SK282344B6 - Spôsob prípravy 3-O-glykozylkolchicínových zlúčenín - Google Patents
Spôsob prípravy 3-O-glykozylkolchicínových zlúčenín Download PDFInfo
- Publication number
- SK282344B6 SK282344B6 SK445-99A SK44599A SK282344B6 SK 282344 B6 SK282344 B6 SK 282344B6 SK 44599 A SK44599 A SK 44599A SK 282344 B6 SK282344 B6 SK 282344B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- colchicine
- culture
- biotransformation
- cultures
- compounds
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-(methylthio)-9-oxo-3-[[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6,7-dihydro-5H-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N 0.000 claims description 10
- 229960000287 thiocolchicoside Drugs 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UXAFRQPVHYZDED-ZZEDUEFDSA-N Colchicoside Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UXAFRQPVHYZDED-ZZEDUEFDSA-N 0.000 claims description 5
- UXAFRQPVHYZDED-UHFFFAOYSA-N Colchicoside Natural products C1=C2CCC(NC(C)=O)C3=CC(=O)C(OC)=CC=C3C2=C(OC)C(OC)=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O UXAFRQPVHYZDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008444 O-glycosides Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical class C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 abstract description 55
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 24
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N n-[(7s)-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- MDYOLVRUBBJPFM-UHFFFAOYSA-N tropolone Chemical group OC1=CC=CC=CC1=O MDYOLVRUBBJPFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 β-D-glucosyl ester Chemical class 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 2
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound O=C1C(SC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NUNCOHUMTCDISK-AWEZNQCLSA-N (7s)-7-amino-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-9-one Chemical compound C1([C@@H](N)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC NUNCOHUMTCDISK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- JRRUSQGIRBEMRN-UHFFFAOYSA-N 3-demethyl-colchicine Natural products O=C1C(OC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CCC(NC(C)=O)C2=C1 JRRUSQGIRBEMRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 244000146462 Centella asiatica Species 0.000 description 1
- 235000004032 Centella asiatica Nutrition 0.000 description 1
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N Rubusoside Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSIDJGUAAUSPMG-CULFPKEHSA-N Steviolmonoside Natural products O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QSIDJGUAAUSPMG-CULFPKEHSA-N 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 241000970875 Streptomyces spectabilis Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002682 anti-psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- NEHMKBQYUWJMIP-NJFSPNSNSA-N chloro(114C)methane Chemical compound [14CH3]Cl NEHMKBQYUWJMIP-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000011968 cross flow microfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- CMEGANPVAXDBPL-UHFFFAOYSA-N n-(1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl)acetamide Chemical compound C1CC(NC(C)=O)C2=CC(=O)C(SC)=CC=C2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2OC CMEGANPVAXDBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRRUSQGIRBEMRN-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2,10-trimethoxy-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound O=C1C(OC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 JRRUSQGIRBEMRN-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N rubusoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/248—Colchicine radicals, e.g. colchicosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/11—Bacillus megaterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Kolchicínové zlúčeniny sa transformovali do zodpovedajúcich 3-O-glykoylových derivátov všeobecného vzorca (I) pomocou kmeňov Bacillus megaterium.ŕ
Description
Oblasť vynálezu
Tento vynález sa týka biotransformácie, spôsobenej pomocou vybraných mikrobiálnych kmeňov, z kolchicínových zlúčenín, na príslušné 3-O-glykozylové deriváty. Spôsob, podľa tohto vynálezu, poskytuje kolchicínové zlúčeniny glykozylované výlučne na polohe C-3 aromatického kruhu A, vychádzajúc z kolchicínu, tiokolchicínu alebo ich derivátov, vo vysokých výťažkoch a čistote.
Doterajší stav techniky
Kolchicínové zlúčeniny glykozylované na polohe C-3 benzénového jadra majú mimoriadny farmakologický význam pre ich vysokú efektívnosť alebo na prípravu nových liekov.
Najmä, tiokolchikozid (3-O-glukozyltiokolchicin) je účinnou zložkou mimoriadne významného použitia vo farmaceutickom odbore, najmä v terapii chorôb svalovo-kostrového systému, a ako východiskový materiál na prípravu nových protinádorových, imunosupresívnych, antipsoriatických a protizápalových liekov.
V minulosti sa vynaložilo množstvo námahy na prípravu 3-glykozyl-kolchicínových zlúčenín, buď pomocou chemických reakcií alebo pomocou bio-transformácie.
Chemický spôsob pozostáva z postupnosti komplexu, nešpecifických reakcií, ktoré vedú k zmesi glykozylovaných derivátov, pričom niektoré z nich sú neaktívne. Z toho dôvodu sú konverzné výťažky v efektívnom produkte špecificky glykozylovanom na polohe C-3 aromatického kruhu, veľmi nízke.
Biologický prístup sa týka najmä biotransformácie tiokolchicínu, pomocou kultúry Centella Asiatica, do monoglykozylovaných derivátov na polohe C-2 a C-3 aromatického kruhu; z toho dôvodu takáto transformácia nie je vysoko selektívna a poskytuje nedostatočné výťažky a produktivitu (Solet, J.M., et Al., Phytochemistry 33, 4, 817 až 820, 1993).
Ostatné úsilia biotransformácie kolchicinových zlúčenín dali jednoducho demetyláciu metoxyskupín viazaných na aromatickom kruhu (na polohe C-2 a C-3), v každom prípade vždy charakterizované limitovanými výťažkami a produktivitou a chudobnou regioselektivitou.
Huffort C.D. a iní (J. Pharm. Sc., 68, 10, 1239 až 1242, 1979), použitím Streptomyces griseus a/alebo Streptomyces spectabilis a Bellet P. a iní, (GB-923421, 1959), použitím rozdielnych rás Streptomyces a ostatných druhov baktérií a húb, skúšali transformovať kolchicín a jeho deriváty na zodpovedajúce 3-demetylované deriváty. Výsledky týchto známych metód potvrdzujú čo je vyššie uvedené v spojení s neselektívnosťou mikrobiálnych enzýmov obsiahnutých, napríklad na polohe C-2, C-3 alebo C-10 alkaloidovej molekuly. Okrem toho, úrovne produktivity uvedených katalytických molekúl sú dosť nízke, čo má za následok znížené konverzné výťažky, redukované substrátové koncentrácie, ktoré môžu byť použité a častú degradáciu tropolónového kruhu.
V poslednom čase viac, Poulev a iní (J. Ferment. Bioeng. 79, 1, 33 až 38, 1995) získali špecifickú biotransformáciu bakteriálnych mikroorganizmov, ale naďalej s chudobnými výťažkami a produktivitou.
Enzýmové aktivity z mikroorganizmov, ktoré sú podobné už uvedeným (Streptomyces, Bacillus, etc.) sa použili na biotransformáciu ostatných zlúčenín, ako napríklad maytanzinoidov (US patent 4 361 650: Izawa, M. a ostatní, J. Antibiotics, 34, 12, 1587 až 1590, 1981). Tiež v tomto prípade katalyzovaná reakcia spočíva výlučne v demetylácii, charakterizovanej nízkymi konverznými výťažkami a produktivitou.
Glykozyltransferázová aktivita α-amylázy z Bacillus megaterium už bola opísaná (Brumm, P.J., et al., Starch, 43, 8, 319 až 323); akceptor špecifickosti transferázovej reakcie (výlučne glukózy alebo glukozidov) sa stáva obzvlášť vysokým. Cyklodextrínglukozyltransferázy, vytvorené rovnakými mikrobiálnymi zdrojmi, katalyzujú a-l,4-transglukosyláciu rubusozidu (13-O-p-glukosyl-steviol β-D-glukozyl ester), vychádzajúc zo škrobu. Taktiež v tejto biokonverzii akceptor transferáznej reakcie je substrát glycidovej frakcie (Darise, M., a o., Agric. Bioel. Chem., 48, 10, 2483 až 2488, 1984). Cyklodextrínglykozyltransferázy sa teda použili na prípravu cyklodextrínov G6, G7 a G8 zo škrobu (Kithata, S., Okada, S., Agric. Biol. (Chem., 38,12, 2413 až 2417,1974).
Tieto príklady dokazujú vysokú substrátovú špecifickosť aktivity glykozyltransferázy vyjadrenej pomocou Bacillus megaterium, ktorý obsahuje len glycidové akceptory, z toho dôvodu neobsahujú žiadne reakcie na sekundárnych metabolitoch, ktoré majú rozdielnu, komplexnú molekulovú štruktúru, ako napríklad kolchicíny. V skutočnosti nie sú známe žiadne príklady použitia uvedených mikroorganizmov na enzýmovú konverziu kolchicínov na 3-glykozylové deriváty.
Teraz sa zistilo, že kmene Bacillus megaterium, schopné rastu v prítomnosti vysokých koncentrácii kolchicínu a tiokolchicínu, majú nesmieme vysokú, veľmi špecifickú biotransformačnú aktivitu kolchicinových substrátov na glykozylované deriváty výlučne na polohe C-3 aromatického kruhu. Takáto transformácia sa uskutoční vo veľmi krátkom čase a je charakterizovaná prekvapivo vysokými výťažkami.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob prípravy 3-O-glykozylkolchicínových zlúčenín vzorca (I)
kde
R1 je O-glykozidový zvyšok,
R2 je vodík alebo C^acyl,
R3 je Ci^alkoxy alebo Ci_6tioalkyl, ktorý pozostáva z biotransformácie zlúčenín, v ktorých R1 je OH alebo metoxyskupina pomocou Bacillus megaterium.
Bacillus megaterium je gram-pozitívna spóra generujúca baktériu s priemerom bunky vyšším než 1,0 pm; rastúcim aeróbne na niekoľkých médiách kultúr; katalázapozitívna; hydrolyzačná želatína.
Kmeň Bacillus megaterium, ktorý môže byť použitý podľa tohto vynálezu, poskytuje schopnosť uspokojivého rastu a udržanie životaschopnosti taktiež vo vysokých koncentráciách kolchicínu a/alebo tiokolchicínu (nad 3 g/1), ako bolo dokázané skúškou rastu a mikroskopickou analýzou.
Kongerické druhy, ako napríklad Bacillus cereus, práve pri koncentrácii substrátu z 1,5 g/1 majú ťažkosti pri raste (absorbancie 15 až 25 % kontroly), ktoré sa ešte viac zvýraznia pri koncentráciách 3 g/1, keď dochádza ku dramatickej autolýze. Vybrané kultúry Bacillus megaterium pri vyššie uvedených koncentráciách naopak môžu v porovnaní s Bacillus cereus dosiahnuť omnoho vyššiu úroveň rastu (dvojité na trojité).
Vysoká selektívnosť a efektívnosť biotransfoimácie je prekvapivá a nezvyčajná, pretože úrovne výťažkov sa pohybujú od 80 % na 100 %, obyčajne okolo 90 % až 95 %.
Ďalej, mikroorganizmy použité v biokonverzii sú schopné si udržať permanentnú katalytickú aktivitu, dokonca v opakovaných fermentačných krokoch, z toho dôvodu poskytujú špecifickú biokonverziu vpríkrmových dávkach a plynulých procesoch. Táto metóda preto poskytuje vysokú úroveň produktivity a reprodukovateľnosti.
Uvedená regioselektívna reakcia zabezpečuje, okrem pozoruhodných produkčných výťažkov, vysokej kvality a čistoty výsledných produktov, teda to poskytuje v 100 % čistote pomocou jednoduchého následného spracovania.
Ďalej, dôležitými výhodami sú: znížené pôsobenie kroku čistenia a znovuzískania produktu, ekonomickosť procesu a afidabilita a bezpečnosť použitia.
Pracovné sekvencie na selekciu bakteriálnych kmeňov použiteľné v spôsobe podľa vynálezu obsahujú:
A) Selekciu kultúr Bacillus mealerium, schopných rásť v prítomnosti vysokých koncentrácií kolchicínových substrátov, vychádzajúc z prírodných zdrojov alebo zo zbierky kmeňov.
B) Selekciu izolátu z A), preskúmanie transformačnej aktivity kolchicínov na zodpovedajúce 3-O-glykozylové deriváty, pomocou biokonverzných skúšok na špecifických substrátoch, podávaných v postupne stúpajúcich koncentráciách.
C) Mikrobiologickú charakterizáciu kmeňov vybraných z B).
D) Stupňovité zvýšenie biotransformačných výťažkov, prostredníctvom špecificky orientovanej selekcie bakteriálnej populácie z B).
E) Preskúmanie a optimalizáciu kritických fermentačných parametrov, optimalizovaním biotransformácie.
F) Preskúmanie a optimalizáciu metód na udržanie vysokoproduktívnych kultúr, zabezpečením stabilných, homogénnych inokul na produktívne použitie na priemyselné účely.
G) Zvýšenie efektivity fermentačného procesu vsádzkového, pokrmového a kontinuálneho.
H) Vyvinutie a optimalizácia metód na výrobu produktu a na znovuzískanie produktu.
Špecificky, mikroorganizmus použitý v tomto vynáleze môže byť vybraný zo zhromaždených kultúr získaných z kmeňových depozitových centier, alebo z pôdnych vzoriek rôznych zdrojov, pomocou selektívnej obnovy na rôznych agarových médiách, obsahujúcich organické dusíkové zdroje (peptóny, kvasinkové extrakty, mäsové extrakty, asparagín, atď.) a uhlíkové zdroje (glycerín, škrob, maltóza, glukóza, atď.) s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7. Inkubačné teplotné rozsahy sú od 20 “C až 45 °C, výhodne od 28 °C až 40 °C.
Kapacita rastu kultúiy v prítomnosti toxických koncentrácií transformovaných kolchicínových substrátov je vyhodnotená technikami desiatkového riedenia a pokovaní v paralele, na rozdielnych agarizovaných substrátoch, časť ktorých bola predchádzajúco pridaná ku kolchicínu alebo tiokolchicínu, v koncentráciách od 0,1 až 3 g/1 (tak aby inhibovali rast hlavnej časti mikroorganizmu).
Kolónie schopné rastu, v opísaných podmienkach, boli sterilné odobraté a umiestnené na rozdielne agarizované médiá, tak aby sa preskúšala ich čistota a homogenita rastu.
Kultivačnými médiami použitými na uchovávanie kultúry sú typické mikrobiologické substráty, obsahujúce organické dusíkové zdroje (peptóny, kvasinkové extrakty, tryptón, mäsové extrakty, atď.), uhlíkové zdroje (glukóza, maltóza, glycerín, atď.), s pH 5 až 8, výhodne 6 až 7. Inkubačné teplotné rozsahy sú od 20 °C do 45 °C, výhodne 28°Caž40°C.
Vybrané organizmy sa potom analyzujú na schopnosť rastu v ponorenej kultúre, v prítomnosti kolchicínových zlúčenín a ich transformovania na zodpovedajúce 3-glykozylové deriváty.
Uvedené skúšky sa vykonali v 100 ml bankách obsahujúcich 20 ml tekutej kultivačnej pôdy, s rozdielnym zložením kultivačnej pôdy, obsahujúcej jeden alebo viac organických dusíkových zdrojov (kvasinkové extrakty, peptóny, tiyptóny, kazeínové hydrolyzáty, mäsové extrakty, kukuričný extrakt, atď.), jeden alebo viac uhlíkových zdrojov (glukóza, glycerol, škrob, sacharóza, atď.), anorganické fosforové a dusíkové zdroje, a anorganické soli rôznych iónov (K+, Na+, Mg1*, Ca4^, Fe++, Mn++, atď.).
Vzorky kultúr sa môžu voliteľne podrobiť mutagénnym spracovaniam, pomocou konvenčných mutagénnych techník (ožiarenie s UV lúčmi, atď.) na získanie mutantov, ktoré majú špecifickú biokonverznú aktivitu, ktorá môže byť vyhodnotená rovnakými spôsobmi ako boli uvedené vyššie.
Vzorky kultúr z každej biokonverznej skúšky sa analyzovali na vyhodnotenie produkcie 3-glykozylových derivátov, prostredníctvom TLC a HPLC chromatografie.
Schopnosť vyselektovaných mikroorganizmov, transformovať kolchicínové substráty na príslušné 3-glykozylové deriváty, sa potvrdila prostredníctvom biokonverzných skúšok v bankách, v 300 ml škále, v rovnakých tekutých kultivačných roztokoch ako boli použité vo výberovom kroku.
Mikroorganizmy, ktoré poskytli pozitívnu odpoveď, sa použili v testoch na optimalizáciu biokonverzie, v odlišných tekutých kultivačných roztokoch, v 300 ml škále. Preskúmavané sú hlavné kultivačné a fermentačné parametre: organické dusíkové zdroje, uhlíkové zdroje, minerálne soli, teplota, miešanie a aerácia, pH, inkubačný čas, podiel inokula, subkultúme kroky, čas pridania substrátu do transformácie.
Vybrané bakteriálne mikroorganizmy, schopné spôsobiť biotransformáciu, podľa tohto vynálezu, môžu rásť na oboch pevných a tekutých substrátoch kultúr, obsahujúcich jeden alebo viac organických dusíkových zdrojov; výhodne kvasinkové extrakty, mäsové extrakty, peptón, tryptón, kazeínové hydrolyzáty, kukuričný extrakt, atď. Uhlíkové zdroje použiteľné na rast a biotransformáciu sú: glukóza, fruktóza, sacharóza, glycerol, sladové extrakty, atď., výhodne glukóza, fruktóza a glycerín. Kultivačné médium ďalej obsahuje anorganické fosforové zdroje a soli K+, Na+, Mg*+, NH4 +, atď.
Vybrané mikroorganizmy môžu rásť pri teplote od 20 °C do 45 °C, výhodne od 28 °C do 40 “C, s pH medzi 5 a 8, výhodne 6 až 7. Pri rovnakých podmienkach, sú mikroorganizmy, vzaté do úvahy, schopné transformácie kolchicínových zlúčenín na zodpovedajúce 3-glykozylové deriváty. Uvedené transformácie sa uskutočňujú v ponorenej kultúre, v bankách inkubovaných na rotačnej trepačke, s miešaním od 150 do 250 otáčok/minútu.
V dôsledku špeciálnej kinetiky tejto biotransformácie, ktorá sa týka mikrobiálneho rastu, sú optimálne podmienky pre potreby biotransformácie rovnaké ako podmienky, ktoré sú optimálne na rast. Preto, kultivačné média vhodné podporiť dobrý mikrobiologický rast, ako napríklad tie, ktoré sú založené na organických a anorganických zlož3 kách, už uvedených, sú tiež použiteľné na dobrú aktivitu biotransformácie zúčastneného substrátu. Tento sa pridá ku kultúre vo východiskovom fermentačnom kroku.
Biotransformácia, podľa tohto vynálezu, je založená na enzýmovej konverzii, ktorá začína v priebehu rastúcej exponenciálnej fázy a pokračuje paralelnou progresiou k tomuto rastu; maximálne úrovne konverzie na 3-glykozylové deriváty (veľmi vysoké: nad 95 až 100 %) sa dosiahnu v priebehu prvých 24 až 30 hodín. Regioselektivita biotransformácie je úplná: nikdy nebola dokázaná prítomnosť 2-glykozylových derivátov. Výsledné produkty sú výlučne mimobunkové.
Biotransformácia podľa tohto vynálezu môže byť odmeraná na fermentačnej úrovni, udržiavaním nezmenených kultivačných podmienok, obzvlášť sa to týka kultivačného média, teploty a času spracovania. S cieľom získania dobrých rastov, sú dôležité adekvátne úrovne miešania a aerácie, najmä aeračné úrovne 1 až 2 litrov vzduchu na liter kultúry za minútu (vvm), výhodne sú požadované 1,5 až 2 vvm,.
Produkty biokonverzie sú extrahované z tekutých kultivačných roztokov po separácii biomasy od tekutej frakcie centrifugáciou a obnovou supematantu, alebo mikrofiltráciou a obnovou permeátu. Kultúra môže byť upravená alkoholmi, s ohľadom na optimálnu obnovu produktu.
Čistenie a obnova biotransformačných produktov sa môžu uskutočniť použitím chromatografických techník na separáciu absorpčných živíc a elúciou s alkoholmi, výhodne s metanolom. Hydrometanolové roztoky obsahujúce tento produkt môžu byť ďalej čistené pomocou extrakcie s lipofilnými organickými rozpúšťadlami, výhodne s dichlórmetánom. Po ďalšej úprave so zmesami alkoholov a organických rozpúšťadiel, sa môže produkt získať v čistom stave z výsledných alkoholových roztokov kryštalizáciou.
Biotransformačný proces je špecifický pre substráty obsahujúce tropolónovú skupinu a môže byť použitý na niekoľko kolchicínových zlúčenín, ako napríklad kolchicín, tiokolchicín, 3-demetylkolchicín, 3-demetyltiokolchicín, N-des-acetyl-tiokolchicín a ostatné varianty substituovaných kolchicínov.
Ostatné prirodzené zlúčeniny bez prítomnosti tropolónu nie sú glykozylované pomocou Bacillus megaterium.
Glukóza sa môže nahradiť ostatnými cukrami, ako napríklad fruktóza alebo galaktóza, bez spôsobenia straty glykozyltransferázovej aktivity.
Nasledujúce príklady opisujú vynález v ďalších detailoch.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Alikvotné častí kultúr Bacillus megaterium izolovaných z poľnohospodárskych pôd, sa resuspendujú v 20 ml sterilného fyziologického roztoku, a podrobia sa desiatkovému riedeniu na 1 : 10 000 000 zrieďovacieho faktora. Suspenzie rôznych roztokov sa pokovajú na LB-Agare kultivačného média a na LB-Agare obohatenom jednotlivo skolchicínom alebo tiokolchicínom, až do finálnej koncentrácie 2 g/1 (pozri tabuľku). Kultúry sú inkubované pri 28 °C, počas 3 dní, v tme. Kolónie rastúce na selekčnom médiu, obohatené kolchicínom, sa izolujú a čistia pomocou umiestnenia na neselekčnom médiu, uvedené vzorky sa inkubujú tak ako je uvedené, ale počas kratšieho času (24 hodín). Následne sa kultúry prenesú do rovnakého agarového prostriedku, do skúmavky a inkubujú tak ako bolo uvedené vyššie počas 24 hodín.
Alikvotné časti kultúr, vybrané ako bolo uvedené, sa použijú na naočkovanie 100 ml Erlenmeyerovej banky obsahujúcej 20 ml kultivačného média ST (pozri tabuľku), obohatené kolchicínom alebo tiokolchicínom, až do 0,4 mg/ml finálnej koncentrácie. Uvedené kultúry sa inkubujú cez noc pri 28 °C, na rotačnej trepačke, pri 200 otáčkach/minútu.
Transformácia kolchicínových sustrátov sa kontroluje analýzami alikvotných častí tekutých kultivačných roztokov, odobratých každé 3 až 4 hodiny, pomocou TPLC na silikagéli s acetónonroctanom etylnatým:vodou, 5:4:1 premývací systém.
Po 4 dňoch inkubácie, sa alikvotné časti kultúr, ktoré preukázali zjavnú katalytickú aktivitu na 3-glykozylové deriváty, regenerujú na platniach, pomocou desiatkového rieďovania, tak ako bolo opísané, na prípravu nového inokula v skúmavke. Biotransformačná skúška v banke sa opakuje v rovnakých podmienkach ako bolo uvedené, ale použitím zjavne vyšších konečných koncentrácií kolchicínu a tiokolchicínu (1 mg/ml). Navyše aktívne jednoduché kultúry (substrátová konverzia podobná alebo vyššia než 80 %) sa použijú na prípravu inokúl v mrazených kryotubách, ako bolo opísané v príklade 3.
Tabuľka
Formulácia kultúrneho média
1) LB-Agar (Sterilizácia: 121 °C x 20')-pH 7
Triptón 10g/1
Kvasinkové výťažky 5g/1
NaCl 10g/1
Agar-agar 15g/1
2) Živná pôda (Sterilizácia: 121 °C x 20 ') - pH 7
Glukóza 20g/1
Glycerín 10g/1
Peptón 15g/1
Kvasinkové výťažky 5g/1
NaCl 3g/1
NH4C1 3g/1
K2HPO4 8g/1
KH2PO4 3g/1
MgSO4.7H2O 0,5 g/1
Príklad 2
Opakuje sa postup opísaný v príklade 1, vychádzajúc z kultúr Bacillus megaterium, odvodených z nasledovných zbierkových kmeňov (Deutsche Sammlung vom Mikroorganismen, Braunschweig, Nemecko): DSM 90, 509, 322, 333,1667, 1670, 1671.
DSM 90,
DSM 509,
DSM 322,
DSM 333,
DSM 1667,
DSM 1670,
DSM 1671.
Kultúry vybrané ako v príklade 1 a pridané k tiokolchicínu (1 mg/ml) sa inkubujú počas 4 dní v tekutej kultúre: TLC analýza zistí vyskytnutú transformáciu substrátu do tiokolchikozidu, s konverzným výťažkami menia4 cimi sa od 50 % (kmeň DSM 1671) do 70 % (kmeň DSM 90), do 80 % a vyššie (kmene DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670).
Príklad 3
Alikvótne časti vzoriek kultúr v skúmavke, vybraných ako bolo opísané v uvedenom príklade, sa použijú na očkovanie 100 ml Erlenmeyer banky, obsahujúcej 20 ml živnej pôdy ST.
Kultúry živnej pôdy sú inkubované pri +30 °C, na rotačnej trepačke pri 200 otáčkach/minútu, počas noci. Po inkubácii sa kultúry obohatia glycerínovým sterilným roztokom do 20 % finálnej koncentrácie. Kultúry sa potom rozptýlia v 2 ml kryotubách a okamžite sa ponoria do tekutého dusíka.
Po niekoľkých dňoch, sa 10 % z kultúr rýchlo rozpustí pri 37 °C. Alikvotné časti každej kryotuby sa použijú na očkovanie 100 ml Erlenmeyerovej banky, obsahujúcej 20 ml média ST, ktorý sa následne inkubuje pri +28 °C, cez noc (prekultúra), pri 200 otáčkach/minútu. Po inkubácii sa prenesú 2 ml každej prekultúry do 20 ml sterilného čerstvého média ST, tentokrát obohatený o kolchicín alebo tiokolchicín, na 1 g/1 finálnej koncentrácie. Biotransformácia sa uskutočňuje a skontroluje v podmienkach opísaných v príklade 1. Analýza potvrdila, že transformácia substrátu na 3-glykozylový derivát prebehla v kvantitatívnych termínoch už opísaných (80 % a vyššie), teda poskytnutím katalytickej stability mrazenej kultúry.
Paralelné kontroly kultúr živnej pôdy, umiestnenej na LB agare okamžite po rozpustení, potvrdili životaschopnosť, homogenitu a čistotu mrazených kultúr.
Príklad 4
Alikvotné časti kultúr v kryotubách sa po rozpustení použijú na očkovanie 30 ml Erlenmeyerovej banky, obsahujúcej 50 ml prostriedku ST (prekultúry). Po inkubácii cez noc pri 30 °C, 250 otáčkach/minútu, sa prenesie 5 ml prekultúry do 50 ml rovnakého média obohateného kolchicínom do 1 g/1 finálnej koncentrácie. Kultúry sa inkubujú počas 2 dní v rovnakých podmienkach aké boli opísané. Každé 4 hodiny sa vzorky odoberú, na vyhodnotenie rastúcej úrovne (meranie absorbancie pri 600 nm), kolchikozidovej produkcie (TLC a HPLC), sterilnosti (na LB agar) a na mikroskopický morfologický prieskum.
Na HPLC analýzu 1 ml frakcií kultúr živnej pôdy sa obohatí 9 ml metanolu a odstredí pri 13000 otáčkach/minútu počas 2 minút. Obsah kolchikozidu v supematante sa analyzuje obrátenou fázou HPLC, s izokratickou elúciou, pomocou voda:acetónitril, 80 : 20 systémové elučné činidlo.
HPLC analýza dokazuje, že konverzia kolchicínu na kolchikozid má za následok progresiu paralelnú k tej rastúcej. Po približne 26 hodinách inkubácie je biokonverzia dokončená.
Kolchikozidový finálny výťažok sa pohybuje od 80 % do 85 %.
Príklad 5
Opakuje sa postup opísaný v príklade 4, pridaním tiokolchicínu namiesto kolchicínu ku kultúram, v tej istej finálnej koncentrácii (1 g/1).
Rastové a výrobné reakcie kultúr sú rovnaké ako tie získané s koichicínom, s tiokolchikozidovými výťažkami okolo 90 %.
Príklad 6
Opakuje sa postup opísaný v príklade 4, pridaním 3-demetyltiokolchicínu namiesto kolchicínu ku kultúre, v tej istej finálnej koncentrácii (1 g/1). Rastové a výrobné reakcie kultúr sú rovnaké ako tie už získané, s tiokolchikozidovými výťažkami okolo 90 %.
Príklad 7
Opakuje sa postup opísaný v príklade 4, pridaním N-formyltiokolchicínu namiesto kolchicínu ku kultúram, v tej istej finálnej koncentrácii (1 g/1). Rastové a výrobné reakcie kultúr sú rovnaké ako tie už získané, s tiokolchikozidovými výťažkami okolo 90 %.
Príklad 8
Jeden liter ST živnej pôdy v Erlenmeyerovej banke sa očkuje s kryotubnou kultúrou kmeňa DSM 1670. Banky sa inkubujú cez noc pri 30 °C, 250 otáčkach/minútu. Inokulum sa sterilné prenesie do 14 1 fermenteru, obsahujúceho 9 1 sterilnej živnej pôdy ST, obohatený tiokolchicínom za vzniku 1 g/1 finálnej koncentrácie. Fermentácia je uskutočňovaná pre udržanie vhodných úrovní miešania a aerácie (miešanie do 900 otáčok/minútu; aerácia 1 až 1,5 wm, závislé na raste kultúry). Každé 2 hodiny sa odoberú vzorky z kultúr živnej pôdy a podrobia sa nasledujúcej analýze:
- optická hustota (OD) pri 600 nm,
- analýza sterility a čistoty kmeňov na LB agare,
- mikroskopická morfológia (gram kmeň),
- analýza obsahu tiokolchikozidu, pomocou TLC a HPLC.
Po 28 hodinách fermentácie je tranformácia do tiokolchikozidu takmer ukončená. Finálny výťažok je okolo 90 %.
Príklad 9
Opakuje sa postup opísaný v príklade 8, ale po 28 hodinách fermentácie, sa regeneruje len 90 % kultúry živnej pôdy, na extrahovanie produktu (frakcia 1). Zvyšok 10 % sa pridal sterilné do fermenteru s 9 1 čerstvého sterilného média ST obsahujúceho 10 g tiokolchicínu. Fermentácia sa uskutoční tak ako bolo opísané v príklade 8. Po 26 hodinách sa nazbiera 91 kultúr živnej pôdy a extrahuje sa (frakcia 2). Zvyšný objem kultúr živnej pôdy sa sterilné obohatí o 9-krát viac 1 čerstvého média ST obsahujúceho čerstvý tiokolchicín (10 g). Fermentácia sa uskutoční tak ako už bolo uvedené. Po 26 hodinách sa kultúry živnej pôdy kompletne nazbierajú a extrahujú (frakcia 3). Biotransformačná aktivita kmeňov zostávajúca stabilná pri všetkých troch testoch, s konverznými výťažkami okolo 90 % a so značne trojitou celkovou produkciou tiokolchikozidu sa porovnáva s tými obdržanými v jednotlivých dávkových spôsoboch.
Príklad 10
Finálne kultúry živnej pôdy z fermentácie (celkový objem: okolo 27 1) sa vystavia priečne-tečúcej mikrofiltrácii na 0,22 pm keramického zásobníka, tak aby sa oddelili bunky od tekutého kultivačného roztoku. Permeát sa absorbuje na stĺpci nasýtenom s HP 21, Mitsubishi absorpčná živica. Po premytí s vodou sa produkt eluuje s metanolom. Metanolový eluát sa koncentruje do sucha vo vákuu, potom sa znovu rozpustí v metanole. Po opakovanej extrakcii s metylchloridom, sa alkoholové frakcie koncentrujú do sucha a znovu rozpustia v etanol-metylénchloride, zmes 1:1.
Po čistení so silikagélom sa roztok koncentruje pod vákuom, metylénchlorid sa potom substituuje s etanolom. Výsledná suspenzia sa koncentruje a nechá vykryštalizovať. Druhá kryštalizácia s etanolom sa uskutoční po ďalšom kroku znovu rozpustenia hmoty v etanol-chloroformovej zmesi a čistenia na silikagéle.
Výsledný produkt sa analyzuje pomocou HPLC, C-NMR, H-NMR a hromadného spektra, až sa nakoniec ukáže rovnaký ako tiokolchikozidový štandard.
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob prípravy 3-O-glykozylkolchicínových zlúčenín vzorca (I) nhr2O) kdeR1 je O-glykozidový zvyšok, R2 je vodík alebo C,.6acyl, R3 je C|.„alkoxy alebo Ci_6- tioalkyl, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa biotransformáciu zlúčenín, v ktorých R* je OH alebo metoxy prostredníctvom Bacillus megaterium.
- 2. Spôsob, podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že v pripravovanej zlúčenine vzorca (I), R1 je 0glukozidový zvyšok.
- 3. Spôsob, podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že sa pripravuje kolchikozid a tiokolchikozid.
- 4. Spôsob, podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov laž 3, vyznačujúci sa tým, že biotransformácia sa uskutočňuje v ponorenej kultúre pri teplote od 28 °C do 40 °C, pri pH od 6 do 7 a s použitím glukózy, fruktózy alebo glycerolu ako uhlíkového zdroja.
- 5. Spôsob, podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že použité kultivačné médium obsahuje 0,1 až 3 g/1 zlúčenín vzorca (I), v ktorých R1 je hydroxyskupina alebo metoxyskupina.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT96MI002063A IT1285777B1 (it) | 1996-10-07 | 1996-10-07 | Processo di biotrasformazione di composti colchicinoidi nei corrispondenti 3-glicosilderivati |
| PCT/EP1997/005429 WO1998015642A1 (en) | 1996-10-07 | 1997-10-02 | A process for the biotransformation of colchicinoid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK44599A3 SK44599A3 (en) | 2000-01-18 |
| SK282344B6 true SK282344B6 (sk) | 2002-01-07 |
Family
ID=11374985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK445-99A SK282344B6 (sk) | 1996-10-07 | 1997-10-02 | Spôsob prípravy 3-O-glykozylkolchicínových zlúčenín |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6150140A (sk) |
| EP (1) | EP0931161B1 (sk) |
| JP (1) | JP3428027B2 (sk) |
| KR (1) | KR100311067B1 (sk) |
| CN (1) | CN1094978C (sk) |
| AT (1) | ATE213782T1 (sk) |
| AU (1) | AU714810B2 (sk) |
| CA (1) | CA2252725C (sk) |
| CZ (1) | CZ295451B6 (sk) |
| DE (1) | DE69710744T2 (sk) |
| DK (1) | DK0931161T3 (sk) |
| ES (1) | ES2171906T3 (sk) |
| HK (1) | HK1019620A1 (sk) |
| HU (1) | HU224896B1 (sk) |
| IT (1) | IT1285777B1 (sk) |
| NO (1) | NO319286B1 (sk) |
| PL (1) | PL187106B1 (sk) |
| PT (1) | PT931161E (sk) |
| RU (1) | RU2196826C2 (sk) |
| SK (1) | SK282344B6 (sk) |
| WO (1) | WO1998015642A1 (sk) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1295272B1 (it) * | 1997-10-03 | 1999-05-04 | Indena Spa | Biotrasformazione di composti colchiconici nei corrispondenti 3- glicosilderivati |
| ITMI20031144A1 (it) * | 2003-06-06 | 2004-12-07 | Indena Spa | Analoghi del colchicoside. |
| WO2005108595A1 (en) * | 2004-05-12 | 2005-11-17 | Indena S.P.A. | Biotransformation of colchicinoid compounds |
| SG165175A1 (en) * | 2004-05-12 | 2010-10-28 | Indena Spa | Biotransformation of colchicinoid compounds |
| ES2356494T3 (es) | 2008-05-28 | 2011-04-08 | Indena S.P.A. | Procedimiento para la glucosidación de colchicina y tiocolchicina. |
| CN102448930A (zh) * | 2009-05-27 | 2012-05-09 | 共有药物有限公司 | 硫代秋水仙碱衍生物、其制造方法和使用方法 |
| US20110178180A1 (en) * | 2010-01-18 | 2011-07-21 | Kurt Nielsen | Deuterium-enriched colchicine, thiocolchicine, and derivatives thereof; methods of preparation; and use thereof |
| US8795986B2 (en) | 2010-09-22 | 2014-08-05 | Sequent Scientific Ltd. | Microbial method for the biotransformation of colchicinoid compounds |
| WO2015097567A1 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Alkaloids Corporation | Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues |
| CN105861601B (zh) * | 2016-04-29 | 2019-05-24 | 中国药科大学 | 一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(hmzg)的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1344157A (fr) * | 1959-05-22 | 1963-11-29 | Roussel Uclaf | Nouvelles colchicines et leur procédé d'obtention |
| JPS5233195B2 (sk) * | 1971-09-30 | 1977-08-26 | ||
| GB8701381D0 (en) * | 1987-01-22 | 1987-02-25 | Erba Farmitalia | Antitumor agent |
| NZ240907A (en) * | 1990-12-14 | 1995-01-27 | Ainsworth Tech Inc | Communication system: signal level adjusting interface between distribution and antenna systems |
-
1996
- 1996-10-07 IT IT96MI002063A patent/IT1285777B1/it active IP Right Grant
-
1997
- 1997-10-02 PL PL97331942A patent/PL187106B1/pl unknown
- 1997-10-02 AT AT97911171T patent/ATE213782T1/de active
- 1997-10-02 HU HU9903806A patent/HU224896B1/hu unknown
- 1997-10-02 DK DK97911171T patent/DK0931161T3/da active
- 1997-10-02 JP JP51715598A patent/JP3428027B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 AU AU48648/97A patent/AU714810B2/en not_active Expired
- 1997-10-02 SK SK445-99A patent/SK282344B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 EP EP97911171A patent/EP0931161B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 CA CA002252725A patent/CA2252725C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 KR KR1019980710918A patent/KR100311067B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-10-02 DE DE69710744T patent/DE69710744T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 PT PT97911171T patent/PT931161E/pt unknown
- 1997-10-02 US US09/230,116 patent/US6150140A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 WO PCT/EP1997/005429 patent/WO1998015642A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-02 ES ES97911171T patent/ES2171906T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 RU RU99109470/13A patent/RU2196826C2/ru active
- 1997-10-02 CN CN97194493A patent/CN1094978C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-02 CZ CZ19991187A patent/CZ295451B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-04-06 NO NO19991633A patent/NO319286B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-10-27 HK HK99104800A patent/HK1019620A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK282344B6 (sk) | Spôsob prípravy 3-O-glykozylkolchicínových zlúčenín | |
| Yoshimoto et al. | New anthracycline metabolites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1 I. Isolation and characterization of various blocked mutants | |
| RU2218409C2 (ru) | Способ биотрансформации колхиконового соединения в соответствующее 3-0-гликозильное производное | |
| NO336051B1 (no) | Biotransformasjon av colchicinoidforbindelser | |
| Ahmad et al. | Microbial transformation of sterols to C19-steroids by Rhodococcus equi | |
| JP4198883B2 (ja) | コルヒコン化合物を対応する３−グリコシル誘導体に生物学的に転換する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20171002 |