CZ295451B6

CZ295451B6 - Způsob biotransformace kolchicinoidových sloučenin na 3-glykosylované deriváty

Info

Publication number: CZ295451B6
Application number: CZ19991187A
Authority: CZ
Inventors: Ezio Bombardelli; Cesare Ponzone
Original assignee: Indena S. P. A.
Priority date: 1996-10-07
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2005-08-17
Also published as: RU2196826C2; SK44599A3; CA2252725A1; CN1094978C; DE69710744T2; DE69710744D1; CA2252725C; PL187106B1; CZ118799A3; NO991633L; JP3428027B2; HUP9903806A2; KR100311067B1; US6150140A; PT931161E; AU714810B2; SK282344B6; JP2000508179A; KR20000022478A; EP0931161B1

Abstract

Způsob přípravy 3-O-glykosylovaných sloučenin vzorce I spočívá v biotransformaci sloučenin vzorce I, kde R.sub.1.n. je hydroxylová nebo methoxylová skupina, mikroorganismem Bacillus megaterium.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se zabývá biotransformací kolchicinoidových sloučenin vybranými bakteriálními kmeny na 3-glykosylované deriváty. Výsledkem vynálezu jsou kolchicinoidové sloučeniny glykosylované výhradně na 3. uhlíku aromatického kruhu, odvozené od kolchicinu, thiokolchicinu nebo jejich derivátů, které jsou získány ve vysoké čistotě a s velkým výtěžkem.

Farmakologický význam kolchicinoidových sloučenin glykosylovaných na 3. uhlíku benzenového jádra spočívá v jejich vysoké účinnosti nebo v množství výroby nových léků.

Zejména thiokolchikosid (3-O-glukosylthiokolchicin) je významná účinná látka, která je ve farmakologii používaná zejména při léčbě svalově - kosterního systému a jako výchozí látka pro přípravu nových protinádorových, imunosupresivních, antipsoriatických a protizánětlivých léků.

Dosavadní stav techniky

Připravit 3-glykosylkolchicinoidové sloučeniny se pokoušelo již mnoho odborníků, a to jak chemickými reakcemi, tak biotransformací.

Chemický způsob sestává z komplexu nespecifických chemických reakcí, jejichž výsledkem je směs glykosylovaných derivátů, některých inaktivních. Vlastní výtěžky derivátů glykosylovaných specifických specificky na 3. uhlíku aromatického kruhu jsou tedy velmi nízké.

Biologický způsob využívá biotransformace thiokolchicinu kulturou Centella asiatica na deriváty monoglykosylované na 2. nebo na 3. uhlíku aromatického kruhu. Tento způsob transformace ale není selektivní a přináší malý výtěžek a má malou produktivitu (Solet, J.M. a kol., Phytochemistry 33,4, 817-820, 1993).

Jiný způsob biotransformace kolchicinoidových sloučenin je založen na prosté demethylaci methoxylových skupin navázaných na 2. nebo na 3. uhlík aromatického kruhu. Ani tento způsob nepřináší dostatečné výtěžky, nemá dostatečnou produktivitu a je provázen nízkou regionální selektivitou.

Hufford C.D. a kol. (J. Pharm. Sc., 68, 10, 1239-1242, 1979) zkoušeli pomocí Streptimyces griseus a nebo Streptomyces spectabilis a Bellet P., a kol., (GB-923421, 1959) pomocí různých kmenů Streptomyces a jiných druhů bakterií a hub transformovat kolchicin a jeho deriváty na odpovídající 3-demethylované deriváty. Výsledkem byly demethylované deriváty, avšak díky neselektivním mikrobiálním enzymům demethylované na 2., 3. nebo 10. uhlíku alkaloidové molekuly. A navíc, z důvodu nízkých výtěžků konverze, omezených koncentrací substrátu a časté degradaci tropolonového kruhu byla produktivita tohoto katalytického systému velmi nízká.

V poslední době provedl specifickou biotransformací bakteriálním mikroorganismem Poulev a kol. (J. Bioeng. 79, 1,33-38, 1995), ale výtěžky a produktivita byly stále velmi nízké.

Enzymová aktivita mikroorganismů podaná té, která je zmiňována výše (Streptomyces, Bacillus, atd.), byla použita při biotransformací i dalších sloučenin, např. maytansinoidů (pat. US 4 361 650: Izawa, M. a kol., J. Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). I v tomto případě byla katalyzovanou reakcí výhradně demethylace, která se vyznačovala nízkými výtěžky konverze a nízkou produktivitou.

-1 CZ 295451 B6

Brumm a kol. popsali glykosyltransferázovou aktivitu α-amylázy Bacillus megaterium (Brumm. P. J. a kol., Starch, 43, 8, 319-323, 1991); specifícita akceptoru transferázové reakce (výhradně glukóza nebo glukosidy) je velmi vysoká. Cyklodextrin-glukosyl transferázy pocházející ze stejného mikrobiálního zdroje katalyzují a-l,4-transglukosylaci rubusosidu (β-D-glukosylester 13-O-P~D-glukosyl-steviolu) ze škrobu. Při této biokonverzi je příjemcem transferázové reakce opět glucidová frakce substrátu (Darise, M. a kol., Agric. Biol. Chem., 48,10,2483-2488,1984). Cyklodextrin-glykosyltransferázy byly původně používány pro přípravu cyklodextrinů G6, G7 a G8 ze škrobu (Kitahata, S., Okada, S., Agric. Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417,1974).

Na těchto příkladech je zřejmá vysoká substrátová specifícita glykosyltransferázové aktivity vytvářené Bacillus megaterium. Akceptorem je vždy glucid, glykosyltransferáza nekatalyzuje žádné reakce sekundárních metabolitů, jejichž molekula má komplexní strukturu, jako jsou kolchicinoidy. Nejsou známy žádné příklady použití zmíněných mikroorganismů k enzymatické konverzi kolchicinoidů na 3-glykosylované deriváty.

Podstata vynálezu

Kmeny Bacillus megaterium, které jsou schopny růst v přítomnosti vysokých koncentrací kolchicinu a thiokolchicinu, mají značnou, velmi specifickou biotransformaění aktivitu, která způsobuje přeměnu kolchicinoidového substrátu na deriváty glykosylované výhradně na 3. uhlíku aromatického kruhu. Tato přeměna se uskutečňuje ve velmi krátkém časovém intervalu a je charakteristická překvapivě vysokými výtěžky.

Vynález se zabývá způsobem přípravy 3-O-glykosylkolchicinoidových sloučenin vzorce I

kde Rj je O-glykosidový zbytek; R₂ je vodík nebo acylová skupina o 1 až 7 uhlících; R₃ je alkoxylová skupina o 1 až 6 uhlících nebo thioalkylová skupina o 1 až 6 uhlících; přičemž způsob výroby spočívá v biotransformaci sloučenin vzorce I, kde Ri je hydroxylová nebo methoxylová skupina, Bacillem megateriem.

Bacillus megaterium je grampozitivní spory tvořící bakterie, jejíž buněčný průměr je větší než 1,0 pm. Tato bakterie roste za aerobních podmínek na mnoha kultivačních půdách, je kataláza pozitivní a hydrolyzuje želatinu.

Kmeny Bacillus megaterium, které mohou být použity podle vynálezu, jsou schopny růst a udržet si životaschopnost také v přítomnosti vysokých koncentrací kolchicinu a nebo thiokolchicinu (kolem 3 g/1). Tato jejich vlastnost je ověřena vyšetřením růstu a mikroskopicky.

Obdobné druhy, jako je např. Bacillus cereus, vykazují při koncentracích substrátu 1,5 g/1 zpomalení růstu (absorbance je 15 až 25% kontrolního vzorku), které je výrazně zřetelnější při koncentraci substrátu 3 g/1, kdy se objevuje dramatická autolýza. Na rozdíl od Bacillus cereus dosahují vybrané kultury Bacillus megaterium při uvedených koncentracích mnohem vyšších růstových hladin (dvakrát až třikrát).

-2CZ 295451 B6

Vysoká selektivita a účinnost biotransformace je překvapující a ne zcela běžná - výtěžky se pohybují mezi 80 a 100 %, zpravidla mezi 90 a 95 %.

A dále, mikroorganismy užívané při biokonverzi si udržují stálou katalytickou aktivitu dokonce i při opakování fermentačních kroků a tudíž umožňují specifickou biokonverzi při postupech, prováděných pro vsázkách i kontinuálních procesech. Proto se tento způsob biokonverze vyznačuje vysokou produktivitou a vysokými hladinami reprodukovatelnosti.

Pozoruhodné výtěžky produkce a vysoká reakční regioselektivita se odrážejí v kvalitě a čistotě výsledného produktu - jednoduchým následným zpracováním je připraven 100% čistý produkt.

Mezi další významné výhody vynálezu se řadí to, že v průběhu biotransformace je méně často nutné produkt čistit a obnovovat, způsob biotransformace je úsporný a jeho použití je reprodukovatelné a bezpečné.

Postup výběru bakteriálních kmenů vhodných pro účely vynálezu je následující:

A) Výběr kultur Bacillus megaterium, které rostou v přítomnosti vysokých koncentrací kolchicinového substrátu, a to z přírodních zdrojů nebo ze sbírky kmenů.

B) Výběr z izolátu z bodu A); zkouškami biokonverze na specifických substrátech podávaných v podstatě se zvyšujících koncentracích se ověřuje aktivita bakterií transformovat kolchiciny na odpovídající 3-O-glykosylované deriváty.

C) Stanovení mikrobiologických charakteristik kmenů vybraných v bodě B).

D) Cíleně specifikovaným výběrem z bakteriální populace z bodu B) se postupně zvyšuje výtěžek biotransformace.

E) K optimalizaci biotransformace se studují a optimalizují kritické parametry fermentace.

F) Studium a optimalizace způsobů uchovávání vysoce produktivních kultur tak, aby byla zjištěna stabilní, homogenní inokulace pro aplikaci na průmyslové úrovni.

G) Rozšíření způsobu biotransformace podle vynálezu ve fermentoru, v diskontinuálních postupech, postupech, prováděných po vsázkách a kontinuálních procesech.

H) Vypracování a optimalizace způsobu biotransformace podle vynálezu pro následné zpracování a pro obnovu produktu.

Mikroorganismy vhodné pro účely vynálezu mohou být vybrány ze sbírky kultur z depozitních středisek nebo ze vzorků půdy různého původu. Mikroorganismy jsou selektivně obnoveny na odlišných agarových půdách, které obsahují zdroje organického dusíku (peptony, kvasnicové výtažky, masové výtažky, asparagin atd.), zdroj uhlíku (glycerol, škrob, maltózu, glukózu atd.) a jejichž pH je 5 až 8, s výhodou 6 až 7. Inkubační teplota se pohybuje mezi 20 a 45 °C, s výhodou mezi 28 a 40 °C.

Schopnost kultury růst v přítomnosti toxických koncentrací kolchicinového substrátu se hodnotí technikou skalární diluce a technikou naočkování na paralelní agarové plotny s různými substráty, přičemž do některých je přidán kolchicin nebo thíokolchicin v koncentracích od 0,1 do 3 g/1 k inhibici růstu hlavní části mikroorganismů.

Kolonie bakterií schopných růst v uvedených podmínkách jsou za sterilních podmínek odebrány a naočkovány na různé agarové půdy, aby se ověřila jejich čistota a homogenita růstu.

Kultivační půdy k uchování kultur jsou typické mikrobiologické substráty, které obsahují zdroje organického dusíku (peptony, kvasnicové výtažky, tryptony, masové výtažky atd.), zdroj uhlíku (glukózu, maltózu, glycerol atd.) a jejichž pH se pohybuje mezi 5 a 8, s výhodou mezi 6 a 7. Inkubační teplota je 20 až 45 °C, s výhodou 28 až 40 °C.

-3CZ 295451 B6

U vybraných mikroorganismů je zkoušena schopnost růst v submerzní kultuře v přítomnosti kolchicinoidových sloučenin a schopnost transformovat tyto sloučeniny na odpovídající 3-glykosylované deriváty.

Zkoušky se provádějí ve lOOml nádobách s 20 ml tekuté půdy různého složení. Půda obsahuje jeden nebo více zdrojů organického dusíku (kvasnicové výtěžky, peptony, tryptony, hydrolyzáty kaseinu, masové výtažky, kukuřičný výluh atd.), jeden nebo více zdrojů uhlíku (glukózu, glycerol, škrob, sacharózu atd.), zdroje anorganického fosforu a dusíku a různé anorganické soli (K⁺, Na⁺⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺ atd.).

Volitelně mohou být vzorky kultur ošetřeny běžnými mutačními technikami (ozáření UVpaprsky apod.) tak, aby vznikly mutanty se specifickou biokonverzní aktivitou, která se zkouší stejným způsobem, jako je popsáno výše.

Vzorky kultur z obou zkoušek biokonverze se analyzují a metodou TLC a HPLC chromatografíe se hodnotí produkce 3-glykosylovaných derivátů.

Schopnost vybraných mikroorganismů transformovat kolchicinoidový substrát na odpovídající 3-glykosylované deriváty se potvrzuje zkouškami biokonverze v 300ml nádobách se stejnými kultivačními půdami, jaké se používají při výběru kultur.

Mikroorganismy, které odpovídají pozitivně, se použijí ve zkouškách optimalizace biokonverze, které se provádějí na různých živných půdách v 300 ml nádobách. Posuzují se tyto hlavní kultivační a fermentační parametry: zdroje organického dusíku, zdroje uhlíku, minerální soli, teplota, míchání - provzdušňování, pH, doba inkubace, inokulační poměr, mezikultivační kroky, čas přidání substrátu, který má být transformován.

Vybrané bakteriální mikroorganismy schopné biotransformace podle vynálezu rostou jak na pevných, tak na tekutých kultivačních půdách, které obsahují jeden nebo více zdrojů organického dusíku, s výhodou kvasnicový výtažek, masový výtažek, pepton, trypton, hydrolyzáty kaseinu, kukuřičný výluh atd. Pro růst a biotransformaci jsou vhodnými zdroji uhlíku glukóza, fruktóza, sacharóza, glycerol, sladový výtažek atd., s výhodou glukóza, fruktóza a glycerol. Kultivační půda obsahuje dále zdroje anorganického fosforu a soli K⁺, Na⁺, Mg⁺⁺, NH₄ ⁺ atd.

Vybrané mikroorganismy rostou při teplotě mezi 20 a 45 °C, s výhodou mezi 28 a 40 °C, při pH 5 až 8, s výhodou 6 až 7. Za stejných podmínek jsou tyto mikroorganismy schopny transformovat kolchicinoidové sloučeniny na odpovídající 3-glykosylované deriváty. Tyto transformace se objeví v submerzní kultuře v nádobách míchaných na rotační třepačce rychlostí 150 až 250 fpm.

Ze zvláštní kinetiky uvažované transformace, která je spojena s růstem mikrobů, vyplývá, že optimální podmínky pro biotransformaci jsou stejné jako optimální podmínky pro růst. Takže i kultivační půdy, které zajišťují dobrý růst mikrobů, jako jsou půdy složené z organických a anorganických komponent popsané výše, jsou vhodné pro zajištění dobré aktivity biotransformace uvažovaného substrátu. Substrát se přidává ke kultuře v úvodním fermentačním kroku.

Biotransformace podle vynálezu je založena na enzymatické konverzi, která začíná během exponenciální růstové fáze a progreduje paralelně s růstem; maximálních hladin konverze na 3-glykosylované deriváty (velmi vysokých: 95 až 100 %) je dosaženo během prvních 24 až 30 hodin. Regioselektivita biotransformace je absolutní: přítomnost 2-glykosylovaných derivátů nebyla nikdy zaznamenána. Výsledné produkty jsou výhradně extracelulární.

Biotransformaci podle vynálezu lze za nezměněných kultivačních podmínek, zvláště kultivační půdy, teploty a doby kultivace, rozšířit na rozměry fermentoru. K zajištění kvalitního růstu jsou

-4CZ 295451 B6 důležité především míchání a provzdušňování, zejména provzdušňování musí obsahovat alespoň 1 až 2 litry vzduchu na litr kultury za minutu (wm), s výhodou 1,5-2 wm.

Produkty biokonverze jsou vytaženy z kultivačních směsí po separaci biomasy z tekuté frakce centrifugací a obnovením supematantu nebo mikrofíltrací a obnovením permeátu. Pro optimální obnovení produktu je možné kultury ošetřit alkoholy.

K čištění a obnovení biotransformačních produktů je možné použít techniky chromatografíe, kdy jsou produkty separovány na absorpčních pryskyřicích a eluovány alkoholy, nejlépe methanolem. Hydromethanolové roztoky obsahující produkt mohou být dále čištěny extrakcí lipofílními organickými rozpouštědly, nejlépe methylenchloridem. Po působení dalších směsí alkoholů a organických rozpouštědel je krystalisací z výsledného alkoholového roztoku získán produkt v čistém stavu.

Proces biotransformace je specifický pro substráty obsahující tropolonovou skupinu a lze jej použít na řadu kolchicinoidových sloučenin, jako je kolchicin, thiokolchicin, 3-demethylkolchicin, 3-demethylthiokolchicin, N-desacetylthiokolchicin a další různé substituované kolchiciny.

Jiné přirozené sloučeniny, které postrádají tropolonovou skupinu, nejsou pomocí Bacillus megaterium glykosvlovatelné.

Bez narušení glykosyltransferázové aktivity je místo glukózy možné použít jiné sacharidy, jako je fruktóza nebo galaktóza.

Vynález je blíže popsán v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Část kultur Bacillus megaterium izolovaných ze zemědělské půdy se resuspenduje ve 20 ml sterilního roztoku chloridu sodného a ředí se skalární dilucí s dilučním faktorem 1:10 000 000. Různě naředěné suspenze se naočkují na LB-agarové kultivační půdy a na obohacené LBagarové kultivační půdy a na obohacené LB-agarové kultivační půdy, tj. půdy obohacené kolchicinem nebo thiokolchicinem v koncentraci do 2 g/1 (viz tabulka). Kultury jsou 3 dny inkubovány ve tmě při teplotě 28 °C. Kolonie vyrostlé na selektivní půdě s kolchicinoidem jsou izolovány a vyčištěny tak, že se naočkují na neselektivní půdu. Tyto vzorky se inkubují za stejných podmínek jako je uvedeno výše, ale kratší dobu (24 hodin). Kultury jsou potom přemístěny do zkumavky na stejnou agarovou kultivační půdu a 24 hodin inkubovány stejným způsobem, jaký je popsán výše.

Části kultur vybrané tak, jak se popsáno výše, jsou naočkovány do 100 ml Erlenmayerových baněk obsahujících 20 ml živné půdy ST (viz tabulka). Po přidání kolchicinu nebo thiokolchicinu až do konečné koncentrace 0,4 mg/ml se kultury při 28 °C přes noc míchají na rotační třepačce rychlostí 200 rpm.

Každé 3 až 4 hodiny jsou z kultivační směsi odebírány vzorky, ve kterých jsou pomocí TLC na silikagelu a eluce acetonem, ethylacetátem a vodou v poměru 5:4:1 stanovovány transformace kolchicinového substrátu.

Po 4-denní inkubaci jsou ty části kultur, které mají zřejmou katalytickou aktivitu v produkci 3-glykosylovaných derivátů, rozočkovány na plotny a skalární dilucí popsanou výše jsou z nich ve zkumavce připravena nová inokulace. Za stejných podmínek, jako jsou popsány výše, se zopakuje biotransformační zkouška v baňce s tím rozdílem, že konečné koncentrace kolchicinu a

-5CZ 295451 B6 thiokolchicinu jsou výrazně vyšší (1 mg/ml). Nejaktivnější jednotlivé kultury (konverze substrátu je rovna nebo vyšší než 80 %) se použijí na přípravu inokul ve zmrazených kryozkumavkáchtak, jak je popsáno v příkladu 3.

Tabulka 3

Složení kultivačních půd

LB-agar (sterilizace: 121 °C*20')-pH 7
trypton	10g/l
kvasnicový výtažek	5 g/1
NaCl	10 g/1
agar Agar	15 g/1
živná půda ST (sterilizace: 121 °C*20')-pH 7
glukóza	20 g/1
glycerol	10 g/1
pepton	15 g/1
kvasnicový výtažek	5 g/1
NaCl	3 g/1
NH₄C1	3 g/1
K₂HPO₄	8 g/1
kh₂po₄	3 g/1
MgSO₄.7H₂O	0,5 g/1

Příklad 2

Postup je stejný jako v příkladu 1. Kultury Bacillus megaterium jsou odvozeny z následující sbírky kmenů (Deutsche Sammlung von Mikroorganismem, Braunschweig, Germany): DSM 90, 509, 22, 333, 1667, 1670, 1671.

DSM	90,
DSM	509,
DSM	322,
DSM	333,
DSM	1667,
DSM	1670,
DSM	1671.

Kultury jsou vybrány stejně jako v příkladu 1, je k nim přidán thiokolchicin (1 mg/ml) a jsou inkubovány 4 dny v tekuté kultivaci: transformace substrátu na thiokolchikosid se analyzuje pomocí TLC, přičemž její výtěžky se pohybují od 50 % (kmeny DSM 1671) do 70 % (kmeny DSM 90), do 80 % a výše (kmeny DSM 333, DSM 509, DSM 1667, DSM 1670).

Příklad 3

Do 100 ml Erlenmayerových baněk obsahujících 20 ml živné půdy ST jsou naočkovány části vzorků kultur vybraných tak, jak je popsáno v příkladu 2.

Kultury se v živné půdě při 30 °C přes noc míchají v rotační třepačce rychlostí 200 rpm. Po inkubaci se do kultivace přidá sterilní vzorek glycerolu do konečné koncentrace 20 %. Kultury se potom rozdělí do 2 ml kryozkumavek a ihned se ponoří do tekutého dusíku.

Po několika dnech se 10 % kultur rychle rozmrazí a zahřeje na 37 °C. Části kultur z jednotlivých kryozkumavek se naočkují do 100 ml Erlenmayerových baněk obsahujících 20 ml živné půdy ST

-6CZ 295451 B6 a baňky se při 28 °C přes noc (předkultura) míchají rychlostí 200 rpm. Po ukončení inkubace se 2 ml z každé předkultury za sterilních podmínek přenesou do 20 ml čerstvé živné půdy ST a v tomtéž okamžiku se do nich přidá kolchicin nebo thiokolchicin do konečné koncentrace 1 g/1. Probíhající biotransformace je kontrolovaná stejně jako v příkladu 1. Z rozboru vyplývá, že transformace substrátu na 3-glykosylované deriváty se objevuje za stejných kvantitativních podmínek jaké jsou popsány výše (80 % a více), čímž je potvrzena stabilita katalytického systému ve zmrazených kulturách.

Paralelní kontroly kultur v živné půdě, které jsou ihned po roztavení naočkovány na LB Agar, dokládají životaschopnost, homogennost a čistotu zmrazených kultur.

Příklad 4

Části kultur v kryozkumavce se ihned po roztavení naočkují do 300 ml Erlenmayerových baněk obsahujících 50 ml půdy ST (předkultura). Po inkubaci přes noc, při 30 °C, při rychlosti míchání 250 rpm je 5 ml předkultury přeneseno do 50 ml stejné půdy a je knim přidán kolchicin do konečné koncentrace 1 g/1. Kultury jsou dva dny inkubovány za stejných podmínek, jako jsou popsány výše. Každé 4 hodiny jsou odebírány vzorky, ve kterých se měří růstová hladina (absorbance při 600 nm), produkce kolchicinoidů (TLC a HPLC), sterilita (na LB Agaru) a mikroskopicky morfologické znaky.

Při HPLC se do 1 ml kultury přidá 9 ml methanolu a centrifuguje se při 13 000 rpm 2 minuty. Obsah kolchikosidů v supernatantu se stanovuje reversní fází při HPLC s izokratickou eluci, kdy eluenty jsou voda a acetonitril v poměru 80:20.

Z HPLC analýzy vyplývá, že konverze kolchicinu na kolchikosid sleduje růst. Konverze je kompletní po 26 hodinové inkubaci.

Výtěžky kolchikosidů se pohybují mezi 80 a 85 %.

Příklad 5

Opakuje se postup stejný, jako v příkladu 4, s tím rozdílem, že se místo kolchicinu přidá thiokolchicin ve stejné konečné koncentraci (1 g/1).

Růst kultur a produkce 3-glykosylovaných derivátů je podobná jako v příkladu s kolchicinem, výtěžky thiokolchikosidů se pohybují kolem 90 %.

Příklad 6

Postup je stejný jako v příkladu 4, ale místo kolchicinu se do kultury přidává 3-demethylthiokolchicin ve stejné konečné koncentraci (1 g/1). Kultury rostou a produkují 3-glykosylované deriváty podobně jako v předchozích příkladech, výtěžky thiokolchikosidů se pohybují kolem 90%.

Příklad 7

Postup je stejný jako v příkladu 4, ale místo kolchicinu se do kultury přidává N-formylthiokolchicin ve stejné konečné koncentraci (1 g/1). Kultury rostou a produkují 3-glykosylované deriváty podobně jako v předchozích příkladech, výtěžky thiokolchikosidů se pohybují kolem 90 %.

Příklad 8

Jeden litr živné půdy ST v Erlenmayerově baňce se naočkuje kulturou kmene DSM 1670 z kryozkumavky. Baňky se přes noc inkubují při 30 °C při rychlosti míchání 250 rpm. Inokulum se za sterilních podmínek přenese do 141 fermentoru, který obsahuje 9 1 sterilní živné půdy ST a přidá se k němu thiokolchicin do konečné koncentrace 1 g/1. Fermentace probíhá za dostatečného míchání a provzdušňování (míchání rychlostí do 900 rpm; provzdušňování 1 a 1,5 wm, podle růstu kultury). Každé 2 hodiny se z živné půdy odebírají vzorky a analyzují se tyto parametry:

- optická hustota (densita) (OD) při 600 nm;

- analýza sterility a čistoty kmene na LB Agaru;

- mikroskopická morfologie (barvení podle Grama);

- analýza obsahu thiokolchikosidů pomocí TLC a HPLC.

Transformace na thiokolchikosidy je zcela ukončena po 28 hodinách fermentace. Konečný výtěžek je kolem 90 %.

Příklad 9

Postup je stejný jako v příkladu 8, ale po 28 hodinách fermentace je k vytažení produktu vyjmuto z fermentoru jen 90 % živné půdy (frakce 1). Zbylých 10 % živné půdy je za sterilních podmínek přidáno do fermentoru s 9 1 čerstvé sterilní půdy ST obsahující 10 g thiokolchicinu. Fermentace probíhá za stejných podmínek jako v příkladu 8. Po 26 hodinách je sebráno a vytaženo 9 1 živné půdy (frakce 2). Zbylý objem živné půdy je za sterilních podmínek přidán do dalších 9 1 čerstvé půdy ST s čerstvým thiokolchicinem (10 g). Fermentace probíhá za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše. Po 26 hodinách fermentace je živná půda kompletně sebrána a vytažena (frakce 3). Biotransformační aktivita kmene se nezměnila po všechna tři kola a výtěžky konverze jsoukolem 90 %. Na rozdíl od jednorázového procesuje produkce thiokolchikosidů trojnásobná.

Příklad 10

Z celého konečného objemu živné půdy z fermentace (asi 27 1) jsou příčnou mikrofiltrací na keramické mřížce s průměrem ok 0,22 pm odděleny buňky. Permeát je absorbován na koloně naplněné HP 21, absorpční pryskyřicí Mitsubishi. Po propláchnutí vodou je permeát eluován methanolem. Methanolový eluát je do sucha zkoncentrován ve vakuu a potom znovu rozpuštěn v methanolu. Po opakovaných extrakcích methylenchloridem je alkoholová frakce zkoncentrována ve vakuu do sucha a znovu rozpuštěna ve směsi ethanolu a methylenchloridu (1:1). Po vyčeření silikagelem je roztok ve vakuu zkoncentrován; methylenchlorid je potom substituován ethanolem. Výsledná suspenze se zkoncentruje a nechá se krystalizovat. Pevná látka se znovu rozpouští ve směsích ethanolu a chloroformu, vyčeří silikagelem a nechá se podruhé krystalizovat.

Výsledný produkt se analyzuje HPLC, C-NMR, H-NMR a stanoví se hmotnostní spektrum. Produkt je shodný s thiokolchikosidovým standardem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy 3-O-glykosylkolchicinoidových sloučenin vzorce I kde R, je O-glykosidový zbytek, R₂ je vodík nebo acylová skupina o 1 až 7 uhlících, R₃ je alkoxylová nebo thioalkylová skupina o 1 až 6 uhlících, vyznačující se tím, že sloučeniny, ve kterých Rj je hydroxylová nebo methoxylová skupina, se biotransformují pomocí Bacillus megaterium.
2. Způsob přípravy sloučenin vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, žeRije O-glukosidový zbytek.
3. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že je připravován kolchikosid a thiokolchikosid.
4. Způsob přípravy podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že biotransformace probíhá v submerzní kultuře při teplotě 28 až 40 °C, při pH 6 až 7 a zdrojem uhlíku je glukóza, fruktóza nebo glycerol.
5. Způsob přípravy podle nároků laž4, vyznačující se tím, že kultivační půda obsahuje 0,1 až 3 g/1 sloučenin vzorce I, kde Ri je hydroxylová nebo methoxylová skupina.