JP3643082B2 - サッカロスリックス新株、これを用いてプラバスタチンを生産する方法及び（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼの単離方法 - Google Patents
サッカロスリックス新株、これを用いてプラバスタチンを生産する方法及び（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼの単離方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４と称されるサッカロスリックス（Saccharothrix）の二種の新規微生物株、これらの株を用いてプラバスタチン（pravastatin）を生産する方法、並びに（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離するための改良された方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血中コレステロールレベルがアテローム性動脈硬化症、特に冠動脈系心臓病の主たる危険因子の一つであることが認識されている。コレステロールの生合成をモニタリングすることはこれらの疾病の抑制に非常に有用である。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリール（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼはコレステロール生合成における律速酵素である。（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼの活性を阻害することにより、生体の血中コレステロールレベルを効果的に減少させることができる。
【０００３】
数多くの（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、例えばプラバスタチン、コンパクチン、ロバスタチン、が発見されている。それらは、ラクトン形の以下に示す構造式で表わされるが、他の形態、例えば酸及び／又はその塩やエステルとして存在してもよい。
【０００４】
【化１】
【０００５】
これらの（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、人間を含む多くの動物で血中コレステロールレベルを下げるのに非常に有効である。プラバスタチンは、コンパクチン及びロバスタチンよりも活性があり、高コレステロール血症の治療に適用されてきた（Ｎａｒａ，Ｆら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２８−３２（１９９３））。
【０００６】
プラバスタチンは、コンパクチンの３β−ヒドロキシ誘導体である。プラバスタチンは、例えばストレプトマイセス・ロゼオクロルノジーナス（Streptomyces roseochrornogenus）（米国特許第４，３４６，２７７号）やアクチノマジュラｓｐ．(Actinomadura sp.）（Ｐｅｎｇ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｄｅｃ：１０３２−１０３５（１９９７）及びＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ １０：１５１−１５６（２０００））等、種々の属の真菌や細菌を用いてコンパクチンを微生物ヒドロキシル化により転換することによって生産されると報告されている。しかしながらこれらの真菌や細菌は、恐らくコンパクチンの抗真菌活性のために、真菌や細菌の発酵培養ブロスに添加される多量のコンパクチンに耐性でなく、その結果プラバスタチンの生産性が低い。よって、より多量のコンパクチンに耐性を示すと共に、効果的転換活性を有する新しい微生物を見い出す必要がある。
【０００７】
一般に、発酵培養ブロスからの（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の単離は、抽出、クロマトグラフィー、ラクトン化及び結晶化という容易でない手続きによって行われる。ヨーロッパ特許出願公開第０８７７０８９Ａ１号は（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の調製方法を開示している。これによると、阻害剤（例えば、ロバスタチン）を含む発酵培養ブロスを塩基性とした後に濾過して細胞を除去し、次いで、濾液をカラムを通して充填する。溶出液をトルエンで抽出し、続いてラクトン化することにより阻害剤が得られる。
【０００８】
しかしながら、クロマトグラフィーを利用する場合には、望む収量で阻害剤を得るためには、大きなカラムと（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む大容量の発酵培養ブロスが通常必要とされ、そのため、阻害剤の精製プロセスの操作の困難性が増大する。さらに、ラクトン化反応は通常多大のエネルギーと時間を必要とする。よって、ラクトン化反応を行ったりクロマトグラフィーを使用することなしに（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を高収率、高純度、且つ低コストで得る改良された方法を探索する必要がある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の一目的は、プラバスタチンを生産することができＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４と命名されたサッカロスリックス（Saccharothrix）の二種の新規微生物株並びにそれらの突然変異体を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明に係る微生物を用いてプラバスタチンを生産する方法を提供することである。特に、プラバスタチンを生産するための本発明方法は、ＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４を適切な条件で培養して発酵培養ブロスを生成するステップ（ａ）と、コンパクチンを前記培養ブロスに供給するステップ（ｂ）と、この培養ブロスを一定時間発酵させてコンパクチンをプラバスタチンに転換するステップ（ｃ）と、プラバスタチンを前記培養ブロスから単離するステップ（ｄ）とを含む。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離する方法を提供することであって、該方法は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む第一の溶液に硫酸アンモニウムを添加して沈澱を生成するステップ（１）と、前記沈澱を単離するステップ（２）と、前記沈澱を極性溶媒を用いて溶解して第二の溶液を得るステップ（３）と、第二の溶液のｐＨを約４から約６に調整するステップ（４）と、第二の溶液を水と混和しない溶媒で抽出して（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離するステップ（５）とを含む。この調製方法は、単離された（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を有機又は無機のカチオン源と反応させて阻害剤を塩の形で生成させるステップを更に含む。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の説明を参照することにより、より十分に理解されその利点が明らかになるであろう。
【００１３】
Ｉ．新規微生物株
本発明の一目的は、良好な収率でプラバスタチンを生産するための二種の新規微生物株を提供することである。本発明者らは、驚くべきことに、土壌試料から放線菌を単離することにより、コンパクチンに対する高い耐性を有すると共にプラバスタチンの生産性が高い二種の新規微生物株、ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を得た。この二種の株は２００２年１月８日、中国基準株保存機関（ＣＣＴＣＣ）に夫々、受託番号Ｍ２０２００１及びＭ２０２００２で寄託された。
【００１４】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４は土壌から単離することができる。まず、土壌試料を滅菌したリン酸緩衝液に懸濁させる。得られた懸濁液を１０倍段階希釈した後、単離培地を含有させた寒天プレート上に拡げる。寒天プレート上に増殖したコロニーを、放線菌の形態学的特徴に基づき顕微鏡検査により事前にスクリーニングすることができる。次いで、候補株を培養し、発酵ブロス（fermentation broth）を得る。この発酵ブロスにコンパクチンを供給して、プラバスタチンを生成させる。発酵ブロス中に生成されたプラバスタチンの量を求める。プラバスタチンの生産率が高いことからＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を選択する。
【００１５】
寒天プレートの培地は本技術分野で良く知られているものであり、好ましくはイーストエキストラクト、モルトエキストラクト、デキストロース及び寒天を含むものである。より好ましくは、ＩＳＰ２培地である。ある種の態様においては、培地に含有させる単離剤は、ナイスタチン、シクロヘキシミド、ペニシリンＧ、ポリミキシンＢ及びゲンタマイシンから選択される抗生物質を含むことが好ましい。放線菌属の形態学的特徴は、Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ｇ．，編集（１９８９）Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：ボルチモア、ｐ．２５８６−２６１５）等の従来の文献や教科書に記載されている。また、このような微生物を培養し発酵させる技術は、本技術分野で公知である。
【００１６】
発酵ブロスに添加されるコンパクチンは、コンパクチンを生産する微生物（例えば真菌や細菌）若しくはその細胞抽出物、又はコンパクチン含有溶液により供給するのが好ましい。発酵ブロスに添加されるコンパクチンの濃度は、微生物が存在しない発酵ブロスに基づいて、かつ供給コンパクチンのみに基づいて計算される。発酵ブロス中に生産されたプラバスタチンは、ＨＰＬＣ等の慣用技術により同定でき、プラバスタチン生成量は、保持時間を標準調製品と比較することにより決定することができる。例えば、生産されたプラバスタチンの収量は式（Ｉ）により求めることができる。さらに、コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率は式（ＩＩ）により計算でき、生産された総プラバスタチン中のエピプラバスタチンの割合（epi-pravastatin ratio）（Ｅｐｉ％）は式（ＩＩＩ）により計算される。
【００１７】
プラバスタチン収量＝（標準濃度／標準面積）×試料面積 （Ｉ）
モル転換効率（ＭＥ％）＝（生産されたプラバスタチンのモル数／転換したコンパクチンのモル数）×１００ （ＩＩ）
エピプラバスタチンの割合（Ｅｐｉ％）＝（エピプラバスタチンの生成量／（エピプラバスタチンの生成量＋プラバスタチンの生成量））×１００％ （ＩＩＩ）
【００１８】
エピプラバスタチンはコンパクチンの６α−ヒドロキシル化体であるが、所望の治療効果を有さないばかりか、臨床治療において望ましくない効果を示す。したがって、エピプラバスタチンの割合は低いことが好ましい。なお、本明細書中、「コンパクチン耐性」とは、微生物発酵ブロス中に供給されたコンパクチンの最終濃度であって、且つ微生物が耐えうる濃度、すなわち、このような濃度のコンパクチンを含む培地において、微生物が正常に成長できる濃度を云う。
【００１９】
上記方法で得られたＹＳ−４４４４２は以下の性質を有する。寒天プレート上のコロニー（７日目）は青みがかった白色であり、胞子を形成しない。ＳＣＹ寒天スラント上の培養物は青みがかった白色であり、少量しか胞子が見られない。コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率（ＭＥ％）は約７０〜７５％である。エピプラバスタチンの割合は６．５〜８％である。プラバスタチンは、発酵ブロスの体積あたり１．０〜１．５ｇ／Ｌ生産される。コンパクチン耐性は１．５〜２．０ｇ／Ｌである。ＹＳ−４４４４２のより詳細な特徴は、後述の実施例に記載される。
【００２０】
上記方法で得られたＹＳ−４５４９４は以下の性質を有する。寒天プレート上のコロニー（７日目）は白色であり、胞子を形成する。ＳＣＹ寒天スラント上の培養物は白色の胞子と黄色の色素を生成する。コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率（ＭＥ％）は約４８〜５０％である。エピプラバスタチンの割合は１．８〜３．０％である。プラバスタチンは、発酵ブロスの体積あたり１．０〜１．５ｇ／Ｌ生産される。コンパクチン耐性は１．５〜２．０ｇ／Ｌに達する。ＹＳ−４５４９４のより詳細な特徴は、後述の実施例に記載される。
【００２１】
本発明は、プラバスタチンを生産する能力を有するＹＳ−４４４４２の突然変異体及びＹＳ−４５４９４の突然変異体をも含む。突然変異体は、親株ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４に従来の突然変異誘発技法を適用することにより得ることができる。突然変異を誘発させる適切な方法としては、例えば、ガンマ線や紫外線を微生物に照射することや、ＥＭＳ（スルホン酸エチルメタン）、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ'−ニトロソグアニジン）、ＮＱＯ（４−ニトロキノリンＮ−オキシド）、ＤＥＳ（ジエチルスルフェート）、ＤＥＢ（ジエポキシブタン）及びＮＭＵ（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素）等の突然変異誘発物質で処理すること等が挙げられる。突然変異体を得るには、親株であるＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４に紫外線を３０、６０、１２０、２４０若しくは４８０秒間、又は、コバルト６０ガンマ線を０．５、１、２、３若しくは４Ｋｇｙの量で照射すればよい。良好な収量でプラバスタチンを生産できる所望の突然変異株は、上記の方法を用いて選択できる。当業者であれば、当技術分野で従来知られている突然変異誘発技法及びスクリーニング法を用いて、親株のＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４からこれらの突然変異体を得ることができる。より詳細な突然変異誘発手順については、後述の実施例に記載する。
【００２２】
ＩＩ．本発明に係る株を用いたプラバスタチンの生産方法
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を用いてプラバスタチンを生産することができる。すなわち、本発明の一目的は、ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を用いたプラバスタチンの生産方法を提供することである。具体的には、本製造方法は、（ａ）ＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４を適切な条件で培養し発酵ブロスを生成するステップと、（ｂ）得られたブロスにコンパクチンを供給するステップと、（ｃ）前記ブロスを一定期間発酵させ、コンパクチンをプラバスタチンに転換するステップと、（ｄ）前記ブロスからプラバスタチンを単離するステップとを含む。
【００２３】
微生物を培養する技術及びプラバスタチンを発酵ブロスから単離する技術は、当技術分野において周知である。当業者であれば、当技術分野において知られている発酵及び単離技術（例えばＨＬＰＣ）を組合せることにより、本発明のＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を用いてプラバスタチンの生産方法を遂行することができる。具体的な実施例を後に説明する。
【００２４】
本発明の一態様において、ステップ（ａ）の発酵ブロスの培養は２日未満、好ましくは約１８時間である。ステップ（ａ）の発酵ブロスは、微生物を適切な条件下で約１８〜４８時間培養した種培養物（seed culture）から得たものが好ましい。種培養物を培養するための種培地（seed medium）は、グルコース、ペプトン、大豆タンパク質及びミネラル源を含むことができる。発酵培地はさらにコーンスティープパウダー（corn steep powder）（Ｃ．Ｓ．Ｐ．）を含むことができる。
【００２５】
前記ブロスに添加されるコンパクチンは、コンパクチンを生産することができる真菌や細菌又はそれらの細胞抽出物、あるいはコンパクチンを含む溶液により提供されるのが好ましい。発酵ブロスに供給されるコンパクチンの濃度は、微生物が存在しない発酵ブロスに基づいて、及び供給コンパクチンのみに基づいて計算される。本発明の好ましい態様において、コンパクチンは、その最終濃度が１．０ｇ／Ｌより高く、より好ましくは１．５〜２．０ｇ／Ｌの範囲になるようにブロスに供給される。
【００２６】
本発明の他の態様において、コンパクチンをプラバスタチンに転換するステップ（ｃ）の期間は５日未満、好ましくは３日未満、さらに好ましくは２４時間未満である。
【００２７】
本発明の好ましい一態様において、ステップ（ｄ）で単離されるプラバスタチンの収量は、０．５ｇ／Ｌより多く、好ましくは１．０ｇ／Ｌより多く、さらに好ましくは１．５ｇ／Ｌより多い。本発明の好ましい一態様において、ステップ（ｄ）で生産される総プラバスタチン量中のエピプラバスタチンの割合（ＥＰ％）は、約１．８〜８％である。本発明の好ましい一態様において、コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率（ＭＥ％）は、４０％より高く、好ましくは５０％より高く、より好ましくは７０％より高い。上記の方法で生産されたプラバスタチンは、ＨＰＬＣ等、当技術分野で慣用の技法のいずれかを用いて単離することができ、さらに抽出や結晶化を行ってもよい。
【００２８】
ＩＩＩ．クロマトグラフィーを用いずにプラバスタチンを単離する方法
本発明者らは、クロマトグラフィーを用いずに（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を良好な収率及び純度で単離しラクトン化反応を進行させるための改善された方法を開発した。
【００２９】
即ち、本発明の一目的は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の単離方法において、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む第一の溶液に硫酸アンモニウムを添加して沈澱物を生成するステップ（１）と、前記沈澱物を分離するステップ（２）と、分離された沈澱物を極性溶媒を用いて溶解して第二の溶液を得るステップ（３）と、第二の溶液のｐＨを約ｐＨ４〜約ｐＨ６に調整するステップ（４）と、水と相溶性のない溶媒を用いて第二の溶液から（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を抽出単離するステップ（５）とを含む該方法を提供することである。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤はプラバスタチン、コンパクチン及びロバスタチンから選択され、プラバスタチンがより好ましい。
【００３１】
本単離方法のステップ（１）に係る第一の溶液は、単離される（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む溶液であれば特に限定されない。本発明の好ましい態様において、本単離方法のステップ（１）における第一の溶液は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を生産できる微生物から誘導することができる微生物発酵ブロスである。該微生物は、ストレプトマイセス・ロゼオクロルノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｒｎｏｇｅｎｕｓ）（米国特許第４，３４６，２７７号）、アクチノマデュラ・ｓｐ．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．）（Ｐｅｎｇ，Ｍ．ら、前掲及びＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、前掲）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ヒポマイセス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）、ホーマ（Ｐｈｏｍａ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、ドラトマイセス（Ｄｏｒａｔｍｙｃｅｓ）、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ギムノアクサス（Ｇｙｍｎｏａｘｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（欧州特許出願公開第０，８７７，０８９，Ａ１号）から選択され、より好ましくは、本発明のＹＳ−４４４４２、ＹＳ−４５４９４及び本明細書中に記載のそれらの突然変異体である。
【００３２】
ステップ（１）の硫酸アンモニウムは、第一の溶液の３０〜６０％（ｗ／ｖ）となる量で第一の溶液に添加されることが好ましい。より好ましくは、添加される硫酸アンモニウム量は第一の溶液における飽和量である。
【００３３】
本単離方法のステップ（１）において、沈澱物は濾過、遠心分離、又はデカント等の当技術分野において知られている方法、好ましくは薄膜濾過により単離できる。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、ステップ（４）に係る第二の溶液のｐＨは無機酸、好ましくは塩酸によって調整される。当業者であれば、第二の溶液のｐＨを調整するための適当な酸を慣用技術及び知識に応じて選択することができる。
【００３５】
本単離方法のステップ（５）において、水と混和しない溶媒を用いて第二の溶液を抽出に付す技術は、当技術分野においてよく知られている。当業者であれば、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を第二の溶液から首尾良く抽出するための水と混和しない適当な溶媒を選択し用いることができる。好ましくは、水と混和しない溶媒は、酢酸エチル、アセトン、トルエン、ジクロロメタン及び酢酸イソプロピルから選択される有機溶媒で、酢酸エチルがより好ましい。有機溶媒の添加量は第二の溶液に含まれる（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の濃度に依存する。抽出時間は５分を超えることが好ましく、５〜３０分の範囲が最も好ましい。
【００３６】
有機溶媒による抽出の後、有機溶媒層を回収し、次いで慣用の技法（例えば、無水硫酸マグネシウムと活性炭素）を用いて乾燥、脱色することにより、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離する。
【００３７】
本発明の一態様においては、本単離方法は更に、単離（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を有機若しくは無機カチオン源、好ましくはナトリウム、と反応させ、阻害剤の塩を得るステップを更に含む。ナトリウム源は、ＮａＯＨ、Ｎａ2ＣＯ3、酢酸ナトリウム（無水）及び２−エチルへキサン酸ナトリウムから選択することが好ましい。カチオン源の添加量及び反応時間は（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の濃度に依存する。当業者であれば、カチオン源の種類及び量を適宜選択し、該阻害剤の塩を得ることができる。濃度０．２〜５．０Ｍでカチオン源を添加し０．５〜２．０時間撹拌することが好ましい。
【００３８】
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
実施例１
Ａ．土壌サンプルからのＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株の単離
放線菌単離のために用いる土壌サンプルを、様々な場所から採集した。土壌サンプルを室温に置き、一定の重量になるまで乾燥させた。空気乾燥した土壌サンプル１グラムを減菌した５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁させ、スーパーミキサで１分間攪拌した。放線菌の胞子を発芽させるため前記土壌サンプルの懸濁液を振とう培養器で３５℃〜５０℃で１０分間加熱した。十倍段階希釈した後、懸濁液を適切な単離培地を含む寒天プレートに散布した。前記寒天プレートに発生したコロニーを裸眼で数え、放線菌の形態学的特性を光学顕微鏡で調べた。未同定の３０００個のコロニーから正の形態学的特性を示す４００株を選んだ。コンパクチンからプラバスタチンへの高転換率（＞５０％）と低エピプラバスタチン含量（＜１０％）の点から、前記４００株からＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株を選んだ。ＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株の単離条件を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
Ｂ．ＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株の特徴
ＹＳ−４４４４２株又はＹＳ−４５４９４株をイーストエキストラクト−モルトエキストラクト含有寒天培地（ＩＳＰ−２）［Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，Ｅ．Ｂ．とＧｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６（３）：３１３−３４０（１９６６）］のスラントの上に保ち、２７℃で培養した。生理学的試験に供するための接種材料およびＤＮＡ抽出のためのバイオマス調製物はトリプトン−イーストエキストラクトブロス（ＩＳＰ−１）［ＳｈｉｒｌｉｎｇとＧｏｔｔｌｉｅｂ、前掲］中で培養することによって調製した。
【００４２】
（１）形態と色素産生
形態学的特徴付けは、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）の記載に従って行った。培養物の形態は４５倍及び１００倍の超長作業距離対物レンズを備えたニコンオプティフォト(Nikon Optiphot)−２顕微鏡を用いた光学顕微鏡検査法で検査した。気中菌糸の色は、大気表面での成熟胞子成長を観察することによって決定した。基層菌糸及びメラニン以外の拡散性可溶性色素の色決定は裏側を観察することによって行った。基層菌糸の着色は次の色グループのいずれかに割り当てた：（１）黄色〜茶色；（２）黄色〜茶色＋赤（またはオレンジ）；（３）黄色〜茶色＋青（または紫）；（３）黄色〜茶色＋緑。色素及び色の決定はＴｅｋｔｒｏｎｉｘ ＲＧＢ 色サンプラー（Ｘｅｒｏｘ， Ｉｎｃ．）との比較に基づいて行った。形態学的特徴付けはイーストエキストラクト−モルトエキストラクト含有寒天培地（ＩＳＰ−２）、オートミール寒天培地（ＩＳＰ−３）、無機塩−スターチ寒天培地（ＩＳＰ−４）及びグリセロール−アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−５）[ＳｈｉｒｌｉｎｇとＧｏｔｔｌｉｅｂ、前掲］で行った。
【００４３】
ＹＳ−４４４４２の結果については、ＩＳＰ−２及びＩＳＰ−４で、５個〜１０個の胞子から成る短く波状の（開いた）フック型または（短い）らせん型の連鎖が観察された。前記胞子は滑らかな球状で菌糸の直径の約２〜３倍であった。偽胞子嚢はＩＳＰ−２及びＩＳＰ−４に存在し、ＩＳＰ−４の方により多く存在していた。気中でのマスの着色はＩＳＰ−２及びＩＳＰ−３で白（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ１００）であった。ＩＳＰ−４及びＩＳＰ−５では気中菌糸は発生しなかった（表２参照）。さらに、ＹＳ−４４４４２における基層菌糸の着色はＩＳＰ−２、ＩＳＰ−３及びＩＳＰ−４で茶色（Ｒ８５ Ｇ７０ Ｂ４０、カラー２）、ＩＳＰ−５で黄〜茶色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ７０、カラー１）だった（表２参照）。ＮａＯＨ（０．０５Ｎ）及び塩酸（０．０５Ｎ）を約１００μｌ加えた後のｐＨ変化に対応した色素の変化はなかった。さらに、ＹＳ−４４４４２は可溶性色素を産生しなかった（表２参照）。
【００４４】
ＹＳ−４５４９４の結果については、気中菌糸の気中でのマスの着色はＩＳＰ−２、３、４及び５では白（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ１００）であった。ＩＳＰ−２では気中菌糸はまっすぐ且つ長く枝分かれしていた。ＩＳＰ−３では気中菌糸が菌糸の栄養成長先端部の膨張部と合体している。経時変化に関しては、Ａ５株はＩＳＰ−５で球棹菌状成分に分解した。基層菌糸の着色はＩＳＰ−２で橙茶色（Ｒ１００ Ｇ８５ Ｂ４０、グループ２）、ＩＳＰ−３で赤〜茶色（Ｒ７０Ｇ５５ Ｂ４０、グループ２）、ＩＳＰ−４で薄黄〜茶色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ８５、カラーグループ１）、ＩＳＰ−５で薄黄〜茶色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ７０、グループ１）であった（表２参照）。ＮａＯＨ（０．０５Ｎ）及び塩酸（０．０５Ｎ）を約１００μｌ加えた後のｐＨ変化に対して色素に変化はなかった。さらに、ＩＳＰ−３及びＩＳＰ−５において可溶性の色素を観察した。着色はＩＳＰ−３で茶色（Ｒ７０ Ｇ５５ Ｂ４０）、ＩＳＰ−５で黄色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ８５）であった（表２参照）。これについてもＮａＯＨ（０．０５Ｎ）及び塩酸（０．０５Ｎ）を約１００μｌ加えた後のｐＨ変化に対して可溶性色素に変化はなかった。
【００４５】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４で観察された形態学的特徴を下の表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
（２）生理学的試験
メラニン産生及び単独炭素源利用はＳｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）の記載に従って測定した。メラニン産生はペプトン−イーストエキストラクト鉄寒天培地（ＩＳＰ−６）及びチロシン寒天培地（ＩＳＰ−７）について評価した[Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）］。単独炭素源利用はＤ−グルコース（正の対照）、ｉ−アラビノース、スクロース、Ｄ−キシロース、ｉ−イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、ラムノース、ラフィノース及びセルロースを１％（ｗ／ｖ）の濃度にしたもので改変した塩基性無機塩寒天培地（ＩＳＰ−９）について評価した[Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）］。負の対照としては改変されていない塩基性無機塩寒天培地を用いた。結果はＳｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂの記載に従って評価した[Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）］。
【００４８】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４の成育一般の特徴を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
ＹＳ−４４４４２の炭水化物利用パターンに関して、強い正(positive)の利用がＬ−アラビノース、スクロース、Ｄ−フラクトース、ｄ−フラクトース及びラムノースで観察された。疑わしい利用はセルロースで観察され、負(negative)の利用はＩ−イノシトール及びラフィロースで観察された。前記培養ではメラノイド色素は産生されなかった。
【００５１】
ＹＳ−４５４９４の炭水化物利用パターンに関して、強い正の利用がＬ−アラビノース、スクロース及びＤ−フラクトースで観察された。正の利用はラムノース及びラフィノースで観察された。疑わしい利用はＤ−キシロース、Ｉ−イノシトール、Ｄ−マンニトール及びセルロースで観察された。前記培養ではメラノイド色素は産生されなかった。
【００５２】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４の炭水化物利用パターンの結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
（３）１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出のためのバイオマスを、オービタルシェーカー（１インチ幅）上で２５０ｒｐｍにて連続振とう下、２７℃で、トリプトン−イーストエキストラクトブロス（ＩＳＰ−１）５０ｍｌ中で１０日間培養して調製した（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ ＆ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、前掲）。１５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、液状培養物を回収した。バイオマスを減菌した乳鉢と乳棒へ移し、ペースト状に丁寧に磨り潰した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス：１ｍＭエチレンジニトロ四酢酸）約０．４ｍｌを加え、緩衝液と細胞砕片を１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液１００μｌを用いて減菌した２ｍｌ遠心分離用試験管へ移した。６５℃で１５分間、水浴中で混合物を培養した。緩衝化フェノール（ｐＨ８）（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版（１９９５），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ．Ｉｖ．（複数頁に渡る））約０．５ｍｌを試験管に加え、１０分間混合した。混合物を１５分間、１４，４７４×ｇで遠心分離した。水層を減菌した２ｍｌ遠心分離用試験管に移し、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）０．５ｍｌを加えた。混合物を１５分間、１４，４７４×ｇで遠心分離し、水層を減菌した２ｍｌ遠心分離用試験管に移した。５Ｍ塩化ナトリウム水溶液約５０μｌと冷９５％エタノール１ｍｌを試験管に加え、混合物を２４時間、−２０℃に保持してＤＮＡを沈澱させた。混合物を４℃で３０分間、１４，４７４×ｇで遠心分離し、上清を除去した。８０％エタノール約１００μｌを試験管に加えた後、１０分間、１４，４７４×ｇで遠心分離した。エタノールを除去し、ペレットを３０分間乾燥させた後、減菌した脱イオン水（１８Ｍｏｈｍ）５０μｌ中に再懸濁させた。使用するまでＤＮＡを−２０℃で保存した。
【００５５】
１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定
パーキン・エルマー社のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム２４００のＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標）ネイティブＴａｑポリメラーゼを用い、１６ｓｒＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を抽出したＤＮＡに対して行なった。増幅された１６ｓ ｒＤＮＡの精製は、バイオ・ラッド社のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ精製システムで行なった。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターサイクル配列決定用調製済み反応キットを用い、配列決定用の蛍光標識したＤＮＡを調製した。製造業者による手引きに従ってＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＰＯＰ−６（商標）パフォーマンスオプティマイズドポリマー６を用い、６１ｃｍ×５０μｍキャピラリーを備えたＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０ジェネティックアナライザーでＤＮＡ配列を解析した。１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅および配列決定では、プライマーＧＭＧ１とＧＭＧ１０を使用した（表５参照）。１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅プログラムは次の通りである：（１）９４℃、７分間；（２）９４℃、１分間；（３）５３℃、１分間；（４）７２℃、２分間；（５）７２℃、６分間；ステップ２〜５を３０回反復；（６）４℃で保持。
【００５６】
【表５】
【００５７】
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４の１６ｓ ｒＤＮＡ配列は配列番号１および２にそれぞれ示した配列を含む。ＡＲＢ配列エディター（リリース８．１）を用い、リボソームデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）〔Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：１７３−１７４（２０００）〕の多数配列アラインメントデータセットに対して配列を整列させた。ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４の１６ｓ ｒＤＮＡ配列とＲＤＰ（Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．ら、前掲）との比較によって、サッカロスリックスｓｐ．ＮＲＲＬ Ｂ−１６１３３［Ｌａｂｅｄａ，Ｄ．Ｐ．とＲ．Ｍ．Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０Ｐｔ １：３３１−６（２０００）］との配列相同性はそれぞれ９９．１％と９９．０％であることが示される。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ＲＤＰ／ｈｔｍｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。加えて、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４と関連する放線菌類（表６）とを比較する、ＡＲＢソフトウェアパッケージ（Ｔｒｅｅ０．１と示す）によって得られた１６ｓ ｒＤＮＡ系統樹を図１に示す。
【００５８】
【表６】
【００５９】
Ｃ．ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４と既知の微生物との比較
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４は両者共、サッカロスリックス・アエロコロニゲネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）およびサッカロスリックス・オーストラリエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）についてＢｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｃｒｏｓｓ，Ｔ．，前掲）に記述されている特徴、そしてサッカロスリックス・テキサセンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ｔｅｘａｓｅｎｓｉｓ）についてＬａｂｅｄａとＬｙｏｎｓ（Ｌａｂｅｄａ，Ｄ．Ｐ．とＬｙｏｎｓ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，３９（３）：３４４−３５８（１９６８９））によって記述されている特徴と同様の表現型の特徴を示す（表７）。ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４は、その形態と炭水化物利用パターンが公開された記述とは異なる（表８）。また、炭水化物利用パターンにおいて、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４はサッカロスリックス・アエロコロニゲネス、サッカロスリックス・オーストラリエンシスおよびサッカロスリックス・テキサセンシスとも異なる（表８）。
【００６０】
【表７】
【００６１】
【表８】
【００６２】
系統発生学的および生理学的分析の総合結果に基づき、ＹＳ−４４４４２株およびＹＳ−４５４９４株は互いに異なり、またサッカロスリックス・アエロコロニゲネス、サッカロスリックス・オーストラリエンシス及びサッカロスリックス・テキサセンシスの各規準株とも異なり、サッカロスリックス属の新規な種であると考えられる。これら２つの株は中国基準株保存機関（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、２００２年１月８日にそれぞれ受託番号Ｍ２０２００１とＭ２０２００２が与えられている。
【００６３】
実施例２
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるプラバスタチンの生産
（１）発酵ブロスに添加するコンパクチン溶液の調製
０．３Ｍ水酸化ナトリウム溶液（５００ｍｌ）を温め、５０〜６０℃に保持した。水酸化ナトリウム溶液にコンパクチン４０ｇを加え、５０〜６０℃で２〜３時間撹拌した。水酸化ナトリウム中のコンパクチン溶液を室温に冷却し、１Ｎ塩酸でｐＨを７．５に調整した。水酸化ナトリウム中のコンパクチン溶液の容量を１０００ｍｌに調整し、２０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を濾過して減菌した。
【００６４】
（２）ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４を用いたプラバスタチンの生産ＹＳ−４４４４２（あるいはＹＳ−４５４９４）の胞子菌懸濁液１ｍｌを−８０℃でＧＬ（１０％グリセロール、５％ラクトース）中に保存し、層をなす花状に開け(opened in laminar flower)、種培地（１リッター当たりグルコース１０ｇ、ペプトン２ｇ、大豆タンパク質４ｇおよびＫＨ2ＰＯ4１ｇを含む、ｐＨ７．０±０．２）２０ｍｌを含む３００ｍｌ振とうフラスコに加えた。種培養物をロータリーシェーカー内で２００〜２２０ｒｐｍにて２４〜４８時間、２７℃で培養した（生育相）。その後、種培養物１．５〜２ｍｌを発酵培地（１リッター当たりグルコース１５ｇ、ペプトン５ｇ、コーンスティープパウダー（Ｃ．Ｓ．Ｐ．）５ｇ、大豆ミール４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇを含む、ｐＨ７．０±０．２）２０ｍｌを含む３００ｍｌ振とうフラスコ内で培養した。振とうフラスコをロータリーシェーカー内で２００ｒｐｍにて１８〜２４時間、２７±０．５℃で培養した（生育相）。発酵ブロス中での最終濃度が１５００〜２０００ｍｇ／Ｌとなるよう上述のように調製したコンパクチンを発酵ブロスに加え、１６〜２４時間培養を継続した。
【００６５】
（３）プラバスタチンおよびコンパクチンのＨＰＬＣ分析
上記で得られた発酵ブロス（０．２ｍｌ）を脱イオン水（１．８ｍｌ）に加えた。混合液を１分間混合し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清をＨＰＬＣを用いて次の条件で分析した。
*移動相は下記の勾配で流した。
時間（分） 流量 ％Ａ ％Ｂ
０ １．０ １００ ０
１．０ １．０ １００ ０
１．１ １．０ ３０ ７０
３．５ １．０ ３０ ７０
３．６ １．０ １００ ０
３０ １．０ １００ ０
３１ ０．０ １００ ０
【００６６】
（４）計算と結果
アルカリ性メタノール（１００％メタノールと０．１Ｎ水酸化ナトリウム）に溶解し、水で希釈した標準プラバスタチンまたはコンパクチン調製物を調製した。プラバスタチン収量、モル転換効率（ＭＥ％）およびエピプラバスタチンの割合（Ｅｐｉ％）は、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で計算される。
【００６７】
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるコンパクチンからプラバスタチンへの転換効率、プラバスタチン収量およびエピプラバスタチンの割合を表９に示す。
【００６８】
【表９】
【００６９】
実施例３
コンパクチンを連続供給するＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるプラバスタチン生産
発酵ブロスに添加するコンパクチン溶液を実施例１の記載に従って調製した。−８０℃でＧＬ（１０％グリセロール、５％ラクトース）中に保存したＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４の胞子懸濁液（９ｍｌ）を、層をなす花状に開け（opened in laminar flower）、実施例１に記載の種培地（６００ｍｌ）を入れた３Ｌ振盪フラスコに加えた。ロータリーシェイカー（２００〜２２０ｒｐｍ）を用いて２４〜４８時間、２７℃で種培養物を培養した（生育相）。その後、消泡剤（ＬＧ−１０９、０．１ｍｌ／Ｌ）を添加した実施例１に記載の発酵培地（１６Ｌ）を３０Ｌ発酵器に入れ、種培養物（１．６Ｌ）を加え培養した。発酵を、ブロスの体積あたり０、９体積／分の空気を供給しながら、２７℃で、撹拌下（１００〜１５０ｒｐｍ）、２４〜４８時間行った。その後、発酵ブロスにコンパクチン（５０〜６０ｇ／Ｌ）を１０〜３０ｍｌ／ｈｒで供給した。２〜３日間供給を続けた後、発酵を停止した。得られた発酵ブロスを実施例１と同様にＨＰＬＣを用いて分析し、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるコンパクチンからプラバスタチンへの転換効率、プラバスタチン収量およびエピプラバスタチンの割合を実施例１と同様に計算した。結果を表１０に示す。
【００７０】
【表１０】
【００７１】
既知の微生物（例えば、Ｐｅｎｇ Ｍ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（前掲）およびＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ（前掲）に記載のアクチノマデュラｓｐ．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．））が、濃度０．５〜１．１ｇ／Ｌのコンパクチン供給濃度で収量０．３２６〜０．８２１ｇ／Ｌのプラバスタチンを生成するために（コンパクチン供給後）５〜７日の転換期間が必要なことに比べ、本発明のＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４は、濃度１．５〜２．０ｇ／Ｌのコンパクチン供給濃度で収量１．０〜１．５ｇ／Ｌのプラバスタチンを（コンパクチン供給後）２４時間以内で生成することができる。また、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４の発酵ブロスを（種培養物の接種から）ほんの１８時間培養した後、すぐにコンパクチンを該発酵ブロスに添加することができる。従来技術においては、アクチノマデュラｓｐ．（Ｐｅｎｇ Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（前掲）およびＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ（前掲））の発酵ブロスを（種培養物の接種から）２日以上培養しなければ、コンパクチンを添加できなかった。さらに、ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４が生産するプラバスタチンは、所望の治療効果を示さないばかりか臨床治療において望ましくない効果を示すエピプラバスタチン（即ち、コンパクチンの６α−ヒドロキシル化体）の割合が低い。本発明の二種の新規微生物は、コンパクチンに対する耐性が高く、コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率が高い。
【００７２】
実施例４
ＮＴＧ突然変異誘発方法
ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４の胞子懸濁液をＩＳＰ２培地（１０ｍｌ）に添加し、振盪下１〜２時間培養した。遠心分離後、胞子ペレットを０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、ＮａＣｌ溶液（０．９％、３ｍｌ）に懸濁させた。得られた胞子懸濁液に、０．２ＭＮａＯＨ溶液（２．５ｍｌ）および１０００ｐｐｍＮＴＧ（１ｍｌ）を加え、よく混合した。次いで、２７±１℃で１０、２０、３０、６０および１２０分間培養した。培養後、１２％チオ硫酸ナトリウムを胞子懸濁液に添加し、遠心分離させた後、上層を除去して、ＮＴＧを除去した。ＩＳＰ２培地（１０ｍｌ）を胞子懸濁液に添加し、振盪下１〜２時間培養した。遠心分離後、胞子ペレットを０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、ＮａＣｌ溶液（０．９％、３ｍｌ）に懸濁させた。１０倍段階希釈の後、希釈胞子懸濁液（０．１ｍｌ）をＩＳＰ２寒天プレート上に散布した。２７±１℃で６〜９日間培養した後、寒天プレート上に現われたコロニーの形態を観察し、それらを計数した。次式で求められる殺傷率(killing rate)が５０〜９９．５％であることが好ましい。
【００７３】
殺傷率＝（ＮＴＧ処理されない細胞の数−ＮＴＧ処理した細胞の数）／（ＮＴＧ処理されない細胞の数）×１００％
【００７４】
例えば、１０4倍希釈した胞子懸濁液を散布しＮＴＧ処理した寒天プレートにコロニーが２８個（細胞数：２．８×１０6個）現われ、１０6倍希釈した胞子懸濁液を散布しＮＴＧ処理しなかった寒天プレートにコロニーが３６個（細胞数：３．６×１０8個）出現した場合、殺傷率は約９９．２２％［１００％×（３６０，０００，０００−２，８００，０００）／３６０，０００，０００］となる。別の突然変異誘発物質を用いた他の突然変異誘発方法も上記の方法で行うことができる。
【００７５】
紫外線照射による突然変異誘発方法
ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４の胞子懸濁液を１０倍段階希釈に付した。希釈胞子懸濁液（０．１ｍｌ）をＩＳＰ２寒天プレート上に散布した。寒天プレートを開け、３０、６０、１２０、２４０および４８０秒間、紫外線処理した。紫外線照射後、それ以上の光照射を避けるために、寒天プレートをカバーし直ちに暗所に移した。２７±１℃で６〜９日間培養した後、寒天プレート上に現われたコロニーの形態を観察し、それらを計数した。上記の式で求められる殺傷率が９９〜９９．９９９％であることが好ましい。
【００７６】
実施例５
ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４由来の突然変異体の生物活性アッセイ
突然変異誘発後、形態学的変異体（morphological variant）を選択し、６〜１０個のガラスビーズおよび脱イオン水（０．５ｍｌ）と共にスクリューチューブ（screw tube）に入れ、よく混合した。懸濁液（０．１〜０．１５ｍｌ）をＩＳＰ２スラント寒天中でリフレッシュ（refreshed）し、液体培地中で発酵させた。発酵中、コンパクチンを最終濃度が１．５ｇ／Ｌまたは２．１ｇ／Ｌとなるように添加し、２７℃で２４〜４８時間、生変換（bioconversion）を進行させた。発酵ブロス（０．２ｍｌ）を脱イオン水（１．８ｍｌ）と混合した。遠心分離後、上記のようにＨＰＬＣによって、上清を分析した。ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４由来の突然変異体を、それら突然変異体のプラバスタチン生産性、転換効率、エピプラバスタチンの割合を調べるために選択した（表１１参照）。
【００７７】
【表１１】
【００７８】
実施例６
硫酸アニモニウム沈澱によるプラバスタチンの精製方法
親株ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４に由来する突然変異体株のプラバスタチン含有発酵ブロス（１４Ｌ、ｐＨ７．５〜８．５）に硫酸アンモニウム（４．５〜７．０ｋｇ）を２〜６時間かけてバッチ添加した。次いで、５〜１５時間、室温で撹拌し、沈澱を得た。得られた沈澱物を濾過により分離した。分離した沈澱物を水（１００〜２００ｍｌ）に溶解し、０．５時間撹拌して、溶液を調製した。溶液をセライト床を通して濾過し、セライト床を水（１００ｍｌ）で一回洗浄した。濾液を回収し、１８％(ｗ／ｖ)塩酸を用いて濾液のｐＨを４．０〜６．０に調整した。前記濾液を１．０〜３．０体積の酢酸エチルと混合し、室温で１０〜３０分間撹拌した。得られた乳液をセライト床で濾過した。相を分離した後、水相を回収し、１．０〜３．０体積の酢酸エチルを用いて再度抽出に付した。このような２度の抽出により得られた酢酸エチル相を合一した。合一酢酸エチル相に無水マグネシウム（０．１〜１．５％ｗ／ｖ）と活性炭素（０．１〜１．５％ｗ／ｖ）を添加し、室温で１〜１５分間撹拌し、濾過し、未使用の酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄して脱水・脱色した。プラバスタチンを収率９４．４９５％（ＨＰＬＣ）で得た。
【００７９】
プラバスタチンナトリウムを以下のようにして得た。上記のように精製したプラバスタチンを未使用の酢酸エチルに溶解し、プラバスタチン濃度５．０〜２５．０ｇ／Ｌの溶液を調製した。上記の溶液に２−エチルヘキサン酸ナトリウム（０．２〜５．０Ｍ）のメタノール／エタノール溶液またはイソプロピルアルコール溶液を添加し、室温で０．５〜２．０時間撹拌した。得られた溶液を０〜２０℃まで冷却し、濾過し、未使用の酢酸エチルで洗浄した。純度９８．５％（ＨＰＬＣ）、各不純物量０．３％未満、合計不純物量１．０％未満のプラバスタチンを収率６０〜８０％で得た。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４をＡＲＢソフトウエアパッケージ（バージョン：Ｔｒｅｅ０．１）で発生させた関連放線菌類と比較する１６ｓ ｒＤＮＡの系統樹である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４と称されるサッカロスリックス（Saccharothrix）の二種の新規微生物株、これらの株を用いてプラバスタチン（pravastatin）を生産する方法、並びに（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離するための改良された方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血中コレステロールレベルがアテローム性動脈硬化症、特に冠動脈系心臓病の主たる危険因子の一つであることが認識されている。コレステロールの生合成をモニタリングすることはこれらの疾病の抑制に非常に有用である。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリール（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼはコレステロール生合成における律速酵素である。（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼの活性を阻害することにより、生体の血中コレステロールレベルを効果的に減少させることができる。
【０００３】
数多くの（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、例えばプラバスタチン、コンパクチン、ロバスタチン、が発見されている。それらは、ラクトン形の以下に示す構造式で表わされるが、他の形態、例えば酸及び／又はその塩やエステルとして存在してもよい。
【０００４】
【化１】
これらの（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、人間を含む多くの動物で血中コレステロールレベルを下げるのに非常に有効である。プラバスタチンは、コンパクチン及びロバスタチンよりも活性があり、高コレステロール血症の治療に適用されてきた（Ｎａｒａ，Ｆら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２８−３２（１９９３））。
【０００６】
プラバスタチンは、コンパクチンの３β−ヒドロキシ誘導体である。プラバスタチンは、例えばストレプトマイセス・ロゼオクロルノジーナス（Streptomyces roseochrornogenus）（米国特許第４，３４６，２７７号）やアクチノマジュラｓｐ．(Actinomadura sp.）（Ｐｅｎｇ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｄｅｃ：１０３２−１０３５（１９９７）及びＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ １０：１５１−１５６（２０００））等、種々の属の真菌や細菌を用いてコンパクチンを微生物ヒドロキシル化により転換することによって生産されると報告されている。しかしながらこれらの真菌や細菌は、恐らくコンパクチンの抗真菌活性のために、真菌や細菌の発酵培養ブロスに添加される多量のコンパクチンに耐性でなく、その結果プラバスタチンの生産性が低い。よって、より多量のコンパクチンに耐性を示すと共に、効果的転換活性を有する新しい微生物を見い出す必要がある。
【０００７】
一般に、発酵培養ブロスからの（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の単離は、抽出、クロマトグラフィー、ラクトン化及び結晶化という容易でない手続きによって行われる。ヨーロッパ特許出願公開第０８７７０８９Ａ１号は（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の調製方法を開示している。これによると、阻害剤（例えば、ロバスタチン）を含む発酵培養ブロスを塩基性とした後に濾過して細胞を除去し、次いで、濾液をカラムを通して充填する。溶出液をトルエンで抽出し、続いてラクトン化することにより阻害剤が得られる。
【０００８】
しかしながら、クロマトグラフィーを利用する場合には、望む収量で阻害剤を得るためには、大きなカラムと（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む大容量の発酵培養ブロスが通常必要とされ、そのため、阻害剤の精製プロセスの操作の困難性が増大する。さらに、ラクトン化反応は通常多大のエネルギーと時間を必要とする。よって、ラクトン化反応を行ったりクロマトグラフィーを使用することなしに（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を高収率、高純度、且つ低コストで得る改良された方法を探索する必要がある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の一目的は、プラバスタチンを生産することができＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４と命名されたサッカロスリックス（Saccharothrix）の二種の新規微生物株並びにそれらの突然変異体を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明に係る微生物を用いてプラバスタチンを生産する方法を提供することである。特に、プラバスタチンを生産するための本発明方法は、ＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４を適切な条件で培養して発酵培養ブロスを生成するステップ（ａ）と、コンパクチンを前記培養ブロスに供給するステップ（ｂ）と、この培養ブロスを一定時間発酵させてコンパクチンをプラバスタチンに転換するステップ（ｃ）と、プラバスタチンを前記培養ブロスから単離するステップ（ｄ）とを含む。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離する方法を提供することであって、該方法は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む第一の溶液に硫酸アンモニウムを添加して沈澱を生成するステップ（１）と、前記沈澱を単離するステップ（２）と、前記沈澱を極性溶媒を用いて溶解して第二の溶液を得るステップ（３）と、第二の溶液のｐＨを約４から約６に調整するステップ（４）と、第二の溶液を水と混和しない溶媒で抽出して（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離するステップ（５）とを含む。この調製方法は、単離された（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を有機又は無機のカチオン源と反応させて阻害剤を塩の形で生成させるステップを更に含む。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の説明を参照することにより、より十分に理解されその利点が明らかになるであろう。
【００１３】
Ｉ．新規微生物株
本発明の一目的は、良好な収率でプラバスタチンを生産するための二種の新規微生物株を提供することである。本発明者らは、驚くべきことに、土壌試料から放線菌を単離することにより、コンパクチンに対する高い耐性を有すると共にプラバスタチンの生産性が高い二種の新規微生物株、ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を得た。この二種の株は２００２年１月８日、中国基準株保存機関（ＣＣＴＣＣ）に夫々、受託番号Ｍ２０２００１及びＭ２０２００２で寄託された。
【００１４】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４は土壌から単離することができる。まず、土壌試料を滅菌したリン酸緩衝液に懸濁させる。得られた懸濁液を１０倍段階希釈した後、単離培地を含有させた寒天プレート上に拡げる。寒天プレート上に増殖したコロニーを、放線菌の形態学的特徴に基づき顕微鏡検査により事前にスクリーニングすることができる。次いで、候補株を培養し、発酵ブロス（fermentation broth）を得る。この発酵ブロスにコンパクチンを供給して、プラバスタチンを生成させる。発酵ブロス中に生成されたプラバスタチンの量を求める。プラバスタチンの生産率が高いことからＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を選択する。
【００１５】
寒天プレートの培地は本技術分野で良く知られているものであり、好ましくはイーストエキストラクト、モルトエキストラクト、デキストロース及び寒天を含むものである。より好ましくは、ＩＳＰ２培地である。ある種の態様においては、培地に含有させる単離剤は、ナイスタチン、シクロヘキシミド、ペニシリンＧ、ポリミキシンＢ及びゲンタマイシンから選択される抗生物質を含むことが好ましい。放線菌属の形態学的特徴は、Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ｇ．，編集（１９８９）Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：ボルチモア、ｐ．２５８６−２６１５）等の従来の文献や教科書に記載されている。また、このような微生物を培養し発酵させる技術は、本技術分野で公知である。
【００１６】
発酵ブロスに添加されるコンパクチンは、コンパクチンを生産する微生物（例えば真菌や細菌）若しくはその細胞抽出物、又はコンパクチン含有溶液により供給するのが好ましい。発酵ブロスに添加されるコンパクチンの濃度は、微生物が存在しない発酵ブロスに基づいて、かつ供給コンパクチンのみに基づいて計算される。発酵ブロス中に生産されたプラバスタチンは、ＨＰＬＣ等の慣用技術により同定でき、プラバスタチン生成量は、保持時間を標準調製品と比較することにより決定することができる。例えば、生産されたプラバスタチンの収量は式（Ｉ）により求めることができる。さらに、コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率は式（ＩＩ）により計算でき、生産された総プラバスタチン中のエピプラバスタチンの割合（epi-pravastatin ratio）（Ｅｐｉ％）は式（ＩＩＩ）により計算される。
【００１７】
プラバスタチン収量＝（標準濃度／標準面積）×試料面積 （Ｉ）
モル転換効率（ＭＥ％）＝（生産されたプラバスタチンのモル数／転換したコンパクチンのモル数）×１００ （ＩＩ）
エピプラバスタチンの割合（Ｅｐｉ％）＝（エピプラバスタチンの生成量／（エピプラバスタチンの生成量＋プラバスタチンの生成量））×１００％ （ＩＩＩ）
【００１８】
エピプラバスタチンはコンパクチンの６α−ヒドロキシル化体であるが、所望の治療効果を有さないばかりか、臨床治療において望ましくない効果を示す。したがって、エピプラバスタチンの割合は低いことが好ましい。なお、本明細書中、「コンパクチン耐性」とは、微生物発酵ブロス中に供給されたコンパクチンの最終濃度であって、且つ微生物が耐えうる濃度、すなわち、このような濃度のコンパクチンを含む培地において、微生物が正常に成長できる濃度を云う。
【００１９】
上記方法で得られたＹＳ−４４４４２は以下の性質を有する。寒天プレート上のコロニー（７日目）は青みがかった白色であり、胞子を形成しない。ＳＣＹ寒天スラント上の培養物は青みがかった白色であり、少量しか胞子が見られない。コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率（ＭＥ％）は約７０〜７５％である。エピプラバスタチンの割合は６．５〜８％である。プラバスタチンは、発酵ブロスの体積あたり１．０〜１．５ｇ／Ｌ生産される。コンパクチン耐性は１．５〜２．０ｇ／Ｌである。ＹＳ−４４４４２のより詳細な特徴は、後述の実施例に記載される。
【００２０】
上記方法で得られたＹＳ−４５４９４は以下の性質を有する。寒天プレート上のコロニー（７日目）は白色であり、胞子を形成する。ＳＣＹ寒天スラント上の培養物は白色の胞子と黄色の色素を生成する。コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率（ＭＥ％）は約４８〜５０％である。エピプラバスタチンの割合は１．８〜３．０％である。プラバスタチンは、発酵ブロスの体積あたり１．０〜１．５ｇ／Ｌ生産される。コンパクチン耐性は１．５〜２．０ｇ／Ｌに達する。ＹＳ−４５４９４のより詳細な特徴は、後述の実施例に記載される。
【００２１】
本発明は、プラバスタチンを生産する能力を有するＹＳ−４４４４２の突然変異体及びＹＳ−４５４９４の突然変異体をも含む。突然変異体は、親株ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４に従来の突然変異誘発技法を適用することにより得ることができる。突然変異を誘発させる適切な方法としては、例えば、ガンマ線や紫外線を微生物に照射することや、ＥＭＳ（スルホン酸エチルメタン）、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ'−ニトロソグアニジン）、ＮＱＯ（４−ニトロキノリンＮ−オキシド）、ＤＥＳ（ジエチルスルフェート）、ＤＥＢ（ジエポキシブタン）及びＮＭＵ（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素）等の突然変異誘発物質で処理すること等が挙げられる。突然変異体を得るには、親株であるＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４に紫外線を３０、６０、１２０、２４０若しくは４８０秒間、又は、コバルト６０ガンマ線を０．５、１、２、３若しくは４Ｋｇｙの量で照射すればよい。良好な収量でプラバスタチンを生産できる所望の突然変異株は、上記の方法を用いて選択できる。当業者であれば、当技術分野で従来知られている突然変異誘発技法及びスクリーニング法を用いて、親株のＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４からこれらの突然変異体を得ることができる。より詳細な突然変異誘発手順については、後述の実施例に記載する。
【００２２】
ＩＩ．本発明に係る株を用いたプラバスタチンの生産方法
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を用いてプラバスタチンを生産することができる。すなわち、本発明の一目的は、ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を用いたプラバスタチンの生産方法を提供することである。具体的には、本製造方法は、（ａ）ＹＳ−４４４４２又はＹＳ−４５４９４を適切な条件で培養し発酵ブロスを生成するステップと、（ｂ）得られたブロスにコンパクチンを供給するステップと、（ｃ）前記ブロスを一定期間発酵させ、コンパクチンをプラバスタチンに転換するステップと、（ｄ）前記ブロスからプラバスタチンを単離するステップとを含む。
【００２３】
微生物を培養する技術及びプラバスタチンを発酵ブロスから単離する技術は、当技術分野において周知である。当業者であれば、当技術分野において知られている発酵及び単離技術（例えばＨＬＰＣ）を組合せることにより、本発明のＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４を用いてプラバスタチンの生産方法を遂行することができる。具体的な実施例を後に説明する。
【００２４】
本発明の一態様において、ステップ（ａ）の発酵ブロスの培養は２日未満、好ましくは約１８時間である。ステップ（ａ）の発酵ブロスは、微生物を適切な条件下で約１８〜４８時間培養した種培養物（seed culture）から得たものが好ましい。種培養物を培養するための種培地（seed medium）は、グルコース、ペプトン、大豆タンパク質及びミネラル源を含むことができる。発酵培地はさらにコーンスティープパウダー（corn steep powder）（Ｃ．Ｓ．Ｐ．）を含むことができる。
【００２５】
前記ブロスに添加されるコンパクチンは、コンパクチンを生産することができる真菌や細菌又はそれらの細胞抽出物、あるいはコンパクチンを含む溶液により提供されるのが好ましい。発酵ブロスに供給されるコンパクチンの濃度は、微生物が存在しない発酵ブロスに基づいて、及び供給コンパクチンのみに基づいて計算される。本発明の好ましい態様において、コンパクチンは、その最終濃度が１．０ｇ／Ｌより高く、より好ましくは１．５〜２．０ｇ／Ｌの範囲になるようにブロスに供給される。
【００２６】
本発明の他の態様において、コンパクチンをプラバスタチンに転換するステップ（ｃ）の期間は５日未満、好ましくは３日未満、さらに好ましくは２４時間未満である。
【００２７】
本発明の好ましい一態様において、ステップ（ｄ）で単離されるプラバスタチンの収量は、０．５ｇ／Ｌより多く、好ましくは１．０ｇ／Ｌより多く、さらに好ましくは１．５ｇ／Ｌより多い。本発明の好ましい一態様において、ステップ（ｄ）で生産される総プラバスタチン量中のエピプラバスタチンの割合（ＥＰ％）は、約１．８〜８％である。本発明の好ましい一態様において、コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率（ＭＥ％）は、４０％より高く、好ましくは５０％より高く、より好ましくは７０％より高い。上記の方法で生産されたプラバスタチンは、ＨＰＬＣ等、当技術分野で慣用の技法のいずれかを用いて単離することができ、さらに抽出や結晶化を行ってもよい。
【００２８】
ＩＩＩ．クロマトグラフィーを用いずにプラバスタチンを単離する方法
本発明者らは、クロマトグラフィーを用いずに（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を良好な収率及び純度で単離しラクトン化反応を進行させるための改善された方法を開発した。
【００２９】
即ち、本発明の一目的は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の単離方法において、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む第一の溶液に硫酸アンモニウムを添加して沈澱物を生成するステップ（１）と、前記沈澱物を分離するステップ（２）と、分離された沈澱物を極性溶媒を用いて溶解して第二の溶液を得るステップ（３）と、第二の溶液のｐＨを約ｐＨ４〜約ｐＨ６に調整するステップ（４）と、水と相溶性のない溶媒を用いて第二の溶液から（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を抽出単離するステップ（５）とを含む該方法を提供することである。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤はプラバスタチン、コンパクチン及びロバスタチンから選択され、プラバスタチンがより好ましい。
【００３１】
本単離方法のステップ（１）に係る第一の溶液は、単離される（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む溶液であれば特に限定されない。本発明の好ましい態様において、本単離方法のステップ（１）における第一の溶液は、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を生産できる微生物から誘導することができる微生物発酵ブロスである。該微生物は、ストレプトマイセス・ロゼオクロルノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｒｎｏｇｅｎｕｓ）（米国特許第４，３４６，２７７号）、アクチノマデュラ・ｓｐ．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．）（Ｐｅｎｇ，Ｍ．ら、前掲及びＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、前掲）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ヒポマイセス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）、ホーマ（Ｐｈｏｍａ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、ドラトマイセス（Ｄｏｒａｔｍｙｃｅｓ）、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ギムノアクサス（Ｇｙｍｎｏａｘｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（欧州特許出願公開第０，８７７，０８９，Ａ１号）から選択され、より好ましくは、本発明のＹＳ−４４４４２、ＹＳ−４５４９４及び本明細書中に記載のそれらの突然変異体である。
【００３２】
ステップ（１）の硫酸アンモニウムは、第一の溶液の３０〜６０％（ｗ／ｖ）となる量で第一の溶液に添加されることが好ましい。より好ましくは、添加される硫酸アンモニウム量は第一の溶液における飽和量である。
【００３３】
本単離方法のステップ（１）において、沈澱物は濾過、遠心分離、又はデカント等の当技術分野において知られている方法、好ましくは薄膜濾過により単離できる。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、ステップ（４）に係る第二の溶液のｐＨは無機酸、好ましくは塩酸によって調整される。当業者であれば、第二の溶液のｐＨを調整するための適当な酸を慣用技術及び知識に応じて選択することができる。
【００３５】
本単離方法のステップ（５）において、水と混和しない溶媒を用いて第二の溶液を抽出に付す技術は、当技術分野においてよく知られている。当業者であれば、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を第二の溶液から首尾良く抽出するための水と混和しない適当な溶媒を選択し用いることができる。好ましくは、水と混和しない溶媒は、酢酸エチル、アセトン、トルエン、ジクロロメタン及び酢酸イソプロピルから選択される有機溶媒で、酢酸エチルがより好ましい。有機溶媒の添加量は第二の溶液に含まれる（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の濃度に依存する。抽出時間は５分を超えることが好ましく、５〜３０分の範囲が最も好ましい。
【００３６】
有機溶媒による抽出の後、有機溶媒層を回収し、次いで慣用の技法（例えば、無水硫酸マグネシウムと活性炭素）を用いて乾燥、脱色することにより、（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を単離する。
【００３７】
本発明の一態様においては、本単離方法は更に、単離（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を有機若しくは無機カチオン源、好ましくはナトリウム、と反応させ、阻害剤の塩を得るステップを更に含む。ナトリウム源は、ＮａＯＨ、Ｎａ2ＣＯ3、酢酸ナトリウム（無水）及び２−エチルへキサン酸ナトリウムから選択することが好ましい。カチオン源の添加量及び反応時間は（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の濃度に依存する。当業者であれば、カチオン源の種類及び量を適宜選択し、該阻害剤の塩を得ることができる。濃度０．２〜５．０Ｍでカチオン源を添加し０．５〜２．０時間撹拌することが好ましい。
【００３８】
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
実施例１
Ａ．土壌サンプルからのＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株の単離
放線菌単離のために用いる土壌サンプルを、様々な場所から採集した。土壌サンプルを室温に置き、一定の重量になるまで乾燥させた。空気乾燥した土壌サンプル１グラムを減菌した５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁させ、スーパーミキサで１分間攪拌した。放線菌の胞子を発芽させるため前記土壌サンプルの懸濁液を振とう培養器で３５℃〜５０℃で１０分間加熱した。十倍段階希釈した後、懸濁液を適切な単離培地を含む寒天プレートに散布した。前記寒天プレートに発生したコロニーを裸眼で数え、放線菌の形態学的特性を光学顕微鏡で調べた。未同定の３０００個のコロニーから正の形態学的特性を示す４００株を選んだ。コンパクチンからプラバスタチンへの高転換率（＞５０％）と低エピプラバスタチン含量（＜１０％）の点から、前記４００株からＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株を選んだ。ＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株の単離条件を表１に示す。
【００４０】
【表１】
Ｂ．ＹＳ−４４４４２株及びＹＳ−４５４９４株の特徴
ＹＳ−４４４４２株又はＹＳ−４５４９４株をイーストエキストラクト−モルトエキストラクト含有寒天培地（ＩＳＰ−２）［Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，Ｅ．Ｂ．とＧｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６（３）：３１３−３４０（１９６６）］のスラントの上に保ち、２７℃で培養した。生理学的試験に供するための接種材料およびＤＮＡ抽出のためのバイオマス調製物はトリプトン−イーストエキストラクトブロス（ＩＳＰ−１）［ＳｈｉｒｌｉｎｇとＧｏｔｔｌｉｅｂ、前掲］中で培養することによって調製した。
【００４２】
（１）形態と色素産生
形態学的特徴付けは、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）の記載に従って行った。培養物の形態は４５倍及び１００倍の超長作業距離対物レンズを備えたニコンオプティフォト(Nikon Optiphot)−２顕微鏡を用いた光学顕微鏡検査法で検査した。気中菌糸の色は、大気表面での成熟胞子成長を観察することによって決定した。基層菌糸及びメラニン以外の拡散性可溶性色素の色決定は裏側を観察することによって行った。基層菌糸の着色は次の色グループのいずれかに割り当てた：（１）黄色〜茶色；（２）黄色〜茶色＋赤（またはオレンジ）；（３）黄色〜茶色＋青（または紫）；（３）黄色〜茶色＋緑。色素及び色の決定はＴｅｋｔｒｏｎｉｘ ＲＧＢ 色サンプラー（Ｘｅｒｏｘ， Ｉｎｃ．）との比較に基づいて行った。形態学的特徴付けはイーストエキストラクト−モルトエキストラクト含有寒天培地（ＩＳＰ−２）、オートミール寒天培地（ＩＳＰ−３）、無機塩−スターチ寒天培地（ＩＳＰ−４）及びグリセロール−アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−５）[ＳｈｉｒｌｉｎｇとＧｏｔｔｌｉｅｂ、前掲］で行った。
【００４３】
ＹＳ−４４４４２の結果については、ＩＳＰ−２及びＩＳＰ−４で、５個〜１０個の胞子から成る短く波状の（開いた）フック型または（短い）らせん型の連鎖が観察された。前記胞子は滑らかな球状で菌糸の直径の約２〜３倍であった。偽胞子嚢はＩＳＰ−２及びＩＳＰ−４に存在し、ＩＳＰ−４の方により多く存在していた。気中でのマスの着色はＩＳＰ−２及びＩＳＰ−３で白（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ１００）であった。ＩＳＰ−４及びＩＳＰ−５では気中菌糸は発生しなかった（表２参照）。さらに、ＹＳ−４４４４２における基層菌糸の着色はＩＳＰ−２、ＩＳＰ−３及びＩＳＰ−４で茶色（Ｒ８５ Ｇ７０ Ｂ４０、カラー２）、ＩＳＰ−５で黄〜茶色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ７０、カラー１）だった（表２参照）。ＮａＯＨ（０．０５Ｎ）及び塩酸（０．０５Ｎ）を約１００μｌ加えた後のｐＨ変化に対応した色素の変化はなかった。さらに、ＹＳ−４４４４２は可溶性色素を産生しなかった（表２参照）。
【００４４】
ＹＳ−４５４９４の結果については、気中菌糸の気中でのマスの着色はＩＳＰ−２、３、４及び５では白（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ１００）であった。ＩＳＰ−２では気中菌糸はまっすぐ且つ長く枝分かれしていた。ＩＳＰ−３では気中菌糸が菌糸の栄養成長先端部の膨張部と合体している。経時変化に関しては、Ａ５株はＩＳＰ−５で球棹菌状成分に分解した。基層菌糸の着色はＩＳＰ−２で橙茶色（Ｒ１００ Ｇ８５ Ｂ４０、グループ２）、ＩＳＰ−３で赤〜茶色（Ｒ７０Ｇ５５ Ｂ４０、グループ２）、ＩＳＰ−４で薄黄〜茶色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ８５、カラーグループ１）、ＩＳＰ−５で薄黄〜茶色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ７０、グループ１）であった（表２参照）。ＮａＯＨ（０．０５Ｎ）及び塩酸（０．０５Ｎ）を約１００μｌ加えた後のｐＨ変化に対して色素に変化はなかった。さらに、ＩＳＰ−３及びＩＳＰ−５において可溶性の色素を観察した。着色はＩＳＰ−３で茶色（Ｒ７０ Ｇ５５ Ｂ４０）、ＩＳＰ−５で黄色（Ｒ１００ Ｇ１００ Ｂ８５）であった（表２参照）。これについてもＮａＯＨ（０．０５Ｎ）及び塩酸（０．０５Ｎ）を約１００μｌ加えた後のｐＨ変化に対して可溶性色素に変化はなかった。
【００４５】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４で観察された形態学的特徴を下の表２に示す。
【００４６】
【表２】
（２）生理学的試験
メラニン産生及び単独炭素源利用はＳｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）の記載に従って測定した。メラニン産生はペプトン−イーストエキストラクト鉄寒天培地（ＩＳＰ−６）及びチロシン寒天培地（ＩＳＰ−７）について評価した[Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）］。単独炭素源利用はＤ−グルコース（正の対照）、ｉ−アラビノース、スクロース、Ｄ−キシロース、ｉ−イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、ラムノース、ラフィノース及びセルロースを１％（ｗ／ｖ）の濃度にしたもので改変した塩基性無機塩寒天培地（ＩＳＰ−９）について評価した[Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）］。負の対照としては改変されていない塩基性無機塩寒天培地を用いた。結果はＳｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂの記載に従って評価した[Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（前掲）］。
【００４８】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４の成育一般の特徴を表３に示す。
【００４９】
【表３】
ＹＳ−４４４４２の炭水化物利用パターンに関して、強い正(positive)の利用がＬ−アラビノース、スクロース、Ｄ−フラクトース、ｄ−フラクトース及びラムノースで観察された。疑わしい利用はセルロースで観察され、負(negative)の利用はＩ−イノシトール及びラフィロースで観察された。前記培養ではメラノイド色素は産生されなかった。
【００５１】
ＹＳ−４５４９４の炭水化物利用パターンに関して、強い正の利用がＬ−アラビノース、スクロース及びＤ−フラクトースで観察された。正の利用はラムノース及びラフィノースで観察された。疑わしい利用はＤ−キシロース、Ｉ−イノシトール、Ｄ−マンニトール及びセルロースで観察された。前記培養ではメラノイド色素は産生されなかった。
【００５２】
ＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４の炭水化物利用パターンの結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
（３）１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出のためのバイオマスを、オービタルシェーカー（１インチ幅）上で２５０ｒｐｍにて連続振とう下、２７℃で、トリプトン−イーストエキストラクトブロス（ＩＳＰ−１）５０ｍｌ中で１０日間培養して調製した（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ ＆ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、前掲）。１５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、液状培養物を回収した。バイオマスを減菌した乳鉢と乳棒へ移し、ペースト状に丁寧に磨り潰した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス：１ｍＭエチレンジニトロ四酢酸）約０．４ｍｌを加え、緩衝液と細胞砕片を１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液１００μｌを用いて減菌した２ｍｌ遠心分離用試験管へ移した。６５℃で１５分間、水浴中で混合物を培養した。緩衝化フェノール（ｐＨ８）（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版（１９９５），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ．Ｉｖ．（複数頁に渡る））約０．５ｍｌを試験管に加え、１０分間混合した。混合物を１５分間、１４，４７４×ｇで遠心分離した。水層を減菌した２ｍｌ遠心分離用試験管に移し、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）０．５ｍｌを加えた。混合物を１５分間、１４，４７４×ｇで遠心分離し、水層を減菌した２ｍｌ遠心分離用試験管に移した。５Ｍ塩化ナトリウム水溶液約５０μｌと冷９５％エタノール１ｍｌを試験管に加え、混合物を２４時間、−２０℃に保持してＤＮＡを沈澱させた。混合物を４℃で３０分間、１４，４７４×ｇで遠心分離し、上清を除去した。８０％エタノール約１００μｌを試験管に加えた後、１０分間、１４，４７４×ｇで遠心分離した。エタノールを除去し、ペレットを３０分間乾燥させた後、減菌した脱イオン水（１８Ｍｏｈｍ）５０μｌ中に再懸濁させた。使用するまでＤＮＡを−２０℃で保存した。
【００５５】
１６ｓ ｒＤＮＡ配列決定
パーキン・エルマー社のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム２４００のＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標）ネイティブＴａｑポリメラーゼを用い、１６ｓｒＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を抽出したＤＮＡに対して行なった。増幅された１６ｓ ｒＤＮＡの精製は、バイオ・ラッド社のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ精製システムで行なった。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターサイクル配列決定用調製済み反応キットを用い、配列決定用の蛍光標識したＤＮＡを調製した。製造業者による手引きに従ってＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＰＯＰ−６（商標）パフォーマンスオプティマイズドポリマー６を用い、６１ｃｍ×５０μｍキャピラリーを備えたＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０ジェネティックアナライザーでＤＮＡ配列を解析した。１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅および配列決定では、プライマーＧＭＧ１とＧＭＧ１０を使用した（表５参照）。１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅プログラムは次の通りである：（１）９４℃、７分間；（２）９４℃、１分間；（３）５３℃、１分間；（４）７２℃、２分間；（５）７２℃、６分間；ステップ２〜５を３０回反復；（６）４℃で保持。
【００５６】
【表５】
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４の１６ｓ ｒＤＮＡ配列は配列番号１および２にそれぞれ示した配列を含む。ＡＲＢ配列エディター（リリース８．１）を用い、リボソームデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）〔Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：１７３−１７４（２０００）〕の多数配列アラインメントデータセットに対して配列を整列させた。ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４の１６ｓ ｒＤＮＡ配列とＲＤＰ（Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．ら、前掲）との比較によって、サッカロスリックスｓｐ．ＮＲＲＬ Ｂ−１６１３３［Ｌａｂｅｄａ，Ｄ．Ｐ．とＲ．Ｍ．Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０Ｐｔ １：３３１−６（２０００）］との配列相同性はそれぞれ９９．１％と９９．０％であることが示される。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ＲＤＰ／ｈｔｍｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。加えて、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４と関連する放線菌類（表６）とを比較する、ＡＲＢソフトウェアパッケージ（Ｔｒｅｅ０．１と示す）によって得られた１６ｓ ｒＤＮＡ系統樹を図１に示す。
【００５８】
【表６】
Ｃ．ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４と既知の微生物との比較
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４は両者共、サッカロスリックス・アエロコロニゲネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）およびサッカロスリックス・オーストラリエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）についてＢｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｃｒｏｓｓ，Ｔ．，前掲）に記述されている特徴、そしてサッカロスリックス・テキサセンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ｔｅｘａｓｅｎｓｉｓ）についてＬａｂｅｄａとＬｙｏｎｓ（Ｌａｂｅｄａ，Ｄ．Ｐ．とＬｙｏｎｓ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，３９（３）：３４４−３５８（１９６８９））によって記述されている特徴と同様の表現型の特徴を示す（表７）。ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４は、その形態と炭水化物利用パターンが公開された記述とは異なる（表８）。また、炭水化物利用パターンにおいて、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４はサッカロスリックス・アエロコロニゲネス、サッカロスリックス・オーストラリエンシスおよびサッカロスリックス・テキサセンシスとも異なる（表８）。
【００６０】
【表７】
【表８】
系統発生学的および生理学的分析の総合結果に基づき、ＹＳ−４４４４２株およびＹＳ−４５４９４株は互いに異なり、またサッカロスリックス・アエロコロニゲネス、サッカロスリックス・オーストラリエンシス及びサッカロスリックス・テキサセンシスの各規準株とも異なり、サッカロスリックス属の新規な種であると考えられる。これら２つの株は中国基準株保存機関（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、２００２年１月８日にそれぞれ受託番号Ｍ２０２００１とＭ２０２００２が与えられている。
【００６３】
実施例２
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるプラバスタチンの生産
（１）発酵ブロスに添加するコンパクチン溶液の調製
０．３Ｍ水酸化ナトリウム溶液（５００ｍｌ）を温め、５０〜６０℃に保持した。水酸化ナトリウム溶液にコンパクチン４０ｇを加え、５０〜６０℃で２〜３時間撹拌した。水酸化ナトリウム中のコンパクチン溶液を室温に冷却し、１Ｎ塩酸でｐＨを７．５に調整した。水酸化ナトリウム中のコンパクチン溶液の容量を１０００ｍｌに調整し、２０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を濾過して減菌した。
【００６４】
（２）ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４を用いたプラバスタチンの生産ＹＳ−４４４４２（あるいはＹＳ−４５４９４）の胞子菌懸濁液１ｍｌを−８０℃でＧＬ（１０％グリセロール、５％ラクトース）中に保存し、層をなす花状に開け(opened in laminar flower)、種培地（１リッター当たりグルコース１０ｇ、ペプトン２ｇ、大豆タンパク質４ｇおよびＫＨ2ＰＯ4１ｇを含む、ｐＨ７．０±０．２）２０ｍｌを含む３００ｍｌ振とうフラスコに加えた。種培養物をロータリーシェーカー内で２００〜２２０ｒｐｍにて２４〜４８時間、２７℃で培養した（生育相）。その後、種培養物１．５〜２ｍｌを発酵培地（１リッター当たりグルコース１５ｇ、ペプトン５ｇ、コーンスティープパウダー（Ｃ．Ｓ．Ｐ．）５ｇ、大豆ミール４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇを含む、ｐＨ７．０±０．２）２０ｍｌを含む３００ｍｌ振とうフラスコ内で培養した。振とうフラスコをロータリーシェーカー内で２００ｒｐｍにて１８〜２４時間、２７±０．５℃で培養した（生育相）。発酵ブロス中での最終濃度が１５００〜２０００ｍｇ／Ｌとなるよう上述のように調製したコンパクチンを発酵ブロスに加え、１６〜２４時間培養を継続した。
【００６５】
（３）プラバスタチンおよびコンパクチンのＨＰＬＣ分析
上記で得られた発酵ブロス（０．２ｍｌ）を脱イオン水（１．８ｍｌ）に加えた。混合液を１分間混合し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清をＨＰＬＣを用いて次の条件で分析した。
時間（分） 流量 ％Ａ ％Ｂ
０ １．０ １００ ０
１．０ １．０ １００ ０
１．１ １．０ ３０ ７０
３．５ １．０ ３０ ７０
３．６ １．０ １００ ０
３０ １．０ １００ ０
３１ ０．０ １００ ０
【００６６】
（４）計算と結果
アルカリ性メタノール（１００％メタノールと０．１Ｎ水酸化ナトリウム）に溶解し、水で希釈した標準プラバスタチンまたはコンパクチン調製物を調製した。プラバスタチン収量、モル転換効率（ＭＥ％）およびエピプラバスタチンの割合（Ｅｐｉ％）は、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で計算される。
【００６７】
ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるコンパクチンからプラバスタチンへの転換効率、プラバスタチン収量およびエピプラバスタチンの割合を表９に示す。
【００６８】
【表９】
実施例３
コンパクチンを連続供給するＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるプラバスタチン生産
発酵ブロスに添加するコンパクチン溶液を実施例１の記載に従って調製した。−８０℃でＧＬ（１０％グリセロール、５％ラクトース）中に保存したＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４の胞子懸濁液（９ｍｌ）を、層をなす花状に開け（opened in laminar flower）、実施例１に記載の種培地（６００ｍｌ）を入れた３Ｌ振盪フラスコに加えた。ロータリーシェイカー（２００〜２２０ｒｐｍ）を用いて２４〜４８時間、２７℃で種培養物を培養した（生育相）。その後、消泡剤（ＬＧ−１０９、０．１ｍｌ／Ｌ）を添加した実施例１に記載の発酵培地（１６Ｌ）を３０Ｌ発酵器に入れ、種培養物（１．６Ｌ）を加え培養した。発酵を、ブロスの体積あたり０、９体積／分の空気を供給しながら、２７℃で、撹拌下（１００〜１５０ｒｐｍ）、２４〜４８時間行った。その後、発酵ブロスにコンパクチン（５０〜６０ｇ／Ｌ）を１０〜３０ｍｌ／ｈｒで供給した。２〜３日間供給を続けた後、発酵を停止した。得られた発酵ブロスを実施例１と同様にＨＰＬＣを用いて分析し、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４によるコンパクチンからプラバスタチンへの転換効率、プラバスタチン収量およびエピプラバスタチンの割合を実施例１と同様に計算した。結果を表１０に示す。
【００７０】
【表１０】
既知の微生物（例えば、Ｐｅｎｇ Ｍ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（前掲）およびＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ（前掲）に記載のアクチノマデュラｓｐ．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．））が、濃度０．５〜１．１ｇ／Ｌのコンパクチン供給濃度で収量０．３２６〜０．８２１ｇ／Ｌのプラバスタチンを生成するために（コンパクチン供給後）５〜７日の転換期間が必要なことに比べ、本発明のＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４は、濃度１．５〜２．０ｇ／Ｌのコンパクチン供給濃度で収量１．０〜１．５ｇ／Ｌのプラバスタチンを（コンパクチン供給後）２４時間以内で生成することができる。また、ＹＳ−４４４４２およびＹＳ−４５４９４の発酵ブロスを（種培養物の接種から）ほんの１８時間培養した後、すぐにコンパクチンを該発酵ブロスに添加することができる。従来技術においては、アクチノマデュラｓｐ．（Ｐｅｎｇ Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（前掲）およびＰｅｎｇ Ｙ．とＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ（前掲））の発酵ブロスを（種培養物の接種から）２日以上培養しなければ、コンパクチンを添加できなかった。さらに、ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４が生産するプラバスタチンは、所望の治療効果を示さないばかりか臨床治療において望ましくない効果を示すエピプラバスタチン（即ち、コンパクチンの６α−ヒドロキシル化体）の割合が低い。本発明の二種の新規微生物は、コンパクチンに対する耐性が高く、コンパクチンからプラバスタチンへの転換効率が高い。
【００７２】
実施例４
ＮＴＧ突然変異誘発方法
ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４の胞子懸濁液をＩＳＰ２培地（１０ｍｌ）に添加し、振盪下１〜２時間培養した。遠心分離後、胞子ペレットを０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、ＮａＣｌ溶液（０．９％、３ｍｌ）に懸濁させた。得られた胞子懸濁液に、０．２ＭＮａＯＨ溶液（２．５ｍｌ）および１０００ｐｐｍＮＴＧ（１ｍｌ）を加え、よく混合した。次いで、２７±１℃で１０、２０、３０、６０および１２０分間培養した。培養後、１２％チオ硫酸ナトリウムを胞子懸濁液に添加し、遠心分離させた後、上層を除去して、ＮＴＧを除去した。ＩＳＰ２培地（１０ｍｌ）を胞子懸濁液に添加し、振盪下１〜２時間培養した。遠心分離後、胞子ペレットを０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、ＮａＣｌ溶液（０．９％、３ｍｌ）に懸濁させた。１０倍段階希釈の後、希釈胞子懸濁液（０．１ｍｌ）をＩＳＰ２寒天プレート上に散布した。２７±１℃で６〜９日間培養した後、寒天プレート上に現われたコロニーの形態を観察し、それらを計数した。次式で求められる殺傷率(killing rate)が５０〜９９．５％であることが好ましい。
【００７３】
殺傷率＝（ＮＴＧ処理されない細胞の数−ＮＴＧ処理した細胞の数）／（ＮＴＧ処理されない細胞の数）×１００％
【００７４】
例えば、１０4倍希釈した胞子懸濁液を散布しＮＴＧ処理した寒天プレートにコロニーが２８個（細胞数：２．８×１０6個）現われ、１０6倍希釈した胞子懸濁液を散布しＮＴＧ処理しなかった寒天プレートにコロニーが３６個（細胞数：３．６×１０8個）出現した場合、殺傷率は約９９．２２％［１００％×（３６０，０００，０００−２，８００，０００）／３６０，０００，０００］となる。別の突然変異誘発物質を用いた他の突然変異誘発方法も上記の方法で行うことができる。
【００７５】
紫外線照射による突然変異誘発方法
ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４の胞子懸濁液を１０倍段階希釈に付した。希釈胞子懸濁液（０．１ｍｌ）をＩＳＰ２寒天プレート上に散布した。寒天プレートを開け、３０、６０、１２０、２４０および４８０秒間、紫外線処理した。紫外線照射後、それ以上の光照射を避けるために、寒天プレートをカバーし直ちに暗所に移した。２７±１℃で６〜９日間培養した後、寒天プレート上に現われたコロニーの形態を観察し、それらを計数した。上記の式で求められる殺傷率が９９〜９９．９９９％であることが好ましい。
【００７６】
実施例５
ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４由来の突然変異体の生物活性アッセイ
突然変異誘発後、形態学的変異体（morphological variant）を選択し、６〜１０個のガラスビーズおよび脱イオン水（０．５ｍｌ）と共にスクリューチューブ（screw tube）に入れ、よく混合した。懸濁液（０．１〜０．１５ｍｌ）をＩＳＰ２スラント寒天中でリフレッシュ（refreshed）し、液体培地中で発酵させた。発酵中、コンパクチンを最終濃度が１．５ｇ／Ｌまたは２．１ｇ／Ｌとなるように添加し、２７℃で２４〜４８時間、生変換（bioconversion）を進行させた。発酵ブロス（０．２ｍｌ）を脱イオン水（１．８ｍｌ）と混合した。遠心分離後、上記のようにＨＰＬＣによって、上清を分析した。ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４由来の突然変異体を、それら突然変異体のプラバスタチン生産性、転換効率、エピプラバスタチンの割合を調べるために選択した（表１１参照）。
【００７７】
【表１１】
実施例６
硫酸アニモニウム沈澱によるプラバスタチンの精製方法
親株ＹＳ−４４４４２またはＹＳ−４５４９４に由来する突然変異体株のプラバスタチン含有発酵ブロス（１４Ｌ、ｐＨ７．５〜８．５）に硫酸アンモニウム（４．５〜７．０ｋｇ）を２〜６時間かけてバッチ添加した。次いで、５〜１５時間、室温で撹拌し、沈澱を得た。得られた沈澱物を濾過により分離した。分離した沈澱物を水（１００〜２００ｍｌ）に溶解し、０．５時間撹拌して、溶液を調製した。溶液をセライト床を通して濾過し、セライト床を水（１００ｍｌ）で一回洗浄した。濾液を回収し、１８％(ｗ／ｖ)塩酸を用いて濾液のｐＨを４．０〜６．０に調整した。前記濾液を１．０〜３．０体積の酢酸エチルと混合し、室温で１０〜３０分間撹拌した。得られた乳液をセライト床で濾過した。相を分離した後、水相を回収し、１．０〜３．０体積の酢酸エチルを用いて再度抽出に付した。このような２度の抽出により得られた酢酸エチル相を合一した。合一酢酸エチル相に無水マグネシウム（０．１〜１．５％ｗ／ｖ）と活性炭素（０．１〜１．５％ｗ／ｖ）を添加し、室温で１〜１５分間撹拌し、濾過し、未使用の酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄して脱水・脱色した。プラバスタチンを収率９４．４９５％（ＨＰＬＣ）で得た。
【００７９】
プラバスタチンナトリウムを以下のようにして得た。上記のように精製したプラバスタチンを未使用の酢酸エチルに溶解し、プラバスタチン濃度５．０〜２５．０ｇ／Ｌの溶液を調製した。上記の溶液に２−エチルヘキサン酸ナトリウム（０．２〜５．０Ｍ）のメタノール／エタノール溶液またはイソプロピルアルコール溶液を添加し、室温で０．５〜２．０時間撹拌した。得られた溶液を０〜２０℃まで冷却し、濾過し、未使用の酢酸エチルで洗浄した。純度９８．５％（ＨＰＬＣ）、各不純物量０．３％未満、合計不純物量１．０％未満のプラバスタチンを収率６０〜８０％で得た。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＹＳ−４４４４２及びＹＳ−４５４９４をＡＲＢソフトウエアパッケージ（バージョン：Ｔｒｅｅ０．１）で発生させた関連放線菌類と比較する１６ｓ ｒＤＮＡの系統樹である。
Claims (12)
- サッカロスリックスの微生物株ＹＳ−４４４４２又は良好な収量でプラバスタチンを生産し得るその突然変異体。
- サッカロスリックスの微生物株ＹＳ−４５４９４又は良好な収量でプラバスタチンを生産し得るその突然変異体。
- 請求項１又は２記載の微生物を用いてプラバスタチンを生産する方法。
- 請求項１又は２記載の微生物を適切な条件で培養して発酵ブロスを生成するステップ（ａ）と、コンパクチンを前記ブロスに供給するステップ（ｂ）と、このブロスを一定時間発酵させてコンパクチンをプラバスタチンに転換するステップ（ｃ）と、プラバスタチンを前記ブロスから単離するステップ（ｄ）とを含む、請求項３に記載の方法。
- ステップ（ａ）の発酵ブロスが２日未満培養されるものである、請求項４に記載の方法。
- ステップ（ａ）の発酵ブロスが約１８時間培養されるものである、請求項５に記載の方法。
- ステップ（ａ）の発酵ブロスが、前記ブロスへの接種前、適切な条件下で約１８時間〜約４８時間培養された前記微生物の種培養物(seed culture)に由来するものである、請求項４に記載の方法。
- ステップ（ｂ）のコンパクチンが、１．０ｇ／Ｌより高い最終濃度で前記ブロスに添加される、請求項４に記載の方法。
- 前記最終濃度が、約１．５〜約２．０ｇ／Ｌである、請求項８に記載の方法。
- ステップ（ｃ）における、コンパクチンからプラバスタチンへの転換時間が５日未満である、請求項４に記載の方法。
- 前記時間が３日未満である、請求項１０に記載の方法。
- 前記時間が２４時間未満である、請求項１１に記載の方法。
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