PL187106B1 - Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych - Google Patents
Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowychInfo
- Publication number
- PL187106B1 PL187106B1 PL97331942A PL33194297A PL187106B1 PL 187106 B1 PL187106 B1 PL 187106B1 PL 97331942 A PL97331942 A PL 97331942A PL 33194297 A PL33194297 A PL 33194297A PL 187106 B1 PL187106 B1 PL 187106B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- culture
- compounds
- biotransformation
- liter
- colchicine
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 title 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 13
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims abstract description 5
- 150000008444 O-glycosides Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 3
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 12
- LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-(methylthio)-9-oxo-3-[[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6,7-dihydro-5H-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 229960000287 thiocolchicoside Drugs 0.000 claims description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- UXAFRQPVHYZDED-ZZEDUEFDSA-N Colchicoside Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UXAFRQPVHYZDED-ZZEDUEFDSA-N 0.000 claims description 5
- UXAFRQPVHYZDED-UHFFFAOYSA-N Colchicoside Natural products C1=C2CCC(NC(C)=O)C3=CC(=O)C(OC)=CC=C3C2=C(OC)C(OC)=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O UXAFRQPVHYZDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 40
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 15
- CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N n-[(7s)-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- MDYOLVRUBBJPFM-UHFFFAOYSA-N tropolone Chemical compound OC1=CC=CC=CC1=O MDYOLVRUBBJPFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 3
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 2
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound O=C1C(SC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 2
- NUNCOHUMTCDISK-AWEZNQCLSA-N (7s)-7-amino-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-9-one Chemical compound C1([C@@H](N)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC NUNCOHUMTCDISK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 244000146462 Centella asiatica Species 0.000 description 1
- 235000004032 Centella asiatica Nutrition 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 229930182473 O-glycoside Natural products 0.000 description 1
- YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N Rubusoside Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N Steviol Natural products C1CC2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C)C1C(C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 241000970875 Streptomyces spectabilis Species 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002682 anti-psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000011968 cross flow microfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- CMEGANPVAXDBPL-UHFFFAOYSA-N n-(1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl)acetamide Chemical compound C1CC(NC(C)=O)C2=CC(=O)C(SC)=CC=C2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2OC CMEGANPVAXDBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRRUSQGIRBEMRN-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2,10-trimethoxy-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound O=C1C(OC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 JRRUSQGIRBEMRN-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N rubusoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229940032084 steviol Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/248—Colchicine radicals, e.g. colchicosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/11—Bacillus megaterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania zwiazków 3-O-glikozylokolchicynoidowych, o wzorze (I) w którym R 1 oznacza reszte O-glikozydu, R2 oznacza atom wodoru lub C1-C7 acyl, R3 oznacza grupe C 1 -C6 alkoksylowa lub C1 -C6 tioalkilowa, znamienny tym, ze prowa- dzi sie biotransformacje zwiazków, w których R 1 oznacza OH lub grupe metoksylowa, za pomoca Bacillus megaterium. PL PL PL PL
Description
Wynalazek dotyczy biotransformacji związków kolchicynoidowych, prowadzonej za pomocą wybranych szczepów bakteryjnych, w odpowiednie pochodne 3-O-glikozylowe. Sposób według wynalazku zapewnia związki kolchicynoidowe glikozylowane wyłącznie przy atomie węgla C-3 pierścienia aromatycznego A, wychodząc z kolchicyny, tiokolchicyny lub ich pochodnych, z dużą wydajnością i czystością..
Związki kolchicynoidowe glikozylowane przy atomie węgla C-3 pierścienia benzenowego mają duże znaczenie farmakologiczne ze względu na ich dużą skuteczność lub do wytwarzania nowych leków.
Zwłaszcza, tiokolchikozyd (3-O-glikozylotiokolchicyna) jest substancją czynną o bardzo ważnym zastosowaniu w dziedzinie farmacji, głównie w leczeniu chorób układu mięśniowo-kostnego, i jako materiały wyjściowe do wytwarzania nowych leków przeciwnowotworowych, immunosupresyjnych, przeciwłuszczycowych i przeciwzapalnych.
W przeszłości prowadzono liczne próby wytwarzania związków 3-glikozylokolchicynoidowych albo za pomocą reakcji chemicznych albo przez biotransformację.
Droga chemiczna polega na sekwencji kompleksowych, niespecyficznych reakcji, prowadzących do mieszaniny glikozydowanych pochodnych, przy czym niektóre z nich są nieaktywne. Dlatego, wydajność konwersji do skutecznego produktu specyficznie glikozydowanego przy atomie węgla C-3 pierścienia aromatycznego, jest bardzo mała.
187 106
Podejście biologiczne zasadniczo dotyczy biotransformacji tiokolchicyny, przez hodowlę Centella Asiatica, w monoglikozydowane pochodne przy atomach węgla C-2 i C-3 pierścienia aromatycznego; dlatego taka transformacja nie jest wysoce selektywna i zapewnia niewielką wydajność i zdolność wytwórczą (Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).
Inne usiłowania biotransformowania związków kolchicynoidowych powodowały po prostu demetylację grup metoksylowych związanych z pierścieniem aromatycznym (przy atomach węgla C-2 i C-3), a w każdym razie zawsze charakteryzowało się ograniczoną wydajnością i zdolnością produkcyjną, a także złą regioselektywnością.
I tak, Hufford C.D. et al. (J. Pharm. Sc., 68, 10, 15 1239-1242, 1979), stosując Streptomyces griseus i/lub Streptomyces spectabilis, i Bellet P. et al., (GB 923421, 1959), stosując różne szczepy Streptomyces i inne szczepy bakterii i grzybów, próbowali przekształcić kolchicynę i jej pochodne w odpowiednie 3-demetylowane pochodne. Rezultaty uzyskane za pomocą tych znanych sposobów potwierdzają to, co powiedziano wyżej w związku z nieselektywnością uwikłanych w reakcję drobnoustrojowych enzymów, np. przy atomach węgla C-2, C-3 lub C-10 cząsteczki alkaloidu. Co więcej, zdolności produkcyjne wspomnianych układów katalitycznych są raczej złe, ze względu na niską wydajność konwersji, zmniejszone stężenia substratów, które można stosować, i częstą degradację pierścienia tropolonowego.
Ostatnio, Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) uzyskali specyficzną biotransformację drobnoustrojów bakteryjnych, ale ciągle ze złą wydajnością i zdolnością produkcyjną.
Aktywność enzymów pochodzących z drobnoustrojów podobnych do wspomnianych wyżej (Streptomyces, Bacillus, i podobne) stosowano do biotransformacji innych związków, takich jak maytansinoidy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4361650: łzawa, M., et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). W tym przypadku reakcja katalityczna również polega wyłącznie na demetylacji, charakteryzując się niską wydajnością konwersji i zdolnością produkcyjną.
Aktywność transferazy glikozylowej α-amylazy pochodzącej z Bacillus megaterium została opisana (Brumm, P.J., et al.V, Starch, 43, 8, 319-323, 1991); przy czym specyficzność akceptora reakcji transferazy (wyłącznie glikoza lub glikozydy) jest szczególnie duża.
Transferazy cyklodekstrynowo-glikozylowe, wytwarzane przez te same źródło drobnoustrojowe, katalizują a-1,4-transglikozylację rubusozydu (ester p-D-glikozylowy 13-0-p-D-glikozylostewiolu), gdy wychodzi się ze skrobi. Także w tej biokonwersji akceptorem w reakcji transferazy jest substrat stanowiący frakcję glucydową (Darise, M., et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Transferazy cyklodekstrinowo-glikozylowe stosowano wcześniej do wytwarzania cyklodekstryn G6, G7 i G8 ze skrobi (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. (Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).
Przykłady te świadczą o dużej specyficzności substratu aktywności transferazy glikozylowej eksprymowanej przez Bacillus megaterium, wymagającej tylko akceptorów glucydowych, i dlatego niezwiązanej z żadnymi reakcjami z udziałem drugorzędowych produktów metabolizmu o różnych, kompleksowych strukturach molekularnych, takich jak kolchicynoidy. W rzeczywistości, nie są znane przykłady stosowania tych drobnoustrojów do enzymatycznej konwersji kolchicynoidów w 3-glikozylowe pochodne.
Obecnie stwierdzono, że szczepy Bacillus megaterium zdolne do wzrastania w obecności dużych stężeń kolchicyny i tiokolchicyny, wykazują znacznie wyższą, bardzo specyficzną aktywność biotransformacji substratów kolchicynoidowych w pochodne glikozylowane wyłącznie przy atomie węgla C-3 pierścienia aromatycznego. Takie przekształcenie zachodzi w bardzo krótkim czasie i charakteryzuje się nieoczekiwanie dużą wydajnością.
Dlatego, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych o wzorze (I)
187 106
w którym Ri oznacza resztę O-glikozydu, R2 oznacza atom wodoru lub C1-C7 acyl, R3 oznacza grupę C1-C6 alkoksylową lub C1-C6 tioalkilową, polegającego na tym, że prowadzi się biotransformację związków, w których R1 oznacza OH lub grupę metoksylową, za pomocą Bacillus megaterium.
Bacillus megaterium jest Gram-dodatnią bakterią tworzącą spory, o średnicy komórki większej niż 1,0 pm; wzrastającą aerobowo na licznych pożywkach hodowlanych; katalazododatnią; hydrolizującą żelatynę.
Szczepy Bacillus megaterium, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, okazały się być zdolne do wzrastania zadawalająco i do zachowywania żywotności także przy dużych stężeniach kolchicyny i/lub tiokolchicyny (powyżej 3 g/litr), jak to potwierdziły badania wzrostu i analiza mikroskopowa.
Szczepy tego samego gatunku, takie jak Bacillus cereus, już przy stężeniach substratu 1,5 g/litr wykazują trudności we wzroście (absorbancje rzędu 15 - 25% kontroli), co staje się nawet wyraźniejsze przy stężeniach 3 g/litr, gdy następuje bardzo silna autoliza. Wybrane hodowle Bacillus megaterium, w przeciwieństwie do tego, przy wspomnianych stężeniach mogą osiągnąć znacznie wyższe poziomy wzrostu (dwukrotnie do trzykrotnie) w porównaniu z Bacillus cereus.
Duża selektywność i skuteczność biotransformacji jest nieoczekiwane i niezwykłe, gdyż wydajność wynosi od 80% do 100%, zwykle około 90 - 95%.
Co więcej, drobnoustroje stosowane w biokonwersji są zdolne do utrzymywania stale aktywności katalitycznej, nawet podczas powtarzanych etapów fermentacji, zapewniając tym samym specyficzną biokonwersję w procesach okresowych i ciągłych. Dlatego, sposób ten zapewnia wysoką zdolność produkcyjną i powtarzalność działania.
Znaczna regioselektywność reakcji zapewnia, oprócz znacznych wydajności produkcji, wysoką jakość i czystość powstałego produktu, zapewniając jego 100% czystość, w prostym procesie współprądowym.
Ponadto, ważnymi zaletami są zmniejszona przypadkowość etapu oczyszczania i odzyskiwania produktu, ekonomiczność procesu i łatwość stosowania procesu i jego bezpieczeństwo.
Kolejność czynności do selekcji szczepów bakterii dających się stosować w sposobie według wynalazku obejmuje:
A) Selekcję hodowli Bacillus megaterium zdolny do wzrostu w obecności wysokich stężeń substratu kolchicynowego, wychodząc ze źródeł naturalnych lub z kolekcji szczepów.
B) Selekcje izolatu z A), aby zweryfikować aktywność transformacji kolchicyny w odpowiednie pochodne 3-O-glikozylowe, za pomocą prób biokonwersji na specyficznych substratach, podawanych w stopniowo wzrastających stężeniach.
C) Mikrobiologiczną charakteryzację szczepów wyselekcjonowanych według punktu B).
D) Stopniowe zwiększanie wydajności biotransformacji, za pomocą celowo-specyficznej selekcji populacji bakterii z punktu B).
E) Badanie i optymalizację krytycznych parametrów fermentacji, aby zoptymalizować biotransformację.
F) Badanie i optymalizację sposobów konserwacji hodowli o dużej zdolności produkcyjnej, aby zagwarantować trwałe, homogeniczne inokula do zastosowań produkcyjnych na skalę przemy słową.
187 106
G) Powiększanie skali procesu w fermentatorze w procesach okresowych, półciągłych i ciągłych. H) Wypracowanie i optymalizację sposobów dla procesu współprądowego i odzyskiwania produktu.
Konkretnie, drobnoustroje dające się stosować w niniejszym wynalazku można wybrać, wychodząc z kolekcji hodowli otrzymanych z centrów deponowania szczepów, lub z próbek gleby różnego pochodzenia, przez selektywne odzyskiwanie na różnych pożywkach agarowych zawierających organiczne źródło azotu (peptony, ekstrakty drożdżowe, ekstrakty mięsne, asparaginę, i podobne), źródło węgla (glicerynę, skrobię, maltozę, glikozę, i podobne), przy pH 5 do 8, korzystnie 6-7. Temperatura inkubacji waha się od 20° do 45°C, korzystnie 28°-40°C.
Zdolność hodowli do wzrastania w obecności toksycznego stężenia substratu kolchicynowego, który ma być przekształcany, i ocenia techniką rozcieńczania skalarnego i posiewania bakterii równolegle na różnych agarowanych stałych substratach, do których części dodano wcześniej kolchicynę lub tiokolchicynę, w stężeniach od 0,1 to 3 g/litr (tak aby zahamować wzrost większości drobnoustrojów).
Kolonie zdolne do wzrastania w opisanych warunkach usuwa się w warunkach jałowości i umieszcza na różnych agarowanych pożywkach, aby zweryfikować ich czystość i jednorodność wzrostu.
Pożywki hodowlane stosowane do konserwacji hodowli są typowymi substratami mikrobiologicznymi, zawierającymi organiczne źródła azotu (peptony, ekstrakty drożdżowe, trypton, ekstrakty mięsne, i podobne), źródło węgla (glikozę, maltozę, glicerynę, i podobne), przy pH 5 do 8, korzystnie 6-7. Temperatura inkubacji waha się od 20° do 45°C, korzystnie 28°-40°C.
Wyselekcjonowane drobnoustroje bada się następnie pod kątem zdolności wzrastania w hodowli podpowierzchniowej, w obecności związków kolchicynoidowych, i przekształcania tych ostatnich w odpowiednie pochodne 3-glikozylowe.
Próby te prowadzi się w kolbach o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml ciekłej pożywki, o różnych składach, zawierających jedno lub większą liczbę organicznych źródeł azotu, (ekstrakty drożdży, peptony, trypton, hydrolizaty kazeiny, ekstrakt mięsa, wyciąg namokowy kukurydzy, i podobne), jedno lub większą liczbę źródeł węgla (glikoza, gliceryna, skrobia, sacharoza, i podobne), nieorganiczne źródła fosforu i źródła azotu, i nieorganiczne sole różnych jonów (K+, Na+, Mg‘H’, Ca+, Fe++, Mn, i podobne).
Próbki hodowli można ewentualnie poddawać obróbce mutagenicznej, za pomocą znanych technik mutagenezy (napromieniowanie promieniami UV, i podobne) aby wywołać powstanie mutantów o specyficznej aktywności biokonwersji, którą można oceniać w taki sam sposób jak opisano wyżej.
Próbki hodowli z każdej próby biokonwersji analizowano, aby ocenić wytwarzanie pochodnych 3-glikozylowych, za pomocą chromatografii TLC i HPLC.
Zdolność wyselekcjonowanych drobnoustrojów do transformowania substratów kolchicynoidowych w odpowiednie pochodne 3-glikozylowe potwierdzono za pomocą prób biokonwersji w kolbach, w skali 300 ml, w tym samym bulionie hodowlanym jak stosowany w etapie selekcjonowania.
Drobnoustroje reagujące dodatnio stosowano w próbach optymalizacji biokonwersji, w różnych bulionach hodowlanych, w skali 300 ml. Głównymi badanymi parametrami hodowli i fermentacji są: organiczne źródła azotu, źródła węgla, sole mineralne, temperatura, mieszanie-napowietrzanie, pH, czas inkubacji, stosunek inokulum, etapy podhodowli, czas dodawania przekształcanego substratu.
Wyselekcjonowane drobnoustroje bakteryjne, zdolne do przeprowadzenia biotransformacji według wynalazku, mogą wzrastać zarówno na stałych jak i ciekłych substratach hodowlanych, zawierających jedno lub większą liczbę organicznych źródeł azotu, korzystnie ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsa, pepton, trypton, hydrolizaty kazeiny, wyciąg namokowy kukurydzy, i podobne. Źródłami węgla, przydatnymi do wzrostu i biotransformacj i są glikoza, fruktoza, sacharoza, gliceryna, ekstrakt słodu, i podobne, korzystnie
187 106 glikoza, fruktoza i gliceryna. Pożywka hodowlana zawiera ponadto nieorganiczne źródła fosforu i sole K+, Na+, Mg++, NH4 , i podobne.
Wyselekcjonowane drobnoustroje mogą wzrastać w temperaturze od 20° do 45°C, korzystnie od 28° do 40°C, przy pH od 5 - 8, korzystnie 6 - 7. W tych samych warunkach rozważane drobnoustroje są zdolne do transformowania związków kolchicynoidowych w odpowiednie pochodne 3-glikozylowe. Przekształcenia te zachodzą w hodowli podpowierzchniowej, w kolbach inkubowanych na wstrząsarce obrotowej, z mieszaniem z prędkością od 150 do 250 obrotów/minutę.
Dzięki szczególnej kinetyce omawianej biotransformacji, związanej ze wzrostem drobnoustroju, optymalne warunki biotransformacji są takie same jak warunki optymalne dla wzrostu. Dlatego, pożywki hodowlane przydatne do promowania dobrego wzrostu drobnoustroju, takie jak te, które są oparte na wspomnianych wyżej składnikach organicznych i nieorganicznych, są także przydatne dla dobrej aktywności biotransformacji przedmiotowego substratu. Ten ostatni dodaje się do hodowli w etapie rozpoczęcia fermentacji.
Biotransformacja według wynalazku oparta jest na konwersji enzymatycznej, rozpoczynającej się podczas wykładniczej fazy wzrostu i jest kontynuowana z progresją równoległą do tego wzrostu; maksymalne poziomy konwersji do pochodnych 3-glikozylowych (bardzo wysokie: aż do 95 - 100%) osiąga się w ciągu pierwszych 24 - 30 godzin. Regioselektywność biotransformacji jest absolutna: zawsze brak jest obecności pochodnych 2-glikozylowych. Powstałe produkty są wyłącznie produktami pozakomórkowymi.
Skalę biotransformacji według wynalazku można powiększać aż do prowadzenia jej w fermentatorze, utrzymując niezmienione warunki hodowli, zwłaszcza jeśli chodzi o pożywkę hodowlaną, temperaturę i czas prowadzenia procesu. Dla uzyskania dobrych wzrostów ważny jest odpowiedni poziom mieszania - napowietrzania, zwłaszcza wymagany jest poziom napowietrzania wynoszący 1-2 litrów powietrza na litr hodowli na minutę (vvm), korzystnie 1,5-2 vvm.
Produkty powstające w wyniku biokonwersji ekstrahuje się z brzeczki hodowlanej po oddzieleniu biomasy od ciekłej frakcji przez odwirowanie i odzyskuje się Supematant, lub przez mikrofiltrację i odzyskuje się przepuszczalną warstwę. Hodowlę można traktować alkoholami, mając na względzie optymalne odzyskanie produktu.
Oczyszczanie i odzyskiwanie produktów biotransformacji można prowadzić, stosując techniki chromatograficzne rozdzielania na żywicach absorpcyjnych i eluowania alkoholami, korzystnie metanolem. Roztwory wodno-metanolowe zawierające produkt można dalej oczyszczać przez ekstrakcję lipofilowymi rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie chlorkiem metylenu. Po dalszym traktowaniu mieszaninami alkoholi i rozpuszczalników organicznych, produkt można otrzymywać w stanie czystym z powstałych roztworów alkoholowych przez krystalizację.
Proces biotransformacji jest specyficzny w odniesieniu do substratów zawierających grupę tropolonową i może być stosowany w odniesieniu do licznych związków kolchicynoidowych, takich jak kolchicyna, tiokolchicyna, 3-dezmetylokolchicyna, 3-dezmetylotiokolchicyna, N-deacetylotiokolchicyna i inne różnie podstawione kolchicyny.
Inne związki naturalne pozbawione tropolonu nie są glikozylowane przez Bacillus megaterium.
Glikoza może być zastąpiona innymi cukrami, takimi jak fruktoza lub galaktoza, bez powodowania utraty aktywności transferazy glikozylowej.
Następujące przykłady ujawniają wynalazek bardziej szczegółowo.
Przykład I.
Małe próbki hodowli Bacillus megaterium, wyizolowanego z gleby uprawnej, zawieszono ponownie w 20 ml jałowej solanki, i poddano skalarnemu rozcieńczaniu do wskaźnika rozcieńczenia 1:10.000.000. Zawiesiny o różnych rozcieńczeniach umieszczano na płytkach z pożywką hodowlaną LB-Agar i na pożywce hodowlanej LB-Agar odpowiednio z dodatkiem kolchicyny lub tiokolchicyny, do końcowego stężenia 2 g/litr (patrz tablica). Hodowle inkubowano w ciemności w ciągu 3 dni w temperaturze +28°C. Wyizolowano kolonie wzrastające na selektywnej pożywce z dodatkiem kolchicynoidu, i oczyszczano je za pomocą umieszczania
187 106 na płytkach na nieselektywnej pożywce; przy czym próbki te inkubowano jak opisano wyżej, ale przez krótszy czas (24 godziny). Następnie hodowlę przenoszono do takiej samej pożywki agarowej, w probówkach do badań, i inkubowano w ciągu 24 godzin jak opisano wyżej.
Małe próbki hodowli, wyselekcjonowane jak opisano wyżej, stosowano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml pożywki hodowlanej ST (patrz tabela), z dodatkiem kolchicyny lub tiokolchicyny, do końcowego stężenia 0,4 mg/ml. Hodowle te inkubowano w ciągu nocy w temperaturze 28°C, na wstrząsarce obrotowej, przy 200 obrotach/minutę. Transformację substratu kolchicynowego sprawdzano, poddając analizie małe próbki brzeczki hodowlanej, pobierane co 3 - 4 godziny, metodą chromatografii TLC na żelu krzemionkowym, stosując układ eluujący aceton : octan etylu : woda 5:4: 1. Po 4 dniach inkubacji, podpróbki hodowli, które wykazywały oczywistą aktywność katalityczną w odniesieniu do pochodnej 3-glikozylowej, odzyskiwano na płytkach za pomocą rozcieńczania skalarnego jak opisano wyżej, w celu sporządzenia nowego inokulum w probówce do badania. Próbę biotransformacji w kolbie powtórzono w takich samych warunkach jak opisano wyżej, lecz stosując znacznie wyższe stężenia kolchicyny i tiokolchicyny (125 mg/ml). Najaktywniejsze pojedyncze kultury (konwersja substratu równa lub wyższa niż 80%) stosowano do sporządzania inokulum w zamrożonych krioprobówkach, jak opisano w przykładzie III.
Tabela
Skład pożywki hodowlanej
LB-Agar (Sterylizacja: 121°C w ciągu 20 minut) - pH 7 | |
Trypton Ekstrakt drożdży NaCl Agar Agar | 10,0 g/litr 5,0 g/litr 10,0 g/litr 15,0 g/litr |
Bulion ST (Sterylizacja: 121°C w ciągu 20 minut) - pH 7 | |
Glikoza | 20,0 g/litr |
Glicerol | 10,0 g/litr |
Pepton | 15,0 g/litr |
Ekstrakt drożdży | 5,0 g/litr |
NaCl | 3,0 g/litr |
NH4CI | 3,0 g/litr |
K2HPO4 | 8,0 g/litr |
KH2PO4 | 3,0 g/litr |
MgSO4 · 7H2O | 0,5 g/litr |
Przykład II.
Postępowano jak w przykładzie I, wychodząc z kultur Bacillus megaterium, pochodzących z następującej kolekcji szczepów (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Niemcy): DSM 90, 509, 322, 333, 1667, 1670, 1671.
DSM | 90, |
DSM | 509, |
DSM | 322, |
DSM | 333, |
DSM | 1667, |
187 106
DSM 1670,
DSM 1671.
Hodowle selekcjonowano jak w przykładzie I z dodatkiem tiokolchicyny (1 mg/ml) inkubowano w ciągu 4 dni w ciekłej hodowli: analiza metodą TLC wykryła następującą transformację substratu w tiokolchikozyd, przy czym wydajność konwersji wahała się od 50% (szczep DSM 1671) do 70% (szczep DsM 90), do 80% i więcej (szczepy DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670).
Przykład III. Podpróbki próbek hodowli w probówkach, wyselekcjonowanych jak opisano w powyższych przykładach, stosowano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml bulionu ST.
Hodowle bulionowe inkubowano w ciągu nocy w temperaturze +30°C, na wstrząsarce obrotowej przy szybkości 200 obrotów/minutę. Po inkubacji, do hodowli dodano wyjałowiony roztwór glicerolu do końcowego stężenia 20%. Hodowle umieszczano następnie w probówkach do zamrażania o pojemności 2 ml i niezwłocznie zanurzano w ciekłym azocie.
Po kilku dniach, 10% hodowli rozmrożono szybko w temperaturze 37°C. Podpróbki z każdej z probówek do zamrażania stosowano do zaszczepiania kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml, zawierających 20 ml pożywki ST, które następnie inkubowano przez noc w temperaturze +28°C, (prehodowla), przy 200 obrotach/minutę. Po inkubacji, 2 ml każdej prehodowli przenoszono w sterylnych warunkach do 20 ml świeżej pożywki ST, do której tym razem dodano kolchicynę lub tiokolchicynę, do końcowego stężenia 1 g/litr. Biotransformację prowadzono i kontrolowano w warunkach opisanych w przykładzie I. Analiza potwierdziła, że przekształcanie substratu w pochodną 3-glikozylową zachodzi z wydajnością ilościową podaną wyżej (80% i wyższą), co dowodzi trwałości katalitycznej zamrożonych hodowli.
Równoległe próbki kontrolne hodowli bulionowych umieszczonych na płytkach z agarem LB Agar niezwłocznie po rozmrożeniu potwierdziły żywotność, homogeniczność i czystość zamrożonych hodowli.
Przykład IV. Podpróbki hodowli w probówkach do zamrażania stosowano, po szybkim rozmrożeniu, do zaszczepiania kolb Erlenmeyera o pojemności 300 ml, zawierających 50 ml pożywki ST (prehodowla). Po inkubowaniu przez noc w temperaturze 30°C, przy 250 obrotach/minutę, 5 ml prehodowli przenoszono do 50 ml tej samej pożywki z dodatkiem kolchicyny do końcowego stężenia 1 g/litr. Hodowle inkubowano w ciągu 2 dni, w takich samych warunkach jak opisano wyżej. Co 4 godziny pobierano próbki dla oceny poziomu wzrostu (oznaczanie absorbancji przy 600 nm), wytwarzania kolchikozydu (TLC i HPLC), jałowości (na agarze LB Agar), i do mikroskopowych badań morfologicznych.
Dla celów analizy metodą HPLC, do 1 ml frakcji bulionu hodowlanego dodawano 9 ml metanolu i wirowano je w ciągu 2 minut przy 13000 obrotach/minutę. Zawartość kolchikozydu w supematancie analizowano metodą chromatografii HPLC z odwróconymi fazami, z eluowaniem izokratycznym, za pomocą układu rozpuszczalników woda : acetonitryl 80 : 20.
Analiza metodą HPLC dowiodła, że konwersja kolchicyny w kolchikozyd postępuje z progresją równoległą z progresją wzrostu. Po około 26 godzinach inkubacji, biokonwersja zostaje zakończona.
Końcowa wydajność kolchikozydu wynosi od 80° do 85%.
Przykład V.
Postępowano jak w przykładzie IV, dodając do hodowli tiokolchicynę zamiast kolchicyny, w takim,samym końcowym stężeniu (1 g/litr).
Wzrost i reakcje produkcyjne hodowli są podobne do uzyskiwanych w przypadku stosowania kolchicyny, przy czym wydajność tiokolchikozydu wynosi około 90%.
Przykład VI.
Postępowano jak w przykładzie IV, dodając do hodowli zamiast kolchicyny 3-demetylotiokolchicynę, w takim samym końcowym stężeniu (1 g/litr).
Wzrost i reakcje produkcyjne hodowli są podobne do uzyskiwanych wyżej, przy czym wydajność tiokolchikozydu wynosi około 90%.
187 106
Przykład VII. Postępowano jak w przykładzie IV, dodając do hodowli zamiast kolchicyny N-formylotiokolchicynę, w takim samym końcowym stężeniu (1 g/litr). Wzrost i reakcje produkcyjne hodowli są podobne do uzyskiwanych wyżej, przy czym wydajność tiokolchikozydu wynosi około 90%.
Przykład VIII. Jeden litr bulionu ST w kolbie Erlenmeyera zaszczepiono hodowlą z probówki do zamrażania szczepu DSM 1670. Kolby inkubowano przez noc w temperaturze +30°C, przy 250 obrotach/minutę. Inokulum przeniesiono w warunkach jałowości do fermentatora o pojemności 14 litrów, zawierającego 9 litrów jałowego bulionu ST, do którego dodano tiokolchicynę do końcowego stężenia 1 g/litr. Fermentację prowadzono, utrzymując stały poziom mieszania/napowietrzania (mieszanie z szybkością do 900 obrotów/minutę; napowietrzanie 1 do 1,5 vvm, w zależności od wzrastania hodowli). Co 2 godziny pobierano próbki brzeczki hodowlanej i poddawano je następującej analizie:
- Badaniu gęstości optycznej (OD) przy 600 nm;
- Analizie sterylności i czystości szczepu na Agarze L9;
- Badaniu mikroskopowemu morfologii (barwienie Grama);
- Badaniu zawartości tiokolchikozydu metodą chromatografii TLC i HPLC.
Po 28 godzinach fermentacji, transformacja w tiokolchikozyd zostaje niemal zakończona. Końcowa wydajność wynosi około 90%.
Przykład IX.
Powtórzono sposób postępowania z przykładu VIII, ale po 28 godzinach fermentacji odzyskiwano tylko 90% brzeczki hodowlanej, aby wyekstrahować produkt (frakcja 1). Pozostałe 10% dodano w warunkach jałowości do fermentatora zawierającego 9 litrów świeżej jałowej pożywki ST zawierającej 10 g tiokolchicyny Fermentację prowadzono jak opisano w przykładzie VIII. Po 26 godzinach zebrano 9 litrów brzeczki hodowlanej i ekstrahowano (frakcja 2). Do pozostałej objętości brzeczki hodowlanej w jałowych warunkach dodano dalszych 9 litrów świeżej jałowej pożywki ST zawierającej świeżą tiokolchicynę (10 g). Fermentację prowadzono jak wyżej. Po 26 godzinach zgromadzono całość brzeczki hodowlanej i ekstrahowano (frakcja 3). Aktywność biotransformacji szczepu pozostawała stała we wszystkich trzech etapach, z wydajnością konwersji około 90%, i z zasadniczo potrojonym wytwarzaniem tiokolchikozydu, w porównaniu z uzyskiwanymi w pojedynczym procesie okresowym.
Przykład X.
Końcową brzeczkę hodowlaną z procesu fermentacji (całkowita objętość: około 27 litrów) poddano mikrofiltracji z przepływem poprzecznym na wypełnieniu ceramicznym 0,22 pm, aby oddzielić komórki od brzeczki. Przesiąkliwy materiał absorbowano na kolumnie wypełnionej żywicą absorbującą HP 21, produkcji firmy Mitsubishi. Po przemyciu wodą produkt eluowano metanolem. Eluat metanolowy zatężano do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym ponownie rozpuszczano go w metanolu. Po powtórnych ekstrakcjach chlorkiem metylenu frakcję alkoholowe zatężono do sucha i ponownie rozpuszczono w mieszaninie 1 : 1 etanol - chlorek metylenu. Po klaryfikacji żelem krzemionkowym, roztwór ten zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem; chlorek metylenu zastępowano następnie etanolem. Powstałą zawiesinę zatężono i pozostawiono to do krystalizacji. Drugą krystalizację z etanolu prowadzono po dalszych operacjach ponownego rozpuszczania substancji stałej w mieszaninach etanol - chloroform i klaryfikacji na żelu krzemionkowym.
Powstały produkt, analizowany metodami HPLC, C-NMR, H-NMR i spektroskopii masowej okazał się być taki sam jak standard tiokolchikozydowy.
Claims (5)
1. Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych, o wzorze (I) w którym Ri oznacza resztę O-glikozydu, R2 oznacza atom wodoru lub C1-C7 acyl, R3 oznacza grupę C1-C6 alkoksylową lub C1-C6 tioalkilową, znamienny tym, że prowadzi się biotransformację związków, w których R1 oznacza OH lub grupę metoksylową, za pomocą Bacillus megaterium·.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się związki o wzorze (I), w których R1 oznacza resztę O-glikozydu.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wytwarza się kolchikozyd i tiokolchikozyd.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację prowadzi się w hodowli podpowierzchniowej w temperaturze od 28 do 40°C, przy pH od 6 do 7, a jako źródło węgla stosuje się glikozę, fruktozę lub glicerol.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą 0,1 do 3 g/litr związków o wzorze (I), w których R1 oznacza grupę hydroksylową lub metoksylową.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT96MI002063A IT1285777B1 (it) | 1996-10-07 | 1996-10-07 | Processo di biotrasformazione di composti colchicinoidi nei corrispondenti 3-glicosilderivati |
PCT/EP1997/005429 WO1998015642A1 (en) | 1996-10-07 | 1997-10-02 | A process for the biotransformation of colchicinoid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL331942A1 PL331942A1 (en) | 1999-08-16 |
PL187106B1 true PL187106B1 (pl) | 2004-05-31 |
Family
ID=11374985
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL97331942A PL187106B1 (pl) | 1996-10-07 | 1997-10-02 | Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6150140A (pl) |
EP (1) | EP0931161B1 (pl) |
JP (1) | JP3428027B2 (pl) |
KR (1) | KR100311067B1 (pl) |
CN (1) | CN1094978C (pl) |
AT (1) | ATE213782T1 (pl) |
AU (1) | AU714810B2 (pl) |
CA (1) | CA2252725C (pl) |
CZ (1) | CZ295451B6 (pl) |
DE (1) | DE69710744T2 (pl) |
DK (1) | DK0931161T3 (pl) |
ES (1) | ES2171906T3 (pl) |
HK (1) | HK1019620A1 (pl) |
HU (1) | HU224896B1 (pl) |
IT (1) | IT1285777B1 (pl) |
NO (1) | NO319286B1 (pl) |
PL (1) | PL187106B1 (pl) |
PT (1) | PT931161E (pl) |
RU (1) | RU2196826C2 (pl) |
SK (1) | SK282344B6 (pl) |
WO (1) | WO1998015642A1 (pl) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1295272B1 (it) * | 1997-10-03 | 1999-05-04 | Indena Spa | Biotrasformazione di composti colchiconici nei corrispondenti 3- glicosilderivati |
ITMI20031144A1 (it) * | 2003-06-06 | 2004-12-07 | Indena Spa | Analoghi del colchicoside. |
EP1745140B1 (en) * | 2004-05-12 | 2009-08-26 | Indena S.P.A. | Biotransformation of colchicinoid compounds |
SG165175A1 (en) * | 2004-05-12 | 2010-10-28 | Indena Spa | Biotransformation of colchicinoid compounds |
PL2128170T3 (pl) | 2008-05-28 | 2011-05-31 | Indena Spa | Sposób glikozydacji kolchicyny i tiokolchicyny |
EP2435403A4 (en) * | 2009-05-27 | 2015-04-01 | Takeda Pharmaceuticals Usa Inc | THIOCOLCHICINE DERIVATIVES AND MANUFACTURING AND USE METHOD THEREFOR |
US20110178180A1 (en) * | 2010-01-18 | 2011-07-21 | Kurt Nielsen | Deuterium-enriched colchicine, thiocolchicine, and derivatives thereof; methods of preparation; and use thereof |
EP2619315A2 (en) | 2010-09-22 | 2013-07-31 | Elysian Life Sciences Private Limited | A microbial method for the biotransformation of colchicinoid compounds |
EP3086794B1 (en) | 2013-12-23 | 2020-01-08 | Alkaloids Corporation | Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues |
CN105861601B (zh) * | 2016-04-29 | 2019-05-24 | 中国药科大学 | 一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(hmzg)的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1344157A (fr) * | 1959-05-22 | 1963-11-29 | Roussel Uclaf | Nouvelles colchicines et leur procédé d'obtention |
JPS5233195B2 (pl) * | 1971-09-30 | 1977-08-26 | ||
GB8701381D0 (en) * | 1987-01-22 | 1987-02-25 | Erba Farmitalia | Antitumor agent |
IE70073B1 (en) * | 1990-12-14 | 1996-10-30 | Ainsworth Tech Inc | Communication system |
-
1996
- 1996-10-07 IT IT96MI002063A patent/IT1285777B1/it active IP Right Grant
-
1997
- 1997-10-02 SK SK445-99A patent/SK282344B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 JP JP51715598A patent/JP3428027B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 PT PT97911171T patent/PT931161E/pt unknown
- 1997-10-02 AU AU48648/97A patent/AU714810B2/en not_active Expired
- 1997-10-02 CZ CZ19991187A patent/CZ295451B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 EP EP97911171A patent/EP0931161B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 HU HU9903806A patent/HU224896B1/hu unknown
- 1997-10-02 DK DK97911171T patent/DK0931161T3/da active
- 1997-10-02 CA CA002252725A patent/CA2252725C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 AT AT97911171T patent/ATE213782T1/de active
- 1997-10-02 RU RU99109470/13A patent/RU2196826C2/ru active
- 1997-10-02 PL PL97331942A patent/PL187106B1/pl unknown
- 1997-10-02 ES ES97911171T patent/ES2171906T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 KR KR1019980710918A patent/KR100311067B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 WO PCT/EP1997/005429 patent/WO1998015642A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-02 CN CN97194493A patent/CN1094978C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 DE DE69710744T patent/DE69710744T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 US US09/230,116 patent/US6150140A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-04-06 NO NO19991633A patent/NO319286B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-10-27 HK HK99104800A patent/HK1019620A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL187106B1 (pl) | Sposób wytwarzania związków 3-O-glikozylokolchicynoidowych | |
Yoshimoto et al. | New anthracycline metabolites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1 I. Isolation and characterization of various blocked mutants | |
Blumauerová et al. | Studies on the production of daunomycinonederived glycosides and related metabolites in Streptomyces coeruleorubidus and Streptomyces peucetius | |
NO336051B1 (no) | Biotransformasjon av colchicinoidforbindelser | |
RU2218409C2 (ru) | Способ биотрансформации колхиконового соединения в соответствующее 3-0-гликозильное производное | |
JP4198883B2 (ja) | コルヒコン化合物を対応する3−グリコシル誘導体に生物学的に転換する方法 | |
Přikrylova et al. | Microbial transformation of semisynthetic derivatives of daunomycinone modified in ring a |