DE60315032T2

DE60315032T2 - Phenylalanin enamidderivate

Info

Publication number: DE60315032T2
Application number: DE60315032T
Authority: DE
Inventors: Julien Alistair Brown; Stuart Bailey; Stephen Brand
Original assignee: UCB Pharma SA
Current assignee: UCB Pharma SA
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2023-07-17
Also published as: AU2003280965B2; JP2005536505A; EP1525204A1; ATE367390T1; JP4451777B2; US6835738B1; EP1525204B1; GB0216571D0; CA2492430A1; ES2290477T3; DE60315032D1; WO2004007494A1; AU2003280965A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Vielzahl von Phenylalaninenamidestern, auf Zusammensetzungen, die diese enthalten, auf Verfahren zu ihrer Herstellung und auf ihre Verwendung in der Medizin.
In den letzten Jahren ist zunehmend deutlich geworden, daß die physikalische Interaktion von Entzündungsleukozyten miteinander und mit anderen Zellen des Körpers bei der Regulierung der Immun- und Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle spielt [Springer, T. A., Nature, 346, 425, (1990); Springer, T. A., Cell, 76, 301, (1994)]. Spezielle Zelloberflächenmoleküle, die gemeinschaftlich als Zelladhäsionsmoleküle bezeichnet werden, vermitteln viele dieser Interaktionen.
Die Adhäsionsmoleküle sind auf der Grundlage ihrer Struktur in verschiedene Gruppen unterteilt worden. Eine Familie von Adhäsionsmolekülen, von der angenommen wird, daß sie bei der Regulierung der Immun- und Entzündungsreaktionen eine besonders wichtige Rolle spielt, ist die Integrin-Familie. Diese Familie von Zelloberflächenglykoproteinen weist eine typische nicht-kovalent verknüpfte Heterodimerstruktur auf. Mindestens 16 verschiedene Integrin-alpha-Ketten und 8 verschiedene Integrin-beta-Ketten sind identifiziert worden [Newman, P. et al, Molecular Medicine Today, 304, (1996)]. Die Mitglieder der Familie werden typischerweise gemäß ihrer Heterodimerzusammensetzung benannt, obwohl die gewöhnliche Nomenklatur in diesem Bereich weit verbreitet ist. Daher besteht das Integrin α4β1 aus der Integrin-alpha-4-Kette, die mit der Integrin-beta-1-Kette in Verbindung steht, wird verbreitet aber auch als Very Late Antigen 4 oder VLA-4 bezeichnet. Es sind noch nicht alle der möglichen Paarungen von Integrin-alpha- und -beta-Ketten in der Natur beobachtet worden, und die Integrinfamilie ist in eine Vielzahl von Untergruppen unterteilt worden, basierend auf den Paarungen, die bis jetzt erkannt worden sind [Sonnenberg, A., Current Topics in Microbiology and Immunology, 184, 7, (1993)].
Die Wichtigkeit der Integrinfunktion bei normalen physiologischen Reaktionen wird durch zwei menschliche Mangelkrankheiten hervorgehoben, bei denen die Integrinfunktion man gelhaft ist. Daher gibt es bei der Krankheit, genannt Leukocyte Adhesion Deficiency (Leukozytenadhäsionsdefekt, LAD), einen Defekt bei einer der Integrin-Familien, exprimiert auf Leukozyten [Marlin, S. D. et al., J. Exp. Med. 164, 855, (1986)]. Patienten, die unter dieser Krankheit leiden, weisen eine verringerte Fähigkeit auf, Leukozyten an die Entzündungsstelle zu rekrutieren, und leiden unter wiederkehrenden Infektionen, die in extremen Fällen tödlich sein können. Im Falle von Patienten, die unter der Krankheit leiden, die Glanzmann-Naegeli-Syndrom genannt wird (ein Defekt bei einem Mitglied der beta-3-Integrin-Familie), besteht der Defekt in der Blutgerinnung (Hodivala-Dilke, K. M., J. Clin. Invest. 103, 229, (1999)].
Die Möglichkeit, die Integrinfunktion in einer Weise zu modifizieren, daß die Zelladhäsion vorteilhaft moduliert wird, ist an Tiermodellen unter Verwendung spezifischer Antikörper und Peptide, die verschiedene Funktionen dieser Moleküle blockieren, gründlich untersucht worden [z. B. Issekutz, T. B., J. Immunol. 149, 3394, (1992); Li, Z. et al., Am. J. Physiol. 263, L723, (1992); Mitjans, F. et al., J. Cell Sci. 108, 2825, (1995); Brooks, P. C. et al., J. Clin. Invest. 96, 1815, (1995); Binns, R. M. et al., J. Immunol. 157, 4094, (1996); Hammes, H. -P. et al., Nature Medicine 2, 529, (1996); Srivata, S. et al., Cardiovascular Res. 36, 408 (1997)]. Insbesondere zeigte ein Anti-α₄β₇-Antikörper sowohl klinische als auch histologische Verbesserung der Entzündungsaktivität und -krankheit bei einem nicht-menschlichen Primatenmodell von entzündlicher Darmerkrankung [Hesterberg, P. E. et al, Gastroenterol, 111, 1373–80 (1996)]. Eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern, die die Integrinfunktion blockieren, werden derzeit hinsichtlich ihres therapeutischen Potentials bei menschlichen Krankheiten untersucht, und ein Antikörper, ReoPro, ein chimärer Antikörper gegen das Thrombozytenintegrin αIIβb3, wird als ein wirksames Antithrombotikum zur Verwendung bei Patienten mit kardiovaskulären Komplikationen nach Koronarangioplastie eingesetzt.
Integrine erkennen sowohl Zelloberflächen- als auch Extrazellulärmatrixliganden, und die Ligandenspezifität wird durch die spezielle Kombination von alpha-beta-Untereinheiten des Moleküls bestimmt [Newman, P., ibid]. Eine spezielle Integrinuntergruppe von Interesse umfaßt die α4-Kette, die sich mit zwei anderen beta-Ketten, β1und β7, paaren kann [Sonnenberg, A., ibid]. Die α4β1-Paarung tritt an vielen zirkulierenden Leukozyten auf (beispielsweise Lymphozyten, Monozyten, Eosinophilen und Basophilen), während sie an zirkulierenden Neutrophilen gar nicht oder nur in geringen Niveaus auftritt. α4β1 bindet an ein Adhäsionsmolekül (Vascular Cell Adhesion Molecule-1, ebenso bekannt als VCAM-1), das häufig auf Endothelzellen an den Entzündungsstellen hochreguliert wird [Osborne, L., Cell, 62, 3, (1990)]. Es ist ebenso gezeigt worden, daß das Molekül an mindestens drei Stellen in dem Matrixmolekül Fibronectin bindet [Humphries, M. J. et al., Ciba Foundation Symposium, 189, 177, (1995)]. Basierend auf den Daten, die mit monoklonalen Antikörpern in Tiermodellen erhalten wurden, wird angenommen, daß die Interaktion zwischen α4β1 und Liganden auf anderen Zellen und der extrazellulären Matrix bei der Leukozytenmigration und -aktivierung ein wichtige Rolle spielt [Yednock, T. A. et al., Nature, 356, 63, (1992); Podolsky, D. K. et al., J. Clin. Invest. 92, 372, (1993); Abraham, W. M. et al., J. Clin. Invest. 93, 776, (1994)].
Das Integrin, erzeugt durch die Paarung von α4 und β7, ist als LPAM-1 bezeichnet worden [Holzmann, B. und Weissman, I. L., EMBO J. 8, 1735, (1989)]. Die α4β7-Paarung wird auf bestimmten Unterpopulationen von T- und B-Lymphozyten und auf Eosinophilen exprimiert [Erle, D. J. et al., J. Immunol. 153, 517 (1994)]. Wie α4β1 bindet α4β7 an VCAM-1 und Fibronectin. Außerdem bindet α4β7 an ein Adhäsionsmolekül, von dem angenommen wird, daß es in das Homing von Leukozyten zum Schleimhautgewebe, wie Magen-Darm-Schleimhaut, bezeichnet als MAdCAM-1, involviert ist [Berlin, C. et al., Cell, 74, 185, (1993)]. MAdCAM-1 wird bevorzugt im Magen-Darm-Trakt exprimiert. Die Interaktion zwischen α4β7 und MAdCAM-1 kann ebenso an Entzündungsstellen außerhalb des Schleimhautgewebes wichtig sein [Yang, X. -D. et al., PNAS, 91, 12604, (1994)].
Es sind Bereiche der Peptidsequenz, erkannt von α4β1 und α4β7, wenn sie an ihre Liganden binden, identifiziert worden. α4β1 scheint LDV-, IDA- oder REDV-Peptidsequenzen in Fibronectin und eine QIDSP-Sequenz in VCAM-1 zu erkennen [Humphries, M. J. et al., ibid], während α4β7 eine LDT-Sequenz in MAdCAM-1 erkennt [Birskin, M. J. et al., J. Immunol. 156, 719, (1996)]. Es gab mehrere Berichte über Inhibitoren dieser Interaktionen, die aus Modifikationen dieser kurzen Peptidsequenzen konstruiert wurden [Cardarelli, P. M. et al., J. Biol. Chem., 269, 18668, (1994); Shorff, H. N. et al., Biorganic Med. Chem. Lett., 6, 2495, (1996); Vanderslice, P. et al., J. Immunol., 158, 1710, (1997)]. Es ist ebenso berichtet worden, daß eine kurze Peptidsequenz, abgeleitet von der α4β1-Bindungsstelle in Fibronectin, eine Kontakthypersensibilitätsreaktion in einer Trinitrochlorbenzol-sensibilisierten Maus inhibieren kann [Ferguson, T. A., et al., PNAS, 88, 8072, (1991)].
Da die alpha-4-Untergruppe von Integrinen überwiegend auf Leukozyten exprimiert wird, ist anzunehmen, daß ihre Inhibierung bei einer Vielzahl von Immun- oder Entzündungskrankheitszuständen vorteilhaft ist. Jedoch ist es aufgrund der ubiquitären Verteilung und dem breiten Bereich an Funktionen, die andere Mitglieder der Integrinfamilie ausüben, wichtig, selektive Inhibitoren der alpha-4-Untergruppe identifizieren zu können.
Wir haben nunmehr eine Vielzahl von Estern gefunden, die wirksame und selektive Inhibitoren von α4-Integrinen sind. Die Verbindungen können α4-Integrine, wie α4β1 und/oder α4β7, beispielsweise in zellulären Assays, wie den hierin beschriebenen, bei Konzentrationen, bei denen sie im allgemeinen keine oder minimale inhibierende Wirkung auf α-Integrine anderer Untergruppen haben, inhibieren.
Daher stellen wir gemäß einem Aspekt der Erfindung eine Verbindung der Formel (1):
worin R¹ eine -CH(CH₃)₂-, -(CH₂)₂CH₃-, -CH₂C(CH₃)₃-, -CH₂CH₂OH-, -CH₂CH₂OCH₃-, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OH-, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃-,
-Gruppe ist,
und die Salze, Solvate und N-Oxide davon bereit.
Es ist selbstverständlich, daß die Verbindungen der Formel (1) als Enantiomere oder Diastereomere existieren. Die Erfindung soll sich auf alle diese Enantiomere, Diastereomere und Gemische davon, einschließlich Racemate erstrecken. Formel (1) soll alle einzelnen Isomere und Gemische davon darstellen, sofern nicht anders angegeben oder dargestellt.
Salze von Verbindungen der Erfindung umfassen pharmazeutisch akzeptable Salze, beispielsweise Säureadditionssalze, abgeleitet von anorganischen oder organischen Säuren.
Säureadditionssalze umfassen Hydrochloride, Hydrobromide, Hydroiodide, Alkylsulfonate, z. B. Methansulfonate, Ethansulfonate oder Isothionate, Arylsulfonate, z. B. p-Toluolsulfonate, Besylate oder Napsylate, Phosphate, Sulfate, Hydrogensulfate, Acetate, Trifluoracetate, Propionate, Citrate, Maleate, Fumarate, Malonate, Succinate, Lactate, Oxalate, Tartrate und Benzoate.
Besonders nützliche Salze von Verbindungen gemäß der Erfindung umfassen pharmazeutisch akzeptable Salze, speziell pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze.
Die Verbindungen der Erfindung sind:
Propyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
2,2-Dimethylpropyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
2-Methoxyethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
2-(2-Hydroxyethoxy)ethyl-(2S)-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
2-(2-Methoxyethoxy)ethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
2-(Morpholin-4-yl)ethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
2-(4-Methylpiperazin-1-yl)ethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
Tetrahydrofuran-2-ylmethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon.
Und stärker bevorzugt:
2-Hydroxyethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon;
Isopropyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat und die Salze, Solvate und N-Oxide davon.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind wirksame und selektive Inhibitoren von α4-Integrinen. Die Fähigkeit der Verbindungen, in dieser Weise zu fungieren, kann unter Einsatz von Tests, wie den zellulären Assays, die in den Beispielen nachstehend beschrieben sind, einfach bestimmt werden.
Die Verbindungen werden bei der Modulation der Zelladhäsion und insbesondere bei der Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten oder Störungen, einschließlich Entzündungen, verwendet, bei denen die Extravasation von Leukozyten eine Rolle spielt, und die Erfindung erstreckt sich auf eine solche Verwendung und auf die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung solcher Krankheiten oder Störungen.
Krankheiten oder Störungen dieses Typs umfassen entzündliche Arthritis, wie Rheumatoidarthritis, Vaskulitis oder Polydermatomyositis, multiple Sklerose, Transplantatabstoßung, Diabetes, entzündliche Dermatosen, wie Schuppenflechte oder Dermatitis, Asthma und entzündliche Darmerkrankung.
Für die Prophylaxe oder Behandlung der Krankheit können die Verbindungen gemäß der Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht werden, und gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung der Formel (1) zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln umfaßt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können eine Form annehmen, die zur oralen, bukkalen, parenteralen, nasalen, topischen oder rektalen Verabreichung geeignet ist, oder eine Form, die zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation geeignet ist.
Zur oralen Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form beispielsweise von Tabletten, Pastillen oder Kapseln annehmen, die durch konventionelle Mittel mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen, wie Bindemitteln (z. B. Maisquellstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z. B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Schmiermitteln (z. B. Magnesiumstearat, Talk oder Siliciumdioxid); Lösungsvermittlern (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumglycollat); oder Benetzungsmitteln (z. B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Präparate zur oralen Verabreichung können die Form beispielsweise von Lösungen, Sirups oder Suspensionen annehmen, oder sie können als ein Trockenprodukt zur Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung vorliegen. Diese flüssigen Präparate können durch konventionelle Mittel mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven, wie Suspendiermitteln, Emulgatoren, nicht-wässerigen Vehikeln und Konservierungsmitteln, hergestellt werden. Die Präparate können nach Bedarf ebenso Puffersalze, Aromastoffe, Farbmittel und Süßungsmittel enthalten.
Präparate zur oralen Verabreichung können geeigneterweise so formuliert werden, daß sie die kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung ermöglichen.
Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die in konventioneller Weise formuliert werden.
Die Verbindungen der Formel (1) können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, beispielsweise durch Bolusinjektion oder Infusion, formuliert werden. Formulierungen für die Injektion können in Einheitsdosierungsform, beispielsweise in Glasampullen, oder Mehrfachdosierungsbehältern, beispielsweise Glasphiolen, vorliegen. Die Zusammensetzungen für die Injektion können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln annehmen, und können Formulierungsmittel, wie Suspendiermittel, Stabili satoren, Konservierungsmittel und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der Wirkstoff vor der Verwendung in Pulverform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem Pyrogen-freiem Wasser, vorliegen.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen der Formel (1) ebenso als ein Depotpräparat formuliert werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden.
Zur nasalen Verabreichung oder Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Form einer Aerosolsprayaufmachung für unter Druck gesetzte Verpackungen oder einen Vernebler unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder anderen geeigneten Gases oder Gemisches aus Gasen geliefert.
Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer Verpackung oder Spendervorrichtung vorliegen, die ein oder mehrere Einheitsdosierungsformen enthalten kann, die den Wirkstoff enthalten. Die Verpackung oder Spendervorrichtung kann Instruktionen für die Verabreichung enthalten.
Die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die für die Prophylaxe oder Behandlung eines speziellen Zustandes erforderlich ist, wird in Abhängigkeit der gewählten Verbindung und des Zustandes des Patienten, der behandelt werden soll, variieren. Im allgemeinen können die täglichen Dosierungen jedoch zwischen rund 100 ng/kg und 100 mg/kg, z. B. rund 0,01 mg/kg und 40 mg/kg Körpergewicht zur oralen oder bukkalen Verabreichung, rund 10 ng/kg und 50 mg/kg Körpergewicht zur parenteralen Verabreichung und rund 0,05 mg und rund 1000 mg, z. B. rund 0,5 mg und rund 1000 mg zur nasalen Verabreichung oder Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation liegen.
Die Ester der Formel (1) können durch die Verfahren, die nachstehend in den Beispielen beschrieben sind, hergestellt werden. Im allgemeinen umfassen diese die Veresterung einer intermediären Säure der Formel (2):
unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wie die Reaktion mit einem Alkohol der Formel R1OH in Gegenwart eines Säurekatalysators, z. B. p-Toluolsulfonsäure. Alternativ kann ein Kondensationsmittel, beispielsweise ein Diimid, wie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, vorteilhafterweise in Gegenwart eines Katalysators, wie einer N-Hydroxy-Verbindung, z. B. einem N-Hydroxytriazol wie 1-Hydroxybenzotriazol, eingesetzt werden.
Die Zwischenprodukte der Formel (2) können unter Verwendung von Verfahren, wie in den Beispielen nachstehend beschrieben, hergestellt werden.
Alternativ kann ein Ester der Formel (1) der Umesterung, bevorzugt in Gegenwart eines Säurekatalysators unterzogen werden, um so einen anderen Ester von Formel (1) zu erhalten.
Die Ester der Formel (1) können ebenso durch Verknüpfen eines Amins der Formel (3):
mit einer aktivierten Säure der Formel (4):
hergestellt werden.
Die Säure der Formel (4) kann durch Umwandlung in ein Säurechlorid unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, aktiviert werden, wie beispielsweise in den Beispielen nachstehend beschrieben. Die Verknüpfungsreaktion kann in Gegenwart einer Base, wie Hydrid, z. B. Natriumhydrid, oder einem Amin, z. B. Triethylamin oder N-Methylmorpholin, in einem Lösungsmittel, wie einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z. B. Dichlormethan oder Kohlenstofftetrachlorid, oder einem dipolaren aprotischen Lösungsmittel, wie einem Amid, z. B. Dimethylformamid, oder einem Ether, z. B. einem cyclischen Ether, wie Tetrahydrofuran, bei beispielsweise Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Alternativ kann die Säure der Formel (4) direkt mit dem Amin der Formel (3) durch die Verwendung eines Kondensationsmittels, beispielsweise einem Diimid, wie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, vorteilhafterweise in Gegenwart eines Katalysators, wie einer N-Hydroxy-Verbindung, z. B. einem N-Hydroxytriazol wie 1-Hydroxybenzotriazol, verknüpft werden. Alternativ kann die Säure vor der gewünschten Acylierungsreaktion mit einem Chlorformiat, beispielsweise Ethylchlorformiat, umgesetzt werden.
Die Amine der Formel (3) können unter Verwendung des allgemeinen Weges, wie in Schema A nachstehend dargestellt, hergestellt werden.
Daher können die Amine der Formel (3) durch Reduktion einer Nitroverbindung der Formel (5) hergestellt werden. Geeignete Bedingungen können katalytische Hydrierung unter Verwendung beispielsweise von Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, beispielsweise Palladium auf einem Träger wie Kohlenstoff, in einem Lösungsmittel, wie einem Ether, z. B. Tetrahydrofuran, oder einem Alkohol, z. B. Methanol oder Ethanol, umfassen. Die Reaktion kann bei Atmosphärendruck oder bis zu einem Druck von 100 psi durchgeführt werden. Alternativ kann die chemische Reduktion beispielsweise unter Verwendung eines Metalls, z. B. Zinn oder Eisen, in Gegenwart einer Säure wie Salzsäure eingesetzt werden.
Die Nitroverbindungen der Formel (5) können durch die Umsetzung eines Cyclobutadiens der Formel (7) mit einem Amin der Formel (6) hergestellt werden. Die Reaktion kann in einem inerten Lösungsmittel oder Gemisch aus Lösungsmitteln, beispielsweise einem Kohlenwasserstoff, wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff, z. B. Benzol oder Toluol, und/oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie 1,2-Dichlorethan oder Dichlormethan, bei einer Temperatur von 0°C bis Rückflußtemperatur durchgeführt werden. Wo notwendig, wenn beispielsweise ein Salz eines Amins der Formel (6) verwendet wird, kann eine organische Base wie Diisopropylethylamin hinzugefügt werden.
Die Amine der Formel (6) können unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, hergestellt werden, wie Veresterung von kommerziell erhältlichem 4-Nitrophenylalanin.
Die Zwischenprodukte der Formel (7) können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, wie in der internationalen Patentanmeldung WO 02/068393 beschrieben.
Außerdem können die N-Oxide von Verbindungen der Formel (1) beispielsweise durch Oxidation der entsprechenden Stickstoffbase unter Verwendung eines Oxidationsmittels, wie Wasserstoffperoxid, in Gegenwart einer Säure, wie Essigsäure, bei einer erhöhten Temperatur, beispielsweise rund 70°C bis 80°C, oder alternativ durch die Umsetzung mit einer Persäure, wie Peressigsäure, in einem Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, bei Umgebungstemperatur hergestellt werden.
Die Salze der Verbindungen der Formel (1) können durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel (1) mit einer entsprechenden Säure in einem geeigneten Lösungsmittel oder Gemisch aus Lösungsmitteln, z. B. einem organischen Lösungsmittel, wie einem Ether, z. B. Diethylether, oder einem Alkohol, z. B. Ethanol, unter Verwendung konventioneller Verfahrensweisen hergestellt werden.
Wo es gewünscht ist, ein spezielles Enantiomer einer Verbindung der Formel (1) zu erhalten, kann dieses aus einem entsprechenden Gemisch aus Enantiomeren unter Verwendung irgendeiner geeigneten konventionellen Verfahrensweise zum Trennen der Enantiomere hergestellt werden.
Daher können beispielsweise diastereomere Derivate, z. B. Salze, durch die Umsetzung eines Gemisches aus Enantiomeren der Formel (1), z. B. einem Racemat, und einer entsprechenden chiralen Verbindung, Z. B. einer chiralen Base, hergestellt werden. Die Diastereomere können dann durch günstige Mittel beispielsweise durch Kristallisation getrennt werden, und das gewünschte Enantiomer beispielsweise durch Behandlung mit einer Säure in dem Fall rückgewonnen werden, wo das Diastereomer ein Salz ist.
Bei einem anderen Trennverfahren kann ein Racemat der Formel (1) unter Verwendung chiraler Hochleistungsflüssigchromatographie getrennt werden. Alternativ kann, wenn gewünscht, ein spezielles Enantiomer unter Verwendung eines entsprechenden chiralen Zwischenproduktes in einem der oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Alternativ kann ein spezielles Enantiomer mittels Durchführen einer enantiomerspezifischen enzymatischen Biotransformation, z. B. einer Esterhydrolyse unter Verwendung einer Esterase, und dann nur Reinigen der enantiomerenreinen hydrolysierten Säure von dem nicht-umgesetzten Esterantipode erhalten werden.
Die Chromatographie, Umkristallisierung und andere konventionelle Trennverfahren können ebenso mit Zwischenprodukten oder Endprodukten verwendet werden, wo es gewünscht ist, ein spezielles geometrisches Isomer der Erfindung zu erhalten.
Die folgenden Beispiele zeigen die Herstellung von Verbindungen der Erfindung. Alle Temperaturen sind in °C angegeben. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

EtOAc: – Ethylacetat;
MeOH: – Methanol;
EtOH: – Ethanol;
DMSO: – Dimethylsulfoxid;
THF: – Tetrahydrofuran;
Et₃NHCl: – Triethylaminhydrochlorid
EDC: – 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
DCM: – Dichlormethan;
HOAc: – Essigsäure;
Me: – Methyl;
DMF: – N,N-Dimethylformamid;
HOBT: – 1-Hydroxybenzotriazol;

Alle NMRs wurden entweder bei 300 MHz oder 400 MHz erhalten.
Alle Zwischenprodukte und Beispiele wurden mit Hilfe von Beilstein Autonom (erhältlich von MDL Information Systems GmbH, Therdor-Heuss-Allee 108D 60486, Frankfurt, Deutschland) benannt oder erhielten Namen, die konsistent erschienen.
Zwischenprodukt 1 3-Cyano-4-(2-(N,N-dimethylamino)ethylen-1-yl)pyridin
Eine Lösung aus 4-Methyl-3-cyanopyridin [hergestellt gemäß Ref: J. Prakt. Chem. 338, 663 (1996)], (8,0 g, 67,8 mmol) und N,N-Dimethylformamiddiethylacetal (11,0 g, 74,8 mmol) in trockenem DMF (50 ml) wurde bei 140°C unter N₂ für 2 Tage gerührt. Ein zusätzlicher Teil N,N-Dimethylformamiddiethylacetal (5 g) wurde zugegeben und bei 140°C für 4 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt und das erhaltene dunkle Öl zwischen EtOAc (300 ml) und Wasser (50 ml) geteilt. Die Phasen wurden abgetrennt und die wässerige Schicht erneut mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung (30 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), mit Aktivkohle behandelt, filtriert und im Vakuum eingedampft, wodurch die im wesentlichen reine Titelverbindung als ein mattorangefarbener Feststoff erhalten wurde (10,1 g, 85%). δH (CDCl₃) 8,49 (1H, s), 8,25 (1H, d, J 5,9 Hz), 7,29 (1H, d, J 13,2 Hz), 7,09 (1H, d, J 5,9 Hz), 5,25 (1H, d, J 13,2 Hz) und 2,99 (6H, s); m/z (ES⁺, 70V) 174 (MH⁺).
Zwischenprodukt 2 1-Hydroxy-[2,7]-naphthyridinhydrochloridsalz
HCl-Gas wurde durch eine gerührte Lösung aus Zwischenprodukt 1 (6,2 g, 3,58 mmol) in Eisessig (50 ml) und Wasser (0,64 ml, 3,55 mmol) für 1 bis 2 min hindurchgeperlt. Das Reaktionsgemisch wurde in einer Stöpselflasche bei 40°C für 18 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt, was einen dunklen Rest ergab, der mit Wasser (3 × 20 ml) behandelt und im Vakuum erneut eingedampft wurde. Der erhaltene dunkle Halbfeststoff wurde mit 40 ml warmem Ethanol behandelt, eisgekühlt und der nicht gelöste Feststoff durch Filtration gesammelt, wodurch die Titelverbindung als ein grüngefärbter Feststoff erhalten wurde (5,2 g, 80%). δH (DMSO-d₆) 12,5 (1H, br s), 9,38 (1H, s), 8,84 (1H, d, J 7,0 Hz), 8,15 (1H, d, J 7,0 Hz), 7,89 (1H, br dd, J 7,0, 5,0 Hz) und 6,85 (1H, d, J 7,0 Hz); m/z (ES⁺ 70V), 147 (MH⁺).
Zwischenprodukt 3 1-Chlor-[2,7]-naphthyridin
Zwischenprodukt 2 (5,2 g, 28,5 mmol) wurde mit Phosphoroxychlorid (75 ml) bei 110°C für 24 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt, was ein dunkles Öl ergab, das in ein eisbadgekühltes Gemisch aus gesättigtem wässerigem NaHCO₃ (100 ml, enthaltend 20 g festes NaHCO₃) und EtOAc (100 ml) gegossen wurde. Nach dem gründlichen Mischen wurden die Phasen abgetrennt und die wässerige Schicht wurde erneut mit EtOAc (2 × 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung (15 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum eingedampft, wodurch die Titelverbindung als ein gelber Feststoff erhalten wurde (4,0 g, 85%). δH (CDCl₃) 9,45 (1H, s), 8,81 (1H, d, J 5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J 5,7 Hz), 7,66 (1H, d, J 5,7 Hz) und 7,60 (1H, d, J 5,7 Hz); m/z (ES⁺, 70V) 165 und 167 (MH⁺).
Zwischenprodukt 4 Ethyl(2S)-2-amino-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]-propanoat
Eine Lösung aus Ethyl-(S)-3-[4-aminophenyl]-2-[t-butoxycarbonylamino]propanoat (638 mg, 2,07 mmol) und Zwischenprodukt 3 (310 mg, 1,88 mmol) in Ethoxyethanol (2 ml) wurde bei 120°C für 15 min und bei 100°C für 1 h unter Stickstoff gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt und der dunkle Rest zwischen EtOAc (70 ml) und gesättigtem wässerigem NaHCO₃ (10 ml) geteilt. Die Phasen wurden abgetrennt und die wässerige Schicht erneut mit EtOAc (2 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum eingedampft, wodurch ein dunkler Schaum erhalten wurde. Chromatographie (SiO₂; 5 bis 10% MeOH/DCM) ergab ein Gemisch aus Ethyl-(S)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]-2-[(t-butoxycarbonyl)amino]propanoat und etwas der Titelverbindung (730 mg). Dieses Gemisch wurde mit einer Lösung aus Trifluoressigsäure (5 ml) und DCM (5 ml) bei Raumtemperatur für 1 h behandelt. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt und der Rest zwischen EtOAc (75 ml) und gesättigtem wässerigem NaHCO₃ (20 ml) geteilt. Die Phasen wurden abgetrennt und die wässerige Schicht erneut mit EtOAc (3 × 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum eingedampft, wodurch ein orangefarbener Feststoff erhalten wurde. Chromatographie (SiO₂; 10% MeOH/DCM) ergab die Titelverbindung als einen strohfarbenen Feststoff (420 mg, 60% über zwei Schritte). δH (CDCl₃) 10,70 (1H, s), 10,31 (1H, s), 9,44 (1H, d, J 5,6 Hz), 8,94 (1H, d, J 5,6 Hz), 8,55 (1H, d, J 7,3 Hz), 8,54 (2H, d, J 8,5 Hz), 8,46 (1H, d, J 5,6 Hz), 7,94 (2H, d, J 8,5 Hz), 4,84 (2H, q, J, 7,1 Hz), 4,35 (1H, t, J 6,6 Hz), 4,10 (2H, br s), 3,64 (1H, dd, J 13,5, 6,4 Hz), 3,56 (1H, dd, J 13,5, 7,0 Hz) und 1,95 (3H, t, J 7,1 Hz); m/z (ES⁺, 70V) 337 (MH⁺).
Zwischenprodukt 5 Ethyl(2S)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]-2-(3-oxo spiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)propanoat
Eine Lösung aus dem Ethylester von Zwischenprodukt 4 (565 mg, 1,68 mmol) und 1-Keto-3-hydroxyspiro[3,5]-non-2-en [hergestellt gemäß dem Verfahren von Wasserman, H. H et. al., J. Org. Chem., 38, 1451–1455 (1973)] (280 mg, 1,84 mmol) in DCM (20 ml) wurde bei Raumtemperatur für 24 h gerührt. Die Konzentration im Vakuum und Chromatographie (SiO₂, EtOAc) des Restes ergaben die Titelverbindung als ein hellgelbes Pulver (1,4 mmol, 73%). δH (CDCl₃) 9,61 (1H, s), 8,65 (1H, d, J 5,7 Hz), 8,25 (1H, d, J 5,8 Hz), 7,71 (2H, d, J 8,4 Hz), 7,63 (1H, d, J 8,5 Hz), 7,12 (2H, d, J 8,5 Hz), 7,05 (1H, d, J 5,8 Hz), 5,80 (1H, m), 4,55 (1H, s), 4,29 (2H, q, J 7,2 Hz), 3,13 (2H, m), 1,87–1,25 (14H, m); m/z (ES⁺, 70V) 471,1 (MH⁺).
Zwischenprodukt 6 Ethyl(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat
Eine gerührte Lösung aus der Verbindung von Zwischenprodukt 5 (300 mg, 0,637 mmol) und Triethylamin (1,2 Äqu., 100 μl) in THF (10 ml) bei 0°C wurde tropfenweise mit einer Lösung aus Brom in DCM (2 Vol.-%, 2,1 ml, 1,2 Äqu.) behandelt. Nach 12 h wurde die Reaktion mit DCM (50 ml) verdünnt und anschließend mit gesättigtem wässerigem NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und im Vakuum konzentriert. Der restliche Schaum wurde mit Diisopropylether zerrieben und der resultierende Feststoff gesammelt und im Vakuum getrocknet, wodurch die Titelverbindung als ein hellgelbes Pulver erhalten wurde (0,45 mmol, 76%). δH (CDCl₃) 9,81 (1H, s), 8,64 (1H, d, J 5,7 Hz), 8,29 (1H, d, J 5,8 Hz), 7,75 (2H, d, J 8,3 Hz), 7,60 (1H, d, J 5,8 Hz), 7,12 (2H, d, J 8,4 Hz), 7,08 (1H, d, J 5,7 Hz), 5,91 (1H, m), 5,03 (1H, m), 4,28 (2H, q, J 7,1 Hz), 3,29 (2H, m), 1,81–1,39 (10H, m), 1,35 (3H, t, J 7,1 Hz); m/z (ES⁺, 70V) 550,0 (MH⁺).
Zwischenprodukt 7 (2S)-2-(2-Brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propionsäure
Die Verbindung in Zwischenprodukt 6 (219 mg, 0,40 mmol) in THF (5 ml) wurde in einem einzelnen Teil mit LiOH·H₂O (19 mg, 0,44 mmol) in H₂O (1 ml) behandelt und die Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h gerührt. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von HOAc (Eisessig, 1 ml) gequencht und die flüchtigen Bestandteile im Vakuum entfernt. Wasser (10 ml) wurde dann zu dem restlichen Schaum zugegeben und kräftig gerührt, um die Ausfällung zu bewirken. Der Niederschlag wurde dann durch Vakuumfiltration gesammelt und der Rest mit Wasser (2 × 5 ml) gewaschen. Das Trocknen unter Vakuum ergab die Titelverbindung als ein weißes Pulver (0,25 mmol, 64%). δH (DMSO d₆, 300 K) 9,90 (1H, s), 9,56 (1H, s), 8,86 (1H, d, J 9,3 Hz), 8,66 (1H, d, J 5,6 Hz), 8,17 (1H, d, J 5,7 Hz), 7,81 (2H, d, J 8,2 Hz), 7,70 (1H, d, J 5,6 Hz), 7,24 (2H, d, J 8,4 Hz), 7,14 (1H, d, J 5,7 Hz), 4,78 (1H, m) 3,23 (1H, dd, J 13,9, 4,1 Hz), 2,99 (1H, dd, J 13,7, 10,0 Hz), 1,81–1,04 (11H, m); m/z (ES⁺, 70V) 522,0 (MH⁺).
Beispiel 1 2-Hydroxyethyl(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat
Zu einer Lösung aus der Säure von Zwischenprodukt 7 (0,35 g, 0,67 mmol) in DMF (3 ml) wurden EDC (0,15 g), HOBT (0,09 g) und Ethylenglycol (1 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann zwischen EtOAc (20 ml) und Wasser (10 ml) geteilt. Die organischen Verbindungen wurden abgetrennt und mit Wasser (4 × 10 ml), Salzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch das Rohprodukt als gelber Schaum erhalten wurde. Die Chromatographie (SiO₂, EtOAc) ergab die Titelverbindung als einen gelben Feststoff (0,25 g, 66%). ¹H-NMR (DMSO d₆) 9,84 (1H, s), 9,53 (1H, s), 8,93 (1H, d, J = 9,3 Hz), 8,66 (1H, d, J = 5,6 Hz), 8,16 (1H, d, J = 5,7 Hz), 7,81 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,69 (1H, d, J = 5,6 Hz), 7,23 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,13 (1H, d, J = 5,7 Hz), 4,87 (2H, m), 4,19 (2H, m), 3,63 (2H, m), 3,24 (1H, dd, J = 4,3, 14,0 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 9,8, 13,9 Hz), 1,53–1,80 (7H, m), 1,42 (1H, d, J = 12,4 Hz), 1,17 (2H, br). m/z (ESI, 70V) 567 (MH⁺).
Beispiel 2 Isopropyl(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat
Die feste Säure aus Zwischenprodukt 7 (3,6 g, 6,9 mmol) wurde portionsweise zu HCl in Isopropanol zugegeben, hergestellt vor der Wirkung von Acetylchlorid (10 ml) auf den Alkohol (100 ml) bei 0 bis 5°C. Die resultierende Lösung wurde bei Umgebungstemperatur (20 bis 25°C) für 16 h stehengelassen, hinsichtlich der Beendigung durch LC untersucht, und dann im Vakuum zur Trockne abgezogen. Der Rest wurde in Isopropylacetat, enthaltend Triethylamin (15 g), aufgenommen und für 1 h gerührt. Der ausgefällte Feststoff (Et₃NHCl) wurde abfiltriert und die Flüssigkeiten wurden in Gegenwart von Kieselgel (10 g) eingedampft. Das voradsorbierte Produkt wurde dann durch Säulenchromatographie gereinigt (SiO₂, Isopropylacetat), wodurch der reine Isopropylester als gelb-grüner Schaum nach der Entfernung des Lösungsmittels erhalten wurde (3,0 g, 77,4% Ausbeute). ¹H-NMR (CDCl₃) 9,45 (1H, s), 8,68 (1H, d), 8,23 (1H, d), 7,68 (2H, d), 7,65 (1H, b, s), 7,54 (1H, d), 7,12 (2H, d), 7,05 (1H, d), 5,96 (1H, d), 5,12 (1H, Septett), 4,95 (1H, m), 3,22 (2H, d), 1,42–1,88 (10H, m), 1,28 (6H, dd). m/z (ESI 70V) 565 (MH⁺).
Die folgenden zellulären Assays können verwendet werden, um die Wirksamkeit und Selektivität der Verbindungen gemäß der Erfindung zu zeigen. In jedem dieser Assays wurde ein IC₅₀-Wert für jede Testverbindung bestimmt und die Konzentration der Verbindung dargestellt, die notwendig ist, um eine 50%ige Inhibierung der Zelladhäsion zu erreichen, wobei 100% = Adhäsion, bewertet in Abwesenheit der Testverbindung, und 0% = Extinktion in Löchern, die keine Zellen erhielten.
α₄β₁-Integrin-abhängige Jurkat-Zelladhäsion an VCAM-Ig
96-Loch-NUNC-Platten wurden mit einem F(ab)₂-Fragment Ziege-Anti-human IgG Fc_γ-spezifischen Antikörper [Jackson Immuno Research 109-006-098: 100 μl bei 2 μg/ml in 0,1M NaHCO₃, pH 8,4] über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden (3 ×) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann für 1 h in PBS/1% BSA bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform blockiert. Nach dem Waschen (3 × in PBS) wurden 9 ng/ml an gereinigtem 2d VCAM-Ig, verdünnt in PBS/1% BSA, zugegeben und die Platten wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform stehengelassen. Die Platten wurden gewaschen (3 × in PBS) und der Assay anschließend bei 37°C für 30 min in einem Gesamtvolumen von 200 μl, enthaltend 2,5 × 10⁵ Jurkat-Zellen, in Gegenwart oder Abwesenheit titrierter Testverbindungen durchgeführt.
Jede Platte wurde (2 ×) mit Medium gewaschen und die adhärenten Zellen wurden mit 100 μl Methanol für 10 Minuten fixiert, gefolgt von einer weiteren Wäsche. 100 μl 0,25% Rose Bengal (Sigma R4507) in PBS wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und die Platten (3 ×) in PBS gewaschen. 100 μl 50% (v/v) Ethanol in PBS wurden zugeben und die Platten für 60 min stehengelassen, wonach die Extiktion (570 nm) gemessen wurde.
α₄β₇-Integrin-abhängige JY-Zelladhäsion an MAdCAM-Ig
Dieser Assay wurde in derselben Weise wie der α₄β₁-Assay durchgeführt, außer daß MAdCAM-Ig (150 ng/ml) anstelle von 2d VCAM-Ig verwendet wurde, und eine Subline der β-lymphoblastenartigen Zellinie JY anstelle von Jurkat-Zellen verwendet wurde. Der IC₅₀-Wert für jede Testverbindung wurde bestimmt, wie in dem α₄β₇-Integrinassay beschrieben.
α₄β₁-Integrin-abhängige K562-Zelladhäsion an Fibronectin
96-Loch-Gewebekulturplatten wurden mit humanem Plasmafibronectin (Sigma F0895) bei 5 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 2 h bei 37°C beschichtet. Die Platten wurden gewaschen (3 × in PBS) und dann für 1 h in 100 μl PBS/1% BSA bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform blockiert. Die blockierten Platten wurden gewaschen (3 × in PBS) und der Assay anschließend bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 200 μl, enthaltend 2,5 × 10⁵ K562-Zellen, Phorbol-12-myristat-13-acetat bei 10 ng/ml und in Gegenwart oder Abwesenheit titrierter Testverbindungen durchgeführt. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten. Jede Platte wurde fixiert und eingefärbt, wie in dem obigen α₄β₁-Assay beschrieben.
α_mβ₂-abhängige humane polymorphonukleare Neutrophiladhäsion an Kunststoff
96-Loch-Gewebekulturplatten wurden mit RPMI 1640/10% FKS für 2 h bei 37°C beschichtet. 2 × 10⁵ frisch isolierte humane, venöse, polymorphonukleare Neutrophile (PMN) wurden zu den Löchern in einem Gesamtvolumen von 200 μl in Gegenwart von 10 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat und in Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindungen zugegeben, und für 20 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von 30 min bei Raumtemperatur. Die Platten wurden in Medium und 100 μl 0,1% (Gew./Vol.) HMB (Hexadecyltrimethylammoniumbro mid, Sigma H5882) in 0,05M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0, das zu jedem Loch zugegeben wurde, gewaschen. Die Platten wurden dann auf einem Schwinger bei Raumtemperatur für 60 min stehengelassen. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde dann unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB) folgendermaßen analysiert: PMN-Lysatproben gemischt mit 0,22% H₂O₂ (Sigma) und 50 μg/ml TMB (Boehringer Mannheim) in 0,1M Natriumacetat/Citratpuffer, pH 6,0 und Extinktion bei 630 nm gemessen.
αIIb/β₃-abhängige humane Thrombozytenaggregation
Die humane Thrombozytenaggregation wurde unter Verwendung von Impedanzaggregation auf dem Chronolog Whole Blood Lumiaggregometer analysiert. Humanes thrombozytenreiches Plasma (PRP) wurde durch Schleudern von frischem humanem Venenblut, antikoaguliert mit 0,38% (Vol./Vol.) Tri-natriumcitrat bei 220 × g für 10 min, erhalten und auf eine Zelldichte von 6 × 10⁸/ml in autologem Plasma verdünnt. Küvetten enthielten gleiche Volumen an PRP und filtriertem Tyrode-Puffer (g/Liter: NaCl 8,0; MgCl₂·H₂O 0,427; CaCl₂ 0,2; KCl 0,2; D-Glucose 1,0; NaHCO₃ 1,0; NaHPO₄·2H₂O 0,065). Die Aggregation wurde nach der Zugabe von 2,5 μM ADP (Sigma) in Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren überwacht.
In den obigen Assays weisen die Verbindungen der Erfindung, wie die Verbindungen der Beispiele, im allgemeinen IC₅₀-Werte in dem α₄β₁-Assay von 1 μM und darunter und in dem α₄β₇-Assay von 5 μM und darunter auf.

Claims

Verbindung der Formel (1):
worin R¹ eine -CH(CH₃)₂-, -(CH₂)₂CH₃-, -CH₂C(CH₃)₃-, -CH₂CH₂OH-, -CH₂CH₂OCH₃-, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OH-, -CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃-,
-Gruppe ist; und die Salze, Solvate und N-Oxide davon.
Verbindung nach Anspruch 1, die 2-Hydroxyethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat ist, und die Salze, Solvate und N-Oxide davon.
Verbindung, die 2-Hydroxyethyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die Isopropyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat ist, und die Salze, Solvate und N-Oxide davon.
Verbindung, die Isopropyl-(2S)-2-(2-brom-3-oxospiro[3.5]non-1-en-1-ylamino)-3-[4-([2,7]naphthyridin-1-ylamino)phenyl]propanoat ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Bindemitteln oder Verdünnungsmitteln.