KR100311067B1

KR100311067B1 - 콜히치노이드화합물들을그와상응하는3-글리코실유도체로만드는생물학적변환과정

Info

Publication number: KR100311067B1
Application number: KR1019980710918A
Authority: KR
Inventors: 에지오 봄바르델리; 세사레 폰존
Original assignee: 다리오 보나꼬르시; 인데나 에스피아
Priority date: 1996-10-07
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2001-12-17
Also published as: EP0931161B1; PT931161E; HK1019620A1; PL331942A1; CA2252725C; HUP9903806A2; AU714810B2; CZ118799A3; CN1218514A; JP3428027B2; CN1094978C; CZ295451B6; SK282344B6; JP2000508179A; DE69710744T2; NO319286B1; HUP9903806A3; WO1998015642A1; US6150140A; KR20000022478A

Abstract

바실러스 메가테리움균주들(Bacillus megaterium strains)을 사용하여 콜히치노이드 화합물들을 각각 상응하는 3-O-글리코실 유도체들로 변환시킨다.

Description

콜히치노이드화합물들을 그와 상응하는 3-글리코실유도체로 만드는 생물학적변환공정

본 발명은 콜히치노이드(colchicinoid) 화합물들을, 선택된 미생물균주룰 이용하여 생물학적변환(biotransformation)을 유도함으로써 각각 해당하는 3-O-글리코실유도체들로 변환시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 공정은 콜히친이나 치오콜히친 또는 이들의 유도체로부터 출발하여 방향족환의 3번탄소자리(C-3)만이 배타적으로 당화되어 있는 콜히치노이드화합물들을 높은 수율과 순도로 제공한다.

벤젠고리의 3번탄소자리(C-3)가 당화되어 있는 화합물들은 약효가 높으며 또한 다른 새로운 의약품을 제조하는데에도 이용될 수 있기 때문에 약리학적으로 매우 중요한 화합물들이다. 특히 치오콜히코사이드(thiocolchicoside) 즉, 3-O-글루코실치오-콜히친은 주로 골격근계통의 질환치료에 쓰이는 약학적으로 매우 중요한 약물의 주성분으로서 그리고 새로운 항암제나 면역억제제, 항소양제와 항염증제약물을 제조하는 출발물질로서 유용하다.

과거에도, 3-글리코실치오콜히치노이드화합물들을 제조하기 위하여 화학반응수단이나 생물학적변환수단을 사용한 수차례의 노력이 있었다. 화학적방법은 복잡하고 비특이적인 일련의 반응으로 구성되어 다수의 당화된 유도체들의 혼합물을 얻게 되는데 이들중 어떤 화합물들은 활성이 없는 것이었다. 따라서, 방향족환의 3번탄소자리(C-3)에만 특이하게 당화가 되어 있는 유효생성물의 전환수율은 매우 낮았다.

한편, 생물학적인 접근법은 실질적으로는, 센텔라 아시아티카균(Centella Asiatica)을 배양함으로써, 치오콜히친을 변환시켜 방향족환의 2번(C-2)과 3번탄소자리(C-3)에 단당류가 결합된 유도체로 변환시키는 방법인데, 이 방법은 선택성이 그다지 높지 않으며 수율이 미미하고 생산성이 낮다(Solet, J.M., et al., Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993 참조). 콜히치노이드화합물을 생물변환시키는 또 다른 노력들은 단순히 방향족환의 2번탄소(C-2)와 3번탄소(C-3)에 있는 메톡시그룹이 탈메틸화(demethylation)되는 결과를 가져왔는데, 어쨋든, 이 방법들은 언제나 제한적인 수율과 낮은 생산성, 그리고 골격선택성이 불량하다는 단점이 있었다.

그래서, 허포드와 그 동료들은(Hufford C. D. et al., J. Pharm. Sc., 68, 10, 1239-1242, 1979), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)와 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis)를 단독내지 병용하였고, 벨레와 그 동료들은(Bellet P. et al., GB-923421,1979)스트렙토마이세스속의 다른 균주와 다른 박테리아와 곰팡이균주들을 이용함으로써 콜히친과 그 유도체들을 각각 그와 상응하는 3-데메칠화유도체들로 변환시키고자 노력하였다.

이러한 공지의 방법들에 의해 얻어진 결과를 보면 위에서 해당 미생물효소의 비선택성(non-selectivity)과 관련하여 언급한 바 있는 내용들이 그대로 확인되는데 예를 들면, 알카로이드분자의 2번탄소(C-2), 3번탄소(C-3) 또는 10번탄소자리(C-10)에 나타나는 변화들이다. 더욱이, 이러한 촉매반응계의 생산성은 낮은 전환율과 사용할 수 있는 기질의 농도가 낮다는 점, 그리고 트로폴론환(tropolone ring)이 자주 분해된다는 점 때문에 매우 빈약한 수준이다. 최근에는, 풀레브와 그 동료들이(Poulev et al., J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33-38, 1995) 박테리아속 미생물에 의한 생물변환의 특이성을 확보하였으나 이 역시 여전히 수율이 빈약하고 생산성이 낮았다.

위에서 언급한 미생물들(스트렙토마이세스, 바실러스등)과 유사한 미생물들로부터 얻은 효소의 활성을 다른 종류의 화합물, 예를 들면, 메이탄시노이드류(maytansinoids)에도 응용하였다(US Pat. 4 361 650: Izawa, M., et al.., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). 이 경우에 있어서도 이 촉매반응은 전적으로 탈메틸화반응이었고 전환수율이 낮고 생산성이 낮았다.

바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 얻은 알파-아밀라제의 글리코실 트란스페라제(Glycosyl Transferase) 활성에 대한 문헌기록을 보면(Brumm, P. J., et al.., Starch, 43, 8, 319-323, 1991), 트란스페라제반응(특히 글루코즈나 글루코사이드에 대한 반응)의 접수체특이성(acceptor specificity)이 매우 높은 것으로 되어 있다. 같은 미생물원으로부터 생산된 싸이클로덱스트린-글루코실트란스페라제(Cyclodextrin-glucosyl transferase)는 전분으로부터 출발하여 루부소사이드(rubusoside, 13-O-beta-D-glucosyl-steviol beta-D-glucosyl ester)의 알파-1.4-트란스글리코실레이션반응(alpha-1,4-transglucosylation)을 촉매한다. 또한, 이 생물학적전환반응(bioconversion)에 있어서 트란스페라제반응의 접수체는 기질의 글루사이드분획(substrate glucide fraction)이다(Darise, M., et al.., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). 싸이클로덱스트린-글루코실트란스페라제는 종래 전분으로부터 싸이클로덱스트린 G6, G7, G8을 제조하는데 이용되어져 왔다(Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

이러한 실예들은, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 의해 발현된 글리코실 트란스페라제의 활성은 높은 기질특이성을 갖고 있어서 오직 글루사이드접수체만이 관여하며 따라서, 분자구조가 다르고 복잡한 2차대사물 즉, 콜히치노사이드들과 같은 물질과는 관여하지 않는다는 점을 명백히 보여준다. 사실, 이러한 미생물들을 사용하여 콜히치노이드류를 3-글리코실유도체로 효소전환하였다는 실예는 전혀 알려져 있지 않다.

그런데, 이제 고농도의 콜히친이나 치오콜히친의 존재하에서 생육할 수 있는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)속의 어떤 균주들이 월등하게 높고 매우 특이적인 생물학적변환활성을 갖고 있어서 콜히치노이드기질을 방향족환의 3번탄소자리(C-3)만 배타적으로 당화된 유도체들로 변환시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 구조변환은 매우 짧은 시간내에 일어나며 놀라울 정도로 높은 수율을 나타낸다는 특징이 있다.

그러므로, 본 발명은 하기의 일반구조식(1)로 표시되는 화합물들, 즉, 3-O-글리코실콜히치노이드화합물들을 제조하는 방법에 관한 것으로,

상기식에서 R₁은 O-글리코사이드잔기를 나타내고, R₂는 수소원자 또는 탄소수 한개 내지 일곱개의 아실(C₁-C₇acyl), R₃는 탄소수 한개 내지 여섯개의 알콕시(C₁-C₆alkoxy) 또는 탄소수 한개 내지 여섯개의 치오알킬(C₁-C₆thioalkyl)을 나타내는데, 이들은 R₁이 수산기 또는 메톡시인 화합물이 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 의하여 생물학적으로 전환시켰을 때 얻어지는 화합물군을 구성한다.

바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)은 그람양성균으로 포자를 생성하며 세포의 반경은 1.0 마이크론보다 크다. 각종의 배양물질에서 호기적으로 생육하며 카탈라제양성이고, 젤라틴을 가수분해한다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)속의 균주들은 성장시험과 현미경적분석을 통하여 밝혀진 것처럼, 콜히친이나 치오콜히친이 고농도인 환경에서도(3 그램/리터 이상) 만족스럽게 성장하며 생존할 수 있는 능력을 갖고 있다.

한편, 같은 속의 다른 균주인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 기질농도가 1.5 그램/리터정도만 되어도 벌써 성장이 곤란한데(흡광도가 대조균에 비하여 15-25 %임), 기질농도가 3 그램/리터가 되면 성장곤란은 더욱 뚜렷해지고 때로는 갑작스런 세포용해현상이 나타나기도 한다. 이에 반하여, 선택된 바실러스 메가테리움균(Bacillus megaterium)의 배양체는 전술한 기질농도조건에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 비하여 훨씬 높은 성장수준(두배 내지 세배)에 이른다.

이러한 높은 선택성과 생물학적변환반응의 효율성은 경이적이며 특별한 것인데, 왜냐면 수율수준이 80 %에서 100 %에 이르고 통상적으로 약 90-95 %이기 때문이다. 더욱이, 생물학적전환반응에 사용된 미생물들은, 반복되는 발효과정에 있어서도, 영구적으로 촉매활성을 유지할 수 있으므로, 당장 주어진 배치에 특이적인 생물학적변환을 제공할 뿐만 아니라 연속적인 공정에도 똑같이 특이적인 생물학적변환을 제공한다. 따라서 이 방법은 높은 생산성과 재현성을 나타낸다.

이러한 주목할만한 생산수율에 덧붙여서, 이 방법은 반응 지역 선택성(reaction regioselectivity)도 뚜렷하기 때문에 결과적으로 생성되는 생성물의 높은 품질과 순도를 보장하여 단순한 하부공정만으로도 100 %의 순도를 제공한다. 또한 이 방법의 중요한 장점으로는 정제공정과 생성물의 회수공정의 단계가 줄어든다는 점과 공정의 경제성 그리고 적용시의 융통성과 안전성을 들 수 있다.

본 발명을 실시하는데 있어서 유용한 미생물균주의 선택을 위한 일련의 작업과정은 다음과 같다.

1) 자연균주원이나 보존균체집단으로부터 고농도의 콜히친기질존재하에서도 성장할 수 있는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)배양체의 선택

2) 상기 1)항으로부터 특정한 기질물질을 점증적인 고농도로 적용한 후 생물학적변환능력분석을 실시함으로써 콜히친화합물들을 그와 상응하는 3-O-글리코실유도체로 변환시킬 수 있는 활성을 검증한 균주의 분리

3) 상기 2)항에서 분리선택된 균주에 대한 미생물학적인 특성확인시험과정

4) 상기 2)항에서 분리선택된 균주에 대하여 목표특이적인 선택시험을 통하여 생물학적변환수율의 점진적인 향상과정

5) 생물학적변환반응을 최적화하기 위하여 절대적인 발효공정변수의 연구 및 최적화과정

6) 산업적인 규모의 생산에 응용할 수 있는 안정적이고 균일한 접종균주를 확보하기 위하여 고생산성 배양체를 보존하는 방법의 연구 및 최적화

7) 배치(batch)작업이나 연속작업에 있어서 발효기 단위나 배치단위공정의 대규모화

8) 하향처리(down stream)공정과 생산물의 회수를 위한 방법의 수립 및 최적화

구체적으로, 본 발명에서 유용한 미생물들은 균주보관센타로부터 입수한 보관균주로부터 출발하거나 또는 다양한 근원지로부터 채취한 토양샘플로부터 출발하여, 하나의 유기질소원(펩톤, 효모추출물, 육류추출물, 아스파라긴, 등등)과 하나의 탄소원(글리세린, 전분, 말토우즈, 글루코우즈, 등등)을 다양하게 함유한 다른 조성의 한천배지에서, pH 5 내지 8, 바람직하게는 pH 6~7범위에서 배양한 후 선택적으로 회수함으로써 선별할 수 있다. 이때의 배양온도는 20℃ 내지 45℃의 범위, 바람직하게는 28℃ 내지 40℃의 범위인 것이 좋다.

전환시키고자 하는 콜히친류물질들이 독성을 나타낼 수 있는 고농도로 존재하는 속에서 배양균주들이 자라는지 그 생장능력을 평가하는 데에는 단계적인 희석을 한 다음, 미리 콜히친이나 치오콜히친을 0.1 그램/리터에서 3.0 그램/리터의 농도(미생물군집의 주요부분의 성장을 억제할 수 있도록)로 첨가한 성분을 부분적으로 함유하고 있는 여러가지 다른 조성의 한천기질위에 접종하는 기법이 사용된다. 전술한 조건하에서 생장할 수 있는 집락들은 무균조건하에서 끄집어내어 다른 한천배지에 접종한 다음 그 순도와 성장의 균질성을 점검한다.

배양균을 보존하기 위하여 사용되는 배지로는 전형적인 미생물학적 기질로서 유기성질소원들(펩톤, 효모추출물, 트립톤, 육류추출물, 등등)과 하나의 탄소원(포도당, 말토우즈, 글리세린, 등등)을 함유하며 pH 5 내지 8, 바람직하게는 pH 6~7의 범위인 것이 좋다. 배양온도는 20℃ 내지 45℃의 범위, 바람직하게는 28℃~40℃인 것이 좋다.

여기서 선택된 미생물들에 대하여 콜히치노이드류화합물들의 존재하에서 액내배양(submerged culture)시의 성장능력과 이들 화합물들을 각각 대응하는 3-글리코실유도체들로 전환시키는 능력을 검정한다. 이 검정은 하나 내지 그 이상의 유기질소원(효무추출물, 펩톤, 트립톤, 카제인수화물, 육류추출물, 옥수수대로 만든 발효액, 등등)과 하나 또는 그 이상의 탄소원(포도당, 글리세롤, 전분, 사탕, 등등)과 무기인과 질소원 그리고 각종 이온들(K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺, 등등)의 무기염류로 구성된 여러가지 다른 조성을 가진 액체배지 20 밀리리터를 함유한 100 밀리리터 용량의 플라스크속에서 실시한다.

또한, 배양균주 샘플에 일반적인 돌연변이 유발기법(자외선조사, 등등)을 사용하여 임의적인 변이를 유발하여 어떤 특정한 생물학적전환능력을 갖게끔 유도한 후 상술한 절차에 따라 평가할 수 있다.

각각의 생물학적전환검정으로 얻어진 배양균주샘플은 박층크로마토그래피(TLC)와 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 3-글리코실유도체를 생산하는 능력을 분석한다. 선택된 미생물들이 콜히치노이드기질을 각각 대응하는 3-글리코실유도체로 전환시키는 능력은 플라스크속에서 300 밀리리터 규모로 전술한 선택단계에서 사용한 것과 같은 배양매체를 사용하여 생물학적전환검정을 실시하여 확인한다. 여기서 양성반응을 보인 미생물들은 다른 배양매체를 사용한 300 밀리리터 규모의 시험을 통하여 생물학적전환능력을 최적화하는데 사용된다.

배양과 발효를 위하여 검토된 주요한 변수인자들은 다음과 같다.: 유기질소원, 탄소원, 광산염류, 온도, 교반 및 통기, pH, 배양시간, 접종비율, 준배양단계수(subculture steps), 전환시키고자 하는 기질의 첨가시기. 본 발명의 생물학적전환을 실시하는데 유용한 능력을 가진 선택된 세균성미생물들은 하나 또는 그 이상의 유기질소원, 바람직하게는 효모추출물, 육류추출물, 펩톤, 트립톤, 카제인수화물, 옥수수대로 만든 발효액, 등등의 하나 또는 그 이상을 함유한 고체나 액체배양기질 양쪽에서 모두 성장할 수 있다. 미생물의 성장과 생물학적전환을 위하여 유용한 탄소원으로서는 포도당, 과당, 사탕, 글리세롤, 맥아엑기스, 등등이 있는데 바람직한 것은 포도당, 과당, 글리세린이다. 배양매체는 또한 무기인원과 K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, NH₄ ⁺, 등등의 염류를 함유한다.

선택된 미생물들은 20℃에서 45℃의 온도, 바람직하게는 28℃에서 40℃의 온도와, pH 5와 8사이, 바람직하게는 pH 6-7사이에서 성장할 수 있다. 같은 조건하에서, 고려대상 미생물들은 콜히치노이드화합물들을 각각 대응하는 3-글리코실유도체들로 전환시킬 수 있다. 이러한 생물학적전환은 배양체를 플라스크속에 넣어서 150 rpm 내지 250 rpm으로 교반하면서 회전진탕기에서 액내배양(submerged culture)할 때에 일어날 수 있다.

미생물의 성장과 관계가 있는 이 생물학적전환의 특수한 반응역학으로 말미암아 생물학적전환목적을 위한 최적조건은 바로 미생물의 성장에 최적인 조건과 동일하다. 그러므로, 미생물성장을 촉진하는데 유용한 배양매체, 즉, 앞에서 언급한 유기 및 무기질성분에 기초한 배양매체는 해당기질물질의 양호한 생물학적전환활성발현에도 유용하다. 후자의 해당기질은 최초발효단계에 배양액중에 첨가한다.

본 발명의 생물학적전환은 미생물의 기하급수적인 성장초기에 나타나기 시작하여 미생물의 성장과 병행하여 향상되는 효소전환에 근거한 것으로서; 3-글리코실유도체로 전환되는 최대치는(매우 높음, 95-100 %까지) 처음 24-30 시간안에 도달된다. 생물학적전환의 지역선택성은 절대적이다. 즉, 2-글리코실유도체가 존재한다는 근거는 전혀 없었다. 결과적으로 생성되는 물질은 전적으로 세포외에 존재한다.

본 발명의 생물학적전환은 그 배양조건, 특히, 배양매체, 온도 및 처리시간에 관한 한 아무런 변화를 시키지 않고도 쉽게 그 규모를 발효조규모로 확대할 수 있다. 미생물의 성장을 좋게하기 위해서는 교반 및 통기의 수준을 적당히 하는 것이 매우 중요한데, 구체적으로는 배양액 1 리터에 대하여 1분당 1-2 리터(1-2 vvm)의 통기수준, 바람직하기로는, 1.5-2.0 리터(1.5-2.0 vvm)의 통기수준을 유지하는 것이 필요하다.

생물학적전환으로 얻어지는 생성물은 액체분획물을 원심분리하여 고형분을 분리제거하고 상등액을 회수한 다음 배양액을 추출하거나 또는 배양액을 마이크로여과할 때 얻어지는 투과물(permeate)을 회수하여 얻는다. 생성물회수를 최적화하기 위하여 배양물을 알코올로 처리할 수도 있다.

생물학적전환으로 얻은 생성물의 정제와 회수는 크로마토그래피기법을 사용하여 흡착수지상에서 알코올, 바람직하게는 메탄올로 전개하여 분리하는 기법으로 실시할 수 있다. 이때 얻어진 생성물을 함유한 수성메탄올용액을 친유성유기용매, 바람직하게는 메칠렌클로라이드로 추출하여 더 정제할 수 있다. 이처럼 알코올과 유기용매의 혼합물로 처리한 다음에는 생성물은 최종알코올용액으로부터 결정화하여 순수한 상태로 얻을 수 있다.

생물학적전환공정은 트로폴론그룹(tropolone group)을 함유한 기질에 특이적이며 콜히친, 치오콜히친, 3-데메칠콜히친, 3-데메칠치오콜히친, 엔-데아세칠치오콜히친과 다른 임의로 치환된 콜히친류와 같은 다수의 콜히치노이드화합물들에 적용할 수 있다. 트로폴론그룹(tropolone group)을 갖고 있지 않은 다른 천연화합물들은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 의하여 당화되지 않는다. 포도당은 글리코실트란스페라제의 활성을 손상시키지 않은 채 다른 당류, 즉, 과당이나 갈락토즈로 대체할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 구체적인 실시예를 가지고 상세히 설명하면 다음과 같다.

(실시예 1)

농가토양으로부터 분리한 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)의 배양체 분획을 무균생리식염액 20 밀리리터에 현탁한 다음 희석계수 1:10,000,000으로 계단희석한다. 여러가지 희석배수로 된 현탁액을 각각 엘비-한천배지(LB-Agar)와 콜히친이나 치오콜히친을 최종농도가 2 그램/리터가 되도록 첨가한 엘비-한천배지(LB-Agar)에(표 참조) 접종한다. 배양물을 온도 28℃에서 3 일간 어둠속에서 배양한다. 콜히치노이드가 함유된 선택배지에서 성장한 집락을 분리하고 비선택배지에 접종하여 정제한다. 이 샘플들은 상술한 바와 같은 조건에서 배양하되 배양시간은 짧게 한다(24 시간). 이어서, 배양물을 시험관속에 들어 있는 동일한 한천배지에 옮기고 위와 같은 조건으로 24 시간동안 배양한다.

상술한 바와같이 하여 선택된 배양물의 분획들을 가지고 콜히친이나 치오콜히친을 최종농도가 0.4 mg/ml가 되도록 첨가한 배지 에스티(ST)(표 참조) 20 밀리리터를 함유한 100 밀리리터 용량의 엘렌마이어 플라스크에 접종한다. 배양물을 회전진탕기에 적재하고 28℃에서 200 rpm으로 교반하면서 철야 배양한다. 매 3-4 시간마다 배양물의 일부를 취하여 실리카겔상에서 아세톤:에칠아세테이트:물 5:4:1의 혼합전개용매시스템을 사용하여 박층크로마토그래피(TLC)를 실시, 분석하여 콜히친기질이 생물전환된 정도를 점검한다.

4일간 배양한 후, 3-글리코실유도체로 분해시키는 촉매적활성이 명백히 나타난 배양분획은, 시험관내에서 새로운 접종균을 조제하기 위하여, 상술한 단계적희석을 통하여 평판플레이트에 회수한다. 플라스크내에서의 생물학적전환 검정은 상기한 조건과 동일하게 반복하여 실시하되 다만 콜히친이나 치오콜히친의 최종적인 농도가 현저히 높은 수준(1 mg/ml)에서 실시한다. 가장 활성이 강한 단일배양균체(기질전환율이 80 %와 동등 또는 그 이상인 것)는 실시예 3에서 서술한 바와같은 냉동시험관에 담긴 접종균을 제조하는데 사용한다.

(표 1)

배지의 조성

1)엘비-한천(LB-Agar)(멸균: 121℃ x 20') - pH 7

트립톤 10 g/l

효모추출물 5 g/l

염화나트륨 10 g/l

한천 15 g/l

2)브로드 에스티(Broth ST)(멸균: 121℃ x 20') - pH 7

포도당 20 g/l

글리세롤 10 g/l

펩톤 15 g/l

효모추출물 5 g/l

염화나트륨 3 g/l

염화암모늄 3 g/l

인산일수소칼륨 8 g/l

인산이수소칼륨 3 g/l

황산마그네슘7수화물 0.5 g/l

(실시예 2)

다음에 기재한 분양균주(독일미생물보관소, 브라운슈바이그, 독일): DSM 90, 509, 322, 333, 1667, 1670, 1671)로부터 유도한 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 출발하여 실시예 1에서 기재한 절차를 그대로 반복한다.

DSM 90,

DSM 509,

DSM 322,

DSM 333,

DSM 1667,

DSM 1670,

DSM 1671.

실시예 1에서와 같이 선택되고 치오콜히친을 첨가한(1 mg/ml) 배양물을 4일간 액체배양법으로 배양한다. 박층크로마토그래피법(TLC)으로 분석하면 기질이 치오콜히코사이드로 전환된 전환수율은 50 %(균주 DSM 1671)에서부터 70 %(균주 DSM 90), 80 %와 그 이상(균주 DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670)까지 다양하게 나타나는 것을 알 수 있다.

(실시예 3)

상기 실시예에서 기술한 바와 같이 하여 얻어진 배양물샘플은 20 밀리리터의 브로드 에스티(broth ST)를 함유한 100 밀리리터 용량의 엘렌마이어플라스크를 접종하는데 사용된다. 브로드배양물을 회전진탕기에 적재하고 200 rpm으로 교반하면서 온도 30℃에서 하룻밤 철야배양한다. 배양이 끝난 다음 멸균글리세린용액을 가하여 배양물의 최종농도가 20 %가 되도록 한다. 그런다음, 배양물을 2 밀리리터용량의 냉동시험관에 분주하고 바로 액체질소중에 담가둔다.

몇일 후, 배양물의 10 %를 37℃에서 급속히 해동시킨다. 각각의 냉동시험관에 든 분획은 20 밀리리터의 배지 에스티(ST)를 함유한 100 밀리리터용량의 엘렌마이어플라스크에 접종한 다음 이어서 온도 28℃에서 하룻밤(전배양) 200 rpm으로 교반하면서 배양한다. 배양이 끝난 다음, 각각의 전배양물 2 밀리리터를 무균하에서 20 밀리리터의 신선한 배지 에스티(ST)배지에 옮기고 이번에는 콜히친이나 치오콜히친을 첨가하여 최종농도가 1 그램/리터가 되게 한다. 실시예 1에 기술한 조건에 따라 생물학적전환을 시행하고 점검한다. 분석결과, 기질이 3-글리코실유도체로 전환된 비율은 위에서 기술한 것처럼 정량적으로(80 %와 그 이상) 일어난 것을 확인할 수 있었는데, 이것은 냉동된 배양물들이 안정된 촉매활성을 갖고 있다는 것을 입증한다. 해동후에 즉시 엘비-한천배지에 접종시킨 브로드배양물의 병행대조물은 냉동배양물의 생육활성, 균질성 및 순도를 확인시켜 준다.

(실시예 4)

냉동시험관에 든 배양물분획은 해동후 50 밀리리터의 배지에스티(ST)배지를 함유한 300 밀리리터용량의 엘렌마이어플라스크를 접종하는데 사용된다. 온도 30℃, 250 rpm으로 철야배양한후 전배양물 5밀리리터를, 콜히친이 최종농도 1 그램/리터로 첨가된 동일한 배지 50 밀리리터에 옮겨 넣는다. 전술한 바와 같은 조건으로 2 일 동안 배양한다. 매 4시간마다, 배양물의 샘플을 취하여 성장수준(600 nm에서 흡광도를 측정)과 콜히코사이드의 생산[박층크로마토그래피(TLC) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)], 멸균도(엘비-한천배지상에서)를 평가하고 현미경하에서 형태학적인 검사를 실시한다.

고속액체크로마토그래피(HPLC)분석을 위하여 배양물분획 1 밀리리터에 메탄올 9밀리리터를 가하고 13,000 rpm으로 2 분간 원심분리한다. 물:아세토니트릴 80:20 의 전개용매시스템을 사용하여 전개시켜 역상크로마토그래피(reverse phase HPLC)를 실시하여 상등액중에 함유된 콜히코사이드의 함량을 분석한다. 고속액체크로마토그래피(HPLC)분석을 해보면 콜히친이 콜히코사이드로 전환되는 것은 성장의 진행과 병행하여 진행한다는 것을 알 수 있다. 약 26 시간 배양 후, 생물학적전환은 완료된다. 콜히코사이드의 최종수율은 80 %에서 85 %에 이른다.

(실시예 5)

실시예 4에서 기술한 방법중에서 콜히친대신에 치오콜히친을 같은 최종농도(1 그램/리터)로 첨가한다는 것이외에는 모두 동일한 과정을 반복한다. 배양물의 성장과 생산반응은 콜히친에서 얻어진 것과 유사하며 치오콜히코사이드의 수율은 약 90%이다.

(실시예 6)

실시예 4에서 기술한 방법중에서 콜히친대신에 3-데메칠치오콜히친을 같은 최종농도(1 그램/리터)로 첨가한다는 것이외에는 모두 동일한 과정을 반복한다. 배양물의 성장과 생산반응은 콜히친에서 얻어진 것과 유사하며 치오콜히코사이드의 수율은 약 90 %이다.

(실시예 7)

실시예 4에서 기술한 방법중에서 콜히친대신에 엔-포르밀치오콜히친(N-formylthiocolchicine)을 같은 최종농도(1 그램/리터)로 첨가한다는 것이외에는 모두 동일한 과정을 반복한다. 배양물의 성장과 생산반응은 콜히친에서 얻어진 것과 유사하며 치오콜히코사이드의 수율은 약 90 %이다.

(실시예 8)

엘렌마이어플라스크에 든 1 리터의 브로드에스티(ST)배지에 DSM 1670을 함유한 냉동시험관으로 접종한다. 플라스크를 온도 30℃, 250 rpm으로 하룻밤 철야배양한다. 무균조건하에 접종균을, 치오콜히친의 최종농도가 1그램/리터가 되도록 첨가한 무균브로드에스티(ST)배지 9 리터를 함유하고 있는 14 리터용량의 배양조에 옮긴다. 적절한 수준으로 교반-통기(교반은 900 rpm까지, 통기는 배양물의 성장정도에 따라 1.0 내지 1.5 vvm범위)를 하면서 발효를 실시한다.

매 2 시간마다, 배양브로드로부터 샘플을 채취하여 다음과 같은 분석시험을 실시한다.

- 파장 600 nm에서 광학밀도(optical density:OD)의 측정

- 엘비-한천상에서 무균도 및 순도분석

- 현미경으로 형태관찰(그람염색)

- 박층크로마토그래피(TLC) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 의한 치오콜히코사이드 함량의 분석

약 28 시간 후 치오콜히코사이드로의 전환은 거의 종료된다. 최종수율은 약90 %이다.

(실시예 9)

실시예 8에서 기술한 과정을 그대로 반복하되 다만, 28 시간동안 발효가 끝난 다음 배양브로드를 90 %만 회수하여 생성물을 추출한다(분획1). 나머지 배양브로드 10 %는, 치오콜히친 10 그램을 함유한 신선한 무균브로드에스티(ST)배지 9 리터와 함께 발효조에 넣는 다음 실시예 8에 기술한 방법대로 발효를 실시한다.

26 시간 후, 배양브로드 9 리터를 모아 추출한다(분획2). 나머지 배양브로드는 다시 신선한 치오콜히친(10 그램)을 함유한 신선한 무균브로드에스티(ST)배지 9 리터와 함께 발효조에 넣은다음, 전술한 방법대로 발효를 실시한다. 26 시간 후, 배양브로드를 전부 모아서 추출한다(분획3). 이상과 같은 세번의 발효작업에서 균주의 생물전환활성은 동일하게 안정된 상태를 유지하여, 전환수율은 약 90 %였으며 치오콜히코사이드의 총생산량은 단일배치공정에서 얻은 것과 비교할 때 실제로 3배였다.

(실시예 10)

발효작업으로부터 얻은 최종배양브로드(총량 약 27 리터)를 가지고, 0.22 마이크로미터 세라믹카트리지로 구성된 마이크로필터를 통과시켜 여과하여 배양브로드로부터 세포를 분리한다. 투과물은 미쓰비시사의 흡착수지인 에치피21(HP21)이 충진된 컬럼에 흡수시킨다. 물로 세척한 다음 메탄올로 전개한다. 메탄올용출액을 진공하에서 농축건조한 후, 다시 메탄올에 녹인다. 메칠렌클로라이드로 반복추출한 다음 알코올분획을 농축건조한 후 다시 에탄올-메칠렌클로라이드 1:1 혼합용매에 녹인다. 실리카겔을 사용하여 정제한 후 용액을 진공하에서 농축시키고 메칠렌클로라이드를 에탄올로 대체시킨다.

결과적으로 얻어지는 현탁액을 농축한 후 결정이 석출하도록 방치한다. 다시 에탄올-클로로포름 혼합용매에 녹인 다음 실리카겔을 사용하여 정제한 후 에탄올로 두번째의 결정화(crystallization)를 실시한다. 결과적으로 얻어지는 생성물은 고속액체크로마토그래피(HPLC), C-NMR, H-NMR 그리고 매스-스펙트럼등으로 분석한 바, 치오콜히코사이드 표준품과 같은 것으로 판명되었다.

Claims

(1회정정) R₁이 수산기 또는 메톡시인 하기 일반식(I) 화합물을 바실러스 메가테리움(Bacillus meaterium)으로 생물학적 변환(biotransformation)시켜 하기 일반식(I)으로 표시되는 3-0-글리코실콜히치노이드화합물들을 제조하는 방법.

상기식에서, R₁은 0-글리코사이드잔기를 나타내고, R₂는 수소원자 또는 탄소수 한개 내지 일곱개의 아실기(C₁-C₇acyl), R₃는 탄소수 한개 내지 여섯개의 알콕시(C₁-C₆alkoxy) 또는 탄소수 한개 내지 여섯개의 치오알킬기(C₁-C₆thioa1kyl)를 각각 나타낸다.
제1항에 있어서, R_l이 O-글루코사이드 잔기인 화합물(1)을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 콜히코사이드와 치오콜히코사이드를 제조하는 방법.
(1회정정) 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 생물학적 변환(biotransformation) 반응이 온도 28℃ 에서 40℃까지, pH 6에서 7까지이고 포도당, 과당 또는 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 심부배양(submerged culture)시켜 수행하는 제조방법.
(1회정정) 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 사용된 배양배지가 R₁이 수산기 또는 메톡시기인 화합물(I)을 0.1에서 3.0 그램/리터를 함유하는 제조방법.
(신설) 제4항에 있어서, 사용된 배지가 R₁이 수산기 또는 메톡시기인 화합물(I)을 0.1에서 3.0그램/리터를 함유하는 제조방법.