KR100210482B1

KR100210482B1 - 스트렙토마이세스엑스포리아투스(streptomycesexfoliatus)yj-118과이를이용한프라바스타틴나트륨의제조방법

Info

Publication number: KR100210482B1
Application number: KR1019970013290A
Authority: KR
Inventors: 이주경; 박주웅; 서동진; 이상춘; 김지윤
Original assignee: 김종인; 영진약품공업주식회사
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 1999-07-15
Also published as: CN1254373A; KR970043038A; EP0975738A1; JP2001519654A; US6306629B1; CN1126815C; WO1998045410A1

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118과 이를 이용한 프라바스타틴 나트륨의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하기로는 신균주 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 사용한 미생물의 효소적-하이드록실화 반응을 이용하여 고지혈증 치료제로 유용한 다음 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴 나트륨을 고수율 및 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus)YJ-118과 이를 이용한 프라바스타틴 나트륨의 제조방법

고지혈증(Hyperlipidemia)은 혈장내의 지질(콜레스테롤, 중성지방, 인지질, 유리지방산 등) 농도가 정상범위를 넘어 증가한 상태를 의미하며 임상적으로는 동맥경화증, 고혈압, 허혈성 심장질환과 췌장염의 원인이 된다. 이에 따라 콜레스테롤치를 감소시킬 수 있는 약제개발이 진행되고 있는데, 이들 중 상기 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴 나트륨(Pravastatin Sodium)은 콜레스테롤 생합성 과정에서 하이드록실메틸글루타릴 Co-A 효소의 작용을 저해하여 콜레스테롤 생성의 억제능이 우수하므로 고지혈증의 치료에 유용한 것으로 잘 알려져있다.

지금까지 알려진 상기 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴 나트륨의 일반적인 제조방법에서는 프라바스타틴 전구체 예를들면, 다음 화학식 2a로 표시되는 ML-236B락톤 또는 다음 화학식 2b로 표시되는 ML-236B 카르복실산 또는 ML-236B 나트륨에 미생물을 투여하여 배양하는 일명, `미생물의 효소적-하이드록실화 반응'에 의해 제조하고 있다.

상기 화학식 2b에서, R은 H 또는 Na이다.

프라바스타틴 나트륨 제조를 위한 미생물의 효소적-하이드록실화 반응에 이용되어온 미생물으로서, 미국특허 제4,346,227호 등에서는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) NRRL-1233, 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) IFO-3363, 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) IFO-3411 등을 사용하였고; 일본특허공고 평4-349034호 등에서는 스트렙토마이세스 카르보필루스(Streptomyces carbophilus) SANK 62585(FERM BP-1145), 스트렙토마이세스 할스테디이(Streptomyces halstedii) IFO-3199을 사용하였다.

그러나, 상기와 같은 미생물을 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 제조한 경우 하이드록실화 반응성이 낮으며 특히 상기 화학식 2a 또는 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체에 대한 생육저해를 받기 때문에 이들 화합물은 저농도로 첨가하여야 하며, 이로 인해 생산성이 떨어지는 문제가 있었다.

이에 본 출원인은 종래 미생물에 의한 효소적-하이드록실화 반응에서의 전구체에 대한 내성이 우수한 균주를 선택하고자 노력하였고, 이로써 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenus subsp.) KCTC 12385를 사용하여 높은 생산성으로 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법을 이미 특허출원한 바도 있다[대한민국특허공개 제96-41369호].

본 발명에서는 상기 화학식 2a 또는 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체에 대한 높은 내성을 갖으며, 효소적-하이드록실화 반응성이 높은 신균주 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 분리 동정하였고, 이러한 미생물 배양액 또는 미생물 추출물에 상기 프라바스타틴 전구체를 첨가하여 배양함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118와 이를 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 대량 생산하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 프라바스타틴 나트륨의 적외선 흡수 스펙트럼이고;

도 2는 프라바스타틴 나트륨의¹³C-NMR 스펙트럼이고;

도 3은 프라바스타틴 나트륨의¹H-NMR 스펙트럼이다.

본 발명은 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118 균주를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 다음 화학식 2a 또는 화학식 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체를 미생물에 의한 효소적-하이드록실화 반응시켜 다음 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 있어서, 상기 미생물로는 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 사용하는 것을 또다른 특징으로 한다.

화학식 2a

화학식 2b

상기 화학식 2b에서, R은 H 또는 Na이다.

화학식 1

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 효소적-하이드록실화 반응성이 높고, 상기 화학식 2a 또는 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체에 내성을 갖는 신균주 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 프라바스타틴 전구체에 첨가하고 배양하는 효소적-하이드록실화 반응에 의하여 고지혈증 치료제로 널리 알려져 있는 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신균주 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118의 분리방법은 다음과 같다.

신규 미생물의 분리

토양 샘플을 멸균 증류수에 10^-3∼ 10^-5배로 희석하고 ISP No.2 한천에 상기 화학식 2a, 2b 또는 이들의 프라바스타틴 전구체 혼합물 0.05 ∼ 0.5%(w/v)를 첨가한 후 도말하여 27℃에서 7일간 배양한다. 그 결과 배양액으로부터 총 500여종의 균주를 분리하였고, 이들 균주중 프라바스타틴 전구체에 내성을 갖고 있으며 효소적-하이드록실화 반응성이 높은 균주를 최종적으로 1종 분리하였다. 분리 신균주를 YJ-118이라 명명하였다.

신규 미생물의 동정

상기에서 분리된 신균주 YJ-118의 생물학적 특징은 다음과 같다.

⑴ 형태적 특징

분리 균주 YJ-118은 ISP(International Streptomyces Project)에 규정된 배지에서 27℃로 7 ∼ 14일간 배양한 후 관찰하였다. 성장은 활발히 일어났으며, 기질균사(Substrate mycelium), 공중균사체(Aerial mycelium), 포자(Spore)를 생산하였다. 주사현미경 관찰결과, 포자는 표면이 매끈(Smooth)하고 원통형이었으며 포자사슬형태는 직선형이거나 휘어져 있었다(rectiflexible). 또한 포자낭의 윤생체, 공막, 분열체와 같은 특징기관은 관찰되지 않았다.

⑵ 세포내 성분

균주 YJ-118의 세포벽 성분을 문헌[Yamada et al., Gen. Appl. Microbiol. 16 : 103∼113(1970)]에 기재된 방법에 따라서 분석한 결과, L,L-디아미노피멜산 및 글라이신, 글루타민산, 알라닌이 검출되었고, 이로써 균주 YJ-118의 세포벽은 세포벽 형태 1에 해당하였다.

세포내 당(糖)성분을 문헌[M. P. Lechevalier et al., Journal of Laboratory and clinical Medicine, 71, 934(1968)]에 기재된 방법에 따라 분석한 결과 특징적인 패턴이 발견되지 않았다.

상기와 같은 결과에 의하면, 본 발명에서의 분리 균주 YJ-118은 악티노마이세테스(Actinomycetes)속의 1종인 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속(genus)에 속하는 것이 명확하게 판명된다.

⑶ 종(Species)동정을 위한 특성분석 및 탁손(TAXON)프로그램에 의한 수리

윌리암 등의 방법에 따라 주군집(Major cluster)동정을 위한 50단위형질(Unit characters)을 조사하였으며, 부군집(Minor cluster)동정을 위하여 34단위형질을 조사하였다.

탁손(TAXON)프로그램은 영국 뉴캐스틀 엎온 타인(Newcastle upon Tyne)대학 미생물학과의 알랜 워드(Alan ward)박사에 의해 개발된 프로그램이다. 이 프로그램에서는 - 또는 +로 간단하게 입력하고, 입력된 자료를 크러스턴(CLUSTAN)으로 분석하여 수리분류하며, 수리분류 데이터를 기본으로하여 작성된 동정확률 행렬(Probabilistic identification matrix)의 특성과 미지균의 특성을 비교 분석하여 수리동정 한다[Journal of general microbiology(1983), 129, 1743∼1813; Rho. Y. T. ph. D. Thesis, Seoul National univ(1993)].

본 발명에서는 종(Species)수준의 동정을 위하여, 실시한 분리균주의 단위 특성을 기본으로 하여 현재까지 분류가 완성된 균주들의 특징을 데이터베이스화하여 이를 수리 분류하도록 작성한 탁손(TAXON)프로그램을 이용하여 수리 동정하였다. 동정에 필요한 균주 YJ-118의 54단위형질(unit characters)은 다음 표 1a 및 표 1b와 같다.

단 위 특 성	YJ-118
형태 및 색소생성	포자사슬형태	직선형이거나 휘어짐(RFS)	+
	포자사슬형태	나선형(SPI)	-
	포자의 색깔	적색(RED)	-
	포자의 색깔	회색(GRY)	+
	균사체 색깔	적색/오렌지색(ROS)	-
	가용성 색소	생성(PIG)	+
	가용성 색소	황색/갈색 (YBP)	+
	멜라노이드 안료의 생성	PYI배지(MPI)	+
	멜라노이드 안료의 생성	타이노신 배지 (MTY)	+
항균력 시험	바실러스 서브틸리스(SUB)	-
	마이크로코커스 루테우스(LUT)	-
	캔디다 알비칸스(ALB)	-
	싸카로마이세스 세레비지아(CER)	-
	스트렙토마이세스 뮤리너스(NUR)	-
	아스파르기루스 나이거(NIG)	+
생화학 시험	레시친나제(LEC)	+
	리포라이시스(LIP)	+
	펙틴 가수분해(PEC)	+
	질산염의 환원(NO₃)	+
	H₂S 생성(H₂S)	+
	하이푸메이트(HIP)	-
분해능 시험	에라스틴(ELA)	+
	크산틴(XAN)	+
	알부틴(ARB)	+

항생물질 내성	네오마이신(NEO)	-
	리팜피신(RIF)	-
	오렌도마이신(OLE)	+
	페니실린 G(PEN)	+
생장시험	45℃(45C)	-
	NaCl(7NA)	-
	아자이드 나트륨(OIZ)	-
	페놀(PHN)	-
	포타슘 텔루리트	-
	탈루스 아세테이트	-
질소원 이용시험	DL-α-아미노-n-부틸산(BUT)	+
	L-시스테인(CYS)	+
	L-바린(VAL)	+
	L-페닐알라닌(PHE)	+
	L-히스티딘(HIS)	+
	L-하이드록시 프로린	+
탄소원 이용	수크로스(SUC)	-
	메소-이노시톨(INO)	-
	만니톨(MAN)	-
	L-람노즈(RHA)	-
	라피노즈(RAF)	-
	D-멜리지토즈(MEZ)	+
	아도니톨(ADO)	+
	덱스트란(DEX)	-
	D-멜리비오즈(MEB)	+
	크실리톨(XYT)	-

분리한 균주 YJ-118을 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 주군집(Major cluster)을 대상으로 탁손(TAXON)프로그램을 사용하여 50가지 특성에 대해 수리동정하여 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다. 표 2에 의하면, 주군집 5(스트렙토마이세스 엑스포리아투스)에 대해 높은 윌콕스 확률(Willcox probability; 0.99999)을 나타내었다.

탁손(TAXON)프로그램에 의한 스트랩토마이세스(Streptomyces)의 주군집(Major cluster)으로 분리한 YJ-118의 동정 점수

탁손 주군집	분류학적 거리	90% 분류군 반경	더멀리 있을 확률	윌콕스 확률
5	0.3838	0.4455	48.4519	0.999999
6	0.4614	0.4126	0.1274	0.000000
33	0.4721	0.3955	0.0050	0.000000
1C	0.4723	0.3883	0.0016	0.000000
1B	0.5252	0.4404	0.0053	0.000000

스트렙토마이세스(Streptomyces)의 주군집 5는 18균종으로 구성된 집단으로 분리주 YJ-118과 이 구성 균종과의 분류단위 특성을 비교하고 심플 매칭 계수(Simple matching coefficient-SSM)를 이용하여 가장 유사한 균주를 찾아보았다.

그 결과, 주군집 5의 대표균주인 스트랩토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus)의 중심균주인 스트렙토마이세스 나쉬빌렌시스(Streptomyces nashvillensis)에 대해 40%만이 일치하였는 바, 분리주 YJ-118을 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118로서 동정하였다.

스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118 균주는 1997년 2월 7일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 기탁하여 수탁번호 KCTC 0318BP를 부여받았다.

프라바스타틴을 생산하는 상기의 미생물을 생물공학적으로 돌연변이 등에 의해 형질변환시켜 목적화합물을 제조할 수 있으며, 플라스미드 유전자 조작 등을 본 발명에 사용할 수 있다.

이와 같은 미생물을 프라바스타틴 나트륨의 제조에 적용한 예는 없으며, 이를 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 경우 고농도 기질을 첨가할 수 있으며 효소적-하이드록실화 반응성이 높으므로 생산성이 높다.

상기와 같은 방법으로 분리 동정한 스트렙토마이세스 엑스포리아투스 YJ-118 균주를 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법을 자세히 설명하면 다음과 같다.

우선, 포도당 0.5∼3.0%, 효모추출물 1.0∼3.0%, 육즙추출액 0.1∼1.0% 및 카제인 분해물(N-Z 아민 A) 0.5∼2.0%를 함유하는 제1배지에 상기 화학식 2a 또는 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체 0.01∼0.05%(w/v)를 무균여과하여 투입한 다음, 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118 균주를 접종하고 27℃에서 2 ∼ 3일 동안 진탕배양한다. 제1배지에서 자란 접종 종자배지를 포도당 1.0∼3.0%, 효모추출액 0.5∼2.0%, 폴리펩톤 0.1∼2.0%, K₂HPO₄0.01∼0.5%, MgSO₄·7H₂O 0.01∼0.1% 및 NaCl 0.01∼0.1%을 함유하는 제2배지내에 그 농도가 10%(w/v)가 되도록 접종하여 다시 27℃에서 진탕배양한다.

그런 다음, 여기에 화학식 2a 또는 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체를 배지부피에 대하여 최종농도가 0.1 ~ 5.0%(w/v), 바람직하기로는 0.1 ~ 3.0%(w/v)될 때 까지 첨가하고 이를 다시 27℃에서 진탕배양한다. 그리고, 전구체가 첨가된후 2 ∼ 3일째에 포도당을 0.3 ~ 0.5%(w/v) 추가로 첨가하는데 이는 포도당이 효소적-하이드록실화 반응에서 에너지원 및 촉매작용을 하기 때문이다.

상기와 같은 배양에 있어서, 프라바스타틴 전구체로서 상기 화학식 2a, 2b 또는 이들의 혼합물을 첨가한다. 미생물 종자 배양을 위한 제1배지에 프라바스타틴 전구체를 투입하지 않아도 종래의 다른 미생물 배양방법에 비교하여 향상된 프라바스타틴의 생산성을 기대할 수 있으나, 효소적-하이드록실화 반응을 활성화하기 위하여 0.05%(w/v) 범위 미만으로 프라바스타틴 전구체를 투입하는 것이 바람직하며, 0.05%(w/v)를 초과하여 과량의 전구체 투입은 오히려 종자 배양 시간을 연장시키고 배양상태가 불량해지는 문제를 야기시킨다. 그리고 미생물 배양배지(제2배지)에는 프라바스타틴 전구체를 0.1 ~ 5.0%(w/v) 투입하는 바, 이때 전구체의 투입량이 0.1%(w/v) 미만이면 프라바스타틴의 생산성이 낮아지며, 5.0%(w/v)를 초과하면 균체의 성장이 나빠짐은 물론이고 프라바스타틴의 생산성이 저하되는 문제가 있다. 배양 시간은 배양조건에 따라서 광범위하게 변화할 수 있지만, 본 발명의 경우 프라바스타틴 전구체를 첨가한 후 5 ∼ 7일의 기간이 적당하다.

이로써 종래 미생물을 이용한 효소적-하이드록실화 반응에서는 기질농도를 0.05 ~ 0.1%(w/v) 정도밖에 상승시킬 수 없었으나, 본 발명에 따른 신균주는 기질에 대한 저항성이 높고 효소적-하이드록실화 반응성이 높기 때문에 미생물 배양방법에서 최고 5%(w/v)의 고농도 기질 첨가가 가능하다.

상기 배양이 완료되면, 배양액중으로부터 목적으로 하는 프라바스타틴 나트륨을 분리정제한다. 분리정제 공정은 통상의 공정이며, 배양조건에 따라 적절히 다양화시킬 수도 있다. 분리공정의 하나의 구현예로서, 먼저 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 여과액을 흡착수지에 흡착시킨 뒤 증류수로 세척한다. 세척이 완료된 후 흡착된 프라바스타틴 나트륨은 유기용매(20∼50% 수성아세톤 또는 20∼50% 수성메탄올, 바람직하기로는 25% 수성아세톤이나 30% 수성메탄올)로 용출시키고, 얻어진 용출액을 침전법이나 혹은 액체 크로마토그래피법을 반복 수행으로 정제하여 고순도의 프라바스타틴 나트륨을 얻는다.

이와 같은 방법으로 제조된 프라바스타틴 나트륨은 종래 미생물 예를들면 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) NRRL-1233, 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) IFO-3363, 스트렙토마이세스 크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) IFO-3411, 스트렙토마이세스 카르보필루스(Streptomyces carbophilus) SANK-62585(FERM Bp-4128) 또는 스트렙토마이세스 할스테디이(Streptomyces halstedii) IFO-3199에 비교하여 보다 기질첨가 농도 및 생산성이 월등히 높다.

이와같은 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같은바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조실시예 : 신규 미생물의 분리

우리나라의 전국 일원에서 채취한 토양시료를 멸균 생리식염수에 10^-3∼10^-5배로 희석하였다. ISP No.2 한천에 상기 화학식 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체를 0.05 ∼ 0.5%(w/v) 첨가한 후, 상기 희석된 토양시료를 일정량 도말한 후 27℃ 항온기에서 5∼10일 동안 배양하여 방선균, 세균 등을 순수 분리하였다. 순수 분리한 500여 균주를 벤넷즈(Bennett's)배지 20㎖가 포함된 125㎖ 삼각플라스크에 주입하고, 121℃에서 15분간 멸균한 후 상기 미생물 1백금환을 무균접종하고 난 후 27℃에서 5일간 진탕배양하였다.

배양개시 2일째 상기 화학식 2a로 표시되는 ML-236B락톤을 0.05% 첨가하고 3일간 배양을 시킨 후, 배양액만을 취하여 액체 크로마토그래피로 상기 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴의 양을 측정하여 효소적-하이드록실화 반응성이 있는 균주를 2차로 10여종을 선별하였으며, 이 중에서 프라바스타틴 전구체에 대한 내성이 높은 균주 1종 즉, 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118을 최종적으로 분리하였다.

실시예 1.

제1배지(pH 7.0; 포도당 1%, 효모추출물 0.2%, 유즙 추출물 0.2%, 카제인 분해물(N-Z아민)0.5% 함유) 20㎖를 각각 포함하는 125㎖용 삼각플라스크에 화학식 2a로 표시되는 ML-236B락톤 0.02%(w/v)를 첨가한 다음, 상기 제조실시예에서 분리한 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118 균주를 접종하였다. 접종한 삼각플라스크는 27℃, 200rpm으로 하여 2일간 진탕 배양하므로써 미생물 종자 배양하였다.

제2배지(pH 7.2; 포도당 1.0%, 효모추출물 1.0%, 폴리펩톤 0.5%, K₂HPO₄0.1%, MgSO₄·7H₂0 0.05%, NaCl 0.01∼0.1% 함유) 400㎖를 각각 포함하는 2ℓ용 삼각플라스크 5개에 상기 종자배지(제1배지)를 20㎖씩 접종하고 27℃, 150rpm으로 1일간 진탕 배양시켰다. 1일간 배양시킨 후, 상기 화학식 2a로 표시되는 ML-236B락톤을 0.05%(w/v) 농도로 하루간격으로 첨가하여 최종농도가 0.2%(w/v)가 될 때까지 각각의 플라스크에 첨가하였다. 계속해서 27℃에서 150rpm으로 6일간 진탕배양시켰다. 그리고, 프라바스타틴 전구체를 첨가한 후 포도당 0.3%를 2일 간격으로 2회 첨가하였다.

배양종료후 배양액을 pH 9.0으로 조절하여 실온에서 3시간 교반한 후 원심분리하여 균체를 제거하였으며, 상등액을 HP-20(삼양사제품)수지 500㎖의 칼럼에 흡착시킨 후, pH 7.5로 조절한 증류수로 충분히 세척하였다. 세척이 끝난 후에 흡착된 프라바스타틴 나트륨염을 25% 수성아세톤로써 용출시켜 프라바스타틴 나트륨염을 함유한 분획을 얻었다.

이 분획을 감압 농축한 후 얻어진 생성물을 분취용 액체 크로마토그래피(컬럼: Kromasil c18, 35%(w/v) 아세토나이트릴, 20㎖/min)를 반복 수행하여 정제된 프라바스타틴 나트륨 1,254㎎(627 ㎎/ℓ)을 얻었다.

실시 예 2.

상기 실시예 1과 동일한 배양방법으로 프라바스타틴 나트륨을 제조하되, 다만 제2배지에서 미생물 배양 12시간 이후부터 화학식 2b로 표시되는 ML-236B 나트륨염을 0.04%(w/v) 농도로 12시간 간격으로 첨가하여 최종농도가 0.4%가 될 때까지 각각의 플라스크에 첨가하였다. 그리고 계속해서 27℃에서 150rpm으로 7일간 진탕배양시켰다.

그 결과, 배양 완료후 배양액으로부터 정제된 프라바스타틴나트륨 2.68g(1,340 ㎎/ℓ)을 얻었다.

실시예 3.

제1배지에서 미생물 종자 배양시 프라바스타틴 전구체 혼합물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 프라바스타틴 나트륨을 제조하였다. 배양 완료후 배양액으로부터 정제된 프라바스타틴나트륨 778㎎(389 ㎎/ℓ)을 얻었다.

상기 실시예 3은 제1배지에서 종자배양시 프라바스타틴 전구체를 첨가하지 않고 다만 제2배지에 프라바스타틴 전구체를 첨가하여 미생물을 배양시킨 예로서, 이는 종래 미생물을 이용하여 배양시킨 경우에 비교하여 60 ~ 65% 향상된 생산성을 나타낸다.

비교예 : 미국특허 제 4,346,227호

포도당 2.0%, 옥수수 침지액 0.2%, K₂HPO₄0.15%, 효모추출물 0.1%, MgSO₄·7H₂0 0.15%, ZnSO₄·7H₂O 0.001%, NH₄NO₃0.1%, 펩톤 0.1% 수돗물 잔액(pH 7.0으로 조절)의 배지 100㎖를 각각 포함하는 500㎖용 플라스크 20개에 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces roseochromogenus) NRRL 1233를 접종하였다. 플라스크를 26℃, 120rpm으로 하여 2일간 진탕배양하엿다. 2일배양 끝무렵에 화학식 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체(R=Na)를 최종 농도가 0.05%(w/v)될 때까지 각각의 플라스크에 첨가하였다. 26℃, 120rpm으로 하여 5일간 계속 배양하였다. 배양이 완료된 후 상기 실시예 1과 같은 방법으로 정제하여 최종적으로 프라바스타틴 나트륨 120㎎(60 ㎎/ℓ)을 얻었다.

상기 비교예의 경우 기질농도 0.05%(w/v)에서 프라바스타틴 나트륨의 생산량이 60 ㎎/ℓ인데 반하여 본 발명에 따른 배양방법에서는 기질농도를 5%(w/v)의 고농도까지 상승시키는 것이 가능하고 이때의 프라바스타틴 나트륨의 생산량이 최고 1,250 ㎎/ℓ로서 매우 향상됨을 알 수 있다.

실험예.

상기 실시예 1 및 비교예에서 제조한 프라바스타틴 나트륨 각각에 대한 분자량, 자외선 흡광도, 적외선 흡광도, 선광도 및 질량스펙트럼 분석 결과는 다음 표 3에 나타내었다. 그리고 본 발명에서 제조된 프라바스타틴 나트륨의 적외선 흡수 스펙트럼은 도 1에 나타내었고,¹³C-NMR 스펙트럼은 도2에 나타내었으며,¹H-NMR 스펙트럼은 도 3에 나타내었다.

구 분	실 시 예 1	비 교 예
구 조 식	C₂₃H₃₅0₇Na	C₂₃H₃₅0₇Na
분 자 량	446.52	446.52
UV(MeOH)	230, 237, 245	230, 237, 245
IR(KBr)	3415, 2964, 2935, 2875, 1727, 1578, 1402, 1265, 1184, 1157, 1085, 1043, 1015, 854, 557, 421 ㎝^-1	2960, 2930, 2875, 1725, 1565, 1400, 1330, 1300, 1265, 1180, 1160, 1080, 1045, 1015, 965 ㎝^-1
선광도[α]²⁶	+150∼160	+150∼160

본 발명에 따른 신균주 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 사용한 배양방법은 기질 첨가 농도가 최고 0.5%(w/v)이며,이로 인해 프라바스타틴의 생산성은 600 ∼ 1,340 ㎎/ℓ으로서 종래 균주(60 ㎎/ℓ)에 비교하여 월등히 향상된 효과를 얻을 수 있다.

Claims

스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118 균주.
다음 화학식 2a 또는 화학식 2b로 표시되는 프라바스타틴 전구체를 미생물에 의한 효소적-하이드록실화 반응시켜 다음 화학식 1로 표시되는 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 있어서,

상기 미생물로는 스트렙토마이세스 엑스포리아투스(Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 사용하는 것을 특징으로 하는 프라바스타틴 나트륨의 제조방법.

화학식 2a

화학식 2b

상기 화학식 2b에서, R은 H 또는 Na이다.

화학식 1
제 2 항에 있어서, 미생물 종자 배양을 위한 제1배지에 상기 프라바스타틴 전구체를 0.05%(w/v) 미만의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 프라바스타틴 나트륨의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 미생물 배양을 위한 제2배지에 상기 프라바스타틴 전구체를 0.1 ∼ 5.0%(w/v) 첨가하는 것을 특징으로 하는 프라바스타틴 나트륨의 제조방법.