no existen orientaciones \alpha y \beta separadas (por ejemplo, debido a la presencia de un doble enlace carbono-carbono en el anillo), y para un sustituyente unido a un átomo de carbono que no es parte de un anillo, se sigue usando la convención anterior, pero se omiten las designaciones \alpha y \beta.
Ya que una variable bivalente puede definirse como dos sustituyentes variables monovalentes separados, los dos sustituyentes variables monovalentes separados pueden definirse para tomarse juntos para formar una variable bivalente. Por ejemplo, en la fórmula -C_{1}(R_{i})H-C_{2}(R_{j})H- (C_{1} y C_{2} definen arbitrariamente un primer y un segundo átomo de carbono, respectivamente) R_{i} y R_{j} pueden definirse para tomarse juntos para formar (1) un segundo enlace entre C_{1} y C_{2} o (2) un grupo bivalente tal como oxa (-O-) y la fórmula describe así un epóxido. Cuando R_{i} y R_{j} se toman juntos para formar una entidad más compleja, tal como el grupo -X-Y-, entonces la orientación de la entidad es tal que C_{1} en la fórmula anterior está unido a X y C_{2} está unido a Y. por tanto, por convención, la designación "... R_{i} y R_{j} se toman juntos para formar -CH_{2}-CH_{2}-O-CO-..." significa una lactona en la que el carbonilo está unido a C_{2}. Sin embargo, cuando los R_{j} y R_{i} designados se toman juntos para formar -CO-OCH_{2}-CH_{2}-, la convención significa una lactona en la que el carbonilo está unido a C_{1}.
El contenido de átomos de carbono de los sustituyentes variables se indica mediante una de dos maneras. El primer método usa un prefijo para el nombre completo de la variable tal como "C_{1}-C_{4}", en el que tanto "1" como "4" son números enteros que representan el número mínimo y máximo de átomos de carbono en la variable. El prefijo se separa de la variable por un espacio. Por ejemplo, "alquilo C_{1}-C_{4}" representa un alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, (incluyendo las formas isoméricas del mismo a menos que se dé una indicación expresa de lo contrario). Siempre que se dé este prefijo individual, el prefijo indica el contenido completo de átomos de carbono de la variable que se está definiendo. Por tanto, alcoxicarbonilo C_{2}-C_{4} describe un grupo CH_{3}-(CH_{2})_{n}-O-CO- en el que n es cero, uno o dos. Mediante el segundo método, sólo se indica el contenido de átomos de carbono de cada parte de la definición, por separado, encerrando la designación "C_{i}-C_{j}" entre paréntesis y colocándola inmediatamente (sin espacio intermedio) después de la parte de la definición que se está definiendo. Mediante esta convención opcional, alcoxi(C_{1}-C_{3}) carbonilo tiene el mismo significado que alcoxicarbonilo C_{2}-C_{4} porque el "C_{1}-C_{3}" se refiere solamente al contenido de átomos de carbono del grupo alcoxilo. De manera similar, mientras que tanto alcoxialquilo C_{2}-C_{6} como alcoxi(C_{1}-C_{3})alquilo(C_{1}-C_{3}) definen grupos alcoxialquilo que contienen desde 2 hasta 6 átomos de carbono, las dos definiciones difieren puesto que la primera definición permite que cualquiera de la parte de alcoxilo o alquilo solas contengan 4 ó 5 átomos de carbono mientras que la última definición limita cualquiera de estos grupos a 3 átomos de
carbono.
Cuando las reivindicaciones contienen un sustituyente bastante complejo (cíclico), al final de la frase que nombra/designa ese sustituyente particular, habrá una anotación entre (paréntesis) que corresponderá al mismo nombre/designación en uno de los diagramas que expondrán también la fórmula estructural química de ese sustituyente particular.
Ha de entenderse que la enumeración de los intervalos numéricos mediante los puntos finales incluye todos los números y fracciones incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1; 1,5; 2; 2,75; 3; 3,80; 4; y 5).
Ha de entenderse que "un" tal como se usa en el presente documento incluye tanto el singular como el plural.
Las definiciones generales usadas en el presente documento tienen los siguientes significados dentro del alcance de la presente invención.
II. Definiciones
Todas las temperaturas son en grados Celsius.
CCF se refiere a cromatografía en capa fina.
psi se refiere a libras/pulgada^{2}.
HPLC se refiere a cromatografía líquida de alta presión.
THF se refiere a tetrahidrofurano.
DMF se refiere a dimetilformamida.
EDC se refiere a etil-1-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida o clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida.
NBS se refiere a N-bromosuccinimida.
TEA se refiere a trietilamina.
BOC se refiere a 1,1-dimetiletoxicarbonilo o t-butoxicarbonilo, -CO-O-C(CH_{3})_{3}.
CBZ se refiere a benciloxicarbonilo, -CO-O-CH_{2}-\varphi.
TFA se refiere a ácido trifluoracético, CF_{3}-COOH.
CDI se refiere a 1,1'-carbonildiimidazol.
Solución salina se refiere a disolución saturada acuosa de cloruro de sodio.
Cromatografía (cromatografía en columna y ultrarrápida) se refiere a purificación/separación de compuestos expresadas como (soporte, eluyente). Se entiende que se reúnen y concentran las fracciones apropiadas para dar los compuesto(s) deseado(s).
RMC se refiere a espectroscopia de resonancia magnética de C-13, los desplazamientos químicos se notifican en ppm (\delta) a campo más bajo de TMS.
RMN se refiere a espectroscopia de resonancia magnética nuclear (de protón), los desplazamientos químicos se notifican en ppm (\delta) a campo más bajo de TMS.
-\phi se refiere a fenilo (C_{6}H_{5}).
EM se refiere a espectrometría de masas expresado como m/e, m/z o unidad de masa/carga. MH^{+} se refiere al ion positivo de un átomo original más uno de hidrógeno. CI se refiere a ionización química. FAB se refiere a bombardeo de átomos rápidos.
EMAR se refiere a espectrometría de masas de alta resolución.
Éter se refiere a dietil éter.
"APP", proteína precursora de amiloide, se define como cualquier polipéptido de APP, incluyendo variantes, mutaciones e isoformas de APP, por ejemplo según se describe en la patente de los EE.UU. número 5.766.846.
"A\beta", beta-péptido beta-amiloide, se define como cualquier péptido que resulta de la escisión mediada por beta-secretasa de APP, incluyendo péptidos de 39, 40, 41, 42, y 43 aminoácidos, y extendiéndose desde el sitio de escisión de beta-amilasa hasta los aminoácidos 39, 40, 41, 42, o 43.
"\beta-secretasa" es una aspartil proteasa que media la escisión de APP en el extremo amino-terminal de A\beta. Se describe \beta-secretasa humana, por ejemplo, en el documento WO00/17369.
Un compuesto de la invención es cualquier compuesto descrito en el presente documento que tiene actividad inhibidora frente a una enzima \beta-secretasa; frente a la producción de A\beta; frente a la producción de placas o depósitos de beta-amiloide; o frente al desarrollo o progresión de una enfermedad neurodegenerativa tal como EA, medido, por ejemplo, mediante uno o más de los ensayos descritos en el presente documento.
Farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista farmacológico/toxicológico y para el químico farmacéutico que los fabrica desde un punto de vista físico/químico con respecto a la composición, formulación, estabilidad, aceptación por el paciente y biodisponibilidad.
Cuando se utilizan pares de disolventes, las razones de disolventes usados son en volumen/volumen (v/v).
Cuando se usa la solubilidad de un sólido en un disolvente, la razón del sólido con respecto al disolvente es en peso/volumen (p/v).
BOP se refiere a hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio.
TBDMSCI se refiere a cloruro de t-butildimetilsililo.
TBDMSOTf se refiere a éster del ácido t-butildimetilsilil-trifluorosulfónico.
Trisomía 21 se refiere a síndrome de Down.
Ac = acetil (metilcarbonilo)
ac. = acuoso
da = doblete ancho
sa = singlete ancho
c = concentración (g/mL)
cc = centímetro cúbico
d = doblete
DCM = diclorometano = cloruro de metileno = CH_{2}Cl_{2}
ed = exceso diastereomérico
EDTA = ácido etilendiaminotetraacético
eq. = equivalentes
EtOAc = acetato de etilo
EtOH = etanol
g = gramos
HOBT = 1-hidroxibenzotriazol
h = hora
CI_{50} = concentración inhibidora que reduce la actividad enzimática a la mitad.
iso = una cadena de alquilo que tiene el grupo terminal 2-metilpropilo, es decir -CH(CH_{3})_{2}.
i.m. = por vía intramuscular
i.v. = por vía intravenosa
s.c. = por vía subcutánea
L = litro
LDA = diisopropilamida de litio
m = multiplete
máx. = máximo
mg = miligramo
mL = mililitro
mm = milímetro
mM = milimolar
mmol = milimol
pf = punto de fusión
MeOH = metanol
meq = miliequivalente
MsOH = ácido metanosulfónico
n = normal, es decir no ramificado, por ejemplo, n-Pr es -CH_{2}-CH_{2}-CH_{3}
N = normal
ng = nanogramo
nm = nanometros
DO = densidad óptica
PEPC = 1-(3-(1-pirrolidinil)propil)-3-etilcarbodiimida
pg = picogramo
pM = picoMolar
R_{f}= razón de movimiento de una sustancia en un cromatograma de capa fina en comparación con el movimiento del frente de disolvente.
\delta = unidades de medición en espectroscopia de resonancia magnética nuclear que son relativas a un patrón, por ejemplo, tetrametilsilano.
q = cuartete
quint. = quintete
rpm = rotaciones por minuto
s = singlete
t = triplete
t o terc = terciario en una cadena de alquilo, por ejemplo, t-butilo es -C(CH_{3})_{3}.
\muL = microlitro
\muM = micromolar (una expresión de concentración en micromoles/litro)
s = singlete
t = triplete
UV = ultravioleta.
A menos que se indique lo contrario, todos los radicales de grupo funcional (por ejemplo, alquilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo cíclico, heterociclilo, etc.) pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los radicales de grupo funcional sustituidos pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes, a menos que se indique lo contrario. Los sustituyentes adecuados para los radicales de grupo funcional sustituidos incluyen generalmente halógeno, hidroxilo, alcoxilo, alquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, arilalcoxilo, y similares. Se entenderá que la terminología "radical X sustituido por un/una Y" incluye el radical "X" que está sustituido por dos o más "Y", a menos que se indique lo contrario.
"Alquilo" se refiere a radicales hidrocarbonados alifáticos saturados, lineales o ramificados, tales como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, octilo, isopropilo, terc-butilo, sec-pentilo, y similares.
"Cicloalquilo" se refiere a radicales hidrocarbonados alifáticos cíclicos, tales como, por ejemplo, anillos hidrocarbonados de 3 a 8 miembros (por ejemplo, ciclohexilo o ciclopentilo), sistemas cíclicos hidrocarbonados de 4 a 10 miembros bicíclicos, y sistemas cíclicos hidrocarbonados de 8 a 14 miembros tricíclicos. Los grupos cicloalquilo monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclohexano y ciclopentano. Los grupos cicloalquilo multicíclicos incluyen por ejemplo ciclohexilo, ciclopentilo, y 1,2,3,4-tetrahidronaftilo.
"Heterociclo" se refiere a radicales no aromáticos cíclicos que contienen al menos dos átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N, y S como miembros de al menos un anillo. Ejemplos de tales radicales incluyen anillos de 3 a 8 miembros; sistemas cíclicos de 4 a 10 miembros bicíclicos, y sistemas cíclicos de 8 a 14 miembros tricíclicos, en los que al menos un anillo (y en algunos casos cada uno de los anillos) de cualquiera de estos ejemplos contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N, y S como miembros del anillo. Los grupos heterocíclicos monocíclicos incluyen por ejemplo morfolinilo, piperazinilo, y tetrahidrofuranilo. Los grupos heterocíclicos multicíclicos incluyen por ejemplo decahidroquinolina, óxido de ciclohexeno, y 3-amino-3-azabiciclo[3.3.0]octano.
"Alquileno" se refiere a, radicales hidrocarbonados alifáticos saturados, lineales o ramificados, bivalentes tales como, por ejemplo, metileno, etileno, propileno, butileno, octileno, isopropileno, terc-butileno, sec-pentileno, y similares.
"Alquenilo" se refiere a radicales hidrocarbonados alifáticos lineales o ramificados que contienen al menos un doble enlace, tales como, por ejemplo, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-metil-1-propenilo, y similares.
"Alquinilo" se refiere a radicales hidrocarbonados alifáticos lineales o ramificados que contienen al menos un triple enlace, tales como, por ejemplo, etinilo (acetilo), 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, y similares.
"Arilo" se refiere a radicales hidrocarbonados aromáticos cíclicos que tienen un único anillo, tales como fenilo, múltiples anillos, tales como bifenilo, y múltiples anillos condensados, tales como naftilo y antracilo. Los grupos arilo monocíclicos incluyen fenilo, por ejemplo. Los grupos arilo multicíclicos incluyen por ejemplo naftilo y antracilo.
"Amina" incluye aminas primarias, secundarias y terciarias que pueden estar en cadenas lineales o ramificadas o, en el caso de las aminas secundarias y terciarias, dentro de anillos (por ejemplo, morfolina y piperazina).
"Heteroarilo" se refiere a anillos aromáticos cíclicos que tienen de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de S, O, y N; y anillos bicíclicos estables orgánicos, de 7 a 10 miembros, aromáticos que tienen de 1 a 5 heteroátomos seleccionados de S, O, y N. Ejemplos de tales radicales incluyen anillos de 3 a 8 miembros; sistemas cíclicos de 4 a 10 miembros bicíclicos; y sistemas cíclicos de 8 a 14 miembros tricíclicos, en los que al menos un anillo (y en algunos casos cada uno de los anillos) de cualquiera de estos ejemplos contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N, y S como miembros del anillo.
"Aciloxilo" se refiere a los grupos R-C(O)O-, R-C(O)O- sustituido, cicloalquil-C(O)O-, aril-C(O)O-, y heterociclil- C(O)O en los que R = alquilo, y alquilo, cicloalquilo, arilo, y heterociclilo son según se definen en el presente documento.
"Acilamino" se refiere a los grupos R-C(O)N-, R-C(O)N- sustituido, cicloalquil-C(O)N-, aril-C(O)N-, y heterociclil-C(O)N- en los que R = alquilo, y alquilo, cicloalquilo, arilo, y heterociclilo según se definen en el presente documento.
"Amida" y "amido" se refieren a un grupo funcional un átomo de carbono unido mediante un doble enlace a un átomo de oxígeno y unido adicionalmente mediante un enlace sencillo a un átomo de nitrógeno [-C(O)-N]. Amida "primaria" describe un grupo amida no sustituido [-C(O)-NH_{2}]. Las amidas "secundarias" y "terciarias" son amidas en las que el nitrógeno está sustituido con uno o dos grupos distintos de hidrógeno, respectivamente. El término "lactama" se refiere a una amida ciclada, es decir una amida secundaria o terciaria en la que el carbono carbonílico y el átomo de nitrógeno son miembros adyacentes de un anillo.
"Halógeno" se refiere a radicales fluoro, cloro, bromo, y yodo.
"Lactona" se refiere un éster ciclado de un ácido carboxílico.
"Tio" se refiere a la sustitución de oxígeno por azufre en un radical definido. Ejemplos de tio compuesto incluyen compuestos de alquiltioxilo (por ejemplo, alquil-S-).
"Tioxialquilo" se refiere al radical divalente -S-alquil-, en el que el alquilo es según se definió anteriormente. Ejemplos de restos tioxialquilo incluyen restos alquil-S-alquilo, tales como CH_{3}-S-CH_{2}CH_{2}-.
"Alcoxilo" se refiere al radical -O-alquilo con alquilo según se definió anteriormente. Los grupos alcoxilo incluyen, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, y similares.
"Arilalquilo" y "aralquilo" se refieren a un radical alquilo sustituido con un arilo.
"Alquilarilo" se refiere a un radical arilo sustituido con un alquilo. Todos los términos "carboxilo", "ácido carboxílico", "carboxilato" y "carbamoílo" son términos que se refieren a grupos funcionales que contienen un átomo de carbono unido mediante un doble enlace a un átomo de oxígeno [C=O, también denominado un grupo acilo o carbonilo, representado en notación lineal como -C(O)-] y unido adicionalmente mediante un enlace sencillo a otro átomo de oxígeno [-C(O)-O-], y en el caso de carbamoílo, también se une adicionalmente un átomo de nitrógeno al carbono carbonílico para dar -N-C(O)-O-. Carboxilo, carboxilato y carbamato incluyen las amidas secundarias y terciarias y los ésteres alquílicos C_{1}-C_{6} y arílicos C_{6}-C_{10} farmacéuticamente aceptables.
También se usan combinaciones de estos términos para radicales de grupo funcional. Normalmente, el último término en la designación contiene el radical que se une al resto de la estructura química. Por ejemplo, "haloalquilo" se refiere a un radical alquilo sustituido por un halógeno, "cicloalquilalquilo" se refiere a un radical alquilo sustituido por un cicloalquilo, y "alquilcicloalquilo" se refiere a un radical cicloalquilo sustituido por un alquilo.
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Diagrama A
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Diagrama A (continuación)
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Diagrama A (continuación)
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Diagrama B
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Ejemplos
Se cree que, un experto en la técnica puede, sin elaboración adicional y usando la descripción precedente, practicar la presente invención en su extensión más completa. Los siguientes ejemplos detallados, describen cómo preparar los diversos compuestos y/o realizar los diversos procedimientos y han de interpretarse de manera meramente ilustrativa, y sin limitaciones de la descripción precedente de ningún modo que sea. Los expertos en la técnica reconocerán inmediatamente variaciones apropiadas de los procedimientos tanto como para reactivos como para condiciones y técnicas de reacción.
A continuación se ilustran en los siguientes ejemplos las preparaciones de los compuestos novedosos de la presente invención que usan el isóstero de hidroxietileno.
Se conservan los ejemplos que no están dentro del alcance de la reivindicación, para fines de información.
Métodos de síntesis
Los siguientes esquemas de reacción ilustran métodos de construcción de los isósteros de dipéptido de hidroxietileno proporcionados en los ejemplos 1-13. En estas reacciones pueden usarse variaciones de materiales de partida para preparar núcleos de hidroxietileno que tienen otros grupos de cadena lateral. Las sustituciones de materiales de partida disponibles, para conseguir variantes de cadena lateral deseadas, serán evidentes para un experto habitual en la técnica.
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Esquema I
Síntesis de un resto de hidroxietileno adecuado para acoplamiento en el C-terminal
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*Procedimiento para la preparación de 1-bromo-5-metilhex-2-eno:
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Alternativamente, pueden prepararse hidroxietilenos mediante los métodos descritos a continuación. Se adaptó la síntesis del material de partida de epóxido treo de Boc-3,5-difluorofenilalanina del procedimiento de Luly, JR, y cols. J. Org. Chem. 1987, 52, 1487-1492 para la síntesis del epóxido treo de Boc-fenilalanina (esquema II). El material de partida utilizado en la preparación del epóxido treo de Boc-3,5-difluorofenilalanina fue 1-3,5-difluorofenilalanina protegida con Boc disponible de Synthetech, Inc. (1290 Industrial Way, P. O. Box 646, Albania, OR 97321 EE.UU.).
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Esquema II
Formación de un precursor de epóxido quiral representativo
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Se lograron la síntesis de amina quiral, la etapa de alquilación inicial y la manipulación adicional para dar la lactona, basándose en los procedimientos de la bibliografía, tal como sigue: Dragovich, PS, y cols. J. Med. Chem. 1999, 42, 1203-1222; Askin, D., y cols. J. Org. Chem. 1992, 57, 2771-2773. Se logró la escisión del grupo protector Boc y el posterior acoplamiento del ácido usando los procedimientos para la desprotección de la amina y el acoplamiento con EDC dados a continuación. Se logró la apertura del anillo de la lactona para dar el producto final usando una etapa de acoplamiento mediada por AlMe_{3} según el procedimiento de la bibliografía de S.F. Martin y cols., Tetrahedron Lett. 1998, 39,1517-1520.
Eliminación de un grupo protector Boc de una amina protegida para generar amina libre
Por ejemplo, se disolvió el producto intermedio de alfa-amino-lactona protegida con Boc del esquema I o II en una disolución de ácido trifluoroacético/diclorometano (1/1). Se monitorizó la reacción mediante CCF para confirmar el consumo de material de partida en el momento en que los disolventes se eliminaron a presión reducida para producir la amina libre, que se usó sin purificación adicional.
Acoplamiento de amina desprotegida con un grupo de ocupación de extremos ("capping") N-terminal
Por ejemplo, se disolvió ácido 2-(N,N-dipropil)amidobenzoico (1,0 equiv.) en 30 mL de diclorometano anhidro, después se añadieron HOBT (2,0 equiv.), \alpha-amino-lactona funcionalizada de la etapa anterior (1,0 equiv.) y TEA (5 equiv.) y se agitó todo durante 20 minutos. Se añadió EDC (1,2 equiv.) y se agitó la mezcla durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno. Después se diluyó la reacción con agua y se extrajo con EtOAc (3x). Se lavaron las fases orgánicas con ácido cítrico acuoso (2x), NaHCO_{3} sat. (2x), salmuera, luego se secaron sobre MgSO_{4}, y se eliminó el disolvente a vacío. Después, el producto de esta etapa puede someterse a la aminolisis del anillo de lactona para proporcionar el enlace de amida deseado.
TABLA 1 Resultados del ensayo de inhibición enzimática para estructuras que tienen la estructura principal peptídica
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Ejemplo 1
Se preparó este compuesto empleando el hidroxietileno con amino e hidroxilo protegidos preparado mediante el esquema I. Se preparó el compuesto mediante métodos sintéticos de péptido soportado sobre resina habitual usando procedimientos de acoplamiento con HOBt, EDC habituales descritos en el esquema II. Se esterificó Boc-Phe al soporte de resina. Se eliminó el grupo protector Boc del Phe mediante tratamiento con ácido trifluoroacético en diclorometano (TFA/DCM) y después se acopló con Boc-Glu (monoéster) según se describió anteriormente. Se repitió el ciclo de desprotección de amino y el acoplamiento con HOBt/EDC, con Boc-Ala, después con el resto de hidroxietileno protegido del esquema I y después Boc-Met y finalmente Ac-Val. Se eliminó el éster de glutamilo mediante hidrólisis con LiOH. Se eliminó el grupo sililo de la función hidroxilo mediante tratamiento con fluoruro de tetra-t-butilamonio [(t-Bu)_{4}NF] en THF.
12
Ejemplo 2
Se acopló el éster metílico del ácido p-aminometilbenzoico (disponible comercialmente) con el resto de hidroxietileno del esquema I usando el acoplamiento con EDC/HOBt habitual. Se eliminó el grupo protector Boc del extremo N-terminal y luego, se acopló posteriormente con Boc-Val-Met. Se hidrolizó el éster metílico según se describió anteriormente y se eliminó el grupo sililo de la función hidroxilo mediante tratamiento con fluoruro de tetra-t-butilamonio [(t-Bu)_{4}NF] en THF.
13
Ejemplo 3
Se acopló el resto de hidroxietileno del esquema con el éster dimetílico de 3,5-dicarboxiciclohexilamina según se preparó en el esquema VI A. A su vez se desprotegió este producto intermedio en el extremo N-terminal con TFA/DCM y después se acopló con el ácido alfa-hidroxi-naftilacético. Se hidrolizaron los ésteres metílicos con LiOH y después se eliminó el grupo sililo de la función hidroxilo mediante tratamiento con fluoruro de tetra-t-butilamonio [(t-Bu)_{4}NF] en THF.
14
Ejemplo 4
Se acopló el hidroxietileno protegido, según se produjo en el esquema I, con el éster dimetílico de 3,5-dicarboxiciclohexilamina (esquema VI A). Se hidrolizó el diéster con LiOH y se eliminó el grupo protector de sililo mediante tratamiento con fluoruro de tetra-t-butilamonio [(t-Bu)_{4}NF] en THF.
15
Ejemplo 5 Diastereomérico en el \alpha-hidroxi-naftilacetilo
Se acopló el resto de hidroxietileno del esquema I con el 3-(1-aminopropil)-4-benzoato de metilo (disponible comercialmente). A su vez se desprotegió este producto intermedio en el extremo N-terminal con TFA/DCM (1:1) y después se acopló con el ácido alfa-hidroxi-naftilacético. Se hidrolizó el éster metílico con LiOH y luego se eliminó el grupo sililo de la función hidroxilo mediante tratamiento con fluoruro de tetra-t-butilamonio [(t-Bu)_{4}NF] en THF.
17
Ejemplo 6
Se preparó este isóstero de pentapéptido para probar la eficacia del ácido \alpha-hidroxinaftilacético como un peptidomimético de grupo N-terminal en una secuencia de oligopéptido que demostraba buena actividad (véase el ejemplo 1). Se preparó el resto de hidroxietileno mediante el método del esquema I. Se empleó la síntesis soportada sobre resina para preparar la molécula uniendo Boc-Phg a un soporte de resina y después se construyó de manera secuencial mediante eliminación del grupo protector Boc y el acoplamiento con HOBt/EDC a su vez con éster metílico del ácido glutámico, valina, el isóstero de hidroxietileno del esquema I y finalmente con ácido \alpha-hidroxi-naftilacético. Luego se escindió
el producto del soporte sólido y se eliminaron los grupos protectores según se describió en los ejemplos anteriores.
18
En el esquema I se explica la preparación de los ejemplos 1-6, según se describe en la tabla 1 anterior.
Ejemplo 7
Después de conseguir el acoplamiento en el extremo C-terminal según se describió anteriormente, se sometió la lactona a aminolisis a temperaturas de reflujo con 3,5-dimetilciclohexilamina en presencia de AlMe_{3} y un disolvente orgánico adecuado para proporcionar el compuesto objeto.
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Ejemplo 8
Después de conseguir el acoplamiento en el extremo C-terminal según se describió anteriormente, se sometió la lactona a aminolisis a temperaturas de reflujo con ácido 6-aminohexanoico en presencia de AlMe_{3} y un disolvente orgánico adecuado para proporcionar el compuesto objeto.
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Ejemplo 9
Después de conseguir el acoplamiento en el extremo C-terminal según se describió anteriormente, se sometió la lactona a aminolisis a temperaturas de reflujo con ácido 8-amino-octanoico en presencia de AlMe_{3} y un disolvente orgánico adecuado que se disolvió después en MeOH y se trató con gas HCl para proporcionar el éster metílico deseado.
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Ejemplo 10
Después de conseguir el acoplamiento en el extremo C-terminal según se describió anteriormente, se sometió la lactona a aminolisis a temperaturas de reflujo con 4-carboxiciclohexilmetilamina en presencia de AlMe_{3} y un disolvente orgánico adecuado para proporcionar el compuesto objeto.
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Ejemplo 11
El compuesto objeto se preparó como en el ejemplo 10 excepto porque en la primera etapa de preparación del producto intermedio de oxazolidina quiral, se sustituyó cloruro de 3-fenilpropionilo (Aldrich Chemical) por cloruro de n-butanoílo.
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Ejemplo 12
El compuesto objeto se preparó como en el ejemplo 10 excepto porque en la primera etapa de preparación del producto intermedio de oxazolidina quiral, se sustituyó cloruro de n-pentanoilo por cloruro de n-butanoílo.
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Ejemplo 13
El compuesto objeto se preparó como en el ejemplo 10 excepto porque en la primera etapa de preparación del producto intermedio de oxazolidina quiral, se sustituyó cloruro de n-propionilo por cloruro de n-butanoílo.
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Las fórmulas de los compuestos referidos en los ejemplos 14-22 se corresponden con los enumerados en el diagrama A. Además, los siguientes ejemplos se refieren a los compuestos enumerados en el diagrama A, en los que
R_{1} = -(CH_{2})3,5-difluorobencilo, R_{2} = Et, R_{N} = N',N'-dipropilisoftalamida, R_{C} = ácido anti-4-aminometilciclohexanocarboxílico, y el grupo protector es Boc. La identidad del sustituyente R_{2} está determinado por el material de partida (es decir, compuestos de fórmula (XIII)) usados en la síntesis del producto intermedio (VII) tal como se explica en el diagrama B. Después se incorpora el producto intermedio (VII), preparado según el diagrama B, al esquema sintético para la preparación de compuestos de hidroxietileno de fórmula (XII), según se explica en el diagrama A, mediante reacción con el epóxido (VI).
Ejemplo 14 Éster terc-butílico del ácido (L)-[2-(3,5-difluorofenil)-1-(metoximetilcarbamoil)-etil]-carbámico (III)
Se disolvió ácido (L)-2-terc-butoxicarbonilamino-3-(3,5-difluorofenil)-propiónico (Synthetech Inc., II, 2,66 g, 8,83 mmol) en una mezcla de THF anhidro (5 mL) y DMF anhidro (2 mL) a t.a. Se añadió 1,1-carbonildiimidazol (1,71 g, 10,6 mmol) en una porción a esta disolución. Después de cesar el desprendimiento de gas, se añadió una disolución de clorhidrato de N-metil-O-metilhidroxilamina (0,955 g, 9,79 mmol) y diisopropiletilamina (1,6 mL, 9,19 mmol) en DMF (4 mL) a t.a. con una jeringuilla. Ésta se agitó a t.a. durante 17 h, tras lo cual se extinguió la reacción con ácido cítrico al 10%. Se extrajo la mezcla con EtOAc. Se lavó el extracto orgánico (NaHCO_{3} saturado, NaCl saturado), se secó (MgSO_{4}), se filtró, y se concentró a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (elución con EtOAc al 30%/hexanos) para dar como producto un aceite: M+Na+ 367,1.
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Ejemplo 15 Éster terc-butílico del ácido (L)-[1-(3,5-difluorobencil)-2-oxoetil]-carbámico (IV)
Se disolvió éster terc-butílico del ácido (L)-[2-(3,5-difluorofenil)-1-(metoximetilcarbamoil)-etil]-carbámico (III, 2,56 g) en THF anhidro (50 mL) y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió a esta mezcla hidruro de litio y aluminio en polvo (285 mg) en porciones durante 5 min. Se agitó la suspensión resultante a 0ºC durante 1 h. Se extinguió la reacción a 0ºC mediante adición lenta de ácido cítrico saturado hasta que cesó el desprendimiento de gas, seguido de la adición gota a gota de ácido cítrico acuoso al 10% (30 mL). Entonces se dejó calentar esto hasta t.a. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con Et_{2}O. Se lavaron los extractos orgánicos combinados (NaHCO_{3} saturado, NaCl saturado), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, y se concentraron a presión reducida para dar un sólido, que se usó sin purificación adicional.
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Ejemplo 16 Éster terc-butílico del ácido (L)-[1-(3,5-difluorobencil)alil]-carbámico (V)
Se suspendió hidruro de potasio (suspensión al 35% en aceite mineral, 1,76 g) en una mezcla de THF anhidro (20 mL) y DMSO (4 mL), y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió con una jeringuilla 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (4,0 mL), y se agitó la mezcla durante 45 min. a 0ºC. Se añadió bromuro de metiltrifenilfosfonio (5,57 g), y se agitó la suspensión amarilla resultante a 0ºC durante 1 h, tras lo cual se enfrió la mezcla hasta -78ºC. Se añadió con una cánula una disolución de éster terc-butílico del ácido (L)-[1-(3,5-difluorobencil)-2-oxoetil]-carbámico (IV, 2,2 g) en THF (15 mL) a -78ºC. Se agitó la suspensión resultante a -78ºC durante 15 min., después se dejó calentar hasta t.a. durante 16 h. Se añadieron MeOH (2 mL) y disolución semisaturada de bicarbonato de sodio (100 mL), y se extrajo la mezcla con EtOAc (2 X 50 mL). Se lavaron los extractos orgánicos combinados (agua, NaCl saturado), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (Et_{2}O al 10-20%/hexanos) para dar como producto un sólido: M+Na+ 306,1.
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Ejemplo 17 Éster terc-butílico del ácido (1S,2R)-[2-(3,5-difluorofenil)-1-oxiraniletil]-carbámico (VI)
Se disolvió éster terc-butílico del ácido (L)-[1-(3,5-difluorobencil)alil]-carbámico (V, 3,3 g) en CH_{2}Cl_{2} (130 mL) y se añadió ácido m-cloroperbenzoico (50-55% puro, 16,0 g) con agitación a t.a. Tras 23 h, se diluyó la mezcla de reacción con Et_{2}O, se lavó (Na_{2}SO_{3} al_{ }10%, NaHCO_{3} saturado, NaCl saturado), se secó (MgSO_{4}), se filtró, y se concentró a presión reducida para dar un sólido: M+Na+ 322,1.
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Ejemplo 18 Éster terc-butílico del ácido (1S,2S,4R)-[1-(3,5-difluorobencil)-4-((3aS,8aR)-2,2-dimetil-8,8a-dihidro-3aH-indeno [1,2-d]oxazol-3-carbonil)-2-hidroxihexil]-carbámico (VIII)
Se combinaron éster terc-butílico del ácido (1S, 2S)-[2-(3,5-difluorofenil)-1-oxiraniletil]-carbámico (VI, 113 mg) y 1-((3aS,8aR)-2,2-dimetil-8,8a-dihidro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-il)-butan-1-ona (VII, 94 mg) en THF anhidro (3 mL), y se enfriaron hasta -78ºC. Se añadió a esta disolución BuLi (2,5 M en hexanos, 0,32 mL) durante 5 min., tras lo cual se dejó calentar la disolución hasta 0ºC durante 1,5 h. Se repartió la mezcla de reacción entre HCl 0,5 N (4 mL) y EtOAc/hexanos 1:1 (2 X 4 mL). Se secaron (MgSO_{4}) las fases orgánicas combinadas, se filtraron, y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (EtOAc al 20-30%/hexanos) para dar un aceite: MH+559,1.
Ejemplo 19 Éster terc-butílico del ácido [2-(3,5-difluorofenil)-1-(S)-(4-(R)-etil-5-oxo-tetrahidrofuran-2-(S)-il)-etil]-carbámico (IX)
Se disolvió éster terc-butílico del ácido (1S,2S,4R)-[1-(3,5-difluorobencil)-4-((3aS,8aR)-2,2-dimetil-8,8a-dihidro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-carbonil)-2-hidroxihexil]-carbámico (VIII, 60 mg) en tolueno/CH_{2}Cl_{2} 5:1 (3 mL), y se añadió ácido p-toluenosulfónico monohidratado (23 mg). Se agitó esto a t.a. durante 18 h. Después se filtró la mezcla, y se repartió entre NaHCO_{3} semisaturado (3 mL) y EtOAc/hexanos 1:1 (2 X 3 mL). Se secaron las fases orgánicas combinadas (MgSO_{4}), se filtraron, y se concentraron a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo proporcionó el producto deseado como un sólido: MH+370,2.
Ejemplo 20 5S-[1S-Amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-3R-etildihidrofuran-2-ona (X)
Se disolvió éster terc-butílico del ácido [2-(3,5-difluorofenil)-1-(S)-(4-(R)-etil-5-oxo-tetrahidrofuran-2-(S)-il)-etil]-carbámico (IX, 313 mg) en CH_{2}Cl_{2} (1 mL) a t.a., tras lo cual se añadió CF_{3}COOH (1 mL). Se agitó esta disolución a t.a. durante 1 h, después se concentró a presión reducida. Ésta se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Ejemplo 21 N-{2-(3,5-difluorofenil)-(1S,2S,4R)-[1-(4-etil-5-oxotetrahidrofuran-2-il)]etil}-N',N'-dipropilisoftalamida (XI)
Se combinó 5S-[1S-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-3R-etildihidrofuran-2-ona (X, 228 mg teóricos) con trietilamina (0,7 mL) en DMF anhidro (2 mL) a 0ºC. Se añadió ácido N,N-dipropilisoftalámico (242 mg) y se disolvió. Se añadieron 1-hidroxibenzotriazol (224 mg) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (320 mg) uno tras otro. Se agitó la mezcla a 0ºC durante 5 min., después se dejó calentar hasta t.a. durante 4 h. Después, ésta se diluyó con ácido cítrico al 10%, y se extrajo 3X con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos combinados (NaHCO_{3} saturado, NaCl saturado), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron, y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (elución con EtOAc al 40%/hexanos) para dar un sólido: MH+501,3.
Ejemplo 22 Ácido 4-(anti)-{[6-(3,5-difluorofenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoilbenzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxihexanoilami- no]-metil}ciclohexanocarboxílico (XII)
Se suspendió ácido anti-4-aminometilciclohexanocarboxílico (57 mg) en 1,2-dicloroetano (2 mL), y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió trimetilaluminio (2,0 M en tolueno, 0,21 mL), seguido de una disolución de N-{2-(3,5-difluorofenil)-(1S,2S,4R)-[1-(4-etil-5-oxotetrahidrofuran-2-il)]etil}-N',N'-dipropilisoftalamida (XI, 30 mg) en 1,2-dicloroetano (1 mL). Después esto se calentó a reflujo durante 1,5 h, tras lo cual la mezcla de reacción se enfrió hasta 0ºC, y la reacción se extinguió con HCl 3 N (2 mL). Se agitó la suspensión a 0ºC durante 30 min., y luego se extrajo con 3 X 5 mL de iPrOH al 10%/CHCl_{3}. Se secaron (MgSO_{4}) los extractos orgánicos combinados, se filtraron, y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (elución con MeOH al 5-10%/CH_{2}Cl_{2}) para dar un sólido: MH+658,4.
Las fórmulas de los compuestos referidos en los ejemplos 23-24 se corresponden con los enumerados en el diagrama B. Además, los siguientes ejemplos se refieren a los compuestos enumerados en el diagrama B, R_{2} = Et.
Ejemplo 23 N-(1S,2R)-(2-Hidroxi-indan-1-il)-butiramida (XV)
Se disolvió (1S,2R)-cis-1-amino-2-indanol (XIV, 1,5 g) con trietilamina (1,5 mL) en THF anhidro (45 mL), y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió cloruro de butirilo (XIII, 1,05 mL) con una jeringuilla, y se agitó la disolución resultante a 0ºC durante 20 min., tras lo cual, la mezcla de reacción se repartió entre NH_{4}Cl semisaturado (45 mL) y EtOAc (2 X 45 mL). Se secaron (MgSO_{4}) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar un sólido, que se tomó para la reacción siguiente sin purificación adicional.
Ejemplo 24 1-((3aS,8aR)-2,2-Dimetil-8,8a-dihidro-3aH-indeno[1,2-d]oxazol-3-il)-butan-1-ona (VII)
Se combinaron N-(1S,2R)-(2-hidroxiindan-1-il)-butiramida (XV, 2,2 g) y 2-metoxipropeno (5 mL) con CH_{2}Cl_{2} (70 mL) a t.a., y se añadió ácido metanosulfónico (0,05 mL).Después de 20 min. a t.a., se repartió la mezcla de reacción entre NaHCO_{3} semisaturado (30 mL) y CH_{2}Cl_{2} (2 X 30 mL). Se secaron (MgSO_{4}) las fases orgánicas combinadas, se filtraron, y se concentraron a presión reducida para dar como producto un aceite: MH+ 260,1.
Los ejemplos 25-30 enumerados a continuación se refieren a la síntesis de los grupos de ocupación de extremos N-terminal.
Ejemplo 25 Grupos de ocupación de extremos N-terminal hidroxilados y bencilados
En el esquema III a continuación, se ilustra la forma de preparar grupos de ocupación de extremos N-terminal hidroxilados y bencilados a partir de materiales de partida de ácido acético aromáticos. Moersch, GW y Zwiesler, ML. (Synthesis, 1971, 647-648, ref. 1 en el esquema III) demuestran una síntesis útil para preparar un grupo de ocupación de extremos N-terminal de ácido arilalquilhidroxicarboxílico. El procedimiento del presente ejemplo proporciona hidroxilación alfa del ácido 1-naftilacético, usando dietilamina de litio y oxígeno. Hon, Yung-Son, Chang, Rong-Chi, Chau, Tay-Yuan (Heterocycles, 1990, Vol. 31, nº 10, 1745-1750, ref. 2 en el esquema III) demostraron una síntesis del correspondiente éter bencílico a partir del compuesto \alpha-hidroxiaromático mediante esterificación de la función carboxilo y eterificación con bromuro de bencilo. O bien el \alpha-hidroxiácido, o bien el derivado de éter es adecuado como un grupo de ocupación de extremos N-terminal.
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Esquema III
27 
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Ejemplo 26 Preparación de carboxibenzamidas 
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Esquema IV A
28
Se disolvió isoftalato de metilo (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI, (1 equiv., 11,1 mmol) en THF:DMF 50:50 (20 mL) antes de la adición de 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) (1,2 equiv., 13,3 mmol) a temperatura ambiente. Durante la adición de CDI, se observó un desprendimiento de gas (CO_{2}). Después de pararse el desprendimiento de gas (aproximadamente un minuto o menos), se añadió la amina (1,2 equiv., 13,3 mmol). Después de 12 h de agitación a temperatura ambiente, se repartió la reacción entre NH_{4}Cl acuoso saturado y acetato de etilo, y se extrajo la fase acuosa dos veces más con acetato de etilo. Después se lavaron los extractos orgánicos con disoluciones acuosas saturadas NaHCO_{3} y NaCl, y se secaron sobre MgSO_{4} o NaSO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio el sólido blanco o aceite transparente bruto. La purificación de estos compuestos, si fuera necesaria, se consiguió mediante cromatografía de gel de sílice con acetato de etilo al 30-40% en hexanos.
Se trató la monoalquil o dialquil amida de isoftalato de metilo con LiOH\cdotH_{2}O (3 equiv., 33,3 mmol) en una cantidad mínima de THF:MeOH:H_{2}O 1:2:1 y se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12 h, se eliminaron los disolventes a vacío y posteriormente se repartieron entre H_{2}O y acetato de etilo. Si las emulsiones impiden la separación de las dos fases, se añadió una cantidad pequeña de salmuera para ayudar a la separación. Se extrajo la fase acuosa una vez más con acetato de etilo (para eliminar cualquier material de partida sin reaccionar). Se acidificó entonces la fase acuosa con HCl concentrado hasta pH \leq 3. Después se extrajo la disolución acuosa ácida blanca turbia, tres veces con acetato de etilo. Se secaron estos extractos orgánicos combinados sobre MgSO_{4} o NaSO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio un sólido. Se usó bruto el isoftalato de mono o dialquilamida en la siguiente reacción.
Ejemplo 27 Preparación de carboxibenzamidas
Esquema IV B
29
Se disolvió isoftalato de metilo (1 equiv., 11,1 mmol) en THF:DMF 50:50 (20 mL) antes de la adición de 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) (1,2 equiv., 13,3 mmol) a temperatura ambiente. Durante la adición de CDI, se observó desprendimiento de gas (CO_{2}). Después de pararse el desprendimiento de gas, (aproximadamente un minuto o menos), se disolvió la amina (1,2 equiv., 13,3 mmol) en DMF y se añadió diisopropiletilamina (1,2 equiv., 13,3 mmol). Después de 12 h de agitación a temperatura ambiente, se repartió la reacción entre NH_{4}Cl acuoso saturado y acetato de etilo, y se extrajo la fase acuosa dos veces más con acetato de etilo. Después se lavaron los extractos orgánicos con disoluciones acuosas saturadas de NaHCO_{3} y NaCl, y se secaron sobre MgSO_{4} o NaSO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio un sólido o aceite. La purificación de estos compuestos, si fuera necesaria, se consiguió mediante cromatografía sobre gel de sílice con acetato de etilo al 30-40% en hexanos.
Después se trató la monoalquil o dialquilamida de isoftalato de metilo (1 equiv., 11,1 mmol) con LiOH\cdotH_{2}O (3 equiv., 33,3 mmol) en una cantidad mínima de THF:MeOH:H_{2}O 1:2:1 y se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12 h, se eliminaron los disolventes a vacío y posteriormente se repartieron entre H_{2}O y acetato de etilo. Si las emulsiones impiden la separación de las dos capas, se añadió una pequeña cantidad de salmuera para ayudar a la separación. Se extrajo la fase acuosa una vez más con acetato de etilo (para eliminar el material de partida sin reaccionar). Se acidificó la fase acuosa con HCl concentrado hasta pH \leq 3. Después se extrajo la disolución acuosa ácida blanca turbia así obtenida tres veces con acetato de etilo. Se secaron estos extractos orgánicos combinados sobre MgSO_{4} o Na_{2}SO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio un sólido. El isoftalato de mono o dialquilamida se usó bruto en la siguiente reacción.
Ejemplo 28 Preparación de amida primaria
Esquema IV C
30
Se disolvió isoftalato de metilo (1 equiv., 11,1 mmol) en THF:DMF 50:50 (20 mL) antes de la adición de 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) (1,2 equiv., 13,3 mmol) a temperatura ambiente. Con la adición de CDI, se observó un desprendimiento de gas (CO_{2}). Después de cinco minutos, se burbujeó amoniaco gas en la disolución a través de una aguja de una jeringuilla durante 1 h. Ya que se calentó la reacción debido a una exoterma, se enfrió la reacción hasta 0ºC en la duración de una hora. Después se dejó agitar la reacción bajo un globo de amoniaco durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12 h, se repartió la reacción entre NH_{4}Cl acuoso saturado y acetato de etilo, y se extrajo la fase acuosa dos veces más con acetato de etilo. Después se lavaron los extractos orgánicos con disoluciones acuosas saturaras de NaHCO_{3} y NaCl, y se secaron sobre MgSO_{4} o NaSO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio un sólido o aceite. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice con isopropanol al 5% en cloroformo dio la amida primaria deseada.
Luego se trató la amida primaria de isoftalato de metilo (7,26 mmol) con LiOH\cdotH_{2}O (3 equiv., 21,8 mmol) en una cantidad mínima de THF:MeOH:H_{2}O 1:2:1 y se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12 h, se eliminaron los disolventes a vacío y posteriormente se repartieron entre H_{2}O y acetato de etilo. Se extrajo la fase acuosa una vez más con acetato de etilo (para eliminar cualquier material de partida sin reaccionar). Después se acidificó la fase acuosa con HCl concentrado hasta pH \leq 3. Después se extrajo la disolución acuosa ácida blanca turbia así obtenida, tres veces con acetato de etilo. Se secaron estos extractos orgánicos combinados sobre MgSO_{4} o NaSO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio un sólido. Se usó bruto el isoftalato de mono o dialquilamida en la siguiente reacción.
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Ejemplo 29 Preparación de amidas heterocíclicas 
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Esquema IV D
31 
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Se disolvió isoftalato de metilo (1,2 equiv., 2,78 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro y tres gotas de DMF (catalítico). Se enfrió la disolución hasta 0ºC antes de la adición gota a gota de cloruro de oxalilo (2 equiv., 4,63 mmol). Se agitó la mezcla a 0ºC durante 1 h. La mezcla nunca se disolvió. Después de 1 h, se eliminaron los disolventes a vacío. Se dejó el cloruro de ácido a vacío durante la noche.
Se disolvió el cloruro de ácido bruto (1 equiv., 2,78 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro y se enfrió hasta 0ºC antes de la adición de NEt_{3} (5 equiv., 11,6 mmol) y N-metilpiperidina (6 equiv., 13,9 mmol). Se agitó la reacción a 0ºC durante 2 h antes de eliminar los disolventes a vacío. Se diluyó el residuo con H_{2}O y acetato de etilo y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa dos veces más con acetato de etilo, y se lavaron los extractos orgánicos combinados con NaHCO_{3} acuoso saturado, y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. La filtración del agente desecante y la eliminación de disolventes a vacío dio el producto bruto.
Después se trató la amida bruta (1 equiv., 2,19 mmol) con LiOH\cdotH_{2}O (1 equiv., 2,19 mmol) en una cantidad mínima de THF:MeOH:H_{2}O 1:2:1 y se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente. Después de 12 h, se eliminaron los disolventes a vacío y posteriormente se repartieron entre H_{2}O y acetato de etilo. Se extrajo la fase acuosa una vez más con acetato de etilo (para eliminar cualquier material de partida sin reaccionar). La eliminación de H_{2}O de la fase acuosa a vacío dio un sólido.
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Ejemplo 30 Preparación de \alpha-hidroxiácidos aromáticos (ilustrado mediante la preparación con ácido \alpha-hidroxi-\alpha-(2-bifenil)acético 
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Esquema V
32
Se colocó una disolución de CH_{2}Cl_{2} (25 mL) y cloruro de oxalilo (2 mL, 21,16 mmol) en un matraz de fondo redondo de 100 mL mantenido bajo nitrógeno. Se agitó la disolución de cloruro de oxalilo a de -50 a -60ºC. Se disolvió Me_{2}SO (2,5 mL, 35,82 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (5 mL). Se añadió el Me_{2}SO gota a gota a la disolución de cloruro de oxalilo agitada a de -50 a -60ºC. Se agitó la mezcla de reacción durante 2 min. y se añadió el alcohol 2-fenilbencílico (16,28 mmol en 10 mL de CH_{2}Cl_{2}) en un plazo de 5 min.; se continuó la agitación durante 60 min. adicionales. Se añadió TEA (11,30 mL, 81,4 mmol) y se agitó la mezcla de reacción durante 60 min. y después se dejó calentar a temperatura ambiente. Después se añadió agua (60 mL) y se volvió a extraer la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} adicional (60 mL). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con disolución saturada de NaCl (120 mL), y se secaron sobre MgSO_{4} anhidro. Se concentró la disolución filtrada en un evaporador rotatorio hasta sequedad. Se realizó la cromatografía sobre gel de sílice del aceite (hexanos:EtOAc 98:2) para dar 1.
Se agitó durante 20 minutos a 50ºC una mezcla de 5,46 mmol de aldehído aromático (1) en 10 mL de CHCl_{3} y \beta-ciclodextrinas (CD) (0,11 mmol) y cloruro de trietilbencilamonio (TEBA) (0,273 mmol) en un matraz equipado con un agitador magnético y un embudo de goteo. Después se añadió al matraz, gota a gota, con agitación, 10 g de hidróxido de sodio disueltos en 10 mL de agua. Tras la finalización de esta adición, se continuó la reacción durante 8 h con la temperatura mantenida a 50º C. Después se añadió suficiente agua destilada para disolver el precipitado formado durante la reacción, y la disolución resultante se lavó a fondo con éter, se ajustó a pH 3 con ácido clorhídrico diluido y se extrajo con 3 x 30 mL de éter. Se secó el extracto con sulfato de sodio anhidro, luego se evaporó hasta sequedad y el precipitado que quedaba se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice usando DCM:MeOH:AcOH (95:5:1) para dar 2.
Los ejemplos 31 y 32 enumerados a continuación se refieren a la síntesis para grupos de ocupación de extremos N-terminal.
Ejemplo 31 Ciclohexildicarboxilato de 1-amino-3,5-cis,cis-dimetilo
Se añadió 5 g de rodio al 5% en alúmina a 10 g (47,85 mmol) de 5-isoftalato de dimetilo en 25 mL de ácido acético y 50 ml de metanol en una botella de alta presión, que se saturó con nitrógeno a 380 kPa y se agitó durante una semana de tiempo.
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Esquema VI A
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33 
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Después se filtró la mezcla a través de una capa gruesa de torta de celite y se enjuagó tres veces con metanol, se concentraron los disolventes y se trituró el sólido bruto con éter dietílico y se filtró de nuevo, lo que proporcionó ciclohexildicarboxilato de 1-amino-3,5-cis,cis-dimetilo, HPLC en fase inversa ha mostrado una pureza del
94,4%.
Ejemplo 32 1-Amino-3,5-cis,cis-dimetoxiciclohexano
Se hicieron reaccionar 10 g (65,36 mmol) de 3,5-dimetoxianilina según se describió en el procedimiento anterior, y se proporcionó 1-amino-3,5-cis,cis-dimetoxiciclohexano.
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Esquema VI B
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34 
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Siguiendo el procedimiento general tal como se explicó en los ejemplos 14-22, y haciendo variaciones no críticas, se obtienen las siguientes aminas sustituidas de fórmula (XII). Estas aminas sustituidas de fórmula (XII) se recogen como ejemplos en las tablas 2, 3 y 4.
35
36
37
38
39
40
41
42
43
Ejemplo 69 (1S)-2-(3,5-difluorofenil)-1-[(2R)-oxiranil]etilcarbamato de bencilo (VI)
Siguiendo el procedimiento general del ejemplo 17 y haciendo variaciones que no son críticas pero partiendo del alcohol (IV) (1S,2R)-3-cloro-1-(3,5-difluorobencil)-2-hidroxipropilcarbamato de bencilo, se obtiene el compuesto del título.
Ejemplo 70 Ensayo de inhibición enzimática
Se analizaron los compuestos de la invención para determinar la actividad inhibidora mediante el uso del ensayo MBP-C125. Este ensayo determina la inhibición relativa de la escisión por \beta-secretasa de un sustrato de APP modelo, MPB-C125SW, mediante los compuestos sometidos a ensayo en comparación con un control no tratado. Puede encontrarse una descripción detallada de los parámetros del ensayo, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.942.400. Brevemente, el sustrato es un péptido de fusión formado de una proteína de unión a maltosa (MBP) y los 125 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal de APP-SW, la mutación sueca. Se preparó \beta-secretasa de cerebro humano a partir de tejido cerebral humano concentrado, purificado parcialmente según se describe en Sindha y cols., 1999, Nature 402: 537-554 y se mantuvo en Triton al 0,20%. Alternativamente, se preparó la enzima de longitud completa recombinante (aminoácidos 1-501) a partir de células 293 que expresan la enzima transgénica.
Se obtuvieron los datos de inhibición a partir de un ensayo ELISA que usa un anticuerpo de captura anti-MBP depositado sobre placas de alta unión de 96 pocillos recubiertos previamente y bloqueados, seguido por incubación con sobrenadante de la reacción enzimática diluido, incubación con el anticuerpo indicador biotinilado específico anti-SW192, e incubación con estreptavidina/fosfatasa alcalina. La escisión de la proteína de fusión MBP-C125SW intacta da como resultado la generación de un fragmento amino-terminal truncado, con el nuevo epítopo positivo para el anticuerpo SW-192 expuesto en el extremo carboxilo-terminal. Se efectuó la detección mediante una señal fluorescente del sustrato con la escisión por la fosfatasa. El ensayo ELISA sólo detectó la escisión tras Leu 596 en el sitio de mutación APP-SW 751 del sustrato.
Los compuestos se diluyeron en una serie de dilución 1:1 para dar una curva de concentración de seis puntos (dos pocillos por concentración) que tomó una fila de una placa de 96 pocillos por compuesto sometido a prueba.
Procedimiento
Se pesó cada uno de los compuestos de prueba en un vial y se añadió DMSO hasta preparar una disolución 10 mM. Para obtener una concentración final de compuesto de 200 \muM en el punto más alto de una curva de dilución de 6 puntos, se añadieron 100 \muL de la disolución 10 mM a un pocillo C1 de una placa de fondo en V de 96 pocillos. Se añadieron cincuenta \muL de DMSO a los pocillos impares de la fila C a lo largo de la placa y se prepararon diluciones en serie 1:1. Se añadieron 10 \muL de cada dilución a cada uno de dos pocillos en la fila C de una placa de fondo en V correspondiente a la que se añadieron previamente 190 \muL de NaOAc 52 mM/DMSO al 7,9%, pH 4,5. La placa con compuesto diluido en NaOAc se centrifugó hasta obtener un sedimento precipitante y se transfirieron 20 \muL/pocillo a una placa de fondo plano correspondiente a la que se añadieron 30 \muL de mezcla de enzima-sustrato enfriada en hielo (2,5 \muL de sustrato MBP-C125SW, 0,03 \muL de enzima y 24,5 de TX100 al 0,09% enfriado en hielo por 30 \muL). Por tanto, la concentración de compuesto en la reacción enzimática final fue 50 veces inferior a la concentración de partida. La mezcla de reacción final de compuesto 200 \muM para el punto más alto de la curva era en DMSO al 5%, NaAc 20 mM, TX100 al 0,06%, a pH 4,5. Se inició La reacción enzimática calentando las placas hasta 37ºC. Tras 90 minutos a 37ºC, se añadieron 200 \muL/pocillo de diluyente de muestra frío para detener la reacción y se transfirieron 20 \muL/pocillo a una placa de ELISA recubierta con anticuerpo anti-MBP correspondiente para captura, que contenía 80 \muL/pocillo de diluyente de muestra. Esta reacción se incubó durante la noche a 4ºC y el ensayo ELISA se reveló al día siguiente tras incubación de 2 h. con anticuerpo anti-192SW, seguido por conjugado de estreptavidina-FA y sustrato fluorescente. Se leyó la señal en un lector de placas fluorescentes.
Resultados
Se determinó la potencia relativa de la inhibición del compuesto calculando la concentración del compuesto que mostraba una reducción del cincuenta por ciento en la señal detectada (CI_{50}) comparado con la señal de la reacción enzimática en los pocillos de control sin compuesto añadido.
Con el fin de agrupar las actividades inhibidoras de los compuestos de la presente invención descritos en las tablas de datos de esta memoria descriptiva, las actividades inhibidoras se han clasificado según sus concentraciones CI_{50}, según el siguiente orden:
Grupo I: compuestos que tienen una CI_{50} inferior a 10 \muM;
Grupo II: compuestos que tienen una CI_{50} de desde 10 \muM hasta e incluyendo 100 \muM;
Grupo III: compuestos que tienen una CI_{50} de desde 100 \muM hasta e incluyendo 200 \muM;
Grupo IV: compuestos que tienen una CI_{50} superior a 200 \muM.
Ejemplo 71 Ensayo de inhibición sin células usando APP-KK
Se usó el sustrato de APP sintético, Biotin-KVEANY-EVEGERC(Oregon green)KK, que tiene biotina en el extremo N-terminal y se hizo fluorescente mediante la unión covalente de Oregon green en el residuo de Cys. Se usa la biotina en el extremo N-terminal para anclar el péptido a una placa de ensayo de sustrato. Se realizó la incubación en las siguientes condiciones: substrato de APP 10 \muM; enzima 50 nM (hAsp2a), pH 4,5, 37ºC, durante 2 horas. Se detectó la actividad de la enzima \beta-secretasa como la pérdida del fluoróforo Oregon green, en el lado opuesto al sitio de escisión desde que se libera el anclaje de biotina con la escisión del sustrato.
La incubación en presencia o ausencia del compuesto inhibidor demuestra la inhibición específica de la escisión enzimática por \beta-secretasa de su sustrato de APP.
Ejemplo 72 Inhibición de \beta-secretasa: ensayo P26-P4'SW
El sustrato P26-P4'sw es un péptido de la secuencia: (biotina)CGGADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNLDAEF (ID SEC Nº:1).
El patrón P26-P1 tiene la secuencia: (biotina)CGGADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNL (ID SEC Nº: 2).
Se prepararon los péptidos por Anaspec, Inc. (San José, CA) usando síntesis en fase sólida de boc-aminoácidos. Se acopló la biotina al sulfhidrilo de la cisteína terminal por Anaspec, Inc. tras la síntesis del péptido, usando EZ-link Iodoacetil-LC-Biotin (Pierce). Se almacenaron los péptidos como disoluciones madre 0,8-1,0 mM en Tris 5 mM, con el pH ajustado a aproximadamente neutro (pH 6,5-7,5) con hidróxido de sodio.
Para el ensayo enzimático, la concentración de sustrato puede variar desde 0 - 200 \muM. Específicamente para someter a prueba los compuestos para determinar la actividad inhibidora, la concentración de sustrato puede ser de 1,0 \muM. Se añaden los compuestos que van a someterse a prueba en DMSO, con una concentración final de DMSO del 5%; en tales experimentos, los controles también recibieron DMSO al 5%. La concentración de enzima se varía, para dar concentraciones de producto en el intervalo lineal del ensayo ELISA (125 - 2000 pM, tras la
dilución).
Estos componentes se incuban en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, Triton X-100 al 0,06%, a 37 grados C durante de 1 a 3 horas. Se diluyen las muestras 5 veces con diluyente de muestra (por ejemplo, cloruro de sodio 145,4 mM, fosfato de sodio 9,51 mM, azida de sodio 7,7 mM, Triton X-405 al 0,05%, albúmina de suero bovino 6 gm/litro, pH 7,4) para extinguir la reacción, luego se diluyen adicionalmente para el ensayo ELISA, según sea necesario.
Para el ensayo ELISA, se recubren placas de ensayo de 96 pocillos de alta unión Costar (Corning, Inc., Corning, NY) con anticuerpo monoclonal SW 192 del clon 16A7, o un clon de afinidad similar. Se diluyen los patrones P26-P1 con diluyente de muestra hasta una concentración final de 0 a 2 nM. Se incuban las muestras y los patrones diluidos (100 \muL) en las placas con SW192 a 4 grados C durante 24 horas. Se lavan las placas 4 veces con tampón TTBS (cloruro de sodio 150 mM, Tris 25 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 7,5), luego se incuban con 0,1 mL/pocillo de estreptavidina-fosfato alcalino (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) diluido 1:3000 in con diluyente de muestra. Tras incubar durante una hora a temperatura ambiente, se lava la placa 4 veces con TTBS, y se incuba con disolución A de sustrato fluorescente (31,2 gm/litro de 2-amino-2-metil-1-propanol, 30 mg/litro, ajustado hasta pH 9,5 con HCl). Se leen los valores de fluorescencia tras 30 minutos.
Los compuestos que son inhibidores eficaces de la actividad \beta-secretasa demuestran una escisión reducida en comparación con un control.
Ejemplo 36 Ensayos que utilizan sustratos de oligopéptidos sintéticos
Se preparan oligopéptidos sintéticos que incorporan el sitio de escisión conocido de \beta-secretasa, y opcionalmente colas detectables, tales como restos fluorescentes o cromogénicos. Ejemplos de tales péptidos, así como sus métodos de producción y detección se describen en la patente admitida de los EE.UU. número: 5.942.400, incorporada al presente documento como referencia. Los productos de escisión pueden detectarse usando cromatografía líquida de alta resolución, o métodos de detección fluorescente o cromogénica apropiados para el péptido que vaya a detectarse, según métodos bien conocidos en la técnica.
A modo de ejemplo, un péptido de este tipo tiene la secuencia SEVNL DAEF (ID SEC Nº: 3), y el sitio de escisión está entre los residuos 5 y 6. Otro sustrato preferido tiene la secuencia ADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNLDAE F (ID SEC Nº: 4), y el sitio de escisión está entre los residuos 26 y 27.
Estos sustratos de APP sintéticos se incuban en presencia de \beta-secretasa en condiciones suficientes para dar como resultado la escisión mediada por \beta-secretasa del sustrato. La comparación de los resultados de la escisión en presencia de los resultados del compuesto inhibidor con respecto a un control proporciona una medida de la actividad inhibidora del compuesto.
Ejemplo 73 Inhibición de la actividad \beta-secretasa - ensayo celular
Un ensayo a modo de ejemplo para el análisis de la inhibición de la actividad \beta-secretasa utiliza la línea celular de riñón embrionario humano HEKp293 (nº de registro ATCC CRL-1573) transfectada de manera estable con APP751 que contiene la doble mutación que se produce de manera natural Lys651Met52 a Asn651Leu652 (numerado para APP751), denominada comúnmente la mutación sueca y demuestra que sobreproduce A\beta (Citron y cols., 1992, Nature 360:672-674). Se cultivaron en placas de 96 pocillos las células y en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma D-6546) que contenía suero bovino fetal al 10%. Tras establecerse las células (1 día tras el cultivo en placa), se incubaron las células en presencia/ausencia del compuesto inhibidor (diluido en DMSO) a la concentración deseada, generalmente desde 0,25 hasta 5,0 \mug/mL, y con una concentración final de DMSO que oscila entre el 0,1 y el 0,5%. Tras incubación a 37º C durante dos horas, se aspira el medio de las células y se sustituye por compuesto nuevo durante una incubación de 2 horas adicionales. Al final del periodo de tratamiento, se centrifuga cada placa de células a 1100 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se analiza el medio condicionado para determinar la actividad \beta-secretasa mediante el análisis de la liberación del fragmento peptídico A\beta en el medio de cultivo mediante inmunoensayo. Usando anticuerpos específicos para detectar el producto de escisión, por ejemplo, A\beta, se mide la actividad enzimática \beta-secretasa en presencia y ausencia de los compuestos inhibidores para demostrar la inhibición específica de la escisión mediada por \beta-secretasa del sustrato de APP.
Ejemplo 74 Inhibición de la actividad \beta-secretasa en células neuronales primarias y tejido cerebral fetal humano
Se somete a ensayo la inhibición de la actividad \beta-secretasa en células neuronales primarias en ratones y tejido cerebral fetal en seres humanos, tal como sigue.
Preparación de medios
Se complementa medio neuronal de ratón sin KCl con lo siguiente: 25 mL de suero bovino fetal (FBS, Sigma F-2422 o JRH Biosciences, 12103-78P), inactivado por calor durante 1 hora a 56ºC; y 25 mL de complemento de Chang (Irvine Scientific C104). Las concentraciones finales en 500 mL de medio neuronal de ratón sin KCl son de FBS al 5%, complemento de Chang al 5%.
Se complementa el medio neuronal humano sin KCl con lo siguiente: 10 mL de disolución madre B27 50x (Gibco 17504-036). La concentración final en 500 mL de medio neuronal humano sin KCl es de 1x B27.
Preparación de placas de cultivo celular
Se diluye 1:10 una disolución de polietilenimina (PEI) (al 50% p/v, obtenida de Sigma, P-3143) con agua con calidad para cultivo tisular para dar una disolución diluida al 5% (p/v). La disolución diluida de PEI se esteriliza entonces por filtración, usando un filtro de 0,45 \mum. La PEI esterilizada por filtración se diluye adicionalmente 1:100 con tampón borato de sodio (150 mM, pH 8,5, estéril) para obtener una disolución de trabajo al 0,05% (p/v).
Se preparan placas de cultivo celular (de fondo plano de 24 pocillos, Coming 25820, o de fondo plano de 6 pocillos, Corning 25810) para el cultivo tal como sigue. Se añade la disolución de trabajo de PEI en una cantidad de 300 \muL/pocillo en placas de 24 pocillos, o 1,5 mL/pocillo en placas de 6 pocillos para recubrir a aproximadamente 80 \mug/cm^{2}. Se incuban las placas recubiertas durante la noche a temperatura ambiente. Luego, se aspiran las placas y se lavan dos veces con 500 \muL/pocillo (para placas de 24 pocillos) o 2,5 \muL/pocillo (para placas de 6 pocillos) de PBS (1X solución salina tamponada con fosfato, pH 7,5, estéril). Entonces se aspiran las placas y se incuban con medio neuronal sin KCl más PBS al 10% (500 \muL/pocillo, 24 pocillos; o 2,5 mL/pocillo, 6-pocillos) a 37ºC durante al menos una hora. Tras la incubación, las placas pueden usarse inmediatamente, almacenarse en condiciones estériles a 37ºC durante hasta una semana (el medio debe desecharse antes de la siembra).
Preparación de cultivos corticales de ratón PDAPP
Se aparean ratones hembra Swiss Webster, de tipo natural con ratones macho PDAPP homocigóticos. De dieciséis a diecisiete días después del apareamiento, se sacrifican las hembras preñadas mediante asfixia con dióxido de carbono. En condiciones estériles, se extraen los fetos y se decapitan. Se extraen los cerebros y se diseccionan las cortezas cerebrales del resto del tejido cerebral usando un microscopio de disección. Se transfieren los tejidos corticales a una placa de cultivo tisular de 35 mm (Coming 25000) que contiene solución salina tamponada de Hank enfriada en hielo (HBSS, Sigma H9269).
Se reúnen los tejidos corticales de diez cerebros de ratón transfiriéndolos a un tubo cónico de polipropileno de 50 mL (Falcon 2070), y se lavan dos veces con 25 mL de HBSS frío. Se resuspenden los tejidos en 5 mL de CMF-HBSS frío (HBSS sin calcio ni magnesio, Sigma H-9394) más 0,5 mL de disolución madre de ADNasa (Sigma D-4527, 1 mg/mL en CMF-HBSS) para producir una concentración final de ADNasa de aproximadamente 100 \mug/mL. Se tritura el tejido con una pipeta de 5 mL hasta que la suspensión se vuelve homogénea (aproximadamente 20-30 veces). Se centrifuga la suspensión celular en una centrífuga clínica durante tres minutos a aproximadamente 600 x g. Se resuspende el sedimento celular en 2,5 mL de tripsina-EDTA (1X tripsina-EDTA, Sigma T-3924), y se incuba a 37ºC durante cinco minutos.
Se añade medio neuronal más FBS al 10% (Sigma F-2422 o JRH Biosciences 12103-78P) en una cantidad de 10 mL a 1 mL de disolución madre de ADNasa. Se mezcla suavemente la disolución y se incuba a temperatura ambiente durante tres minutos. Se filtra la suspensión celular mediante su paso a través de un tamiz de nylon estéril (100 \mum de tamaño de poro, Falcon 2360). Se centrifuga el filtrado en una centrífuga clínica durante tres minutos a aproximadamente 600 x g.
Se recubre el sedimento celular y se resuspende en 5 mL de medio de ratón completo, preparado según se describió anteriormente. Se cuentan las células con un hemocitómetro mezclando 50 \muL de suspensión celular con 450 \muL de disolución de azul trípano (al 0,4%, Sigma T-8154). Se diluyen las células hasta 1,2 x 10^{6} células/mL con medio de ratón. Entonces se cultivan en placas las células con 0,5 mL/pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas con PEI, preparadas según se describió anteriormente. Se alimentan los cultivos dos veces a la semana para el intercambio completo de los medios.
Preparación de cultivos corticales fetales humanos
Se obtiene tejido cerebral fetal humano de Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA). Se usa el tejido cerebral fetal inmediatamente tras su recogida, y se realiza el trabajo en una campana de clase II. Se procesa el tejido identificando la corteza cerebral y eliminando todas las trazas de las meninges con pinzas estériles.
Se reúnen los tejidos corticales transfiriéndolos a un tubo cónico de 50 mL. Entonces se lavan dos veces los tejidos corticales reunidos con 25 mL de HBSS frío. Luego, se resuspenden los tejidos en 10 mL de CMF-HBSS frío (Sigma H-9394) más 1 mL de disolución madre de ADNasa (Sigma D-4527) para producir aproximadamente una concentración final de ADNasa de 100 \mug/mL. Se tritura el tejido con una pipeta de 10 mL hasta que la suspensión se vuelve homogénea (aproximadamente 20-30 veces). Se centrifuga la suspensión celular en una centrífuga clínica durante tres minutos a aproximadamente 600 x g. Se resuspende en sedimento celular en 10 mL de tripsina-EDTA (1X tripsina-EDTA, Sigma T-3924), y se incuba a 37ºC durante cinco minutos. Se añade medio neuronal más FBS al 10% en una cantidad de 10 mL a 1 mL de disolución madre de ADNasa. Se mezcla suavemente la disolución y se incuba a temperatura ambiente durante tres minutos.
Entonces, se filtra la suspensión celular mediante su paso a través de un tamiz de nylon estéril (según se describió anteriormente). Luego, se centrifuga el filtrado como anteriormente. Se resuspende el sedimento celular en 5 mL de medio humano (preparado según se describió anteriormente). Se cuentan las células con un hemocitómetro mezclando 50 \muL de suspensión celular con 450 \muL de disolución de azul trípano. Se diluyen las células hasta 1,2 x 10^{6} células/mL con medio completo (preparado según se describió anteriormente). Entonces se cultiva en placas la suspensión celular con 2 mL/pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con PEI, preparadas según se describió anterior-
mente.
No se perturban las células durante la primera semana. Tras ese tiempo, se alimentan los cultivos dos veces a la semana mediante intercambio completo de los medios.
Ensayos de A\beta de cultivo neuronal
Se incuban cultivos maduros con 300 \muL/pocillo (ratón) o 750 \muL/pocillo (ser humano) de medio nuevo durante 24 horas para generar valores iniciales de A\beta. Se recogen y almacenan a -20ºC los medios condicionados hasta que se someten a ensayo.
Entonces, se tratan los cultivos con 300 \muL/pocillo (ratón) o 750 \muL/pocillo (ser humano) de medio nuevo que contiene el compuesto en el intervalo deseado de concentraciones durante 24 horas. Se recogen y almacenan a -20ºC los medios condicionados hasta que se someten a ensayo.
Para las mediciones de A\beta total y las mediciones de A\beta_{1-42}, se analizan 100 \muL/pocillo mediante ensayo ELISA. Se determina la inhibición de la producción tanto para A\beta total como para A\beta_{1-42} mediante la diferencia entre los valores de A\beta para los periodos inicial y de tratamiento con compuesto. Se representan las curvas de dosis-respuesta como la inhibición en porcentaje frente a la concentración de compuesto.
Al final de este periodo de tratamiento, se somete a prueba la viabilidad celular mediante el ensayo de citotoxicidad MTT. Tras eliminarse el medio condicionado de las placas con células para la medición de A\beta mediante ensayo ELIA, se añaden 25 \muL de disolución madre de MTT (Sigma M-5655 a 5 mg/mL en 1x PBS, se toma una alícuota y se almacena -20ºC) a todos los pocillos. Se incuban las placas con células a 37ºC en una incubadora de CO_{2} durante 1 hora. Se añade tampón de lisis MTT en una cantidad de 125 \muL a cada pocillo, y se sitúan las placas en un agitador de placas de titulación en una posición baja durante la noche. Se leen las placas en un lector de microplacas a 562-650 nm. Se calcula la viabilidad celular mediante el porcentaje de densidad óptica (DO) de las células de control.
Ejemplo 75 Inhibición de \beta-secretasa en modelos de animales de EA
Pueden usarse varios modelos de animales para detectar la inhibición de la actividad \beta-secretasa. Ejemplos de modelos de animales útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, ratón, cobaya, y similares. Los animales usados pueden ser modelos de tipo natural, transgénicos o deficientes ("knockout"). Se describen ejemplos de modelos de mamíferos no humanos transgénicos en las patentes de los EE.UU. números 5.912.410 y 5.811.633. Además, los modelos de mamíferos pueden expresar mutaciones en APP, tales como APP695-SW y similares descritas en el presente documento.
Se administra a los animales una cantidad del compuesto inhibidor formulado apropiadamente en PBS. Los animales de control no se tratan o se tratan con un compuesto inactivo. Se repite la administración diaria durante un periodo de días. Empezando en el día 0, se obtiene tejido o líquido cerebral de animales seleccionados y se analiza para determinar la presencia de péptidos de escisión de APP, incluyendo A\beta, usando los anticuerpos específicos frente a A\beta. Al final del periodo de prueba, se sacrifican los animales y se analiza el tejido o líquido cerebral para determinar la presencia de placas de beta-amiloide y/o A\beta. También se analiza el tejido para determinar necrosis.
Se espera que los animales a los que se les administran los compuestos inhibidores demuestren una reducción de A\beta en los tejidos y líquidos cerebrales y una reducción de las placas de beta-amiloide en el tejido cerebral, en comparación con los controles no tratados.
Ejemplo 76 Inhibición de la producción de A\beta en pacientes humanos
Los pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer (EA) demuestran un aumento de la cantidad de A\beta en el cerebro. A los pacientes con EA se les administra una cantidad del compuesto inhibidor diluido en PBS. Se repite diariamente la administración en la duración del periodo de prueba. Comenzando en el día 0, se realizan pruebas cognitivas y de memoria una vez a la semana.
Se espera que los pacientes a los que se les administran los compuestos inhibidores demuestren puntuaciones cognitivas y de memoria que se ralentizan y/o estabilizan en comparación con los pacientes no tratados.
Ejemplo 77 Prevención de la producción de A\beta en pacientes en riesgo de desarrollar EA
Se identifican los pacientes predispuestos o en riesgo de desarrollar EA mediante el reconocimiento de un patrón de herencia familiar, por ejemplo, la presencia de la mutación sueca, y/o monitorizando parámetros de diagnóstico. A los pacientes identificados como predispuestos o en riesgo de desarrollar EA se les administra una cantidad del compuesto inhibidor diluido en PBS. Se repite diariamente la administración en la duración del periodo de prueba. Comenzando en el día 0, se realizan pruebas cognitivas y de memoria una vez al mes.
Se espera que los pacientes a los que se les administran los compuestos inhibidores demuestren puntuaciones cognitivas y de memoria que permanecen estables en comparación con los pacientes no tratados.
Esta invención se ha descrito con respecto a diversos ejemplos y realizaciones específicos.

Claims (5)

1. Compuesto de fórmula
44
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en el que R_{1} es:
(I) alquilo C_{1}-C_{6}, sustituido o no sustituido con uno, dos o tres alquilo C_{1}-C_{3}, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH_{2}, -C\equivN, -CF_{3}, o -N_{3},
(II) -(CH_{2})_{1-2}-S-CH_{3},
(III) -CH_{2}-CH_{2}-S-CH_{3},
(IV) -CH_{2}-(alquenilo C_{2}-C_{6}) sustituido o no sustituido por un -F,
(V) -(CH_{2})_{0-3}-(R_{1-arilo}) en el que R_{1-arilo} es fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, indanilo, indenilo, dihidronaftilo, tetralinilo no sustituido o sustituido independientemente en el anillo de arilo con uno o dos de alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
R_{2} es:
(I) -H,
(II) alquilo C_{1}-C_{6}, o
(III) -(CH_{2})_{0-4}-R_{2-1} en el que R_{2-1} es cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), R_{1-arilo} en el que R_{1-arilo} es según se definió anteriormente;
R_{N-1} es fenilo que está sustituido independientemente con uno, dos, tres o cuatro de R_{100} en el que R_{100} es
(1)
alquilo C_{1}-C_{6},
(2)
-F, -Cl, -Br, o -I,
(3)
-OH,
(4)
-NO_{2},
(5)
-CO-OH,
(6)
-C\equivN,
(7)
-CO-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} son iguales o diferentes y son:
(a)
-H,
(b)
-alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con un -OH o -NH_{2},
(c)
-alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con de uno a tres -F, -Cl, -Br, o -I,
(d)
-cicloalquilo C_{3}-C_{7},
(e)
-(alquil C_{1}-C_{2})-(cicloalquilo C_{3}-C_{7}),
(f)
-(alquil C_{1}-C_{6})-O-(alquilo C_{1}-C_{3}),
(g)
-alquenilo C_{1}-C_{6} con uno o dos dobles enlaces,
(h)
-alquinilo C_{1}-C_{6} con uno o dos triples enlaces,
(i)
cadena de alquilo C_{1}-C_{6} con un doble enlace y un triple enlace,
(8)
-CO-(alquilo C_{3}-C_{12}),
(9)
-CO-(cicloalquilo C_{3}-C_{6}),
(11)
-CO-R_{1-heterociclo} en el que R_{1-heterociclo} es morfolinilo, tiomorfolinilo, S-óxido de tiomorfolinilo, S,S-dióxido de tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, tetrahidrofuranilo, o tetrahidrotiofenilo, en el que el grupo R_{1-heterociclo} está unido mediante cualquier átomo del grupo R_{1-heterociclo} original sustituido por hidrógeno de tal forma que el nuevo enlace al grupo R_{1-heteroalilo} sustituye al átomo de hidrógeno y su enlace, en el que el heterociclo no está sustituido o está sustituido con uno o dos =O, alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -OCF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN,
(12)
-CO-R_{N-4} en el que R_{N-4} es morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, piperidinilo o pirrolidinilo en el que cada grupo no está sustituido o está sustituido con uno o dos alquilo C_{1}-C_{3},
(13)
-CO-O-R_{N-5} en el que R_{N-5} es:
(a)
alquilo C_{1}-C_{6}, o
(b)
-(CH_{2})_{0-2}-(R_{1-arilo}) en el que R_{1-arilo} es según se definió anteriormente,
(14)
-SO_{2}-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} son según se definieron anteriormente,
(15)
-SO-(alquilo C_{1}-C_{8}),
(16)
-SO_{2}-(alquilo C_{3}-C_{12}),
(17)
-NH-CO-O-R_{N-5} en el que R_{N-5} es según se definió anteriormente,
(18)
-NH-CO-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(19)
-N-CS-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(20)
-N(alquil C_{1}-C_{3})-CO-R_{N-5} en el que R_{N-5} es según se definió anteriormente,
(21)
-NR_{N-2}R_{N-3} en el que R_{N-2} y R_{N-3} pueden ser iguales o diferentes y son según se definieron anteriormente,
(22)
-R_{N-4} en el que R_{N-4} es según se definió anteriormente,
(23)
-O-CO-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(24)
-O-CO-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(25)
-O-CS-N(alquilo C_{1}-C_{3})_{2},
(26)
-O-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(27)
-O-(alquil C_{2}-C_{5})-COOH,
(28)
-S-(alquilo C_{1}-C_{6}),
(29)
alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1, 2, 3, 4, o 5 -F,
(30)
-O-(alquilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1, 2, 3, 4, o 5 -F, o
(31)
-O-\varphi;
R_{a} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6};
R_{C} es
(1) R_{CH} en el que R_{CH} es morfolinilo, tiomorfolinilo, S-óxido de tiomorfolinilo, S,S-dióxido de tiomorfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, tetrahidrofuranilo, o tetrahidrotiofenilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con oxo, alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br o -I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
\newpage
(2) R_{CY} en el que R_{CY} es piridinilo, pirimidinilo, quinolinilo, indenilo, indanilo, benzotiofenilo, indolilo, indolinilo, piridazinilo, pirazinilo, isoindolilo, isoquinolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, indazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, indolizinilo, indazolilo, benzotiazolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, 1,4-benzodioxanilo, purinilo, oxazolopiridinilo, imidazopiridinilo, isotiazolilo, naftiridinilo, cinolinilo, carbazolilo, \beta-carbolinilo, isocromanilo, cromanilo, furazanilo, tetrahidroisoquinolina, isoindolinilo, isobenzotetrahidrofuranilo, isobenzotetrahidrotienilo, isobenzotiofenilo, benzoxazolilo, o piridopiridinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con alquilo C_{1}-C_{3}, -CF_{3}, -F, Cl, -Br, o I, alcoxilo C_{1}-C_{3}, -O-CF_{3}, -NH_{2}, -OH, o -C\equivN;
(3) alquil (C_{1}-C_{10})-R_{CH};
(4) alquil (C_{1}-C_{10})-R_{CY}; o
(5) alquil (C_{1}-C_{10})-K_{1-3} en el que:
(A)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con un -OH,
(B)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con un alcoxilo C_{1}-C_{6} no sustituido o sustituido con 1-5 -F,
(D)
la cadena de alquilo no está sustituida o está sustituida con 1-5 -F
(F)
cada K es:
(1)
H,
(2)
alquilo C_{1}-C_{3},
(3)
alcoxilo C_{1}-C_{3},
(4)
alquiltioxilo C_{1}-C_{3},
(5)
alquilacilamino C_{1}-C_{6},
(6)
alquilaciloxilo C_{1}-C_{6},
(7)
amido
(8)
alquilamino C_{1}-C_{6}
(9)
fenilamino,
(10)
carbamilo
(11)
carboxilo
(12)
carboxialcoxilo (C_{2}-C_{5}),
(13)
carboxialquiltioxilo (C_{2}-C_{5}),
(16)
amino no sustituido o sustituido con alquilo C_{1}-C_{6},
(17)
hidroxilo, o
(18)
éster carboxi-metílico.
2. Compuesto según la reivindicación 1, que es:
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-(piperidin-1-carbonil)-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-(2-morfolin-4-il-etilcarbamoil)-pentil]-5-metil-N,N-dipropil-
isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-[(tetrahidro-furan-2-ilmetil)-carbamoil]-pentil)-5-metil-N,N-di-
propil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-metil-5-morfolin-4-il-5-oxo-pentil]-5-metil-N,N-dipropil-isof-
talamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-4-(R)-[(furan-2-ilmetil)-carbamoil]-2-(S)-hidroxipentil)-5-metil-N,N-dipropil-isof-
talamida.
3. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Uso del compuesto según la reivindicación 1 ó 2, o de la composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer.
5. Compuesto según la reivindicación 1, que es:
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-isobutilcarbamoil-pentil]-5-metil-N,N-dipropil-isoftalamida;
ácido 3-[6-(3,5-difluorofenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoilbenzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxihexanoilamino]-
propiónico;
ácido 8-[6-(3,5-difluorofenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoilbenzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxihexanoilamino]-
octanoico;
éster metílico del ácido 8-[6-(3,5-difluoro-fenil)-5-(S)-(3-dipropilcarbamoil-benzoilamino)-2-(R)-etil-4-(S)-hidroxi-hexanoilamino]-octanoico;
N-[4-(R)-butilcarbamoil-1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-isobutilcarbamoil-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[4-(R)-bencilcarbamoil-1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[4-(R)-(ciclohexilmetil-carbamoil)-1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxihexil]-N,N-dipropil-isoftalamida;
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-2-(S)-hidroxi-4-(R)-(piperidin-1-carbonil)-hexil]-N,N-dipropil-isoftalamida; o
N-[1-(S)-(3,5-difluoro-bencil)-4-(R)-(2-dimetilamino-etilcarbamoil)-2-(S)-hidroxi-hexil]-N,N-dipropil-isoftala-
mida.
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