PL197770B1 - Zwierzę transgeniczne, transgen, znakowane epitopowo TBP, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, sposób charakteryzowania składu i wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, sposób identyfikowania czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF oraz przeciwciało - Google Patents

Abstract

1. Zwierz e transgeniczne inne ni z cz lowiek, znamienne tym, ze zawiera komórki z wprowa- dzonym do genomu tych komórek transgenem eksprymuj acym znakowane epitopami HA i His bia lko wiaz ace kaset e TATA (TBP). 4. Sposób wytwarzania zwierz ecia transgenicznego zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, ze (a) wprowadza si e transgen koduj acy znakowane epitopowo bia lko wiazace kaset e TATA (TBP) do komórek tego zwierz ecia oraz (b) wprowadza si e komórki z etapu (a) do komórek samicy biorcy. 7. Transgen koduj acy znakowane epitopami HA i His bia lko wi azace kaset e TATA (TBP), do wytwarzania zwierz ecia transgenicznego zdefiniowanego w zastrz. 1. 31. Sposób charakteryzowania sk ladu ró znych kompleksów transkrypcyjnych wy zszego rz edu, znamienny tym, ze a) transgen zdefiniowany w zastrz. 7 wprowadza si e do zwierz ecia, b) znakowa- ne epitopowo TBP wyodr ebnia si e z ró znych zwierz ecych tkanek i/lub typów komórek zwierz ecia, ewentualnie w ró znych stadiach cyklu rozwojowego zwierz ecia i c) okre sla si e sk lad kompleksów transkrypcyjnych wy zszego rz edu. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zwierzę transgeniczne, transgen, znakowane epitopowo TBP, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, sposób charakteryzowania składu i wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, sposób identyfikowania czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF oraz przeciwciało.

Centralnym wydarzeniem w regulacji transkrypcji genów eukariotycznych jest stopniowe formowanie się i aktywność kompleksu preinicjacyjnego. Jest to duży, składający się z wielu podjednostek kompleks, który jest niezbędny do poprawnego usytuowania i inicjacji enzymu polimerazy II RNA w miejscu startu transkrypcji. W ostatnich latach scharakteryzowano wiele ogólnych czynników transkrypcyjnych (GTF) w jądrze komórek eukariotycznych, w tym TF_HA, TF_nB, TF_nD, TF_nE, TF_nF i TF_hH (Zawel i Reinberg (1995) Ann. Rev. Biochem. 64, 533-5 61; Serizawa i inni (1994) w Transcription: Mechanlsms and regulation, 45-66, Raven press). W promotorach zawierających kasetę TATA TF_HD wykazuje specyficzne powinowactwo do sekwencji kasety TATA. Dzięki rozpoznawaniu tej sekwencji TF_hD jest pierwszym elementem wiążącym się z promotorem w podstawowej transkrypcji z udziałem polimerazy II RNA, a tym samym zapoczątkowującym tworzenie się kompleksu (Lewin, B. (1990) Cell 61: 1161-1164). Kolejne GTF wiążą się w zdefiniowany, stopniowy sposób, co w efekcie daje kompletny kompleks preinicjacyjny. Następnie ten duży kompleks włącza i właściwie umiejscawia polimerazę II RNA (Pol II) w miejscu startu transkrypcji, aby zainicjować podstawową transkrypcję. Stało się jasne, że TF_HD, sam będący kompleksem składającym się z wielu podjednostek, odgrywa kluczową rolę w regulacji „aktywowanej transkrypcji”, bardzo ogólnie zdefiniowanej jako wzrost poziomu produkcji mRNA w obecności aktywatorów transkrypcyjnych. Takie aktywatory mogą być naturalnie występującymi determinantami wiążącymi się ze wzmacniaczem, takimi jak USF wiążący się do kasety E (Sawadogo i Roeder (1985) Cell 43: 165-175; Kirschbaum i inni (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 5094-5100) lub czynnikami wirusowymi, jak VP16 (Stringer i inni (1990) Nature 345: 783-786).

TF_hD składa się z białka wiążącego TATA (TBP) i kilku związanych z TBP czynników (TAF_n). W niniejszym opisie określenie „TAF_N” obejmuje dowolny rodzaj czynnika transkrypcyjnego, aktywatora transkrypcji lub inhibitora transkrypcji. Dotychczas scharakteryzowano aż 20 różnych czynników TAFii i zaobserwowano kompleksy TF_nD zawierające różne kombinacje czynników TAF_n (Zawel i Reinberg (1995) Ann. Rev. Biochem. 64, 533-561; Hori, R. i Carey, M. (1994) Curr. Opinion Gen. Dev. 4: 236-244). Ponadto różne kombinacje czynników TAF_n nadają różne właściwości kompleksowi TF_nD. Na przykład u Drosophila wzór formowania białek Hunchback (HB) i Bicoid (BCD) jest całkowicie zależny od obecności czynników TAF_H110 i TAF_n250 w kompleksie TF_nD (Sauer, F. i inni Science 270, 1783-1788). Te składniki TF_nD służą jako koaktywatory poprzedzających białek HB i BCD związanych ze wzmacniaczem. Wykazano, iż neurogeniczny czynnik NTF-1 potrzebuje co najmniej kompleksu TBP, czynnika TAF_n250 (z którym się wiąże) i czynnika TAF_n250 dla aktywowanej transkrypcji, podczas gdy SP1 potrzebuje dla aktywacji dodatkowo czynnika TAF_n110 (Chen, J.-L. i inni (1994) Cell 79: 93-105). Inne badania pomogły zidentyfikować czynnik TAF_n28, którego obecność jest niezbędna do transkrypcyjnej aktywacji przez jądrowe receptory estrogenów i witaminy D3 (May, M. i inni 1996 EMBO 15: 3093-3104). Jest prawdopodobne, iż czynniki TAF_n służą jako transkrypcyjne adaptory, przekazujące informację regulatorową z czynników aktywujących/reprymujących do rdzeniowego kompleksu inicjacyjnego poprzez interakcje białko-białko.

W świetle obecnej wiedzy o regulowanej transkrypcji ekspresja pojedynczych genów i/lub małych grup blisko związanych loci jest kontrolowana przez określony zestaw podjednostek kompleksów transkrypcyjnych. Pomimo iż niektóre czynniki występują powszechnie i są obecne w większości wydarzeń transkrypcyjnych, jak np. GTF, opisuje się obecnie coraz większą liczbę genowo- i komórkowospecyficznych elementów regulowanej transkrypcji.

Istnieje kilka wypróbowanych sposobów stosowanych do identyfikowania czynników transkrypcyjnych. Wczesne strategie, które pozwoliły odkryć Poi II RNA i siedem GTF (TF_nA, TF_nB, TF_nD, TF_nE, TFiiF, TFiiH i TFiiJ), obejmowały głównie kolumnowe frakcjonowanie preparatów jądrowych z linii komórkowych (Zawel i Reinberg (1995); Serizawa i inni (1994); Roeder, R.G. (1996) TIBS 21: 327-335). Z frakcji tych otrzymywano częściowo oczyszczone białka o różnych poziomach zdolności transkrypcyjnej. Większość tych frakcji okazała się być absolutnie konieczna w podstawowej transkrypcji. Wiadomo było wówczas, iż frakcja TF_HD jest odpowiedzialna za rozpoznawanie kasety TATA. Jednakże próby izolacji pojedynczego białka o zdolności wiązania TATA zakończyły się niepowodzeniem. Przełom nastąpił gdy okazało się, że pojedynczy składnik drożdży jest zdolny do zastąpienia TF_nD w tePL 197 770 B1 stach rekonstytuowanej podstawowej transkrypcji, co doprowadziło do izolacji i sklonowania białka wiążącego TATA (TBP) o 27kD (Buratowski, S. i inni (1988) Nature 334: 37-42; Cavallini, B. i inni (1988) Proc. Nar. Acad. Sci. 86: 9803-9809) . Zastosowanie degenerowanych starterów doprowadziło do identyfikacji kolejnych genów podjednostki TBP ludzkiego (Kao, CC. i inni (1990) Science 248: 1646-1649; Hoffmann, A. i inni (1990) Nature 346: 387-390; Peterson, M.G. i inni (1990) Science 248: 1625-1630), z Drosophila (Hoey, T. i inni (1990) Cell 61: 1179-1186; Muhich, M.L. i inni (1990) Proc. Nat. Acad. Sci: 87, 9148-9152) i mysiego TF_HD (Tamura, T. i inni (1991) Nuc. Acids Res. 19: 3861-3865).

Dostępność cDNA dla TBP z różnych gatunków umożliwiła badania na szeroką skalę, włącznie z nadekspresją tych białek w hodowlach komórkowych. Wyprodukowano linie komórkowe HeLa, które eksprymują konstytutywnie białko TBP znakowane FLAG lub epitopem hemaglutyniny wirusa grypy (HA) dodanym do jego N-końca (Zhou, Q. i inni (1993) Genes & Development 7, 180-187; Chiang i inni (1993) EMBO 12, 2749-2762). Znacznik FLAG jest epitopem składającym się z syntetycznej sekwencji ośmiu aminokwasów. Znacznik HA jest naturalnym epitopem o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 1 „MGYPYDVPDYAV” (w kodzie jednoliterowym).

Zastosowano również krótszy peptyd z naturalnego znacznika HA (10 aminokwasów z hemaglutyniny wirusa grypy) do ekspresji białka fuzyjnego zawierającego TBP w linii komórek Drosophila (Colgan i Manley (1992), Genes Dev. 6, 304-331; Trivrdi i inni (1996) Mol. Cel. Biol. 16, 6909-6916).

Białka TBP z dwoma znacznikami epitopowymi, epitopami FLAG i HA, dołączonymi do ich N-końca, eksprymowano w bakteriach (Chiang i inni (1993) EMBO 12: 2749-2762). Białka TBP znakowane FLAG eksprymowano także pod kontrolą indukowalnego promotora (Wu i inni, (1996) Bio Techniques 21: 718-725). Przeciwciała monoklonalne przeciwko epitopowi/epitopom wykorzystano do oczyszczenia kompleksów związanych z TBP z ekstraktów jądrowych, a tym samym równoczesnego oczyszczenia czynników kompleksu TF_HD związanych z TBP (TAF_H) (Zhou, Q. i inni (1993) Genes Dev. 7, 180-187).

Badania w tych kierunkach są prowadzone w wielu laboratoriach, co ostatnio zaowocowało odkryciem i scharakteryzowaniem szeregu nowych czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF pochodzących z ekstraktów jądrowych HeLa i drożdży (Hori i Carey (1994) Curr. Op. Gen. Dev. 4: 236-244; Zawel i Reinberg (1995) Ann. Rev. Biochem. 64: 533-561; Roeder, R.G. (1996) Trends Biochem. Sci. 21,327-335).

U ludzi zidentyfikowano czynniki TAF_H68, TAF_H55, TAF_H30, TAF_H28, TAF_H20 i TAF_H18 (Mengus i inni (1995) EMBO 14: 1520-1531, Bertolotti i inni (1996) EMBO 15: 5022-5031; Wu i Chiang (1996) Biotechnigues 21: 718-725).

Należy jednak mocno podkreślić, iż, pomimo bogactwa czynników znalezionych za pomocą tych metod, badania są ograniczone do kompleksów transkrypcyjnych, czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF, które są specyficzne dla użytego typu linii komórkowej lub szczepu drożdży.

Obecnie opracowano bardziej uniwersalny system, w którym znaczone epitopem białko TBP jest stosowane do oczyszczania metodą powinowactwa nowych kompleksów transkrypcyjnych i czynników transkrypcyjnych, czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF, w kontekście całego zwierzęcia, a tym samym z wielu różnych tkanek eukariotycznych i typów komórek.

Wynalazek dotyczy zatem zwierzęcia transgenicznego innego niż człowiek, charakteryzującego się tym, że zawiera komórki z wprowadzonym do genomu tych komórek transgenem eksprymującym znakowane epitopami HA i His białko wiążące kasetę TATA (TBP).

Korzystnie białko stanowi białko fuzyjne zawierające ludzkie TBP (hTBP).

Korzystnie białko stanowi białko fuzyjne zawierające sekwencję o numerze identyfikacyjnym 16.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej, polegającego na tym, że (a) wprowadza się transgen kodujący znakowane epitopowo białko wiążące kasetę TATA (TBP) do komórek tego zwierzęcia oraz (b) wprowadza się komórki z etapu (a) do komórek samicy biorcy.

Korzystnie stosuje się mikroiniekcję transgenicznego DNA do zygoty zwierzęcia.

Korzystnie wprowadza się transgen kodujący znakowane epitopowo białko wiążące kasetę TATA (TBP) do komórki pnia embrionalnego blastocysty.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy transgenu kodującego znakowane epitopami HA i His białko wiążące kasetę TATA (TBP), do wytwarzania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej.

PL 197 770 B1

Korzystny jest transgen zawierający pierwszą sekwencję DNA kodującą TBP i drugą sekwencję DNA kodującą znaczniki epitopowe.

W szczególności sekwencją DNA kodującą TBP jest sekwencja cDNA, a zwłaszcza sekwencja cDNA ludzkiego TBP (hTBP).

Korzystny jest transgen, w którym epitop HA ma jedną z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, o numerze identyfikacyjnym 2, o numerze identyfikacyjnym 3 lub o numerze identyfikacyjnym 4.

Korzystny jest transgen zawierający sekwencję o numerze identyfikacyjnym 13.

Korzystny jest transgen zawierający DNA indukowalnego lub konstytutywnego promotora.

Korzystniejszy jest transgen, w którym promotorem jest promotor genu EF.

Korzystniejszy jest transgen, w którym promotorem jest promotor genu MT.

Korzystny jest transgen zawierający sekwencję o numerze identyfikacyjnym 14 lub 15.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania transgenu zdefiniowanego powyżej, polegającego na tym, że z sekwencją DNA kodującą białko TBP łączy się z sekwencją DNA kodującą znacznik epitopowy.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania transgenu zdefiniowanego powyżej do wytwarzania znakowanego epitopowo TBP.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej do eksprymowania znakowanego epitopowo TBP.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy znakowanego epitopowo TBP eksprymowanego w zwierzęciu transgenicznym zdefiniowanym powyżej.

Korzystnie TBP stanowi hTBP.

Korzystnie TBP jest połączone z epitopem HA i epitopem His.

Korzystnie epitop HA ma jedną z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, o numerze identyfikacyjnym 2, o numerze identyfikacyjnym 3 lub o numerze identyfikacyjnym 4.

Korzystne jest znakowane epitopowo TBP zawierające sekwencję o numerze identyfikacyjnym 16.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania znakowanego epitopowo TBP zdefiniowanego powyżej, polegającego na tym, że wprowadza się transgen zdefiniowany powyżej do komórek zwierzęcia.

Korzystnie wprowadza się transgen zawierający indukowalny promotor do zwierzęcia, po czym epitopowo znakowane TBP ulega ekspresji w zwierzęciu.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej do identyfikowania nowych i/lub specyficznych czynników TAF i/lub czynników oddziaływujących z TAF.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania znakowanego epitopowo TBP do wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu z transgenicznego zwierzęcia i do identyfikowania czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej do eksprymowania znakowanego epitopowo TBP.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy zastosowania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej do wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu z różnych tkanek i/lub typów komórek, ewentualnie w różnych stadiach cyklu rozwojowego zwierzęcia.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy sposobu charakteryzowania składu różnych kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, polegającego na tym, że a) transgen zdefiniowany powyżej wprowadza się do zwierzęcia, b) znakowane epitopowo TBP wyodrębnia się z różnych zwierzęcych tkanek i/lub typów komórek zwierzęcia, ewentualnie w różnych stadiach cyklu rozwojowego zwierzęcia i c) określa się skład kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania nowego i/lub specyficznego czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF, polegającego na tym, że a) transgen zdefiniowany powyżej wprowadza się do zwierzęcia, b) znakowane epitopowo TBP wyodrębnia się z określonej zwierzęcej tkanki i/lub określonego typu komórek zwierzęcia, ewentualnie w określonym stadium cyklu rozwojowego i c) czynnik TAF i/lub czynnik oddziaływujący z TAF zasocjowany ze znakowanym epitopowo TBP w kompleksie transkrypcyjnym wyższego rzędu dysocjuje się i oddziela.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy sposobu wyodrębniania różnych kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu ze zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego powyżej, polegającego na tym, że kompleks transkrypcyjny wyższego rzędu zasocjowany ze znakowanym epitopowo TBP współoczyszcza się metodą powinowactwa, przy czym znakowane epitopowo TBP oczyszcza się

PL 197 770 B1 metodą powinowactwa z zastosowaniem co najmniej jednego znacznika epitopowego dołączonego do TBP.

Korzystnie znakowane epitopowo TBP oczyszcza się przez wiązanie jego epitopu His w kolumrne z Np.

Korzystnie znakowane epitopowo TBP oczyszcza się przez wiązanie jego epitopu HA z przeciwciałami przeciw-HA.

Korzystnie kompleks transkrypcyjny wyższego rzędu wyodrębnia się metodą powinowactwa z użyciem kolumny z przeciwciałami rozpoznającymi epitop znakowanego epitopowo TBP z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 17.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy przeciwciała rozpoznającego epitop znakowanego epitopowo TBP z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 17.

Tak więc w zgodnie z wynalazkiem dostarcza się transgen kodujący znakowane epitopem TBP. Korzystnie transgen zawiera pierwszą sekwencję DNA kodującą jeden lub więcej znaczników epitopowych oraz zawiera drugą sekwencję DNA kodującą TBP. Transgen może zawierać jedną lub większą liczbę kolejnych sekwencji DNA kodujących znacznik(-i) epitopowe. Korzystnie DNA kodującym TBP jest cDNA. DNA kodujący TBP może być jakimkolwiek naturalnie występującym DNA, jego pochodną lub częścią. DNA, korzystnie cDNA, może pochodzić np. z eukariotów, w tym ptaków, płazów, gadów, drożdży, C. elegans, ssaków itd. Może zastosować np. DNA kodujący TBP lub jego część z gryzoni, owcy, psa, krowy, świni i naczelnych, człowieka. Korzystne jest zastosowanie ludzkiego TBP (hTBP)-cDNA. Stosuje się także dowolny DNA nie występujący naturalnie, np. pochodną cDNA z TBP. Pochodna DNA może mieć np. zmienioną sekwencję, np. zmutowaną lub zmodyfikowaną sekwencję i/lub może zawierać modyfikowane nukleotydy. Pochodną DNA może być także sól, korzystnie sól tolerowana fizjologicznie.

Transgen zawiera jedną lub większą liczbę sekwencji DNA kodujących jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub więcej znaczników epitopowych. Korzystnie transgen zawiera DNA kodujący dwa znaczniki epitopowe. DNA kodujący poszczególne znaczniki epitopowe może być umieszczony na 5'- i/lub 3'-końcu DNA kodującego TBP i/lub w dowolnym wygodnym miejscu wewnątrz sekwencji DNA kodującej TBP. DNA kodujący poszczególne znaczniki epitopowe może być oddzielony i/lub ułożony w sekwencjach tandemowych lub może sąsiadować bezpośrednio.

Jako znacznik epitopowy można zastosować dowolny naturalny lub syntetyczny peptyd. Każdy znacznik epitopowy jest eksprymowany jako białko fuzyjne z TBP; znacznik epitopowy może być np. dołączony bezpośrednio do TBP lub przez peptydowy odstępnik. Korzystnie znacznik epitopowy powinien stwarzać możliwość oczyszczania metodą powinowactwa TBP lub białka fuzyjnego oraz oczyszczania metodą powinowactwa białek związanych z TBP lub białkiem fuzyjnym, takich jak czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF. Ponadto znacznik epitopowy nie powinien niszczyć aktywności funkcjonalnej TBP przy ekspresji jako białko fuzyjne z TBP. Z tego też powodu korzystne jest używanie krótkich peptydów jako znaczników epitopowych. Mogą się one zawierać 1-50 lub więcej aminokwasów, a w szczególności stosuje się peptydy składające się z 5-15 aminokwasów. Nie ograniczającymi przykładami peptydów, które mogą być użyte jako znaczniki epitopowe, są epitop FLAG, epitop HA, sekwencja kilku histydyn (od 6 do 10 reszt histydyny lub więcej, korzystnie 6 reszt histydyny) (znacznik His), znacznik Myc (Stone i inni (1996) Nature 384: 129-134), znaczniki streptawidynowe i inne. Do tego celu można także zastosować krótsze peptydy naturalnych epitopów. Przykładowo zastosowanie epitopu HA obejmuje zastosowanie epitopów „MGYPYDVPDYA” (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2), „GYPYDVPDYA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3), „YPYDVPDYA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4) lub innych peptydów pochodzących od epitopu HA.

Zgodnie z wynalazkiem transgen zawiera cDNA ludzkiego TBP i dwie sekwencje DNA kodujące znacznik epitopowy. Korzystnie pierwsza sekwencja DNA koduje epitop HA, który może służyć jako epitop dla immunoreakcji, np. z dostępnym w handlu przeciwciałem monoklonalnym (Kołodziej i Young (1991) Meth. Enzym. 194: 508-519). W pozycji 3' względem sekwencji kodującej znacznik HA znajduje się sekwencja DNA kodująca odcinek składający się z 6 reszt histydyny (znacznik His). Znacznik His może tworzyć niekowalencyjny, odwracalny kompleks z jonami Ni²⁺. Przykładowo dostępny w handlu materiał kolumnowy do chromatografii powinowactwa zawierający agarozę z Ni2+ jest rutynowo wykorzystywany do oczyszczania białek ze znacznikiem His (Hochuli, E. i inni (1987) J. Chromatography 411: 177-184; Janknecht, R. i inni (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 4835). Zgodnie ze szczególną postacią wynalazku transgen zawiera sekwencję DNA o numerze identyfikacyjnym 13.

PL 197 770 B1

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13 dostarcza transgenu kodującego białko fuzyjne składające się z podwójnie znakowanego hTBP.

Zgodnie z wynalazkiem dostarcza się transgen kodujący białko TBP znakowane epitopem i zawierający promotor do ekspresji białka fuzyjnego. Transgen może zawierać jedną lub więcej sekwencji regulatorowych genu oprócz DNA kodującego TBP (np. cDNA dla TBP lub jego pochodną) oraz jedną lub większą liczbę sekwencji DNA kodujących znaczniki epitopowe. Takimi sekwencjami regulatorowymi genu są np. naturalne lub syntetyczne promotory lub ich części i/lub cis-działające elementy (np. wzmacniacz, wyciszacz). W celu można zastosować promotory ssacze, np. promotory mysiego genu transferryny, promotory genu enolazy neuronospecyficznej (NSE) (Forss-Peter, S. i inni (1990) Neuron 5: 187-197) lub promotory genu kinazy tymidynowej. Można także zastosować promotory wirusowe, jak np. promotory genów cytomegalowirusa lub wczesny gen SV 40. Korzystne jest zastosowanie indukowalnych lub konstytutywnych promotorów lub ich pochodnych. Jako konstytutywny promotor można zastosować promotor genu ludzkiego czynnika elongacji-1 alfa (EF) (Uetsuki, T. i inni (1989) J. Biol. Chem. 264: 5791-5798). Jako indukowalny promotor można zastosować np. promotor genu metalotioniny (MT), który zawiera szereg elementów cis reagujących na metale ciężkie (Palmiter, R.D. (1987) Experimentia Supplementum 52: 63-80, Birkhauser Verlag). Ponadto można w tym celu zastosować promotor genu eksprymowanego, np. specyficzny dla cyklu komórkowego, rodzaju komórki czy rozwoju.

Zgodnie z wynalazkiem transgen zawiera cDNA hTBP i sekwencje DNA kodujące epitop HA (np. 9 aminokwasów naturalnego epitopu HA) i epitop His (np. znacznik 6xHis) oraz konstytutywny promotor. Przykładowo ekspresja TBP jest kontrolowana przez promotor ludzkiego czynnika elongacji1 alfa (EF) (Uetsuki, T. i inni (1989) J. Biol. Chem. 264: 5791-5798). Promotor EF jest promotorem nie zawierającym TATA, zastosowanym do ekspresji transgenów u myszy na średnim, ale stałym poziomie (Hanaoka, K. i inni (1991) Differentiation, 183-189). W szczególności transgen zawiera sekwencję DNA kodującą podwójnie znakowane (epitopy HA i His) hTBP i sekwencję promotora EF, a w szczególności transgen zawiera sekwencję DNA o numerze identyfikacyjnym 14.

Zgodnie z wynalazkiem transgen zawiera DNA kodujący TBP, korzystnie cDNA hTBP, oraz sekwencje DNA kodujące epitop HA (np. 9 aminokwasów naturalnego epitopu HA) i epitop His (np. 6xHis) oraz indukowalny promotor. Korzystnie indukowalny promotor jest promotorem metalotioniny (MT). Gdy np. wprowadzenie dodatkowej sekwencji kodującej TBP do genomu zwierzęcia i późniejsza ekspresja TBP lub białka fuzyjnego TBP jest toksyczna, ta postać wynalazku pozwoli zwierzęciu urodzić się z transgenem kodującym białko fuzyjne TBP pozostającym w spoczynku aż do wprowadzenia promotora. Promotor może być np. indukowany, gdy zwierzę jest w pełni dorosłe lub w jakimkolwiek interesującym stadium rozwojowym, np. w przypadku promotora MT przez wstrzyknięcie dootrzewnowe kationów dwuwartościowych, jak Zn²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ lub Cd²⁺. Jak to pokazano dla innych modeli, zachodzić będzie zwiększona ekspresja genu pod kontrolą MT (Palmiter, R.D. i inni (1982) Cell 29: 701-710). W szczególności transgen zawiera sekwencję DNA kodującą podwójnie znakowane hTBP (epitopy HA i HIS) i promotor MT, a w szczególności transgen zawiera sekwencję DNA o numerze identyfikacyjnym 15.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się transgen, który może być użyty np. do wytwarzania zrekombinowanego wektora.

Sposób wytwarzania zrekombinowanego wektora obejmuje integrację transgenu z odpowiednim wektorem, np. wektorem zawierającym sekwencje regulatorowe. Przykładowymi wektorami są wektory ekspresyjne i retrowirusy oraz ich pochodne.

Stosować można zrekombinowane wektory zawierające transgen, a zwłaszcza zrekombinowany wektor zawierający transgen (który np. zawiera cDNA TBP lub jego pochodną, w szczególności hTBP i sekwencje DNA kodujące znaczniki epitopowe, np. sekwencje DNA kodujące epitopy HA i His). Wektor stosuje się do wprowadzania transgenu do komórki eukariotycznej, w szczególności do wprowadzenia go do komórki ssaczej. Wektor zawierający taki transgen stosuje się ponadto do namnażania transgenicznego DNA w komórkach bakteryjnych lub eukariotycznych. Komórka eukariotyczna, do której został wprowadzany wektor zawierający transgen, może także być wykorzystana do heterologicznej/transgenicznej ekspresji transgenu. Komórka eukariotyczna (komórka gospodarza) może być częścią zwierzęcia transgenicznego.

W głównej postaci wynalazku transgen stosuje się do wytwarzania zwierzęcia transgenicznego. Zatem transgen lub zrekombinowany wektor zawierający transgen wprowadza się do komórki gospodarza i/lub do zwierzęcia. Zgodnie z wynalazkiem dostarcza się zwierzęta transgeniczne (inne niż

PL 197 770 B1 człowiek) wytworzone przez wprowadzenie transgenu do zwierzęcia lub jego komórki. Zwierzę transgeniczne według wynalazku ma zdolność ekspresji lub nadekspresji TBP albo białka fuzyjnego składającego się lub zawierającego znakowane epitopem TBP.

Do wytwarzania zwierzęcia transgenicznego używa się jako gospodarza zwierzęcia nie będącego człowiekiem. Do takich zwierząt należą takie kręgowce jak gryzonie, naczelne (inne niż człowiek), owce, kozy, psy, krowy, świnie, ptaki, płazy, gady itd. Korzystnie zwierzę wybiera się spośród ssaczych gatunków zwierząt (innych niż człowiek), korzystnie zwierząt z rodziny gryzoni, włącznie ze szczurem i myszą, a najkorzystniej myszy.

Zwierzę transgeniczne według wynalazku stanowi dowolne zwierzę, do genomu którego wprowadzono jedną lub większą liczbę kopii transgenu(-ów) kierujących ekspresją lub kodujących TBP lub jego pochodne, takie jak białka fuzyjne stanowiące lub zawierające TBP i znaczniki epitopowe. Zwierzę transgeniczne powinno mieć zdolność eksprymowania znaczonego epitopem białka TBP. Zwierzę transgeniczne może mieć transgenicznie przerwany lub zmieniony jeden lub większą liczbę endogennych genów TBP (zwierzę z nokautem).

Zwierzę transgeniczne według wynalazku jest zwierzęciem, do którego wprowadzono w nienaturalny sposób (tj. przez ludzką manipulację) jeden lub więcej genów TBP (transgenów według wynalazku) nie występujących naturalnie u tego zwierzęcia, np. obcy gen TBP lub jego pochodną, jak endogeniczny lub obcy gen TBP, który poddano przekształceniom metodami inżynierii genetycznej. Nie występujący naturalnie gen TBP nazywa się transgenem. Transgen może pochodzić z tego samego lub innego gatunku, co zwierzę, ale w żadnym przypadku transgen nie występuje naturalnie w zwierzęciu w konfiguracji i/lub w chromosomalnym locus właściwych transgenowi.

Transgen (transgeniczny DNA) może zawierać obcy gen kodujący TBP, to jest sekwencje normalnie nie występujące w genomie zwierzęcego gospodarza, jak gen TBP lub cDNA uzyskane z innego gatunku. Alternatywnie lub dodatkowo transgen może zawierać endogeniczny gen kodujący TBP, np. nienormalne sekwencje DNA przeorganizowane lub zmutowane in vitro aby zmienić normalnie występujący in vivo wzór ekspresji genu TPB, lub zmienić albo wyeliminować aktywność biologiczną endogennego TBP. Do wytworzenia zwierzęcia transgenicznego można również wykorzystać ekspresję wektorów zawierających transgen.

Zwierzę transgeniczne według wynalazku można wytworzyć przez wprowadzenie transgenu i/lub wektora, np. wektora ekspresyjnego zawierającego transgen, odpowiednio do linii zarodkowej lub komórki linii zarodkowej i/lub do komórki somatycznej zwierzęcia (innego niż człowiek). Do wprowadzenia transgenu według wynalazku można wykorzystać np. embrionalne komórki docelowe w różnych stadiach rozwoju. Można zastosować różne sposoby, zależnie od stopnia rozwoju embrionalnej(-ych) komórki(-ek) docelowej(-ych). Poniżej podano kilka przykładów.

1. Mikroiniekcja zygot jest sposobem wprowadzania transgenu do genomu zwierzęcia stanowiącym korzystny wariant realizacji wynalazku. Przy mikroiniekcji wyodrębnia się embriony w stadium jednokomórkowym. Zatem korzystną komórką docelową do mikroiniekcji transgenicznego DNA (DNA transgenu) jest zygota, zapłodnione jajo, które nie przeszło fuzji przedjądrzy lub następującego po niej podziału komórki. Mysie przedjądrze męskie osiąga średnicę około 20 ąm; jest to wielkość pozwalająca na powtarzalne wstrzyknięcie 1-2 pikolitrów roztworu zawierającego transgeniczny DNA. Zastosowanie zygoty do wprowadzenia transgenu ma także tę zaletę, że w większości przypadków wstrzykiwany transgeniczny DNA będzie wbudowywać się do genomu zwierzęcia-gospodarza przed pierwszym podziałem komórkowym (Brinster, i inni (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 4438-4442). W rezultacie wszystkie komórki powstałego w ten sposób zwierzęcia transgenicznego (zwierzęcia założyciela) stabilnie niosą wprowadzony transgen w określonym locus genetycznym, zwanym transgenicznym allelem. Transgeniczny allel dziedziczy się w sposób mendlowski: połowa potomstwa będącego wynikiem krzyżówki transgenicznego zwierzęcia ze zwierzęciem nietransgenicznym odziedziczy transgeniczny allel, zgodnie z prawem Mendla niezależnej segregacji cech.

Powszechnie stosowane procedury manipulacji embrionami i mikroiniekcji transgenicznego DNA opisane są dokładnie w „Transgenic Animal Technology - A Laboratory Handbook pod redakcją Carla A. Pinkerta, Academic Press, Inc. (1994).

2. Można także wykorzystać wirusową integrację do wprowadzenia transgenu według wynalazku do zwierzęcia. Rozwijające się embriony są hodowane in vitro do stadium rozwojowego znanego jako blastocysta. W tym czasie blastomery mogą zostać zainfekowane wektorami zawierającymi transgen (konstrukty transgeniczny DNA/DNA), w którym to celu można wykorzystać np. wektory wirusowe lub retrowirusowe (Jaenich, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 73: 1260-1264). Transfor8

PL 197 770 B1 macja lub infekcja blastomerów może zostać wzmocniona przez enzymatyczne usunięcie osłony przejrzystej (zona pellucida) (Hogan, i inni (1986), Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Jeżeli transgen wprowadzany jest do blastomerów przez wektory wirusowe, takie wektory wykazują zazwyczaj upośledzoną replikację, ale pozostają kompetentne dla integracji sekwencji transgenicznego DNA połączonych z sekwencjami wektora do genomu zwierzęcego gospodarza (Jahner i inni (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 6927-6931; Van der Putten i inni (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 6148-6152). Transfekcja jest łatwo i wydajnie osiągalna przez hodowlę blastomerów w pojedynczej warstwie komórek wytwarzających wektor zawierający transgen (Van der Putten i inni (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 6148-6152; Stewart i inni (1987) EMBO 6: 383-388).

Alternatywnie infekcję można przeprowadzić w późniejszym stadiach, takich jak blastocel (Jahner, D. i inni (1982) Nature 298: 623-628). W każdym przypadku większość transgenicznych zwierząt założycieli tworzy się przez integrację retro-wirusową lub wirusową tylko do określonej części komórek, które formują transgeniczne zwierzę założyciela. Ponadto wielokrotna (retro)wirusowa integracja może wystąpić w pojedynczym zwierzęciu założycielu, co spowoduje powstanie wielokrotnych transgenicznych alleli, które rozdzielają się w przyszłych pokoleniach potomstwa. Wprowadzenie transgenu do komórek linii zarodkowych takim sposobem jest możliwe, ale prawdopodobnie występuje z niską częstością (Jahner, D. i inni (1982) Nature 298: 623-628). Jednakże, kiedy raz transgen zostanie wprowadzony w taki sposób do komórek linii zarodkowych, może powstać potomstwo, w którym allel transgeniczny jest obecny we wszystkich komórkach zwierzęcia, tj. zarówno w komórkach somatycznych, jak i linii zarodkowych.

3. Komórki pnia embrionalnego (ES) mogą także służyć jako komórki docelowe do wprowadzenia transgenu według wynalazku do zwierząt. Komórki ES pozyskuje się z embrionów preimplantacyjnych, które mogą być hodowane in vitro (Evens, M.J. i inni (1981) Nature 292: 154-156; Bradley, M.O. i inni (1984) Nature 309: 255-258; Gossler, i inni (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 9065-9069; Robertson i inni (1986) Nature 322: 455-448; Robertson, E.J. w Teratocarcinomas and Embryonic Steam Cells: A Practical Approach, pod redakcją Robertson, E.J., IRL Press, Oxford (1987), strony 71-112). Komórki ES, które są dostępne w handlu (np. z Genome Systems, Inc., St. Louis, MO), mogą być transformowane jednym lub większą liczbą transgenów znanymi metodami (Lovell-Badge, R.H., w Teratocarcinomas and Embryonic Steam Cells: A Practical Approach, pod redakcją Robertson, E.J., IRL Press, Oxford (1987), strony 153-182). Transformowane komórki ES mogą być łączone ze zwierzęcą blastocystą, w wyniku czego komórki ES kolonizują embrion i wchodzą do linii zarodkowej powstałego w ten sposób zwierzęcia, które będzie chimerą (złożoną z komórek pochodzących od dwóch lub więcej zwierząt) (Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468-1474; Bradley, A., w Teratocarcinomas and Embryonic Steam Cells: A Practical Approach, pod redakcją Robertson, E.J., IRL Press, Oxford (1987), strony 113-151). Kiedy transgen zostanie wprowadzony w ten sposób do komórek linii zarodkowych, może być produkowane potomstwo, w którym allel transgeniczny jest obecny we wszystkich komórkach zwierzęcia, tj. w komórkach somatycznych i linii zarodkowych.

Bez względu na to, jako to się dzieje, początkowe wprowadzenie transgenu jest zdarzeniem niemendlowskim. Jednakże transgen według wynalazku może zostać stabilnie wbudowany do komórek linii zarodkowej i przekazany potomstwu transgenicznego zwierzęcia jako mendlowskie loci. Wbudowywanie do linii zarodkowej jest niezbędne do stworzenia zwierząt transgenicznych, które mogą przenosić informację genetyczną do swojego potomstwa w sposób zgodny z prawami Mendla, i zastosowania tych zwierząt transgenicznych jako wiecznych modeli zwierzęcych.

Inne techniki transgeniczne dają w efekcie mozaikowe zwierzęta transgeniczne, w których część komórek niesie transgen, a część nie. W mozaikowych zwierzętach transgenicznych, których komórki linii zarodkowych nie niosą transgenu, przekazanie transgenu potomstwu nie następuje. Niemniej jednak mozaikowe zwierzęta transgeniczne są zdolne do wykazywania cech fenotypowych związanych z transgenem i mogą być wykorzystane do oczyszczania metodami powinowactwa określonych kompleksów transkrypcyjnych, czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF. Wynalazek dotyczy mozaikowych zwierząt transgenicznych, które zawierają opisany transgen według wynalazku.

Wynalazek dotyczy także transgenicznie wprowadzonych mutacji, które zawierają allele nieważne („nokaut”), w których sekwencja DNA kodująca specyficzne gatunkowo TBP jest wydeletowana i/lub podstawiona przez genetycznie zmienioną sekwencję TBP (np. transgen według wynalazku) tego samego lub innego gatunku pod kontrolą jednego lub większej liczby wybranych promotorów/wzmacniaczy.

PL 197 770 B1

Wynalazek dotyczy zwierzęcia transgenicznego, do którego wprowadzono transgen zawierający DNA kodujący znakowane epitopami TBP, w razie potrzeby w kontekście konstytutywnego lub indukowalnego promotora. W szczególności wynalazek dotyczy zwierzęcia transgenicznego, do którego wprowadzono transgen zawierający DNA kodujący hTBP znakowany epitopami HA i His oraz sekwencję DNA promotora EF. Inna szczególna postać wynalazku to zwierzę transgeniczne, do którego wprowadzono transgen zawierający DNA kodujący hTBP znakowane epitopami HA i His i sekwencję DNA promotora MT. Zgodnie ze szczególną postacią wynalazku zwierzę transgeniczne zawiera transgen z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 13. Inne zwierzę transgeniczne według wynalazku zawiera transgen z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 14. Inne zwierzę transgeniczne według wynalazku zawiera transgen z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 15. W szczególności wynalazek dotyczy zwierzęcia transgenicznego zawierającego transgen stabilnie wbudowany do jego genomu, np. sekwencję DNA o numerze identyfikacyjnym 13, numerze 14 i/lub o numerze 15.

Potomstwo, które odziedziczyło transgen może zostać odróżnione od pozostałych zwierząt w miocie, które nie odziedziczyły transgenu, przez analizę materiału genetycznego z potomstwa, w celu stwierdzenia obecności biocząsteczek, które zawierają unikalne sekwencje odpowiadające sekwencjom transgenu lub kodujące transgen. Zatem np. płyny biologiczne zawierające polipeptydy (np. znakowane epitopowo TBP) unikalnie kodowane przez transgen według wynalazku mogą być przetestowane immunologicznie na obecność polipeptydu kodowanego przez transgen, np. TBP znakowanego epitopowo. Prostszym i bardziej wiarygodnym sposobem identyfikowania transgenicznego potomstwa jest otrzymanie próbek tkanek z końcowych odcinków zwierzęcia, np. ogona, i wykonanie analizy tych próbek na obecność sekwencji kwasu nukleinowego odpowiadających sekwencji DNA unikalnej jednej lub większej liczby części transgenu według wynalazku. Obecność takiej sekwencji kwasu nukleinowego można ustalić np. drogą analizy z zastosowaniem hybrydyzacji („Southern”, „Northern”) z sekwencjami DNA odpowiadającymi unikalnym częściom, analizę produktów reakcji PCR z zastoso-waniem sekwencji DNA w próbce jako substratów i oligonukleotydów wyprowadzonych z sekwencji DNA transgenu itd.

Zgodnie z wynalazkiem przeprowadza się testy, w których analizuje się pierwsze możliwe pokolenie zwierząt transgenicznych (G_o), jak i wszelkie kolejne pokolenia zwierząt transgenicznych (G₁, G2, G3, G4,...), albo zwierząt z linii zwierząt transgenicznych, na obecność transgenu, np. w standardowych reakcjach PCR. W tym celu genomowy DNA można wyekstrahować z tkanek zwierzęcych, np. z tkanki ogona, po potraktowaniu proteinazą K i RNAzą. W takich reakcjach PCR sekwencja starterów powinna odpowiadać częściom sekwencji transgenu, np. wewnątrz regionów promotorowych, jednego lub większej liczby regionów DNA kodujących znacznik(-i) epitopowy(-e) i/lub regionów DNA unikalnych dla określonego konstruktu TBP. W takich reakcjach PCR, np. u myszy, w około 25% poddanych iniekcji jaj można wykryć odpowiadający produkt PCR, to jest około 25% myszy daje pozytywne potomstwo.

Inną metodą zweryfikowania, czy zwierze niesie transgen, czy też nie, jest test na obecność transgenicznego mRNA w możliwie transgenicznych zwierzętach/transgenicznych liniach zwierzęcych. Początkowe testy można np. przeprowadzić z zastosowaniem analizy S1, która jest bardzo czuła na niskie poziomy mRNA (Berk, A.J. i Sharp, P.A. (1977) Cell 12, 721). W tym celu znakowane, antysensowne oligonukleotydy hybrydyzuje się z całkowitym RNA wyizolowanym z tkanki zwierzęcia. Następnie przez traktowanie nukleazą S1 trawi się wszystkie jednoniciowe kwasy nukleinowe, DNA i RNA. Dwuniciowe DNA lub hybrydy DNA-RNA pozostają nienaruszone. Jeżeli jakikolwiek transgeniczny mRNA jest obecny, hybrydyzuje on z antysensownym oligonukleotydem, co „chroni” go przed strawieniem nukleazą S1.

Zgodnie z wynalazkiem obecność transgenicznego mRNA jest wykrywana w preparatach tkankowych, np. preparatach całkowitego mRNA z wątroby w testach z ochroną przed S1. Można zsyntetyzować antysensowne oligonukleotydy, komplementarne z częścią transgenicznego mRNA (np. mRNA odpowiadającego sekwencji DNA TBP znakowanego epitopowo). Oligonukleotydy są znakowane, np. na 5' końcu, np. radioaktywnie z zastosowaniem S, P, P, H lub C, albo markerami fluorescencyjnymi lub innymi markerami, jak biotyna lub digoksygenina. Znakowane oligonukleotydy miesza się z mRNA transgenicznych myszy w selektywnych warunkach hybrydyzacji, według standardowych procedur (Sambrook i inni, 1989). Mieszanina jest następnie traktowana nukleazą S1. Krótki region nie pasujący do sekwencji, np. na końcu 3' oligonukleotydu, powinien być zawsze strawiony, tak aby zapewniał on wewnętrzną kontrolę w celu wykazania, iż nukleaza S1 rzeczywiście trawi wszystkie jednoniciowe kwasy nukleinowe. W obecności transgenicznego mRNA znakowany oligonukleotyd

PL 197 770 B1 powinien być chroniony przed trawieniem, a jego obecność oraz wielkość może zostać łatwo określona przez np. elektroforezę typu sekwencyjnego w warunkach denaturujących (np. w 8M moczniku PAGE). Obecność nie strawionych, znakowanych oligonukleotydów, można wykryć np. przez wystawienie kliszy na działanie żelu. Brak transgenicznego mRNA objawi się brakiem prążków, ponieważ nie chroniony oligonukleotyd będzie trawiony przez nukleazę S1. Wynalazek umożliwia testowanie na obecność transgenicznego mRNA różnych tkanek i komórek różnych typów otrzymanych ze zwierząt.

Zwierzęta transgeniczne można testować metodą Northern. Najkorzystniej zwierzęta transgeniczne, które zaklasyfikowano jako pozytywne pod względem obecności transgenicznego mRNA na podstawie PCR lub mapowania nukleazą S1, poddaje się dalszym testom metodą Northern (McMaster, G.K. i Carmichael (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 4835). W tym celu można wyizolować całkowity RNA z różnych tkanek i/lub typów komórek oraz rozdzielić go według wielkości np. metodą elektroforezy w żelu agarozowym w warunkach denaturujących. RNA można następnie związać na błonie lub filtrze z zastosowaniem np. transferu kapilarnego i usieciować za pomocą UV. Związany RNA można przebadać w typowych warunkach hybrydyzacji Northern ze znakowaną sondą odpowiadającą regionowi kodującemu transgenu lub jego części, np. z sondą DNA odpowiadającą końcowi 5' transgenu zgodnie z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 13. Korzystnie takie sondy DNA mają długość od około 20 do 1000 par zasad (bp). Najkorzystniej ich długość wynosi około 100, 200, 300, 400 i 500 bp. Jeżeli jest to konieczne, nadmiar znakowanej sondy wymywa się i kliszę wystawia się na działanie błony. Sondy mogą być znakowane tak jak opisano wyżej w przypadku oligonukleotydów. W tych doświadczeniach z użyciem technik hybrydyzacji typu Northern można także czasem stosować oligonukleotydy.

Zwierzę transgeniczne, korzystnie zwierzę, które zweryfikowano jako transgeniczne w jakimkolwiek innym teście z dziedziny biologii molekularnej, poddaje się badaniom na obecność transgenicznego białka TBP na drodze specyficznych reakcji immunologicznych, np. metodą hybrydyzacji typu Western lub w teście ELISA. Zatem z tkanek lub określonych komórek zwierząt, korzystnie z tkanki wątrobowej lub jakiejkolwiek innej tkanki miękkiej, wydziela się jądra typowymi sposobami, np. na sacharozie z gradientem uzyskanym w wyniku ultrawirowania. Z takich jąder można zebrać całkowite białko jądrowe, np. przez obróbkę jąder w warunkach o dużym stężeniu soli (np. 400 mM KCl) i w obecności niejonowego detergenta (np. NP-40). Następnie białka jądrowe można rozdziellć pod względem wielkości przez zastosowanie np. odpowiedniej elektroforezy w żelu denaturującym, korzystnie SDS-PAGE. Takie żele mogą być transferowane np. na drodze elektrotransferu na stałą powierzchnię, np. na błonę lub filtr, korzystnie na błonę nitrocelulozową. Błony lub filtry można następnie wstępnie zablokować i sondować z zastosowaniem odpowiednich przeciwciał zgodnie z typowymi metodami (Sambrook i inni „Molecular Cloning’ wydanie drugie (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Do takich celów można zastosować przeciwciała poliklonalne i/lub monoklonalne, np. wytwarzane w myszy, króliku, szczurze, owcy, kozie, koniu, ptakach itp. Detekcję można prowadzić bezpośrednio przy pomocy rozpoznających białko fuzyjne TBP przeciwciał, które mają dołączony enzym lub marker, np. alkaliczną fosfatazę lub marker fluorescencyjny, biotynę lub didoksygeninę, albo są znakowane radioaktywnie. Detekcję można także przeprowadzić pośrednio przez zastosowanie drugiego przeciwciała rozpoznającego konserwowany region pierwszego przeciwciała, np. gdy pierwsze przeciwciało jest wytworzone w myszy, drugie przeciwciało musi być przeciwciałem przeciw-mysim, wytwarzanym np. w owcy. Takie drugie przeciwciało może być również połączone z enzymem lub innym markerem w celu wykrycia.

Wynalazek dotyczy również zastosowania transgenu lub jego części lub kodowanego białka fuzyjnego lub jego części, do wytwarzania przeciwciał wiążących znakowane epitopowo TBP kodowane przez transgen, np. do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych.

Przeciwciała według wynalazku są przeciwciałami rozpoznającymi jeden lub więcej epitopów białka fuzyjnego TBP. Takie przeciwciała mogą być skierowane przeciwko jednemu lub większej liczbie pojedynczych epitopów, należących do TBP i/lub mogą być skierowane przeciwko jednemu lub większej liczbie znaczników epitopowych. Jednym z przeciwciał według wynalazku jest przeciwciało rozpoznające N-końcowy region białka fuzyjnego TBP. Innym przeciwciałem według wynalazku jest przeciwciało rozpoznające region C-końcowy białka fuzyjnego TBP. Kolejnym przeciwciałem według wynalazku to przeciwciało rozpoznające epitop sąsiadujący z sekwencją aminokwasową, gdzie połączone są TBP i znacznik(-i) epitopowy(-e) i/lub gdzie połączone są dwa znaczniki epitopowe.

PL 197 770 B1

Przeciwciałem według wynalazku jest przeciwciało rozpoznające epitop białka fuzyjnego, składający się z hTBP i dwóch znaczników epitopowych. W szczególności przeciwciało rozpoznaje epitop białka fuzyjnego zawierający znaczniki His i HA oraz hTBP. Najkorzystniej przeciwciało rozpoznaje epitop(-y) na N-końcu TBP znakowanego HA i His. W szczególności przeciwciałem jest przeciwciało rozpoznające sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 16 lub epitop prawidłowo sfałdowanego białka fuzyjnego o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 16 lub jego część. Wynalazek dotyczy przeciwciała (przeciwciał przeciw-TBP), które rozpoznaje sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 17 lub jej prawidłowo sfałdowany epitop, korzystnie w kontekście białka fuzyjnego TBP.

Przeciwciała według wynalazku mogą być przeciwciałami poliklonalnymi lub monoklonalnymi. Przeciwciała mogą być wytwarzane we wszystkich gatunkach zwierząt, innych niż człowiek, korzystnie w myszy, szczurze, króliku, owcy, kozie, koniu lub ptakach (np. z ich jaj). Takie przeciwciała mogą być wytwarzane z zastosowaniem powszechnie stosowanych metod (Hurlow i Lane „Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Press). Przeciwciała można w razie potrzeby oczyszczać metodami powinowactwa z zastosowaniem pierwotnego peptydu immunizującego (epitopu). Szczególna postać wynalazku to przeciwciała poliklonalne produkowane w króliku, wytwarzane na drodze immunizacji królika peptydem o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 17 (np. połączonym z odpowiednim białkiem nośnikowym). Przeciwciało poliklonalne (przeciwciało przeciw-TBP) rozpoznaje białko fuzyjne hTBP (znaczniki HA i His).

Przeciwciało według wynalazku można zastosować w analizie typu „Western blot oraz w oczyszczaniu metodami powinowactwa białka fuzyjnego TBP i kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu związanych z białkiem fuzyjnym TBP. Kompleksy wyższego rzędu zawierają czynniki TAF związane z białkiem fuzyjnym TBP i czynniki oddziaływujące z TAF.

Wynalazek dotyczy zastosowania zwierząt transgenicznych. Zwierzę transgeniczne według wynalazku można zastosować do współoczyszczania metodami powinowactwa kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF z tkanek zwierząt transgenicznych i/lub hodowli komórkowych ze zwierząt transgenicznych. Takie kompleksy transkrypcyjne wyższego rzędu mogą być wyodrębniane i oczyszczone z różnych tkanek i/lub typów komórek. Korzystnie wykorzystuje się do tego celu preparaty jądrowe z takich tkanek/typów komórek, a najkorzystniej wykorzystuje się zhomogenizowane komórki, stosując powszechnie znane metody (Dignam i inni (1983) Nuc. Acids Res. 11: 1575; Lichtenstein i inni (1987) Cell 51: 963-973; Gorsky i inni (1986) Cell 47, 767-776). Jeżeli jest to konieczne, białka jądrowe mogą być następnie gromadzone powszechnie stosowanymi metodami. Zgodnie w wynalazkiem stosuje się również sposoby współoczyszczania metodami powinowactwa kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF ze zwierząt transgenicznych.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się np. oczyszczanie metodami powinowactwa kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF przez zastosowanie przeciwciał epitopowo-specyficznych lub materiałów naładowanych (dodatnio lub ujemnie). Dla tego celu można zastosować np. przeciwciała dokładnie opisane powyżej. Jednym z najkorzystniejszych sposobów współoczyszczania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, które zawierają TBP znakowane epitopowo epitopami HA i His, korzystnie hTBP, jest oczyszczanie metodami powinowactwa z zastosowaniem Ni²⁺ i/lub przeciwciał przeciw-HA (np. przeciwciał dostępnych w handlu) i/lub przeciwciał rozpoznających epitop zgodnie z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 17. Takie przeciwciała lub Ni można sprzęgać z odpowiednim materiałem w kolumnie, tak więc oczyszczanie metodą powinowactwa można wykonać z zastosowaniem np. kolumn z Ni2+ lub kolumn ze specyficznymi przeciwciałami, np. z przeciwciałami przeciw-HA lub przeciw-TBP.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się białko fuzyjne TBP, znakowane epitopowo TBP. Korzystnie białko fuzyjne TBP jest eksprymowane w zwierzęciu transgenicznym. W szczególności stosuje się białko fuzyjne hTBP. Białko fuzyjne TBP może być wyodrębnione i oczyszczone ze zwierzęcia transgenicznego. Jedno z białek stanowi białko TBP znakowane HA i His, w szczególności znakowane HA i His białko hTBP. Innym białkiem jest białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 16. Jeszcze innym białkiem jest białko fuzyjne TBP zawierające jedno lub więcej miejsc cięcia dla proteinazy/peptydazy, np. trombinowe miejsce cięcia. Korzystnie miejsca cięcia znajdują się w sekwencji aminokwasowej białka fuzyjnego pomiędzy znacznikiem(-ami) epitopowym(-i) i białkiem TBP.

PL 197 770 B1

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania białka fuzyjnego TBP, zgodnie z którym transgen według wynalazku eksprymuje się w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie pochodzącej ze zwierzęcia transgenicznego.

Transgeniczne mRNA i/lub białko fuzyjne kodowane przez transgen i/lub kompleksy transkrypcyjne wyższego rzędu związane z białkiem fuzyjnym TBP można wyodrębniać z różnych typów tkanek i/lub typów komórek znajdowanych w zwierzętach transgenicznych, np. z mózgu, serca, nerek, wątroby, płuc, układu nerwowego, mięśni, gruczołów, szpiku kostnego, komórek należących do układu immunologicznego, skóry itd.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się fuzyjne białko TBP, w szczególności do wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu ze zwierząt transgenicznych i do charakteryzacji wydzielonych kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu uzyskanych z różnych gatunków, z różnych tkanek i/lub różnych typów komórek. Zatem białko fuzyjne TBP i zwierzę transgeniczne, zgodnie z wynalazkiem, można stosować do wyodrębniania i charakteryzacji pojedynczych białek, takich jak czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF, które są związane w różnych kompleksach wyższego rzędu. Przykładowo białka zasocjowane w określonym kompleksie transkrypcyjnym wyższego rzędu mogą być poddane dysocjacji i rozdzielone tak, że możliwa będzie identyfikacja poszczególnych czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF. Skład czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF różni się przynajmniej w pewnym stopniu w różnych kompleksach wyższego rzędu, zależnie od typu tkanki i/lub typu komórki i/lub stadium rozwojowego i/lub eksprymowanego transgenu.

Czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF, w szczególności czynniki tkankowo specyficzne, które zostały już scharakteryzowane i dla których otrzymano przeciwciała, można szybko zidentyfikować i ocenić pod względem stopnia asocjacji z kompleksem transkrypcyjnym. Przykładem może być tu czynnik Bob-l/OCA-B, który, jak się uważa, jest tkankowo specyficznym koaktywatorem odpowiedzialnym za ograniczoną aktywację komórek B (Gstaiger, M. i inni (1996) EMBO 15, 2781-2790). Chociaż czynnik ten nie ma sam w sobie zdolności wiązania się z DNA i wymaga obecnych w prawie wszystkich tkankach czynników Oct, jednak występuje specyficznie tkankowo w komórkach B i ma zdolność do wywoływania w komórkach B aktywności transkrypcyjnej przez specyficzne oddziaływania białko-białko.

Ponadto można zidentyfikować nowe czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF, w szczególności specyficzne względem tkanki i/lub typu komórki i/lub (stadium) rozwoju i/lub cyklu komórkowego czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF, w kompleksach transkrypcyjnych wyższego rzędu. Jak wspomniano powyżej, istnieje wiele danych, które zdecydowanie sugerują iż wiele wiążących się ze wzmacniaczem czynników tkankowo specyficznych jest zdolnych do wywierania wpływu, tak że specyficzność tkankowa wywiera wpływ na aktywność transkrypcyjną genów. Zatem mogą zostać zidentyfikowane „unikalne” czynniki tkankowo specyficzne, komórkowo specyficzne, specyficzne względem cyklu komórkowego czy specyficzne względem stadium rozwojowego, które regulują specyficzną ekspresję genów.

Ten „uniwersalny” system transgeniczny oferuje ponadto potężne narzędzie do badania stopnia, w jakim czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF (np. koaktywatory) wiążą się z TBP i/lub czynnikami TAF i kompleksem transkrypcyjnym w wielu tkankach i typach komórek.

Wynalazek dotyczy również sposobu identyfikowania i charakteryzowania różnych kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, zgodnie z którym ze zwierzęcia transgenicznego wyodrębnia się znakowane epitopowo TBP, do którego przyłączone są kompleksy transkrypcyjne wyższego rzędu. Sposób charakteryzowania składu różnych kompleksów transkrypcyjnych może np. obejmować a) wprowadzenie transgenu według wynalazku do zwierzęcia (innego niż człowiek), b) wyodrębnienie znakowanego epitopowo TBP z różnych tkanek zwierzęcia i/lub różnych typów komórek zwierzęcia, ewentualnie w różnych stadiach rozwojowych zwierzęcia i c) ustalenie składu kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu.

Jednym ze sposobów wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu ze zwierzęcia transgenicznego jest oczyszczanie metodami powinowactwa z zastosowaniem co najmniej jednego z epitopów będących znacznikami TBP. Korzystnie podczas wyodrębniania znakowanego epitopowo TBP, kompleks transkrypcyjny wyższego rzędu i czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF związane w tym kompleksie współoczyszcza się. Przykładowo można wyizolować kompleks transkrypcyjny wyższego rzędu, gdy oczyszcza się znakowane epitopowo TBP przez związanie jednego z jego epitopów, korzystnie epitopu znacznikowego, z materiałem, z którym epitop wiąże się specy-ficznie. Materiałem takim może być kolumna z Ni²⁺ (wiążącym się z epitopem His) lub przeciwPL 197 770 B1 ciała, np. przeciwciała przeciw-HA (wiążące się z epitopem HA), albo przeciwciała wiążące się z epitopem znakowanego epitopowo TBP o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 17 lub jej części (np. epitopem o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 17).

Wynalazek dotyczy także sposobu identyfikowania nowego i/lub specyficznego czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF. Korzystnie kompleks transkrypcyjny wyższego rzędu wydziela się ze zwierzęcia transgenicznego według wynalazku. Taki sposób może np. obejmować a) wprowadzenie transgenu według wynalazku do zwierzęcia (innego niż człowiek), b) wydzielanie znakowanego epitopowo TBP z określonej tkanki zwierzęcia i/lub określonego typu komórek zwierzęcia, ewentualnie w określonym stadium rozwojowym zwierzęcia i c) przeprowadzenie dysocjacji i oddzielenie czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF, związanych ze znakowanym epitopowo TBP w kompleksie transkrypcyjnym wyższego rzędu i d) w razie potrzeby, określenie sekwencji aminokwasowej czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF.

Ponadto, potwierdzając znane już mechanizmy, model II transgeniczny wykazuje zalety w stosunku do obecnie stosowanych systemów hodowli komórkowych w wynajdywaniu i charakteryzacji nowych czynników TAF i nowych czynników związanych z TAF. Jak wspomniano powyżej, białka TAF, które współoczyszczano dotychczas metodami powinowactwa, pochodzą z badań nad komórkami HeLa i drożdżowymi. cDNA TAF zostały także znalezione u innych organizmów, ale dokonano tego czasochłonnymi metodami badań przesiewowych bibliotek. Fakt, iż model odnosi się do „całego organizmu”, czyni ten uniwersalny system transgeniczny szczególnie odpowiednim do rozpoznawania nowych, tkankowo specyficznych elementów aktywacyjnych przez pozostanie bardzo „blisko” przebiegającego faktycznie in vivo procesu transkrypcji.

Jest oczywiste, że takie zwierzę transgeniczne eksprymujące znakowane epitopowo TBP, np. mysz, może przyczynić się do rozwoju leków. Znacznym zainteresowaniem farmaceutów cieszą się wszelkie „unikalne”, specyficzne tkankowo, specyficzne względem typu komórki, specyficzne względem cyklu komórkowego lub specyficzne względem stadium rozwojowego czynniki (czynniki TAF, czynniki oddziaływujące z TAF) kompleksu transkrypcyjnego danego genu, szczególnie jeżeli ten gen jest związany z chorobą. Identyfikacja i charakteryzacja „kluczowych” czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF, które biorą udział w kontroli transkrypcyjnej jednego lub kilku genów związanych z chorobą, stanowi ważną strategię w opracowywaniu terapeutycznych związków łagodzących taką chorobę genetyczną. Gdy czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF zostaną scharakteryzowane i sklonowane, można będzie podjąć wiele różnych procedur przeszukiwania w celu zidentyfikowania cząsteczek/substancji, które reagują specyficznie z czynnikami TAF i czynnikami związanymi z TAF. Farmaceutycznie użyteczne cząsteczki/substancje będą wzmacniać lub osłabiać aktywność czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF in vitro i/lub in vivo, co pozwoli terapeutycznie oddziaływać na odnośny gen.

Zidentyfikowane czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF mogą być także wykorzystane jako narzędzia w biochemii i biologii molekularnej. Przykładowo białka ze zwierząt transgenicznych (innych niż człowiek) mogą być użyte jako sondy do wyodrębniania odpowiadających im ludzkich czynników TAF i czynników oddziaływujących z TAF lub ich cDNA. Ludzkie czynniki TAF i czynniki oddziaływujące z TAF mogą być także wykorzystane do badań przesiewowych wysoko specyficznych leków.

Wynalazek ilustrują bardziej szczegółowo poniższe przykłady, nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie zwierząt transgenicznych

Potencjalne źródła zwierząt:

Zwierzęta odpowiednie do doświadczeń transgenicznych uzyskano z normalnych źródeł handlowych, Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY) i The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). Myszy B6SJL/F1 użyto do otrzymania embrionów i transferu. Samce B6SJL/F1 mogą być wykorzystane do kojarzenia, a samce Swiss Webster z wyciętymi nasieniowodami można zastosować do stymulacji pseudo ciąży.

Myszy transgeniczne:

Sześciotygodniowe samice stymuluje się do nadmiernej owulacji przez wstrzyknięcie 5 IU (0,1 cm, dootrzewnowo) gonadotropiny z surowicy ciężarnej klaczy (PMSG; np. Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) i kolejne wstrzyknięcie po 48 godzinach 5 IU (0,1 cm, dootrzewnowo) ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG; np. Sigma). Samice umieszcza się razem z samcami zaraz po wstrzyknięciu hCG. Po 21 godzinach od podania hCG skojarzone samice są uśmiercane przez uduszenie za pomocą CO2 lub skręcenie szyi i embriony odzyskuje się z wyciętych jajowodów i umieszcza w po14

PL 197 770 B1 żywce M2 (np. Sigma). Otaczające komórki wzgórka usuwa się przy pomocy hialuronidazy (1 mg/ml). Embriony mające przedjądrza przemywa się i umieszcza w pożywce M16 (np. Sigma), a następnie umieszcza w inkubatorze w 37°C w wilgotnej atmosferze o składzie 5% CO2, O2 i 90% N2 aż do czasu wstrzyknięcia.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie konstruktów do transfekcji i mikroiniekcji

Klony DNA do mikroiniekcji pocięto odpowiednimi enzymami, klony DNA zwierające transgen MT-hTBP (podwójnie znakowany, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15) enzymami Cla I i BamHI, a zawierające transgen EF-hTBP (podwójnie znakowany, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14) enzymami Eco RI/Eco RI, po czym odpowiedniej długości fragmenty DNA poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym w buforze TBE (Sambrook i inni (1989)). Prążki DNA poddano wizualizacji przez barwienie bromkiem etydiowym, wycięto i umieszczono w workach dializacyjnych zawierających 0,3 M octan sodu, pH 7,0. DNA poddano elektroelucji do worków dializacyjnych, wyekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform (1:1) i strącono dwiema objętościami etanolu. DNA zawieszono w buforze TE (10 mM Tris, pH 7,4 i 1 mM EDTA) i oczyszczono na kolumnie DEAE sephacel (np. Pharmacia, Uppsala, Schweden). Kolumnę początkowo przemywano 0,5 ml buforu o dużym stężeniu soli (1,5 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, i 1 mM EDTA), a następnie 3 ml buforu o małym stężeniu soli (0,15 M NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, i 1 mM EDTA). Roztwory DNA nastawiono solą do 0,15M NaCl i przepuszczono przez kolumnę w celu związania DNA ze złożem w kolumnie. Po trzykrotnym przemyciu porcjami po 3 ml buforu o małym stężeniu soli wyeluowano DNA w równych frakcjach 4 x 0,3 ml buforu o dużym stężeniu soli i wytrącono dwiema objętościami etanolu. Frakcje połączono przez zawieszenie w 200 ąl buforu TE, wyekstrahowano jednokrotnie mieszaniną fenol:chloroform, wyekstrahowano dwukrotnie chloroformem, po czym DNA wytrącano etanolem przez noc. DNA zawieszono w buforze do mikroiniekcji TE (10 mM Tris pH 7,4, 0,1 mM EDTA) i stężenie DNA doprowadzono do 2 ng/μΙ, po czym przeprowadzono wizualizację przez elektroforezę na żelu agarozowym w obecności znanych wzorców DNA.

Mikroiniekcja

Transgeniczne DNA (MT-hTBP lub EF-hTBP) oczyszczone za pomocą DEAE doprowadzono w buforze do mikroiniekcji do stężenia 2 ng/μΙ. Mikroigły i pipety utrzymujące wyciągnięto w rozciągarce do mikropipet Flaming Brown, np. Model P87 (Sutter Inst. Co.). Pipety utrzymujące złamano następnie i rozgrzano w mikrokuźni typu deFonbrune (np. Technical Product Inst. Inc.). Pipety umieszczono w mikromanipulatorach (np. Leitz) dołączonych do mikroskopu Zeiss Axiovert® 135. Wypełnioną powietrzem pipetę iniekcyjną (np. Medical System Corp.) napełniono roztworem DNA przez końcówkę. Embriony w grupach po 40-50 umieszczono do mikromanipulacji w 200 ąl pożywki M2 pod olejem silikonowym. Embriony były zorientowane i utrzymywane przez pipetę utrzymującą, a następnie pipetę iniekcyjną umieszczono w przedjądrzu najbliższym pipecie iniekcyjnej. Iniekcję monitorowano na podstawie obrzmienia przedjądrza. Po iniekcji grupę embrionów umieszczono w pożywce M16 aż do transferu do samic biorców.

P r z y k ł a d 3. Transfer embrionów przez mikroiniekcję

Losowo cyklujące, dojrzałe samice myszy sparowano z pozbawionymi nasieniowodów samcami. W tym celu można zastosować szczep Swiss Webster lub inny porównywalny. Samice-biorczynie sparowano w tym samym czasie co samice-dawczynie. W czasie transferu samice-biorczynie uśpiono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,015 ml 2,5% awertyny/g masy ciała. Jajowody odsłonięte przez pojedyncze nacięcie grzbietu w linii środkowej ciała. Nacięcie wykonano przez bok ciała dokładnie nad jajowodami. Torebkę jajnikową rozdarto przy pomocy szczypczyków zegarmistrzowskich. Embriony, które miały zostać przeniesione, umieszczono w pożywce M16, a następnie w końcówce pipety transferowej (około 10-12 embrionów). Końcówkę pipety umieszczono w lejku i embriony przeniesiono. Po transferze nacięcie zamknięto dwoma szwami i skórę spięto klamrą. Następnie samice-biorczynie umieszczono na 2 godziny na ogrzewanej tacy w celu dojścia do siebie po zabiegu, a potem w klatce aż do porodu.

Do 469 embrionów z przedjądrzami wstrzyknięto MT-hTBP i uzyskano 170 młodych, a do 407 embrionów z przedjądrzami wstrzyknięto EF-hTBP i otrzymano 76 młodych.

P r z y k ł a d 4. Detekcja transgenicznego DNA w myszy założycielce

4a) Ekstrakcja DNA

Genomowy DNA myszy mogącej być założycielką wyekstrahowano z krótkiego fragmentu ogona (około 1 cm) obciętego 2-4 tygodniowym młodym. Fragmenty ogonów inkubowano przez noc w wytrząsarce w 500-750 ąl buforu do ogonów w 54°C (bufor do ogonów: 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM

PL 197 770 B1

NaCI, 10 mM EDTA, 0,5% SDS, 30 ng/ml Proteinazy K). Następnie do każdej próbki ogona dodano równą objętość mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1). Próbki delikatnie wytrząsano ręcznie lub miksowano automatycznie w aparacie Vortex przy niskiej nastawie. Próbki wirowano w wirówce laboratoryjnej przez 10 minut. Fazę wodną przeniesiono do probówki polipropylenowej o objętości 5 ml (np. probówka falcon®). Następnie stopniowo wkroplono równą objętość etanolu, aby umożliwić stopniowe wytrącanie się DNA. Następną objętość etanolu dodano normalnie, aby wymieszać zawartość probówki. Probówki odwrócono następnie kilkakrotnie, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Z kolei genomowy DNA nawinięto na płaską końcówkę pipety (końcówka do żeli sekwencyjnych) i przeniesiono do osobnych studzienek płytki do mikromiareczkowania. DNA wysuszono następnie na wolnym powietrzu przez 4 godziny. Dodano po 200 nl 1 x TE (1 x TE: 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA) do każdej próbki. DNA rozpuszczano przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wymieszano przez delikatne pipetowanie w górę i w dół. Płytki do mikro-miareczkowania często przechowywano w -20°C przed wykonaniem PCR. Przed wykonaniem PCR pobrano 10 nl i strawiono przy pomocy EcoRI (np. 10 nl DNA genomowego, 2 nl buforu do EcoRI 10x, 7 nl H₂O, 1 nl EcoRI; enzym i bufor z Boehringer-Mannheim, Mannheim, Niemcy).

4b) Reakcje PCR

Strawiony DNA genomowy rozcieńczono wodą w proporcji 1:3. Następnie próbki ogrzewano do 100°C na płytce grzejnej przez 10 minut. W reakcji PCR zastosowano 2 nl próbki. Reakcje przeprowadzano w 50 nl objętości, w tym 2 nl DNA genomowego, bufor do reakcji 1x, 1,5 mM MgCl, 0,8 nM starter oligonukleotydowy do reakcji do przodu, 0,8 nM starter oligonukleotydowy do reakcji powrotnej, 8 nl mieszaniny nukleotydów zawierającej 0,2 mM każdego nukleotydu (dATP, dCTP, dTTP i dGTP) i 2,5 jednostki polimerazy Taq. PCR wykonano przy pomocy np. enzymu AmpliTaq® i buforu z Perkin Elmer (Perkin Elmer Norwalk, Conneticut, USA).

Detekcję transgenu MT-hTBP wykonano stosując starter oligonukleotydowy do reakcji do przodu (starter sensowny) 5' GGAGCA ACC GCC TGC TGG GTG C 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) i starter oligonukleotydowy do reakcji powrotnej (starter antysensowny) 5' CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 6).

Detekcję transgenu EF-hTBP wykonano stosując starter oligonukleotydowy do reakcji do przodu 5' GGA GAG TGA AGT TAG GCC AGC 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7) i taki sam starter oligonukleotydowy do reakcji powrotnej jak w przypadku MT-hTB (5' CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG 3').

Cykle temperaturowe zostały ustawione przy pomocy automatycznego aparatu do cykli temperaturowych (np. ze Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Temperatury cykli były następujące:

cykl 1:	94°C 5 minut	60°C 3 minuty	72°C 2 minuty
cykl 2-25:	94°C 1 minuta	60°C 2 minuty	72°C 3 minuty
cykl 26:	94°C 1 minuta	60°C 2 minuty	72°C 5 minut
lub
cykle 1-40:	95°C 2 minuty	55°C 1 minuta	72°C 1 minuta

Obecność zamplifikowanego produktu stwierdzono wykonując standardową elektroforezę w żelu agarozowym (np. 1,2-1,5% agaroza) i wybarwienie żelu bromkiem etydiowym dla uwidocznienia DNA w świetle UV.

Pozytywne próbki MT-hTBP odróżniono na podstawie obecności fragmentu 580 bp zamplifikowanego DNA. Pozytywne próbki EF-hTBP dawały fragment 500bp zamplifikowanego DNA.

Analiza DNA ze 170 młodych na obecność MT-hTBP przy pomocy reakcji PCR wykazała iż 35 próbek genomowego DNA jest pozytywnych pod względem obecności transgenu. Analiza genomowego DNA z 76 młodych na obecność EF-hTBP przy pomocy reakcji PCR wykazała, iż 9 myszy zawierało transgen.

4d) Rozprzestrzenianie modelu transgenicznego

Założycieli (G_o) pozytywnych względem DNA skrzyżowano z nietransgenicznymi myszami B6SJL i powstałe w wyniku krzyżówek potomstwo przebadano przy pomocy PCR. Potomstwo G1 wykorzystano do kontynuowania hodowli i utrzymania pojedynczych linii do dalszych badań mRNA i białka.

P r z y k ł a d 5. Detekcja transgenicznego mRNA metodą ochrony przed nukleazą S1

5a) Materiały

PL 197 770 B1

Zsyntetyzowano oligonukleotydy (oligo) komplementarne do 5' końca i do 3' końca transgenicznego transkryptu:

Sekwencja 5'oligo (starter sensowny) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8):

5'GCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGACTG CGTAA TGCGGTCATGACGCTTT 3'

Sekwencja 3'oligo (starter antysensowny) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 9):

5'GAAGGGGGTGGGGGAGGCAAGGGTACATGAGAGCCATTACGTCGTCTTCCTGAA

TCCCT TTAGCCGCTTTGCTCG 3'

Podkreślone regiony są sekwencjami nie hybrydyzującymi.

Wyznakowano 40 ng oligonukleotydów na końcu 5' przy pomocy (³²P gamma) ATP (5000 cpm/mM) z zastosowaniem kinazy polinukleotydowej T4 i buforu np. z Boehringer-Mannheim (Mannheim). Reakcję przeprowadzano w objętości 50 μΙ w 30°C przez 1 godzinę. Wyznakowane oligonukleotydy oddzielono od nie wbudowanej ( P gamma)ATP, z zastosowaniem chromatografii z wykluczeniem wymiarów (n^p. Push-Cotomns®, ^Strato^gene, La JoNa, CA, ^USA).

5b) Indukcja promotora

Przed analizą RNA należało zaindukować myszy MT-hTBP, gdyż promotor jest aktywowany w obecności Zn2+. Myszom MT-hTBP wstrzyknięto śródotrzewnowo ZnSC4 w H₂O na 18 godzin i następnie na 4 godziny przed usunięciem wątroby (dawka 0,1 mg ZnSO4/10 g masy myszy).

5c) Ekstrakcja RNA

Całkowity RNA wyekstrahowano z 1 - 5 g tkanki przy pomocy dostępnego w handlu preparatu Trizol (np. Gibco-BRL, Paisly, UK). Tkankę zhomogenizowano przy pomocy Ultra-Turrax w 5 ml Trizolu w polipropylenowej probówce o pojemności 12 ml (np. probówka falcon®). Dodano 1 ml chloroformu, po czym probówki zamknięto i wytrząsano energicznie w ręku przez 15 sekund. Roztwory inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 min, następnie odwirowano przy 12 000 x g przez 15 minut w 4°C w wirówce Sorvall SS-34. Supernatant przeniesiono do nowej probówki, dodano 2,5 ml izopropanolu i wymieszano. Następnie prowadzono inkubację w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Próbki odwirowano przy 12000 x g przez 10 minut w 4°C. Supernatant usunięto i osad RNA przemyto 5 ml 75% etanolu. Próbki wymieszano i wirowano przy 7500 x g przez 10 minut. Osady RNA zawieszono w wodzie wolnej od RNAzy i wyznaczono ich stężenie na podstawie pomiaru absorbancji przy 260 nm.

5d) Ochrona przed nukleazą S1

Jednakowe ilości RNA (10-20 Liq) doprowadzono do 100 μl wodą wolną od RNAzy. Dodano 50000-150000 dpm znakowanych oligonukleotydów (0,1-1 ng, zależnie od wydajności znakowania). Mieszaninę RNA/oligonukleotydy wytrącono 0,3M octanem sodu i etanolem. Osad RNA/oligonukleotydy przemyto i wysuszono na wolnym powietrzu. Dodano 23 μl roztworu hybrydyzacyjnego (80% formamid, 10 mM PIPES pH 6,4 (Sambrook i inni (1989)), 1 mM EDTA, 0,05% SDS). Mieszaninę reakcyjną wymieszano i zdenaturowano w 65°C przez 20 minut, po czym dodano 2 μl 5M NaCl do każdej próbki w 65°C. Próbki inkubowano dodatkowo przez 1 godzinę w 65°C w łaźni wodnej, po czym nastawiono temperaturę łaźni na 37°C. Stopniowe obniżanie temperatury (przez noc) z 65°C do 37°C ułatwiało specyficzną hybrydyzację oligonukleotydy-mRNA. Następnego dnia dodano 300 μl buforu S1 do każdej próbki (bufor S1: 167U/ml nukleazy S1 (np. Gibco BRL, Paisly, UK), 0,3 M NaCl, 30 mM NaOAc (pH 4,5), 3 mM ZnSO4. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie dodano 1 ml etanolu (zimnego), aby wytrącić kwasy nukleinowe. Osad odwirowano i osuszono krótko w urządzeniu Speed-Vac. Następnie osad zawieszono w 12 μl buforu S1 do nakładania (85% formamid, 0,01% błękit bromofenolowy, 0,01% cyjanol ksylenowy, 1 x TBE). Próbki ogrzano do 70°C przez 5 minut przed nałożeniem i rozdziałem według wielkości przy pomocy denaturującej (6 M mocznik) elektroforezy na cienkim żelu. Przeprowadzono autoradiografię wysuszonego żelu w celu znalezienia chronionych, nie strawionych prążków.

Na 35 założycieli zawierających MT-hTBP, 7 wykazywało wykrywalny poziom mRNA w analizie ochrony metodą przed nukleazą S1. W przypadku EF-hTBP 3 założycieli wykazywało wykrywalny poziom mRNA w analizie S1.

P r z y k ł a d 6. Detekcja transgenicznego mRNA metodą hybrydyzacji typu Northern

6a) Synteza sondy hybrydyzacyjnej drogą amplifikacji TBP metodą PCR i znakowanie sondy TBP

Zaprojektowano i zsyntetyzowano oligonukleotydy/startery dla fragmentu podwójnie znakowanego konstruktu hTBP (498 bp).

PL 197 770 B1

Oligonukleotydy do reakcji do przodu zaczynały się 10 zasad w dół od miejsca startu „AUG” (miejsce ATG sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13). Sekwencja sensownego startera była następująca: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 10:

5' CCCTATGACGTCCCGGATTACG 3'.

Starter do reakcji powrotnej kończył się przy 507 bp w dół od miejsca startu „AUG” (miejsce ATG o numerze identyfikacyjnym 13). Sekwencja antysensownego startera była następująca: sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11:

5' GTGGAGTGGTGCCCGGCAAGGG 3'.

Reakcje PCR przeprowadzono w 0,2 μΙ pAG-17, 0,5 mM MgCh, 0,8 μΜ każdego ze starterów, ¹x ^bu^for ^do ^PCR (Perkin-^Elmer), ^0,2 mIM ^dATP dTTP, ^{dCTP dGTP i 2,5 U} enz^ymu Am^pliTaq® (^Perkin Elmer Norwalk, Conneticut, USA).

Program cykli temperaturowych cykle 1-35: 94°C 1 minuta 55°C 1 minuta 72° 1 minuta a następnie 10 minut w 72°C i przechowywanie w 4°C. Zamplifikowane prążki oczyszczono z 0,7% żelu agarozowego.

Sonda TBP-DNA została wyznakowana losowymi starterami i fragmentem Klenowa enzymu z zestawu do znakowania (zestaw do znakowania Megaprime®, Amersham, UK). 25-50 ng sondy DNA zmieszano z 5 μl losowego startera heksamerowego (np. Amersham) i 20 μl H₂O. DNA zdenaturowano w 100°C przez 5 minut. Do mieszaniny znakującej dodano do końcowej objętości 50 μ|, 1x bufor do reakcji, 1x dATP, 1x dTTP, 1x dGTP, 4 μl 3000 Ci/mmol alfa-³²P dCTP (np. Amersham) i 2U enzymu Klenowa. Reakcję przeprowadzano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Wyznakowane DNA oddzielono od nie wbudowanych nukleotydów metodą chromatografii z wykluczeniem wymiarów (np. Push Columns®).

6b) Elektroforeza na żelu i transfer

10-20 μg całkowitego RNA wytrącono etanolem, osad zdenaturowano w ciągu 10 minut w 65°C w buforze do ładowania RNA (65% formamid, 20% formaldehyd (37% roztwór), 1x bufor MOPS (Sambrook i inni (1989)), 5% gliceryny, 0,01% błękitu bromofenolowego, 0,01% cyjanolu ksylenowego, 0,1 mg/ml bromku etydiowego). RNA rozdzielono pod względem wielkości na 1% żelu agarozowym, zawierającym 18% formaldehydu (37% roztwór) i 1x buforu do elektroforezy MOPS (40 mM MOPS pH 7,0, 10 mM octan sodu, 1 mM EDTA). Elektroforezę przeprowadzono powoli przez noc przy 1 V/cm w 1x buforze do elektroforezy MOPS zawierającym 18% formaldehydu (37% roztwór). Żel poddano obróbce w 0,05M NaOH/1,5 M NaCl przez 30 minut, a następnie przez 20 minut w 0,5 M Tris (pH 7,4)/1,5 M NaCl. RNA przeniesiono na nylonową błonę (np. Hybond-N+, Amersham, UK) przy pomocy technik kapilarnych. Związany z błoną RNA utrwalono, np. przy pomocy UV z zastosowaniem Stratalinker® (^Stra^ta^gene^, La ^JoHa, CA ^usa).

6c) Hybrydyzacja i przemycie

Pre-hybrydyzację przeprowadzono np. w buforze „Rapid-Hyb” (Amersham, UK) w obrotowym piecyku hybrydyzacyjnym (np. Hybaid) w 65°C przez 1-2 godziny. Hybrydyzację przeprowadzono n^p. w ⁶-¹⁰ m^{l b}u^foru „^Ra^pid-^Hyb” zawtoraj^ące^go ¹⁰⁶ - ¹⁰ x ¹⁰⁶ c^pm zdenatorowanej sond^{y 65}°C przez 2-3 godziny. Błonę przemyto dwukrotnie w temperaturze pokojowej (10 minut/przemycie) w 2x SSC/0,1% SDS (1xSSC: 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodowy, pH 7,0). Następnie błonę przemyto dwukrotnie w 65°C (15 minut/przemycie) w 1x SSC/0,1% SDS. Kolejne dwa przemycia przeprowadzono w 65°C przez 15 minut w 0,5xSSC/0,1% SDS, a na koniec przemywano błonę 1 lub 2 razy (według potrzeb) przez 15 minut/przemycie w 65°C w 0,2xSSC/0,1% SDS. Wykonano autoradiografię przemytej błony.

P r z y k ł a d 7. Wytwarzanie poliklonalnych przeciwciał specyficznych do znakowanego hTBP

Ogólna strategia

Istnieje znacząca homologia w sekwencji ludzkiego i mysiego TBP. Dlatego też najczęściej dostępne w handlu przeciwciała będą reagowały krzyżowo, umożliwiając wykrycie zarówno endogennego, jak i transgenicznego TBP. Aby odróżnić te dwa białka, wytworzono przeciwciała poliklonalne przeciwko znakowanemu regionowi TBP (odpowiadającemu trombinowemu miejscu cięcia i znacznikowi His w znakowanym hTBP): sekwencję o numerze identyfikacyjnym 12:

H₂N-MGSSHHHHHHSSGLVPRGC-COOH.

Peptyd połączono z nośnikiem białkowym i wstrzyknięto królikom z zastosowaniem standardowych technik. Surowicę zbierano w regularnych odstępach czasu i badano pod względem obecności przeciwciał przeciw-hTBP z zastosowaniem testu ELISA.

P r z y k ł a d 8. Detekcja transgenicznego białka z zastosowaniem hybrydyzacji typu Western

PL 197 770 B1

8a) Wytworzenie ekstraktów jądrowych z wątroby

Myszom MT-hTBP podano dwukrotnie przez dootrzewnowe wstrzyknięcia ZnSO₄ (zobacz 5b). Myszy uśmiercono przez przemieszczenie kręgów szyjnych i usunięto im wątroby. Zaraz po m tym wątroby zhomogenizowano w 10 ml buforu do homogenizacji (1,8 M sacharoza, 10 mM HEPES pH

7,4 (Sambrook i inni (1989), 25 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% gliceryna, 0,15 mM spermina, 0,5 mM spermidyna, 0,4 mM PMSF). Następnie homogenizat doprowadzono do objętości 25 ml przy pomocy tego samego buforu. Homogenizat ostrożnie nawarstwiono na 7 ml buforu do homogenizacji w probówkach wirówkowych n^p. w ^pro^bów^kac^h Ukra-Ctoar ^SW-²⁸® (Bec^kman Paró CA ^USA). Pró^bki okrawano w wirówce SW-28 przez 1 godzinę przy 25 000 obrotach/minutę (4°C). Ostrożnie usunięto supernatant i osad jąder zawieszono w 200 μΙ buforu NEXB (20 mM HEPES pH 7,9, 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10% gliceryny, 2 μg/ml aprotyniny, 2 μρ/ml leupeptyny, 2 μρ/ml pepstatyny-A). Zawieszone jądra inkubowano w lodzie przez 15-30 minut często mieszając i pipetując w górę i w dół. Próbki poddano 5 cyklom zamrażania/rozmrażania w łaźni z suchym lodem i etanolem i w łaźni z H2O w 37°C. Próbki odwirowano przez 30 sekund przy szybkich obrotach i oceniono w supernatancie zawartość białka, np. przy pomocy próby z odczynnikiem do białek (np. Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

8b) Elektroforeza i transfer

20-75 μg ekstraktu rozdzielono pod względem wielkości przy pomocy elektroforezy w żelu denaturującym. Żel rozdzielający: 10% akryloamid (akryloamid:bis-akryloamid 1:37), 0,1% SDS, 375 mM Tris pH 8,8. Żel nawarstwiający: 5% akryloamid, 0,1% SDS, 125 mM Tris pH 8,3. Bufor do elektroforezy: 25mM Tris pH 8,3, 192 mM glicyna, 0,1% SDS. Białka przeniesiono na czysty filtr nitrocelulozowy (np. Bio-Rad) przy pomocy półsuchej suszki (np. Hoefer, San Francisco, CA, USA) z zastosowaniem zmodyfikowanego buforu do transferu Bjerrum (48 mM Tris, 39 mM glicyna, 10% metanol, 0,0375% SDS, pH 9,2). Transfer wykonano przy 0,8 mA/cm przez 2-4 godziny.

8c) Immunodetekcja

Błony blokowano 3% żelatyną (np. Bio-Rad) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na kołyszącej się powierzchni w 1x TBS (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl). Błony przemyto przez 10 minut w 1x TTBS (1xTBS z 0,05% Tween-20) w temperaturze pokojowej. Przeprowadzono hybrydyzację z pierwotnym przeciwciałem w 1% żelatynie/1x TTBS przez okres od 4 godzin do całej nocy na kołyszącej się powierzchni w temperaturze pokojowej. Błony przemyto 2-3 razy (5 minut/przemycie) za pomocą 1x TTBS. Przeprowadzono hybrydyzację z wtórnym przeciwciałem, połączonym z alkaliczną fosfatazą (AP) w 1% żelatynie/1xTTBS przez 2-3 godziny. Błony przemyto 2-3 razy (5 minut/przemycie) w 1x TTBS w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto przez 5 minut w 1x buforze TBS. Błony inkubowano w 1x buforze do wywoływania (np. BioRad) zawierającym odczynniki NBT/BCIP w temperaturze pokojowej, aż zaobserwowano wystarczająco intensywne prążki. Reakcję AP zatrzymano przez przemycie H2O.

Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: Hoechst Aktiengesellschaft (B) Ulica: (C) Miasto: Frankfurt (D) Land: (E) Państwo: Niemcy (F) Kod pocztowy: 65926 (G) Telefon: 069-305-7072 (H) Telefaks: 069-35-7175 (I) Teleks: (ii) Tytuł zgłoszenia:

Zwierzę transgeniczne oraz jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, transgen oraz jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, znakowane epitopowo TBP oraz jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, sposoby identyfikowania, charakteryzowania, określania składu i wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, sposób identyfikowania czynników TAF i przeciwciało (iii) Liczba sekwencji: 17 (iv) Sposób odczytu komputerowego:

PL 197 770 B1 (A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja 1.25 (EPO) (2) Informacja o SEK NR ID: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 12 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Położenie: 1..12 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 1:

Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val

5 10 (2) Informacja o SEK NR ID: 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 11 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Położenie: 1..11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 2:

Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

5 10 (2) Informacja o SEK NR ID: 3:

(A) Długość: 10 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Położenie: 1..10 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 3:

Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

5 10 (2) Informacja o SEK NR ID: 4:

(A) Długość: 9 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Położenie: 1..9 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 4:

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

5

PL 197 770 B1 (2) Informacja o SEK NR ID: 5:

(A) Długość: 22 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..22 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 5:

GGAGCAACCG CCTGCTGGGT GC 22 (2) Informacja o SEK NR ID: 6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B). Położenie: 1. .21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 6:

CCTGTGTTGC CTGCTGGGAC G 221 (2) Informacja o SEK NR ID: 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..21 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 7:

GGAGACTGAA GTTAGGCCAG C 21 (2) Informacja o SEK NR ID: 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 76 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..76 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 8:

GCGGCACCAG GCCGCTGCTG TGATGATGAT GATGATGGCT GCTGCCCATG ACTGCGTAAT 60 GCGGTCATGA CGCTTT 76 (2) Informacja o SEK NR ID: 9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 75 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

PL 197 770 B1 (A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..75 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 9:

GAAGGGGGTG GGGGAGGCAA GGGTACATGA GAGCCATTAC GTCGTCTTCC TGAATCCCTT 60 TAGCCGCTTT GCTCG 75 (2) Informacja o SEK NR ID: 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..22 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 10:

CCCTATGACG TCCCGGATTA CG 22 (2) Informacja o SEK NR ID: 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..22 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 11:

GTGGAGTGGT GCCCGGCAAG GG 22 (2) Informacja o SEK NR ID: 12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 19 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Położenie: 1. .19 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 12:

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

5 10 15

Arg Gly Cys (2) Informacja o SEK NR ID: 13:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1310 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..1310

PL 197 770 B1

(xi) OPIS SEKWENCJI: CCATGGGCTA TCCCTATGAC	: SEK NR ID 13:	GGGCAGCAGC	CATCATCATC	60
GTCCCGGATT	ACGCAGTCAT
ATCATCACAG	CAGCGGCCTG	GTGCCGCGCG	GCAGCCATAT	GGATCAGAAC	AACAGCCTGC	120
CACCTTACGC	TCAGGGCTTG	GCCTCCCCTC	AGGGTGCCAT	GACTCCCGGA	ATCCCTATCT	180
TTAGTCCAAT	GATGCCTTAT	GGCACTGGAC	TGACCCCACA	GCCTATTCAG	AACACCAATA	240
GTCTGTCTAT	TTTGGAAGAG	CAACAAAGGC	AGCAGCAGCA	ACAACAACAG	CAGCAGCAGC	300
AGCAGCAGCA	GCAGCAACAG	CAACAGCAGC	AGCAGCAGCA	GCAGCAGCAG	CAGCAGCAGC	360
AGCAGCAGCA	GCAGCAGCAA	CAGGCAGTGG	CAGCTGCAGC	CGTTCAGCAG	TCAACGTCCC	420
AGCAGGCAAC	ACAGGGAACC	TCAGGCCAGG	CACCACAGCT	CTTCCACTCA	CAGACTCTCA	480
CAACTGCACC	CTTGCCGGGC	ACCACTCCAC	TGTATCCCTC	CCCCATGACT	CCCATGACCC	540
CCATCACTCC	TGCCACGCCA	GCTTCGGAGA	GTTCTGGGAT	TGTACCGCAG	CTGCAAAATA	600
TTGTATCCAC	AGTGAATCTT	GGTTGTAAAC	TTGACCTAAA	GACCATTGCA	CTTCGTGCCC	660
GAAACGCCGA	ATATAATCCC	AAGCGGTTTG	CTGCGGTAAT	CATGAGGATA	AGAGAGCCAC	720
GAACCACGGC	ACTGATTTTC	AGTTCTGGGA	AAATGGTGTG	CACAGGAGCC	AAGAGTGAAG	780
AACAGTCCAG	ACTGGCAGCA	AGAAAATATG	CTAGAGTTGT	ACAGAAGTTG	GGTTTTCCAG	840
CTAAGTTCTT	GGACTTCAAG	ATTCAGAACA	TGGTGGGGAG	CTGTGATGTG	AAGTTTCCTA	900
TAAGGTTAGA	AGGCCTTGTG	CTCACCCACC	AACAATTTAG	TAGTTATGAG	CCAGAGTTAT	960
TTCCTGGTTT	AATCTACAGA	ATGATCAAAC	CCAGAATTGT	TCTCCTTATT	TTTGTTTCTG	1020
GAAAAGTTGT	ATTAACAGGT	GCTAAAGTCA	GAGCAGAAAT	TTATGAAGCA	TTTGAAAACA	1080
TCTACCCTAT	TCTAAAGGGA	TTCAGGAAGA	CGACGTAATG	GCTCTCATGT	ACCCTTGCCT	1140
CCCCCACCCC	CTTCTTTTTT	TTTTTTTAAA	CAAATCAGTT	TGTTTTGGTA	CCTTTAAATG	1200
GTGGTGTTGT	GAGAAGATGG	ATGTTGAGTT	GCAGGGTGTG	GCACCAGGTG	ATGCCCTTCT	1260
GTAAGTGCCC	CTTCCGGCAT	CCCGGAATTC	CTGCAGCCCA	ACGCGGCCGC		1310

(2) Informacja o SEK NR ID: 14 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4286 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..4286

PL 197 770 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 14

GAATTCCCCT	GCAGGTCACT	TAGCGTTGGC	CACATAGTAG	GTTCTCAAAT	ACTTGTTAAT	60
AAATAAGTTT	GTTCGAGAAG	CTGGGCAATG	ATATTCTACA	GCTGGAAGAA	GAAACATAAT	120
gatctagtaa	TTAGCTCAAT	TAAAAATAAA	CGTTCTTCTT	TCCTCAGAGG	AGCATTTCCC	180
AAGGCCTGCC	TTGATAGCCA	TCCAAAAAGG	CCAAGCTCAT	CCAATCTTGC	CCTAGATTTA	240
TGCTAAAATG	CAGTTACAAT	CGATAGGATG	ACAGAAAACG	ACAGCACTTA	TTTAAATATA	300
ATAGGCACTT	ATTTAAATAG	GAGAAGCTGT	GACTTCATAG	CAAGTGTTGG	GGTTAGGAAA	360
CTGGGTGGAT	AAACTTGCTG	ATGCTGTAGA	TCTTAGCCTC	TACATGAGAT	CATGTGGAAA	420
ATCTGAAAGC	ATTTTAGGTT	CCTTATGTTT	GCAATCAAAT	AACTGTACAC	CTTTTAATTT	480
AAAAAGTACC	ATGAGGCACA	CACACACACT	CGCAGGAACT	TTTTGGCGTA	ACAAAACTAG	540
AATTAGATCT	AAAAGCTAAC	TGTAGGACTG	AGTCTATTCT	AAACTGAAAG	CCTGGACATC	600
TGGAGTACCA	GGGGGAGATG	ACGTGTTACG	GGCTTCCATA	AAAGCAGCTG	GCTTTGAATG	660
GAAGGAGCCA	AGAGGCCAGC	ACAGGAGCGG	ATTCGTCGCT	TTCACGGCCA	TCGAGCCGAA	720
CCTCTCGCAA	GTCCGTGAGC	CGTTAAGGAG	GCCCCCAGTC	CCGACCCTTC	GCCCCAAGCC	780
CCTCGGGGTC	CCCGGGCCTG	GTACTCCTTG	CCACACGGGA	GGGGCGCGGA	AGCCGGGGCG	840
GAGGAGGAGC	CAACCCCGGG	CTGGGCTGAG	ACCCGCAGAG	GAAGACGCTC	TAGGGATTTG	900
TCCCGGACTA	GCGAGATGGC	AAGGCTGAGG	ACGGGAGGCT	GATTGAGAGG	CGAAGGTACA	960
CCCTAATCTC	AATACAACCT	TTGGAGCTAA	GCCAGCAATG	GTAGAGGGAA	GATTCTGCAC	1020
GTCCCTTCCA	GGCGGCCTCC	CCGTCACCAC	CCCCCCCAAC	CCGCCCCGAC	CGGAGCTGAG	1080
AGTAATTCAT	ACAAAAGGAC	TCGCCCCTGC	CTTGGGGAAT	CCCAGGGACC	GTCGTTAAAC	1140
TCCCACTAAC	GTAGAACCCA	GAGATCGCTG	CGTTCCCGCC	CCCTCACCCG	CCCGCTCTCG	1200
TCATCACTGA	GGTGGAGAAG	AGCATGCGTG	AGGCTCCGGT	GCCCGTCAGT	GGGCAGAGCG	1260
CACATCGCCC	ACAGTCCCCG	AGAAGTTGGG	GGGAGGGGTC	GGCAATTGAA	CCGGTGCCTA	1320
GAGAAGGTGG	CGCGGGGTAA	ACTGGGAAAG	TGATGTCGTG	TACTGGCTCC	GCCTTTTTCC	1380
CGAGGGTGGG	GGAGAACCGT	ATATAAGTGC	AGTAGTCGCC	GTGAACGTTC	TTTTTCGCAA	1440
CGGGTTTGCC	GCCAGAACAC	AGGTAAGTGC	CGTGTGTGGT	TCCCGCGGGC	CTGGCCTCTT	1500

PL197 770 Β1

TACGGGTTAT	GGCCCTTGCG	TGCCTTGAAT	TACTTCCACG	CCCCTGGCTG	CAGTACGTGA	1560
TTCTTGATCC	CGAGCTTCGG	GTTGGAAGTG	GGTGGGAGAG	TTCGAGGCCT	TGCGCTTAAG	1620
GAGCCCCTTC	GCCTCGTGCT	TGAGTTGAGG	CCTGGCCTGG	GCGCTGGGGC	CGCCGCGTGC	1680
GAATCTGGTG	GCACCTTCGC	GCCTGTCTCG	CTGCTTTCGA	TAAGTCTCTA	GCCATTTAAA	1740
ATTTTTGATG	ACCTGCTGCG	ACGCTTTTTT	TCTGGCAAGA	TAGTCTTGTA	AATGCGGGCC	1800
AAGATCTGCA	CACTGGTATT	TCGGTTTTTG	GGGCCGCGGG	CGGCGACGGG	GCCCGTGCGT	1860
CCCAGCGCAC	ATGTTCGGCG	AGGCGGGGCC	TGCGAGCGCG	GCCACCGAGA	ATCGGACGGG	1920
GGTAGTCTCA	AGCTGGCCGG	CCTGCTCTGG	TGCCTGGCCT	CGCGCCGCCG	TGTATCGCCC	1980
CGCCCTGGGC	GGCAAGGCTG	GCCCGGTCGG	CACCAGTTGC	GTGAGCGGAA	AGATGGCCGC	2040
TTCCCGGCCC	TGCTGCAGGG	AGCTCAAAAT	GGAGGACGCG	GCGCTCGGGA	GAGCGGGCGG	2100
GTGAGTCACC	CACACAAAGG	AAAAGGGCCT	TTCCGTCCTC	AGCCGTCGCT	TCATGTGACT	2160
CCACGGAGTA	CCGGGCGCCG	TCCAGGCACC	TCGATTAGTT	CTCGAGCTTT	TGGAGTACGT	2220
CGTCTTTAGG	TTGGGGGGAG	GGGTTTTATG	CGATGGAGTT	TCCCCACACT	GAGTGGGTGG	2280
AGACTGAAGT	TAGGCCAGCT	TGGCACTTGA	TGTAATTCTC	CTTGGAATTT	GCCCTTTTTG	2340
AGTTTGGATC	TTGGTTCATT	CTCAAGCCTC	AGACAGTGGT	TCAAAGTTTT	TTTCTTCCAT	2400
TTCAGGTGTC	GTGAGGAATT	GCCCGGGGGA	TCCATGGGCT	ATCCCTATGA	CGTCCCGGAT	2460
TACGCAGTCA	TGGGCAGCAG	CCATCATCAT	CATCATCACA	GCAGCGGCCT	GGTGCCGCGC	2520
GGCAGCCATA	TGGATCAGAA	CAACAGCCTG	CCACCTTACG	CTCAGGGCTT	GGCCTCCCCT	2580
CAGGGTGCCA	TGACTCCCGG	AATCCCTATC	TTTAGTCCAA	TGATGCCTTA	TGGCACTGGA	2640
CTGACCCCAC	AGCCTATTCA	GAACACCAAT	AGTCTGTCTA	TTTTGGAAGA	GCAACAAAGG	2700
CAGCAGCAGC	AACAACAACA	GCAGCAGCAG	CAGCAGCAGC	AGCAGCAACA	GCAACAGCAG	2760
CAGCAGCAGC	AGCAGCAGCA	GCAGCAGCAG	CAGCAGCAGC	AGCAGCAGCA	ACAGGCAGTG	2820
GCAGCTGCAG	CCGTTCAGCA	GTCAACGTCC	CAGCAGGCAA	CACAGGGAAC	CTCAGGCCAG	2880
GCACCACAGC	TCTTCCACTC	ACAGACTCTC	ACAACTGCAC	CCTTGCCGGG	CACCACTCCA	2940
CTGTATCCCT	CCCCCATGAC	TCCCATGACC	CCCATCACTC	CTGCCACGCC	AGCTTCGGAG	3000
AGTTCTGGGA	TTGTACCGCA	GCTGCAAAAT	ATTGTATCCA	CAGTGAATCT	TGGTTGTAAA	3060
CTTGACCTAA	AGACCATTGC	ACTTCGTGCC	CGAAACGCCG	AATATAATCC	CAAGCGGTTT	3120
GCTGCGGTAA	TCATGAGGAT	AAGAGAGCCA	CGAACCACGG	CACTGATTTT	CAGTTCTGGG	3180
AAAATGGTGT	GCACAGGAGC	CAAGAGTGAA	GAACAGTCCA	GACTGGCAGC	AAGAAAATAT	3240

PL 197 770 B1

GCTAGAGTTG	TACAGAAGTT	GGGTTTTCCA	GCTAAGTTCT	TGGACTTCAA	GATTCAGAAC	3300
ATGGTGGGGA	GCTGTGATGT	GAAGTTTCCT	ATAAGGTTAG	AAGGCCTTGT	GCTCACCCAC	3360
CAACAATTTA	GTAGTTATGA	GCCAGAGTTA	TTTCCTGGTT	TAATCTACAG	AATGATCAAA	3420
CCCAGAATTG	TTCTCCTTAT	TTTTGTTTCT	GGAAAAGTTG	TATTAACAGG	TGCTAAAGTC	3480
AGAGCAGAAA	TTTATGAAGC	ATTTGAAAAC	ATCTACCCTA	TTCTAAAGGG	ATTCAGGAAG	3540
ACGACGTAAT	GGCTCTCATG	TACCCTTGCC	TCCCCCACCC	CCTTCTTTTT	TTTTTTTTAA	3600
ACAAATCAGT	TTGTTTTGGT	ACCTTTAAAT	GGTGGTGTTG	TGAGAAGATG	GATGTTGAGT	3660
TGCAGGGTGT	GGCACCAGGT	GATGCCCTTC	TGTAAGTGCC	CCTTCCGGCA	TCCCGGATAT	3720
CCTGCAGCCC	AACACGGCCG	CTCGAGCATG	CATCTAGAGA	ACGTCACGGC	CGCGATCCCC	3780
CTGTGCCTTC	TAGTTGCCAG	CCATCTGGTT	GTTTGCCCCT	CCCCCGTGCC	TTCCTTGACC	3840
CTGGAAGGTG	CCACTCCCAC	TGTCCTTTCC	TAATAAAATG	AGGAAATTGC	ATCGCATTGT	3900
CTGAGTAGGT	GTCATTCTAT	TCTGGGGGGT	GGGGTGGGGC	AGGACAGCAA	GGGGGAGGAT	3960
TGGGAAGACA	ATAGCAGGCA	TGCTGGGGAT	GCGGTGGGCT	CTATGGGTAC	CCAGGTGCTG	4020
AAGAATTGAC	CCGGTTCCTC	CTGGGCCAGA	AAGAAGCAGG	CACATCCCCT	TCTCTGTGAC	4080
ACACCCTGTC	CACGCCCCTG	GTTCTTAGTT	CCAGCCCCAC	TCATAGGACA	CTCAACTTGG	4140
AGCGGTCTCT	CCCTCCCTCA	TCAGCCCACC	AAACCAAACC	TAGCCTCCAA	GAGTGGGAAG	4200
AAATTAAAGC	AAGAAGGCTA	TTAAGTGCAG	AGGGAGAGAA	AATGCCTCCA	ACATGTGAGG	4260
AAGTAATGAT	AGAAATCATA	GAATTC				4286

(2) Informacja o SEK NR ID: 15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3263 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) Położenie: 1..3263

PL197 770 Β1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 15:

ATCGATAAGC	TGAGATCCGG	CTAGAAACTG	CTGAGGGCTG	GACCGCATCT	GGGGACCATC	60
TGTTCTTGGC	CCTGAGCGGG	GCAGGAACTG	CTTACCGCAG	ATATCCTGTT	TGCCCCAATT	120
CAGCTGTTCC	ATCTGTTCTT	GGCCCTGAGC	GGGGCAGGAA	CTGCTTACCA	CAGATATCCT	180
GTTTGGCCCA	TATTCAGCTG	TCTCTCTGTT	CCTGACCTTG	ATCTGAACTT	CTCTATTCTC	240
AGTTATGTAT	TTTTCCCATG	CCTTGCAAAA	TGGCGTTACT	TAAGCTAGCT	TGCCAAACCT	300
ACGGCTGGGG	TCTTTCACGT	TTATATCTAT	GAGGGGAAGG	ACCCAGAGTG	GGGAAGCTGG	360
GATCTTGGGA	ACACGCTTCT	CTACATGGCA	TTGTCTGCAC	GGTGGAGTCC	GGATCTGAGC	420
TTGGCTTGGT	TTTTAAAACC	AGCCTGGAGT	AGAGCAGA7G	GGTTAAGGTG	AGTGACCCCT	480
CAGCCCTGGA	CATTCTTAGA	TGAGCCCCCT	CAGGAGTAGA	GAATAATGTT	GAGATGAGTT	540
CTGTTGGCTA	AAATAATCAA	GGCTAGTCTT	TATAAAACTG	TCTCCTCTTC	TCCTAGCTTC	600
GATCCAGAGA	GAGACCTGGG	CGGAGCTGGT	CGCTGCTCAG	GAACTCCAGG	AAAGGAGAAG	660
CTGAGGTTAC	CACGCTGCGA	ATGGGTTTAC	GGAGATAGCT	GGCTTTCCGG	GGTGAGTTCT	720
CGTAAACTCC	AGAGCAGCGA	TAGGCCGTAA	TATCGGGGAA	AGCACTATAG	GGACATGATG	780
TTCCACACGT	CACATGGGTC	GTCCTATCCG	AGCCAGTCGT	GCCAAAGGGG	CGGTCCCGCT	840
GTGCACACTG	GCGCTCCAGG	GAGCTCTGCA	CTCCGCCCGA	AAAGTGCGCT	CGGCTCTGCC	900
AGGACGCGGG	GCGCGTGACT	ATGCGTGGGC	TGGAGCAACC	GCCTGCTGGG	TGCAAACCCT	960
TTGCGCCCGG	ACTCGTCCAA	CGACTATAAA	GAGGGCAGGC	TGTCCTCTAA	GCGTCACCAC	1020
GACTTCAACG	TCCTGAGTAC	CTTCTCCTCA	CTTACTCCGT	AGCTCCAGCT	TCACCAGATC	1080
CTCGAGAACG	TCTCCCATGG	GCTATCCCTA	TGACGTCCCG	GATTACGCAG	TCATGGGCAG	1140
CAGCCATCAT	CATCATCATC	ACAGCAGCGG	CCTGGTGCCG	CGCGGCAGCC	ATATGGATCA	1200
GAACAACAGC	CTGCCACCTT	ACGĆTCAGGG	CTTGGCCTCC	CCTCAGGGTG	CCATGACTCC	1260
CGGAATCCCT	ATCTTTAGTC	CAATGATGCC	TTATGGCACT	GGACTGACCC	CACAGCCTAT	1320
TCAGAACACC	AATAGTCTGT	CTATTTTGGA	AGAGCAACAA	AGGCAGCAGC	AGCAACAACA	1380
ACAGCAGCAG	CAGCAGCAGC	AGCAGCAGCA	ACAGCAACAG	CAGCAGCAGC	AGCAGCAGCA	1440
GCAGCAGCAG	CAGCAGCAGC	AGCAGCAGCA	GCAACAGGCA	GTGGCAGCTG	CAGCCGTTCA	1500
GCAGTCAACG	TCCCAGCAGG	CAACACAGGG	AACCTCAGGC	CAGGCACCAC	AGCTCTTCCA	1560
CTCACAGACT	CTCACAACTG	CACCCTTGCC	GGGCACCACT	CCACTGTATC	CCTCCCCCAT	1620
GACTCCCATG	ACCCCCATCA	CTCCTGCCAC	GCCAGCTTCG	GAGAGTTCTG	GGATTGTACC	1680
GCAGCTGCAA	AATATTGTAT	CCACAGTGAA	TCTTGGTTGT	AAACTTGACC	TAAAGACCAT	1740

PL 197 770 B1

TGCACTTCGT	GCCCGAAACG	CCGAATATAA	TCCCAAGCGG	TTTGCTGCGG	TAATCATGAG	1800
GATAAGAGAG	CCACGAACCA	CGGCACTGAT	TTTCAGTTCT	GGGAAAATGG	TGTGCACAGG	1860
AGCCAAGAGT	GAAGAACAGT	CCAGACTGGC	AGCAAGAAAA	TATGCTAGAG	TTGTACAGAA	1920
gttgggtttt	CCAGCTAAGT	TCTTGGACTT	CAAGATTCAG	AACAIGGTGG	GGAGCTGTGA	1980
TGTGAAGTTT	CCTATAAGGT	TAGAAGGCCT	TGTGCTCACC	CACCAACAAT	TTAGTAGTTA	2040
TGAGCCAGAG	TTATTTCCTG	GTTTAATCTA	CAGAATGATC	AAACCCAGAA	TTGTTCTCCT	2100
TATTTTTGTT	TCTGGAAAAG	TTGTATTAAC	AGGTGCTAAA	GTCAGAGCAG	AAATTTATGA	2160
AGCATTTGAA	AACATCTACC	CTATTCTAAA	GGGATTCAGG	AAGACGACGT	AATGGCTCTC	2220
ATGTACCCTT	GCCTCCCCCA	CCCCCTTCTT	TTTTTTTTTT	TAAACAAATC	AGTTTGTTTT	2280
GGTACCTTTA	AATGGTGGTG	TTGTGAGAAG	ATGGATGTTG	AGTTGCAGGG	TGTGGCACCA	2340
GGTGATGCCC	TTCTGTAAGT	GCCCCTTCCG	GCATCCCGGA	ATTCCTGCAG	CCCAACGCGG	2400
CCGCTTCGAG	GGATCTTTGT	GAAGGAACCT	TACTTCTGTG	GTGTGACATA	ATTGGACAAA	2460
CTACCTACAG	AGATTTAAAG	CTCTAAGGTA	AATATAAAAT	TTTTAAGTGT	ATAATGTGTT	2520
AAACTACTGA	TTCTAATTGT	TTGTGTATTT	TAGATTCCAA	CCTATGGAAC	TGATGAATGG	2580
GAGCAGTGGT	GGAATGCCTT	TAATGAGGAA	AACCTGTTTT	GCTCAGAAGA	AATGCCATCT	2640
AGTGATGATG	AGGCTACTGC	TGACTCTCAA	CATTCTACTC	CTCCAAAAAA	GAAGAGAAAG	2700
GTAGAAGACC	CCAAGGACTT	TCCTTCAGAA	TTGCTAAGTT	TTTTGAGTCA	TGCTGTGTTT	2760
AGTAATAGAA	CTCTTGCTTG	CTTTGCTATT	TACACCACAA	AGGAAAAAGC	TGCACTGCTA	2820
TACAAGAAAA	TTATGGAAAA	atattctgta	ACCTTTATAA	GTAGGCATAA	CAGTTATAAT	2880
CATAACATAC	TGTTTTTTCT	TACTCCACAC	AGGCATAGAG	TGTCTGCTAT	TAATAACTAT	2940
GCTCAAAAAT	TGTGTACCTT	TAGCTTTTTA	ATTTGTAAAG	GGGTTAATAA	GGAATATTTG	3000
atgtatagtg	CCTTGACTAG	AGATCATAAT	CAGCCATACC	ACATTTGTAG	AGGTTTTACT	3060
TGCTTTAAAA	AACCTCCCAC	ACCTCCCCCT	GAACCTGAAA	CATAAAATGA	ATGCAATTGT	3120
TGTTGTTAAC	TTGTTTATTG	CAGCTTATAA	TGGTTACAAA	TAAAGCAATA	GCATCACAAA	3180
TTTCACAAAT	AAAGCATTTT	TTTCACTGCA	TTCTAGTTGT	GGTTTGTCCA	AACTCATCAA	3240
TGTATCTTAT	CATGTCTGGA	TCC				3263

(2) Informacja o SEK NR ID: 16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 371 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1. .371

PL 197 770 Β1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 16:

Met 1

Gly Tyr Pro

Tyr 5

ASp

Val

Pro

Asp Tyr Ala 10

Val

Met

Gly

Ser Ser 15

His

His

His

His

His

His

Ser

Ser

Gly

Leu

Val

Pro

Arg

Gly

Ser

His

20

25

30

Met

Asp

Gin

Asn

Asn

Ser

Leu

Pro

Pro

Tyr

Ala

Gin

Gly

Leu

Ala

Ser

35

40

45

Pro

Gin

Gly

Ala

Met

Thr

Pro

Gly

Ile

Pro

Ile

Phe

Ser

Pro

Met

Met

50

55

60

Pro

Tyr

Gly

Thr

Gly

Leu

Thr

Pro

Gin

Pro

Ile

Gin

Asn

Thr

Asn

Ser

65

70

75

80

Leu

Ser

Ile

Leu

Glu

Glu

Gin

Gin

Arg

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

85

90

95

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

100

105

110

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Ala

115

120

125

Val

Ala

Ala

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Ser

Thr

Ser

Gin

Gin

Ala

Thr

Gin

130

135

140

Gly

Thr

Ser

Gly

Gin

Ala

Pro

Gin

Leu

Phe

His

Ser

Gin

Thr

Leu

Thr

145

150

155

160

Thr

Ala

Pro

Leu

Pro

Gly

Thr

Thr

Pro

Leu

Tyr

Pro

Ser

Pro

Met

Thr

165

170

175

Pro

Met

Thr

Pro

Ile

Thr

Pro

Ala

Thr

Pro

Ala

Ser

Glu

Ser

Ser

Gly

180

185

190

Ile

Val

Pro

Gin

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Ser

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Cys

195

200

205

Lys

Leu

Asp

Leu

Lys

Thr

Ile

Ala

Leu

Arg

Ala

Arg

Asn

Ala

Glu

Tyr

210 215 220

Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Arg

PL 197 770 B1

225 230 235 240

Thr

Thr

Ala

Leu

Ile 245

Phe Ser Ser

Gly

Lys Met Val Cys Thr Gly Ala

250

255

Lys

Ser

Glu

Glu

Gin

Ser

Arg

Leu

Ala

Ala

Arg

Lys

Tyr

Ala

Arg

Val

260

265

270

Val

Gin

Lys

Leu

Gly

Phe

Pro

Ala

Lys

Phe

Leu

Asp

Phe

Lys

Ile

Gin

275

280

285

Asn

Met

Val

Gly

Ser

Cys

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Ile

Arg

Leu

Glu

Gly

290

295

300

Leu

Val

Leu

Thr

His

Gin

Gin

Phe

Ser

Ser

Tyr

Glu

Pro

Glu

Leu

Phe

305

310

315

320

Pro

Gly

Leu

Ile

Tyr

Arg

Met

Ile

Lys

Pro

Arg

Ile

Val

Leu

Leu

Ile

325

330

335

Phe

Val

Ser

Gly

Lys

Val

Val

Leu

Thr

Gly

Ala

Lys

Val

Arg

Ala

Glu

340

345

350

Ile

Tyr

Glu

Ala

Phe

Glu

Asn

Ile

Tyr

Pro

Ile

Leu

Lys

Gly

Phe

Arg

355 360 365

Lys Thr Thr 370 (2) Informacja o SEK NR ID: 17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1 ..18

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 10 15

Arg Gly

Claims (37)

1. Zwieerztrannsgniczneinnen iż człowiek, zznmieenntym, żż ezwierakomórki zwprowaadznym do genomu tych komórek transgenem eksprymującym znakowane epitopami HA i His białko wiążące kasetę TATA (TBP).

2. Zwiprzzwpeług zzaisz-l , zzamieenneymi, żż b iałko stanewi b iałko h^nn ezwierającc kjddkie TBP (hTBP).

3. Zwiedz wpełud zzai^l 1 zznaiieenneymr żż białto sranem/i białto -udzjnezzwierająccser kwencję o numerze identyfikacyjnym 16.

PL 197 770 B1

4. Sposób wytwarzania zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanegow zastrz. 1, znamienny tym, żn (s) worswseas tię trretons kodujący aeskswseg noitsosws bisłks wiążązn ksgntc TATA (TBP) ds ksmbrnk tngs awinraczis srsa (b) worswseas się ksmbrki a ntspu (s) ds ksmbrnk tsmizy bisrzy.

5. Sposób ww^ndłu zasttz. 4, znamienny tym, żż stostje się mikroiniencję 1taneóogicznego DNA ds ayosty awinraczis.

6. Sposóbwagłuu zastrz^, znamienaytym. żż warowaSea siętraneóog kcSejeczznencwar en noitsosws bisłks wiążązn ksgntc TATA (TBP) ds ksmbrki osis gmbriseslegos blsótszygty.

7. Traneóog ZcSejecz znencwaneegitosomi HA i His Ziałkk wiążączkcnórę TATA (TTB), dd wytwsraseis awinraczis trseóogeizaegos adgfieiswsegos w asótra. 1.

8. Traneóog wagłuuz astrze, z awierajączpiegrwóę s ógwageję DDN kcSejączTTB i d ruues gn kwnszjc DNA ksdujązą asszasiki noitsoswn.

9. Trsegone wndłuo asgtra. 7 slbs 8, w ktbrym gnkwnezją DNA ksdujązą TBP jngt gnkwnezjs zDNA.

10. Traneóog wanrugzantrz.9, w Móiym sógwagejeDDA j egtsógwagejacDDA Auddęieno TTB (hTBP).

11. Traneóog wanrugz astrze , w któibrrn e nitosHA ma ^ndsz s ógwageji o n emerzaiddgtyfikcr zyjsym 1, s sumnran idnetyfikszyjsym 2, s sumnran idnetyfikszyjsym 3 lub s sumnran idnstyfikszyjsym 4.

12. Trsegone wndłuo asgtra. 7, aswinrsjązy gnkwnezjc s sumnran idnetyfikszyjsym 13.

13. Trssgons wndłuo asgtrz. 7, aswinrsjązy DNA isdukswslsnos lub kssgtytutywsnos orsmstsrs.

14. Trssgons wndłuo asgtra. 13, w ktbrym orsmstsrnm jngt orsmstsr onsu EF.

15. Trssgons wndłuo asgtra. 13, w ktbrym orsmstsrnm jngt orsmstsr onsu MT.

16. Trssgons wndłuo asgtra. 7, aswinrsjązy gnkwnezjc s sumnran idnetyfikszyjsym 14 lub 15.

17. Sposib watwarzaniar1aneóogszadriniowanenow za^rz^ z namienaytym. żż z s ógwagzją DNA ksdujązą bisłks TBP łązay gic a gnkwnezją DNA ksdujązą asszasik noitsoswy.

18. Zantosówanie trzneóogs zadriniowaneno w za^rz. Z Zd watwarzania znencwaneno znitoosws TBP.

19. Zantosówanie zwieizacia t rzneóogiczneno zadgniowaneno w za^rz. 1 Zd zgkólymawania asskswssnos noitsosws TBP.

20. Znerc>wane enitosowo TBP egkófzfaawane w zwierzaciu 1rzneóogicznem zadgniowanem w asgtra. 1.

21. Zsskswssn noitsosws TBP wndłuo asgtra. 20, w ktbrym TBP gtssswi hTBP.

22. Zzencwaneenitosowa TTB wanrug za^rz^ 2, w któibrrn TTB j po-ąszanez enkosom HA i noitsonm Aig.

23. Zzencwane znitosowa TTB wandłg za^rz. Z2, w Ztórym znitos HA zm s enee z zógwageji s sumnran idnetyfikszyjsym 1, s sumnran idnetyfikszyjsym 2, s sumnran idnetyfikszyjsym 3 lub s sumnran idnetyfikszyjsym 4.

24. ZzencwaneenitosowaTAB wanrug zd^rz^O, zawierareszsógwagejęo ΓϋΠϋΐ'ζ. iddgtyfikszyjsym 16.

25. SposóbwatwarzdniazdencwanenoenitosowaTAB zddriniowanenow zdntrz.2O,znamiienay tym, żn worswsdas gic trssgons adnfisiswssy w asgtra. 7 ds ksmbrnk awinraczis.

26. Sposóbwanrugzdntrz.2O. znamienaatym. żż warowaSddsięt raneóog zdwieraresz i nedu kswslsy orsmstsr ds awinraczis, os zaym noitsosws asskswssn TBP ulnos nkgorngji w awinracziu.

27. Zzntosówanie zwierzdcia 1rzneóogiczdeno zddgniowaneno w za^rz. 1 dd iddgtytikowania sswyzh i/lub gonzyfizasyzh zayssikbw TAF i/lub zayssikbw sddaisływujązyzh a TAF.

28. Zzntosówanie zdencwaneno enitosowa TTB dd waySrzCniania kcmalegków 1rznegtzyoztsyzh wyżganos racdu a trasgonsizasnos awinraczis i ds idnstyfikswssis zayssikbw TAF i zayssikbw sddaisływujązyzh a TAF.

29. Zzntosówanie zwierzdcia 1rzneóogiczdeno zddgniowaneno w za^rz. 1 Zd zgkólymawania asskswssnos noitsosws TBP.

30. Zzntosówanie zwierzdcia 1rzneóogiczdeno zddgniowaneno w zantrz. 1 do waySrzCniania ksmolnkgbw trssgkryozyjsyzh wyżganos mcdu a rbżsyzh tkssnk i/lub tyobw ksmbrnk, nwnstuslsin w rbżsyzh gtsdiszh zyklu rsawsjswnos awinraczis.

31. SposóbcZaranteryydwaniasgtaSo róbneyz Zcmalegków tranegryyozjneyZwaysódno rzacd, namminaay tyi, żn s) trssgons adnfisiswssy w asgtra. 7 worswsdas gic ds awinraczis, b) asskswssn

PL 197 770 B1 epitopowo TBP wyodrębnia się z różnych zwierzęcych tkanek i/lub typów komórek zwierzęcia, ewentualnie w różnych stadiach cyklu rozwojowego zwierzęcia i c) określa się skład kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu.

32. Sposób identyfikowania nowego i/lub specyficznego czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF, znamienny tym, że a) transgen zdefiniowany w zastrz. 7 wprowadza się do zwierzęcia, b) znakowane epitopowo TBP wyodrębnia się z określonej zwierzęcej tkanki i/lub określonego typu komórek zwierzęcia, ewentualnie w określonym stadium cyklu rozwojowego i c) czynnik TAF i/lub czynnik oddziaływujący z TAF zasocjowany ze znakowanym epitopowo TBP w kompleksie transkrypcyjnym wyższego rzędu dysocjuje się i oddziela.

33. Sposób wyodrębniania różnych kompleksów wyższego rzędu ze zwierzęcia transgenicznego zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, że kompleks transkrypcyjny wyższego rzędu zasocjowany ze znakowanym epitopowo TBP współoczyszcza się metodą powinowactwa, przy czym znakowane epitopowo TBP oczyszcza się metodą powinowactwa z zastosowaniem co najmniej jednego znacznika epitopowego dołączonego do TBP.

34. Sposób według zastrz. 33, tym, że znakowane eprtopowo TBP się przez wiązanie jego epitopu His w kolumnie z Ni²⁺.

35. Sposób według zz^^sr^^. 33 albo 34, znamienny tym, że znakowaneeprtopowo TBP orc^z^^^cza się przez wiązanie jego epitopu HA z przeciwciałami przeciw-HA.

36. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym. że kompleks wyżi^-zi^igio rzędu wyodrębnia się metodą powinowactwa z użyciem kolumny z przeciwciałami rozpoznającymi epitop znakowanego epitopowo TBP z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 17.

37. Przeciwciało rozpoznałące epitop znakowanego epitopowo TBP z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 17.