KR100470078B1 - 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환할 수 있는 스트렙토마이세스 종(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)ＣＪＰＶ 975652 및 그를 이용한 프라바스타틴의 제조방법 - Google Patents

컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환할 수 있는 스트렙토마이세스 종(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)ＣＪＰＶ 975652 및 그를 이용한 프라바스타틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시킬 수 있는 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 컴팩틴을 포함하는 배지에서 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)을 배양하고, 그 배양물로부터 프라바스타틴을 회수하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)를 이용한 프라바스타틴의 제조방법에 관한 것이다.

Description

컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환할 수 있는 스트렙토마이세스 종(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.) ＣＪＰＶ 975652 및 그를 이용한 프라바스타틴의 제조방법{Streptomyces sp. CJPV 975652 capable of converting compactin into pravastatin and a method for producing a a provastatin using the same}
본 발명은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환할 수 있는 신규의 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) 및 그를 이용한 프라바스타틴의 제조방법에 관한 것이다.
프라바스타틴(pravastatin)과 컴팩틴(compactin)은 고지혈증에 대한 치료 효과를 갖는 물질이다. 고지혈증은 선진국에서 심혈관계 질환에 의한 주요 사망원인이 되고 있는 동맥 경화증 및 관상동맥증의 중요한 원인이 된다. 고지혈증이란 혈장 내의 지질-콜레스테롤, 중성 지방의 농도가 지단백질의 대사이상으로 정상 범위를 넘어 증가한 상태를 말한다. 신체 콜레스테롤은 60% 이상이 체내에서 생합성에 의하여 얻어진다. 콜레스테롤의 생합성 과정에는 25개 이상의 효소가 관여하는데, 이들 효소 중 3-히드록시-3-메틸글루타릴(HMG)-CoA 환원효소가 주요 속도 제한 단계의 효소이다. 따라서, HMG-CoA 환원효소의 작용을 선택적으로 저해함으로써, 이러한 질병들을 효과적으로 치료할 수 있다. 컴팩틴 및 프라바스타틴은 이러한 HMG-CoA 환원효소의 경쟁적인 억제제로서 그 중 하나가 존재하면, 콜레스테롤 생합성을 억제할 수 있다. 예를 들면, 프라바스타틴을 하루 5mg-10mg 씩 3개월 정도 복용하면, 총콜레스테롤 값과 몸에 해로운 LDL-콜레스테롤 값이 20% 내지 40% 감소하는 것으로 알려져 있다. 상기 프라바스타틴은 예를 들면, 컴팩틴을 미생물에 의하여 수산화시켜 제조될 수 있으며, HMG-CoA 환원효소의 억제제로서 컴팩틴 보다 효과적이다.
현재 알려진 고지혈증 치료제 중 HMG-CoA 환원효소를 억제하는 의약품 중에서, 합성 의약품으로서는 심바스타틴(simvastatin) 및 아토바스타틴(atorvastatin) 등이 있다. 또한, 미생물 발효에 의하여 생산될 수 있는 의약품에는 로바스타틴과 프라바스타틴이 대표적이다. 상기 프라바스타틴은 전구체인 컴팩틴의 수산화에 의하여 생합성되는 약물로서 1980년대 초 개발된 이후, 그 효능과 안전성이 입증되어 활발하게 고지혈증 환자에게 사용되어져 왔다.
컴팩틴은 악티노마이세테스군의 노카르디아속; 마두로마이세테스군의 악티노뮤두라속; 및 스트렙토마이세테스군의 기타 종 가운데 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스속 및 스트렙토마이세스 카르보필루스속의 세균 및 다양한 진균속을 사용한 미생물적 수산화에 의해 프라바스타틴으로 전환될 수 있는 것으로 보고된 바 있다(미국특허 제5,179,013호, 제4,448,979호, 제4,346,227호, 제4,537,859호 및 일본특허 제58-10573호).
그러나, 여전히 발효액에서 고농도 및 높은 수율로 프라바스타틴을 생산할 수 있는 미생물 및 프라바스타틴의 개선된 미생물학적 제조방법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 높은 효율로 전환할 수 있는신규한 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 신규의 스트렙토마이세스 균주를 이용하여 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환하는 단계를 포함하는 프라바스타틴의 제조방법을 제공하는 것이다.
도1은 본 발명의 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)에 의하여 전환된 프라바스타틴의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 도1에서, 프라바스타틴의 체류시간(retention time)은 12.766분(면적 401298)이고, 컴팩틴의 체류시간은 18.337분(면적 230258)이었다.
도2는 HPLC에서 얻어진 프라바스타틴 분획(fraction)을 LC-MS 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 네가티브 모드에서 측정하였으며, 423의 위치에 있는 피크가 프라바스타틴을 나타내는 피크이다.
도3은 HPLC에서 얻어진 프라바스타틴 분획(fraction)을 MS 도우터 스캔(daughter scan) 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 네가티브 모드에서 측정하였으며, 423의 위치에 있는 피크가 프라바스타틴을 나타내는 피크이고, 321의 위치에 있는 피크가 프라바스타틴의 특징적인 분절 산물의 피크이다.
도4는 정제된 프라바스타틴의 자외선 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도5는 정제된 프라바스타틴의 수소-핵자기공명(H-NMR) 스펙트럼을 나타내는도면이다.
도6은 본 발명의 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)의 전자현미경 관찰 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시킬 수 있는 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)를 제공한다. 상기 균주는 배양액중에 컴팩틴을 프라바스타틴으로 높은 수율로 전환시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 컴팩틴을 포함하는 배지에서 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)을 배양하고, 그 배양물로부터 프라바스타틴을 회수하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)를 이용한 프라바스타틴의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, "컴팩틴(compactin)"이라 함은 메바스타틴(mevastatin)으로 알려진 락톤(lactone) 구조를 갖는 형태, 산(free acid) 형태 및 그의 염 형태 모두를 포함하는 것으로, 이들의 구조는 다음 화학식 1, 2, 및 3과 같다. 도3은 염 형태의 일예인 나트륨염을 나타낸다.
또한, 본 발명에 있어서, "프라바스타틴"이라 함은 상기 컴팩틴의 6β 위치에서 수산화된 화합물을 말하는 것으로, 락톤, 산 및 그의 염 형태를 포함하는 것이다(화학식 4, 5 및 6). 화학식6은 염 형태의 일예인 나트륨염을 나타낸다.
상기 배지는 통상의 스트렙토마이세스 속 균주의 배양에 사용되는 것이면 어느 것이나 될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 배양물로부터 프라바스타틴을 회수하는 단계는 통상의 분리정제 수단을 사용할 수 있다. 예를 들면, 추출 및 HPLC가 사용될 수 있다.
이하 본 발명은 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 토양 미생물의 분리 및 동정
토양은 인삼밭(경기도, 강화지역)에서 채취하였으며, 40℃에서 24시간 동안 건조하였다. 상기 건조된 토양 시료 1.0g을 10ml의 멸균 증류수에 현탁, 2회 연속 희석하고, 20ml의 방선균 분리용 한천 배지(표1 참조)에 희석액 0.1ml 씩을 도말하고, 28℃에서 14-21일 동안 배양하여, 토양 미생물을 분리하였다. 상기 방선균 분리용 배지는 항진균제인 사이클로헥시미드(cycloheximide, 50㎍/ml)와 항균제 날리딕식산(nalidixic acid, 200㎍/ml)을 포함하는 휴믹산-비타민 한천배지(humic acid-vitamin agar)를 사용하였으며, 121℃에서 15분 동안 멸균한 후 별도로 여과 살균한 항진균제와 항균제를 첨가하였다. 휴믹산-비타민 한천 배지의 조성은 표1과 같다.
표1. 휴믹산-비타민 한천 배지의 조성
성 분 조 성 비 고
휴믹산 1.0g 0.2N NaOH 10ml 용해
Na2HPO4 0.5g
KCl 1.71g
MgSO4ㆍ7H2O 0.05g
FeSO4ㆍ7H2O 0.01g
비타민 B 군 0.5mg 시아민-HCl, B2, 니아신, 피리독신-HCl, 이노시톨, Ca-펜토세테이트, p-아미노 에벤존산 각 0.5mg, 비오틴 0.25mg
시클로헥시미드 50mg
날리딕식산 200㎍/ml
한천 20g
증류수 1L pH 7.0
이러한 방법으로 얻어진 토양 방선균 집락을 순수 분리하고, 배양 중에 컴팩틴을 전구체로 첨가하였을 때, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 방선균을 분리하고, 이를 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)로 명명하였다.
상기 미생물의 생육은 전반적으로 양호하였으며, 기균사는 주로 황색, 회색이었으며, 배면색은 주로 옅은 황색이었다. 상기 미생물의 전자현미경 관찰 결과 포자사슬은 직선형이었으며, 포자 표면은 매끄러웠고, 분절된 형태를 나타내었다(도 6). 상기 미생물은 배지 내의 디(D)-글루코스, 자당, 디(D)-마니톨, 디(D)-프럭토스, 디(D)-자일로스, 엘(L)-아라비노스, 아이-이노시톨, 람노스, 라피노스 등 대부분의 당류를 사용하였으며, 젤라틴 액화력은 양성, 전분분해력도 양성으로 나타났다. 또한, 세포벽을 분해시켜 세포벽내 당분석을 실시한 결과, 글루코스, 아라비노스, 갈락토스, 리보오스가 검출되었으며, 아미노산의 분석에서는 메조-디아미노피멜릭산이 검출되었다.
이러한 상기 분리 주의 형태학적, 배양학적 특성 및 생리학적 특성을 종합하여 기존의 방선균과 비교하여 본 결과, 스트렙토마이세스 속의 새로운 종으로 판단되어 이 분리주를 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652로 명명하고, 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2003년 5월 12일 자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM-10497). 상기 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 배양학적 특성은 표2.와 같다.
표2. 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 배양학적 특성.
배 지 생장정도 기균사 색 배면색 수용성 색소
트립톤-효모 추출물 한천배지 좋음 연황색 연갈색 -
효모 추출물-말트 추출물 한천배지 매우좋음 밝은회색 갈색 -
오트밀 한천배지 좋음 백색, 미색 미색 -
무기염-전분 한천배지 매우좋음 백색, 미색 황색 -
글리세롤-아스파라긴 한천배지 좋음 황색, 백색 연갈색 -
티로신 한천배지 매우좋음 연황색 황색 밝은 황색
영양 한천배지 보통 백색,미색 황색 -
설탕 한천배지 매우좋음 미색 황색 -
포도당-아스파라긴 한천배지 좋음 미색 미색 -
또한, 상기 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 탄소원 이용특성은 표3과 같다.
표3. 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 탄소원 이용특성.
탄 소 원 이 용
디-글루코스 +
엘-아라비노스 +
자당 +
디-자이로스 +
아이-이노지톨 +
디-만니톨 +
디-프럭토스 +
라피노스 +
또한, 상기 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 생리학적 특성은 표4와 같다.
표4. 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 생리학적 특성.
항 목 특 성
멜라닌 생성 음 성
질산염 환원 양 성
녹말의 가수분해 양 성
젤라틴 액화 양 성
카제인 분해 음 성
카제인 응고 양 성
또한, 상기 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 세포벽 성분의 특성은 표5와 같다.
표5. 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)의 세포벽 성분.
항 목 성 분
디에이피(DAP, diaminopimellic acid) 메조-디에이피
글리신(Glycine) -
당 수크로스갈락토스아라비노스리보오스
실시예2 : 스트렙토마이세스 종( Streptomyces sp.) CJPV 975652(수탁번호 KCCM-10497)에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환 확인.
사용균주 : 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652.
배양방법 : 전배양배지(표6) 50㎖를 500㎖ 삼각플라스크에 분주하고, 121℃에서 20분 동안 가압 살균하였다. 평판배지에서 2주 동안 자란 배지(균주포함) 조각(0.5cm x 0.5cm)을 살균된 전배양 배지에 식균하고, 회전 교반 배양기에서 분당 250회전 속도로 교반하면서 28℃에서 2일 동안 배양하였다.
121℃에서 20분 동안 가압 살균된 본배양 배지(표7) 50㎖을 500㎖ 삼각플라스크에 넣고, 상기 얻어진 전배양액을 10%(5㎖, v/v)로 접종하고, 회전 교반 배양기에서 분당 250회전 속도로 교반하면서 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양 2일째부터 멸균된 컴팩틴(나트륨염 형태)을 0.5g/L의 농도로 매일 2회씩 첨가하여 프라바스타틴으로의 전환을 유도하였다. 균체의 성장은 발효액 10㎖을 취하여 450xg에서 10분 동안 원심분리한 후, PMV(Packed Mycellium Volume)을 측정하였다.
그 결과, 배양액의 pH는 7.50, PMV는 23%였다. 프라바스타틴 분석은 워터스 C18 컬럼(3.9 x 300mm)과, 시마주(Shimadzu) (Model LC-10AD) HPLC 기기를 사용하였다. 이 배양액 600㎕에 400㎕의 에탄올을 가하여 혼합하고, 15분 내지 30분간 흔들고 원심분리하여 HPLC 분석법(메탄올 : 트리에틸아민 : 초산 : 물 = 500 : 1 : 1: 500, 1ml/min 유속)으로 정량 하였을 때, 배양액 중의 프라바스타틴이 확인 되었다(도1). 또한, LC-MS 및 자외선 흡광도를 측정하여 프라바스타틴을 재확인하였다(도2, 도3 및 도4). LC는 PDA2996(Waters 사)을 사용하였으며, 질량분석기(Mass spectrometer)는 Ultima-PT(Micro-Mass 사)를 사용하였다. 질량분석 조건은 모세관 전압 1970V, 콘 전압(cone voltage) 97V, 충돌 에너지(collision energy) 13eV이었으며, 네가티브 모드(negative mode)로 측정하였다.
도1에서, 프라바스타틴의 체류시간(retention time)은 12.766분(면적 401298)이고, 컴팩틴의 체류시간은 18.337분(면적 230258)이었다. 도1에 나타낸, HPLC 크로마토그램에서 컴팩틴과 프라바스타틴의 면적 합계에 대한 프라바스타틴의 면적 비율은 약 64%로서, 컴팩틴에서 프라바스타틴으로의 전환비율이 약 64%이상으로 아주 높음을 알 수 있었다.
도2 및 도3에서, 423의 위치에 있는 피크가 프라바스타틴을 나타내는 피크이다. 상기 프라바스타틴은 네가티브 모드에서 측정된 것이므로, 나트륨이 이탈된 형태인 것으로 여겨진다. 321의 위치에 있는 피크는 프라바스타틴의 분절(fragmentation)에 의하여 형성된 물질(딸형(daughter type) 물질)로서, 프라바스타틴의 특징적인 피크이다.
표6. 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652의 전배양 배지.
성 분 함 량
효모-추출물 0.1%
대두분 1.5%
NaNO3 0.5%
포도당 1.5%
글리세롤 0.25%
CaCO3 0.4%
표7. 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652의 본배양 배지.
성 분 함 량
효모-추출물 0.1%
대두분 2.0%
펩톤 0.5%
NaNO3 0.5%
포도당 3.0%
글리세롤 0.25%
CaCO3 0.4%
NaCl 0.5%
실시예3 : 프라바스타틴의 정제
배양이 끝난 미생물 배양물 3L를 2배의 증류수로 희석한 한 다음, 3% 부피의 규조토를 교반하며 가하고, 규조토로 충진 된 여과용 깔대기로 여과하였다. 다음으로, 500ml의 HP-20 수지가 충진 된 컬럼에 상기 여과물을 흡착시겼다. 충분한 양의 물로 수세한 다음, 50%의 에탄올용액으로 용출하였다. 용출된 용액에 활성탄 및 알루미나 수지를 사용하여 탈색한 후, 감압 농축기를 사용하여 농축하였다.
농축된 조 정제물을 XAD-1600 (Amberlite사) 수지가 200ml 충전 된 컬럼에 흡착시키고, 10% 에탄올을 이용하여 세척한 다음, 40%의 에탄올 용액으로 프라바스타틴을 분리하였다. 상기 분리 된 용액을 감압 농축하고, 이 프라바스타틴 정제물을 에탄올과 에틸아세테이트를 사용하여 결정화시키고 여과하여 감압 건조를 통하여 1.3g의 백색 결정을 얻었다. 상기 얻어진 프라바스타틴을 수소 핵자기공명(H-NMR) 분석을 하였다. 이때 NMR 기기는 Brucker ARX400 FT-NMR을 사용하였으며, 용매로는 MeOH-d4를 사용하였다.
그 결과를 도5에 나타내었다. 도5에서, 각 화학적 시프트(chemical shift)에 대한 할당(assignment) 결과는 다음 표8과 같다.
표8. 화학적 시프트의 할당 결과.
도5에 나타낸 바와 같이, 프라바스타틴을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)에 의하면, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 높은 효율로 전환시킬 수 있다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)를 이용한 프라바스타틴의 제조방법에 의하면, 프라바스타틴을 높은 효율로 제조할 수 있다.

Claims (2)

  1. 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시킬 수 있는 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497).
  2. 컴팩틴을 포함하는 배지에서 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)을 배양하고, 그 배양물로부터 프라바스타틴을 회수하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.) CJPV 975652(KCCM-10497)를 이용한 프라바스타틴의 제조방법.
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