JP2001519654A - ストレプトミセス・エキソフォリアツスｙｊ−１１８と上記菌株を利用するプラバスタチンナトリウムの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118と上記菌株を利用するプラバスタチンナトリウムの製造方法に関するもので、より詳細には新菌株のストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118を利用した微生物の酵素的なヒドロキシル化反応を通じて高脂血症治療剤として有用な次の化学式１で示されるプラバスタチンナトリウムを高収率かつ高純度で製造する方法に関するものである。化学式１

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118と上記菌株を 利用するプラバスタチンナトリウムの製造方法 発明の背景 発明の分野 本発明は、ストレプトミセス・エキソフォリアツス(Streptomyces exfoliatus )YJ-118と上記菌株を利用するプラバスタチンナトリウムの製造方法に関するも ので、より詳細には新菌株のストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118を利 用した微生物の酵素的なヒドロキシル化反応を通じて高脂血症治療剤として有用 な次の化学式１で示されるプラバスタチンナトリウムを高収率かつ高純度で製造 する方法に関するものである。 化学式１ 従来の技術 高脂血症（hyperlipidemia）は、血液中の脂質（コレステロール、中性脂肪、 燐脂質、遊離脂肪酸等）濃度が正常範囲を超えて増加した病態を意味し、臨床的 には動脈硬化症、高血圧、虚血性心臓疾患と膵臓炎の原因になる、従って、コレ ステロール値を減少させる薬剤開発が進行して来たが、特に上記化学式１で示さ れるプラバスタチンナトリウムは、コレステロールの生合成過程からヒドロキシ ルメチルグルタニルCo−Ａ酵素の作用を徂害してコレステロールの生成抑制能が 優れるので、高脂血症の治療に有用であることがよく知られている。 いままでに知られた上記化学式１で示されるプラバスタチンナトリウムの一般 的な製造方法では、プラバスタチン前駆体、例えば次の化学式２ａで示されるＭ Ｌ−２３６Ａ或いは次の化学式２ｂで示されるＭＬ−２３６Ｂカルボン酸或いは ＭＬ−２３６Ｂナトリウムに微生物を入れて培養するいわば“微生物の酵素的な ヒドロキシル化反応”により製造されている。 化学式２ａ 化学式２ｂ 上記化学式２ｂで、ＲはＨ或いはNaである。 プラバスタチンナトリウムを製造するために、微生物の酵素的なヒドロキシル 化反応に利用されて来た微生物として米国特許第４,３４６,２７７号では、Stre ptomyces roseochromogenus NRRL-1233，Streptomyces roseochromogenus IFO-3 363，Streptomyces roseochromogenus IFO-3411等を使用し、特公平４−３４９ ０３４号等では、Streptomyces carbophilus SANK 62585(FERM BP-1145)， Streptomyces halstedii IFO-3199を使用した。 しかし、上記微生物を利用してプラバスタチンナトリウムを製造した場合、ヒ ドロキシル化の反応性が低く、特に上記微生物の成長は上記化学式２ａ或いは２ ｂで示されるプラバスタチン前駆体より阻害されるので、低濃度の関連化合物を 添加しなければならないし、これにより生産性も低くなる問題があった。 本出願人は上記問題に鑑み、従来の微生物による酵素的なヒドロキシル化反応 での前駆体に対する耐性の優れる菌株を選択しようと努力し、Streptomyces ros eochromogenusの亜種（KTCC 12385）を利用して高い生産性を有するプラバスタ チンナトリウムを製造する方法を、特許出願した〔大韓民国特許公開第９６−４ １３６９号〕。 発明が解決しようとする課題 本発明では、上記化学式２ａ或いは２ｂで示されるプラバスタチン前駆体に対 して高い耐性を有し、酵素的なヒドロキシル化の反応性も高いストレプトミセス ・エキソフォリアツスYJ-118を分離・同定し、上記微生物培養液或いは微生物抽 出物に上記プラバスタチン前駆体を添加・培養して本発明を完成した。 従って、本発明は、ストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118と上記菌株 を利用してプラバスタチンナトリウムを大量生産する方法を提供することにその 目的がある。 発明の構成及び作用 本発明は、新菌株のストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118をその特徴 とする。 また、本発明は、上記化学式２ａ或いは２ｂで示されるプラバスタチン前駆体 を微生物により酵素的なヒドロキシル化反応させて次の化学式１で示されるプラ バスタチンナトリウムを製造する方法において、上記微生物としてはストレプト ミセス・エキソフォリアツスYJ-118を利用することを他の特徴とする。 化学式２ａ 化学式２ｂ 上記化学式２ｂで、ＲはＨ或いはNaである。 化学式１ このような本発明をより詳細に説明すれば次の通りである。 本発明は、酵素的なヒドロキシル化の反応性が高いし、上記化学式２ａ或いは ２ｂで示されるプラバスタチン前駆体に耐性を有する新菌株のストレプトミセ ス・エキソフォリアツスYJ-118をプラバスタチン前駆体に添加・培養する酵素的 なヒドロキシル化反応により高脂血症治療剤として広く知られている化学式１で 示されるプラバスタチンナトリウムを製造する方法に関するものである。 本発明による新菌株のストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118を分離す る方法は次の通りである。 −新規微生物の分離− 土壌試料を滅菌蒸溜水に１０^-3〜１０^-5倍として稀釈し、ISP No.２の寒天に 上記化学式２ａ或いは化学式２ｂで示される０.０５〜０.５％(w/v)のプラバス タチン前駆体或いは上記前駆体の混合物を添加・塗抹して２７℃で７日間培養し た。上記培養液から計５００余種の菌株を分離し、上記菌株の中で、プラバスタ チン前駆体に耐性を示し、酵素的なヒドロキシル化の反応性が高い１種の菌株を 最終的に分離した。分離された新菌株をYJ-118と命名した。 −新規微生物の同定− 上記から分離された新菌株のYJ-118の生物学的な特徴は次の通りである。 (1) 形態学的特徴 分離菌株のYJ-118は、ISP(Internalional Streptomyces Project)に規定され た培地から２７℃で７〜１４日間培養してから観察した。成長は活発に行い、基 質菌糸(Substrate mycelium),空中菌糸体(Aerial mycelium)，胞子(Spore)を生 産した。走査顕微鏡で観察した結果、胞子の表面はなめらか（smooth）で円筒形 であり、胞子の鎖形態は直線形又は曲がっていた(rectiflexible)。また、胞子 嚢の輪生体、掌膜、分裂体のような特徴器官は観察されなかった。 (2) 細胞内の成分 菌株YJ-118の細胞壁成分を、既存文献〔Yamada et．al，Gen．Appl．Microbio l．１６：１０３〜１１３（１９７０）〕に記載の方法により分析した結果、Ｌ ，Ｌ−ジアミノピメリン酸、グリシン、グルタミン酸、アラニンが検出された、 上記結果により菌株YJ-118の細胞壁は細胞壁形態１に該当した。 細胞内の糖成分を、既存文献〔M．P．Lechevalier et al.，Journal of Labor atory and Clinical Medicine，７１，９３４（１９６８）〕に記載の方法によ り分析した結果、特徴的なパターンは観察されなかった。 上記結果によると、本発明による分離菌株YJ-118は、Actinomycetesの１種で あるStreptomycesに属することが判明した。 (3) 種(Species)を同定するための特性分析及びタキソン（ＴＡＸＯＮ）プログ ラムによる数値同定 ウィリアム等の方法により主群集(major cluster)を同定するための５０単位 形質(unit characters)と副群集(minor cluster)を同定するための３０単位形質 を調べた。 タキソンプログラムは、英国のNewcastle upon Tyne大学微生物学科のアラン ワード（Allan Ward）博士により開発されたプログラムである。上記プログラム ではデータを“−”或いは“＋”の形で入力し、入力されたデータをクラスタン （ＣＬＵＳＴＡＮ）により分析と数値分類して数値分類データを基本として作成 された同定確率行列(Probabilistic identification matrix)の特性と未知菌の 特性を比較・分析して数値同定する〔Journal of General Microbiology（１９ ８３），１２９，１７４３〜１８１３；Rho．Y．T．Ph．D．Thesis，Seoul Nati onal Univ（１９８３）〕。 本発明によると、種水準のものを同定するために、実施した分離菌株の単位特 性を基本として現在まで分類が終った菌株の特徴をデータベース化してこれを数 値分類するために作成したタキソンプログラムを利用して数値同定した。同定に 必要であるYJ-118の５４単位形質(unit characters)は表１ａ及び１ｂの通りで ある。 分離した菌株YJ-118を、Streptomycesの主群集(major cluster)を対象とする タキソンプログラムにより５０個の特性に対して数値同定し、その結果を表２に 示した。表２によると、主群集５（ストレプトミセス・エキソフォリアツス）に 高いWilcox確率(0.99999)を示した。 Streptomycesの主群集５は、１８菌種からなる集団であり、分離菌株のYJ-118 と上記構成菌種との分類単位特性を比較し、simple matching coefficient（Ｓ ＳＭ）を利用して一番類似な菌株を探して見た。 その結果、主群集５の代表菌株からストレプトミセス・エキソフォリアツスの 中心菌株であるストレプトミセス・ナシヴィレンシス（Streptomyces nashville nsis）に対して40％だけが一致したが、分離菌株のYJ-118をストレプトミセス・ エキソフォリアツスYJ-118として同定した。 ストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118菌株は、１９９７年２月７日 附に大韓民国の特許菌株寄託機関である韓国科学技術研究院附設生命工学研究所 内の遺伝資源センターに寄託して受託番号ＫＣＴＣ０３１８ＢＰを与えられた。 プラバスタチンを生産する上記微生物は、生物工学的に突然変異等により形質 変換させて目的化合物を製造することができるし、プラスミド遺伝子操作等を本 発明に利用することができる。 上記微生物は、プラバスタチンナトリウムの製造に適用した例はなかったし、 これを利用してプラバスタチンナトリウムを製造すれば高濃度の基質を添加する ことができる。尚、酵素的なヒドロキシル化の高い反応性により生産性も高い。 上記のような方法により分離同定した菌株のストレプトミセス・エキソフォリ アツスYJ-118を利用してプラバスタチンナトリウムを製造する方法を詳細に説明 すれば次の通りである。 先ず、０.５〜３.０％の葡萄糖、１.０〜３.０％の酵母抽出物、０.１〜１.０ ％の乳汁抽出物及び０.５〜２.０％のカゼイン分解物（Ｎ−Ｚのアミン−Ａ）を 含む第１培地に、上記化学式２ａ或いは２ｂで示される０.０１〜０.０５％(w/v )のプラバスタチン前駆体を無菌濾過して投入した後、ストレプトミセス・エキ ソフォリアツスYJ-118菌株を接種して２７℃で２〜３日間培養する。第１培地か ら育てられた接種の種子培地を、１.０〜３.０％の葡萄糖、０.５〜２.０％の酵 母抽出物、０.１〜２.０％のポリペプトン、０.０１〜０.５％のK₂HPO₄、０.０ １〜０.１％のMgSO₄・7H₂O及び０.０１〜０.１％のNaClを含む第２培地の内にお いて、その濃度が１０％(w/v)になるように接種して再び２７℃で培養する。 つづいて、第２培地に化学式２ａ或いは２ｂで示されるプラバスタチン前駆体 を培地カサに対して最終濃度が０.１〜５.０％(w/v)、望しくは０.１〜３.０％( w/v)となるまで添加し、これを再び２７℃で培養する。上記前駆体の添加された 後、２〜３日目に０.３〜０.５％(w/v)の葡萄糖を追加的に添加するが、その理 由としては、葡萄糖が酵素的なヒドロキシル化反応でエネルギ源となり触媒作用 を発揮するからである。 上記培養において、プラバスタチン前駆体として上記化学式２ａ或いは２ｂも しくはこれらの混合物を添加する。微生物を種子培養するための第１培地にプラ バスタチン前駆体を投入しなくても、従来の微生物の培養方法と比べて向上され たプラバスタチンの生産性を期待することができるが、酵素的なヒドロキシル化 反応を活性化するために０.０５％(w/v)未満の範囲でプラバスタチン前駆体を投 入することが望しい。もしも、０.０５％(w/v)を超過して過量の前駆体を投入す ることは、かえって種子の培養時間を延長し、培養状態が不良になる問題がある 。また、微生物の培養培地（第２培地）には０.１〜５.０％(w/v)のプラバスタ チン前駆体を投入する。この時、前駆体の投入量が０.１％(w/v)未満であればプ ラバスタチンの生産性が低くなり、５.０％(w/v)を超過すれば菌体の成長が悪く なるばかりでなく、プラバスタチンの生産性が低くなる問題がある。培養時間は 培養条件により広く変化されるが、本発明の場合にはプラバスタチン前駆体を加 えてから５〜７日の期間が適当である。 前述したように、従来の微生物を利用した酵素的なヒドロキシル化反応では基 質濃度を０.０５〜０.１％(w/v)ほどしか上昇させることができなかったが、本 発明による新菌株は基質に対する抵抗性と酵素的なヒドロキシル化の反応性が高 いので、微生物の培養方法では最高５％(w/v)の高濃度基質の添加が可能である 。 上記培養が終ると、培養液から目的とするプラバスタチンナトリウムを分離精 製する。分離と精製工程は通常の工程であり、培養条件により適切に多様化させ ることができる。分離工程の１つの具体例として、先ず培養液を遠心分離して菌 体を除去し、濾過液を吸着樹脂に吸着させてから蒸溜水で洗浄する。洗浄の終っ た後、吸着されたプラバスタチンナトリウムを有機溶媒（２０〜５０％水性アセ トン或いは２０〜５０％水性メタノール、望しくは２５％水性アセトン或いは３ ０％水性メタノール）で溶出し、得られた溶出液を沈澱法或いは液体クロマトグ ラフィを反復実施することにより精製し、高純度のプラバスタチンナトリウムを 得る。 このような方法により製造されたプラバスタチンナトリウムは、従来の微生物 、例えばStreptomyces roseochromogenus NRRL-1233，Streptomyces roseochrom ogenus IFO-3363，Streptomyces roseochromogenus IFO-3411，Streptomyces ca rbophilus SANK 62585（FERM BP-1145）或いはStreptomyces halstedii IFO-319 9に比べてより基質の添加濃度及び生産性が非常に高い。 このような本発明を、次の実施例にもとづいてより詳細に説明すれば次の通り であるが、本発明が実施例により限定されるものではない。 製造実施例：新規微生物の分離 韓国の全国地域から採取した土壌試料を、滅菌された生埋食塩水に１０^-3〜１ ０^-5倍に稀釈した、ISP No.２の寒天に、上記化学式２ｂで示される０.０５〜０ .５％(w/v)のプラバスタチン前駆体を添加し、上記稀釈された一定量の土壌試料 を塗抹してから２７℃の恒温器で５〜１０日間培養して放線菌、細菌等を純粋分 離した。純粋に分離した約５００菌株を、２０mlのBennet's培地が含まれた１２ ５mlの三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間滅菌してから１白金環の上記微 生物を無菌接種して２７℃で５日間培養した。 培養を開始した２日目に、上記化学式２ａで示される０.０５％のＭＬ−２３ ６Ｂラクトンを添加して３日間培養した。上記培養液だけを取って液体クロマト グラフィを通じて上記化学式１で示されるプラバスタチンの量を測定し、酵素的 なヒドロキシル化の反応性がある菌株を２次に約１０種を選別した。その中で、 プラバスタチン前駆体に対する耐性の高い１種の菌株、即ちストレプトミセス・ エキソフォリアツスYJ-118を最終的に分離した。 実施例１ 第１培地〔pH７.０；１％の葡萄糖、０.２％の酵母抽出物、０.２％の乳汁抽 出物、２０mlの０.５％カゼイン分解物（Ｎ−Ｚのアミン）〕を含む１２５mlの 三角フラスコに、化学式２ａで示される０.０２％(w/v)ＭＬ−２３６Ｂラクトン を添加した後、上記製造実施例により分離した新菌株のストレプトミセス・エキ ソフォリアツスYJ-118を接種した。接種した三角フラスコに２７℃、２００rpm の条件下で２日間にわたって微生物種子を培養した。 第２培地（pH７.２；１.０％の葡萄糖、１.０％の酵母抽出物、０.５％のポリ ペプトン、０.１％のK₂HPO₄、０.０５％のMgSO₄・7H₂O及び０.０１〜０.１％のNa Clを含む４００mlの２Ｌ三角フラスコ（５個）に、上記種子培地（第１培地）を ２０mlずつ接種し、２７℃と１５０rpmの条件下で１日間にわたって微生物種子 を培養した。その後、上記化学式２ａで示されるＭＬ−２３６ラクトンを０.０ ５％(w/v)の濃度として１日ごとに添加し、最終濃度が０.２％(w/v)になるまで それぞれのフラスコに添加した。つづいて、２７℃と１５０rpmの条件下で６日 間 培養した。また、プラバスタチン前駆体を添加してから０.３％の葡萄糖を２日 ごとに２回添加した。 培養の終った後、培養液のpHを９.０に調節し、室温で３時間攪拌してから遠 心分離して菌体を除去した。上澄液を５００mlのＨＰ−２０（三養社製品）樹脂 カラムに吸着させた後、pH７.５に調節した蒸溜水で充分に洗浄した。洗浄の終 った後、吸着されたプラバスタチンナトリウム塩を２５％の水性アセトンで溶出 させてプラバスタチンナトリウム塩を含む分画を得た。 上記分画を減圧濃縮した後、得られた生成物を分取用の液体クロマトグラフィ （カラム：Kromasil c18，３５％(w/v)のアセトニトリル、２０ml／min）を反復 実施して精製された１，２５４mg(６２７mg／L)のプラバスタチンナトリウムを 得た。 実施例２ 上記実施例１と同様な培養方法によりプラバスタチンナトリウムを製造したが 、ただ第２培地から微生物種子を培養して１２時間後から化学式２ｂで示される ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を、０.０４％(w/v)の濃度として１２時間の間隔に より添加し、最終濃度が０.４％(w/v)になるまでそれぞれのフラスコに添加した 。つづいて、２７℃、１５０rpmの条件下で７日間培養させた。 培養の終った後、培養液から精製された２.６８ｇ(１,３４０mg／L)のプラバ スタチンナトリウムを得た。 実施例３ 第１培地から微生物種子を培養した時にプラバスタチン前駆体の混合物を添加 しなかったことを除き、上記実施例１と同様な培養方法によりプラバスタチンナ トリウムを製造した。培養の終った後、培養液から精製された７７８mg(３８９m g／L)のプラバスタチンナトリウムを得た。 上記実施例３は、第１培地から微生物種子を培養した時にプラバスタチン前駆 体を添加せずに、ただ第２培地にプラバスタチン前駆体を添加して微生物を培養 させた例であり、従来の微生物を利用して培養させた場合に比べて６０〜６５％ の生産性が向上されたことを示す。 比較例：米国特許第４,３４６,２２７号 ２.０％の葡萄糖、０.２％のコーン浸漬液、０.１５％のK₂HPO₄、０.１％の酵 母抽出物、０.１５％のMgSO₄・7H₂O、０.００１％のZnSO₄・7H₂O、０.１％のNH₄NO₃ 、０.１％のペプトン、残りが水道水（pH７.０に調節）からなる培地（１００m l）を、それぞれの５００mlフラスコ（２０個）にStreptomyces roseochromogen us NRRL-1233を接種した。フラスコを２６℃と１２０rpmの条件下で２日間培養 させた。２日間の培養が終った時、化学式２ｂで示されるプラバスタチン前駆体 （Ｒ＝Na）の最終濃度が０.０５％(w/v)になる時まで、それぞれのフラスコに添 加した。２６℃と１２０rpmの条件下で５日間にわたって継続培養した。培養の 終った後、上記実施例１と同じ方法により精製して最終的に１２０mg(６０mg／L )のプラバスタチンナトリウムを得た。 上記比較例によると、０.０５％(w/v)の基質濃度でプラバスタチンナトリウム の生産量は６０mg／Lであった。これに対して、本発明による培養方法では、基 質濃度を５％(w/v)の高濃度まで上昇させることが出来、この時のプラバスタチ ンナトリウムの生産量は最高１,２５０mg／Lであり、非常に向上したことがわか る。 実験例 上記実施例１及び比較例により製造したそれぞれのプラバスタチンナトリウム に対して分子量、紫外線吸光度、旋光度及び質量スペクトルを分析した結果を次 の表３に示した。また、本発明により製造されたプラバスタチンナトリウムの赤 外線吸収スペクトルは図１、¹³C-NMRスペクトルは図２、¹H-NMRスペクトルは図 ３にそれぞれ示した。発明の効果 本発明による新菌株のストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118を利用し た培養方法は、基質の添加濃度は最高０.５％(w/v)であり、それによりプラバス タチンの生産性は６００〜１,３４０mg／Lであるので、従来の菌株（６０mg／L ）に比べて非常に向上した効果を得ることができる。 図面の簡単な説明 図１は、プラバスタチンナトリウムの赤外線吸収スペクトルであり； 図２は、プラバスタチンナトリウムの¹³C-NMRスペクトルであり； 図３は、プラバスタチンナトリウムの¹H-NMRスペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ソウ ドン イン 大韓民国 キュンキ―ドウ 459―010 ソ ンタン―シ ソイェオン―ドン 896―10 ライフ ヴィラ ガー ビー02 (72)発明者 リー サン チョーン 大韓民国 ソウル 135―190 カンナム― ク サエゴク―ドン 170―10 (72)発明者 キム イ ヨーン 大韓民国 キョンキ―ドウ 459―110 ソ ンタン―シ イーサン―ドン 1158

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ストレプトミセス・エキソフォリアツスYJ-118。 2. 次の化学式２ａ或いは化学式２ｂで示されるプラバスタチン前駆体を、微生 物により酵素的なヒドロキシル化反応をさせて次の化学式１で示されるプラバ スタチンナトリウムを製造する方法において、上記微生物として、ストレプト ミセス・エキソフォリアツスYJ-118を利用することを特徴とするプラバスタチ ンナトリウムの製造方法。 化学式２ａ 化学式２ｂ 上記化学式２ｂにおいて、ＲはＨ或いはNaである。 化学式１3. 微生物の種子を培養するために、第１培地に上記プラバスタチン前駆体を０ .０５％(w/v)未満の濃度として添加することを特徴とする請求項２のプラバス タチンナトリウムの製造方法。 4. 微生物の種子を培養するために、第２培地に上記プラバスタチン前駆体を０ .１〜５.０％(w/v)の濃度として添加することを特徴とする請求項２のプラバ スタチンナトリウムの製造方法。