NO336051B1 - Biotransformasjon av colchicinoidforbindelser - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en biotransformasjonsprosess, effektuert ved hjelp av utvalgte mikrobestammer, for fremstillingen av 3-O-glykosylderivater av colchicinoidforbindelser.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer spesielt colchicinoidforbindelser glykosylert utelukkende ved C-3 på den aromatiske ringen A, som starter fra colchicin, tiocolchicin eller derivatene derav. Fremgangsmåten som resulterer i høy produktivitet og renhet av det oppnådde produktet, er basert på en tidlig aktivering av glykosyleringsenzymet, bestemt ved et demetylert colchicinin-termediat. Foretrukket består fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen av en multippel mate-batch-fermenteringsprosess, omfattende den fraksjonerte matingen av en nitrogenkilde, en karbonkilde og substratet som skal transformeres.

Colchicinoidforbindelsene glykosydert ved C-3 på benzenringen er av bemerkelses-verdig farmakologisk viktighet med hensyn til deres høye effektivitet og som inter-mediater for fremstillingen av nye medikamenter.

Spesielt er tiocolchicosid (3-O-glukosyltiocolchicin) en attraktiv og interessant aktiv ingrediens på det farmasøytiske området, hovedsakelig i terapien av sykdommer i muskel-skjelettsystemet, og som utgangsmaterialer for fremstillingen av ny anti-tumor, immunnedbrytende, antipsoriasis og antiinflammatoriske medikamenter.

WO 98/15642 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av colchicinoidglykosyl-derivater i høye konverteringsutbytter (opp til 90%), startende fra colchicinoidforbindelser slik som colchicin, tiocolchicin og derivater derav, med en opprinnelig konsentrasjon opp til 1 g/l. Fremgangsmåten er basert på et preliminært, regio-selektivt demetyleringstrinn av C-3-metoksygruppen bundet til den aromatiske ringen av colchicinoidet, og en etterfølgende glykosylering av demetylderivatet på det samme molekylsetet.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen tillater, samtidig som man opprettholder det samme konverteringsutbyttet som tidligere, transformasjonen av vesentlig større mengde av totalt substrat, som således forbedrer både den totale produktiviteten, uttrykt som den totale mengden av produkt oppnådd per liter per batch, og den spesifikke produktiviteten, uttrykt som mengden produkt oppnådd per liter per tidsenhet (dvs.: time) under biotransformasjonsprosessen. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedaktiveringsmekanismen av glykosyleringstrinnet, basert på induksjonen av det spesifikke enzymet. Det har faktisk overraskende blitt funnet at enzymet involvert i glykosyleringstrinnet effektivt induseres av demetylerte colchicinoider slik som 3-O-demetylcolchicin (DMC) eller 3-O-demetyltiocolchicin (DMTC). En tilsetning av små mengder (200-600 mg/l) av 3-demetylderivatet i de tidlige trinnene av biotransformasjonsprosessen, eller foretrukket i den preliminære utsåingskulturen, er nyttig for en tidlig aktivering av glykosyleringssystemet. Ved slik betingelse kan det demetylerte intermediatet, gradvis frigitt av demetyleringsenzymet, effektivt konverteres til det endelige glykosyl-derivatet, og biotransformasjonen kan fortsette svært raskt, i løpet av de første 15-18 timene av fermentering. Videre er det ingen signifikant akkumulering av intermediatet, dvs. ingen inhibering av demetyleringsaktiviteten og høy konver-teringshastighet. Biotransformasjonen er fullstendig etter 18-21 timer og er derfor vesentlig raskere enn den ifølge den kjente fremgangsmåten (26-28 timer). Konverteringsutbyttet forblir svært høyt, fra 80% til 100%, vanligvis omkring 90-95%, men med en vesentlig økning av totalt transformert substrat og følgelig av slutt-produkt.

Oppfinnelsen tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for fremstilling av 3-O-glykosylcolchicinoidforbindelser med formel (I),

hvori Ri er et O-glykosydresidu, R2er hydrogen eller C!-C7acyl, R3er Ci-C6alkoksy eller C!-C6tioalkyl, omfattende biotransformasjonen av forbindelser hvori Ri er metoksy ved hjelp av Bacillus megaterium, som er kjennetegnet ved at den omfatter multippel, fraksjonert mating av en forbindelse med formel (I) hvori Ri er metoksy i kombinasjon med en nitrogen- og karbonkilde, til en preliminær utsåingskultur inneholdende et demetylert colchicinoid anvendt for å indusere det glykosylerende enzymsystemet.

R]_ er foretrukket et O-glukosidresidu.

Pepton og glukose er egnet nitrogen- og karbonkilde. Denne betingelsen tillater, ved å sikre en stabil veksthastighet av mikrobedyrkingen, en relevant økning av det totale substratet tilsatt til fermenteringsbatchen (2-4 g/l, i stedet for 1 g/l) og føl-gelig av produktiviteten av fremgangsmåten (opp til 2,5-5,2 g/l av glykosylert produkt per enkelt batch, i stedet for 1-1,2 g/l), uten noe tap av konverteringseffekti-vitet og risiko for toksiske effekter på bakteriedyrking, grunnet en vesentlig akkumulering av det utransformerte substratet.

Den foreliggende oppfinnelsen er også fordelaktig når det gjelder den reduserte prosesstiden, som resulterer i en høy levedyktighet av dyrkingen og en begrenset cellelysis, med redusert celleavfallsdannelse og vesentlige fordeler for nedstrøms-prosesseringen og gjenvinningen av produktet. Denne fordelen kan ytterligere for-bedres ved anvendelsen av absorpsjonsresiner, som XAD 1180 (Rohm & Haas) eller HP 21 (Mitsubishi), nyttige for en selektiv absorpsjon av colchicinoidforbindelsene og en effektiv produktgjenvinning fra fermenteringsbuljongen.

En ytterligere fordel vedrører muligheten for en halvkontinuerlig fremgangsmåte, ved å gjenvinne hovedfraksjonen (75-90%) av den endelige fermenteringsbuljongen, inneholdende produktet, å tilsette nytt fermenteringsmedium til den gjenværende delen av buljongen i bioreaktoren, og å starte med en ny batch. Denne til-nærmingen kan utvides til gjentatte fermenteringstrinn, med en proporsjonal økning av den totale produktiviteten.

Videre sikrer den konstante regioselektiviteten av katalysen, i tillegg til de bemer-kelsesverdige produksjonsutbyttene, en høy kvalitet på det resulterende produktet, som tillater en renhet > 99% med en enkel nedstrømprosessering og en redusert forekomst av trinnet for rensing og gjenvinning av produktet. Dette aspektet impli-serer ytterligere fordeler når det gjelder løsemiddelbegrensning og høy miljømessig forenlighet av fremgangsmåten.

Bacillus megaterium-mikroorganismene anvendelige i den foreliggende oppfinnelsen, er de samme som beskrevet i WO 98/15642.

De kan velges fra forskjellige agar-media inneholdende en organisk nitrogenkilde (peptoner, gjære kst ra kter, kjøtte kst rakte r, asparagin, etc), en karbonkilde (glyserin, stivelse, maltose, glukose, etc), med pH 5 til 8, foretrukket 6-7. Inkubasjonstemperaturen strekker seg fra 20° til 45°C, fortrinnsvis 28-40°C.

Dyrkingsmedia anvendt for konserveringen av dyrkingen er typisk mikrobiologiske substrater, innholdende organiske nitrogenkilder (pepton, gjære kst rakte r, trypton, kjøtte kst rakte r, etc), en karbonkilde (glukose, maltose, glyserin, etc), ved pH 5 til 8, fortrinnsvis 6-7. Inkubasjonstemperaturen strekker seg fra 20 til 45°C, fortrinnsvis

28-40°C.

De valgte mikroorganismene kan testes for evnen til å vokse i undervannsdyrking, i nærvær av colchicinoidforbindelser, tilsatt som beskrevet i foreliggende oppfinnelse, og til å transformere sistnevnte til de tilsvarende 3-glykosylderivatene.

Assayene ble utført i 100 ml kolber inneholdende 20 ml flytende medium, med forskjellige mediumformuleringer, omfattende én eller flere organiske nitrogenkilder (gjærekstrakter, peptoner, trypton, kaseinhydrolysater, kjøttekstrakt, maisuttrekk, etc), én eller flere karbonkilder (glukose, glyserol, stivelse, sakkarose, etc), uorganiske fosfor- og nitrogenkilder og uorganiske salter av forskjellige ioner (K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn ++, etc).

Dyrkingsprøvene kan eventuelt underkastes mutagenbehandlinger, ved hjelp av de konvensjonelle mutagenteknikkene (bestråling med UV-stråler, etc.) for å indusere mutanter med en spesifikk biokonverteringsaktivitet som kan evalueres med den samme fremgangsmåten som over.

Det utvalgte bakterienes evne til å transformeres til de respektive 3-glykosylderivat colchicinoidsubstratene, tilsatt til dyrkingsbuljongen i gjentatte fraksjoner, sammen meden karbon- og en nitrogenkilde, har blitt bekreftet ved hjelp av biokonverte-ringsassayer i kolber, i en 300 ml skala, inneholdende forskjellige mediumformuleringer, omfattende én eller flere organiske nitrogenkilder (gjærekstrakter, peptoner, trypton, kaseinhydrolysater, kjøttekstrakt, maisuttrekk, etc), én eller flere karbonkilder (glukose, glyserol, stivelse, sakkarose, etc), uorganiske fosfor- og nitrogenkilder og uorganiske salter av forskjellige ioner (K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++, NH4+, etc).

Bakterievekst og biotransformasjon er støttet av én eller flere organiske nitrogenkilder, fortrinnsvis kjøttekstrakt, pepton, trypton, kaseinhydrolysater, maisuttrekk, etc. Karbonkilder nyttige for vekst og biotransformasjon er glukose, fruktose, sakkarose, glyserol, maltekstrakt, etc, fortrinnsvis glukose, fruktose og glyserol. Dyrkingsmediet inneholder videre uorganiske fosforkilder og salter av K+, Na+, Mg++, Mn++, NH4+, etc.

Karbonkilden nyttig i prosessmating er fortrinnsvis glukose og fruktose. Nitrogen-kilden for prosessmating er fortrinnsvis en organisk kilde, som pepton, kaseinhydrolysat, trypton eller en uorganisk slik som ammoniumsulfat eller en kombinasjon av begge.

Preliminære eksperimenter har vist at innføringen, før biotransformasjonstinnet, av en neddykket utsåingskultur, inneholdende en mediumformulering lik den av pro-duksjonsmediet, resulterer i en svært homogen og svært aktiv mikrobepopulasjon i begynnelsen av biotransformasjonen.

Ytterligere eksperimenter har blitt utført ved anvendelse av forskjellige fermente-ringsparametre, som mengde, tidspunkt og modalitet for substrattilsetning, ma-tingsforhold, inkubasjonstid, inokulasjonsforhold, etc.

En tidlig tilsetning av et demetylcolchicinoid som induser, i begynnelsen av bio-transformasjonstrinnet eller bedre under den preliminære utsåingskulturen, kan vesentlig øke konverteringseffektiviteten og den totale produktiviteten av prosessen.

Ytterligere økning kan oppnås ved å mate substratet som skal konverteres i flere fraksjoner i løpet av prosessen, i kombinasjon med en karbonkilde og en nitrogenkilde.

En typisk fremgangsmåte, som kombinerer parametrene beskrevet over, kan derfor være basert på følgende plan: en preliminær tilsetning av et 3-O-demetylcolchicinoid (200-600 mg/l, fortrinns vis 300-500 mg/l) i utsåingskulturen; tilsetning av alikvoter (300-800 mg/l, fortrinnsvis 500-600 mg/l) av colchicino idsubstratet som skal konverteres, i begynnelsen av hver 1-3 timer, fortrinnsvis 1,5-2,5 timer, i løpet av de første 14-18 timer, fortrinnsvis 15-16 timer biotransformasjon; tilsetning, ved hver substratmating, av en løsning inneholdende følgende råma terialer: a) pepton, eller trypton, eller kaseinhydrolysat, i en sluttkonsentrasjon på mellom 2 og 4 g/l, fortrinnsvis 2,5-3,5 g/l (også i kombinasjon med ammoniumsulfat

1-3 g/l, fortrinnsvis 1,5-2,5 g/l);

b) glukose eller fruktose, i en sluttkonsentrasjon på mellom 5 og 15 g/l, fortrinnsvis

8-12 g/l.

Tatt i betraktning en total fermenteringstid på 20 timer, vil en opprinnelig substrat-konsentrasjon på 500 g/l, et i-prosess matingsintervall på 2 timer og et totalt antall av 7 matingstrinn (siste substrattilsetning ved 14. fermenteringstime), en total substratmengde på 4 g/l (i stedet for 1 g/l, som beskrevet i WO 98/15642) tilsettes til kulturen.

Biotransformasjonen kan utføres ved 25-35°C, fortrinnsvis ved 28-32°C, ved pH mellom 4 og 8, fortrinnsvis 5-7, i omrørte kolber på en roterende rister.

Biotransformasjonen ifølge oppfinnelsen kan oppskaleres til fermenteringstanknivå, som holder dyrkingsbetingelsene uendret, spesielt når det gjelder dyrkingsmedium, temperatur og prosesseringstider. For å oppnå god vekst er passende nivåer av røre-ventilasjon viktig, spesielt er ventilasjonsnivåer på 1-2 liter luft per liter kultur per minutt (vvm), fortrinnsvis på 1,4-1,8 vvm, nødvendig. I slikt tilfelle er prosessen svært rask, og etter 20-21 timer er biotransformasjon fullstendig.

Produktet er ekstracellulært og kan ekstraheres fra dyrkingsbuljongen etter separa-sjon av biomassen fra væskefraksjonen ved sentrifugering og gjenvinning av supernatanten, eller mikrofiltrering og gjenvinning av permeatet. Kulturen kan be-handles med alkoholer når det gjelder optimal gjenvinning av produktet.

Rensingen kan utføres ved kromatografiske teknikker, væske-væske-ekstraksjon med alkoholer og lipofile organiske løsemidler og krystallisering, som beskrevet i WO 98/154621.

Følgende eksempler beskriver oppfinnelsen mer detaljert.

Eksempel 1

En alikvot av frossen kultur av Bacillus meqaterium anvendes for inokulasjon av utsåingskulturer (dvs.: predyrking) i 1000 ml Erlenmeyer-kolbe, inneholdende 250 ml medium SF2 (tabell), tilsatt 3-O-demetyltiocolchicin til en 0,4 g/l sluttkonsentrasjon. Kulturene inkuberes natten over ved 30°C, på en roterende rister ved 250 rpm. Etter inkubasjon overføres 500 ml prekultur sterilt til en 14 I fermenterer, inneholdende 9,5 I friskt medium SF2 (se tabell 1), tilsatt med tiocolchicin til en 0,5 g/l sluttkonsentrasjon. Fermenteringen utføres ved 30°C, som holder passende nivåer av røring-ventilasjon (omrøring opp til 900 rpm; ventilasjon 1 til 1,8 vvm, av-hengig av dyrkingsveksten). Hver 2. time settes tiocolchicin (0,5 g/l sluttkonsentrasjon), pepton (2 g/l), ammoniumsulfat (2 g/l) og glukose (10 g/l) til kulturen, i lø-pet av de første 14 timene fermentering. Før hver tilsetning (dvs.: hver 2. time) tas det prøver fra dyrkingsbuljongene og de underkastes følgende analyse: vekstnivå, som optisk densitet (OD) ved 600 nm;

sterilitets- og ren hetsa na lyse av stammen på LB Agar;

mikroskopmorfologi (Gram-farging);

analyse av tiocolchicosidinnholdet, med TLC og HPLC.

TLC-analyse utføres på silikagel, med et aceton:etylacetat:vann 5:4:1 eluentsys-tem. For HPLC-analysen, settes 1 ml fraksjoner av dyrkingsbuljongene til 9 ml metanol og sentrifugeres ved 13 000 rpm i 2 minutter. Innholdet i tiocolchicosid av supernatanten analyseres ved revers fase HPLC, med isokratisk eluering, ved hjelp av vann:acetonitril 80:20 eluentsystemet. HPLC-analyse viser at konverteringen av tiocolchicin til tiocolchicosid starter svært tidlig og er nesten fullstendig etter 20 timer. En total mengde på 4 g/l tiocolchicin transformeres til 5,2 g/l tiocolchicosid, med et 96% konverteringsutbytte og en spesifikk produktivitet på 0,26 g/l.h av glukosylert colchicinoid.

Eksempel 2

Den endelige dyrkingsbuljongen fra fermenteringen (totalt volum: ca. 10 I), inneholdende ca. 52 g tiocolchicosid som bestemt ved HPLC-analyse, underkastes en kryss-strøm-mikrofiltrering på en 0,22 pm keramisk patron, for å separeres cellene fra buljongen. Permeatet absorberes på en kolonne fylt med en XAD 1180 (Rohm & Haas) absorpsjonsresin. Etter vasking med vann eluderes produktet med metanol. Metanoleluatet konsentreres til tørrhet under vakuum, deretter gjenoppløses det i metanol. Etter ekstraksjon med metylenklorid konsentreres alkoholfraksjonen til tørrhet og gjenoppløses i en etanol-metylenklorid, l:l-blanding. Etter klaring med silikagel konsentreres løsningen under vakuum; metylenklorid erstattes deretter med etanol. Den resulterende suspensjonen konsentreres og levnes til å krystallise-res. En andre krystallisering med etanol utføres etter ytterligere gjenoppløsnings-trinn av faststoffet i etanol-kloroformblandinger og klaring på silikagel. En total mengde på 49,9 g produkt oppnås etter rensing, med et renseutbytte på 96% og en renhet på 99,5%.

Det resulterende produktet, analysert med HPLC, C-NMR, H-NMR og massespekt-rum, ser ut til å være det samme som tiocolchicosidstandarden.

Sammenliqninqseksempel 3

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 gjentas, men tiocolchicin tilsettes fullstendig i en enkel fraksjon, i en sluttkonsentrasjon på 4 g/l, i begynnelsen av fermenteringen. Den resulterende veksten er svært dårlig og blokkeres praktisk talt etter noen få timers inkubasjon. Tydelig cellelysis påvises ved mikroskopanalyse. Ingen signifikant biotransformasjon vises ved TLC- og HPLC-analyse.

Sammenliqninqseksempel 4

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 gjentas, men uten noen tilsetning av 3-0-demetyltiocolchicin i den preliminære utsåingskulturen (ingen enzyminduksjon). Biotransformasjon resulterer langsommere enn den i eksempel 1, og stoppes etter 28 timer, med et endelig konverteringsutbytte på 61%, en total produktivitet på 3,3 g/l og en spesifikk produktivitet på 0,118 g/l.h av tiocolchicosid.

Sammenliqninqseksempel 5 ( tilsvarende WO 98/ 15462)

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4 repeteres, men tiocolchicin tilsettes fullstendig i en enkel fraksjon, i en sluttkonsentrasjon på 1 g/l, i begynnelsen av fermenteringen, ved anvendelse av fermenteringsmedium ST som beskrevet i W098/15462. Biotransformasjon resulterer langsommere enn i eksempel 1, og stoppes etter 28 timer, med et endelig konverteringsutbytte på 90%, en total produktivitet på 1,22 g/l og en spesifikk produktivitet på 0,044 g/l.h tiocolchicosid.

Følgende tabell viser en sammenligning uttrykt som total produktivitet, spesifikk produktivitet og konverteringsutbytte av tiocolchicin til tiocolchicosid, mellom fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse (A) og den i WO098/15642 (B).

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av 3-0-glykosylcolchicinoid-forbindelser med formel (I),

hvori Ri er et O-glykosydresidu, R2er hydrogen eller C1-C7acyl, R3er Ci-C6alkoksy eller Ci-C6tioalkyl, omfattende biotransformasjonen av en forbindelse med formel (I) hvori Ri er OH eller metoksy ved hjelp av Bacillus megaterium,karakterisert vedat den omfatter multippel, fraksjonert mating av en forbindelse med formel (I) hvori Ri er metoksy i kombinasjon med en nitrogen- og karbonkilde, til en preliminær utsåingskultur inneholdende et demetylert colchicinoid anvendt for å indusere det glykosylerende enzymsystemet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori det demetylerte colchicinoidet velges fra 3-O-demetylcolchicin (DMC) eller 3-O-demetyltiocolchicin (DMTC).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori det demetylerte colchicinoidet tilsettes i en mengde på 200-600 mg/l.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 1-3, hvori nitrogen- og karbonkilden er pepton og glukose.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst krav 1-4, hvori det totale substratet tilsatt til fermenteringsbatchen er på 2-4 g/l.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 1-5, hvori gjenvinningen av produktet utføres ved hjelp av absorpsjonsresiner.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 1-6, utført i en halvkontinuerlig prosess, ved å gjenvinne hovedfraksjonen (75-90%) av den endelige fermente ringsbuljongen, inneholdende produktet, å tilsette nytt fermenteringsmedium til den gjenværende delen av buljongen i bioreaktoren, og å starte med en ny batch.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 1-7, omfattende: en preliminær tilsetning av et 3-O-demetylcolchicinoid i utsåingskulturen; tilsetning av alikvoter av 300-800 mg/l av colchicinoidsubstratet som skal konverteres, i begynnelsen og hver 1-3 time, i løpet av de første 14-18 timene biotransformasjon; tilsetning, ved hver substratmating, av en løsning inneholdende følgende råmaterialer: a) pepton, eller trypton, eller kaseinhydrolysat, i en sluttkonsentrasjon på 2-4 g/l, i kombinasjon med 1-3 g/l ammoniumsulfat; b) glukose eller fruktose, i en sluttkonsentrasjon på 5-15 g/l.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av krav 1-8, hvori biotransformasjonen utføres ved 25-35°C, ved pH mellom 4-8.

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av krav 1-9, hvori ventileringsnivåene på 1-2 liter luft per liter dyrking per minutt (vvm) anvendes.