HU224896B1 - A process for the biotransformation of colchicionid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives - Google Patents
A process for the biotransformation of colchicionid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives Download PDFInfo
- Publication number
- HU224896B1 HU224896B1 HU9903806A HUP9903806A HU224896B1 HU 224896 B1 HU224896 B1 HU 224896B1 HU 9903806 A HU9903806 A HU 9903806A HU P9903806 A HUP9903806 A HU P9903806A HU 224896 B1 HU224896 B1 HU 224896B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- culture
- conversion
- derivatives
- cultures
- biological
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 6
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 35
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 15
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 11
- LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-(methylthio)-9-oxo-3-[[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6,7-dihydro-5H-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N 0.000 claims description 10
- 229960000287 thiocolchicoside Drugs 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UXAFRQPVHYZDED-ZZEDUEFDSA-N Colchicoside Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UXAFRQPVHYZDED-ZZEDUEFDSA-N 0.000 claims description 5
- UXAFRQPVHYZDED-UHFFFAOYSA-N Colchicoside Natural products C1=C2CCC(NC(C)=O)C3=CC(=O)C(OC)=CC=C3C2=C(OC)C(OC)=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O UXAFRQPVHYZDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182473 O-glycoside Natural products 0.000 claims description 2
- 150000008444 O-glycosides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 1
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 40
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N n-[(7s)-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 3
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- CMEGANPVAXDBPL-UHFFFAOYSA-N n-(1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl)acetamide Chemical compound C1CC(NC(C)=O)C2=CC(=O)C(SC)=CC=C2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2OC CMEGANPVAXDBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical group O=C1C(SC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 2
- MDYOLVRUBBJPFM-UHFFFAOYSA-N tropolone Chemical compound OC1=CC=CC=CC1=O MDYOLVRUBBJPFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NUNCOHUMTCDISK-AWEZNQCLSA-N (7s)-7-amino-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-9-one Chemical group C1([C@@H](N)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC NUNCOHUMTCDISK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 244000146462 Centella asiatica Species 0.000 description 1
- 235000004032 Centella asiatica Nutrition 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N Rubusoside Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 241000970875 Streptomyces spectabilis Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002682 anti-psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005858 glycosidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N rubusoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 208000013363 skeletal muscle disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/248—Colchicine radicals, e.g. colchicosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/11—Bacillus megaterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A találmány az (I) általános képletű kolchicinoidszármazékoknak kiválasztott mikrobatörzsek segítségével a megfelelő 3-O-glikozil-származékokká történő biológiai átalakítására vonatkozik. A találmányunk szerinti eljárással kizárólag az A aromás gyűrű C-3 szénatomján glikozidezett kolchicinoidszármazékok állíthatók elő kolchicinből, tiokolchicinből vagy ezek származékaiból nagy kitermeléssel és tisztasággal.
A benzolgyűrű C-3 szénatomján glikozidezett kolchicinoidszármazékok figyelemre méltó farmakológiai jelentőségűek, mivel igen hatékonyak és jól alkalmazhatók új gyógyszerek előállítására.
A tiokolchikozid (3-O-glükozil-tiokolchicin) különös jelentőségű farmakológiai hatóanyag, amelyet főleg a vázizomzat betegségeinek kezelésére, továbbá új tumorellenes, immunszuppresszív, pszoriázisellenes és gyulladásgátló hatású gyógyszerek előállításának kiindulási anyagaként alkalmaznak.
A múltban számos erőfeszítés történt a 3-glikozilkolchicinoid-származékok kémiai reakcióval vagy biológiai átalakítással történő előállítására.
A kémiai út összetett, nemspecifikus reakciók sorozatából áll, és glikozidezett származékok keverékét eredményezi, amelyek közül néhány inaktív. Ezért az aromás gyűrű C-3 szénatomján specifikusan glikozidezett hatóanyagra nézve a kitermelés nagyon kicsi.
A biológiai megközelítés lényegében a tiokolchicin Centella Asiatica tenyészettel történő biológiai átalakításából áll, amelynek során az aromás gyűrű C-2 és C-3 szénatomján monoglikozidezett származék képződik. Az átalakítás nem nagy mértékben szelektív, továbbá gyenge kitermeléssel és termelékenységgel jellemezhető [Sólet, J. M. és munkatársai: Phytochemistry 33, 4, 817-820(1993)].
A kolchicinoidszármazékok biológiai átalakítására tett további erőfeszítések során az aromás gyűrű C-2 és C-3 szénatomjához kapcsolódó metoxicsoportokat egyszerűen demetilezték, ezeket a reakciókat korlátozott kitermelés és termelékenység, valamint gyenge regioszelektivitás jellemezte.
Ezért Hufford, C. D. és munkatársai [J. Pharm. Se., 68, 10, 1239-1242 (1979)] Streptomyces griseus és/vagy Streptomyces spectabilis alkalmazásával, továbbá Béliét, P. és munkatársai [GB-923421 (1959)] különböző Streptomyces törzsek és más baktérium- és gombafajok alkalmazásával a kolchicint és származékait a megfelelő 3-demetilezett származékokká próbálták átalakítani. A fent ismertetett eljárások eredményei megerősítik az érintett mikrobaenzimek szelektivitásának hiányával kapcsolatos állításunkat, például az alkaloidmolekula C-2, C-3 vagy C-10 szénatomjaira vonatkozóan. Ezen túlmenően az említett katalitikus rendszerek termelékenysége meglehetősen gyenge az átalakulás kis kitermelése, az alkalmazható kis szubsztrátumkoncentráció és a tropolongyűrű gyakori degradációja következtében.
Az utóbbi időben Poulev és munkatársai [J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38 (1995)] is végrehajtottak bakteriális mikroorganizmusokon specifikus biológiai átalakítást, azonban a kitermelés és a termelékenység ebben az esetben is meglehetősen alacsony volt.
A fent említettekhez hasonló mikroorganizmusokból származó enzimes hatóanyagokat (Streptomyces, Bacillus) alkalmaztak más vegyületek, például maytansinoidok biológiai átalakítására [4 361 650 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, Izawa, M. és munkatársai, J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590 (1981)]. A katalizált reakció ebben az esetben is kizárólag a demetilezésre vonatkozott, ami alacsony kitermeléssel és termelékenységgel ment végbe.
A Bacillus megateriumból származó α-amiláz glikoziltranszferáz hatóanyaga is ismert [Brumm, P. J. és munkatársai: Starch, 43, 8, 319-323 (1991)], ahol a transzferázreakció akceptorspecificitása (kizárólag glükóz vagy glükozidok esetében) különösen magas. Ugyanezen mikrobaforrásból előállított ciklodextrin-glükozil-transzferázok katalizálják a rubusosid (13-Ο-β-ϋglükozil-szteviol-p-D-glükozil-észter) a-1,4-transzglükozilezését keményítőből kiindulva. A transzferázreakció akceptora ebben a biológiai átalakításban is a szubsztrátum glucid frakció [Darise, M. és munkatársai: Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488 (1984)]. Ciklodextrin-glikozil-transzferázokat használtak előzőleg G6, G7 és G8 ciklodextrinek keményítőből történő előállítására [Kitahata, S., Okada, S., Agric. Bioi. (Chem., 38, 12, 2413-2417(1974)].
Ezek a példák bizonyítják a Bacillus megateriummal expresszált glikoziltranszferáz hatóanyag nagy szubsztrátumspecificitását, amely kizárólag glucid akceptorokat foglal magában, így a különböző komplex molekulaszerkezetű szekunder metabolitok, például a kolchicinoidok reakcióira nem terjed ki. Ezért nincs ismert példa az említett mikroorganizmusok alkalmazására a kolchicinoid 3-glikozilszármazékokká történő enzimes átalakítására.
Felismertük, hogy a Bacillus megaterium törzsek nagy kolchicin- és tiokolchicinkoncentráció jelenlétében is képesek szaporodni, és a kolchicinoid szubsztrátumokat rendkívül nagy aktivitással és nagyon specifikus biológiai átalakítással kizárólag az aromás gyűrű C-3 szénatomján glikozidezett származékokká alakítják.
Ennek megfelelően találmányunk az (I) általános képletű 3-O-glikozil-kolchicinoid-származékok előállítási eljárására vonatkozik, amelyek képletében
R1 jelentése O-glikozid-csoport,
R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-7 szénatomos acilcsoport,
R3 jelentése 1-6 szénatomos alkoxi- vagy 1-6 szénatomos tio-alkil-csoport, amelynek során R1 jelentésében hidroxil- vagy metoxicsoportot tartalmazó vegyületeket biológiai átalakításnak vetünk alá Bacillus megateriummal.
A Bacillus megaterium egy Gram-pozitív spóratermelő baktérium, amelynek sejtátmérője 1,0 pm-nél nagyobb, és sokféle tenyészközegben aerob körülmények között szaporodik, katalázpozitív és zselatinhidrolizáló tulajdonságú.
A találmányunk szerint alkalmazható Bacillus megaterium törzsek nagy kolchicin- és/vagy tiokolchicin2
HU 224 896 Β1 koncentrációknál is életképesek, és kielégítően képesek szaporodni (3 g/l koncentráció felett), amit a szaporodás vizsgálatával és mikroszkópos analízissel bizonyítunk.
A kongenerikus fajok, mint a Bacillus cereus esetében, már 1,5 g/l szubsztrátumkoncentrációnál szaporodási nehézségek mutatkoznak (a kontroll 15% és 25% közötti abszorbanciája), ami kifejezettebbé válik 3 g/l koncentrációnál, amikor is drámai autolízis következik be. Ezzel szemben a Bacillus megaterium kiválasztott tenyészetei a fent említett koncentrációknál sokkal nagyobb szaporodási szinteket érnek el (kétszeres és háromszoros közötti) a Bacillus cereusszal összehasonlítva.
A biológiai átalakulás nagy szelektivitása és hatékonysága meglepő és szokatlan, a kitermelés 80% és 100% közötti, általában körülbelül 90% és 95% közötti.
Ezen túlmenően a biológiai átalakításban használt mikroorganizmusok katalitikus aktivitása, még ismételt fermentációs lépésekben is folyamatosan fennmarad, ami a sarzsonkénti, valamint folyamatos eljárásban specifikus biológiai átalakulást biztosít. Ezért ezzel az eljárással nagy termelékenység és reprodukálhatóság érhető el.
A jelzett reakció régiószelektivitása figyelemre méltó kitermelés mellett jó minőségű és nagy tisztaságú terméket biztosít, egyszerű áramlásirányban végrehajtott eljárásban 100%-os tisztaság érhető el.
Ezenkívül nagy előnyt jelent, hogy nincs szükség tisztítási lépésre és a termék kinyerésére, az eljárás gazdaságos és biztonságosan alkalmazható.
A találmányunk szerinti eljárásban alkalmazható baktériumtörzsek kiválasztásának operatív szekvenciái a következők:
A) nagy kolchicinszubsztrátum-koncentráció jelenlétében szaporodásra képes Bacillus megaterium-tenyészetek kiválasztása természetes forrásokból vagy törzsgyűjteményből;
B) az A) pont szerinti izolátum kiválasztása a kolchicin megfelelő 3-O-glikozil-származékokká történő átalakítási aktivitásának bizonyítására, fokozatosan növekvő koncentrációkban adagolt specifikus szubsztrátumokon végzett biológiai átalakítási vizsgálatokkal;
C) a B) pont szerint kiválasztott törzsek mikrobiológiai jellemzése;
D) a biológiai átalakítás kitermelésének fokozatos növelése a B) pont szerinti baktériumpopuláció célspecifikus kiválasztásával;
E) a kritikus fermentációs paraméterek tanulmányozása és optimalizálása a biológiai átalakítás optimalizálására;
F) a nagy termelékenységű tenyészetek tartósítására vonatkozó eljárás tanulmányozása és optimalizálása ipari méretű termelékeny eljáráshoz megfelelően stabil homogén oltóanyag biztosítására;
G) az eljárás nagy méretekben történő kifejlesztése fermenterben, sarzsban és folyamatos eljárásban történő alkalmazáshoz;
H) az eljárás kidolgozása és optimalizálása áramlásirányban végrehajtott eljárásra és a termék kinyerésére.
A találmányunk szerint alkalmazható mikroorganizmusok jellemzően törzsdeponálási centrumokból beszerzett tenyészetgyűjteményekből vagy különböző eredetű földmintákból választhatók el, szerves nitrogénforrást (peptonok, élesztőextraktumok, húsextraktumok, aszparagin) és szénforrást (glicerin, keményítő, maltóz, glükóz) tartalmazó különböző agarközegeken végzett szelektív visszanyeréssel, 5 és 8 közötti, előnyösen 6 és 7 közötti pH-értéken. Az inkubációs hőmérséklet 20 °C és 45 °C közötti, előnyösen 28 °C és 40 °C közötti.
Az átalakítandó kolchicinszubsztrátum toxikus koncentrációjának jelenlétében szaporodó tenyészet kapacitását skálás hígítási eljárással és különböző agarozott szubsztrátumokon párhuzamosan végzett baktériumszélesztéssel határozzuk meg, melynek egy részét előzőleg a kolchicinhez vagy tiokolchicinhez adjuk 0,1 g/l és 3 g/l közötti koncentrációban, a mikroorganizmusok nagyobb része szaporodásának gátlására.
Az ismertetett körülmények között szaporodásra képes kolóniákat sterilen kivonjuk, és különböző agarozott közegekbe helyezzük tisztaságuk és szaporodási homogenitásuk igazolására.
A tenyészetek konzerválására alkalmazott tenyészközegek jellegzetes mikrobiológiai szubsztrátumok, amelyek szerves nitrogénforrásokat (peptonok, élesztőextraktumok, tripton, húsextraktumok) és egy szénforrást (glükóz, maltóz, glicerin) tartalmaznak 5 és 8 közötti, előnyösen 6 és 7 közötti pH-η. Az inkubációs hőmérséklet 20 °C és 45 °C közötti, előnyösen 28 °C és 40 °C közötti.
Ezután megvizsgáljuk a kiválasztott mikroorganizmusok szaporodóképességét alámerített tenyészetben a kolchicinoidszármazékok jelenlétében, valamint az utóbbiaknak a megfelelő 3-glikozilszármazékokká történő átalakulási képességét.
Ezeket a vizsgálatokat 20 ml folyékony közeget tartalmazó 100 ml-es lombikokban végezzük, amely folyékony közeg egy vagy több szerves nitrogénforrást (élesztőextraktumok, peptonok, tripton, kazeinhidrolizátumok, húsextraktumok, gabona-áztatólé), szervetlen foszfor- és nitrogénforrásokat és különböző kationokkal (kálium, nátrium, magnézium, kalcium, vas, mangán) képzett szervetlen sókat tartalmazó különböző közegkészítmények.
A tenyészetmintákat adott esetben szokásos mutageneziseljárásokkal (mint az UV-besugárzás) végrehajtott mutagénkezeléseknek vethetjük alá specifikus biológiai átalakítási aktivitást mutató mutánsok indukálására, amelyet a fentivel azonos eljárással végezhetünk.
A biológiai átalakítási vizsgálatból származó mintákat TLC és HPLC kromatográfiás eljárásokkal analizáljuk a 3-glikozilszármazékok előállításának meghatározására.
A kiválasztott mikroorganizmusok kolchicinoidszubsztrátumoknak a megfelelő 3-glikozilszármazékokká történő átalakulóképességét egy lombikban 300 ml térfogatban végrehajtott biológiai átalakítási vizsgálattal igazoljuk az elválasztási lépésben alkalmazottal azonos tenyésztáptalajon.
HU 224 896 Β1
A pozitív választ adó mikroorganizmusokat használjuk fel a biológiai átalakítás optimalizálására szolgáló vizsgálatban különböző tenyésztáptalajokban 300 ml térfogatban. A vizsgált fő tenyésztési és fermentációs paraméterek: szerves nitrogénforrások, szénforrások, ásványi sók, hőmérséklet, keverés-szellőztetés, pH, inkubálás ideje, oltóanyagarány, szubkultúraeljárások, az átalakítandó szubsztrátum addíciós ideje.
A találmányunk szerinti biológiai átalakítás végrehajtására alkalmas kiválasztott bakteriális mikroorganizmusok mind szilárd, mind folyékony tenyészetszubsztrátumokon képesek szaporodni, amelyek egy vagy több szerves nitrogénforrást, előnyösen keményítőextraktumot, húsextraktumot, peptont, triptont, kazeinhidrolizátumokat, gabona-áztatólét tartalmaznak. A szaporításra és biológiai átalakításra alkalmazható szénforrások például a glükóz, fruktóz, szacharóz, glicerin vagy malátaextraktum, előnyösen glükóz, fruktóz vagy glicerin. Ezen túlmenően a tenyészközeg szervetlen foszforforrásokat és kálium-, nátrium-, magnéziumvagy ammóniumsókat tartalmaz.
A kiválasztott mikroorganizmusok 20 °C és 45 °C közötti, előnyösen 28 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, 5 és 8 pH-értéken, előnyösen 6 és 7 közötti pH-értéken képesek szaporodni. A kérdéses mikroorganizmusok ugyanilyen körülmények között képesek a kolchicinoidvegyületeket a megfelelő 3-glikozilszármazékokká alakítani. Ezek az átalakítások alámerített tenyészetben rotációs rázógépben 150 fordulat/perc és 250 fordulat/perc között keverve inkubált lombikban játszódnak le.
A mikrobás szaporodásra vonatkozó kérdéses biológiai átalakulás egyedi kinetikája következtében a biológiai átalakulás céljából optimális körülmények azonosak a szaporítás optimális körülményeivel. Ezért a megfelelő mikrobás szaporodás (például a fent idézett szerves és szervetlen komponenseken alapulók) elősegítésére alkalmas tenyészközeg szintén megfelelő hatóanyagként alkalmazható a kérdéses szubsztrátum biológiai átalakítására. Az utóbbit a kezdeti fermentációs lépésben adagoljuk a tenyészethez.
A találmányunk szerinti biológiai átalakítás enzimes átalakuláson alapul, amely a szaporodás exponenciális fázisában kezdődik, és a szaporodással párhuzamosan növekszik, a maximális 3-glikozilszármazék-átalakulási szint (amely nagyon magas, 95% és 100% közötti) az első 24 óra és 30 óra közötti időtartam alatt érhető el. A biológiai átalakulás régiószelektivitása abszolút: 2-glikozilszármazékok jelenléte sosem volt tapasztalható. A képződő termékek kizárólag extracellulárisak.
A találmányunk szerinti biológiai átalakítás fermenterszinten is végrehajtható a tenyészeti körülményeket változatlanul tartva, különösen a tenyészközeg, a hőmérséklet és az eljárási idő tekintetében. Jó szaporodás elérése céljából fontos a megfelelő mértékű keverés és szellőztetés, a szellőztetés mértéke előnyösen 1 I tenyészetre vonatkoztatva percenként 1 I és 2 I közötti, előnyösen 1,5 I és 2 I közötti mennyiségű levegő (vvm).
A biológiai átalakításban előállított termékeket a tenyésztáptalajból a folyadékfrakcióból származó biomassza elválasztása után centrifugálással és a felülúszó visszanyerésével vagy mikroszűréssel és a permeátum visszanyerésével extraháljuk. A tenyészetet a termék optimális kinyerése céljából alkoholokkal kezeljük.
A biológiai átalakítás termékének tisztítását és visszanyerését kromatográfiás eljárások alkalmazásával végezhetjük abszorpciós gyantákon történő elválasztással és alkoholokkal, előnyösen metanollal végzett elúcióval. A terméket tartalmazó hidrometanololdatokat további tisztításnak vethetjük alá lipofil szerves oldószerekkel, előnyösen metilén-kloriddal végzett extrakcióval. Az alkoholos keverékekkel és szerves oldószerekkel végzett további kezelések után a kapott alkoholos oldatokból a termék kristályosítással nyerhető ki tiszta állapotban.
A biológiai átalakítási eljárás tropoloncsoportot tartalmazó szubsztrátumokra nézve specifikus és számos kolchicinoidszármazék esetében alkalmazható, mint a kolchicin, tiokolchicin, 3-demetil-kolchicin, 3-demetil-tiokolchicin, N-dezacetil-tiokolchicin és más, különböző módon helyettesített kolchicinszármazékok.
Egyéb, tropolont nem tartalmazó természetes vegyületek nem glikozideződnek Basicillus megateriummal.
A glükózt más cukrokkal is helyettesíthetjük, például fruktózzal vagy galaktózzal a glikoziltranszferázaktivitás csökkenése nélkül.
Találmányunkat az alábbi példákban ismertetjük részletesen.
1. példa
Mezőgazdasági földből izolált Bacillus megaterium-tenyészetek aliquot mennyiségeit 20 ml steril sóoldatban szuszpendáljuk, és 1:10 000 000 hígítási faktorral skálás hígítást végzünk. A különböző hígításokhoz tartozó szuszpenziókat LB-agar tenyészközegen és LB-agaron tálcákra helyezzük, rendre kolchicinnel vagy tiokolchicinnel 2 g/l végső koncentrációban, ahogy ez a táblázatban látható. A tenyészeteket 28 °C-on 3 napig sötétben inkubáljuk. A kolchicinoiddal adagolt kiválasztott közegen szaporított kolóniákat izoláljuk, és nem szelektív közegen történő szélesztéssel tisztítjuk. A mintákat a fentiek szerint inkubáljuk, azonban rövidebb ideig, 24 órán át. Ezután a tenyészeteket átvisszük egy kémcsőbe ugyanezen agarközegre, és a fentiek szerint inkubáljuk 24 órán át.
A fentiekben ismertetett módon kiválasztott tenyészetek aliquot mennyiségeit egy 100 ml-es Erlenmeyerlombikban 20 ml ST-tenyészközeg oltására használjuk, ahogy ez a táblázatban látható, ehhez kolchicint vagy tiokolchicint adunk 0,4 mg/ml végső koncentrációban. A tenyészeteket egy éjszakán át 28 °C-on inkubáljuk rotációs rázógépben 200 fordulat/perc értéken.
A kolchicinszubsztrátum átalakítását a tenyésztáptalajok aliquot mennyiségeinek analízisével követjük 3-4 óránként szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiával aceton:etil-acetát:víz 5:4:1 arányú elúciós rendszerrel.
HU 224 896 Β1 nap inkubálás után a 3-glikozilszármazékkal szemben katalitikus hatásúnak bizonyult tenyészetek aliquot mennyiségeit lemezekre visszük fel a fentiekben ismertetett skaláris hígítással, ezáltal a kémcsőben új oltóanyagokat állítunk elő. A lombikban a biológiai átalakítási vizsgálatot a fentiekkel azonos körülmények között megismételjük, azonban lényegesen magasabb végső kolchicin- és tiokolchicinkoncentrációknál (1 mg/ml). A leghatékonyabb tenyészeteket, ahol a szubsztrátum átalakítása 80%-kal egyenlő vagy annál nagyobb, használjuk fel fagyasztott kriocsövekben az oltóanyag előállítására, a 3. példában ismertetett módon.
Táblázat
A tenyészközeg előállítása
| . LB-agar (sterilizálás: 121 °Cx20 perc) - pH 7 | |
| Tripton | 10 g/l |
| Élesztőextraktum | 5 g/l |
| Nátrium-klorid | 10 g/l |
| Agaragar | 15 g/l |
| . ST táptalaj (sterilizálás: 121 °Cx20 perc) | -pH 7 |
| Glükóz | 20 g/l |
| Glicerin | 10 g/l |
| Pepton | 15 g/l |
| Élesztőextraktum | 5 g/l |
| Nátrium-klorid | 3 g/l |
| Ammónium-klorid | 3 g/l |
| Dikálium-hidrogén-foszfát | 8 g/l |
| Kálium-dihidrogén-foszfát | 3 g/l |
| Magnézium-szulfát-7 kristályvíz | 0,5 g/l |
2. példa
Az 1. példában ismertetett eljárást ismételjük meg az alábbi kollekciótörzsekből származó Bacillus megaterium-tenyészetekből kiindulva (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Németország): DSM 90, 509, 322, 333, 1667, 1670, 1671.
DSM 90,
DSM 509,
DSM 322,
DSM 333,
DSM 1667,
DSM 1670,
DSM 1671.
A tenyészeteket az 1. példa szerint választjuk ki és 4 napig folyékony tenyészetben inkubált 1 mg/ml tiokolchicinhez adjuk: a vékonyréteg-analízis a szubsztrátum tiokolchikoziddá történő átalakulását detektálja 50% (DSM 1671 törzs esetében) és 70% (DSM 90 törzs esetén) vagy 80% közötti vagy efölötti (DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670 törzsek esetében) kitermeléssel.
3. példa
A fenti példában ismertetett módon kiválasztott, kémcsőbe bemért tenyészetminták aliquot mennyiségeit használjuk 20 ml ST-táptalaj 100 ml-es Erlenmeyer-lombikban történő oltására.
A táptalajtenyészeteket 30 °C-on inkubáljuk rotációs rázógépben 1 éjszakán át 200 fordulat/perc értéken. Inkubálás után a tenyészeteket steril glicerinoldathoz adjuk 20% végső koncentrációban. Ezután a tenyészeteket 2 ml-es kriocsőbe mérjük be, és azonnal folyékony nitrogénbe merítjük.
Néhány nap után a tenyészetek 10%-át gyorsan 37 °C-ra melegítjük. A kriocsőben lévő aliquot mennyiségek mindegyikét 20 ml ST-közeget tartalmazó 100 ml-es Erlenmeyer-lombik oltására használjuk fel, amelyet ezt követően 28 °C-on inkubáljuk 1 éjszakán át (prekultúra) 200 fordulat/perc értéken. Inkubálás után mindegyik prekultúrából 2 ml-t sterilen 20 ml friss ST-közegbe viszünk át, és ekkor kolchicint vagy tiokolchicint adunk hozzá 1 g/l végső koncentrációban. A biológiai átalakítást az 1. példában ismertetett körülmények között végezzük és vizsgáljuk. Az analízis megerősíti, hogy a szubsztrátum 3-glikozilszármazékká történő átalakulása a fenti módon kvantitatívan lejátszódik (80% vagy ennél nagyobb), ez a fagyasztott tenyészetek katalitikus stabilitását biztosítja.
A táptalajközegek párhuzamos kontrollja, amelyet közvetlenül felolvasztás után LB-agaron szélesztünk, a fagyasztott tenyészetek életképességét, homogenitását és tisztaságát bizonyítja.
4. példa
Kriocsőben lévő tenyészetek aliquot mennyiségeit felolvasztás után 300 ml Erlenmeyer-lombikban lévő 50 ml ST-közeg (prekultúra) oltására használjuk. Egy éjszakán át 30 °C-on 250 fordulat/perc értéken inkubáljuk, majd 5 ml prekultúrát 50 ml ugyanilyen közegbe visszük át, amely kolchicint tartalmaz 1 g/l végső koncentrációban. A tenyészeteket 2 napig inkubáljuk a fentiekkel azonos körülmények között. Minden 4. órában mintát veszünk a szaporodási szint (600 nm-nél mért abszorbancia meghatározásával), a kolchikozidtermelődés (TLC és HPLC) és a sterilitás (LB-agaron) meghatározására, valamint mikroszkópos morfológiai vizsgálatra.
A HPLC analízishez 1 ml tenyésztáptalaj-frakciót adunk 9 ml metanolhoz, és 2 percig 13 000 fordulat/perc értéken centrifugáljuk. A felülúszó kolchikozidtartalmát reverz fázisú HPLC-vel analizáljuk izokratikus elúcióval víz.acetonitril 80:20 eluens rendszer alkalmazásával.
A HPLC analízis szerint a kolchicin kolchikoziddá történő átalakulása a szaporodással párhuzamosan megy végbe. Körülbelül 26 óra inkubáció után a biológiai átalakulás befejeződik.
A kolchikozid végső kitermelése 80% és 85% közötti.
5. példa
A 4. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azonban kolchicin helyett tiokolchicint adunk a tenyészethez azonos végső koncentrációban, ami 1 g/l.
A tenyészetek növekedési és képződési válasza hasonló a kolchicin esetében meghatározotthoz, a tiokolchikozid kitermelése körülbelül 90%.
6. példa
A 4. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azonban kolchicin helyett 3-demetil-tiokolchicint adunk
HU 224 896 Β1 a tenyészethez azonos végső koncentrációban, ami 1 g/l. A tenyészetek növekedési és képződési válasza hasonló a fent meghatározotthoz, a tiokolchikozid kitermelése körülbelül 90%.
7. példa
A 4. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azonban kolchicin helyett N-formil-tiokolchicint adunk a tenyészethez azonos végső koncentrációban, ami 1 g/l. A tenyészetek növekedési és képződési válasza hasonló a fent meghatározotthoz, a tiokolchikozid kitermelése körülbelül 90%.
8. példa
Erlenmeyer-lombikban 1 I ST-táptalajt oltunk be a DSM 1670 törzs kriocsőben lévő tenyészetével. A lombikokat 1 éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk 250 fordulat/perc értéken. Az oltóanyagot sterilen 14 l-es fermenterbe visszük át, ami 9 I steril ST-táptalajt tartalmaz, és tiokolchicint adunk hozzá 1 g/l végső koncentrációban. A fermentációt megfelelő mértékű keverés és szellőztetés mellett végezzük (a keverés 900 fordulat/perc, a szellőztetés 1 vvm és 1,5 vvm közötti, a tenyészet szaporodásától függően). A tenyészettáptalajból minden második órában mintát veszünk, és a következő analízisnek vetjük alá:
- optikai sűrűség (OD) 600 nm-en,
- a törzs sterilitása és tisztasági analízise LB-agaron,
- mikroszkópos morfológia (Gram-törzs),
- TLC-vel és HPLC-vel végzett tiokolchikozidtartalom-analízis.
óra fermentáció után a tiokolchikozid átalakulása majdnem befejeződik. A végső kitermelés körülbelül 90%.
9. példa
A 8. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azonban 28 óra fermentáció után csak a tenyészettáptalaj 90%-át nyerjük vissza a termék extrahálására (1. frakció). A maradék 10%-ot sterilen egy 9 I friss steril ST-közeget és 10 g tiokolchicint tartalmazó fermenterbe adjuk. A fermentációt a 8. példában ismertetett módon végezzük. 26 óra után a 9 I tenyészettáptalajt összegyűjtjük és extraháljuk (2. frakció). A maradék tenyészettáptalaj-térfogatot sterilen további 9 liter steril friss ST-közeghez és 10 g friss tiokolchicínhez adjuk. A fermentációt a fentiek szerint végezzük. 26 óra után a tenyésztáptalaj teljes mennyiségét összegyűjtjük és extraháljuk (3. frakció). A törzs biológiai átalakulási aktivitása stabil marad mind a három körben, körülbelül 90% kitermelés és lényegében háromszoros teljes tiokolchikozidképződés mellett, összehasonlítva az egyetlen sarzson alapuló eljárással.
10. példa
A fermentációból származó végső tenyésztáptalajt, amelynek teljes térfogata körülbelül 27 I, átfolyásos mikroszűrésnek vetjük alá 0,22 pm-es kerámiatölteten a sejteknek a táptalajtól történő elválasztására. A permeátumot HP 21 Mitsubishi abszorpciós gyantával töltött oszlopon abszorbeáljuk. Vízzel mossuk és a terméket metanollal eluáljuk. A metanolos eluátumot vákuumban szárazra pároljuk, majd metanolban oldjuk. Ismételt metilén-kloridos extrakciók után az alkoholos frakciót szárazra pároljuk és etanol-metilén-klorid 1:1 arányú keverékében újraoldjuk. Szilikagélen végzett derítés után az oldatot vákuumban bepároljuk, és a metilén-kloridot etanollal helyettesítjük. A képződő szuszpenziót koncentráljuk és kristályosodni hagyjuk. A szilárd anyagot etanol-kloroform keverékből újraoldjuk és szilikagélen derítjük, majd egy második etanolos kristályosítást végzünk.
A képződött terméket HPLC, C-NMR, H-NMR és tömegspektroszkópiával analizáljuk, az eredmények megegyeznek a tiokolchikozid-standardértékekkel.
Claims (5)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás az (I) általános képletű 3-O-glikozil-kolchicínoid-származékok előállítására, a képletbenR1 jelentése O-glikozid-csoport,R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-7 szénatomos acilcsoport,R3 jelentése 1-6 szénatomos alkoxi- vagy 1-6 szénatomos tio-alkil-csoport, azzal jellemezve, hogy R1 jelentésében hidroxil- vagy metoxicsoportot tartalmazó vegyületet Bacillus megateriummal végzett biológiai átalakításnak vetünk alá.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületeket állítunk elő, ahol R1 jelentése O-glükozid-csoport.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kolchikozidot és tiokolchikozidot állítunk elő.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai átalakítást alámerített tenyészetben végezzük 28 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten 6 és 7 közötti pH-értéken, és szénatomforrásként glükózt, fruktózt vagy glicerint alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R1 jelentésében hidroxil- vagy metoxicsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületre nézve 0,1 g/l és 3 g/l közötti koncentrációjú tenyészközeget használunk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT96MI002063A IT1285777B1 (it) | 1996-10-07 | 1996-10-07 | Processo di biotrasformazione di composti colchicinoidi nei corrispondenti 3-glicosilderivati |
| PCT/EP1997/005429 WO1998015642A1 (en) | 1996-10-07 | 1997-10-02 | A process for the biotransformation of colchicinoid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9903806A2 HUP9903806A2 (hu) | 2000-03-28 |
| HUP9903806A3 HUP9903806A3 (en) | 2001-12-28 |
| HU224896B1 true HU224896B1 (en) | 2006-04-28 |
Family
ID=11374985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9903806A HU224896B1 (en) | 1996-10-07 | 1997-10-02 | A process for the biotransformation of colchicionid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6150140A (hu) |
| EP (1) | EP0931161B1 (hu) |
| JP (1) | JP3428027B2 (hu) |
| KR (1) | KR100311067B1 (hu) |
| CN (1) | CN1094978C (hu) |
| AT (1) | ATE213782T1 (hu) |
| AU (1) | AU714810B2 (hu) |
| CA (1) | CA2252725C (hu) |
| CZ (1) | CZ295451B6 (hu) |
| DE (1) | DE69710744T2 (hu) |
| DK (1) | DK0931161T3 (hu) |
| ES (1) | ES2171906T3 (hu) |
| HK (1) | HK1019620A1 (hu) |
| HU (1) | HU224896B1 (hu) |
| IT (1) | IT1285777B1 (hu) |
| NO (1) | NO319286B1 (hu) |
| PL (1) | PL187106B1 (hu) |
| PT (1) | PT931161E (hu) |
| RU (1) | RU2196826C2 (hu) |
| SK (1) | SK282344B6 (hu) |
| WO (1) | WO1998015642A1 (hu) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1295272B1 (it) * | 1997-10-03 | 1999-05-04 | Indena Spa | Biotrasformazione di composti colchiconici nei corrispondenti 3- glicosilderivati |
| ITMI20031144A1 (it) * | 2003-06-06 | 2004-12-07 | Indena Spa | Analoghi del colchicoside. |
| SG165175A1 (en) * | 2004-05-12 | 2010-10-28 | Indena Spa | Biotransformation of colchicinoid compounds |
| JP4580980B2 (ja) * | 2004-05-12 | 2010-11-17 | インデナ・ソチエタ・ペル・アチオニ | コルヒチノイド化合物のバイオトランスフォーメーション |
| SI2128170T1 (sl) | 2008-05-28 | 2011-04-29 | Indena Spa | Postopek za glikozidacijo kolhicina in tiokolhicina |
| US8497290B2 (en) * | 2009-05-27 | 2013-07-30 | Takeda Pharmaceuticals U.S.A., Inc. | Thiocolchicine derivatives, method of making and methods of use thereof |
| US20110178180A1 (en) * | 2010-01-18 | 2011-07-21 | Kurt Nielsen | Deuterium-enriched colchicine, thiocolchicine, and derivatives thereof; methods of preparation; and use thereof |
| EP2619315A2 (en) | 2010-09-22 | 2013-07-31 | Elysian Life Sciences Private Limited | A microbial method for the biotransformation of colchicinoid compounds |
| WO2015097567A1 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Alkaloids Corporation | Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues |
| CN105861601B (zh) * | 2016-04-29 | 2019-05-24 | 中国药科大学 | 一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(hmzg)的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1344157A (fr) * | 1959-05-22 | 1963-11-29 | Roussel Uclaf | Nouvelles colchicines et leur procédé d'obtention |
| JPS5233195B2 (hu) * | 1971-09-30 | 1977-08-26 | ||
| GB8701381D0 (en) * | 1987-01-22 | 1987-02-25 | Erba Farmitalia | Antitumor agent |
| IE70073B1 (en) * | 1990-12-14 | 1996-10-30 | Ainsworth Tech Inc | Communication system |
-
1996
- 1996-10-07 IT IT96MI002063A patent/IT1285777B1/it active IP Right Grant
-
1997
- 1997-10-02 SK SK445-99A patent/SK282344B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 JP JP51715598A patent/JP3428027B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 PT PT97911171T patent/PT931161E/pt unknown
- 1997-10-02 PL PL97331942A patent/PL187106B1/pl unknown
- 1997-10-02 HU HU9903806A patent/HU224896B1/hu unknown
- 1997-10-02 RU RU99109470/13A patent/RU2196826C2/ru active
- 1997-10-02 EP EP97911171A patent/EP0931161B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 WO PCT/EP1997/005429 patent/WO1998015642A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-02 KR KR1019980710918A patent/KR100311067B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 ES ES97911171T patent/ES2171906T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 DK DK97911171T patent/DK0931161T3/da active
- 1997-10-02 CA CA002252725A patent/CA2252725C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 CN CN97194493A patent/CN1094978C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 AU AU48648/97A patent/AU714810B2/en not_active Expired
- 1997-10-02 AT AT97911171T patent/ATE213782T1/de active
- 1997-10-02 CZ CZ19991187A patent/CZ295451B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 US US09/230,116 patent/US6150140A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 DE DE69710744T patent/DE69710744T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-04-06 NO NO19991633A patent/NO319286B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-10-27 HK HK99104800A patent/HK1019620A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU224896B1 (en) | A process for the biotransformation of colchicionid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives | |
| Yoshimoto et al. | New anthracycline metabolites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1 I. Isolation and characterization of various blocked mutants | |
| RU2218409C2 (ru) | Способ биотрансформации колхиконового соединения в соответствующее 3-0-гликозильное производное | |
| JP4198883B2 (ja) | コルヒコン化合物を対応する３−グリコシル誘導体に生物学的に転換する方法 | |
| KR101116424B1 (ko) | 콜키시노이드 화합물들의 생체내변환방법 | |
| FUKAGAWA et al. | DEEPOXIDATION OF 16-MEMBERED EPOXYENONE MACROLIDE ANTIBIOTICS I. MICROBIAL DEEPOXIDATION AND SUBSEQUENT ISOMERIZATION OF DELTAMYCINS A 1, A 2, A 3, A 4 (CARBOMYCIN A) AND X | |
| JPH08149986A (ja) | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 | |
| KR960014621B1 (ko) | 신 균주 스트렙토마이세스 라벤도폴리아 dk-506 및 이를 이용한 아클라시노마이신 a의 제조와 분리정제 방법 | |
| CA2258282C (en) | Biological process for producing steroids hydroxylated at the 25-position | |
| Přikrylova et al. | Microbial transformation of semisynthetic derivatives of daunomycinone modified in ring a | |
| JPH0889277A (ja) | １２−ヒドロキシ−６−ｏ−アルキルエリスロマイシン及びその類縁体の製造方法 |