KR101116424B1 - 콜키시노이드 화합물들의 생체내변환방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 콜키시노이드(colchicinoid) 화합물들의 3-오-글리코실 유도체(3-O-glycosyl derivatives)의 제조를 위한, 선택된 미생물 균주에 의하여 성취되는 생체내변환(효소법 ; biotransformation) 공정에 관한 것이다.
콜키시노이드(colchicinoid), 생체내변환(biotransformation)

Description

콜키시노이드 화합물들의 생체내변환방법{BIOTRANSFORMATION OF COLCHICINOID COMPOUNDS}
본 발명은 콜키시노이드(colchicinoid)의 3-오-글리코실(3-O-glycosyl) 유도체들을 제조하기 위한, 선택된 미생물 균주들에 의한 생체내변환(biotransformation) 공정에 관한 것이다.
자세하게는, 본 발명의 공정은 콜키신(colchicine), 티오콜키신(thiocolchicin) 또는 그의 유도체들에서 시작하는 방향족 고리 A의 C-3 위치에 배타적으로 글리코실화된 콜키시노이드(colchicinoid) 화합물을 제공한다. 공정은 획득된 산물의 높은 생산성과 순도를 가져오며, 탈메틸화된 콜키신(chlchicine) 중간체에 의해 확인된, 글리코실화 효소의 초기 활성화에 기초가 된다. 바람직하게는, 발명의 공정은 질소원(nitrogen source), 탄소원(carbon source) 그리고 변형될 기질(substrate)의 분획된 공급으로 이루어지며, 복합 공급 뱃치(multiple feed-batch) 발효 공정으로 구성된다.
벤젠 고리(benzene ring)에 C-3 위치에서 글리코실화된 콜키시노이 드(colchicinoid) 화합물은 그들의 높은 효과 유효성의 관점과, 새로운 약물들의 제조 중간체로서, 주목할만한 약제학적 중요성이 있다.
특히, 티오콜키코사이드(thiocolchicoside)(3-오-글루코실티오콜키신)(3-O-glucosylthiocolchicine)은 주로 근골격계(muscle-skeletal system) 질환의 치료와, 신규한 항종양(antitumor), 면역억제(immunosuppressive), 항건선(antipsoriasis) 그리고 항염증(antiinflammatory) 약물들의 제조를 위한 출발물질로 약제학적 분야에서 관심과 흥미가 있는 활성 성분이다.
WO 제98/15642호에는 초기 농도가 1 g/l에 이르는, 콜키신(colchicine), 티오콜키신(thiocolchicine) 그리고 그들의 유도체와 같은 콜키시노이드(colchicinoid) 화합물들에서 시작하는 높은 변환 수득률(90 %에 이르는)의 콜키시노이드 글리코실-유도체(colchicinoid glycosyl-dericatives)의 생산을 위한 공정이 개시되어있다. 공정은 콜키시노이드(colchicinoid)의 방향족 고리에 결합된 C-3 메톡시 그룹(methoxy group)의 위치선택적 탈메틸화 단계와, 같은 분자 부위의 탈메틸(demethyl) 유도체의 계속적인 글리코실화(glycosylation) 단계의 예비적으로 기초가 된다.
본 발명의 공정은, 전자(the former)의 같은 높은 변형 수득률(conversion yield)이 지속하는 동안, 전체기질의 현저히 많은 양의 변형이 일어나며, 뱃치 리터당 획득된 산물의 총량으로 표시된 총생산성(total productivity)과, 생물변형 공정 동안 시간 단위(예를 들어 : 시간(hour)) 리터당 획득된 산물의 양으로 표시된 특이생산성(specific productivity) 모두를 개선시켰다.
발명의 공정은 글리코실화 단계의 활성 메카니즘(mechanism)의 특징이 있고, 특정 효소의 도입에 근거를 둔다. 실제로, 3-오-데메틸콜키신(3-O-demethylcolchicine)(DMC) 또는 3-오-데메틸티오콜키신(3-O-demethylthiocolchicine)(DMTC)과 같은 탈메틸화된 콜키시노이드류(colchicinoids)에 의해 효과적으로 유도된 글리코실화 단계에서 수반된 효소가 놀랍게 발견됐다. 생체내변환(biotransformation) 공정의 초기 단계, 또는 되도록이면 예비 종배양(preliminary seed culture)에서, 3-데메틸 유도체(3-demethyl derivative)의 적은 양(200 - 600 mg/l)의 추가는 글리코실화 방식의 초기 활성화에 유용하다. 이러한 상태에서, 탈메틸화 효소에 의해 단계적으로 방출된 탈메틸화된 중간체는 최종 글리코실-유도체(glycosyl-derivative)로 효과적으로 전환될 수 있고, 생체내변환(biotransformation)은 발효의 최초 15 - 18 시간 동안 매우 빠르게 진행될 수 있다. 더욱이 이들은 중간체의 중대한 축적이 없고, 그것은 탈메틸화 활성과 높은 변환 비율의 억제가 없다는 것을 의미한다. 생체내변환(biotransformation)은 18- 21 시간 후에 완료되고, 따라서, 공지된 공정(26 - 28 시간)의 변환보다 꽤 빠르다. 변형 수득률(conversion yield)은 80 - 100 %로, 보통 약 90 - 95 %로 매우 높으나, 전체 변형된 기질의 현저한 증가로 그 결과로 최종 산물의 현저한 증가를 보인다.
따라서, 본 발명은 탈메틸화된 콜키시노이드류(colchicinoids)의 글리코실화 효소 체계를 도입하는데 특징적으로 사용되는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 의해 R1이 OH 또는 메톡시(methoxy)인 화합물의 생체내변환(biotransformation)을 시키는 것으로 구성된, 구조식(Ⅰ)의 3-오-글리코실콜키시노이드(3-O-glycosylcolchicinoid) 화합물의 제조를 위한 공정을 제공한다.
Figure 112006082061052-pct00001
상기식에서, R1은 오-글리코사이드 잔기(O-glycosyde residue)이고, R2는 수소(hydrogen) 또는 C1-C7 아실(acyl)이며, R3은 C1-C6 알콕시(alkoxy) 또는 C1-C6 티오알킬(thioalkyl)이다.
R1은 바람직하게는 오-글루코사이드(O-glucoside) 잔기이다.
발명의 공정의 바람직한 태양은, 펩톤(pepton)과 글루코스(glucose)같은, 질소(nitrogen)와 탄소(carbon) 원으로 조합된 기질의 복합, 분획된 공급으로 구성된다. 이런 조건은, 미생물 배양(micobial culture)의 안정된 성장 비율의 확신에 의해, 미변환 기질(untransformed substrate)의 현저한 축적에 기인한, 박테리아 배양(bacterial culture) 상에서 변환 능률의 어떤 손실과 독성 효과의 위험 없이, 발효 뱃치(batch)(1 g/l 대신 2 - 4 g/l)에 첨가된 총기질의 상대적 증가가 오고, 결과적으로 제조공정상의 생산성이 증가된다(1 - 1,2 g/l 대신 글리코실화된 산물 단일 뱃치 당 2,5 - 5,2 g/l 까지).
본 발명은 감소된 세포 파편 형성으로, 배양의 높은 생존력과 한정된 세포 용해로 공정의 시간을 줄이는 관점에서 또한 유리하고, 하위 공정과 산물의 회수를 위한 중요한 이점이 있다. 이런 장점은 콜키시노이드(colchicinoid) 화합물의 선택적 흡수와 발효 영양액(broth)에서 효과적인 산물 회수에 유용한, XAD 1180(롬 & 하스(Rohm & Haas)) 또는 HP 21(미스비시(Mitsubishi))와 같은, 흡수 수지(resins)의 사용에 의해 보다 개선될 수 있다.
더욱이 장점으로 산물을 포함하는 최종 발효 영양액(broth)의 주요 분획(75 - 90 %)의 회수로, 생물반응기(bioreactor)에서 발효 영양액(broth)의 남은 부분에 새로운 발효 배지의 첨가 그리고 새로운 뱃치(batch)의 시작으로, 반-연속(semi-continuous) 공정의 가능성과 관계가 있다는 것이 이런 접근은 전체 생산성의 비례적인 증가로, 반복된 발효 단계들로 확장되는 것이 가능하다.
더우기 촉매의 부위선택성(regioselectivity)은, 주목할만한 생산 수득률, 얻어진 산물의 높은 순도, 단순한 하위 공정으로 순도 ≥ 99 %가 보장될 수 있으며, 산물의 정제와 회수의 단계의 영향이 적다. 이 장점은 공정의 용매 제한과 높은 환경 적합성 면에서 그 이상의 장점들을 의미한다.
본 발명에서 사용가능한 바실러스 메가테리움 미생물들(Bacillus megaterium microorganisms)은 여기 참고문헌으로 구체화된 WO 제98/15642호에 설명되어 있다.
그들은 pH 5 - 8, 되도록이면 6 - 7에서 유기 질소원(nitrogen source)(펩톤(peptones), 이스트 추출물(yeast extracts), 고기 추출물(meat extracts), 아스파라긴(asparagine), 등), 탄소원(carbon source)(글리세린(glycerin), 전분(starch), 말토스(maltose), 글루코스(glucose), 등)을 포함하는 특이한 한천 메디아(agar media) 중에서 선택될 수 있다. 항온 온도(incubation temperature)는 20 - 45 ℃, 바람직하게는 28 - 40 ℃의 범위이다.
배양의 보호를 위해 사용되는 배양 배지(culture media)는 pH 5 - 8, 되도록이면 6 - 7로 유기 질소원(nitrogen sources)(펩톤(peptones), 이스트 추출물(yeast extracts), 트립톤(tryptone), 고기 추출물(meat extracts), 등), 탄소원(carbon source)(글루코스(glucose), 말토스(maltose), 글리세린(glycerin), 등)을 포함하는 전형적인 미생물학적인 기질들이다. 항온 온도는 20 - 45 ℃, 되도록이면 28 - 40 ℃의 범위이다.
선택된 미생물은 본 발명에 설명된 것처럼, 첨가된 콜키시노이드(colchicinoid) 화합물들의 존재 하, 심부 배양(submerged culture)에서 성장능력과 후자를 대응하는 3-글리코실 유도체들(3-glycosyl derivatives)로의 변형능력으로 평가(assay)될 수 있다.
상기 언급된 평가(정량)들은 하나 또는 그 이상의 유기 질소원(nitrogen sources)(이스트 추출물(yeast extracts), 펩톤(peptones), 트립톤(tryptone), 카세인 가수분해물(casein hydrolysates), 고기 추출물(meat extracts), 옥수수액(corn- step liquor), 등), 하나 또는 그 이상의 탄소원(carbon sources)(글루코스(glucose), 글리세롤(glycerol), 전분(starch), 사카로스(saccharose), 등), 무기 인(phosphorous) 및 질소원(nitroven sources), 그리고 다양한 이온들의 무기염들(K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++, 등)로 구성된 특이한 배지조성으로, 액체 배지(medium) 20 ml를 포함하는 100 ml 플라스크에서 수행되었다.
배양 샘플들(culture samples)은 위에서처럼 같은 순서로 평가될 수 있는 특이한 생물 변환 활성(specific bioconversion activity)을 갖는 돌연변이(mutants)를 유발하는 관용의 돌연변이유발 기술(mutagenesis techniques)에 의해 돌연변이 처리를 임의적으로 실시할 수 있다.
탄소(carbon)와 질소(nitrogen) 원이 함께, 반복된 분획물 중에서 배양 영양액(broth)에 첨가된, 각각의 3-글리코실(3-glycosyl) 유도체들의 콜키시노이드(colchicinoid) 기질들로 변형되는 선택된 박테리아(bacteria)의 능력은 하나 또는 그 이상의 유기 질소원(nitrogen sources)(이스트 추출물(yeast extracts), 펩톤(peptones), 트립톤(tryptone), 카세인 가수분해물(casein hydrolysates), 고기 추출물(meat extracts), 옥수수액(corn- step liquor), 등), 하나 또는 그 이상의 탄소원(carbon sources)(글루코스(glucose), 글리세롤(glycerol), 전분(starch), 사카로스(saccharose), 등), 무기 인(phosphorous) 및 질소원(nitroven sources), 그리고 다양한 이온들의 무기 염들(K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++, NH4+, 등)로 구성된 특이한 배지 조성을 포함하는, 300 ml 크기의 플라스크에서 생물변환 분석으로 확인되었다.
박테리아 성장과 생체내변환(biotransformation)은 하나 또는 그 이상의 유기 질소원(nitrogen sources), 바람직하게는 고기 추출물(meat extracts), 펩톤(peptones), 트립톤(tryptone), 카세인 가수분해물(casein hydrolysates), 옥수수액(corn- step liquor), 등에 의해 지지된다. 성장과 생체내변환(biotransformation)에 유용한 탄소원(carbon sources)은 글루코스(glucose), 과당(fructose), 사카로스(saccharose), 글리세롤(glycerol), 엿기름 추출물(malt extract), 등이고, 바람직한 것은 글루코스(glucose), 과당(fructose), 글리세롤(glycerol)이다. 배양 배지(culture medium)은 또한 K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++, NH4+, 등의 염과 무기 인 원(phosphorous sources)을 추가로 포함한다.
공급 공정에서 유용한 탄소원(carbon sources)은 바람직하게는 글로코스(glucose)와 과당(fructose) 이다. 공급 공정을 위한 질소원(nitrogen sources)은 바람직하게는 펩톤(peptones), 카세인 가수분해물(casein hydrolysates), 트립톤(tryptone)과 같은 유기원(source) 또는 암모니움 설페이트(ammonium sulphate)와 같은 무기원, 또는 이 둘의 조합물이다.
예비 실험은 생체내변환(biotransformation)의 초기에 매우 균질하고 높은 활성의 미생물 개체군에서 생기는 생산 배지(medium)것과 유사한 배지(medium) 조성을 포함하는 심부 종배양(seed culture)의 생체내변환(biotransformation) 단계 전에 도입을 보여준다.
부가적 실험은, 기질 부가물의 양(amount) 시간과 양상, 공급 비율, 배양 시간, 접종물 비율 등과 같은 특이한 발효 파라미터(parameters)를 사용하여 실행됐다.
생체내변환(biotransformation) 단계의 초기 또는 보다 나은, 예비 종 배양 동안에, 유도물질로 데메틸 콜키시노이드(demethyl colchicinoid)의 초기 첨가는 변환 능률과 공정의 전체 생산성을 상당히 증가시킬 수 있다.
추가적 증가가 탄소원(carbon source)과 질소원(nitrogen source)의 조합으로 공정 동안에 많은 분획들로 전환될 수 있는 기질의 공급에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 위에 설명된 파라미터(parameters)를 포함하는 전형적인 절차는 다음 계획에 따라 수행될 수 있다 :
- 종배양에 3-오-데메틸 콜키시노이드(3-O-demethyl colchicinoid)(200 - 600 mg/l, 바람직하게는 300 - 500 mg/l)을 예비 첨가하고 ;
- 생체내변환(biotransformation)의 초기와 매 1 - 3 시간, 바람직하게는 1,5 - 2,5 시간, 전반 14 - 18 시간, 되도록이면 15 - 16 시간 동안에 전환될 수 있는 콜키시노이드(colchicinoid) 기질의 분취량(aliquot)(300 - 800 mg/l, 바람직하게는 500 - 600 mg/l)을 첨가하며,
- 다음 원료 재료들(raw materials)을 함유하는 용액을 기질 공급의 각각의 시간에 첨가한다 :
a) 최종 농도가 2 - 4 g/l, 되도록이면 2,5 - 3,5 g/l에서 펩톤(peptones) 또는 트립톤(tryptone) 또는 카세인 가수분해물(casein hydrolysates)(암모니움 설페이트(ammonium sulphate) 1 - 3 g/l, 바람직하게는 1,5 - 2,5 g/l으로 조합)을 가하고 ;
b) 최종 농도가 5 - 15 g/l, 되도록이면 8 - 12 g/l에서 글루코스(glucose) 또는 과당(fructose)을 가한다.
20 시간의 전체 발효 시간을 고려할 때, 500 g/l의 최초 기질 농도가, 2시간의 공정간 공급 간격으로 가하고, 7개 공급 단계들의 전체 수(14 번째의 발효 시간에 마지막 기질 첨가), 전체 기질 양이 4 g/l(WO 제98/15642호에 설명된 것처럼, 1 g/l 대신)이 되도록 배양에 첨가될 것이다.
생체내변환(biotransformation)은 25 - 35 ℃, 되도록이면 28 - 32 ℃, pH 4 와 8 사이, 바람직하게는 5 - 7에서 회전 교반기(rotary shaker) 상에서 휘졌는 후라스크 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 생체내변환(biotransformation)은, 특히 배양 배지(medium), 온도와 공정 시간이 관계되는 한에서, 배양 상태를 그대로 유지하면서, 발효 탱크의 수준을 늘리는 것이 가능하다. 우수한 성장물을 얻기 위해, 충분한 수준의 교반-통기(stirring-aeration)가 중요한데, 특히 분당 배양의 리터(litre) 당 공기의 1 - 2 리터(litres)의 통기 수준(vvm), 바람직하게는 1,4 - 1,8 vvm이 요구된다. 그런 상태의 공정은 매우 빠르고, 20 - 21 시간 후 생체내변환(biotransformation)이 완결된다.
산물은 외부세포질(extracellular)이고, 원심분리와 상등액(supernatant)의 회수, 또는 미세여과와 침투의 회수에 의해 액체 분획에서 바이오매스(biomass)를 분리 후에 배양 영양액(broth)에서 추출될 수 있다. 배양은 산물의 최적 회수를 고려해 알코올(alcohols)로 처리될 수 있다.
정제(purification)는 WO 제98/154621호에 설명된 것처럼, 크로마토그래피 기술(chromatographic techniques)인, 알코올(alcohols)과 친유성 유기용매(lipophylic organic solvents)로 액체-액체(liquid-liquid) 추출을 수행한 후, 결정화하는 것이다.
다음의 실시예들은 발명을 보다 자세하게 설명한다.
실시예 1
바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)의 냉동된 배양의 분취량(aliquot)을 최종 농도 0,4 g/l의 3-오-데메틸티오콜키신(3-O-demethylthiocolchicine)이 되도록 첨가된 배지 SF2 250 ml(표)를 포함하는 1000 ml 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)에 종배양의 접종(예를 들어 : 예비배양(preculture))을 위해 활용되었다. 언급된 배양은 30 ℃에, 교반 회전기 상에서, 250 rpm으로 밤새 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션 후, 500 ml의 전배양물(preculture)을 9,5 l의 신선한 배지(medium) SF2(표 1 보기)를 담은 14 l 발효조(fermenter) 안으로 무균상태로 옮기고, 최종 농도 0,5 g/l이 되도록 티오콜키신(thiocolchicine)을 첨가하였다. 발효는 30 ℃에서, 교반-통기(stirring-aeration)의 적당한 수준을 유지하면서 수행되었다(배양 성장에 의존, 900 rpm으로 교반 ; 1 - 1.8 vvm 통기). 매일 2시간 티오콜키신(thiocolchicine)(최종 농도 0,5 g/l), 펩톤(pepton)(2 g/l), 암모니움 설페이트(ammonium sulphate)(2 g/l) 그리고 글루코스(glucose)(10 g/l)를, 발효의 전반 14 시간 동안, 배양에 첨가시켰다. 배양 영양액(broths)에서 샘플들 각각의 첨가(예를 들어 매일 2시간) 전에 취하고, 다음 분석을 실시하였다 :
- 600 nm에서 광학 밀도(optical density)(OD)로 성장 수준 분석 ;
- LB Agar 상의 균주(strain)의 무균(sterility)과 순도 검사 ;
- 현미경 형태학(microscope morphology)(Gram stain) 분석 ;
- TLC와 HPLC에 의한 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 함유량의 분석.
TLC 분석은 아세톤(acetone) : 에틸아세테이트(ethylacetate) : 물(water) 5 : 4 : 1 용리액 방식으로 실리카겔(silica gel) 상에서 수행된다. HPLC 분석을 위해, 배양 영약액(broths)의 1 ml 분획을 9 ml의 메탄올(methanol)에 첨가시키고, 2 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리시켰다.
상등액(supernatant) 중의 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 함유량을 물(water) : 아세토니트릴(acetonitril) 80 : 20 용리액 방식에 의해 등용매 용리(isocratic elution)로 역상(reverse phase) HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 티오콜키신(thiocolchicine)의 티오콜키코사이드(thiocolchicoside)로의 변환은 매우 초기에 시작되고, 20 시간 후 대부분 완료된다는 것이 증명되었다. 티오콜키신(thiocolchicine) 4 g/l의 전체 양은 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 5,2 g/l로 변형되었고 변환 수득률 96 %에 해당하며, 글루코실화된 콜키시노사이 드(colchicinoid) 0,26 g/l.h의 특유한 생산성을 보였다.
실시예 2
HPLC 분석으로 측정된 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 52 g 을 함유하는 발효(전체 부피 : 약 10 l)에서 얻은 최종 배양 영양액(broth)을, 영양액(broth)에서 세포들을 분리하기 위해 0.22 μm 세라믹 카트리지(ceramic cartridge) 상에서 크로스-후로(cross-flow) 미세여과(microfiltration) 시켰다. 투과물(permeate)은 XAD 1180(롬과 하스(Rohm and Haas) 흡수 수지(resin)로 채워진 컬럼(column) 상에서 흡수시켰다. 물로 세척 후, 산물은 메탄올(methanol)로 용리시킨다. 메탄올(methanol) 용리는 진공 하에서 건조상태로 농축시키고, 다음 메탄올(methanol)에 재용해시킨다. 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)로 추출 후, 알코올(alcohol) 분획물을 건조상태로 농축시키고, 에탄올(ethanol)-메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 1 : 1 혼합물에서 재용해시킨다. 실리카겔(silica gel)로 정제 후, 용액을 진공 하에서 농축시킨다 ; 다음 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)는 에탄올(ethanol)로 대치시킨다. 얻어진 현탁액을 농축시키고, 결정화를 위해 남겨진다. 에탄올(ethanol)로 두 번째 결정화는 에탄올(ethanol)-클로로포름(chloroform) 혼합물에서 고체의 추가적인 재용해 단계 수행과 실리카겔(silica gel) 상의 정제를 실시하였다. 산물 49,9 g의 전체 양이 얻어졌고, 96 %의 정제 수륵률에 해당하며, 99.5 %의 순도를 보였다.
얻어진 산물을 HPLC, C-NMR, H-NMR 그리고 질량 스펙트럼(mass spectrum) 분 석을 실시하였는바, 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 표준품과 동일하였다.
비교 실시예 3
실시예 1에 설명된 방법은 반복하지만, 티오콜키신(thiocolchicine)을 발효 초기에 최종 농도가 4 g/l에서 단일 분획물 중에 완전히 첨가시켰다. 얻어진 성장물은 매우 열악하고, 인큐베이션 몇 시간 후 실제적으로 성장이 차단됐다. 분명한 세포 용해가 현미경 분석에 의해 발견되었다. 중요한 생체내변환(biotransformation)가 없다는 것이 TLC와 HPLC 분석에 의해 밝혀졌다.
비교 실시예 4
실시예 1에 설명된 방법으로 반복되지만, 예비 종배양(효소 도입 없는)에서 3-오-데메틸티오콜키신(3-O-demethylthiocolchicine)의 어떠한 첨가도 없었다. 생체내변환(biotransformation)은 실시예 1의 그것보다 느리게 일어나고, 최종 변화 수득률은 61 %, 전체 생산성은 3,3 g/l, 그리고 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 특유의 생산성은 0,118 g/l.h로, 28시간 후에 정지되었다.
비교 실시예 5(WO 제98/15462호와 유사)
실시예 4에 설명된 방법으로 반복되지만, 티오콜키신(thiocolchicine)은 WO 제98/15462호에 설명된 것처럼 발효 배지(medium) ST를 사용하여 발효의 초기에 최종 농도 1 g/l의 단일 분획물 중에 전부 첨가시켰다. 생체내변 환(biotransformation)은 실시예 1의 그것보다 느리게 일어나고, 최종 변화 수득률은 90 %, 전체 생산성은 1,22 g/l, 그리고 티오콜키코사이드(thiocolchicoside) 특유의 생산성은 0,044 g/l.h로, 28시간 후에 정지되었다.
다음 표는 본 발명의 방법(A)과 WO 제98/15642호의 방법(B) 사이의 전체 생산성, 특유의 생산성과 티오콜키신(thiocolchicine)에서 티오콜키코사이드(thiocolchicoside)로의 변환 수득률에 의하여 비교를 보여준다.

생산성(전체) g/l
생산성(특유) g/l
변환 수득률 %

A*
5,22
0,261
96

B*
1,22
0.044
90
* 기질(티오콜키신(thiocolchicine)) 첨가 ; 4 g/l(A) ; 1 g/l(B)
표 1
배양 배지(media)의 조성
1) LB-Agar(살균 : 121 ℃ × 20,) - pH 7
트립톤(Triptone) 10 g/l
이스트 추출물(Yeast extract) 5 g/l
NaCl 10 g/l
한천 한천(Agar Agar) 15 g/l
2) Broth SF2(살균 : 121 ℃ × 20,) - pH 7
글루코스(Glucose) 40 g/l
펩톤(Pepton) 20 g/l
이스트 추출물(Yeast extract) 5 g/l
NaCl 3 g/l
(NH4)2SO4 3 g/l
K2HPO4 8 g/l
KH2PO4 3 g/l
MgSO4?7H2O 0,5 g/l

Claims (12)

  1. 하기 구조식(Ⅰ)의 글리코실콜키시노이드 화합물(3-O-glycosylcolchicinoid compounds)의 제조 방법에 있어서,
    Figure 112011051424709-pct00003
    (Ⅰ)
    (상기식에서, R1은 오-글리코시드(O-glycosyde) 잔기이고, R2는 수소(hydrogen) 또는 C1-C7 아실(acyl)이며, R3은 C1-C6 알콕시(alkoxy) 또는 C1-C6 티오알킬(thioalkyl)이다.)
    바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)을 사용하여, R1이 메톡시(methoxy)인 구조식(Ⅰ) 화합물을 질소원 및 탄소원과 조합시키고, 다수회 분할하여, 글리코실화 효소계를 유도하기 위하여 사용되는 3-오-데메틸콜키신(3-O-demethylcolchicine, DMC) 또는 3-오-데메틸티오콜키신(3-O-demethylthiocolchicine, DMTC) 중에서 선택된 데메틸화된 콜키시노이드를 함유하는 예비 종배양액(preliminary seed culture)에 공급함을 특징으로 하는 하기 구조식(Ⅰ)의 3-오-글리코실콜키시노이드 화합물(3-O-glycosylcolchicinoid compounds)을의 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 200 - 600 mg/l의 범위 양으로 3-오-데메틸콜키신(3-O-demethylcolchicine, DMC) 또는 3-오-데메틸티오콜키신(3-O-demethylthiocolchicine, DMTC)을 첨가시키는 방법.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 질소원은 펩톤(peptone)이고, 탄소원은 글루코스(glucose)인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, R1이 메톡시(methoxy)인 구조식(Ⅰ) 화합물 전체가, 2 - 4 g/l 되도록 발효 뱃치(batch)에 첨가하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 생성물 회수(recovery of the product)를 흡수 수지(absorption resins)를 사용하여 수행하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 생성물(product)을 포함하는 최종 발효 배지 영양액(broth)의 주부분(75 - 90 %)을 회수하고, 새로운 발효 배양액을 생물반응기내의 상기 영양액(broth)의 잔여부분에 첨가한 다음, 새로운 뱃치(batch)를 개시하므로서, 반연속 공정으로 실시하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    - 3-오-데메틸콜키신(3-O-demethylcolchicine, DMC) 또는 3-오-데메틸티오콜키신(3-O-demethylthiocolchicine, DMTC)을 종배양 중에 예비적으로 첨가하는 공정과,
    - 생체내변환(biotransformation)의 최초 14 - 18 시간에 있어서, 전환될 R1이 메톡시(methoxy)인 구조식(Ⅰ) 화합물 기질 분취량(aliquot) 300 - 800 mg/l를, 개시시 및 매 1 - 3 시간에 첨가하는 공정과,
    - R1이 메톡시(methoxy)인 구조식(Ⅰ) 화합물 공급시에, 이하의 원료(raw materials)
    a) 최종 농도 2 - 4 g/l인 펩톤(peptones), 트립톤(tryptone) 또는 카세인 가수분해물(casein hydrolysates)과 암모늄 설페이트(ammonium sulphate) 1 - 3 g/l와 조합시키고 ;
    b) 최종 농도 5 - 15 g/l인 글루코스(glucose) 또는 과당(fructose),
    을 함유하는 용액을 첨가하는 공정을 포함하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 생체내변환(biotransformation)이 25 - 35 ℃, pH 4 - 8에서 수행되는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 배지 1 리터당, 공기의 통기 수준이 1 - 2 리터(litres)(vvm)가 되도록 사용하는 방법.
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