CH655090A5

CH655090A5 - Hexahydronaphthalinderivate und ihre herstellung.

Info

Publication number: CH655090A5
Application number: CH3722/81A
Authority: CH
Inventors: Akira Terahara; Minoru Tanaka
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1980-06-06
Filing date: 1981-06-05
Publication date: 1986-03-27
Also published as: DE3122499C2; AU549988B2; NL960028I2; DK247081A; MX7065E; DK149080C; IE811257L; FI71168C; US4410629A; ES502827A0; FI71168B; AU7137681A; NL191738C; BE889150A; DK149080B; US4346227A; FI811762L; NL960028I1; SE453389B; IT1144598B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Reihe von neuen Derivaten der bekannten Verbindung ML-236B, auf 30 Verfahren zu deren Herstellung und auf solche Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate.

ML-236B entspricht der folgenden chemischen Struktur:

35

40

entspricht, wobei der Mikroorganismus aus der aus Syncephalastrum nigricans und Syncephalastrum racemosum bestehenden Gruppe entnommen wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z. B. den Methylrest, bedeutet.

28. Verfahren nach Anspruch 26, worin das Salz ein Alkalimetallsalz, z. B. ein Natriumsalz, ist.

29. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel:

worin R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest darstellt, pharmazeutische Salze der entsprechenden Säure, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, oder der Formel:

und ist in der Amerikanischen Patentschrift Nr. 3 983140 45 beschrieben. Diese Verbindung wurde aus den metabolischen Produkten von Mikroorganismen der Gattung Pénicillium, insbesondere Pénicillium citrinum, einer Art von Blaufäule, isoliert und gereinigt. Diese Verbindung hat gezeigt, dass sie die Biosynthese von Cholesterin durch Enzyme oder durch gezüchtete 50 Zellen, welche aus Testtieren durch Testen mit der die

Geschwindigkeit bestimmenden Enzymtätigkeit in der Biosynthese von Cholesterin gewonnen worden waren, nämlich 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-Coenzym-A-Reduktase, zu verhindern und demzufolge die Serumcholesterinspiegel bei Tieren 55 wesentlich zu reduzieren vermag [vgl. Journal of Antibiotics, 29, 1346 (1976)]. Gewisse strukturell mit ML-236B verwandte Verbindungen sind ebenfalls offenbart worden und haben sich für die Hemmung der Biosynthese von Cholesterin als geeignet erwiesen.

60 Es wurden nun weitere neue Verbindungen entwickelt, welche man durch enzymatische Hydroxylierung von ML-236B oder von Derivaten davon herstellen kann und welche die Biosynthese von Cholesterin zu hemmen vermögen, wobei die Aktivität dieser neuen Verbindungen mindestens mit der Wirkung von ML-236B 65 selbst vergleichbar ist und sogar in gewissen Fällen die Wirkung wesentlich übersteigt.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind Hydroxycarbon-säuren der folgenden allgemeinen Formel:

655 090

6

HOOC

(I!

Im Hinblick auf die Zahl von asymmetrischen Kohlenstoffatomen in diesen Verbindungen ist eine Varietät von geometrischen Isomeren möglich.

Unter diesen sind die folgenden Isomeren die am wichtigsten: 5 Verbindungen der folgenden Formel:

»OH

worin R einer der beiden folgenden Formeln entspricht:

0

oder

10

(IVI

worin R1 die obige Bedeutung hat, und pharmazeutisch zulässige Salze der entsprechenden Säure, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, und das entsprechende Lacton der folgenden Formel:

20

sowie die Lactone, Salze und Ester dieser Verbindungen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I und von Lacto-nen, Salzen oder Estern davon durch enzymatische Hydroxylie-rung von ML-236B oder ML-236B-carbonsäure oder einem Salz oder Ester davon.

Die ML-236B-carbonsäure entspricht der folgenden Formel:

.OH

HOOC-

25

30

und Verbindungen der folgenden Formel:

35

40

Eine Klasse der erfindungsgemässen Verbindungen umfasst die Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

H100C

(III

(VII

worin R1 die obige Bedeutung hat sowie die pharmazeutisch zulässigen Salze der entsprechenden Säure, worin R1 das Wasser-43 stoffatom darstellt, und das entsprechende Lacton der folgenden Formel:

0,

50

worin R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1-5 Kohlenstoffatomen darstellt, und umfasst auch pharmazeutisch zulässige Salze dieser Säure, worin R' das Wasserstoffatom darstellt, und das entsprechende Lacton der folgenden Formel:

(IUI

(VIII

55

Die Hydroxycarbonsäure der Formel IV, worin R1 das Wasser-60 stoffatom darstellt, wird nachstehend als M-4 benannt, während die Derivate dieser Säure, insbesondere die Salze und Ester, als Derivate von M-4 benannt werden. Das entsprechende Lacton der Formel V wird nachstehend als M-4-lacton bezeichnet. In ähnlicher Weise wird die Hydroxycarbonsäure der Formel VI, 65 worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, nachstehend als M-4' und die Derivate dieser Säuren als Derivate von M-4' bezeichnet, während das entsprechende Lacton der Formel VII als M-4'-Iacton bezeichnet wird.

7

655 090

Eine andere bevorzugte Klasse der erfindungsgemässen Verbindungen entspricht den Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel:

tfoor

(Vili)

worin R1 die obige Bedeutung hat, sowie die pharmazeutisch zulässigen Salze dieser Säure, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, und schliesslich das entsprechende Lacton der folgenden Formel:

0.

10

worin R1 die obige Bedeutung hat, und umfasst die pharmazeutisch zulässigen Salze dieser Säure, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, sowie das entsprechende Lacton der folgenden Formel: Q

(IX)

IXUI1

Es sind verschiedene geometrische Isomeren dieser Verbindungen möglich, wobei als wichtigste Verbindungen die folgenden genannt seien:

Verbindungen der folgenden Formel:

(XI

20

25

30

35

40

worin R1 die obige Bedeutung hat, sowie die pharmazeutisch zulässigen Salze dieser Säure, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, und das entsprechende Lacton der folgenden Formel:

(XII

sowie Verbindungen der folgenden Formel: R100C'

(Xll!

Die Säure der Formel X wird nachstehend als Iso-M-4 und deren Derivate, wie z. B, die Salze und Ester, als Derivate von Iso-M-4 bezeichnet, während das entsprechende Lacton der Formel XI nachstehend als Iso-M-4-lacton bezeichnet wird. Die Säure der Formel XII, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, wird nachstehend als Iso-M-4' bezeichnet, während deren Derivate als Derivate von Iso-M-4' bezeichnet werden. Das entsprechende Lacton der Formel XIII wird nachstehend als Iso-M-4'-lacton benannt.

Unter den Estern der Hydroxycarbonsäuren der Formel I werden die Alkylester mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Diese Alkylester können geradkettige oder verzweigte Gruppen sein. Beispiele hierfür sind die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopro-pyl-, Butyl- und Isobutylreste, wobei der Methylrest besonders bevorzugt wird.

Die Hydroxycarbonsäuren bilden ebenfalls Salze mit verschiedenen Kationen, insbesondere mit Metallen und noch leichter mit Alkalimetallen, wie z. B. Natrium oder Kalium. Die Natriumsalze werden am meisten bevorzugt.

Unter den erfindungsgemässen Verbindungen werden die folgenden am meisten bevorzugt: M-4-lacton, M-4-Natriumsalz, M-4-Methylester, Iso-M-4'-lacton, Iso-M-4-Natriumsalz und Iso-M-4-methylester, wobei das Natriumsalz von M-4 insbesondere bevorzugt wird.

Die erfindungsgemässen Verbindungen lassen sich durch enzy-matische Hydroxylierung von ML-236B oder einem Derivat davon, nämlich der ML-236B-carbonsäure oder einem Salz oder Ester davon, herstellen.

Diese enzymatische Hydroxylierung kann als Teil des Säuge-43 tiermethabolismus von ML-236B oder einem Derivat davon bewirkt werden, beispielsweise durch Verabreichung von ML-236B an ein geeignetes Tier, durch Sammeln eines metabolischen Produktes, z. B. Urin, und durch anschliessende Abtrennung der gewünschten, erfindungsgemässen Verbindung bzw. Verbindun-50 gen aus dem Urin. Andererseits kann man anstelle des lebenden Tiers auch die Leber oder einen enzy mhaltigen Extrakt aus der Leber verwenden.

Dabei hat sich gezeigt, dass die Verfahren unter Verwendung von animalischen Metabolismen oder tierischen Produkten eine 55 relativ niedrige Produktivität zeigen und dass die Wiederholbarkeit sehr schwierig ist. Daher wird man Mikroorganismen oder enzymhaltige Extrakte aus den Mikroorganismen bevorzugen.

Demzufolge wird das erfindungsgemässe Verfahren vorzugsweise so durchgeführt, dass man einen Mikroorganismus verwen-60 det, welcher ML-236B oder ein Derivat davon in eine erfindungsgemässe Verbindung überzuführen vermag, oder einen enzym-haltigen Extrakt einem solchen Mikroorganismus einsetzt. Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind jene der folgenden Gattungen: Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Circinella, Actino-65 mucor, Gongronella, Phycomyces, Martierella, Pycnoporus, Rhizoctonia, Absidia, Cunninghamella, Syncephalastrum und Streptomyces. Insbesondere werden die folgenden Arten bevorzugt:

655 090

8

Absidia coerulea Cunninghamella echinulata Syncephalastrum racemosum Streptomyces roseochromogenus Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorphosporus Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor globosus

Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Mucor heterosporus Mucor spinescens Rhizopus chinensis Rhizopus circinans Rhizopus arrhizus Zygorynchus moelleri Circinella muscae Circinella rigida Circinella umbellata Actinomucor elegans Phycomyces blakesleeanus Martierella isabellina Gongronella butleri Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani Syncephalastrum nigricans Absidia glauca var. paradoxa

Insbesondere werden die folgenden Arten bevorzugt:

Absidia coerulea IFO-4423 Cunninghamella echinulata IFO-4445 Cunninghamella echinulata IFCM444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233 Streptomyces roseochromogenus IFO-3363 Streptomyces roseochromogenus IFO-3411 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5303 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556 Mugor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585 Mucor globosus NRRL-12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Rhizopus chinensis IFO-4772 Rhizopus circinans ATCC-1225 Rhizopus arrhizus ATCC-11145

Zygorynchus moelleri IFO-4833 Circinella muscae IFO-4457 Circinella rigida NRRL-2341 Circinella umbellata NRRL-1713 Circinella umbellata IFO-4452 Circinella umbellata IFO-5842 Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 Martierella isabellina IFO-6739 Gongronella butleri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 Syncephalastrum nigricans NRRL-12480 Absidia glauca var. paradoxa IFO-4431 Actinomucor elegans ATCC-6476

Die oben erwähnten Mikroorganismen sind bei internationalen Züchtungssammelstellen erhältlich, wie dies unter Hinweis auf deren Hinterlegungsnummern mit den zugefügten Namen ersichtlich ist. Die Hinterlegungsstellen sind die folgenden:

IFO = Institute for Fermentation, 17-85 Juso-honmachi2-

chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan

NRRL = Agricultural Research Culture Collection, Northern

Regional Research Center, Peoria, Illinois 61604, USA

CBS = Centraal Bureau voorSchimmelcultures, Oosterstraat

1, 3740 AG Baarn, Netherlands

IAM = Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, Tokyo, Japan

ATCC = American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA

Die zurzeit noch nicht öffentlich zugänglichen 8 Mikroorganismen, nämlich:

Mucor hiemalis f. corticolus sank 34572 (NRRL-12473),

Mucor globosus sank 35472 (NRRL-12474),

Phycomyces blakesleeanus sank 45172 (NRRL-12475), Pycnoporus coccineus sank 11280 (NRRL-12476),

Rhizoctonia solani sank 22972 (NRRL-12477), Syncephalastrum nigricans vuillemin sank 42372 (NRRL-12478), Syncephalastrum nigricans vuillemin sank 42172 (NRRL-12479), Syncephalastrum nigricans vuillemin sank 42272 (NRRL-12480),

sind am 21. Mai 1981 bei Agricultural Research Culture Collection = ARS bzw. Northern Regional Research Center = NRRL hinterlegt worden.

Von den oben erwähnten Arten sind die folgenden besonders bevorzugt:

Absidia coerulea Cunninghamella echinulata Syncephalastrum racemosum Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorphosporus Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor globosus

Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Mucor heterosporus Mucor spinescens Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani Syncephalastrum nigricans

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

655 090

Die folgenden gelten als die bevorzugtesten Stämme der obgenannten Arten:

Absidia coerulea IFO-4423 Cunninghamella echinulata IFO-4445 Cunninghamella echinulata IFO-4444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5304 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556 Mucor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585 Mucor globosus NRRL-12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 Syncephalastrum nigricans NRRL-12480

Für die Herstellung der Verbindungen der obigen Formeln IV und V und deren Salze werden die folgenden Arten bevorzugt:

Mucor hiemalis f. hiemali Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor fragilis Mucor genevensis

Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani

Für die Herstellung von Verbindungen der obigen Formeln VI und VIII und deren Salze werden die Arten Syncephalastrum nigricans und Syncephalastrum racemosum bevorzugt.

Für die Herstellung von Verbindungen der obigen Formeln VIII und IX und deren Salze werden die Arten Absidia coerulea und Cunninghamella echinulata bevorzugt.

Unter sämtlichen oben erwähnten Arten wird Mucor hiemalis f. hiemalis besonders bevorzugt, da dieser Mikroorganismus ML-236B und dessen Derivate bei Ausbeuten von 90 % und sogar mehr in die gewünschten Verbindungen der Formel I zu überführen vermögen.

Die Überführung von ML-236B oder Derivaten davon in Verbindungen der allgemeinen Formel I kann dadurch bewirkt werden, dass man den vollständigen Zellularmikroorganismus oder in gewissen Fällen einen zellenfreien Extrakt aus dem Mikroorganismus mit ML-236B oder einem Derivat davon in Berührung bringt. Die Form der erzeugten Verbindung hängt von den Zahlungsbedingungen und der Form des verwendeten Mikroorganismus ab. So wird beispielsweise beim Züchten des kompletten Zellularmikroorganismus in Gegenwart von ML-236B oder einem Derivat davon das Produkt in Form der Carbonsäure, in Form des Lactons oder in Form eines Alkalimetallsalzes anfallen, und dies je nach den Züchtungsbedingungen 5 und insbesondere je nach dem pH-Wert. In jenen Fällen wiederum, in denen ML-236B oder ein Derivat davon einfach mit einem verbleibenden Zellularsystem oder mit einem zellfreien Extrakt in Berührung gelangt, erhält man die erfindungsgemässen Verbindungen in Form eines Alkalimetallsalzes. 10 Der Verlauf der Umwandlungsreaktion kann dadurch bestimmt werden, dass man während des Reaktionsverlaufes Proben aus dem Reaktionsgemisch entnimmt, um den Umwandlungsstatus festzustellen. So kann man beispielsweise die Anwesenheit von M-4-lacton durch Flüssigkeitschromatographie unter 15 Verwendung eines Trägermittels, nämlich «micro bondapak C18» (hergestellt durch die Firma Waters Co., USA), und eines Lösungsmittels, bestehend aus wässrigem 62 vol. %igem Methanol mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min bestimmen. Wird M-4 unter Anwendung seines Ultraviolettabsorptionswertes bei 137 20 nm nachgewiesen, so liefert M-4 ein Peak bei einer Retentions-dauer von 10 min. Auf diese Weise lässt sich die Bestimmung vornehmen. Ähnliche Techniken sind für das Testen der anderen erfindungsgemässen Verbindungen zugänglich.

Sollen die Mikroorganismen in Gegenwart von ML-236B oder 25 einem Derivat davon gezüchtet werden, um die erfindungsgemässen Verbindungen herzustellen, werden die verwendeten Züchtungsbedingungen und Züchtungsmedien so ausgewählt, dass sie den zu züchtenden besonderen Mikroorganismus ange-passt werden. Da die für das erfindungsgemässe Verfahren in 30 Vorschlag gebrachten Mikroorganismenarten bestens bekannt sind, sind auch die Züchtungsbedingungen und Züchtungsmedien, wie sie für diese Mikroorganismen in Frage kommen, bestens bekannt.

Die erfindungsgemässen Verbindungen lassen sich in an sich 35 bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch gewinnen, beispielsweise durch Abfiltrieren von mikrobiellen Zellen, sofern dies nötig ist, worauf man das verbliebene Gemisch entweder der Dünnschichtchromatographie, der Säulenchromatographie oder der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gegebenenfalls 40 kombiniert, unterwirft. Die verschiedenen erfindungsgemässen Verbindungen lassen sich in jenen Fällen, in denen zwei oder mehrere gleichzeitig erhalten werden, durch eine oder mehrere dieser chromatographischen Reinigungsstufen voneinander trennen.

43 Zusätzlich zu den erfindungsgemässen Verbindungen kann in gewissen Fällen auch eine Verbindung erhalten werden, welche als M-3 bezeichnet wird und unter dem Namen 3' ,5'-Dihydroxy-(dihydro-ML-236B) aus der Britischen Patentschrift Nr. 2075013, betitelt «Hydronaphthalene Derivatives, their Prepa-50 ration and Use», geoffenbart ist. Auch diese Verbindung lässt sich in gleicher Weise abtrennen.

Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemässen Verbindungen eine 50%ige Hemmung der Cholesterinbiosynthese bei Konzentrationswerten, welche vergleichbar sind mit jenen für 55 ML-236B und gewissen anderen ähnlichen bekannten Verbindungen oder in gewissen Fällen sogar bei wesentlich geringeren Werten erhalten werden können. Die Hemmaktivitäten der erfindungsgemässen Verbindungen, bewertet bei Konzentrationen in [ig/ml, welche zur Hemmung der Cholesterinbiosynthese 60 um 50 % erforderlich sind [gemessen nach der Methode, wie sie in Journal of Biological Chemistry, 234,2835 (1959) beschrieben ist] sind die folgenden:

M-4-methylester 0,001

65 M-4-natriumsalz 0,0008

4-4-lacton 0,016

Iso-M-4'-methylester 0,007

Iso-M-4'-lacton 0.013

655 090

10

M-4'-

Na-Salz von M-4' ML-236B

0,019 0,00049 0,01

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele erläu- 5 tert.

Beispiel 1 Herstellung von M-4-lacton 20 Sakaguchikolben mit einem Fassungsvermögen von jeweils 10 500 ml, welche jeweils 100 ml eines Mediums der nachstehenden Zusammensetzung enthielten, wurden mit Sporen von Absidia coerulea IFO-4423 inokuliert. Dann wurden die Kolben bei 26° C während 2 Tagen mit 120 Hub pro Minute geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeitdauer wurde das Natriumsalz von ML-236B 15 einem jeden dieser Kolben zugegeben bis zur Erzielung einer Endkonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.). Die Züchtung wurde während weiteren 5 Tagen bei 26° C und 120 Umdrehungen pro Minute weiter geführt.

Die Zusammensetzung des Mediums war die folgende (% 20 Gew./Vol.):

Glucose

K2HPO4

MgS04.7H20

NH4NO3

Pepton

Maisquellflüssigkeit Hefeextrakt ZnS04.7H20 Trinkwasser eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0.

2,0% 0,15% 0,15% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,001% Rest

25

30

Nach beendeter Züchtung wurde die Reaktionsflüssigkeit filtriert und das Filtrat mittels Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Das so erhaltene Gemisch wurde dreimal mit j eweils 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man M-4 enthaltende Extrakte erhielt. Diese Verbindung zeigte einen Rf-Wert von 0,45 bei einer Dünnschichtchromatographie TLC(Platte: Merck Kieselgel Art 5715; Lösungsmittel: Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumenmischverhältnis von 50:50:3). Die vereinigten Extrakte wurden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf wurde eine katalytische Menge T rifluoressigsäure zur Lactonisierung zugegeben. Das entstandene Gemisch wurde hierauf mit einer l%igen (Gew./Vol.) wässrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde der präparativen Flüssigkeitschromatographie unterworfen und zwar System 500 unter Anwendung einer Prep PAK-500/ C18-Patrone der Firma Waters Associates (Prep PAK ist ein Warenzeichen). Die Reinigung mit einem wässrigen 55 vol. %igen Methanolsystem ergab 50,1 mg M-4-lacton.

M-4-lacton besitzt die folgenden physikalischen Eigenschaften:

1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Das magnetische Kernresonanzspektrum wurde bei 60 MHz in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standardwert gemessen und zeigte die in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung veranschaulichten Werte.

2. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanollösung) >.maxnm:

230; 236,7; 244,6.

3. Infrarotabsorptionsspektrum (Flüssigkeitsfilm) YmaxCm"1:

3400, 2950,1725.

4. Dünnschichtchromatographie:

TLC-Platte: Merck Kieselgel Art 5715 ; Lösungsmittel: Mischung

35

40

von Benzol, Aceton und Essigsäure im Vol-Mischungsverhältnis von 50:50:3;

Rf-Wert: 0,62.

Beispiel 2

Beim Arbeiten in dergleichen Weise wie in Beispiel 1 wurden 48 mg M-4-lacton bei Verwendung von Cunninghamella echinulata IFO-4445 erhalten.

Beispiel 3

Beim Arbeiten in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurden 30 mg M-4-lacton unter Verwendung von Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233 erhalten.

Beispiel 4

Beim Arbeiten in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhielt man 5 mg M-4-lacton, wenn man Syncephalastrum racemosum IFO-4814 verwendete.

Beispiel 5

Beim Arbeiten in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhielt man, ausgehend von Syncephalastrum racemosum IFO-4828,6 mg M-4-lacton.

Beispiel 6 Herstellung von Iso-M-4'-methylester

20 Sakaguchikolben mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 500 ml, welche jeweils 100 ml des Mediums enthielten, welches die nachstehend wiedergegebene Zusammensetzung aufwies, wurden mit Sporen von Absidia coerulea IFO-4423 inokuliert. Dann wurden die Kolben während 2 Tagen bei 26° C und 120 Hub pro Minute geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeitspanne wurde jedem Kolben das Natriumsalz von ML-236B bis zu einer Konzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) hinzugegeben. Die Züchtung wurde während weiteren 5 Tagen bei 26° C und 120 Hub pro Minute weitergeführt.

Die Zusammensetzung des Mediums (% in Gew./Vol.) war die folgende:

45

50

55

60

65

Glucose

K2HP04

MgS04.7H,0

NH4N03

Pepton

2,0% 0,15% 0,15% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,001% Rest

Nach beendeter Züchtung wurde die Reaktionsflüssigkeit filtriert und das Filtrat durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Dann wurde das entstandene Gemisch dreimal mit jeweils 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man Extrakte erhielt, welche Iso-M-4' enthielten. Diese Verbindung besass einen Rf-Wert von 0,45 bei der Dünnschichtchroma-tographie (Platte: Merck Kieselgel Art 5715; Lösungsmittel: eine Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure in einem Volumenmischverhältnis von 50:50:3). Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und dann mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan versetzt. Dann wurde das Gemisch während 30 min stehen gelassen und hierauf unter vermindertem Druck zurTrockne eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Lobarsäule (Merck Si 60, Size A) aufgetragen und unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, bestehend aus einer Mischung von Benzol und Äthylacetat in einem Volumenmischungsverhältnis von 1:1 gereinigt. Auf diese

11

655 090

Weise erhielt man 200 mg einer Iso-M-4'-methylesterfraktion. Diese Fraktion wurde auf einer Lobarsäule (Merck RP-8, Size A) unter Verwendung von wässrigem Acetonitril (Volumenmischverhältnis 35 %) als Eluiermittel weiter gereinigt, wobei man 78 mg reinen Iso-M-4'-methylester mit folgenden Eigenschaften erhielt:

1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Das bei 100 mHz in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als inneren Standard gemessene magnetische Kernresonanzspektrum ist aus Fig. 2 der beiliegenden Zeichnung ersichtlich."

2. Massenspektrum:

Gemessen wurde nach der Silylierung mit N,0-Bis-(trimethyl-silyl)-trifluoracetimid unter Anwendung eines Massenspektro-meters, Typ D-300 der Firma Nippon Electronics.

M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 272, 233, 231.

3. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanollösung) Xma!inm:

229; 234,8; 244,5.

4. Infrarotabsorptionsspektrum

(Flüssigkeitsfilm) gemäss Fig. 3 der beiliegenden Zeichnung.

5. Dünnschichtchromatographie:

TLC-Platte: Merck Kieselgel Art 5715; Lösungsmittel: Mischung von Benzol und Aceton im Volumenmischverhältnis von 1:1; Rf-Wert: 0,88.

Nach dem Arbeiten in der oben erwähnten Weise, jedoch durch Ersatz des Diazomethans durch ein anderes geeignetes Diazoalkan ist es möglich, andere Ester von Iso-M-4' zu erhalten.

Beispiel 7 Herstellung von Iso-M-4'-lacton

Man wiederholte die Arbeitsweise gemäss Beispiel 6 einschliesslich der Extraktion mit Äthylacetat, wobei man Extrakte erhielt, welche Iso-M-4' enthielten. Die vereinigten Extrakte wurden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf zur Trockne eingedampft, wobei man das Lactonprodukt erhielt. Der entstandene Rückstand wurde auf eine Lobarsäule (Merck Si 60, Size A) aufgetragen und unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus einer Mischung von Benzyl und Äthylacetat im Volumenmischverhältnis von 1:1 gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 198 mgIso-M-4'-lacton. Dieses Produkt wurde auf einer Lobarsäule (Merck RP-8 Size A) gereinigt und unter Eluierung mit einer 35 vol%igen wässrigen Acetonitrillösung. Auf diese Weise erhielt man 82 mg reines Iso-M-4'-lacton, welchem die folgenden Eigenschaften zustehen:

1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Das magnetische Kernresonanzspektrum, gemessen bei 100 MHz in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetrame-thylsilan als innerer Standard, ist aus Fig. 4 der beiliegenden Zeichnung ersichtlich.

2. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanollösung) ).maxnm:

229; 234,8; 244,5.

3. Infrarotabsorptionsspektrum

(Flüssigkeitsfilm): gemäss Fig. 5 der beiliegenden Zeichnung.

Beispiel 8

Beim Arbeiten in der gleichen Weise wie in Beispiel 7, jedoch unter Verwendung von Cunninghamella echinulata IFO 4445 erhielt man 63 mg Iso-M-4'-lacton.

Beispiel 9

Man erhielt 24 mg Ido-M'-lacton, wenn man in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 arbeitete, jedoch Syncephalosporum racemosum IFO-4814 verwendete.

10

Beispiel 10

35 mg Iso-M-4'-lacton wurden dann erhalten, wenn man in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 arbeitete, jedoch Syncephalosporum racemosum IFO-4828 verwendete.

Beispiel 11

12 mg Iso-M-4'-lacton wurden nach den Angaben gemäss Beispiel 7 erzeugt, wenn man den Mikroorganismus Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233 einsetzte.

Beispiel 12

Herstellung des Natriumsalzes von Iso-M-4'

In wenig Aceton löste man 10 mg des Iso-M-4'-lactons. Diese 15 Lösung wurde mit einer äquivalenten Menge Natriumhydroxyd versetzt und das Gemisch während 1 h stehen gelassen. Der pH-Wert des so erhaltenen Gemischs wurde hierauf durch Zugabe von 0,ln Salzsäure auf 8,0 eingestellt. Dann wurde das Aceton abdestilliert und der Rückstand über einer XAD-20-Säule (unge-20 fähr 20 ml) aufgetragen. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und hierauf mit 50 ml 50 % vol.-%iger wässriger Acetonlösung eluiert. Das Aceton wurde erneut abdestilliert und der Rückstand gefriergetrocknet, wobei man 6 mg des Natriumsalzes von Iso-M-4' erhielt, welches die folgenden 25 Eigenschaften aufwies:

1. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanollösung)

Xmaxnm: 229 (Schulter); 235; 245 (Schulter).

2. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) vcm"1:3400,2850,1710, 30 1580.

3. Dünnschichtchromatographie:

TLC-Platte: Merck Kieselgel Art 5715 ; Lösungsmittel: Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure im Vol.-Mischungsverhältnis von 50:50:3;

35 Rf-Wert: 0,45

Beispiel 13 Herstellung von M-4-methylester

Zwanzig 500 ml Sakaguchi-Kolben, welche jeweils 100 ml 40 eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielten, wurden mit Sporen von Absidia coerulea IFO-4423 inokuliert. Die Kolben wurden dann während zwei Tagen bei 120 Hub pro Minute und bei einer Temperatur von 26° C der Schüttelkultur unterworfen. Das Natriumsalz von ML-236B wurde 43 einem jeden Kolben bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) zugegeben. Die Züchtung erfolgte während weiteren 5 Tagen bei einer Temperatur von 26° C und 120 Hub pro Minute.

Nach beendeter Züchtung wurde die Reaktionsflüssigkeit 50 filtriert und das Filtrat mittels Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 gestellt. Das entstandene Gemisch wurde dreimal mit jeweils 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man Extrakte erhielt, welche M-3, M-4 und Iso-M-4' enthielten. Sowohl M-4 als auch Iso-M-4' zeigten einen Rf-Wert von 0,45 bei der Dünnschicht-55 Chromatographie (Platte: Merck Kieselgel Art 5715; Lösungsmittel: eine Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure im Vol.-Mischungsverhältnis von 50:50:3). Die vereinigten Extrakte wurden mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf mit einer ätherischen Lösung von 60 Diazomethan versetzt. Dann wurde das Gemisch während 30 min stehen gelassen und anschliessend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Wurde dieser Rückstand anschliessend auf einer Lobar-Säule (Merck Si 60, Size A) aufgetragen und erfolgte die Reinigung 65 unter Verwendung einer Mischung von Benzol und Äthylacetat im Vol.-Mischungsverhältnis von 1:1, so erhielt man eine Fraktion, welche den Iso-M-4'-methylester enthielt und eine Fraktion, welche den M-4-methylester aufwies. Auf diese Weise

655 090

12

erhielt man 185,3 mg der letzteren aktiven Fraktion, aus welcher man 20 mg reinen M-4-methylester in Form eines farblosen Öls gewinnen konnte, wenn man eine Lobar-Säule (Merck RP-8,

Size A) zur Anwendung brachte und die Eluierung mit einer 35 vol.%igen wässrigen Acetonitrillösung vornahm. Der M-4-methylester besitzt die folgenden Eigenschaften:

1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Gemessen bei 200 MHz in Deuterochloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard ôppm:

0,88 (3H, Triplett, J=7,3 Hz);

0,89 (3H, Dublett, J=6,5 Hz);

1,12 (3H, Dublett, J=6,8 Hz);

1,1-1,7 (10H, Multiple«);

2,34 (IH, Sextuplett, J=7 Hz);

2,3-2,5 (2H, Multiplett);

2,49 (2H, Dublett, J=6,4Hz);

2,58 (1H, Multiplett);

3,72 (3H, Singulett);

3,78 (1H, Multiplett);

4,25 (IH, Quintuple«, J=7 Hz);

4,4 (1H, Multiplett);

5,42 (1H, Multiplett);

5,56 (1H, Multiplett);

5,90 (1H, doppeltes Dublett, J=9,8 und 5,6 Hz); 5,99 (1H, Dublett, J=9,8 Hz).

2. Massenspektrum:

Das Messen erfolgte nach der Silylierung mit N,0-Bis-(trime-thylsilyl)-trifluoracetimid unter Anwendung eines Massenspek-trometers vom Typ D-300 der Fa. Nippon Electronics. M/e: 654 (M+), 552, 462, 372, 290, 272,233,231.

3. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Äthanollösung) Xmaxnm: 230,1; 237,3; 246,4.

4. Infrarotabsorptionsspektrum (Flüssigkeitsfilm) vcm"1:3400, 2950,1730.

5. Dünnschichtchromatographie:

TLC-Platte: Merck Kieselgel Art 5715; Lösungsmittel: Mischung von Benzol und Aceton im Vol.-Mischungsverhältnis von 1:1; Rf-Wert: 0,88.

Beim Arbeiten gemäss den obigen Angaben, jedoch unter Verwendung eines anderen geeigneten Diazoalkans anstelle von Diazomethan, war es möglich, andere Ester von M-4 zu erzeugen.

Beispiel 14

Herstellung der Natriumsalze von M-4 und Iso-M-4' Man arbeitete in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bis zur Filterung der Reaktionsflüssigkeit. Das Filtrat wurde hierauf über einer HP-20-Säule der Fa. Mitsubishi Chemical Industries adsorbiert. Nach dem Waschen der Säure mit Wasser wurden Fraktionen, welche das Natriumsalz vonM-4, das Natriumsalz von Iso-M-4' und das Natriumsalz von M-3 enthielten. Diese wurden mit Hilfe von 50 vol.-%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gefriergetrocknet, wobei man 830 mg eines gefriergetrockneten Produktes erhielt, das durch wiederholte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Säule: Microbondapack C18,40 vol. %ige wässrige Methanollösung 1 ml/min) gereinigt wurde. Auf diese Weise erhielt man 32 mg des Natriumsalzes von M-4 und 280 mg des Natriumsalzes von Iso-M-4'.

Die Eigenschaften des Natriumsalzes von Iso-M-4' sind identisch mit j enen des Produktes von Beispiel 12 und die Eigenschaften des Natriumsalzes von M-4 sind die folgenden: 1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Gemessen bei 200 MHz in Deuteromethanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard:

ôppm:

lu

15

20

25

30

35

40

45

0,91 (3H, Triplett, J=7,5 Hz);

0,92 (3H, Dublett, J=7 Hz);

1,12 (3H, Dublett, J=7Hz);

1.1-1,8 (10H, Multiplett);

2,25 (1H, doppeltes Dublett, J=15 und 7,6 Hz); 2,34 (1H, doppeltes Dublett, J=15 und 5,5 Hz);

2.2-2,4 (3H, Multiplett);

2,48 (1H, Multiplett);

3,68 (1H, Multiplett);

4,07 (1H, Multiplett);

4,28 (1H, Multiplett);

5,36 (1H, Multiplett);

5,48 (1H, doppeltes Dublett, J=3 und 2 Hz); 5,88 (1H, doppeltes Dublett, J=9,6 und 5,3 Hz); 5,98 (1H, Dublett, J=9,8 Hz).

2. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanollösung)

Xmaxnm: 230,0; 237,2; 245,0.

3. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) vcm"1:3400,2900,1725, 1580.

4. Dünnschichtchromatographie:

TCL-Platte: Merck Kieselgel Art 5715 ; Lösungsmittel : eine Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure im Vol.-Verhält-nis von 50:50:3;

Rf-Wert: 0,45.

Beispiel 15

18 mg M-4-methylester wurden nach den Angaben gemäss Beispiel 13 erhalten, wenn man den Mikroorganismus Cunninghamella echinulata IFO 4445 einsetzte.

Beispiel 16

33 mg M-4-methylester wurden erhalten, wenn man nach den Angaben gemäss Beispiel 13 arbeitete, jedoch den Mikroorganismus Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233 verwendete.

Beispiel 17

12 mg des M-4-methylesters wurden erhalten beim Arbeiten gemäss Beispiel 13, jedoch unter Verwendung von Syncephalos-porum racemosum IFO 4814.

Beispiel 18

16 mg des M-4-methylesters wurden beim Arbeiten gemäss Beispiel 13 dann erhalten, wenn man als Mikroorganismus Syncephalosporum racemosum IFO 4828 verwendete.

50

Beispiel 19 Herstellung des M-4-methylesters An fünf männlichen Spürhunden mit einem mittleren Gewicht von 10 kg wurde ML-236B in einer Menge von 200 mg/kg/Tag verabreicht und der Urin dieser Tiere während 3 Tagen gesammelt. 31 dieses gesammelten Urins wurden durch eine 500 ml XAD-2-SäuIe geleitet und mit 500 ml einer 50 vol. %igen wässri-55 gen Acetonlösung eluiert, worauf man das Aceton unter vermindertem Druck abdestillierte und die verbleibende Flüssigkeit durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 einstellte. Hierauf wurde das Gemisch dreimal und zwar jedesmal mit 11 Äthylacetat extrahiert, umM-4zu erhalten. Diese 60 Verbindung zeigte einen Rf-Wert von 0,45 bei einer Dünnschichtchromatographie: (TLC-Platte: Kieselgel Art 5715 der FirmaMerckund Co., Inc.; Lösungsmittel: eine Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumenmischverhältnis von 50:50:3). Der Extrakt wurde mit einer wässrigen gesättigten 65 Natriumchloridlösung gewaschen und dann nach der Zugabe einer ätherischen Lösung von Diazomethan während 30 min stehen gelassen. Hierauf wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zurTrockne eingedampft. Der Rückstand

13

655 090

wurde in 10 ml einer 55 vol. %igen wässrigen Methanollösung gelöst und durch eine Säule (Produkt der Firma Merck & Co., Inc. ; RP-8, Size B) chromatographiert. Nach dem Hindurchlassen von 200 ml einer 55 vol. %igen wässrigen Methanollösung wurde mit einer 60 vol. %igen wässrigen Methanollösung eluiert. Die ersten 240 ml des Eluates wurden beiseite gestellt und die weiteren 120 ml gesammelt. Diese Fraktion wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 2,5 ml einer 65 vol. %igen wässrigen Methanollösung gelöst und durch Hochleistungsflüs-sigkeitschromatographie (Jasco-Trirotar, Säule: jx-Bondapack C18) gereinigt. Der das'vierte Peak zeigende Teil wurde abgetrennt und das Lösungsmittel abdestilliert, wobei man den M-4-methylester als farbloses Öl in einer Menge von 4 mg erhielt. Dieses Öl besass die gleichen Eigenschaften wie das Produkt gemäss Beispiel 13.

Beispiel 20 Herstellung von M-4 Homogenisierte Kaninchenleber wurde in diesem Beispiel angewandt, um M-4 aus ML-236B zu erhalten.

(a) Enzymatische Lösung 3 Volumina einer 1,15 Gew.-Teile Kaliumchlorid auf 100 Vol.-Teile einer 10 millimolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,4) wurden 1 Volumen Kaninchenleber hinzugegeben und das Gemisch homogenisiert. Das so homogenisierte Gemisch wurde hierauf bei 9000 G während 20 min zentrifugiert und die obenaufflies-sende Fraktion als enzymatische Lösung entnommen.

Beispiel 22 Herstellung des M-4-methylesters Jeder der 20 Erlenmeyerkolben mit jeweils 500 ml Fassungs-5 vermögen, welcher 100 ml eines Mediums der weiter unten beschriebenen Zusammensetzung aufwies, wurde mit Sporen von Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 geimpft. Das Inokulum wurde einer Schüttelkultur bei 220 Umdrehungen pro Minute und bei 26° C unterworfen. Nach Ablauf von 4 Tagen wurde ML-lo 236B einer Endkonzentration von 0,05% (Gew./Vol.) hinzugegeben und die Züchtung während weiteren 6 h bei 220 Umdrehungen pro Minute und bei einerTemperatur von 26° C fortgeführt. Die Zusammensetzung des Mediums (in %) (Gew./Vol.) war die folgende:

15

20

Glucose

Pepton

Fleischextrakt

Hefeextrakt

Maisquellflüssigkeit

Brunnenwasser

(pH nicht eingestellt)

1,0% 0,2% 0,1% 0,1% 0,3% Rest

Nach beendeter Züchtung wurde das Filtrat durch Zugabe von 25 Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Hierauf wurde das Gemisch dreimal und zwar jedesmal mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Auf diese Weise erhielt man eine M-4 enthaltende Fraktion. M-4 besitzt einen Rf-Wert von 0,45 bei der Dünnschichtchromatographie (Platte: Merck Kieselgel Art 5715; 30 Lösungsmittel: eine Mischung von Benzol, Aceton und Essig-(b) Cofaktorlösung säureim Volumenmischverhältnis von 50:50:3). DasUmwand-

ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADPH) in der lungsausmass betrug 90 %. Dieser Extrakt wurde mit einer reduzierten Form 3 mg gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, worauf

MgCl2-Lösung (508 mg/10 ml) 0,1 ml man eine ätherische Diazomethanlösung hinzugab. Das erhal-

1,15%ige (Gew./Vol.) KCL-Lösung 0,3 ml35 tene Gemisch wurde während 30 min stehen gelassen und hierauf

0^2 molare Phosphatpufferlösung (pH 7,4) o',6ml unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rück-

Die obigen Substanzen wurden auf ein Gesamtvolumen von 1 ml vermischt, um die Cofaktorlösung zu erhalten.

(c) Reaktionslösung 80 |il der oben erwähnten enzymatischen Lösung, 20 (xl der oben erwähnten Cofaktorlösung und 2 jxl einer Methanollösung von ML-236B wurden miteinander vermischt, um eine Endkonzentration von ML-236B von 1 mMzu erhalten. Die entstandene Lösung wurde während 30 min bei 37° C geschüttelt. M-4 wurde im Reaktionsgemisch gebildet. Das Vorhandensein von M-4 wurde durch TLC (die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 19) identifiziert.

Beispiel 21 Herstellung des Natriumsalzes von M-4 2 mg M-4-methylester wurden in 1 ml einer 0,In Natriumchloridlösung gelöst und während 1 h bei 30° C hydrolysiert. D ann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 ml Chloroform gewaschen und die entstandene wässrige Phase durch Zugabe von 0,ln Salzsäurelösung auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und über eine XAD-2-Säule (ca. 5 ml) geleitet. Die Säule wurde mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen und das gewünschte Produkt mit 15 ml einer 50 vol. %igen wässrigen Acetonlösung eluiert. Das Aceton wurde aus dem Eluat abdestilliert. Dann wurde der Rückstand durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestätigt, wobei man ein einzelnes Peak (die Retentionsdauer betrug 13 min bei Eluierung mit einer 40 vol. %igen wässrigen Methanollösung bei 1 ml/min) erzielte. Der Rückstand wurde hierauf lyophilisiert. Auf diese Weise erhielt man 0,8 mg des Natriumsalzes von M-4, welches die gleichen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 14 aufwies.

stand wurde auf eine Lobarsäule (Merck Si 60, Size A) gebracht und mit einer Mischung von Benzol und Äthylacetat im Volumenmischverhältnis von 1:1 gereinigt. Auf diese Weise erhielt 40 man ungefähr 600 mg des M-4-methylesters, welcher die gleichen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 13 aufwies.

Beispiel 23 Herstellung von M-4-lacton Das in Beispiel 22 beschriebene Verfahren wurde bis und mit dem dreifachen Waschvorgang mit Äthylacetat wiederholt und mit einer wässrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen . Die entstandene Lösung wurde hierauf zur Trockne eingedampft, wobei man ein Lactonprodukt erhielt. Dieses Produkt wurde aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei man ungefähr 560 mg (56 %) M-4-lacton mit den gleichen Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 1 erhielt.

45

50

55

60

Beispiel 24 Herstellung des Natriumsalzes von M-4 Die Arbeitsweise erfolgt nach den Angaben in Beispiel 22, wobei man aus der Umwandlungsreaktion 1,91 des Filtrâtes erhielt. Dieses Filtrat wurde dreimal mit jeweils 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man M-4 enthaltende Fraktionen erhielt. Durch unmittelbare Überführung dieser Fraktionen in eine wässrige 5%ige (Gew./Vol.) Natriumbicarbonatlösung erhielt man eine das Natriumsalz von M-4 enthaltende Fraktion. Hierauf wurde die dieses Natriumsalz enthaltende Fraktion mit 2n 65 Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf einer H-20 Säule der Firma Mitsubishi Chemical Industries adsorbiert. Durch Waschen mit Wasser und Eluieren mit einer 50 vol. %igen wässrigen Acetonlösung gelangte man zu einer das Natriumsalz

655 090

14

M-4 enthaltenden Fraktion, aus welcher man 570 mg (52 %) eines gefriergetrockneten Produktes gleicher Eigenschaften wie in Beispiel 14 erhielt.

Beispiel 25 5

Herstellung von M-4 Es wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 22 gearbeitet, mit dem Unterschied jedoch, dass man als Mikroorganismen die folgenden einsetzte, wobei man die nachstehend bezeichneten 10 Werte für die Umwandlung in M-4 erzielte.

Mikrooranismen Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5303 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556 Mucor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585 Mucor globosus NRRL-12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Mucor chinensis IFO-4772 Rhizopus circinans ATCC-1225 Rhizopus arrhizus ATCC-11145 Zygorynchus moelleri IFO-4833 Circinella muscae IFO-4457 Circinella rigida NRRL-2341 Circinella umbellata NRRL-1713 Circinella umbellata IFO-4452 Circinella umbellata IFO-5842 Actinomucor elegans ATCC-6476 Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 Martierella isabellina IFO-6739 Gongronella butleri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477

Überführung in M-4 +4 +4 15 +4 +4 +4 +4 +420 +4 +4 +4 +4 Spuren25 +1 + 1 Spuren Spuren

+ 130

+ 1 Spuren +1 Spuren Spuren35 Spuren +1 +1 +1 +l"o Spuren +1 +1 +1

+ 145

Spuren Spuren +1 +1 +250

26° C unterworfen. Nach Ablauf von 4 Tagen gab man einer Endkonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) ML-236B hinzu und führte die Züchtung während weiteren 6 Tagen bei 26° C und 120 Hub pro Minute durch.

Nach beendeter Züchtung wurde das Umwandlungsreaktions-gemisch abfiltriert und das Filtrat mittels Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. Dann wurde das Gemisch dreimal mit jeweils 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man eine Iso-M-4'-enthaltende Fraktion erhielt. Dieser Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf zur Trockne eingedampft. Auf diese Weise erhielt man ein Lactonprodukt. Der Rückstand wurde auf eine Lobarsäule (Merck Si 60, Size A) aufgetragen und mit einem Äthylace-tatsystem gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 12 mg Iso-M-4'-lacton mit den gleichen Eigenschaften wie in Beispiel 7.

Beispiel 27 Herstellung von M-4'-lacton Jeweils 20 Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von500 ml, welche 100 ml eines Mediums der weiter unten angegebenen Zusammensetzung enthielten, wurden mit Sporen von Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 geimpft. Das Inokulum wurde dann einer Schüttelkultur bei 26° C und 220 Umdrehungen pro Minute unterworfen. Nach Ablauf von 3 Tagen wurde bei einer Endkonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) ML-236B hinzugegeben und die Züchtung bei 26° C und 220 Umdrehungen pro Minute durchgeführt.

Die Zusammensetzung des Mediums war die folgende (% Gew./Vol.):

Glucose

Pepton

Fleischextrakt

Hefeextrakt

Maisquellflüssigkeit

(pH nicht eingestellt)

1,0% 0,2% 0,1% 0,1% 0,3%

Die oben erwähnten Zahlenwerte hinsichtlich der Überführung in M-4 haben die folgenden Bedeutungen:

Spuren + 1 +2 +3 +4

0,5 % oder weniger 55 0,5-5% 5,0-10,0% 10,0-30,0% 70,0-90,0%

60

Nach beendeter Züchtung wurde das Umwandlungsreaktions-gemisch abfiltriert und das Filtrat mittels Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Das Gemisch wurde hierauf dreimal, und zwar jeweils mit 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man eine M-4' enthaltende Fraktion erhielt, welche einen Rf-Wert von 0,46 bei der Dünnschichtchromatographie (Platte: Merck Kieselgel Art 5715 ; Lösungsmittel: Mischung von Benzol, Aceton und Essigsäure im Volumenmischverhältnis von 50:50:3) aufwies. Dieser Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Zugabe einer katalytischen Menge Trifluoressigsäure lactonisiert. Das entstandene Gemisch wurde hierauf mit einer 5%igen (Gew./Vol.) wässrigen Natriumbicar-bonatlösung gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat dehy-dratisiert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat zum Auskristallisieren gebracht, wobei man ungefähr 180 mg M-4'-lacton erhielt, welches die folgenden physikalischen Eigenschaften aufwies.

1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Gemessen in Deuterochloroform bei 100 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard.

Beispiel 26 Herstellung von Iso-M-4'-lacton Jeweils 20 Sakaguchikolben mit 500 ml Fassungsvermögen, welche 100 ml eines Mediums der in Beispiel 22 beschriebenen Zusammensetzung enthielten, wurde mit Sporen von circinella muscae IFO-4457 inokuliert. Das Inokulum wurde einer Schüttelkultur bei 220 Hub pro Minute und bei einer Temperatur von

ôppm:

6,01 (IH, Dublett), 5,90 (IH, Quartett), f'5 5,75 (1H, Multiplett), 5,50 (1H, Multiplett), 4,60 (1H, Multiplett), 4,25 (1H, Multiplett).

2. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanollösung)

Xmaxnm: 230, 237, 245.

3. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) vcm"': 3500, 1720.

4. Massenspektrum: M/e: 406 (M+), 304, 286.

5. Optische Drehung: [a] d = +310,9° (c = 0,66, Methanol).

6. Schmelzpunkt: 141 bis 143° C.

Elementaranalyse:

ber.: C 67,95; H 8,43%

gef.: C 68,05; H 8,37%

8. Dünnschichtchromatographie: TLC-Platte: Merck Kieselgel Art 5715; Lösungsmittel: Mischung von Benzol und Aceton (Volumenmischverhältnis 1:1)

Rf-Wert: 0,64.

Beispiel 28 Herstellung des Natriumsalzes von M-4'

Beim Züchtungsvorgang in ähnlicher Weise wie in Beispiel 27 gelangte man zu einem Umwandlungsreaktionsgemisch.

Nach beendeter Züchtung wurde das Umwandlungsreaktionsgemisch abfiltriert und das Filtrat durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Hierauf wurde dreimal mit jeweils 11 Äthylacetat extrahiert, wobei man eine M-4' enthaltende Fraktion erhielt, welche man mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung wusch und unmittelbar hierauf in eine 5%ige (Gew./Vol.) wässrige Natriumbicarbonatlösung eintrug. Auf diese Weise erhielt man eine das Natriumsalz M-4' enthaltende Fraktion. Die so erhaltene wässrige Schicht wurde durch Zugabe von 0,ln Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und auf einer Diaion HP 20 Harzsäule der Firma Mitsubishi Chemical Industries adsorbiert. Hierauf wurde mit einer 50vol. %igen wässrigen Acetonlösung eluiert. Das Aceton wurde abdestilliert und der Rückstand gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhieltman 1,41 g des Natriumsalzes von M-4', welches die folgenden physikalischen Eigenschaften aufwies.

1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

Gemessen in Deuterochloroform bei 60 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard.

ôppm:

6,00 (IH, Dublett),

5,95 (IH, Quartett),

5,70 (IH, breites Singulett),

5,50 (1H, breites Singulett).

15 655 090

2. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanol) Xmaxnm: 230, 238, 246.

3. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) vcm"1:3400,2900,1680.

5 Beispiel 29

Herstellung von M-4'-methylester

Es wurde praktisch in der gleichen Weise gezüchtet wie in Beispiel 27, wobei man ein Umwandlungsreaktionsgemisch er-io hielt.

Nach beendeter Züchtung wurde das Umwandlungsgemisch abfiltriert und das Filtrat mittels Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt. Hierauf wurde dreimal mit jeweils 11 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit ]5 einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf mit einer ätherischen Diazomethanlösung versetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde während 30 min stehen gelassen und hierauf unter vermindertem Druck zurTrockne eingeengt. Der Rückstand wurde unter Verwendung einer Lobarsäule 20 (Merck RP-8, Size A) gereinigt, wobei man als Entwicklerlösungsmittel eine Mischung von Benzol und Aceton im Volumenmischverhältnis von 1:1 einsetzte. Auf diese Weise erhielt man 150 mg des M-4'-methylesters in Form einer farblosen öligen Substanz, welche die folgenden Eigenschaften aufwies. 25 1. Magnetisches Kernresonanzspektrum:

ôppm:

30 6,01 (IH, Dublett),

5,90 (IH, Quartett),

5,75 (IH, breites Singulett),

5,50 (1H, breites Singulett),

3,70 (3H, Singulett).

35

2. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanol) Xma!tnm: 230, 238, 246.

3. Infrarotabsorptionsspektrum (Flüssigkeitsfilm) vcm"1:3400, 1730.

40 4. Massenspektrum:

Das Messen erfolgte nach der Silylierung mit N,0-Bis-(trime-thylsilyl)-trifhioracetimid unter Verwendung eines Massenspek-trometers vom Typ D-300 der Firma Nippon Electronics.

M/e: 654 (M+).

M

3 Blatt Zeichnungen

Claims

655 090

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Die Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel:

HOOC^N^0"

H0\J (II

R

worin R eine der beiden folgenden Gruppen bedeutet:

0
7. Verbindungen nach Anspruch 2 mit der folgenden Konfigurationsformel:

(TO 00

(VI)

H3C'

'jtxr oder

10

worin R1 die gleiche Bedeutung wie im Anspruch 2 hat, sowie die pharmazeutisch zulässigen Salze davon.
8. Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, 15 dass R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5

Kohlenstoffatomen, z. B. den Methylrest, bedeutet.
9. Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form von Alkalimetallsalzen, z.B. der Natriumsalze, vorliegen.

20 10. Die Verbindung nach Anspruch 1 mit der folgenden Formel:

25

sowie die Lactone, Salze und Ester dieser Verbindungen.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 der folgenden allgemeinen 30 Formel:

R^OOC

(im
11. Die Verbindung nach Anspruch 10 mit der folgenden Konfigurationsform el :

(III

35

40

(VI

worin R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z. B. den Methylrest, bedeutet, sowie ihre pharmazeutisch zulässigen Salze. _ 12. Verbindung nach Anspruch 10 mit der folgenden Konfigu-
3. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, 45 rationsformel:

dass sie in Form von Alkalimetallsalzen, z. B. in Form der Natriumsalze, vorliegen.
4. Verbindungen nach Anspruch 2, welche die Konfiguration gemäss folgender Formel aufweisen:

50

(IVI

55

(VIII
13. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:

60

worin R1 die gleiche Bedeutung wie im Anspruch 2 hat, sowie die pharmazeutisch zulässigen Salze davon.
5. Verbindungen nach Anspruch 4, worin R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z. B. den Methylrest, bedeutet. 65
6. Verbindungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

dass sie in Form von Alkalimetallsalzen, z. B. in Form von Natriumsalzen, vorliegen.

(Villi

655 090

4

Rhizopus circinans ATCC-1225 Rhizopus arrhizus ATCC-11145 Zygorynchus moelleri IFO-4833 Circinella muscae IFO-4457 Circinella rigida NRRL-2341 Circinella umbellata NRRL-1713 Circinella umbellata IFO-4452 Circinella umbellata IFO-5842 Phycomyces blakesleeanus NRRL-12475 Martierella isabellina IFO-6739 Gongronella butleri IFO-8080 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 Syncephalastrum nigricans NRRL-12480 Absidia glauca var. paradoxa IFO-4431 Actinomucor elegans ATCC-6476
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Mikroorganismus der folgenden Gruppe entnommen wird:

Mucor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585 Mucor globosus NRRL-12474 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus 1FO-4563 5 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Pycnoporus coccineus NRRL-12476 Rhizoctonia solani NRRL-12477 Syncephalastrum nigricans NRRL-12478 10 Syncephalastrum nigricans NRRL-12479 und Syncephalastrum nigricans NRRL-12480.
22. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der folgenden Gruppe entnommen 15 wird:

Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor fragilis Mucor genevensis 20 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Pycnoporus coccineus und Rhizoctonia solani.

Absidia coerulea Cunninghamella echinulata Syncephalastrum racemosum Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorphosporus Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor globosus

Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Mucor heterosporus Mucor spinescens Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani Syncephalastrum nigricans
21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der folgenden Gruppe entnommen wird:

Absidia coerulea IFO-4423 Cunninghamella echinulata IFO-4445 Cunninghamella echinulata IFO-4444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5303 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-242.35 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-4554 Mucor circinelloides f..circinelloides IFO-5775 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556

25
23. Verfahrennach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Reaktionsgemisch eine Verbindung isoliert, welche der Gruppe entnommen ist, welche aus den Verbindungen der Formeln:

R1ooc./~sV,,oh '

30

35

40

45

50

55

60

65

3

655 090

worin R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, sowie die pharmazeutisch zulässigen Salze dieser Säuren.
14. Verbindungen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form von Alkalimetallsalzen, z. B. in Form von Natriumsalzen, vorliegen.
15. Die Verbindung nach Anspruch 1 mit der folgenden
16. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel:

HODC KO

II

worin R eine der beiden folgenden Formeln darstellt:

oder oder von Lactonen, Salzen oder Estern davon, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat, das aus der Verbindung der Formel der entsprechenden Carbonsäure und einem Salz und einem Ester dieser Carbonsäure ausgewählt ist, enzymatisch hydroxy-liert.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Hydroxylierung mit Hilfe eines Mikroorganismus vornimmt, welcher ausgewählt wird aus den Gattungen Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Circinella, Actino-mucor, Gongronella, Phycomyces, Martierella, Pycnoporus, Rhizoctonia, Absidia, Cunninghamella, Syncephalastrum und Streptomyces, oder mit einem zellfreien, enzymhaltigen Extrakt aus solchen Mikroorganismen bewirkt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der folgenden Gruppe entnommen wird:

Absidia coerulea Cunninghamella echinulata Syncephalastrum racemosum Streptomyces roseochromogenus 5 Mucor hiemalis f. hiemalis Mucor bacilliformis Mucor circinelloides f. circinelloides Mucor hiemalis f. corticolus Mucor dimorphosporus 10 Mucor fragilis Mucor genevensis Mucor globosus

Mucor circinelloides f. griseo-cyanus Mucor heterosporus 15 Mucor spinescens Rhizopus chinensis Rhizopus circinans Rhizpous arrhizus Zygorynchus moelleri 20 Circinella muscae Circinella rigida Circinella umbellata Actinomucor elegans Phycomyces blakesleeanus 25 Martierella isabellina Gongronella butleri Pycnoporus coccineus Rhizoctonia solani Syncephalastrum nigricans 30 Absidia glauca var. paradoxa
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der folgenden Gruppe entnommen wird:

35

Absidia coerulea IFO-4423 Cunninghamella echinulata IFO-4445 Cunninghamella echinulata IFO-4444 Cunninghamella echinulata ATCC-9244 40 Syncephalastrum racemosum IFO-4814 Syncephalastrum racemosum IFO-4828 Streptomyces roseochromogenus NRRL-1233 Streptomyces roseochromogenus IFO-3363 Streptomyces roseochromogenus IFO-3411 45 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5834 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-5303 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8567 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8449 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8448 50 Mucor hiemalis f. hiemalis IFO-8565 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-117.08 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-109.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-200.28 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS 242.35 55 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-110.19 Mucor hiemalis f. hiemalis CBS-201.65 Mucor bacilliformis NRRL-2346 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-4554 Mucor circinelloides f. circinelloides IFO-5775 60 Mucor hiemalis f. corticolus NRRL-12473 Mucor dimorphosporus IFO-4556 Mucor fragilis CBS-236.35 Mucor genevensis IFO-4585 Mucor globosus NRRL-12474 65 Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO-4563 Mucor heterosporus NRRL-3154 Mucor spinescens IAM-6071 Rhizopus chinensis IFO-4772

5

655 090

worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, oder einem Salz oder einem Ester oder einem Lacton der Verbindungen der obigen Formeln oder einem Gemisch davon besteht.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester ein Alkylester mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z. B. ein Methylester, ist.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz ein Alkalimetallsalz, z. B. ein Natriumsalz, ist.
26. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung herstellt, welche der Formel:

(VII

worin R1 Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, einem pharmazeutisch zulässigen Salz der entsprechenden Säuren, worin R1 das Wasserstoffatom darstellt, oder der Formel:

(VIII

(Villi

(IX)

io herstellt und dass der Mikroorganismus aus der aus Absidia coerulea und Cunninghamella echinulata bestehenden Gruppe entnommen wird.

]5 30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass R1 das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, z. B. einen Methylrest, bedeutet.
31. Verfahren nach Anspruch 29, worin das Salz ein Alkalimetallsalz, z. B. ein Natriumsalz, ist.

20 32. Pharmazeutisches Präparat, welches als Wirkstoff eine Verbindung der Formel I oder ein Lacton, ein Salz oder einen Ester derselben nach Anspruch 1 enthält.
33. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 32, in welchem der Wirkstoff eine Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 25 15 ist.