JPWO2004033703A1

JPWO2004033703A1 - 新規マクロファージ泡沫化阻害物質ｆｋａ−２５およびその製造法

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Publication number: JPWO2004033703A1
Application number: JP2004542792A
Authority: JP
Inventors: 大村　智; 智大村; 洋供田; 碌郎増間
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2006-02-09
Also published as: WO2004033703A1; EP1550727A1; US20040265979A1; AU2002344079A1; CA2461942A1

Abstract

本発明は、マウス由来のマクロファージ泡沫化を阻害する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５物質およびその製造法であり、シュードボトリティス属に属する、ＦＫＡ−２５物質を生産する能力を有するシュードボトリティスエスピーＦＫＡ−２５を培地に培養し、その培養物中にＦＫＡ−２５物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＡ−２５物質を採取される。得られたＦＫＡ−２５物質はマウス由来のマクロファージの泡沫化を特異的に阻害することから動脈硬化症やそれに起因する疾病の予防および治療に有用であると期待される。

Description

本発明は、マウス由来のマクロファージ泡沫化を特異的に阻害して動脈硬化症、心筋梗塞、脳溢血や脳卒中などの各種疾病の予防や治療に有用な新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５およびその製造法に関する。

近年、食生活の向上に伴い成人の高脂血症や肥満などの生活習慣病が、粥状動脈硬化症、さらには心筋梗塞、脳溢血や脳卒中など死と直結した病態へと進展することが知られている（ＭａｔｓｕｚａｗａＹ．ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ，５９巻，１８９−１９４，２００１年）。現在、動脈硬化の予防、治療薬としてスタチン系の薬剤、例えばプラバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンやアトロバスタチンなどが用いられているが、これらの薬剤はすべて体内でのコレステロール生合成の律速酵素の１つであるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することにより、血中のコレステロール値を低下させる効果に起因する。しかし、動脈硬化症は複雑でかつ複合的な成因によることからも、作用機構の異なる薬剤の開発が強く望まれている。
粥状動脈硬化症の初期病変では、動脈内皮に浸潤したマクロファージが、血中を流れる低密度リポタンパク質（ＬｏｗＤｅｎｓｉｔｙＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下ＬＤＬと呼称することもある）が酸化や糖化などのごとき何らかの変性を受けて生じる変性ＬＤＬを認識し、際限なく取り込み、加水分解して生成する遊離のコレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程を経て、動脈硬化を進展させることが知られている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６巻，３３３−３３７，１９７９年；Ｇｅｒｒｉｔｙ，Ｒ．Ｇ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１０３巻，１８１−１９０，１９８１年）。
従って、このマクロファージ泡沫化の過程を阻害する物質は、直接動脈硬化巣の進展を抑止することが期待されるが、スタチン系薬剤たとえばプラバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンやアトロバスタチンを含めてそのような効果を有する医薬品は知られていなかった。

かかる実情において、マクロファージ泡沫化を阻害する物質を提供することは、動脈硬化症の病巣に直接働き、その進展を抑止する新しい医薬品として人類の健康への福音をもたらすことが期待される。
本発明はこのような期待を満足し得る新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５およびその製造法を提供するものであり、更にマクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５を有効成分とする動脈硬化症状、心筋梗塞、脳溢血および脳卒中などの予防、治療薬および該物質を生産するための微生物を提供するものである。
そこで、本発明者らは上記のごとき課題を解決すべく新規マクロファージ泡沫化阻害物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分離し、その生産物について鋭意研究を続けた結果、新たな土壌から分離した糸状菌ＦＫＡ−２５９菌株の培養液中にマクロファージ泡沫化を阻害する活性を有する物質が産生されることを見出した。次いで、該培養物からマクロファージ泡沫化阻害活性物質を分離、精製した結果、後記の式で示される化学構造を有する物質を見出した。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、本物質をＦＫＡ−２５（又はＦＫＡ−２５物質）と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式

で表される化合物である新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５を提供するものである。
本発明はまた、シュードボトリティス属に属し、ＦＫＡ−２５物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培養物中にＦＫＡ−２５物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＡ−２５物質を採取する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の製造法を提供するものである。
本発明はさらにまた、シュードボトリティス属に属する微生物が、シュードボトリティスエスピーＦＫＡ−２５（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐ．ＦＫＡ−２５）である微生物を提供するものである。
本発明はまた、コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する疾病の予防または治療のために使用する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５を提供するものである。
本発明は更にコレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する動脈硬化症の予防または治療のために使用する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５を提供するものである。
本発明は更にまたコレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する心筋梗塞の予防または治療のために使用する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５を提供するものである。
本発明は更にコレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳溢血の予防または治療のために使用する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５を提供するものであるに。
本発明は更に、コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳卒中の予防または治療のために使用する新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用を提供するものである。
本発明は更にまた、コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する動脈硬化症の予防用または治療用薬物の製造のための新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用を提供するものである。
本発明は更に、コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する心筋梗塞の予防用または治療用薬剤のための新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用を提供するものである。
本発明は更に、コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳溢血の予防用または治療用薬剤のための新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用を提供するものである。
本発明は更に、コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳卒中の予防用または治療用薬剤のための新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用を提供するものである。
前記の式で表される本発明のＦＫＡ−２５物質を生産する能力を有する微生物（以下「ＦＫＡ−２５物質生産菌」と称する）は、シュードボトリティス（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓ）属に属するが、例えば本発明者らが新たに鹿児島県屋久島の土壌から分離したシュードボトリティスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐ．）ＦＫＡ−２５菌株は、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。
本発明のジュードボトリティスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐ．）ＦＫＡ−２５株の菌学的性状を示すと、以下のとおりである。
（Ｉ）形態的性質
本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、コーン・ミール寒天培地、三浦寒天培地、麦芽汁寒天培地などで中程度に生育した。バレイショ・ブドウ糖寒天培地および麦芽汁寒天培地で分生子の着生は良好であったが、コーン・ミール寒天培地および三浦寒天培地ではやや抑制的であった。
三浦寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を有しており、分生子柄は基底菌糸より直立し、まれに気菌糸より分岐することもある。その長さは１８０〜３９０μｍ×４．５〜６．０μｍで、表面は有色で先端近くでは無色、滑面である。頂端部分は若干膨らみ分生子形成構造（２０〜３０μｍ×２．３〜３．７５μｍ）が６〜１４本輪生する。分生子形成細胞の先端は膨らみ、その周辺の歯牙状の突起から分生子が盛んに形成される。歯牙状突起先端からシンポジオ型に形成される分生子は、楕円形から棍棒形、２細胞で隔壁部分は若干くびれ、基端部分に乳頭状の切断痕を持ち、大きさ８．０〜１０．５μｍ×３．０〜４．５μｍで、淡い茶褐色である。厚膜胞子は、淡褐色から暗褐色で、球形から亜球形（５．５〜８．５μｍ）もしくは倒卵形（８．５〜１２．０μｍ×７．０〜８．０μｍ）である。
（ＩＩ）各種培地上での培養性状
各種寒天培地上で、２５℃、１４日間培養した場合における肉眼的観察の結果は下記のとおりである。

（ＩＩＩ）生理学的諸性質
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、ｐＨ４〜６、温度２５．５〜３４．０℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲は、ｐＨ３〜７、温度１２．５〜３９．５℃である。
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
以上のような形態的特徴、培養性状および生理学的性状を示す本菌株を既知菌種との比較を試みた結果、本菌株は、シュードボトリティス（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓ）属に属する一菌株と同定し、シュードボトリティスエスピーＦＫＡ−２５（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐ．ＦＫＡ−２５）として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴＴｓｕｋｕｂａＣｅｎｔｒａｌ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ１−ＣｈｏｍｅＴｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ３０５−８５６６Ｊａｐａｎ］に所在する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰａｔｅｎｔＯｒｇａｎｉｓｍＤｅｐｏｓｉｔａｒｙＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｄｖａｎｃｅｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に平成１４年（２００２）９月２７日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８１９９が付与された。
本発明で使用されるＦＫＡ−２５物質生産菌としては、前述のシュードボトリティスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐ．）ＦＫＡ−２５菌株が好ましい例として挙げられるが、菌は一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工変異株は勿論、自然変異株も含め、シュードボトリティス属に属し、前記の式で表されるＦＫＡ−２５物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
本発明のＦＫＡ−２５物質を製造するにあたっては、先ずシュードボトリティス属に属するＦＫＡ−２５物質生産菌を培地に培養することにより行われる。本発明のＦＫＡ−２５物質生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉などの糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他ＦＫＡ−２５物質の生産に好適なものが添加される。
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい、少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込みなど既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は、滅菌したものを使用する。培養温度は、本ＦＫＡ−２５物質生産菌が本ＦＫＡ−２５物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２５〜３２℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常は５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は７日程度である。
このようにして得られた培養物に蓄積されるＦＫＡ−２５物質は、通常は培養菌体中に存在する。培養菌体から目的とするＦＫＡ−２５物質を採取するには、通常の微生物の培養物から代謝産物を採取するに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して用いられる。すなわち、例えば、ろ過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば沈殿、結晶化、再結晶、転溶、向流分配等）、クロマトグラフィー等の手段が用いられる。
本ＦＫＡ−２５物質を分離、採取するには菌体抽出液から採取すればよい。例えば菌体よりアセトン、エタノールあるいはメタノールなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後クロロホルムや酢酸エチルなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー等によって本ＦＫＡ−２５物質を単離することができる。
本発明のＦＫＡ−２５物質の理化学的性状は次のとおりである。
（１）性状：白色粉末
（２）分子量：５１９（Ｍ＋、電子衝撃質量分析による）
（３）分子式：Ｃ_３３Ｈ_４５Ｏ_４Ｎ
（４）比旋光度：［α］_Ｄ＝−１８．０°（ｃ＝０．１、メタノール中）
（５）紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：第１図に示すとおり、２３９ｎｍ、２８８ｎｍに極大吸収を有する
（６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ錠）：第２図に示すとおり、３４４０．４、３４２６、２９２９、１６９３、１４５６、１３７８ｃｍ^−１付近に特徴的な吸収帯を有する
（７）溶剤に対する溶解性：メタノール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチルに可溶、水、ヘキサンに難溶
（８）呈色反応：硫酸、ドラーゲンドルフに陽性、ニンヒドリンに陰性
（９）^１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、ＸＬ−４００（バリアン社製、日本国）を用いて測定した。その化学シフト（ｐｐｍ）は７．８８（１Ｈ）、７．２１（２Ｈ）、５．１７（１Ｈ）、４．８１（１Ｈ）、３．７５（１Ｈ）、３．６５（１Ｈ）、３．２７（１Ｈ）、２．８６（１Ｈ）、２．６８（２Ｈ）、２．５４（１Ｈ）、２．００（２Ｈ）、１．８２（１Ｈ）、１．７８（３Ｈ）、１．７２（１Ｈ）、１．６４（３Ｈ）、１．６３（２Ｈ）、１．６２（１Ｈ）、１．３０（３Ｈ）、１．３２（３Ｈ）、１．２９（３Ｈ）、１．２５（３Ｈ）、１．２４（３Ｈ）、１．１１（３Ｈ）、（但し、Ｈはプロトンの数を示す）
（１０）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、ＸＬ−４００（バリアン社製、日本国）を用いて測定した。その化学シフト（ｐｐｍ）は２１６．９ｓ、１５２．８ｓ、１３９．７ｓ、１３１．４ｓ、１３１．３ｓ、１２９．８ｓ、１２５．６ｓ、１２４．９ｄ、１２０．１ｄ、１１７．２ｓ、１１０．２ｄ、８１．４ｓ、６９．６ｄ、６８．２ｄ、６０．１ｓ、５４．８ｓ、５２．９ｓ、４９．５ｄ、４３．６ｓ、３４．６ｔ、３２．４ｔ、２９．８ｔ、２９．５ｔ、２９．０ｔ、２５．８ｑ、２５．１ｑ、２４．２ｑ、２３．１ｑ、２２．７ｑ、２１．１ｑ、１９．５ｑ、１８．５ｑ、１７．９ｑ、（但し、ｓ；一重線、ｄ；二重線、ｔ；三重線、ｑ；四重線を示す）
（１１）酸性、中性、塩基性の区別
弱塩基性物質
以上のように、ＦＫＡ−２５物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＡ−２５物質は下記式で表される化学構造であることが決定された。

次に、本発明のＦＫＡ−２５物質のマウス腹腔薙いでのコレステリルエステル及び脂肪滴形成に対する阻害作用について説明する。
マウス腹腔マクロファージ内でのコレステリルエステル形成および脂肪滴形成は生田目らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５巻、３１９〜３２７頁、１９９９年）に従って行った。
マウス腹腔より単離したマクロファージを６．８％リポタンパク質欠乏血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（６．８％ＬＰＤＳ−ＤＭＥＭ培地）２．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁し、４８穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）あるいはスライドチャンバー（Ｎｕｎｃ社製）に０．２５ｍｌずつまく。
次に５％炭酸ガスインキュベーター内で、３７℃で２時間培養を行った後、付着しない細胞をハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄することにより除去する。洗浄後、６．８％ＬＰＤＳ−ＤＭＥＭ培地で一時間培養した後、ＦＫＡ−２５物質（２．５μｌメタノール溶液）、リポソーム（１０μｌの０．３Ｍグルコース中にホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン／ジセチルホスフェート／コレステロール＝１０：１０：２：１５（ｎｍｏｌ）の組成から構成されている）及び［１−^１４Ｃ］オレイン酸（５μｌ、０．０５μＣｉ、１ｎｍｏｌ）を添加し、さらに１４時間培養した。
培養上清を除去し、細胞内中性脂質をヘキサン０．６ｍｌとイソプロパノール０．４ｍｌを加えて２回抽出した。これを濃縮後、ＴＬＣ（シリカゲルプレート、米国、メルク社製、厚さ０．５ｍｍ）にスポットし、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０：３０：１：ｖ／ｖ）の溶媒で展開し、分離した［^１４Ｃ］コレステリルオレートと［^１４Ｃ］トリアシルグリセロールの量をラジオスキャナー（アンビス社製、米国）で定量した。その結果、ＦＫＡ−２５物質は［^１４Ｃ］コレステリルオレートの生成を比較的選択的に阻害し、そのＩＣ_５０値はＦＫＡ−２５物質で４．０μＭと測定され、トリアシルグリセロールの生成に対しても、ＦＫＡ−２５物質は３．２μＭで約５０％阻害を示した。

第１図は本発明のＦＫＡ−２５物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第２図は本発明のＦＫＡ−２５物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ錠）を示したものである。

次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
５００ｍｌ容三角フラスコにグルコース２．０％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製、日本国）０．２％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、ポリペプトン０．５％、リン酸２カリウム０．１％、寒天０．１％からなる液体培地（ｐＨ６．０）を１００ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、これにデンプン（溶性）１．５％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製、日本国）０．４％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、リン酸２カリウム０．１％、寒天２．０％を含む寒天斜面培地で２７℃で培養したシュードボトリティスエスピーＦＫＡ−２５（ＦＥＲＭＢＰ−８１９９）を１白金ずつ接種し、回転式振とう機を用いて２７℃で４日間培養し、種培養液を得た。
一方、３０リットルジャーファーメンター１基にサッカロース２．０％、グルコース１．０％、コーン・スチープパウダー（イワキ社製、日本国）０．５％、肉エキス（極東製薬社製、日本国）０．５％、炭酸カルシウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、リン酸１カリウム０．０５％、寒天０．１％からなる液体培地（ｐＨ６．０）を２０リットル仕込み、１２１℃で６０分間蒸気滅菌した。これに種培養液２本分を接種し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量１５１／分で２７℃で４日間培養した。
培養液に２０リットルのアセトンを加え３０分攪拌し、遠心後上清を得た。得られたアセトン溶液を減圧濃縮し、水溶液を得た。得られた水溶液に２０リットルの酢酸エチルを加えて攪拌し、これをシャープレスで遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）して水層と酢酸エチル層に分別した。得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウム５００ｇを加え、脱水した後、酢酸エチル層を減圧濃縮し、４．６ｇの粗物質Ｉを得た。この粗物質を少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（３５ｇ、米国、Ｍｅｒｃｋ社製、シリカゲル６０メッシュ７０〜２３０μｍ）の上端にのせ、クロロホルムでカラムを洗った後、クロロホルム−メタノール（９：１）で活性物質を溶出した。
溶出した活性物質を減圧下で濃縮することによって７９５ｍｇの粗物質ＩＩを得た。この粗物質ＩＩを再度少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（１７ｇ、米国、Ｍｅｒｃｋ社製、シリカゲル６０メッシュ２３０〜４００μｍ）の上端にのせ、クロロホルムでカラムを洗った後、クロロホルム−メタノール（１０：１）で粗物質ＩＩＩを得た。
この粗物質ＩＩＩを少量のメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＰＥＧＡＳＩＬＯＤＳ、φ２０×２５０ｍｍ、センシュウー科学社製、日本国）にかけ、６０％アセトニトリルを移動相として２４０ｎｍの吸収を検出しながら、８ｍｌ／分の流速において１６分に溶出するピークを集めた。これを減圧濃縮してマクロファージ泡沫化を阻害するＦＫＡ−２５物質の白色粉末を１３．９ｍｇ得た。
産業上の利用分野
以上に説明したように、シュードボトリティス属に属するＦＫＡ−２５物質を生産する能力を有するシュードボトリティスエスピーＦＫＡ−２５株を培地に培養し、その培養物中にＦＫＡ−２５物質を蓄積せしめ、該培養物から採取したＦＫＡ−２５物質は、マウス由来のマクロファージの泡沫化を特異的に阻害することから動脈硬化症やそれに起因する疾病の予防および治療に有用であると期待される。

Claims

下記式

で表される化合物である新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５。
シュードボトリティス属に属し、ＦＫＡ−２５物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、その培養物中にＦＫＡ−２５物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＡ−２５物質を採取することを特徴とする新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の製造法。
前記の物質を生産する能力を有する微生物がシュードボトリティスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐ．）ＦＫＡ−２５（ＦＥＲＭＢＰ−８１９９）またはそれの変異株である請求の範囲２に記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の製造法。
請求の範囲１に記載の物質を生産する能力を有するシュードボトリティス（Ｐｓｅｕｄｏｂｏｔｒｙｔｉｓ）属に属する微生物。
上記の物質を生産する能力を有する微生物が、シュードボトリティスエスピーＦＫＡ−２５（ＦＥＲＭＢＰ−８１９９）またはそれの変異株である請求の範囲４に記載の微生物。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する疾病の予防または治療のために使用する請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する動脈硬化症の予防または治療のために使用する請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する心筋梗塞の予防または治療のために使用する請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳溢血の予防または治療のために使用する請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳卒中の予防または治療のために使用する請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する動脈硬化症の予防用または治療用薬物の製造のための請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する心筋梗塞の予防用または治療用薬剤のための請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳溢血の予防用または治療用薬剤のための請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用。
コレステロールや脂肪酸をコレステリルエステルやトリアシルグリセロールに変換して脂肪滴として細胞質に蓄積し、泡沫化する過程に起因する脳卒中の予防用または治療用薬剤のための請求の範囲１記載の新規マクロファージ泡沫化阻害物質ＦＫＡ−２５の使用。