NO146141B

NO146141B - Fremgangsmaate til fremstilling av aminocyklitolantibiotika

Info

Publication number: NO146141B
Application number: NO803186A
Authority: NO
Inventors: Sol Jacob Daum; Robert Lagrone Clarke
Original assignee: Sterling Drug Inc
Priority date: 1975-09-22
Filing date: 1980-10-24
Publication date: 1982-04-26
Also published as: FR2366309B1; NO803186L; SE8007539L; PH16042A; NO146141C; FR2366309A1; US3982996A; GB1543518A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av aminocyklitolantibiotika med formelen:

hvor R2 og R 5 hver er hydrogen eller hydroksy; og Rg og R^

hver er hydrogen eller metyl, samt syreaddisjonssalter derav.

Skjønt det er kjent at aminocyklitoler kan inkorpo-reres i aminocyklitolantibiotika, enten ved at man dyrker et næringsmedium som mangler aminocyklitolunderenheten som sådan, i nærvær av en passende mikroorganisme (f.eks. kan man inkorporere deoksystreptamin i neomycin, slik det er angitt av Waksman et al., Science 109, 305-307 (1949)),

eller ved å dyrke et næringsmedium inneholdende en amino-cyklitolunderenhet i nærvær av en mutant mikroorganisme som er ute av stand til å biosyntetisere selve aminocyklitolet,

men som på den annen side er i stand til å inkorporere nevnte aminocyklitol i nevnte antibiotikum (man kan f.eks. få inkor-porert streptamin eller epistreptamin i hybrimicin antibio-tika, f.eks. slik det er beskrevet i US-patent 3.669.838) slik dette er beskrevet ovenfor, så har man hittil ikke oppnådd å

få en direkte inkorporering av cyklitoler til aminocyklitolantibiotika. Det har i virkeligheten aldri lykkes å inkorporere

hverken myo-inositol, en mulig biogenetisk forløperforbin-delse for streptamin, eller en heksahydroksycykloheksanmono-metyleter (quebrachitol) i aminocyklitolantibiotika ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet av Rinehart og Shier (Testa et al., J. Antibiotics 27, 917-921 (1974)).

Det ville være meget fordelaktig hvis man kunne bruke cyklitoler istedenfor aminocyklitoler for en inkorporering i aminocyklitolantibiotika ved hjelp av mutante mikroorganismer og ved hjelp av metoden i US-patent 3.669.838, fordi denne fremgangsmåte ved et passende valg av mikroorganismer og cyklitolunderenhet, kan oppnå en viss grad av biogenetisk styring av det resulterende antibiotikum. Ettersom aminocyklitoler alltid er mer kostbare enn ikke-aminerte cyklitoler, ville man således oppnå betydelig besparelser med hensyn til sluttproduktet. (Det kan f.eks. nevnes at streptamin for tiden koster ca. 1 amerikansk dollar pr.

gram, mens den mulige biogenetiske forløperforbindelse, nemlig scyllo-inosose, kan fremstilles i et utbytte på ca. 80% ved ..fermentativ oksydasjon av •myo-inositol, som bare koster ca. 2 cent pr. gram for tiden.)

Ifølge foreliggende fremgangsmåte fremstilles forbindelsene méd formel I ved at man dyrker mikroorganismen Micromonospo.ra/purpurea ATCC 31.164 i et næringsmedium inneholdende karbohydrater, en kilde for assimilerbart nitrogen, vesentlige salter og en cyklitolforbindelse med formelen:

hvor X er C=0 eller C(H)0H; hvor R i hvert tilfelle, er ' hydrogen eller acetyl og hvor R2' og R,-' hver er hydrogen eller OR, og, om ønsket omdanner en oppnådd fri base til et syreaddisjonssalt derav.

Forbindelsene med formel I har blitt prøvet i antibakterielle prøver av standard seriefortynningstypen og man har funnet at de har antibakteriell aktivitet, da spesielt mot gentamicin-resistente organismer. Forbindelsene kan således brukes som antibakterielle midler.

Forbindelser med formel I kan primært brukes for oral, topisk eller parenteral tilførsel, og kan opparbeides for anvendelse med et farmasøytisk bærestoff ved en suspen-dering, og forbindelsene kan enten brukes i form av sine frie baser eller som farmasøytisk akseptable, ikke toksiske syreaddisjonssalter, i et inert bærestoff som polyetylen-glykol, eller ved at man fremstiller tabletter eller kapsler for oral tilførsel, enten alene eller med passende fortyn-ningsmidler, eller alternativt kan de opparbeides til vanlige kremer eller salver for topisk anvendelse.

Strukturen på forbindelser med formel I ble fast-slått ved hjelp av studier over deres kromatografiske egen-skaper, noe som ble bestemt ved tynnsjiktskromatografianalyse, deres kjernemagnetiske resonans, samt massespektra, ved ned-brytning til kjente forbindelser, ved sammenligning med produkter fremstilt ved fermentering med mutanten M. purpurea ATCC 31.119 ved å bruke aminocyklitoler beskrevet i US-patent nr. 3.669.838 som substrater med produkter fremstilt ved fermentering med mutanten M. purpurea ATCC 31.164 ved å bruke cyklitoler med formlene Illa og Illb og ved overensstemmelse mellom beregnende og funnede verdier ved en analyse over de tilstedeværende elementer.

Resultater av antibakterielle prøver

Forbindelsen 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-metylamino-(l-L-arabinopyranosyl- (l->6) -0- [ 2-amino-6-metylamino-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl-(l-»4)]-D-streptamin beskrevet i eksempel 1 og betegnet komponent 1 ble prøvet i sammenligning med gentamicin mot en rekke mikroorganismer ved hjelp av følgende fremgangsmåte.

Lageroppløsninger av hver forbindelse inneholdende 200 mcg/ml base ble fremstilt i destillert vann og filter-sterilisert. Kulturer av prøveorganismene ble dyrket i 24 timer ved 3 7°C i 10 ml rør inneholdende tryptosefosfat eller Mueller-Hinton-medium. Hver kultur ble justert med medium til en optisk tetthet på 0,1 i et Spectronic 20-apparat (omtrent 10 gceller/ml). De justerte kulturer ble fortynnet til 1:500 i medium og ble så brukt som inokulum (endelig cellekonsen-trasjon ca. 2 x 10^ celler/ml). Forbindelsene ble prøvet for antibakteriell aktivitet ved en enkeltråd rør-fortynnings-metode. To parallelle seriefortynninger ble utført i mediet fra selve lageroppløsningene, og 0,2 ml av hver konsentrasjon ble plassert i sytten 13 x 100 mm rør. Alle rør ble inokulert med 0,2 ml av en passende fortynnet kultur (endelig celle-konsentrasjon pr. rør er ca. 10 5 celler/ml). Minimumshemmende konsentrasjoner (laveste konsentrasjon som ikke ga synlig vekst) ble avlest etter 16 timers inkubering ved 37°C.

Resultatene er angitt i tabell I nedenfor. Forbindelsene ble ansett å være inaktive ved hemmende konsentrasjoner på mer enn 100 mcg/ml.

Den samme komponent 1 beskrevet i eksempel 1, nemlig 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-metylamino-f}-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-metylamino-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl-(l-»4) ]-D-streptamin ble prøvet i sammenligning med gentamicin-komplekset (C,, C_ og C, ) og genta-

X £. X cl

micin C^. Disse resultater er angitt i tabell II nedenfor hvor prøveorganismene 1, 2, 3, 4, 5 og 6 angir B. subtilis ATCC 6633, S. aureus Smith, E. coli JR 76.2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumoniae A-20636 og Ps\ aeruginosa A-20897, respektivt.

Fremstilling av mellomprodukter

Fremstilling 1

dl-Viboquercitol[dl-1,2,3,4,5-cykloheksapentol-(1,2,4-cis)] (McCasland et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 4020

(1953)) (0,40 mol) ble underkastet en mikrobiologisk oksydasjon ved hjelp av Acetobacter suboxydans ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet av Posternak, Heiv. Chim, Acta 3_3, 1594-1596 (1950) . Det resulterende medium ble tilsatt 5 g blyacetat i 60 ml vann, og oppløsningen ble filtrert gjennom et filterhjelpemiddel, hvoretter filtratet ble ført over 180 g Dowex-harpiks 50-124. Det resulterende eluat ble konsentrert til et volum på ca. 150 ml,.fortynnet med tilsvarende volum etanol og så avkjølt. Det utskilte materialet ble oppsamlet, og man fikk 15,1 g dl-deoksy-inosose [dl-2,3,4,5-tetrahydroksy-l-cykloheksanon(2,4-cis)], smeltepunkt 221-222°C. Ytterligere konsentrering av filtratet fra første utbytte ga tre. ytterligere mengder som totalt veide 28,7 g, smeltepunkt 220-221°C.

Fremstilling 2

En oppløsning av 9,5 g (0,053 mol) dl-epi-inosose (Posternak, Heiv. Chim. Acta 19, 1333 (1936)) i 300 ml 0,IN saltsyre ble redusert med hydrogen over 6 g platinaoksyd ved et begynnende hydrogentrykk på ca. 4 kg/cm 2. Produktet ble isolert ved filtrering og konsentrasjonen av filtratet til tørrhet og omkrystallisering av resten fra vandig metanol.

Man fikk således fremstilt dl-epi-quercitol, smeltepunkt 214-215°C.

Sistnevnte forbindelse ble underkastet en mikrobiologisk oksydasjon ved hjelp av Acetobacter suboxydans og ved å bruke den fremgangsmåte som er angitt av Posternak og som er beskrevet under fremstilling nr. 1, og produktet ble isolert som beskrevet samme sted og deretter omkrystallisert fra etanol. Man fikk dl-2,3,4,6-tetrahydroksy-l-cykloheksanon-(2,4,6-cis), smeltepunkt 175-177°C.

Fremstilling 3

Til en oppløsning av 22,5 g (0,11 mol) 3-klor-penbenzo-syre i 150 ml metylendiklorid ble det tilsatt 11,4 g (0,1 mol) 4-cykloheksen-la,23-diol (McCasland et al., J. Org. Chem, 28, 898 (1963)), og den resulterende oppløsning ble omrørt under avkjøling slik at temperaturen stadig var under 30°C. Blandingen ble omrørt i en time, fortynnet med 150 ml dietyl-eter, omrørt i ytterligere 3 timer og så fortynnet med 150 ml vann. Produktet ble isolert fra det organiske lag på vanlig måte, og man fikk 9,1 g råprodukt som ble omkrystallisert fra etanol/eter, og man fikk to utbytter på totalt 4,75 g 4,5-epoksycykloheksan-la,23-diol, smeltepunkt 80°C og 70-75°C.

En oppløsning av 6,63 g (0,051 mol) av sistnevnte forbindelse i 20 ml dimetylsulfoksyd ble behandlet med 0,06 ml bortrifluorideterat. Den resulterende oppløsning ble oppvarmet på et dampbad i ca. 20 timer, hvoretter man tilsatte ytterligere 0,0 3 ml bortrifluorideterat, hvorpå oppløsnings-midlet ble fjernet i vakuum. Resten ble behandlet med 50 ml etanol, det resulterende faste stoff ble utskilt, og filtratet konsentrert til tørrhet, hvorved man fikk 7,75 g av en rødbrun olje, 1,1 g av denne ble så kromatografert på silisiumdioksyd-gelplater og en eluering med tetrahydrofuran ga 550 mg 2,4,5-trihydroksycykloheksanon(2,4-cis), hvis massespektrum ga massetopper på 14 4 og 145 og hvis infrarøde spektrum viste en sterk topp ved 1723 cm

Mutasjonsprosesser

I de følgende fremgangsmåter brukte man følgende media:

Den brukte organismen, nemlig Micromonospora purpurea, fikk man fra US. Dept. of Agriculture som NRRL 2953, og denne ble holdt på N-Z-amin-skråagar (medium 1). Fermentering i selve mediet ble utført i kolber inneholdende spiringsmedium 2 i 4 døgn ved 37°C i et roterende rysteapparat.

Fra dette første trinns utgangsmedium overførte man en 10% ino-kulum til gjæringsmediet (medium 2), og fermenteringen ble fortsatt som nevnt ovenfor ved 28°C i 7 døgn.

For å etablere organismens evne til å biosyntetisere gentamicin i fravær av tilsatt deoksystreptamin, utførte man en tredje trinns fermentering ved å bruke en 5% inokulum i en 10 liters fermentor tank i et soyabønne-glukose-medium (3) ved 28°C, omrøring med 200 omdr./minutt og gjennom-bobling med 2 liter/minutt ved hjelp av filtrert luft. Etter 6 døgn ble tankens innhold surgjort ved pH 2,0 med 6N svovelsyre, filtrert,"og en 500 ml porsjon nøytralisert med ammoniumhydroksyd og ført gjennom en IRC-50 ionevekslerharpiks (Na<+->form). Kolonnen ble så vasket med vann og eluert med 2N svovelsyre. Ved å bruke fremgangsmåten fra US-patent 3.091.572 fikk man isolert en 300 mg prøve av urent gentamicin, som man fant var biologisk aktiv og som inneholdt tre komponenter tilsvarende C^, C- °9 vec^ tynnsjiktskromatografi-undersøkelse.

For å få mutert organismen ble forskjellige kulturer dyrket i et medium 2 (37°C i 3 døgn), og de resulterende celler høstet ved sentrifugering, vasket og resuspendert i bufferet saltoppløsning. Denne suspensjon ble behandlet med et mutagenisk middel, nemlig N-metyl-N<1->nitro-N-nitroso-guanidin. Prøver av den mutante kultur ble utplatet i medium 4 ved 37°C inntil man fikk kolonier (dette tok vanlig-vis en uke). Koloniene ble plukket ut og overført til parallelle plater (medium 4), og et sett ble overlagt en sporesuspensjon av B. subtilis. Etter inkubering ved 37°C i fra 18 til 20 timer, ble de kolonier som ikke viste noen hemmings-sone på B. subtilis-platen overført fra hovedplaten (intet B. subtilis) til skråagar av medium 1 og inkubert inntil

man fikk full vekst.

Disse mulige ikke-produserende mutanter ble så ut-satt for deoksystreptamin i et forsøk på å stimulere antibiotikum-biosyntese på følgende måte. Kulturer av mulige mutanter ble streket ut som bånd på overflaten av plater med medium 4, og de ble så inkubert ved 37°C inntil man fikk god vekst (dette tok fra ca. 3 til 4 døgn). Filterpapirskiver ble så dyppet i en oppløsning av deoksystreptamin (500 mcg/ml) og plassert på toppen av strekkulturen. Etter inkubering i 24 timer ble overflaten av platene inokulert med B. subtilis idet man brukte overlegningsteknikken, og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere 18 til 20 timer. De isolater som viste inhiberingssoner som omga skiven, ble betegnet som deoksystreptamin-mutanter. En slik mutant som fikk betegnelsen VIB, er plassert i the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 som Micromonospora purpurea ATCC 31.119.

Den sistnevnte organisme ble i seg selv underkastet samme mutasjonsprosedyre slik den er beskrevet ovenfor, og prøver av mutagene kulturer ble utplassert i medium 4 ved 37°C inntil man fikk gode kolonier (dette tok- ca. en uke). Koloniene ble så plassert ut på parallelle plater som inneholdt streptomicin-prøve-agar (medium 6).

Et sett tjente som master-plate for senere innvinning, mens det annet sett inneholdt 25 yg/ml streptaminsulfat og man brukte en sporesuspensjon av B. subtilis som prøveorganisme. Platene.ble inkubert ved 37°C i 24 timer og undersøkt for inhiberingssoner. De som viste de største soner ble overført fra master-platen til skråagarer av N-Z-amin-medium (medium 1) og inkubert i en uke ved 37°C.

De mutanter som inkorporerte små mengder av streptaminsulfat ble så siktet med streptamin og scyllo-inosose ved 500 yg/ml som utgangspunkt. Vedlikeholdskulturer ble over-ført til kolber inneholdende meidum 2, samt ovennevnte mellomprodukter og inkubert ved 37°C i et roterende risteapparat i 7 døgn. Kolbene ble periodevis bedømt for antibiotisk aktivitet- via den såkalte skivediffusjonsprøven hvor man brukte B. subtilis som prøveorganisme. De isolater som viste hemmings-soner omkring skiven ble betegnet som streptamin eller scyllo-inosose-mutanter. En slik mutant med betegnelsen VIB-3P er levert the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20851 som Micromonospora purpurea

ATCC 31,164, og denne er brukt for fremstilling av aminocyklitol-antibiotika av streptamin, deoksystreptamin og dideoksystreptamin-typen slik dette er beskrevet nedenfor. Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Biosynteser med M. purpurea ATCC 31. 164

Inkorporering av cyklitoler

Eksempel 1

Den mutante organisme, nemlig M. purpurea ATCC

31.164 ble holdt på N-Z-amin-skråagar (medium 1), og et første trinns frøinokulum ble fremstilt ved å inokulere en meget liten porsjon fra skråagaren til et 50 ml spiringsmedium (medium 2) og inkuberte dette i 4 døgn på et roterende risteapparat ved 27-28°C. Et 5% inokulum ble så overført til 500 ml spiringsmedium, og dette ble inkubert i 3 døgn som ovenfor. En liter av dette annet trinns medium ble brukt for å inokulere 9 liter produksjonsmedium (medium 5) i tanker som ble omrørt ved 400 omdr./minutt og gjennomboblet med filtrert luft i en mengde på 5 liter/minutt ved 28-29°C i 48 timer. Deretter ble deler av dette medium på tredje trinn brukt for

å inokulere 75 liter produksjonsmedium inneholdende 16 g scyllo-inosose. Fermentering ble utført i 4 døgn, omrøring var 400 omdr./minutt og gjennomlufting var ca. 42 liter/ minutt ved 29-30°C.

Tankens innhold ble surgjort til pH 2,0 med 10N svovelsyre og filtrert ved hjelp av filterhjelp for å fjerne mycel. Filtratet ble justert til pH 6,0 og ført over en 8 x 50 cm kationvekslerharpiks ("Bio-Rex 70", natriumioneform, 20-50 mesh). Eluatet ble undersøkt for antibiotisk aktivitet via en bio-prøve og man fant at det var inaktivt overfor B. subtilis. Kolonnen ble så eluert med 2N svovelsyre og man oppnådde 500'

ml fraksjoner. Fraksjonene ble bedømt mot B. subtilis, og alle de fraksjoner som viste antibiotisk aktivitet ble kombinert og nøytralisert til et sluttvolum på 10 liter. Dette ble konsentrert til ca. 5 liter under vakuum, og pH ble justert til 10,5 med 10N natriumhydroksyd, og man tilsatte 5 volumer aceton under kraftig omrøring. De uorganiske utskilte salter ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert i vakuum etter justering til pH 7,0 med fortynnet svovelsyre. Da volumet var ca. 4 liter, ble pH rejustert til 4,5 og prøven ytterligere redusert til 150 ml. pH ble så justert til 10,5 og 5 volumer aceton ble tilsatt for ytterligere avsalting. Filtratet ble konsentrert, justert til pH 4,5 og ytterligere konsentrert til 10 ml. Ved å tilsette 100 ml metanol fikk man et råprodukt av antibiotikum som veide 9 g, og dette ble oppløst i 10 ml vann og ekstrahert med fem 50 ml porsjoner av den nedre fase av et oppløsningsmiddel sammensatt av 2 volumer kloroform, 1 volum isopropanol og 1 volum av 17% ammoniumhydroksyd. Ekstraktene fra to slike forsøk ble kombinert og konsentrert i vakuum og man fikk en oljeaktig rest som veide 300 mg..

Prøven ble blandet med 5 g silisiumdioksydgel (100-

200 mesh) og plassert på en 100 g silisiumdioksydgel-kolonne (2,5 x 45 cm) og utviklet med kloroform:isopropanol:ammoniumhydroksyd som beskrevet ovenfor. Fraksjonene ble oppsamlet, underkastet tynnsjiktskromatografi-analyse og utvalgte fraksjoner ble kombinert og konsentrert i vakuum til en blekt gul olje som veide 0,210 g. Denne ble omdannet til sulfat-saltet og man fikk 0,288 g av 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-(metylamino) -Ø-L-arabinopyranosyl- (l-»-6) -O- [2-amino-6- (metylamino) - 6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl-(1+4)]-D-streptamin som bi-base«pentasulfat•tetrahydrat.

Analyse: Beregnet for C2iH4 3N5°8*2 1/^ 2 H2S04'2H20:

C 32,55 H 6,76 N 9,04 S 10,35

Funnet: C 32,49 H 6,91 N 9,36 S 9,75

Den strukturelle likhet med gentamicin ble etablert på følgende måte:

De kromatografiske bevegeligheter for forbindelsen identifisert ovenfor og som er betegnet eksempel 1 og gentamicin er vist i den følgende tabell.

System 1 - Silisiumdioksydgel 60F254, lavere fase av kloroform (1):metanol(1):30% ammoniumhydroksyd(1), plate

sprøytet med ninhydrin.

System 2 - Watman nr. 1 papir - oppløsningsmiddelsystem som i

System 1 - bioautografi ved å bruke B subtilis.

RgCl - Bevegelighet i forhold til gentamicin C^.

For det annet viste massespektrumet av en prøve i form av den frie base et molekylært ion ved 493 og fragmenter ved 477, 476, 463, 457, 436, 418, 405,401, 383, 376, 366, 363, 344, 335, 321, 318, 277, 261, 160 og 157.

For det tredje så viste det kjernemagnetiske resonsnsspektrumet signaler som skyldtes to NCH^-grupper og en CH^CH-gruppe.

Videre ble en 10-20 mg prøve av produktet som er nevnt ovenfor i 0,3 ml 6N saltsyre i et 0,5 mm kapillærrør oppvarmet i kokende 6N saltsyre i seks timer. Blandingen ble hensatt ved romtemperatur i 2 døgn, så fortynnet med 1,5 ml etanol. Den resulterende, klare overliggende væske ble helt av den faste rest, og det faste stoff ble oppløst i vann og kromatografert på silisiumdioksydgel-plater idet man brukte kloroform(3):metanol(4)konsentrert ammoniumhydroksyd-(2)-system. Sammenlignende prøver av autentiske streptamin og deoksystreptamin ble kromatografert samtidig. Identi-teten av hydrolyseproduktet med streptamin ble vist ved en identitet for de kromatografiske bevegeligheter for de to prøver (0,1) sammenlignet med den kromatografiske bevegelighet for deoksystreptamin (0,2).

Et ytterligere bevis for at nedbrytingsproduktet fra ovennevnte hydrolyse var streptamin, fikk man ved at en auten-tisk prøve av N,N-diacetylstreptamin-tetraacetat ble fremstilt ved å omsette 810 mg streptaminsulfat med 50 ml eddiksyreanhydrid i nævær av 500 mg natriumacetat. Etter koking under tilbakeløp i en time, ble blandingen avkjølt til romtemperatur, fordampet til tørrhet og ekstrahert med kloroform/vann, og man fikk 440 mg av et stoff som hadde smeltepunkt på 252-256°C, (smelter under omkrystallisering), dekomponerer 334-336°C. (Litteraturen angir: delvis smelting ved 250°C med overgang til lange nåler, smelter >300°C.

Peck et al., J.Am. Chem. Soc. 6j3, 776 (1946)).

Lignende acetylering av nedbrytingsproduktet som ble fremstilt som nevnt ovenfor med 5 mg natriumacetat i 1 ml eddiksyreanhydrid ga 5,6 mg av et materiale som smeltet på 250-257°C (smelter med omkrystallisering), og som dekomponerer ved 336-339°C. En prøve ved å blande den kjente prøven og referanseprøven og undersøke deres smeltepunkt, viste at smeltepunktet ikke ble senket.

Til slutt utførte man dampfasekromatografiske sammen-ligninger mellom N,N-diacetylstreptamin-tetraacetatet og den tilsvarende forbindelse fremstilt fra nedbrytingsproduktet, og dette ble sammenlignet med N,N-diacetyldeoksystreptamin-triacetat. Streptaminderivatet og nedbrytingsprøven viste seg å være identisk (R.T. = 10,6 minutter), men forskjellig fra den man fant for N,N-diacetyldeoksystreptamin-triacetat (R.T. = 9,1).

Eksempel 2

Ved å bruke samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 1 ovenfor og ved å bruke 0,50 g/liter av dl-epi-inosose-2-[2,3,4,5,6-pentahydroksycykloheksanon (2,3,4,6-cis)] i tre 10 liters fermenteringer i medium 5" pluss 0,1% tilsatt fyton i nærvær av M. purpurea ATCC 31.164 og isolering av produktet som beskrevet ovenfor, ga 0,148 g av et oljeaktig produkt som ved sammenligning med sin kromatografiske bevegelighet med kjente prøver og fra sitt massespektrum, viste seg å være identisk med gentamicin C^, nemlig O-3-deoksy-4-C-metyl-3- (metylamino) -Ø-L-arabinopyranosyl- (l->-6) -O- [2-amino-6-(metylamino)-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glykopyranosyl- (l->-4) -D-2-deoksy streptamin. Mas se spektrumet vise et molekylært ion ved 4 77 og hovedfragmenter som er identisk med det man finner for gentamicin C-^ ved 420, 360, 350, 347, 322, 319, 304, 160 og 157.

Eksempel 3

Man brukte samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 1 ovenfor, idet man brukte 0,50 g/liter av 3,4,5,6-tetrahydroksycykloheksen (3,5-cis) i tre 10 liters fermen-teringstanker i medium 5 pluss 0,1% tilsatt fyton i nærvær av M. purpurea ATCC 31.164, og produktet ble isolert som tidligere. Man fikk ialt 0,68 g materiale som fra tynnsjiktskromatografianalyse og kromatografiske bevegeligheter viste seg å være identisk med gentamicin C^, C2 og Videre ble en 2 mg prøve av materialet avsatt på en tynnsjiktskromato-grafiplate sammen med en prøve av kommersielt gentamicin og platen ble utviklet med kloroform(1)imetanol(1)rkonsentrert ammoniumhydroksyd(l). De resulterende tre bånd fra den eksperimentelle prøven, hvis kromatografiske bevegelighets-verdier (R^) som tilsvarte identisk de tre båndene man fikk fra kommersielt gentamicin, ble fjernet, eluert med det ut-viklende oppløsningsmiddel og underkastet en massespektral-analyse. Spektrene av de to første båndene med R^-verdier på 0,37 og 0,29, henholdsvis, var i overensstemmelse med massespektra av gentamicin C^ og gentamicin C2 henholdsvis, idet massetoppen for de to prøvene var følgende: Gentamicin C^. M<+>477, M<+>+l 478, 420, 360, 350, 347, 322, 319

304, 160, 157.

Gentamicin C2: M<+>(intet), 420, 350, 346, 333, 322, 305, 304,

160, 143.

Det tredje svakere bånd fra den eksperimentelle

prøve med en R^-verdi på 0,22 var utilstrekkelig til at man kunne få en massespektral-analyse.

Eksempel 4

dl-deoksyinosose-(dl-2,3,4,5-tetrahydroksy-l-cyklo-heksanon) (500 yg/ml) beskrevet ovenfor under fremstilling 1

ble inkubert med mutanten M. purpurea ATCC 31.164, i 4 døgn i spiringsmedium 2, og det resulterende medium ble funnet å være antibiotisk aktiv ved en skivediffusjonsprøve mot B. subtilis som prøveorganisme. Et råprodukt fra mediet viste ved hjelp av tynnsjiktskromatografi via bioautografi idet man brukte B. subtilis som prøveorganisme, tre antibakterielle komponenter som tilsvarte gentamicinene C, , C_.og. Cv ved

x z xa R^-verdier på 0,37, 0,31 og 0,26 henholdisvis, idet system 1 er beskrevet i eksempel 1 ovenfor.

Eksempel 5

Scyllo-inosose-pentaacetat[2,3,4,5,6-pentahydroksy-cykloheksanon-pentaacetat-(2,4,6-cis)] (Kluyver et al., Ree. trav. chim. Pays-Bas. 58, 956 (1939)) (500 yg/ml) ble inkubert med mutanten M. purpurea ATCC 31.164 i 4 døgn i medium 2, og det resulterende fermenteringsmedium inneholdt streptamin-analogen av gentamicin og var antibiotisk aktiv ved en skive-dif f us jonsprøve mot B. subtilis som prøveorganisme.

Eksempel 6

dl-Viboquercitol-[dl-1,2,3,4,5-cykloheksanpentol-(1,2,4-cis)] (McCasland et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 4020

(1953)) (500 yg/ml) ble inkubert med mutanten M. purpurea ATCC 31.164 i 7 døgn i medium 2, og det ferdige medium inneholdt gentamicin som var antibiotisk aktiv ved en skivediffu-sjonsprøve mot B. subtilis som prøveorganisme.

Eksempel 7

dl-2,3,4,6-tetrahydroksy-l-cykloheksanon-(2,4,6-

cis) beskrevet ovenfor under fremstilling 3, ble inkubert med mutanten M. purpurea ATCC 31.164 i 4 døgn i medium 2,

og det resulterende medium inneholdt en blanding av 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-(metylamino)-p-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2-amino-6-(metylamino)-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl- (l->-4) ]-D-5-deoksystreptamin, 0-3-deoksy-4-C-metyl-3- (metylamino) -3-L-arabinopyranosyl- (l->-6) - O-[2,6-diamino-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytroglukopyranosyl- (l->-4) ] -D-5-deoksystreptamin og 0-3-deoksy-4-C-metyl-3- (metylamino) -3-L-arabinopyransoyl- (l-»-6) -O- [2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyransoyl-(1+4)]-D-5-deoksystreptamin, og man fant at disse forbindelser var

antibiotisk aktive ved en skivediffusjonsprøve mot B. subtilis som prøveorganisme.

Eksempel 8

2,4,5-trihydroksycykloheksanon-(2,4-cis) (500 yg/ml) beskrevet ovenfor under fremstilling 4 ble inkubert med mutanten M. purpurea ATCC 31.164 i 4 døgn i medium 2, og det resulterende fermenterte medium inneholdt en blanding av 0-3-deoksy-4-C-metyl-3- (metylamino) -p-L-arabinopyranosyl- (l->-6) - 0-[2-amino-6-(metylamino)-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl- (1^-4) ] -D-2 , 5-dideoksystreptamin, 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-(metylamino)-p-L-arabinopyranosyl-(1+6) -0- [2,6-diamino-6-C-metyl-2,3,4,6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl-(l->-4) ]-D-2 , 5-dideoksystreptamin og 0-3--deoksy-4-C-metyl-3- (metylamino) -p-L-arabinopyranosyl-(l-»-6) -0- [2, 6-diamino-2, 3,4, 6-tetradeoksy-a-D-erytro-glukopyranosyl- (l->-4)] -D-2, 5-dideoksystreptamin, og forbindelsene var antibiotisk aktive ved en skivediffusjonsprøve mot B. subtilis som prøveorganisme.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av aminocyklitolantibiotika med formelen: hvor R 2 og R,- hver er hydrogen eller hydroksy; og Rg og R^ hver er hydrogen eller metyl, samt syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at man dyrker mikroorganismen Micromonospora purpurea ATCC 31.164 i et næringsmedium inneholdende karbohydrater, en kilde for assimilerbart nitrogen, vesentlige salter og en cyklitolforbindelse med formelen: hvor X er C=0 eller C(H)OH; hvor R i hvert tilfelle, er hydrogen eller acetyl og hvor R2' og Rj.1 hver er hydrogen eller OR, og, om ønsket omdanner en oppnådd fri base til et syreaddisjonssalt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til fremstilling av 0-3-deoksy-4-C-metyl-3- (metylamino) -f}-L-arabinopyranosyl-(l-*6) -0- [2-amino-6- (metylamino) -6-C-metyl-2,3,4, 5-tetra-deoksy-a-D-erytroglukopyranosyl- (l->4) ] -D-streptamin, karakterisert ved at man som cyklitol anvender scyllo-inosose.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til fremstilling av 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-(metylamino)-3-L-arabinopyranosyl-(l-»6) -0- [2-amino-6- (metylamino) -6-C-metyl-2,3,4 , 6-tetra-deoksy-a-D-erytroglukopyranosyl-(l-»4)]-D-2,5-dideoksystreptamin; 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-(metylamino)-&-L-arabinopyrano-syl- (l->6) -0- [2, 6-diamino-6-C-metyl-2,3,4, 6-tetradeoksy-oc-D-erytroglukopyranosyl- (l->4) ] -D-2,5-dideoksystreptamin, eller 0-3-deoksy-4-C-metyl-3-(metylamino)-3-L-arabinopyrano-syl- (l->6) -0- [2, 6-diamino-2,3,4, 6-tetradeoksy-a-D-erytroglukopyranosyl- (l-»4) ] -D-2 , 5-dideoksystreptamin, karakterisert ved at man som cyklitol-forbindélse anvender 2,4,5-trihydroksycykloheksanon(2,4-cis).