JP4451777B2

JP4451777B2 - フェニルアラニンエナミド誘導体

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Publication number: JP4451777B2
Application number: JP2004520903A
Authority: JP
Inventors: ブラウン、ジュリアン、アリスター; ベイリー、スチュアート; ブランド、スティーヴン
Original assignee: ユセベファルマソシエテアノニム
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2023-07-16
Also published as: GB0216571D0; WO2004007494A1; ES2290477T3; CA2492430A1; DE60315032T2; AU2003280965B2; JP2005536505A; DE60315032D1; US6835738B1; EP1525204B1; AU2003280965A1; ATE367390T1; EP1525204A1

Description

本発明は、多数のフェニルアラニンエナミドエステル（phenylalanine enamide esters）、それを含有する組成物、それらの製法、及び医薬品としてのそれらの使用に関するものである。

この数年の間に、炎症性白血球の相互間及び体の他の細胞との相互作用が免疫及び炎症性応答の調節に重要な役割を演じていることが次第に明らかになってきた［Springer, T.A., Nature, 346, 425,(1990); Springer, T.A., Cell, 76, 301,(1994)］。細胞接着分子と総称される特種な細胞表面分子は、これ等の相互作用の多くを仲介する。

接着分子は、その構造に基づいて種々のグループに小分類されている。免疫及び炎症応答の調節において特に重要な役割を演じていると考えられている接着分子のファミリーは、インテグリンファミリーである。細胞表面糖タンパク質であるこのファミリーは、典型的な非共有結合性ヘテロ2量体構造を有している。少なくとも16種の異なるインテグリンアルファ鎖及び8種の異なるインテグリンベータ鎖が確認されている［Newman, P. et al, Molecular Medicine Today, 304,(1996)］。このファミリーのメンバーは、この分野では慣用名が広く知られているが、通常はそのヘテロ2量体の組成に従って命名される。したがってインテグリンα4β1は、インテグリンベータ1鎖を伴うインテグリンアルファ4鎖からなるが、これはまた、広くVery Late抗原4又はVLA-4とも呼ばれる。インテグリンのアルファ鎖及びベータ鎖の可能な組み合わせの全てが実際に発見されているわけではないが、インテグリンファミリーは今まで確認された組合せに基づいて多数のサブグループに小分類されている［Sonnenberg, A., Current Topics in Microbiology and Immunology, 184, 7,(1993)］。

正常な生理的応答においてインテグリン機能が重要であることは、インテグリン機能が失われている二種のヒト欠損症により脚光を浴びた。たとえば白血球粘着異常症（LAD）と呼ばれる病気において、白血球上に発現するインテグリンのファミリーの一つが欠損している［Marlin, S.D. et al, J. Exp. Med. 164, 855,(1986)］。この病気に罹患した患者は、炎症部位へ白血球を動員する能力が減少し、極端な場合には致命的となることがある再発性の感染症に患わされる。Glanzman血小板減少症（ベータ3インテグリンファミリーメンバーの欠損）と呼ばれる病気に罹患した患者の場合では、血液凝固に欠陥がある［Hodivala-Dilke, K. M., J. Clin. Invest. 103, 229,(1999)］。

細胞接着を都合よく変化させる方法でインテグリンの機能を調節する可能性については、これ等の分子の種々の機能を阻害する特異的な抗体及びペプチドを使用して、動物モデルにおいて広範に検討されてきた［例えば、Issekutz, T.B., J. Immunol. 149, 3394,(1992); Li, Z. et al, Am. J. Physiol. 263, L723,(1992); Mitjans, F. et al, J. Cell Sci. 108, 2825,(1995); Brooks, P.C. et al, J. Clin. Invest. 96, 1815,(1995); Binns, R.M. et al, J. Immunol. 157, 4094(1996); Hammes, H.-P. et al, Nature Medicine 2, 529,(1996); Srivata, S. et al, Cardiovascular Res. 36,408(1997)］。特に抗α4β7-抗体は、炎症性腸疾患の非ヒト霊長類モデルにおいて臨床的にも組織学的にも炎症性活性及び病気の改善を示すことが実証されている［Hesterberg, P.E. et al, Gastroenterol, 111，1373-80（1996）］。インテグリン機能を阻害する多数のモノクロナール抗体が、現在ヒトの病気における治療効果について検討されており、その一つ、ReoPro、血小板インテグリンαIIbβ3に対するキメラ抗体は、冠血管形成術後の心臓血管合併症の患者に使用する有効な抗血栓薬として使用されている。

インテグリンは、細胞表面及び細胞外マトリックスのいずれのリガンドも認識し、リガンド特異性は、その分子の特定のアルファ-ベータサブユニットの組合せにより決まる［Newman, P.,前出］。興味あるインテグリンの一つの特別なサブグループは、二つの異なるβ鎖β1及びβ7と組合せを作るα4鎖を含んでいる［Sonnenberg, A.,前出］。α4β1の組合せは、多数の循環白血球（例えば、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球）上で生じるが、循環好中球上には存在しないか又は低レベルでのみ存在する。α4β1は、炎症部位の内皮細胞上でしばしば上方調節されている接着分子（VCAM-1としても知られている血管細胞接着分子-1）に結合する［Osborne, L., Cell, 62, 3,(1990)］。この分子はまた、マトリックス分子のフィブロネクチンの少なくとも3箇所に結合することが示されている［Humphries, M. J. et al, Ciba Foundation Symposium, 189, 177,(1995)］。動物モデルにおいてモノクロナール抗体を使用して得られたデータに基づき、α4β1と他の細胞及び細胞外マトリックス上のリガンドの間の相互作用は、白血球の移動及び活性化において重要な役割を演じていると考えられている［Yednock, T.A. et al,Nature, 356, 63,(1992); Podolsky, D.K. et al, J. Clin. Invest. 92, 372,(1993); Abraham, W.M. et al, J. Clin. Invest. 93, 776,(1994)］。

α4及びβ7の組合せにより生じるインテグリンは、LPAM-1と命名されている［Holzmann, B. and Weissman, I.L., EMBO J. 8, 1735,(1989)］。α4β7の組合せは、T及びBリンパ球のあるサブグループ上及び好酸球上で発現する［Erle, D.J. et al, J. Immunol. 153, 517 (1994)］。α4β1と同様に、α4β7は、VCAM-1及びフィブロネクチンに結合する。さらにα4β7は、胃腸粘膜のような粘膜組織への白血球のホーミングに関与すると考えられているMAdCAM-1と呼ばれる接着分子に結合する［Berlin, C. et al, Cell, 74,185,(1993)］。MAdCAM-1は、胃腸管に選択的に発現する。α4β7及びMAdCAM-1の間の相互作用は、粘膜組織外の炎症部位においても重要であると思われる［Yang, X.-D. et al, PNAS, 91, 12604,(1994)］。

α4β1及びα4β7がそのリガンドと結合する場合にα4β1及びα4β7によって認識されるペプチド配列の領域が、同定されている。α4β1はフィブロネクチン中のLDV, IDA又はREDVペプチド配列及びVCAM-1中のQIDSP配列を認識すると思われ［Humphries, M.J. et al,前出］、その一方、α4β7は、MAdCAM-1中のLDT配列を認識する［Birskin, M.J. et al, J. Immunol. 156,719,(1996)］。これ等の短いペプチド配列の修飾により設計されたこれらの相互作用に対する阻害物質についていくつかの報告がある［Cardarelli, P.M. et al, J. Biol. Chem., 269, 18668,(1994); Shorff, H.N. et al, Biorganic Med. Chem. Lett., 6, 2495,(1996); Vanderslice, P. et al, J. Immunol., 158, 1710,(1997)］。フィブロネクチン中のα4β1結合部位に由来する短いペプチド配列がトリニトロクロロベンゼンで感作したマウスにおける接触過敏性反応を阻害できることも報告されている［Ferguson, T.A., et al, PNAS, 88, 8072,(1991)］。

インテグリンのアルファ4サブグループは主に白血球上に発現するので、その阻害は多くの免疫性又は炎症性の病態において有益であることが期待される。しかし、インテグリンファミリーの他のメンバーは至るところに分布し、それらにより実行される機能は広範囲に及ぶので、アルファ4サブグループの選択的阻害物質を同定できることが重要である。

我々は今回、α4インテグリンの有効で選択的な阻害物質である多数のエステルを見出した。この化合物は、例えば本明細書で記述するような細胞アッセイにおいて、通常他のサブグループのαインテグリンに対して阻害作用を有しないか又は極わずかしか示さない濃度でα4β1及び/又はα4β7などのα4インテグリンを阻害することができる。

即ち、本発明の一態様によれば、式（1）の化合物：

並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシドが提供される。

式（1）の化合物は、エナンチオマー又はジアステレオマーとして存在できることが理解されるであろう。本発明は、ラセミ化合物を含む、そのようなエナンチオマー、ジアステレオマー及びそれらの混合物の全てに及ぶ。式（1）は、特に記述しない限り、個別の異性体及びその混合物の全てを表すことを意図している。

本発明の化合物の塩は、医薬として受容しうる塩、例えば無機又は有機の酸から得られる酸付加塩を含む。

酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、アルキルスルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はイソチオン酸塩）、アリールスルホン酸塩（例えば、p-トルエンスルホン酸塩、ベシレート又はナプシレート）、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩及び安息香酸塩がある。

本発明による化合物の特に有用な塩は、医薬として受容しうる塩、特に医薬として受容しうる酸付加塩を含む。

本発明の化合物としては、
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸プロピル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2,2-ジメチルプロピル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-メトキシエチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-(2-メトキシエトキシ)エチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-(モルホリン-4-イル)エチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸テトラヒドロフラン-2-イルメチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
がある。

そして特に、
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-ヒドロキシエチル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシド；
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸イソプロピル並びにその塩、溶媒和物及びN-オキシドがある。

本発明による化合物は、α4インテグリンの有効で選択的な阻害物質である。この様式で作用する化合物の効能は、後に示す実施例に記述されている細胞アッセイのような試験を使用することにより簡単に測定することができる。

この化合物は細胞接着を調節するのに有用であり、特に白血球の血管外遊出が関与する炎症を含む病気又は障害の予防及び治療に有用である。本発明は、そのような使用及びそのような病気又は障害を治療するための薬剤を製造するためのその化合物の使用に及ぶ。

このタイプの病気又は障害には、慢性関節リュウマチのような炎症性関節炎、血管炎又は多彩皮膚筋炎、多発性硬化症、同種移植片拒絶反応、糖尿病、乾癬又は皮膚炎のような炎症性皮膚病、喘息及び炎症性腸疾患が含まれる。

病気の予防又は治療のために、本発明による化合物を医薬組成物として投与することができ、本発明の別の態様によれば、1又はそれ以上の医薬として受容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に式（1）の化合物を含有する医薬組成物が提供される。

本発明による医薬組成物は、経口、口腔、非経口、鼻腔、局所又は直腸投与に適した形態或いは吸入又は吹入（insufflation）による投与に適した形態をとることができる。

経口投与用において、医薬組成物は、例えば、結着剤（例えば、ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはグリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬として受容し得る賦形剤を使用して通常の手段により調製される、錠剤、トローチ又はカプセルの形態を取ることができる。錠剤は当技術分野においてよく知られている方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁剤の形態をとることができるし、或いは使用前に水又はそのほかの適当な基剤と共に構成させるための乾燥製品として提供することもできる。このような液体製剤は、医薬として受容しうる添加物、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性基剤及び保存剤と共に通常の手段により調製することができる。製剤は適宜、緩衝性塩、矯臭剤、着色及び甘味剤を含ませることもできる。

経口投与用の製剤は、活性化合物を制御放出するように適切に製剤化することができる。

口腔投与用において、本発明の組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤又はトローチの形態をとることができる。

式（1）の化合物は、例えば、ボーラス注射又は注入などの注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、例えば、硝子アンプルなどの単位投与量の形態、或いは例えば、硝子バイアルなどの複数回投与容器に入れて提供することができる。注射用の組成物は、油性又は水性の基剤中における懸濁液、溶液又は乳液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、保存剤及び/又は分散剤のような製剤用物質を含むことができる。そのほかに、活性成分を、使用前に適当な基剤、例えば、発熱物質を含まない滅菌水と共に構成させるための粉末形態にすることもできる。

上記の製剤に加えて、式（1）の化合物はデポー製剤として製剤化することができる。そのような持続作用型製剤は、埋め込み又は筋肉内注射により投与することができる。

鼻腔投与用又は吸入による投与用には、本発明に従って使用する化合物を、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロローフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適当なガス若しくはガスの混合物などの適当な高圧ガスを使用して、加圧容器やネブライザーによるエアロゾル噴霧形態として供給するのが便利である。

望むならば、本発明の組成物は、活性成分を含有する単位投与量の1または複数を含む包装またはディスペンサーに入れて提供することができる。その包装またはディスペンサーには、投与の指示書を添付することができる。

個々の病気の予防または治療に必要な本発明の化合物の量は、選択した化合物、及び治療すべき患者の状態により異なるであろう。しかし、一般的には、経口または口腔投与における1日投与量は、約100 ng/kgから100 mg/kg、例えば、約0.01 mg/kgから40 mg/kg体重の範囲であり、非経口投与では約10 ng/kgから50 mg/kg体重の範囲であり、鼻腔投与または吸入若しくは吹入による投与では約0.05 mgから約1000 mg、例えば、約0.5 mgから約1000 mgの範囲である。

式（1）のエステルは、後記の実施例に記述されている方法により調製することができる。一般的にこの方法は、酸触媒、例えば、p-トルエンスルホン酸の存在下に式R1OHのアルコールと反応させるような当業者に既知の標準的方法を使用する、式（2）の中間体酸：

のエステル化を含んでいる。そのほかには、縮合剤、例えば1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド又はN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなジイミドを使用することができ、N-ヒドロキシ化合物（例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールのようなN-ヒドロキシトリアゾール）などの触媒の存在下で使用することが有利である。

式（2）の中間体は、後記の実施例に記述する方法を使用して調製することができる。

そのほかに式（1）のエステルは、好ましくは酸触媒の存在下にエステル交換を行って、式（1）の別のエステルを得ることができる。

式（1）のエステルは式（3）のアミン：

と式（4）の活性化した酸：

のカップリングによっても調製することができる。

式（4）の酸は、例えば、後記の実施例に記述されているような当業者に既知の標準的方法を使用して、酸クロリドに変換することにより活性化することができる。カップリング反応は、ヒドリド（例えば、ナトリウムヒドリド）又はアミン（例えば、トリエチルアミン又はN-メチルモルホリン）のような塩基の存在下に、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン又は四塩化炭素）のような溶媒中或いはアミド（例えばジメチルホルムアミド）又はエーテル（例えばテトラヒドロフランのような環状エーテル）のような双極性非プロトン性溶媒中において、例えば室温において行うことができる。そのほかには、縮合剤、例えば1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド又はN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなジイミドを使用することにより、式（4）の酸を式（3）のアミンに直接カップリングすることができ、N-ヒドロキシ化合物（例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのN-ヒドロキシトリアゾール）などの触媒の存在下に行うことが有利である。そのほかには、所望のアシル化反応に先立って、酸をクロロ蟻酸エステル、例えばクロロ蟻酸エチルと反応させることができる。

式（3）のアミンは下記スキームAに示す一般的ルートを使用して調製することができる。

このように、式（3）のアミンは、式（5）のニトロ化合物の還元により調製することができる。適当な条件は、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン）又はアルコール（例えば、メタノール又はエタノール）のような溶媒中で、金属触媒（例えば炭素のような支持体上のパラジウム）の存在下に、例えば水素を使用する、触媒的水素化を含むことができる。この反応は、大気圧において又は100 ps.iまでの圧において行うことができる。そのほかには、塩酸のような酸の存在下に、金属、例えば、錫又は鉄を使用する、化学的還元を使用することができる。

式（5）のニトロ化合物は、式（7）のシクロブタジエンと式（6）のアミンとの反応により調製することができる。この反応は不活性な溶媒又は溶媒の混合物、例えば芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン又はトルエン）などの炭化水素及び/又は1,2-ジクロロエタン、又はジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素中で、0℃から還流温度（reflux temperature）までの温度において行うことができる。必要な場合、例えば式（6）のアミンの塩を使用する場合には、ジイソプロピルエチルアミンのような有機塩基を加えることができる。

式（6）のアミンは、市販されている4-ニトロフェニルアラニンのエステル化など、当業者に既知の標準的方法を使用して調製することができる。

式（7）の中間体は、国際特許出願WO 02/068393に記述されている方法を使用して調製することができる。

さらに、式（1）の化合物のN-オキシドは、高い温度、例えば約70℃から80℃において、酢酸のような酸の存在下に、過酸化水素のような酸化剤を使用して、対応する窒素塩基の酸化によって調製することができるし、或いは室温で溶媒、例えば、ジクロロメタン中において、過酢酸などの過酸との反応により調製することができる。

式（1）の塩は、通常の方法を使用して、適当な溶媒又は溶媒の混合物、例えば、エーテル（例えば、ジエチルエーテル）又はアルコール（例えば、エタノール）などの有機溶媒中において、式（1）の化合物と適当な酸とを反応させることにより調製することができる。

式（1）の化合物の特定のエナンチオマーを得ることを望む場合には、エナンチオマーを分割する適当な従来の方法を使用して、対応するエナンチオマーの混合物から特定のエナンチオマーを製造することができる。

このようにして、例えばジアステレオマー誘導体（例えば、塩）は、式（1）のエナンチオマー（例えば、ラセミ化合物）と、適当なキラル化合物（例えば、キラル塩基）との混合物の反応により製造することができる。次いでジアステレオマーを、簡便な方法、例えば結晶化により分離し、ジアステレオマーが塩である場合には酸で処理することにより、所望のジアステレオマーを回収することができる。

その他の分割方法において、式（1）のラセミ化合物は、キラル高速液体クロマトグラフィーを使用して分離することができる。そのほかには、必要があれば、上記のプロセスの一つにおいて適当なキラル中間体を使用することにより特定のエナンチオマーを得ることができる。そのほかには、エナンチオマーに特異的な酵素による生物的転換反応、例えば、エステラーゼを使用するエステル加水分解を実施し、次いで反応しなかったエステル対掌体からエナンチオマーとして純粋な加水分解された酸のみを精製することにより特定のエナンチオマーを得ることができる。

本発明の特別な立体異性体を得たい場合には、中間体又は最終産物にもクロマトグラフィー、再結晶及びその他の従来の分離方法を使用することができる。

以下の実施例は本発明の化合物の調製法を説明するものである。温度は全て ℃である。以下の略語を使用する：
EtOAc - 酢酸エチル；
DCM - ジクロロメタン；
MeOH - メタノール；
HOAc - 酢酸；
EtOH - エタノール；
Me - メチル；
DMSO - ジメチルスルホキシド；
DMF - N,N-ジメチルホルムアミド；
THF - テトラヒドロフラン；
HOBT - 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
Et₃NHCl - 塩酸トリエチルアミン；
EDC - 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩。
NMRは全て300 MHz又は400 MHzのいずれかにおいて測定した。

中間体及び実施例は全てBeilstein Autonom (MDL Information Systems GmbH, Therdor-Heuss-Allee 108D 60486, Frankfurt, Germanyより入手可能)に従って命名されるか又は首尾一貫すると思われる名称が与えられている。

（中間体1）：3-シアノ-4-(2-(N,N-ジメチルアミノ)エチレン-1-イル)ピリジン
4-メチル-3-シアノピリジン［Ref:J. Prakt. Chem. 338, 663 (1996)に従って調製］（8.0 g, 67.8 mmol）及びN,N-ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（11.0 g, 74.8 mmol）の乾燥DMF（50 ml）中溶液を、2日間窒素下で140°で撹拌した。N,N-ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（5.0 g）を追加して140°で4時間撹拌した。揮発物を減圧下に除去し、得られた暗色油状物をEtOAc（300 ml）及び水（50 ml）に分配した。層を分離し、水層をEtOAc（3ｘ100 ml）で再抽出した。有機層を集めて食塩液（30 ml）で洗い、乾燥し（Na₂SO₄）、活性炭で処理し、濾過し、減圧下で蒸発させて淡橙色固体として本質的に純粋な表題化合物を得た（10.1 g, 85%）。

（中間体2）：1-ヒドロキシ-[2,7]-ナフチリジン塩酸塩
氷酢酸（50 ml）及び水（0.64 ml, 3.55 mmol）中の中間体1（6.2 g, 3.58 mmol）の撹拌溶液中にHClガスを1〜2分間吹き込んだ。この反応混合物を栓をしたフラスコ中40°で18時間撹拌した。減圧下に揮発物を除去して黒色残留物を得、これに水（3ｘ20 ml）を加えて、減圧下に再蒸発させた。得られた暗色半固体を40 mlの温エタノールで処理し、氷冷し、そして不溶の固体を濾過して集め、緑色固体として表題化合物を得た（5.2 g, 80%）。

（中間体3）：1-クロロ-[2,7]-ナフチリジン
中間体2（5.2 g, 28.5 mmol）を、オキシ塩化リン（75 ml）と共に110°で24時間撹拌した。揮発物を減圧下に除去して暗色油状物を得、これを氷浴で冷却した飽和NaHCO₃水溶液（20 gの固体NaHCO₃を含む100 ml）及びEtOAc（100 ml）の混合物中に注いだ。よく混合した後に層を分離し、水層をEtOAc（2ｘ75 ml）で再抽出した。合せた有機層を食塩液（15 ml）で洗い、乾燥し（Na₂SO₄）、そして減圧下で蒸発させて黄色固体として表題化合物を得た（4.0 g, 85%）。

（中間体4）：(2S)-2-アミノ-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸エチル
(S)-3-[4-アミノフェニル]-2-[t-ブトキシカルボニルアミノ]プロパン酸エチル（638 mg, 2.07 mmol）及び中間体3（310 mg, 1.88 mmol）のエトキシエタノール（2 ml）中溶液を、窒素下において120°で15分間及び100°で1時間撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、暗色残留物をEtOAc（70 ml）及び飽和NaHCO₃水溶液（10 ml）に分配した。層を分離し、水層をEtOAc（2ｘ30 ml）で再抽出した。合わせた有機層を食塩液（10 ml）で洗い、乾燥し（Na₂SO₄）、そして減圧下で蒸発させて暗色泡状物質を得た。クロマトグラフィー（SiO₂；5から10％MeOH/DCM）により(S)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]-2-[(t-ブトキシカルボニル)アミノ]プロパン酸エチル及び一部の表題化合物の混合物（730 mg）を得た。この混合物をトリフルオロ酢酸（5 ml）及びDCM（5 ml）の溶液で1時間室温において処理した。減圧下に揮発物質を除去し、残留物をEtOAc（75 ml）及び飽和NaHCO₃水溶液（20 ml）に分配した。層を分離し、水層をEtOAc（3ｘ30 ml）で再抽出した。合わせた抽出有機層を食塩液（10 ml）で洗い、乾燥し（Na₂SO₄）、そして減圧下に蒸発させて橙色固体を得た。クロマトグラフィー（SiO₂；10％MeOH/DCM）により麦わら色の固体として表題化合物を得た（420 mg, 2段階を通して60％）。

（中間体5）：(2S)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]-2-(3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)プロパン酸エチル
中間体4のエチルエステル（565 mg, 1.68 mmol）及び1-ケト-3-ヒドロキシスピロ[3,5]-ノン-2-エン［Wasserman, H.H et al J. Org. Chem., 38, 1451-1455 (1973)の方法に従って調製］（280 mg, 1.84 mmol）のDCM（20 ml）中の溶液を、24時間室温で撹拌した。減圧下に濃縮し、残留物をクロマトグラフィー（SiO₂,EtOAc）にかけ淡黄色粉末として表題化合物を得た（1.4 mmol, 73％）。

（中間体6）：(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノナ-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸エチル
中間体5（300 mg, 0.637 mmol）及びトリエチルアミン（1.2当量、100 μl）の0°のTHF（10 ml）中の撹拌溶液に、ブロムのDCM溶液（2％v/v, 2.1 ml, 1.2 当量）を滴下した。12時間後、反応液をDCM（50 ml）で希釈し、飽和NaHCO₃水溶液で連続的に洗い、乾燥し（MgSO₄）、濾過しそして減圧下で濃縮した。残留する泡状物を、ジイソプロピルエーテルで粉砕し、得られた固体を集め、減圧下に乾燥して淡黄色粉末として表題化合物を得た（0.45 mmol, 76％）。

（中間体7）：(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸
THF（5 ml）中の中間体6の化合物（219 mg, 0.40 mmol）に水（1 ml）中のLiOH・H₂O（19 mg, 0.44 mmol）を一度に加え、反応液を室温で2時間撹拌した。HOAc（氷酢酸、1 ml）を加えて反応を停止し、減圧下に揮発物を除去した。次いで残った泡状物質に水（10 ml）を加え、激しく撹拌し沈殿を生じさせた。次いで沈殿物を吸引濾過により集め、残留物を水（2ｘ5 ml）で洗った。減圧下に乾燥し白色粉末として表題化合物を得た（0.25 mmol, 64％）。

（実施例1）：(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-ヒドロキシエチル
DMF（3 ml）中の中間体7の酸（0.35 g, 0.67 mmol）の溶液に、EDC（0.15 g）、HOBT（0.09 g）,及びエチレングリコール（1 ml）を加えた。混合物を終夜室温で撹拌し、次いでEtOAc（20 ml）及び水（10 ml）に分配した。有機層を分離し、水（4ｘ10 ml）及び食塩液（10 ml）で洗い、乾燥し（Na₂SO₄）、濾過し、減圧下に濃縮して黄色泡状物質として粗生成物を得た。クロマトグラフィー（SiO₂,EtOAc）にかけて黄色固体として表題化合物を得た（0.25 g, 66％）。

（実施例2）：(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸イソプロピル
0〜5℃においてそのアルコール（100 ml）にアセチルクロリド（10 ml）を作用することにより予め調製したイソプロパノール中HClに、中間体7の固体酸（3.6 g, 6.9 mmol）を少量ずつ加えた。生じた溶液を室温（20〜25℃）に16時間放置し、LCにより反応完了をチェックし、次いで減圧下に乾固した。残留物をトリエチルアミン（15 g）を含有する酢酸イソプロピルに溶解し、1時間撹拌した。沈殿した固体（Et₃NHCl）を濾去し、溶液をシリカゲル（10 g）の存在下に蒸発させた。次いで予備吸着させた（pre-adsorbed）生成物をカラムクロマトグラフィー（SiO₂, 酢酸イソプロピル）により精製し、溶媒を除去後に黄緑色泡状物質として精製イソプロピルエステルを得た（3.0 g, 収率77.4％）。

以下の細胞アッセイは、本発明による化合物の効能及び選択性を実証するために使用することができる。これ等の検定のそれぞれにおいて、各試験化合物に対してIC₅₀値が決定される。IC₅₀値は、100％ = 試験化合物が存在しないときに測定された接着で、0％ = 細胞が入っていないウエルにおける吸光度とした場合の細胞接着の50％阻害を達成するのに必要な化合物の濃度を示す。

α4β1インテグリン-依存性のVCAM-IgへのJurkat細胞の接着
96ウエルNUNCプレートを、F(ab)₂フラグメントヤギ抗-ヒトIgG Fcγ-特異的抗体［Jackson Immuno Research 109-006-098:2 μg/ml 0.1 M NaHCO₃, pH 8.4の100 μl］で終夜4°でコーティングした。このプレートをリン酸緩衝食塩液（PBS）中で洗い（3ｘ）、次いで振とう機上で1時間室温でPBS/1％ BSA中においてブロックした。洗浄（PBS中3ｘ）後、PBS/1％ BSAで希釈した精製2d VCAM-Ig 9 ng/mlを加え、プレートを60分間室温で振とう機上においた。プレートを洗い（PBS中3ｘ）、次いで2.5ｘ10⁵Jurkat細胞を含む合計容量200 μl中において濃度を変えた試験化合物の存在下又は非存在下に37°で30分間アッセイを行った。

各プレートを培地で洗い（2ｘ）、接着細胞を10分間100 μlのメタノールで固定し、もう一度洗った。PBS中0.25％のRose Bengal（Sigma R4507）の100 μlを室温で5分間で加え、プレートをPBS中で洗った（3ｘ）。PBS中50％（v/v）エタノールの100 μlを加え、プレートを60分間放置した後に吸光度（570 nm）を測定した。

α4β7インテグリン-依存性のMAdCAM-IgへのJY細胞の接着
この検定は、2d VCAM-Igの代りにMAdCAM-Ig（150 ng/ml）を使用し、Jurkat細胞の代りにβ-リンパ芽球細胞系JYの亜系を使用したこと以外は、α4β1検定と同様にして行った。各試験化合物に対するIC₅₀値は、α4β1インテグリン検定で記述したようにして測定した。

α5β1インテグリン-依存性のフィブロネクチンへのK562細胞の接着
96ウエル組織培養プレートを、リン酸緩衝食塩液（PBS）中5μg/mlのヒト血漿フィブロネクチン（Sigma F0895）で、2時間37℃においてコーティングした。プレートを洗い（PBS中3ｘ）、次いで振とう機上で室温において100 μl PBS/1% BSA中で1時間ブロックした。ブロックしたプレートを洗い（PBS中3ｘ）、次いで2.5ｘ10⁵K562細胞、10 ng/mlのホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸を含有する全容量200 μl中において、濃度を変えた試験化合物の存在下又は非存在下に37℃で検定を行った。インキュベーション時間は30分間であった。各プレートを固定し、上記α4β1アッセイにおいて記述したようにして染色した。

αmβ2依存性のプラスチックへのヒト多形核好中球の接着
96ウエル組織培養プレートを、37℃において2時間RPMI 1640/10% FCSでコーティングした。新鮮単離ヒト静脈多形核好中球（PMN）の2ｘ10⁵個を、10 ng/mlのホルボール-12-ミリスチン酸-13-酢酸を含有する全容量200 μlの入ったウエル中に加え、試験化合物の存在下又は非存在下に、37℃で20分間次いで室温で30分間インキュベートした。プレートを培地で洗い、0.05 Mリン酸カリウム緩衝液、pH 6.0 中0.1％（w/v）HMB（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、Sigma H5882）100 μlを、各ウエルに加えた。次いでプレートを室温で60分間振とう機上においた。次いで内在性パーオキシダーゼ活性をテトラメチルベンジジン（TMB）を使用して以下のように検定した。即ち、PMN溶解検体を0.22％ H₂O₂（Sigma）及び0.1 M酢酸ナトリウム/クエン酸緩衝液、pH 6.0中の50 μg/ml TMB（Boehringer Mannheim）と混合し、630 nmにおいて吸光度を測定した。

αIIb/β3依存性のヒト血小板凝集
ヒト血小板凝集を、Chronolog Whole Blood Lumiaggregometerのインピーダンス凝集を使用して検定した。ヒト血小板リッチ血漿（PRP）は0.38％（v/v）クエン酸三ナトリウムで抗凝固化した新鮮ヒト静脈血を220ｘgにおいて10分間遠心分離することにより得、6ｘ10⁸/mlの細胞密度になるように自家血漿で希釈した。キュベットには等容量のPRP及び濾過したTyrode緩衝液（g/リットル：NaCl 8.0; MgCl₂.H₂0 0.427; CaCl₂ 0.2; KCl 0.2；D-グルコース 1.0 ;NaHCO₃ 1.0; NaHPO₄.2H₂O 0.065）を入れた。阻害物質の存在下又は非存在下に2.5 μM ADP（Sigma）を加えた後に凝集を測定した。

上記検定において、実施例の化合物のような本発明の化合物は、一般的にα4β1アッセイにおいて1 μM以下のIC₅₀値を有し、α4β7検定において5 μM以下のIC₅₀値を有する。

Claims

(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸2-ヒドロキシエチルである化合物。
(2S)-2-(2-ブロモ-3-オキソスピロ[3,5]ノン-1-エン-1-イルアミノ)-3-[4-([2,7]ナフチリジン-1-イルアミノ)フェニル]プロパン酸イソプロピルである化合物。