ITMI962063A1 - Processo di biotrasformazione di composti colchicinoidi nei corrispondenti 3-glicosilderivati - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "PROCESSO DI BIOTRASFORMAZIONE DI COMPOSTI COLCHICINOIDI NEI CORRI SPONDENT I 3-GLICOSI LDERI VATI "
La presente invenzione riguarda la biotrasformazione, operata mediante ceppi microbici selezionati, di composti colchicinoidi, nei rispettivi 3-O-glicosilderivati. Il processo oggetto della presente invenzione consente l'ottenimento di prodotti colchicinoidi glicosidati esclusivamente in C-3 dell'anello aromatico A, a partire da colchicina, tiocolchicina o loro derivati, con rese e purezza elevate.
I composti colchicinoidi glicosidati in C-3 dell'anello benzenico sono di notevole importanza farmacologica per la loro alta efficacia, o come intermedi per la produzione di nuovi farmaci.
In particolare il tiocolchicoside (3-O-glucosiltiocolchicina) è un principio attivo di notevole importanza applicativa nel campo farmaceutico, soprattutto nella terapia di patologie del sistema muscolo-scheletrico, e come base per la preparazione di nuovi farmaci antitumorali, immunosoppressori, antipsoriatici ed antiinfiammatori.
Diversi tentativi di sintesi di composti 3-glicosilcolchicinoidi sono stati effettuati in passato, sia mediante reazioni chimiche, sia mediante biotrasformazione.
La via chimica si basa su sequenze di reazioni complicate e non specifiche che si risolvono in una miscela di derivati glicosidati, alcuni dei quali inattivi. Le rese di conversione in prodotto attivo, glicosidato in modo specifico in C-3 dell'anello aromatico, risultano di conseguenza assai basse.
L’approccio biologico riguarda essenzialmente la biotrasformazione di tiocolchicina, mediante colture di Centella Asiaticaf in derivati monoglicosidati in C-2 ed in C-3 dell'anello aromatico; trasformazione, quindi, non altamente selettiva, e caratterizzata da rese e produttività limitate (Solet, J.M., et Al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).
Altri tentativi di biotrasformare composti colchicinoidi si sono risolti in semplici demetilazioni dei metossili legati all’anello aromatico (in C-2 ed in C-3), in ogni caso sempre caratterizzate da rese e produttività limitate, e da scarsa regioselettività.
Così Hufford C.D. et al. (J. Pharm. Se., 68, 10, 1239-1242, 1979), utilizzando Streptomvces oriseus e/o Streotornvces spectabilis. e Bellet P. et al., (GB-923421, 1959), impiegando altri ceppi di gtreptomyces e di altre specie di Batteri e di Funghi, tentarono di trasformare colchicina e derivati nei corrispondenti derivati 3-demetilati . I risultati di questi metodi noti confermano quanto precedentemente sottolineato sulla non selettività degli enzimi microbici coinvolti, ad esempio a livello di C-2, C-3 o C-10 della molecola dell'alcaloide. Inoltre i livelli di produttività di tali sistemi catalitici sono assai limitati, sia per le basse rese di conversione, sia per le ridotte concentrazioni di substrato utilizzabili, sia per la frequente degradazione dell'anello tropoionico.
Più recentemente Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) hanno ottenuto la biotrasforinazione specifica di microorganismi batterici, con rese e produttività comunque ancora assai limitate.
Attività enzimatiche da microorganismi simili ai precedenti (Streptomyces , Bacillus, etc.) sono state applicate alla biotrasformazione di altri composti, come i maitansinoidi (US pat.
4 361 650: Izawa, M., et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). Anche in questo caso la reazione catalizzata consiste esclusivamente in una demetilazione, caratterizzata da rese di conversione e da produttività limitate.
E' stata descritta l'attività glicosiltransferasica di α-amilasi di Bacillus meoaterium (Bruirai, P.J., et al., Starch, 43, 8, 319-323, 1991); la specificità di accettore della reazione transferasica (esclusivamente glucosio o glucosidi) è risultata particolarmente elevata. Ciclodestrina-glucosiltransferasi, prodotte dalla stessa fonte microbica, catalizzano una α-l,4-transglucosilazione di rubusoside (β—D— glucosil estere del 13-0-β-D-glucosil-steviolo), a partire da amido. Anche in questa bioconversione 1'accettore della reazione transferasica è rappresentato dalla frazione glicidica del substrato (Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). In precedenza ciclodestrina-glicosiltransferasi erano state utilizzate per la produzione di ciclodestrine G6, G7 e G8 da amido (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. (Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).
Da questi esempi si evidenzia una elevata specificità di substrato delle attività glicosiltransferasiche espresse da Bacillus megaterium. con coinvolgimento esclusivo di accettori di natura glicidica, tale da non lasciare prevedere possibili reazioni su metaboliti secondari, dalla struttura molecolare alquanto diversa e complessa, come i colchicinoidi. In effetti non sono noti esempi di applicazione di tali microorganismi per la conversione enzimatica di colchicinoidi a 3-glicosilderivati.
Si è ora trovato che ceppi di Bacillus meaaterium capaci di crescere su concentrazioni elevate di colchicina e tiocolchicina, sono dotati di una elevatissima ed assai specifica attività di biotrasformazione di substrati colchicinoidi, in derivati glicosidati esclusivamente in C-3 dell'anello aromatico. Tale trasformazione avviene in tempi estremamente ridotti, ed è caratterizzata da rese sorprendentemente alte.
L'invenzione riguarda pertanto un processo per la preparazione di composti 3-0-glicosilcolchicinoidi di formula (I)
in cui 3⁄4 è un residuo O-glicosidico, è idrogeno o acile r3 è C1-C6 alcossi o C1-C6 tioalchile, che comprende la biotrasformazione di composti in cui R1 è OH o metossi ad opera di Bacillus meaaterium.
Il Bacillus meaaterium è un batterio Gram-positivo, formante spore, con diametro cellulare maggiore di 1.0 pm; capace di crescita aerobica su svariati terreni di coltura; catalasi-positivo; capace di determinare idrolisi della gelatina.
Ceppi di Bacillus megaterium utilizzabili secondo l'invenzione sono risultati capaci di crescere in modo soddisfacente e di mantenersi vitali anche a concentrazioni elevate di colchicina e/o di tiocolchicina (oltre 3 g/1), come è stato dimostrato dall'esame della crescita e dall'analisi microscopica.
Specie congeneriche, come Bacillus cereus. già a concentrazioni di substrato di 1,5 g/1 manifestano evidenti difficoltà di crescita (assorbanze pari al 15-25% del controllo), che diventano ancora più marcate a concentrazioni di 3 g/1, a cui si manifestano drammatici fenomeni di autolisi. Colture selezionate di Bacillus megaterium. al contrario, alle concentrazioni summenzionate possono raggiungere livelli di crescita molto più elevati (da doppi a tripli) rispetto a Bacillus cereus.
L'alta selettività ed efficienza della biotrasformazione è sorprendente ed insolita, in considerazione del fatto che i livelli di resa sono compresi tra l'80% ed il 100%, normalmente intorno al 90-95%.
Inoltre i microorganismi utilizzati nella bioconversione sono in grado di conservare stabilmente l'attività catalitica, anche per step fermentativi ripetuti, e quindi di produrre la bioconversione specifica in processi in semicontinuo ed in continuo. Pertanto questo metodo garantisce elevati livelli di produttività e di riproducibilità.
La spiccata regioselettività della reazione assicura, oltre alle notevoli rese produttive, la elevata qualità e purezza del prodotto ottenuto, consentendo l'ottenimento dello stesso al 100% di purezza, con un limitato impegno di downstream processing.
Ulteriori, importanti vantaggi sono rappresentati dalla ridotta incidenza della fase di separazione ed isolamento del prodotto, dall'economicità del processo e dalla affidabilità e sicurezza d 'impiego.
Le sequenze operative per la selezione dei ceppi batterici utilizzabili nel processo dell'invenzione comprendono:
A) Selezione, a partire da fonti naturali o da ceppi da collezione, di colture di Bacillus megaterium capaci di crescere su elevate concentrazioni di substrato colchicinico.
B) Selezione degli isolati da A), per la verifica dell'attività di trasformazione delle colchicine nei corrispondenti 3-0-glicosilderivati, mediante saggi di bioconversione sui substrati specifici, somministrati in concentrazioni progressivamente crescenti.
C) Caratterizzazione microbiologica dei ceppi selezionati in B).
D) Graduale incremento di resa della biotrasformazione, mediante selezione mirata della popolazione batterica da B).
E) Studio ed ottimizzazione dei parametri fermentativi critici, ai fini della ottimizzazione della biotrasformazione.
F) Studio ed ottimizzazione dei metodi di conservazione delle colture alto-produttive, ai fini di garantire inoculi stabili ed omogenei, per applicazioni produttive su scala industriale.
G) Scale-up del processo in fermentatore, in processi a batch, fedbatch ed in continuo.
H) Elaborazione ed ottimizzazione dei metodi di finissaggio e di isolamento del prodotto.
In particolare, i microorganismi utilizzabili nella presente invenzione possono essere selezionati a partire da colture di collezione, ottenute da banche di ceppi, o da campioni di terreno di varia origine, mediante isolamento selettivo su diversi substrati di coltura agarizzati, contenenti una fonte di azoto organico (peptoni, estratti di lievito, estratti di carne, asparagina, ecc.), una fonte di carbonio (glicerina, amido, maltosio, glucosio, ecc.), con pH da 5 a 8, preferibilmente 6 - 7. La temperatura di incubazione è compresa tra 20° e 45 °C, preferibilmente 28° - 40°C.
La capacità delle colture di crescere in presenza di concentrazioni tossiche del substrato colchicinico da trasformare viene valutata mediante tecniche di diluizione scalare e di piastratura in parallelo, su diversi substrati agarizzati, una parte dei quali è stata preventivamente addizionata di colchicina o tiocolchicina, in concentrazioni tra 0.1 e 3 g/1 (tali da inibire la crescita di gran parte dei microorganismi).
Le colonie capaci di crescere nelle condizioni descritte sono prelevate sterilmente e trasferite su diversi terreni agarizzati, per verificarne la purezza e l'omogeneità di crescita.
I terreni di coltura utilizzati per la conservazione delle colture sono tipici substrati microbiologici, contenenti fonti di azoto organico (peptoni, estratti di lievito, triptone, estratti di carne, ecc.), una fonte di carbonio (glucosio, maltosio, glicerina, ecc.), con pH da 5 a 8, preferibilmente 6 - 7. La temperatura di incubazione è compresa tra 20° e 45°C, preferibilmente 28° - 40°C.
I microorganismi selezionati sono quindi sperimentati per la capacità di crescere in coltura sommersa, in presenza di composti colchicinoidi , e di trasformare questi ultimi nei corrispondenti 3-glicosilderivati .
Tali saggi sono stati realizzati in beute da 100 mi., contenenti 20 mi di terreno liquido, con diverse formulazioni di terreno, comprendenti una o più fonti di azoto organico (estratti di lievito, peptoni, triptone, idrolisati di caseina, estratti di carne, corn-step liquor, ecc.), una o più fonti di carbonio (glucosio, glicerolo, amido, saccarosio, ecc.), fonti inorganiche di fosforo e azoto, e sali inorganici di vari ioni (K<+>, Na<+>, Mg<++>, Ca<++>, Fe<++ >, Mn<++>, ecc.).
I campioni di coltura possono essere eventualmente sottoposti a trattamenti mutageni, mediante le tecniche di metagenesi convenzionali (irradiazione con raggi UV, ecc.) per l'induzione di mutanti la cui attività di bioconversione specifica può essere valutata con la stessa procedura di cui sopra.
Campioni colturali, provenienti da ciascun saggio di bioconversione, sono stati analizzati per valutare la produzione di 3-glicosilderivati, mediante cromatografia in TLC ed in HPLC.
La capacità di trasformare substrati colchicinoidi nei rispettivi 3-glicosilderivati , da parte dei microorganismi selezionati, è stata confermata mediante prove di bioconversione in beuta, in scala 300 mi, nei medesimi brodi di coltura utilizzati nella fase di selezione.
I microorganismi che hanno fornito risposta positiva sono stati utilizzati per prove di ottimizzazione della bioconversione, in diversi brodi di coltura, in scala 300 ml . I principali parametri colturali e fermentativi studiati sono: fonti di azoto organico, fonti di carbonio, sali minerali, temperatura, agitazione-aerazione, pH, tempo di incubazione, rapporto di inoculo, stadi di subcultura, tempo di aggiunta del substrato da trasformare.
I microorganismi batterici selezionati, capaci di operare la biotrasformazione oggetto della presente invenzione, possono crescere su substrati di coltura solidi e liquidi, contenenti una o più fonti di azoto organico, preferibilmente estratto di lievito, estratto di carne, peptone, triptone, idrolisati di caseina, com steep liquor, ecc.. Fonti di carbonio utili per la crescita e la biotrasformazione sono rappresentate da glucosio, fruttosio, saccarosio, glicerolo, estratti di malto, ecc., preferibilmente glucosio, fruttosio e glicerina. Il terreno di coltura contiene inoltre fonti inorganiche di fosforo e sali di K<+>, Na<+>, Mg<++>, NH4<+>, ecc..
I microorganismi selezionati possono crescere a temperature comprese tra 20" e 45"C, preferibilmente tra 28° e 40°C, a pH tra 5 e 8, preferibilmente 6 - 7. Nelle medesime condizioni i microorganismi considerati sono in grado di convertire i composti colchicinoidi nei corrispondenti 3-glicosilderivati . Tali trasformazioni avvengono in coltura sommersa, in beute incubate su shaker rotativo, con velocità di agitazione comprese tra 150 e 250 rpm.
A causa della particolare cinetica della biotrasformazione in oggetto, che è correlata alla crescita microbica, le condizioni ottimali ai fini della biotrasformazione sono le stesse condizioni rivelatesi ottimali per la crescita. Pertanto i terreni di coltura utili a favorire una buona crescita microbica, come quelli basati sui componenti organici ed inorganici precedentemente citati, sono altrettanto utili per una buona attività di biotrasformazione del substrato considerato. Questo ultimo è addizionato alla coltura nelle fasi fermentative iniziali.
La biotrasformazione oggetto dell1invenzione è basata su di una conversione enzimatica, che inizia durante la fase esponenziale di crescita e prosegue con un andamento parallelo a quello della crescita; i livelli massimi di conversione a 3-glicosilderivato (molto elevati: fino al 95-100%) sono raggiunti entro le prime 24-30 ore. La regioselettività della biotrasformazione è assoluta: non è mai stata evidenziata la presenza di 2-glicosilderivati. I prodotti ottenuti sono esclusivamente extracellulari.
La biotrasformazione oggetto dell'invenzione può essere scalata a livello di fermentatore, mantenendo inalterate le condizioni colturali descritte, in particolare per quanto riguarda terreno di coltura, temperatura e tempi di processo. Ai fini di ottenere buone crescite sono importanti adeguati livelli di agitazione-aerazione, in particolare si richiedono livelli di aerazione di 1 - 2 litri di aria, per litro di coltura, per minuto (w m), preferibilmente di 1,5-2 w m.
I prodotti ottenuti dalla bioconversione sono estratti dalle brodocolture dopo separazione della biomassa dalla frazione liquida, mediante centrifugazione e recupero del sum atante, o microfiltrazione e recupero del permeato. E' possibile trattare le colture con alcooli, ai fini di un recupero ottimale del prodotto.
La purificazione e l'isolamento dei prodotti di biotrasformazione può essére realizzata applicando tecniche cromatografiche di separazione su resine di adsorbimento ed eluizione con alcool!, preferibilmente con metanolo. Le soluzioni idrometanoliche, contenenti il prodotto, possono essere ulteriormente purificate mediante estrazione con solventi organici lipofili, preferibilmente con cloruro di metilene. Dopo ulteriori trattamenti con miscele di alcooli e solventi organici, il prodotto può essere ottenuto allo stato puro dalle soluzioni alcooliche risultanti mediante cristallizzazione.
Il processo di biotrasformazione è specifico per substrati contenenti un gruppo tropoionico e può essere applicato a numerosi composti colchicinoidi, quali colchicina, tiocolchicina, 3-demetilcolchicina, 3-demetiltiocolchicina, N-desacetiltiocolchicina ed altre colchicine variamente sostituite.
Altri composti naturali privi dell'anello tropoionico non sono glicosidati da Bacillus meaaterium.
E' possibile sostituire il glucosio con altri zuccheri, come fruttosio o galattosio, senza per questo determinare la perdita dell'attività glicosiltransferasica.
Gli esempi seguenti descrivono l'invenzione in maggior dettaglio. ESEMPIO 1
Aliquote di colture di Bacillus meaaterium . isolate da terreno agrario, sono risospese in 20 mi di soluzione fisiologica sterile, e sottoposte a diluizione scalare, fino ad un fattore di diluizione di 1:10.000.000. Le sospensioni alle varie diluizioni sono piastrate su terreno di coltura LB-Agar tal quale, ed LB-Agar addizionato rispettivamente di colchicina o tiocolchicina, ad una concentrazione finale di 2 g/1 (v. Tabella). Le colture sono incubate a 28°C, per 3 giorni, al buio. Le colonie cresciute sul terreno selettivo, addizionato del colchicincide , sono isolate e purificate, mediante striscio su terreno non selettivo; tali campioni vengono incubati come sopra, ma per un tempo più breve (24 ore). Successivamente le colture sono trasferite sullo stesso terreno agarizzato, in provetta, ed incubate come sopra, per 24 ore.
Aliquote di colture, selezionate come descritto, sono utilizzate per inoculare beute da Erlenmeyer da 100 mi., contenenti 20 mi di terreno di coltura ST (Tabella), addizionato di colchicina o tiocolchicina, ad una concentrazione finale di 0.4 mg/ml. Tali colture sono incubate overnight a 28°C, su shaker rotativo, a 200 rpm.
La trasformazione del substrato colchicinico è verificata mediante analisi di aliquote di brodocoltura, prelevate ogni 3 - 4 ore, in TLC, su gel disilice, con il sistema eluente: acetone : acetato di etile : acqua, 5 :4 :1.
Dopo 4 giorni di incubazioni aliquote delle colture, che hanno rivelato una evidente attività catalitica in direzione del 3-glicosilderivato, sono sottoposte a isolamento su piastra, mediante diluizione scalare, come descritto precedentemente, fino alla preparazione di nuovi inoculi in provetta. La prova di biotrasformazione in beuta è ripetuta nelle stesse condizioni di cui sopra, ma utilizzando concentrazioni finali di colchicina e tiocolchicina decisamente più elevate (1 mg/ml). Le singole colture più attive (conversione del substrato pari o superiore all'80%) sono utilizzate per la preparazione di inoculi in criotubi congelati, come descritto nell'esempio 3.
Tabella
ESEMPIO 2
Quanto descritto nell'Esempio 1 è ripetuto, partendo da colture di Bacillus_ meaaterium. originate dai seguenti ceppi da collezione (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germania): DSM 90, 509, 322, 333, 1667, 1670, 1671.
Dopo 4 giorni di incubazione in coltura liquida delle colture, selezionate come nell'Esempio 1 ed addizionate di tiocolchicina (1 mg/ml), l'analisi in TLC rivela l'avvenuta trasformazione del substrato in tiocolchicoside, con rese di conversione differenti, dal 50% (ceppo DSM 1671) al 70% (ceppo DSM 90), all'80% e oltre (ceppi DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670).
ESEMPIO 3
Aliquote di campioni colturali in provetta, selezionati come descritto nell'esempio precedente, sono utilizzate per inoculare beute di Erlenmeyer da 100 mi, contenenti 20 mi di brodo ST.
Le brodocolture sono incubate a 30°C, su shaker rotativo, a 200 rpm, ovem ight. Dopo incubazione le colture sono addizionate di una soluzione sterile di glicerolo, ad una concentrazione finale del 20%. Le colture sono poi ripartite in criotubi da 2 mi ed immediatamente immerse in azoto liquido.
Dopo alcuni giorni il 10% delle colture viene scongelato rapidamente a 37°C. Aliquote di ogni criotubo sono utilizzate per inoculare beute di Erlenmeyer da 100 mi, contenenti 20 mi di terreno ST, che vengono successivamente incubate a 28°C, overnight (precoltura), a 200 rpm. Dopo incubazione 2 mi di ogni precoltura sono trasferiti sterilmente in 20 mi di nuovo terreno ST, addizionato questa volta di colchicina o tiocolchicina, ad una concentrazione finale di 1 g/1. La biotrasformazione viene condotta e controllata nelle condizioni descritte nell'Esempio 1. La conferma analitica della avvenuta trasformazione del substrato a 3-glicosilderivato, nei termini quantitativi precedentemente descritti (80% e oltre) rappresenta la verifica della stabilità catalitica delle colture congelate.
Controlli paralleli delle brodocolture, mediante piastratura delle stesse su LB Agar subito dopo lo scongelamento, confermano vitalità, omogeneità e purezza dei congelati.
ESEMPIO 1
Aliquote di colture in criotubo, dopo scongelamento, sono utilizzate per inoculare beute di Erlenmeyer da 300 mi, contenenti 50 mi di terreno ST (precoltura). Dopo incubazione ovem ight, a 30°C, 250 rpm, 5 mi di precoltura sono trasferiti in 50 mi dello stesso terreno, addizionato di colchicina ad una concentrazione finale di 1 g/1. Le colture sono incubate per 2 giorni, nelle stesse condizioni sopra descritte. Ogni 4 ore sono prelevati campioni per la valutazione del livello di crescita (mediante misura di assorbenza a 600 nm), di produzione di colchicoside (TLC ed HPLC), di sterilità (su LB Agar), e per l'esame della morfologia microscopica.
Per l'analisi in HPLC frazioni di brodocoltura da 1 mi sono addizionate di 9 ml di metanolo e centrifugate a 13.000 rpm, per 2 minuti. Il contenuto in colchicoside del supernatante è analizzato in HPLC in fase inversa, con eluizione isocratica, mediante il sistema eluente: Acqua : Acetonitrile, 80 : 20.
L'analisi in HPLC dimostra che la conversione della colchicina in colchicoside segue un andamento parallelo a quello della crescita. Dopo circa 26 ore di incubazione la bioconversione è terminata.
La resa finale in colchicoside è compresa tra l'80% e l'85%.
ESEMPIO. 5
Si ripete l'esperimento descritto nell'Esempio 4, ma aggiungendo tiocolchicina alle colture in luogo della colchicina, alla stessa concentrazione finale (1 g/1).
La risposta di crescita e di produzione delle colture è simile a quella fornita su colchicina, con rese in tiocolchicoside di circa il 90%.
ESEMPIO 6
Si ripete l’esperimento descritto nell'Esempio 4, ma aggiungendo 3-demetiltiocolchicina alle colture in luogo della colchicina, alla stessa concentrazione finale (1 g/1). Il risultato, in termini di crescita e di produzione, è simile ai precedenti, con rese in tiocolchicoside di circa il 90%.
ESEMPIO 7
Si ripete l'esperimento descritto nell'Esempio 4, ma aggiungendo N-formiltiocolchicina alle colture in luogo della colchicina, alla stessa concentrazione finale (1 g/1). Il risultato, in termini di crescita e di conversione, è simile ai precedenti, con rese in N-formiltiocolchicoside di circa il 90%.
ESEMPIO 8
A partire da una coltura in criotubo del ceppo DSM 1670, si inocula 11 totale di brodo ST, in beute di Erlenmeyer (inoculo). Le beute sono incubate overnight a 30*C, 250 rpm. L'inoculo è trasferito sterilmente in fermentatore da 14 1, contenente 91 di brodo ST sterile, addizionato di tiocolchicina ad una concentrazione finale di 1 g/1. La fermentazione è condotta mantenendo adeguati livelli di agitazione-aerazione (agitazione fino a 900 rpm; aerazione da 1 a 1,5 w m, in funzione della crescita della coltura). Ogni 2 ore si prelevano aliquote di brodocoltura, che vengono sottoposte alle seguenti analisi:
Densità ottica (OD) a 600 nm,
Analisi di sterilità e purezza del ceppo (striscio su LB Agar);
Morfologia microscopica (colorazione di Gram);
Analisi del contenuto in tiocolchicoside, mediante TLC ed HPLC. Dopo 28 ore di fermentazione la trasformazione in tiocolchicoside è pressoché terminata. La resa finale è di circa il 90%.
ESEMPIO 9
Si ripete l'Esempio descritto nell'Esempio 8, ma dopo 28 ore di fermentazione si raccoglie solo il 90% della brodocoltura, per l'estrazione del prodotto (frazione 1). Il restante 10% è addizionato sterilmente, nel fermentatore, di 9 1 di terreno fresco ST sterile contenente 10 g di tiocolchicina. La fermentazione è condotta come descritto nell'Esempio 8. Dopo 26 ore, 91 di brodocoltura sono raccolti ed estratti (frazione 2). Il restante volume di brodocoltura è addizionato sterilmente di altri’ 9 1 di terreno fresco ST sterile contenente nuova tiocolchicina (10 g). La fermentazione è condotta come sopra. Dopo 26 ore la brodocoltura è raccolta totalmente ed estratta (frazione 3). L'attività di biotrasformazione del ceppo si è mantenuta stabile per tutte e tre le frazioni, con rese di conversione di circa il 90%, e con una produzione totale di tiocolchicoside praticamente tripla, rispetto a quella ottenuta nel processo a batch singolo.
ESEMPIO 10
La brodocoltura finale da fermentatore (volume totale: ca 27 1) è sottoposta a microfiltrazione a flusso tangenziale, su cartuccia di ceramica da 0.22 pm, per la separazione delle cellule dal brodo. Il permeato è adsorbito in colonna, su resina di adsorbimento HP 21, Mitsubishi. Dopo lavaggio con acqua il prodotto è eluito con metanolo.
L'eluato metanolico è concentrato a secco, sotto vuoto, e ridisciolto in metanolo. Dopo successive estrazioni con cloruro di metilene, la frazione alcoolica viene concentrata a secco e ridisciolta in una miscela etanolo-cloruro di metilene, 1:1. Dopo chiarificazione con gel di silice la soluzione viene concentrata sotto vuoto; il cloruro di metilene viene poi sostituito con etanolo. La sospensione ottenuta viene concentrata e lasciata cristallizzare. Una seconda cristallizzazione etanolica viene effettuata dopo ulteriori step di ridissoluzione del solido in miscele etanolo-cloroformiche, e di chiarificazione su gel di silice.
Il prodotto ottenuto, analizzato mediante HPLC, C-NMR, H-NMR e spettro di massa, risulta essere perfettamente identico allo standard di tiocolchicoside.
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di conposti 3-0-glicosilcolchicinoidi di formula (I) (I) C1-C6 ricossi o C1-C6 tioalchile, che conprende la biotrasformazione di composti in cui 3⁄4 è OH o metossi ad opera di Bacillus meaaterium.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1, per la preparazione di conposti (I) in cui R1 è un residuo O-glucosidico.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 2, per la preparazione di colchicoside e tiocolchicoside.
- 4. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che la biotrasformazione viene effettuata in coltura sommersa ad una temperatura compresa fra 28 e 40 "C, a un pH compreso fra 6 e 7 e utilizzando glucosio, fruttosio o glicerina come fonte di carbonio.
- 5. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura utilizzato contiene da 0.1 a 3 g/1 di conposti I in cui 3⁄4 è idrossi o metossi.
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