NO319286B1 - Fremgangsmate ved biotransformasjon av kolkisinforbindelser til de tilsvarende 3-glykosyl-derivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av 3-0-glykosylkolkisinforbindelser med formel (I) som angitt i krav 1, ved biotransformasjon, utløst ved hjelp av Bacillus megaterium. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gir kolkisinforbindelser som er glykosydert utelukkende ved C-3 av den aromatiske ring A, utgående fra kolkisin, tiokolkisin eller derivatene derav, i høye utbytter og høy renhet.

Kolkisinforbindelsene som er glykosydert ved C-3 av benzen-ringen, har spesielt farmakologisk betydning på grunn av sin høye effekt, eller for fremstilling av nye legemidler.

Nærmere bestemt er tiokolkikosid (3-0-glykosylotiokolkisin) en aktiv ingrediens som er spesielt viktig ved bruk i det

farmasøytiske område, hovedsaklig ved terapi av sykdommer i muskelskjelettsystemet, og som utgangsstoffer for fremstilling av nye antisvulst-, immunosuppressive, antipsoriatiske og antiinflammatoriske legemidler.

Et antall forsøk på å fremstille 3-glykosylkolkisinforbin-delser er blitt utført tidligere, enten ved hjelp av kjemiske reaksjoner eller ved biotransformasjon.

Den kjemiske rute består av sekvenser av komplekse, ikke-spesifikke reaksjoner som fører til en blanding av glykosy-derte derivater, hvorav enkelte er uvirksomme. Derfor er omdannelsesutbyttet til virksomt produkt som er spesifikt glykosydert ved C-3 av den aromatiske ring, meget lavt.

Den biologiske fremgangsmåte omfatter hovedsaklig biotransformasjonen av tiokolkisin, ved hjelp av kulturer av Cen-tella Asiatica, til monoglykosyderte derivater ved C-2 og ved C-3 av den aromatiske ring. En slik transformasjon er derfor ikke høyt selektiv, og gir et lavt utbytte og lav produktivitet {Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993).

Andre forsøk på biotransformasjon av kolkisinforbindelser gav ganske enkelt demetyleringer av metoksygruppene som er bundet på den aromatiske ring {ved C-2 og C-3), og var uan-sett alltid kjennetegnet ved et begrenset utbytte, en begrenset produktivitet og en dårlig regioselektivitet,

Slik forsøkte Hufford, CD. et al. (J. Pharm. Sc, 68, 10, 1239-1242, 1979) ved bruk av Streptomyces griseus og/eller Streptomyces spectabilis, og Beilet, P. et al. {GB-923421, 1959) ved bruk av forskjellige stammer av Streptomyces og av andre arter av bakterier og sopp, å omdanne kolkisin og dets derivater til de tilsvarende 3-demetylerte derivater. Resultatene av disse kjente metoder bekrefter hva som ble nevnt ovenfor i sammenheng med ikke-selektiviteten av de involverte mikrobielle enzymer, f.eks. ved C-2, C-3 eller C-10 av det alkaloide molekyl. Videre er produktivitets-nivået av disse katalytiske systemer ganske dårlig på grunn av det lave omdannelsesutbytte, de lave substratkonsentrasjoner som kan brukes, samt den hyppige degradering av tro-polonringen.

I nyligere tid har Poulev et al. (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) oppnådd en spesifikk biotransformasjon av bakterielle mikroorganismer, men fortsatt med nokså lavt utbytte og lav produktivitet.

Enzymaktiviteten fra mikroorganismer som ligner de ovennevnte {Streptomyces, Bacillus osv.), er blitt brukt for biotransformasjon av andre forbindelser, såsom maytansinoi-der (US-patent 4.361.650; Izawa, M. et al., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). I dette tilfelle omfatter den katalyserte reaksjon også utelukkende en demetylering, som kjennetegnes ved lavt omdannelsesutbytte og lav produktivitet .

Glykosyltransferaseaktiviteten av a-amylase fra Bacillus megaterium er blitt beskrevet (Brumm, P.J. et al., Starch, 43, 8, 319-323, 1991), hvor akseptorspesifisiteten av transferasereaksjonen (utelukkende glukose eller glukosi-der) er spesielt høy. Cyklodekstrin-glukosyltransferaser, som dannes av den samme mikrobielle kilde, katalyserer en a-1,4-transglukosylasjon av rubusosid {13-0-p-D-glukosyl-steviol p-D-glukosylester), utgående fra stivelse. Også i denne biokonversjon er substratglucidfraksjonen akseptor av transferasereaksjonen (Darise, M. et al., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Cyklodekstrin-glykosyl-transferaser ble tidligere brukt for fremstilling av cyklo-dekstriner G6, G7 og G8 fra stivelse (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

Disse eksempler demonstrerer den høye substratspesifisitet av aktiviteten av glykosyltransferase som uttrykes av Bacillus megaterium, som utelukkende omfatter glukosid-akseptorer og derfor ikke innebærer noen reaksjoner på sekundære metabolitter med en forskjellig, kompleks moleky-lær struktur, såsom kolkisiner. Faktisk er det ikke kjent noen eksempler på bruken av disse mikroorganismer for en-zymomdanelse av kolkisiner til 3-glykosylderivater.

Man har nå funnet at stammer av Bacillus megaterium som har evnen til å vokse i nærvær av høye konsentrasjoner av kolkisin og tiokolkisin, har en ekstremt høy og meget spesifikk biotransformasjonsaktivitet av kolkisinsubstrater til derivater som er glykosylert utelukkende ved C-3 av den aromatiske ring. En slik transformasjon finner sted i løpet av mget kort tid, og kjennetegnes av et overraskende høyt utbytte.

Derfor vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte ved fremstilling av 3-0-glykosylkolkisinforbindelser med formel (I) hvor Ri betyr et 0-glykosydresiduum, R2 betyr hydrogen eller Ci-C7-acyl, R3 betyr d-C6-alkoksy eller Ci-C6-tio-alkyl, hvilken fremgangsmåte omfatter biotransformasjon av forbindelser hvor Ri betyr OH eller metoksy, ved hjelp av Bacillus megaterium.

Bacillus megaterium er en gram-positiv sporegenererende bakterie med en cellediameter som er over 1,0 (im; vokser aerobisk på et antall kulturmedier er katalase-positiv og hydrolyserer gelatin.

Stammer av Bacillus megaterium som kan brukes ifølge oppfinnelsen, viste seg å være istand til en tilfredsstillende vekst og å holde seg levedyktige også ved høye konsentrasjoner av kolkisin og/eller tiokolkisin (over 3 g/l), slik det ble vist ved undersøkelser av veksten og ved mikroskop-analyse.

Kongenere arter, såsom Bacillus cereus, har allerede ved substratkonsentrasjoner på 1,5 g/l vanskeligheter med å vokse (absorbanser 15-25% av kontrollgruppen), og disse vanskeligheter blir enda mer markerte ved konsentrasjoner på 3 g/l, når det finner sted en dramatisk autolyse. Utvalgte kulturer av Bacillus megaterium kan ved de ovennevnte konsentrasjoner derimot oppnå meget høyere vekst-nivåer (dobbelt eller tredobbelt) enn Bacillus cereus.

Den høye selektivitet og effekt av biotransformasjonen er overraskende og uvanlig i betraktning av at utbyttet varierer fra 80-100%, vanligvis 90-95%.

Videre har mikroorganismene som brukes i bioomdannelsen, evnen til å permanent vedlikeholde den katalytiske aktivitet, selv i gjentatte fermenteringstrinn, og tilveiebringer derfor den spesifikke biokonversjon i batchmateprosesser og kontinuerlige prosesser. Derfor gir denne fremgangsmåte et høyt produktivitets- og reproduserbarhetsnivå.

Den markerte regioselektivitet av reaksjonen, i tillegg til de bemerkelsesverdige produksjonsutbytter, sikrer en høy kvalitet og renhet av det dannede produkt, og tilveiebringer det dermed i 100% renhet med en enkel nedstrøms behandling.

Andre viktige trekk er den nedsatte hyppighet av rense- og isolasjonstrinnet av produktet, fremgangsmåtens lave kost-nader og påliteligheten og sikkerheten ved bruk.

De operative sekvenser for utvalg av bakteriestammer som kan brukes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfatter: A) Utvalg av kulturer av Bacillus megaterium som har evnen til å vokse i nærvær av høye konsentrasjoner av kolkisinsubstrat, utgående fra naturlige kilder eller

fra stammer fra samlinger.

B) Utvalg av isolatet fra A) for å verifisere transforma-sjonsaktiviteten av kolkisiner til de tilsvarende 3-0-glykosylderivater, ved hjelp av biokonversjonsassayer på de bestemte substrater, administrert i gradvis sti-gende konsentrasjoner. C) Mikrobiologisk karakterisering av stammene som ble utvalgt i B). D) Gradvis økning av biotransformasjonsutbyttet, ved hjelp av et målspesifikt valg av den bakterielle popu-lasjon fra B). E) Undersøkelse og optimering av de kritiske fermentasjonsparametere for å optimere biotransformasjonen. F) Undersøkelse og optimering av fremgangsmåtene for konservering av de høyt produktive kulturer, for å garan-tere stabile, homogene podestoffer for en produktiv

anvendelse i industriell skala.

G) Oppskalering av prosessen i en fermentasjonsanordning, i batchprosesser, batchmateprosesser og kontinuerlige

prosesser.

H) Opparbeidelse og optimering av fremgangsmåtene for en

nedstrøms behandling og for isolasjon av produktet.

Spesielt kan mikroorganismene som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, velges utgående fra samlingskulturer erholdt fra stamme-deponeringssentre eller fra jordprøver av forskjellig opprinnelse, ved selektiv isolasjon på forskjellige agarmedier inneholdende en organisk nitrogenkilde (peptoner, gjærekstrakter, kjøttekstrakter, asparagin osv.), en karbonkilde (glycerin, stivelse, maltose, glukose osv.) med pH 5-8, fortrinnsvis 6-7. Inkubasjonstemperaturen varierer fra 20-45°C, fortrinnsvis 28-40°C.

Kulturens evne til å vokse i nærvær av toksiske konsentrasjoner av kolkisinsubstratet som skal transformeres, bedøm-mes ifølge teknikker med skalert fortynning og parallell platebestrykning på forskjellige agariserte substrater, hvor man til en del har forhåndstilsatt kolkisin eller tiokolkisin i konsentrasjoner fra 0,1-3 g/l (for å hemme veksten av hoveddelen av mikroorganismene).

Koloniene som har evnen til å vokse under de beskrevne betingelser, fjernes sterilt og plasseres på forskjellige agariserte medier for å bekrefte deres renhet og homogeniteten av veksten.

Kulturmediene som brukes for konservering av kulturen, er typiske mikrobiologiske substrater som inneholder organiske nitrogenkilder (peptoner, gjærekstrakter, trypton, kjøttekstrakter osv.), en karbonkilde (glukose, maltose, glycerin osv.), ved pH 5-8, fortrinnsvis 6-7. Inkubasjonstemperaturen varierer fra 20-45°C, fortrinnsvis 28-40°C.

De utvalgte mikroorganismer testes deretter for sin evne til å vokse i en nedsenket kultur i nærvær av kolkisinforbindelser og å transformere disse til de tilsvarende 3-glykosylderivater.

Assayene ble utført i 100 ml kolber som inneholdt 20 ml flytende medium, med forskjellige mediumformuleringer, omfattende én eller flere organiske nitrogenkilder (gjærekstrakter, peptoner, trypton, kaseinhydrolysater, kjøttekstrakt, "corn-steep liquor" osv.), én eller flere karbonkilder (glukose, glycerol, stivelse, sakkarose osv.), uorganiske fosfor- og nitrogenkilder og uorganiske salter av forskjellige ioner (K<+>, Na<+>, Mg<++>, Ca<++>, Fe<++>, Mn<++> osv.).

Kulturprøvene kan valgfritt underkastes mutagene behandlinger ved hjelp av de konvensjonelle mutageneseteknikker (bestråling med UV-stråler osv.) for å indusere mutanter som har en spesifikk biokonversjonsaktivitet, som kan bedømmes ved den samme fremgangsmåte som ovenfor beskrevet.

Kulturprøver fra hvert biokonversjonsassay ble analysert for å bedømme produksjonen av 3-glykosylderivater ved hjelp av TLC- og HPLC-kromatografi.

Evnen av den valgte mikroorganisme til å omdanne kolkisinsubstrater til de tilsvarende 3-glykosylderivater ble bekreftet ved hjelp av bioomdannelsesassayer i kolber i 300 ml skala i de samme kulturmedier som ble brukt under selek-sjonstrinnet.

Mikroorganismene som gav en positiv respons, ble brukt i tester for optimering av biokonversjonen i forskjellige kulturmedier i 300 ml skala. De hovedsaklige kultur- og fermentasjonsparametere som ble undersøkt, var: organiske nitrogenkilder, karbonkilder, mineralsalter, temperaturen, omrøring/lufting, pH-verdi, inkubasjonstid, innpodings-forhold, subkultur-trinn, tilsetningstidspunkt for substratet som skulle omdannes.

De valgte bakterielle mikroorganismer som har evnen til å utløse biotransformasjon ifølge foreliggende oppfinnelse, kan vokse både på faste og i flytende kultursubstrater som inneholder én eller flere organiske nitrogenkilder, fortrinnsvis gjærekstrakt, kjøttekstrakt, pepton, trypton, kaseinhydrolysater, "corn-steep liquor" osv. Karbonkilder som er nyttige for vekst og biotransformasjon, er glukose, fruktose, sakkarose, glycerol, maltekstrakt osv., fortrinnsvis glukose, fruktose og glycerin. Kulturmediet inneholder videre uorganiske fosforkilder og salter av K<+>, Na<+>, Mg<++>, NH4<+> osv.

De valgte mikroorganismer kan vokse ved temperaturer fra 20-45°C, fortrinnsvis 28-40°C, ved pH-verdier fra 5-8, fortrinnsvis 6-7. Under de samme betingelser har de aktuelle mikroorganismer evnen til å transformere kolkisinforbindelsene til de tilsvarende 3-glykosylderivater. Transformasjonen finner sted i nedsenket kultur, i kolber som inkuberes på en roterende rysteanordning, med omrøring med 150-250 rpm.

På grunn av den spesielle kinetikk av den aktuelle bio-transf ormas j on, som er forbundet med den mikrobielle vekst, er de optimale betingelser for biotransformasjonen de samme betingelser som er optimale for veksten. Derfor er kulturmedier som er nyttige for å fremme en god mikrobiell vekst, såsom slike som er basert på de ovennevnte organiske og uorganiske komponenter, også nyttige for en god biotransformasjonsaktivitet av det aktuelle substrat. Substratet tilsettes til kulturen i utgangsfermentasjonstrinnet.

Biotransformasjonen ifølge oppfinnelsen baserer seg på en enzymomdannelse som starter under den eksponensielle vekst-fase og fortsetter med en parallel progresjon av veksten; den maksimale omdannelsesgrad til 3-glykosylderivat (meget høy: opptil 95-100%) oppnås i løpet av de første 24-30 timene. Regioselektiviteten av biotransformasjonen er abso-lutt: man har aldrig sett tegn til nærvær av 2-glykosylderivater. De dannede produkter er utelukkende ektracellu-lære.

Biotransformasjonen ifølge oppfinnelsen kan oppskaleres til nivået for fermentasjonsanordninger, mens kulturbetingel-sene holdes uendret, spesielt hva angår kulturmedium, temperatur og behandlingstid. For å oppnå en god vekst, er det viktig med tilstrekkelig omrøring og lufting, spesielt er det nødvendig med luftingsmengder på 1-2 liter luft pr. liter kultur pr. minutt (vvm), fortrinnsvis 1,5-2 vvm.

Produktene som dannes ved biokonversjonen, ekstraheres fra kulturmediene etter separasjon av biomassen fra den flytende fraksjon ved sentrifugering og samling av supernatanten, eller mikrofiltrering og samling av permeatet. Kulturen kan behandles med alkoholer med hensyn til en optimal isolasjon av produktet.

Rensingen og isolasjonen av biotransformasjonsproduktene kan utføres ved bruk av kromatografiske teknikker for separasjon på absorpsjonsharpikser og eluering med alkoholer, fortrinnsvis med metanol. Hydrometanoloppløsningene som inneholder produktet, kan dessuten renses ved ekstraksjon med lipofile organiske løsemidler, fortrinnsvis med metylenklorid. Etter ytterligere behandlinger med blandinger av alkoholer og organiske løsemidler kan produktet erholdes i ren tilstand fra de dannede alkoholoppløsninger ved krystallisasjon.

Biotransformasjonsprosessen er spesifikk for substrater som inneholder en tropolengruppe, og kan anvendes på et antall kolkisinforbindelser, såsom kolkisin, tiokolkisin, 3-de-metylkolkisin, 3-demetyltiokolkisin, N-desacetyltiokolkisin og andre kolkisiner som er substituert på forskjellige må-ter .

Andre naturlige forbindelser som mangler tropolonet, glyko-syleres ikke av Bacillus megaterium.

Glukose kan erstattes med andre sukkere, såsom fruktose eller galaktose, uten å forårsake tap av glykosyltransferaseaktiviteten.

De følgende eksempler beskriver oppfinnelsen i ytterligere detalj.

EKSEMPEL 1

Alikvoter av kulturer av Bacillus megaterium, isolert fra jordbruksjord, resuspenderes i 20 ml sterilt saltvann og underkastes en skalert fortynning til tynningsfaktoren 1:10.000.000. Suspensjonene i de forskjellige fortynninger strykes på plater med LB-agarkulturmedium og på LB-agar som har fått tilsatt henholdsvis kolkisin eller tiokolkisin i den endelige konsentrasjon 2 g/l (jfr. tabell). Kulturene inkuberes ved +28°C i 3 dager i mørke. Koloniene som ble dyrket på det selektive medium med tilsatt kolkisinforbin-delse, isoleres og renses ved å stryke dem på plater med ikke-selektivt medium. Prøvene inkuberes slik det ble beskrevet ovenfor, men over et kortere tidsrom (24 timer). Deretter overføres kulturene til det same agarmedium i et prøverør og inkuberes slik det ble beskrevet ovenfor, i 24 timer.

Alikvoter av kulturer, utvalgt slik det ble beskrevet, brukes for å pode 100 ml Erlenmeyer-kolber som inneholder 20 ml kulturmedium ST (tabell), til hvilket det er blitt tilsatt kolkisin eller tiokolkisin i den endelige konsentrasjon 0,4 mg/ml. Kulturene inkuberes over natten ved 28°C på en rotasjonsryster ved 200 rpm.

Transformasjonen av kolkisinsubstratet overvåkes ved analyse av alikvoter av kulturvæsker tatt hver 3. eller 4. time, ved TLC på kiselgel med et 5:4:1 aceton:etyl-acetat:vann-eluentsystem.

Etter 4 dagers inkubasjon isoleres alikvoter av kulturene som viste en åpenbar katalytisk aktivitet til 3-glykosylderivatet, på plater ved skalert fortynning slik det ble beskrevet ovenfor, for fremstilling av nye podestoffer i prøverør. Biotransformasjonsassayet i kolben gjentas under de samme betingelser som ble beskrevet ovenfor, men ved bruk av merkbart høyere endelige konsentrasjoner av kolkisin og tiokolkisin (1 mg/ml). De mest aktive enkelte kulturer (substratomdannelse lik eller høyere enn 80%) brukes for fremstilling av podestoffer i frosne kryorør slik det skal beskrives i eksempel 3. 2) Medium ST (sterilisering: 121°C x 20') - pH 7

EKSEMPEL 2

Fremgangsmåten som ble beskrevet i eksempel 1, gjentas utgående fra Bacillus mega terium-kulturer som stammet fra de følgende samlingsstammer (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen, Braunschweig, Tyskland): DMS 90, 509, 322, 333, 1667, 1670, 1671.

Kulturen som ble valgt slik det ble beskrevet i eksempel 1 og tilsatt tiokolkisin (1 mg/ml), inkuberes i 4 dager i flytende kultur: TLC-analyse påviser den inntrufne transformasjon av substratet til tiokolkikosid, hvor omdannelsesutbyttet varierte fra 50% (stamme DSM 1671) til 70%

(stamme DSM 90) til 80% og mer (stammene DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670).

EKSEMPEL 3

Alikvoter av kulturprøver i prøverør, utvalgt slik det ble beskrevet i eksemplet ovenfor, brukes for å pode 100 ml Erlenmeyer-kolber som inneholder 20 ml av medium ST.

Dyrkningskulturene inkuberes ved +30°C på en rotasjonsryster med 200 rpm over natten. Etter inkubasjonen tilsettes en steril glyceroloppløsning til kulturene, til den endelige konsentrasjon 20%. Kulturene fylles deretter i 2 ml kryorør og nedsenkes umiddelbart i flytende nitrogen.

Etter noen dager tines 10% av kulturene raskt ved 37°C. Alikvoter av hvert kryorør brukes for å pode 100 ml Erlenmeyer-kolber som inneholder 20 ml medium ST, som deretter inkuberes ved +28 °C over natten (forkultur) med 200 rpm. Etter inkubasjonen overføres 2 ml av hver forkultur sterilt til 20 ml ferskt medium ST, denne gang tilsatt kolkisin eller tiokolkisin i den endelige konsentrasjon 1 g/l. Bio-transf ormas jonen utføres og kontrolleres under betingelsene som ble beskrevet i eksempel 1. Analysen bekreftet at transformasjonen av substrat til 3-glykosylderivatet fant sted med de kvantitative omfang som ble nevnt ovenfor (80% og høyere), hvilket beviste den katalytiske stabilitet av de frosne kulturer.

Parallellkontroller av mediumskulturene som var blitt strøket på plater med LB Agar direkte etter tiningen, bekrefter levedyktigheten, homogeniteten og renheten av de frosne kulturer.

EKSEMPEL 4

Alikvoter av kulturer i kryorør etter tining brukes for å pode 300 ml Erlenmeyer-kolber som inneholder 50 ml medium ST (forkultur). Etter inkubasjon over natten ved 30°C, 250 rpm, overføres 5 ml av forkulturen til 50 ml av det samme medium med tilsatt kolkisin i den endelige konsentrasjon 1 g/l. Kulturene inkuberes i 2 dager under de samme betingelser som ble beskrevet ovenfor. Hver 4. time tas prøver for å bedømme vekstnivået (ved å måle absorbansen ved 600 nm), kolkikosidproduksjonen (TLC og HPLC), steriliteten (på LB Agar) og for en morfologisk undersøkelse under mikroskop.

For HPLC-analysen blir det til 1 ml-fraksjoner av kulturmedium tilsatt 9 ml metanol, og det hele blir sentrifugert med 13.000 rpm i 2 minutter. Innholdet av kolkikosid i supernatanten analyseres ved reversfase-HPLC, med isokra-tisk eluering, f.eks. ved hjelp av eluentsystemet vann:acetonitril 80:20.

HPLC-analysen beviser at omdannelsen av kolkisin til kolkikosid følger en progresjon som er parallell med veksten. Etter ca. 26 timers inkubasjon er biokonversjonen fullført.

Det endelige kolkikosidutbytte varierer fra 80-85%.

EKSEMPEL 5

Fremgangsmåten som ble beskrevet i eksempel 4, gjentas, men det tilsettes tiokolkisin istedenfor kolkisin til kulturene i den samme endelige konsentrasjon (1 g/l).

Veksten og produksjonsresponsen av kulturene ligner hva som ble oppnådd med kolkisin, og tiokolkikosidutbyttet er ca. 90%.

EKSEMPEL 6

Fremgangsmåten som ble beskrevet i eksempel 4, gjentas, men det tilsettes 3-demetyltiokolkisin istedenfor kolkisin til kulturen i den samme endelige konsentrasjon (1 g/l). Veksten og produksjonsresponsen ligner hva som ble oppnådd tidligere, med et tiokolkikosidutbytte på ca. 90%.

EKSEMPEL 7

Fremgangsmåten som ble beskrevet i eksempel 4, gjentas, men det tilsettes N-formyltiokolkisin istedenfor kolkisin til kulturen i den samme endelige konsentrasjon (1 g/l). Veksten og produksjonsresponsen av kulturene ligner hva som ble oppnådd ovenfor, og tiokolkikosidutbyttet er ca. 90%.

EKSEMPEL 8

1 liter ST-medium i Erlenmeyer-kolber podes med en kryorør-kultur av stammen DSM 1670. Kolbene inkuberes over natten ved +30°C, 250 rpm. Podestoffet overføres sterilt til en 14 liters fermenterer som inneholder 9 1 sterilt medium ST, til hvilken det er blitt tilsatt tiokolkisin i den endelige konsentrasjon 1 g/l. Fermentasjonen utføres mens man utfø-rer egnet omrøring/lufting (omrøring opptil 900 rmp; lufting 1-1,5 vvm, avhengig av kulturveksten). Hver 2. time tas prøver fra kulturkraftene, og disse underkastes de føl-gende analyser:

Optisk tetthet (OD) ved 600 nm,

Sterilitets- og renhetsanalyse av stammen på LB Agar, Mikroskop-morfologi (gram-flekking)

Analyse av tiokolkikosidinnholdet ifølge TLC og HPLC.

Etter 28 timers fermentering er transformasjonen til tiokolkikosid nesten avsluttet. Det endelige utbytte er ca. 90%.

EKSEMPEL 9

Fremgangsmåten som ble beskrevet i Eksempel 8, gjentas, men etter 28 timers fermentering isoleres kun 90% av kulturmediet for å ekstrahere produktet (fraksjon 1). De øvrige 10% får i fermentereren sterilt tilsatt 9 liter ferskt sterilt medium ST som inneholder 10 g tiokolkisin. Fermenteringen utføres slik det ble beskrevet i eksempel 8. Etter 26 timer samles 9 1 kulturmedium og ekstraheres (fraksjon

2). Restvolumet kulturmedium får sterilt tilført 9 liter til sterilt ferskt medium ST som inneholder ferskt tiokolkisin (10 g). Fermenteringen utføres slik det ble beskrevet ovenfor. Etter 26 timer samles hele kulturmediet og ekstraheres (fraksjon 3). Biotransformasjonsaktiviteten av stammen holdt seg stabil over alle de tre løp, med omdannelsesutbytter på ca. 90%, og med en tilnærmet tredoblet samlet produksjon av tiokolkikosid sammenlignet med hva som ble oppnådd i en enkelt batchprosess.

EKSEMPEL 10

Det endelige kulturmedium fra fermenteringen (samlet volum: ca. 27 1) underkastes tverrstrømningsmikrofiltrering på en 0,22 \ ua keramisk patron for å adskille cellene fra mediet. Permeatet absorberes på en kolonne fylt med HP21 absorp-sjonsresin fra Mitsubishi. Etter vasking med vann, elueres produktet med metanol. Metanoleluatet inndampes til tørrhet under vakuum og gjenoppløses deretter i metanol. Etter gjentatte ekstraksjoner med metylenklorid, inndampes alko-holfraksjonen til tørhet og gjenoppløses i en 1:1 etanol/metylenklorid-blanding. Etter klarning med kiselgel, inndampes oppløsningen under vakuum, og metylenkloridet erstattes deretter med etanol. Den dannede suspensjon inndampes og får krystallisere. En andre krystallisasjon med etanol utføres etter ytterligere gjenoppløsningstrinn av det faste stoff i etanol/kloroform-blandinger og klarning på kiselgel.

Det dannede produkt, analysert ved HPLC, C-NMR, H-NMR og massespektrum, viser seg å være det samme som tiokolkikosid-standarden.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av 3-0-glykosylkolki-sinforbindelser med formel (I) hvor Ri betyr et O-glykosydresiduum, R2 betyr hydrogen eller Ci-C7-acyl, R3 betyr Ci-C6-alkoksy eller Ci-C6-tio-alkyl, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter biotransformasjon av forbindelser hvor Ri betyr OH eller metoksy, ved hjelp av Bacillus megaterium.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den utføres for fremstilling av forbindelser (!) hvor Ri betyr et 0-glukosidresiduum.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den utføres for fremstilling av kolkikosid og tiokolkikosid.

4. Fremgangsmåte ifølge et av de forutgående krav, karakterisert ved at biotransformeringen utføres i nedsenket kultur ved en temperatur fra 28-40°C, ved en pH-verdi fra 6-7 og ved bruk av glukose, fruktose eller glycerol som karbonkilde.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at kulturmediet som brukes, inneholder 0,1 til 3 g/l av forbindelser I hvor Ri betyr hydroksy eller metoksy.