JP2005000144A - コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種cjpv975652及びそれを利用したプラバスタチンの製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種(Streptomyces sp.)CJPV 975652及びそれを利用したプラバスタチンの製造法を提供する。
【解決手段】コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)および、コンパクチンを含む培地でストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を培養して、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法。これにより、コンパクチンをプラバスタチンに高効率で転換でき、またプラバスタチンを高効率で製造できる。
【選択図】 図1
【解決手段】コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)および、コンパクチンを含む培地でストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を培養して、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法。これにより、コンパクチンをプラバスタチンに高効率で転換でき、またプラバスタチンを高効率で製造できる。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに転換できる新規のストレプトミセス種(Streptomyces sp.)及びそれを利用したプラバスタチンの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
プラバスタチン(pravastatin)とコンパクチン(compactin)とは高脂血症に対する治療効果を有する物質である。高脂血症は先進国で心血管係疾患のうち主要死亡原因となっている動脈硬化症及び冠状動脈症の重要な原因となる。高脂血症とは、血しょう内の脂質−コレステロール、中性脂肪の濃度が脂蛋白質の代謝異常に正常範囲を超えて増加した状態を意味する。身体のコレステロールは60%以上が体内で生合成によって得られる。コレステロールの生合成過程には25個以上の酵素が関するが、それら酵素のうち3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル(HMG)−CoA還元酵素が主要速度制限段階の酵素である。したがって、HMG−CoA還元酵素の作用を選択的に阻害することによって、かかる疾病を効果的に治療できる。コンパクチン及びプラバスタチンはこのようなHMG−CoA還元酵素の競争的な抑制剤であって、そのうち一つが存在すれば、コレステロール生合成を抑制できる。例えば、プラバスタチンを一日5mg〜10mgずつ約3ケ月服用すれば、総コレステロール値と体に悪いLDL−コレステロール値とが20%ないし40%減少すると知られている。前記プラバスタチンは、例えば、コンパクチンを微生物によって水酸化させて製造され、HMG−CoA還元酵素に対する抑制剤としてコンパクチンより効果的である。
【0003】
現在公知の高脂血症治療剤のうちHMG−CoA還元酵素を抑制する医薬品のうち、合成医薬品としてはシンバスタチン(simvastatin)及びアトルバスタチン(atorvastatin)などがある。また、微生物の醗酵によって生産されうる医薬品にはロバスタチンとプラバスタチンとが代表的である。前記プラバスタチンは前駆体であるコンパクチンの水酸化によって生合成される薬物であって、1980年代初めに開発された以降、その効能および安全性が立証されて活発に高脂血症患者に使用されてきた。
【0004】
コンパクチンはアクチノミセテス群のノカルディア属;マドゥロミセテス群のアクチノミュドラ属;及びストレプトミセテス群のその他の種のうちストレプトミセスロセオクロモゲネス属及びストレプトミセスカルボフィルス属の細菌及び多様な真菌属を使用した微生物的水酸化によりプラバスタチンに転換できると報告されたことがある(例えば、特許文献1ないし5参照)。
【0005】
しかし、依然として醗酵液から高濃度及び高収率でプラバスタチンを生産できる微生物及びプラバスタチンの改善された微生物学的製造法が要求されている。
【0006】
【特許文献1】
米国特許第5,179,013号公報
【特許文献2】
米国特許第4,448,979号公報
【特許文献3】
米国特許第4,346,227号公報
【特許文献4】
米国特許第4,537,859号公報
【特許文献5】
日本国特許第58−10573号公報
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに高効率に転換できる新規なストレプトミセス菌株を提供することである。
【0008】
また、本発明の目的は、前記新規のストレプトミセス菌株を利用してコンパクチンをプラバスタチンに転換する段階を含むプラバスタチンの製造法を提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を提供する。前記菌株は培養液中でコンパクチンをプラバスタチンに高収率に転換できる。
【0010】
また、本発明はコンパクチンを含む培地でストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を培養し、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法を提供する。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明において、「コンパクチン」とは、メバスタチンと知されたラクトン構造を有する形態、酸形態及びその塩形態いずれも含むものであって、それらの構造は次の化学式1ないし3と同一である。図3は、塩形態の一例であるナトリウム塩を示す。
【化1】
【化2】
【化3】
【0012】
また、本発明において、「プラバスタチン」とは、前記コンパクチンの6β位置で水酸化された化合物をいい、ラクトン、酸及びその塩形態を含むものである(化学式4ないし6)。化学式6は塩形態の一例であるナトリウム塩を示す。
【化4】
【化5】
【化6】
【0013】
前記培地は通常のストレプトミセス属菌株の培養に使われるものであればいかなるものでもよいが、ここに限定されることではない。また、前記培養物からプラバスタチンを回収する段階は通常の分離・精製手段を使用できる。例えば、抽出及びHPLCを使用できる。
【0014】
以下、本発明は実施例を通じて詳細に説明する。しかし、それら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれら実施例に限定されることではない。
【0015】
【実施例】
<実施例1> 土壌微生物の分離及び同定
土壌は朝鮮人参の畑(京畿道、江華島地域)から採取し、40℃で24時間乾燥させた。前記乾燥された土壌試料1.0gを10mlの滅菌蒸溜水に懸濁、2回続けて希釈し, それを0.1mlずつ放線菌分離用寒天培地(表1参照)20ml塗抹し、28℃で14〜21日間培養して土壌微生物を分離した。前記放線菌分離用培地は抗真菌剤であるシクロヘキシミド(50μg/ml)と抗菌剤ナリジクス酸(nalidixic acid,200μ g /ml)とを含むフミン酸−ビタミン寒天培地を使用(humic acid−vitamin agar)し、121℃で15分間滅菌した後、別途にろ過殺菌した抗真菌剤および抗菌剤を添加した。フミン酸−ビタミン寒天培地の組成は表1の通りである。
【0016】
【表1】フミン酸−ビタミン寒天培地の組成
【0017】
このような方法により得られた土壌放線菌集落を純粋分離し、培養中にコンパクチンを前駆体として添加した時、コンパクチンをプラバスタチンに転換する放線菌を分離してそれをストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)と名づけた。
【0018】
前記微生物の生育は全般的に良好であり、基菌糸(substrate mycelium)は主に黄色、灰色であり、背面色は主に薄い黄色であった。前記微生物の電子顕微鏡による観察結果、胞子鎖は直線型であり、胞子の表面は滑らかであり、分節された形態を示す。前記微生物は培地内のD−グルコース、蔗糖、D−マニトール、D−フルクトース、D−キシロース、L−アラビノース、I−イノシトール、ラムノース、ラフィノース等の大部分の糖類を使用し、ゼラチン液化力も、澱粉分解力も陽性を示した。また、細胞壁を分解して細胞壁内の糖分析を実施した結果、グルコース、アラビノース、ガラクトース、リボースが検出され、アミノ酸の分析結果、メゾ−ジアミノピメリン酸が検出された。
【0019】
このような前記分離株の形態学的、培養学的特性及び生理学的特性を総合して既存の放線菌と比較した結果、ストレプトミセス属の新しい種と判断されてこの分離株をストレプトミセス種CJPV 975652と名づけ、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに2003年5月12日付に寄託した(受託番号KCCM−10497)。前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の培養学的特性は表2の通りである。
【0020】
【表2】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の培養学的特性
【0021】
また、前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の炭素源利用特性は表3の通りである。
【0022】
【表3】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の炭素源利用特性
【0023】
また、前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の生理学的特性は表4の通りである。
【0024】
【表4】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の生理学的特性
【0025】
また、前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の細胞壁成分の特性は表5の通りである。
【0026】
【表5】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の細胞壁成分
【0027】
<実施例2> ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)によるコンパクチンのプラバスタチンへの転換確認
使用菌株:ストレプトミセス種CJPV 975652。
培養方法:前培養培地(表6)50mlを500mlの三角フラスコに分株し、121℃で20分間加圧殺菌した。平板培地で2週間育った培地(菌株を含む)切れ(0.5cm×0.5cm)を殺菌された前培養培地に植菌し、回転攪拌培養器で分当り250回転速度で攪拌しながら28℃で2日間培養した。
【0028】
121℃で20分間加圧殺菌された本培養培地(表7)50mlを500mlの三角フラスコに入れて前記得られた前培養液を10%(5ml, v/v)接種し、回転攪拌培養器で分当り250回転速度で攪拌しながら28℃で5日間培養した。培養2日目から滅菌されたコンパクチン(ナトリウム塩形態)を0.5g/Lの濃度で毎日2回ずつ添加してプラバスタチンへの転換を誘導した。菌体の成長は醗酵液10mlをとって450xgで10分間遠心分離した後、PMV(Packed Mycellium Volume)を測定した。
【0029】
その結果、培養液のpHは7.50、PMVは23%であった。プラバスタチン分析はウォーターズC18カラム(3.9×300mm)と、島津(ModelLC−10AD)HPLC機器を使用した。この培養液600μlに400μlのエタノールを加えて混合し、15分ないし30分間攪拌して遠心分離してHPLC分析法(メタノール:トリエチルアミン:酢酸:水=500:1:1:500、1ml/min流速)で定量した時、培養液中のプラバスタチンが確認された(図1)。また、LC−MS及び紫外線吸光度を測定してプラバスタチンを再確認した(図2、図3及び図4)。LCはPDA2996(ウォーターズ社)を使用し、質量分析器はUltima−PT(マイクロマス社)を使用した。質量分析条件は毛細管電圧1970V、コーン電圧97V、衝突エネルギー13eVであり、ネガティブモードで測定した。
【0030】
図1で、プラバスタチンの滞留時間は12.766分(面積401298)であり、コンパクチンの滞留時間は18.337分(面積230258)であった。図1に示した、HPLCクロマトグラムにおいてコンパクチンとプラバスタチンとの面積和に対するプラバスタチンの面積比率は約64%であって、コンパクチンからプラバスタチンへの転換比率が約64%以上で非常に高いことが分かった。
【0031】
図2及び図3において、423の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークである。前記プラバスタチンはネガティブモード測定されたので、ナトリウムイオンが離脱した形態と思われる。321の位置にあるピークはプラバスタチンの分節(fragmentation)により形成された物質(子形物質、daughter type)を示し、プラバスタチンの特徴的なピークである。
【0032】
【表6】ストレプトミセス種CJPV 975652の前培養培地
【0033】
【表7】ストレプトミセス種CJPV 975652の本培養培地
【0034】
<実施例3> プラバスタチンの精製
培養が終わった微生物の培養物3Lを2倍の蒸溜水で希釈した後、3%体積の硅藻土を攪拌しながら加えて、硅藻土で満たされたろ過用じょうごにろ過させた。次に、500mlのHP−20樹脂が満たされたカラムに前記ろ過物を吸着させた。十分量の水で洗浄した後、50%のエタノール溶液で湧出した。湧出された溶液に活性弾及びアルミナ樹脂を使用して色抜きした後、減圧濃縮器を使用して濃縮させた。
【0035】
濃縮された粗精製物をXAD−1600(アンバーライト社)樹脂が200ml満たされたカラムに吸着させ、10%エタノールを利用して洗浄した後、40%のエタノール溶液でプラバスタチンを分離した。前記分離された溶液を減圧濃縮し、このプラバスタチン精製物をエタノールおよびエチルアセテートを使用して結晶化させ、かつろ過して減圧乾燥を通じて1.3gの白色結晶を得た。前記得られたプラバスタチンを水素核磁気共鳴(H−NMR)分析し、その結果を図5に示した。該 NMR 器機は Brucker ARX400 FT−NMRであり、溶媒としてはMeOH−d4を使用した。図5で、各化学的シフトに対する割当て結果は次の表8の通りである。
【0036】
【表8】化学的シフトの割当て結果
【化7】
【0037】
図5に示したように、プラバスタチンを確認できた。
【0038】
【発明の効果】
本発明によるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)によれば、コンパクチンをプラバスタチンに高効率で転換できる。
【0039】
本発明によるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法によれば、プラバスタチンを高効率で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)によって転換されたプラバスタチンのHPLCクロマトグラムを示す図面である。図1で、プラバスタチンの滞留時間は12.766分(面積401298)であり、コンパクチンの滞留時間は18.337分(面積230258)であった。
【図2】HPLCで得られたプラバスタチン分画をLC−MS分析した結果を示す図面である。ネガティブモードで測定しており、423の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークである。
【図3】HPLCで得られたプラバスタチン分画をMS ドータースキャン分析した結果を示す図面である。ネガティブモードで 測定しており、423の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークであり、321の位置にあるピークがプラバスタチンの特徴的な分節産物を示すピークである。
【図4】精製されたプラバスタチンの紫外線スペクトルを示す図面である。
【図5】精製されたプラバスタチンの水素−核磁気共鳴(H−NMR)スペクトルを示す図面である。
【図6】本発明のストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)の電子顕微鏡による観察結果を示す図面である。
【発明の属する技術分野】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに転換できる新規のストレプトミセス種(Streptomyces sp.)及びそれを利用したプラバスタチンの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
プラバスタチン(pravastatin)とコンパクチン(compactin)とは高脂血症に対する治療効果を有する物質である。高脂血症は先進国で心血管係疾患のうち主要死亡原因となっている動脈硬化症及び冠状動脈症の重要な原因となる。高脂血症とは、血しょう内の脂質−コレステロール、中性脂肪の濃度が脂蛋白質の代謝異常に正常範囲を超えて増加した状態を意味する。身体のコレステロールは60%以上が体内で生合成によって得られる。コレステロールの生合成過程には25個以上の酵素が関するが、それら酵素のうち3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル(HMG)−CoA還元酵素が主要速度制限段階の酵素である。したがって、HMG−CoA還元酵素の作用を選択的に阻害することによって、かかる疾病を効果的に治療できる。コンパクチン及びプラバスタチンはこのようなHMG−CoA還元酵素の競争的な抑制剤であって、そのうち一つが存在すれば、コレステロール生合成を抑制できる。例えば、プラバスタチンを一日5mg〜10mgずつ約3ケ月服用すれば、総コレステロール値と体に悪いLDL−コレステロール値とが20%ないし40%減少すると知られている。前記プラバスタチンは、例えば、コンパクチンを微生物によって水酸化させて製造され、HMG−CoA還元酵素に対する抑制剤としてコンパクチンより効果的である。
【0003】
現在公知の高脂血症治療剤のうちHMG−CoA還元酵素を抑制する医薬品のうち、合成医薬品としてはシンバスタチン(simvastatin)及びアトルバスタチン(atorvastatin)などがある。また、微生物の醗酵によって生産されうる医薬品にはロバスタチンとプラバスタチンとが代表的である。前記プラバスタチンは前駆体であるコンパクチンの水酸化によって生合成される薬物であって、1980年代初めに開発された以降、その効能および安全性が立証されて活発に高脂血症患者に使用されてきた。
【0004】
コンパクチンはアクチノミセテス群のノカルディア属;マドゥロミセテス群のアクチノミュドラ属;及びストレプトミセテス群のその他の種のうちストレプトミセスロセオクロモゲネス属及びストレプトミセスカルボフィルス属の細菌及び多様な真菌属を使用した微生物的水酸化によりプラバスタチンに転換できると報告されたことがある(例えば、特許文献1ないし5参照)。
【0005】
しかし、依然として醗酵液から高濃度及び高収率でプラバスタチンを生産できる微生物及びプラバスタチンの改善された微生物学的製造法が要求されている。
【0006】
【特許文献1】
米国特許第5,179,013号公報
【特許文献2】
米国特許第4,448,979号公報
【特許文献3】
米国特許第4,346,227号公報
【特許文献4】
米国特許第4,537,859号公報
【特許文献5】
日本国特許第58−10573号公報
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに高効率に転換できる新規なストレプトミセス菌株を提供することである。
【0008】
また、本発明の目的は、前記新規のストレプトミセス菌株を利用してコンパクチンをプラバスタチンに転換する段階を含むプラバスタチンの製造法を提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を提供する。前記菌株は培養液中でコンパクチンをプラバスタチンに高収率に転換できる。
【0010】
また、本発明はコンパクチンを含む培地でストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を培養し、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法を提供する。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明において、「コンパクチン」とは、メバスタチンと知されたラクトン構造を有する形態、酸形態及びその塩形態いずれも含むものであって、それらの構造は次の化学式1ないし3と同一である。図3は、塩形態の一例であるナトリウム塩を示す。
【化1】
【化2】
【化3】
【0012】
また、本発明において、「プラバスタチン」とは、前記コンパクチンの6β位置で水酸化された化合物をいい、ラクトン、酸及びその塩形態を含むものである(化学式4ないし6)。化学式6は塩形態の一例であるナトリウム塩を示す。
【化4】
【化5】
【化6】
【0013】
前記培地は通常のストレプトミセス属菌株の培養に使われるものであればいかなるものでもよいが、ここに限定されることではない。また、前記培養物からプラバスタチンを回収する段階は通常の分離・精製手段を使用できる。例えば、抽出及びHPLCを使用できる。
【0014】
以下、本発明は実施例を通じて詳細に説明する。しかし、それら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれら実施例に限定されることではない。
【0015】
【実施例】
<実施例1> 土壌微生物の分離及び同定
土壌は朝鮮人参の畑(京畿道、江華島地域)から採取し、40℃で24時間乾燥させた。前記乾燥された土壌試料1.0gを10mlの滅菌蒸溜水に懸濁、2回続けて希釈し, それを0.1mlずつ放線菌分離用寒天培地(表1参照)20ml塗抹し、28℃で14〜21日間培養して土壌微生物を分離した。前記放線菌分離用培地は抗真菌剤であるシクロヘキシミド(50μg/ml)と抗菌剤ナリジクス酸(nalidixic acid,200μ g /ml)とを含むフミン酸−ビタミン寒天培地を使用(humic acid−vitamin agar)し、121℃で15分間滅菌した後、別途にろ過殺菌した抗真菌剤および抗菌剤を添加した。フミン酸−ビタミン寒天培地の組成は表1の通りである。
【0016】
【表1】フミン酸−ビタミン寒天培地の組成
【0017】
このような方法により得られた土壌放線菌集落を純粋分離し、培養中にコンパクチンを前駆体として添加した時、コンパクチンをプラバスタチンに転換する放線菌を分離してそれをストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)と名づけた。
【0018】
前記微生物の生育は全般的に良好であり、基菌糸(substrate mycelium)は主に黄色、灰色であり、背面色は主に薄い黄色であった。前記微生物の電子顕微鏡による観察結果、胞子鎖は直線型であり、胞子の表面は滑らかであり、分節された形態を示す。前記微生物は培地内のD−グルコース、蔗糖、D−マニトール、D−フルクトース、D−キシロース、L−アラビノース、I−イノシトール、ラムノース、ラフィノース等の大部分の糖類を使用し、ゼラチン液化力も、澱粉分解力も陽性を示した。また、細胞壁を分解して細胞壁内の糖分析を実施した結果、グルコース、アラビノース、ガラクトース、リボースが検出され、アミノ酸の分析結果、メゾ−ジアミノピメリン酸が検出された。
【0019】
このような前記分離株の形態学的、培養学的特性及び生理学的特性を総合して既存の放線菌と比較した結果、ストレプトミセス属の新しい種と判断されてこの分離株をストレプトミセス種CJPV 975652と名づけ、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに2003年5月12日付に寄託した(受託番号KCCM−10497)。前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の培養学的特性は表2の通りである。
【0020】
【表2】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の培養学的特性
【0021】
また、前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の炭素源利用特性は表3の通りである。
【0022】
【表3】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の炭素源利用特性
【0023】
また、前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の生理学的特性は表4の通りである。
【0024】
【表4】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の生理学的特性
【0025】
また、前記ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の細胞壁成分の特性は表5の通りである。
【0026】
【表5】ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)の細胞壁成分
【0027】
<実施例2> ストレプトミセス種CJPV 975652(受託番号KCCM−10497)によるコンパクチンのプラバスタチンへの転換確認
使用菌株:ストレプトミセス種CJPV 975652。
培養方法:前培養培地(表6)50mlを500mlの三角フラスコに分株し、121℃で20分間加圧殺菌した。平板培地で2週間育った培地(菌株を含む)切れ(0.5cm×0.5cm)を殺菌された前培養培地に植菌し、回転攪拌培養器で分当り250回転速度で攪拌しながら28℃で2日間培養した。
【0028】
121℃で20分間加圧殺菌された本培養培地(表7)50mlを500mlの三角フラスコに入れて前記得られた前培養液を10%(5ml, v/v)接種し、回転攪拌培養器で分当り250回転速度で攪拌しながら28℃で5日間培養した。培養2日目から滅菌されたコンパクチン(ナトリウム塩形態)を0.5g/Lの濃度で毎日2回ずつ添加してプラバスタチンへの転換を誘導した。菌体の成長は醗酵液10mlをとって450xgで10分間遠心分離した後、PMV(Packed Mycellium Volume)を測定した。
【0029】
その結果、培養液のpHは7.50、PMVは23%であった。プラバスタチン分析はウォーターズC18カラム(3.9×300mm)と、島津(ModelLC−10AD)HPLC機器を使用した。この培養液600μlに400μlのエタノールを加えて混合し、15分ないし30分間攪拌して遠心分離してHPLC分析法(メタノール:トリエチルアミン:酢酸:水=500:1:1:500、1ml/min流速)で定量した時、培養液中のプラバスタチンが確認された(図1)。また、LC−MS及び紫外線吸光度を測定してプラバスタチンを再確認した(図2、図3及び図4)。LCはPDA2996(ウォーターズ社)を使用し、質量分析器はUltima−PT(マイクロマス社)を使用した。質量分析条件は毛細管電圧1970V、コーン電圧97V、衝突エネルギー13eVであり、ネガティブモードで測定した。
【0030】
図1で、プラバスタチンの滞留時間は12.766分(面積401298)であり、コンパクチンの滞留時間は18.337分(面積230258)であった。図1に示した、HPLCクロマトグラムにおいてコンパクチンとプラバスタチンとの面積和に対するプラバスタチンの面積比率は約64%であって、コンパクチンからプラバスタチンへの転換比率が約64%以上で非常に高いことが分かった。
【0031】
図2及び図3において、423の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークである。前記プラバスタチンはネガティブモード測定されたので、ナトリウムイオンが離脱した形態と思われる。321の位置にあるピークはプラバスタチンの分節(fragmentation)により形成された物質(子形物質、daughter type)を示し、プラバスタチンの特徴的なピークである。
【0032】
【表6】ストレプトミセス種CJPV 975652の前培養培地
【0033】
【表7】ストレプトミセス種CJPV 975652の本培養培地
【0034】
<実施例3> プラバスタチンの精製
培養が終わった微生物の培養物3Lを2倍の蒸溜水で希釈した後、3%体積の硅藻土を攪拌しながら加えて、硅藻土で満たされたろ過用じょうごにろ過させた。次に、500mlのHP−20樹脂が満たされたカラムに前記ろ過物を吸着させた。十分量の水で洗浄した後、50%のエタノール溶液で湧出した。湧出された溶液に活性弾及びアルミナ樹脂を使用して色抜きした後、減圧濃縮器を使用して濃縮させた。
【0035】
濃縮された粗精製物をXAD−1600(アンバーライト社)樹脂が200ml満たされたカラムに吸着させ、10%エタノールを利用して洗浄した後、40%のエタノール溶液でプラバスタチンを分離した。前記分離された溶液を減圧濃縮し、このプラバスタチン精製物をエタノールおよびエチルアセテートを使用して結晶化させ、かつろ過して減圧乾燥を通じて1.3gの白色結晶を得た。前記得られたプラバスタチンを水素核磁気共鳴(H−NMR)分析し、その結果を図5に示した。該 NMR 器機は Brucker ARX400 FT−NMRであり、溶媒としてはMeOH−d4を使用した。図5で、各化学的シフトに対する割当て結果は次の表8の通りである。
【0036】
【表8】化学的シフトの割当て結果
【化7】
【0037】
図5に示したように、プラバスタチンを確認できた。
【0038】
【発明の効果】
本発明によるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)によれば、コンパクチンをプラバスタチンに高効率で転換できる。
【0039】
本発明によるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法によれば、プラバスタチンを高効率で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)によって転換されたプラバスタチンのHPLCクロマトグラムを示す図面である。図1で、プラバスタチンの滞留時間は12.766分(面積401298)であり、コンパクチンの滞留時間は18.337分(面積230258)であった。
【図2】HPLCで得られたプラバスタチン分画をLC−MS分析した結果を示す図面である。ネガティブモードで測定しており、423の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークである。
【図3】HPLCで得られたプラバスタチン分画をMS ドータースキャン分析した結果を示す図面である。ネガティブモードで 測定しており、423の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークであり、321の位置にあるピークがプラバスタチンの特徴的な分節産物を示すピークである。
【図4】精製されたプラバスタチンの紫外線スペクトルを示す図面である。
【図5】精製されたプラバスタチンの水素−核磁気共鳴(H−NMR)スペクトルを示す図面である。
【図6】本発明のストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)の電子顕微鏡による観察結果を示す図面である。
Claims (2)
- コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)。
- コンパクチンを含む培地でストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を培養し、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種CJPV 975652(KCCM−10497)を利用したプラバスタチンの製造法。
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