DD157344A5 - Verfahren zur herstellung von polyhydro-3,7-dimethyl-8-2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2h-pyran-2-yl)-aethyl-1-napthtylenyl-2-methylbutanoaten und deren entsprechenden saeuren - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Substanzen nach der Kultivierung eines Mikroorganismus, der zum Genus Aspergillus gehoert, in einem Kulturmedium. Die Verbindungen besitzen die Strukturen I bis IV. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der entsprechenden Salze und Ester der Carbonsaeuren. Diese Verbindungen sind hoch-aktive hypocholesterinaemische und hypolipaemische Arzneimittel.
Description
VertretersίInternationales Patentbüro Berlin ;Wallstraße 23-24, DDR-1020 Berlin
Anmelder^ , Merck & Co „, Ine
P.O. Box 2000 Rahway, New Jersey 07065, USA
Titel der Erfindung: . .
Verfahren zur Herstellung von Pol"ynydro-3,7-dimethyl-8-/2"-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran~2-yl)-äthyl/-1-naphthylenyl· 2-methylbutanoaten und den entsprechenden Säuren
Anwendungsgebiet der Erfindung?
Die Erfindung betrifft hypocholesterinämische Produkte aus der Züchtung eines Mikrofungus der Spezie Aspergillus, Sie betrifft insbesondere Verbindungen der Formeini
HO
HO.
-X-
2 18 3 2
. HO
III
wie auch ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze und die niedrigen Alkyl- und substituierten Allylester der Carbonsäuren, bei denen der mögliche Substituent "Phenyl, Dimethylamine) oder Acetylamino ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Züchtung des Mikrofungus und zur Isolierung aus dem Medium einer hypocholesterinämischen Verbindung der obigen Strukturen. Diese neuen Verbindungen besitzen ausgezeichnete Eigenschaften bei der Inhibierung der Cholesterinbiosynthese und sind nützlich gegenüber Hypercholesterämie und Hyper'lipämie.
Charakteristik der bekannten Lösungen:
Wegen der möglichen Verbindung zwischen einem hohen Blutcholesteringehalt'und Ahterosklerose hat man viele Bemühungen unternommen, um Wege und Verbindungen zu finden, mit denen der Cholesteringehalt im Körper von Säugetieren erniedrigt werden kann. Einer dieser Wege besteht darin, die Fähigkeit des Körpers des Säugetiers zu inhibieren, Cholesterin zu synthetisieren, .j."''·."
Kürzlich haben Endo et al. in den US-PS»en 4 049 495 und 3 983 140 ein Fermentationsprodukt beschrieben, das durch Züchtung eines.Mikroorganismus des Genus Penicillium und Isolierung aus dem Medium erhalten wird. Sie bezeichnen es ML 236 B und bestimmten seine Struktur zusammen mit zwei verwandten Verbindungen 236 A und 236. Ci Seine Struktur wurde unter dem Namen
J ^ „3"
Compactin ebenfalls von A.G." Brown, T.C« Smalef T0J. King in "J. Chem. Soc." (Perkin I), 1165.(1975) bestimmt. Es wurde ge- £ lindens, daß diese Verbindung ein in-vivo-Inhibitor für die Biosynthese von Cholesterin ist.
Ziel der Erfindung:
Der vorliegenden Erfinaimg liegt das Ziel zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die die Biosynthese von Cholesterin inhibieren und als Arzneimittel .nützlich sind.
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Züchtung eines Mikroorganismus, der sich von dem,- der von Endo verwendet wurde, unterscheidet, eines Mikrofungus des Genus Aspergillus, neue Substanzen ergibt, die sehr potente Inhibitoren der Biosynthese von Cholesterin bei Säugetieren sind. Es wurde weiterhin gefunden, daß diese Verbindungen im wesentlichen die neuen Verbindungen I, II, III und IV der obigen Strukturen enthalten, die von Spuren von anderen Verbindungen begleitet sind. Diese neuen Verbindungen sind wesentlich wirksamere Inhibitoren derCholesterinsynthese in vivo als die von Endo beschriebene Verbindung ML 236 B.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser Verbindungen sind solche, die aus Kationen, wie Natrium, Kalium, Aluminium, Calcium,. Lithium, Magnesium, Zink, Ammoniak, Äthylendiamin, N-Methylglucamin, Lysin, Arginin, "Ornithin, Cholin, N,Nf-Dibenzyläthylendiamin, Chloroprocain, Diäthanolamin, Procain, N-Benzylphenäthyläinin, 1-p~Chlorbenzyl-2-pyrrolidin~1!-yl-methylbenzimidazol, Diäthylamin, Piperazin, Tris-(hydroxymethyl)-amino~ methan und Tetramethylammonium gebildet werden«
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sehr wertvolle antihypercholesterinämische'Mittel für die Behandlung von Atheroskle
rose, Hyperlipämie und ähnlichen Krankheiten beim Menschen. Sie können oral oder parenteral in Form von Kapseln, einer Tablette, einer injizierbaren·Zubereitung oder auf ähnliche Weise verabreicht werden. Es ist im allgemeinen bevorzugt, den oralen Weg zu verwenden e"' Die Dosen können variieren, abhängig von dem Alter der Stärke, dem Körpergewicht und anderen Zuständen des menschlichen Patienten«, Tägliche Dosismengen für Erwachsene im Bereich von 2 bis 2000 mg, bevorzugt 2 bis 100 mg, können verwendet werden, die in Form von zwei bis vier unterteilten Dpsiseinheiten verabreicht werden können. Je nach Bedarf können auch höhere Dosismengen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen weiterhin nützliche, den Pilzbefall verhindernde Aktivitäten«, Beispielsweise'können sie zur Kontrolle von Stämmen von Penicillium sp„, Aspergillus niger, Cladosporium sp., Cochliobolus miyabeorus und Helminthosporium eynodnotis verwendet werden. Für diese Verwendungen werden sie mit geeigneten Formulierüngsmitteln, Pulvern, Emulgiermitteln oder Lösungsmitteln, wie wäßrigem Äthanol, vermischt und auf die zu schützenden Pflanzen versprüht oder die Pflanzen v/erden mit ihnen bestäubt. .
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, das dadurch gekennzeich net ist, daß man Mikroorganismen, die zum Genus Aspergillus gehören, kultiviert und dann die erfindüngsgemäßen Verbindungen aus diesen KuItürbrühen wiedergewinnt. Aufgrund taxonomischer Untersuchungen wurde dieser Aspergillus isoliert und als noch nicht beschriebener Mikroorganismus identifiziert. Er wurde in der Hinterlegungsstelle von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. als MF-4833 bezeichnet und eine Kultur von ihm wurde, permanent bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 20541 hinterlegt. Eine andere Probe eines ähnlichen Organismus,. die als MF -4845 in der Merck-Hinterlegungsstelle bezeichnet wurde, wurde auf ähnliche Weise hinterlegt und erhielt die
Hinterlegungsnummer ATCC 20542. Der letztere Organismus ist der Organismus, der eine bessere Ausbeute ergibt. Obgleich ihre Verwendung im Zusammenhang mit dein erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben wurde, sind andere Organismen des Genus Aspergillus
inschließlieh der Mutanten der obigen ebenfalls fähig, die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen zu liefern^ und ihre Verwendung ist bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich.
Die morphologischen Eigenschaften der Mikroorganismen MF-4833 und MF-4845 sind solche vom Genus Aspergillus. Unter Verwendung der in dem'Standardwerk "Manual of the Aspergilli", Charles Thorn und Kenneth B. Rasper, publiziert von Williams und Wilkins Company, Baltimore, Md. 1945$ aufgeführten Kriterien und im Vergleich mit bekannten Spezies wurde bestimmt, daß beide Stämme Aspergillus terreus sind. Hervorzuhebende Eigenschaften von Deiden Kulturen von Aspergillus terreus sind wie folgt:
Die konidialen Endstücke sind kompakt, säulenförmig und gelbbraun, bei Älterwerden der Kultur sich zu braun vertiefend. Die Konidienträger sind glatt und farblos. Die Bläschen sind halbkugelig und zur Hälfte bis zwei Drittel durch Sterigmen bedeckt. Die Ste3:igmen liegen in 2 Reihen vor. Die Konidien sind kugelförmig bis leicht elliptisch und glatt.
Die Kultur dieser Organismen für die Herstellung der neuen Verbindungen erfolgt'in wäßrigen Medien, .wie solchen, wie sie für die Herstellung anderer Fermentationsprodukte verwendet werden. Solche Medien enthalten Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, die von den Mikroorganismen assimilierbar sind. ·
Im allgemeinen können Kohlehydratef wie. Zucker, beispielsweise lucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit und ähnliche, und Stärken, wie Getreide, beispielsv/eise Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und ähnliche, entweder'allein oder als Gemisch als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden„ Die genaue' Menge der. Kohlenhydratquelle oder den -quellen, die in dem Medium verwendet wird, hängt von den anderen Bestandteilen des Mediums ab. Im allgemeinen variier die Menge an Kohlehydrat zwischen etwa 1 und 6 Gew.~% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solche Kohlenstoffquellen können in dem Medium verinigt werden. Im allgemeinen können viele proteinhaltige Mate-
rialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren ver wendet werden« Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Hefehydrolj^sate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellwasser, Schlempen oder Tomatenpasten usw« Die Quellen für Stickstoff werden entweder alleine oder als Gemisch in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis Gew.-%, bezogen auf das wäßrige.Medium, verwendet.
Unter den anorganischen Nährsalzen, die in das Kulturmedium eingearbeitet v/erden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium«, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Car» bonat- und ähnliche Ionen ergeben, zu verstehen» Ebenfalls verwendet werden können Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan., Eisen und Magnesium.
Die in den Beispielen beschriebenen Medien dienen nur der Erläuterung einer großen Vielzahl von Medien, die verwendet werden können, und stellen keine Beschränkung dar. Insbesondere sind Kohlenstoffquellen, die in dem Kulturmedium zur Herstellung der neuen 'erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, Dextrose, Dextrin, Hafermehl, Haferschrot, Melassen, Citrat, Sojabohnenöl, Glycerin, Malzextrakt, Dorschieberöl, Stärke, Ätna nol, Feigen, Natriumascorbat und Schweineöle Beispiele für Stickstoffquellen sind peptonisierte Milch, autolysierte Hefe, Hefe-RNA, Tomatenpaste, Casein, primäre Hefe, Erdnußmehl, Schiern pen, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, · Maismehl, NZ-Amin, Fleisch extrakt, Asparagin, Baumwollsamenniehl und Ammoniumsulfate Die wesentlichsten ionischen Komponenten sind CaCO,, KHpPO/, MgSOr.7H2O und NaCl und geringe Mengen von CaCl2.6H2O und Spuren von Fe, Mn, Mo, B und Cu sind ebenfalls vorhanden.
Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 370C Für optimale Ergebnisse wird es jedoch bevorzugt, die Fermentierung bei Temperaturen von etwa 22 bis 300C durchzuführen. Der pH-Wert der Nährmedien, die zum Züchten von Aspergilluskultüren und für die Herstellung der neuen Verbindungen geeignet sind, kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.
-s-
Obgleich die neuen Verbindungen sowohl durch die Oberflächenais auch durch eine eingetauchte Kultur erhältlich sind, ist es bevorzugt, die'Fermentierung im eingetauchten Zustand durchzuführen. Eine Fermentierung in geringem Maßstab wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit Aspergilluskultur inokuliert und nach der Übertragung in ein Produktionsmedium die Fermentierung bei konstanter Temperatur von etwa .280C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen läßt.
Die Fermentierung wird in einem sterilisierten Kolben aus Me-. dium über eine oder.mehrere Stufen der Keimentwicklung durchgeführt. Das Nährmedium für die Keimstufe kann irgendeine geeignete Kombination aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Keim- bzw. Impfkolben wird bei etwa 28°C in einer Kammer mit konstanter Temperatur während 2 Tagen geschüttelt oder bis das Wachstum zufriedenstellend ist. Ein Teil des Wachstums wird zur Inokulierung entweder der zweiten Impfstufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impf- bzw. Keimkolben für Zwischenstufen werden, wenn sie verwendet werden, auf ähnliche Weise entwickelt, deh. ein Teil des Inhalts des Kolbens von der letzten Impfstufe wird zur Inokulierung des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden bei konstanter Temperatur während mehrerer Tage geschüttelt und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Inhalt der. Kolben zentrifugiert oder filtriert.
Für das Arbeiten in großem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentierung in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung lind einerEinrichtung für die Belüftung des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Entsprechend diesem Verfahren wird das Nährmedium in dem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei einer Temperatur bis zu etwa 1200C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfmaterial der produzierenden Kultur inokuliert und die Fermentation kann während'einer Zeit von beispielsweise 3 bis Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums durchge-
führt werden«, Die Temperatur wird bei etwa 280C gehalten. Dieses Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen ist besonders Or die Herstellung großer Mengen geeignet.
Die Verbindungen v/erden zweckdienlich, aus der Fermentationsbrühe als Lactone 1 und Il isoliert» Alternativ können sie als Salze der Verbindungen III und IV isoliert werdenβ
Die Verbindungen I und II können mit Basen, wie KaOH, unter Bildung der Salze, wie der Natriumsalze der Verbindungen III und Vy hydrolysiert werden,, Die Verwendung von Basen mit anderen, pharmazeutisch annehmbaren Kationen ergibt Salze dieser Kationen, Eine sorgfältige Ansäuerung der Salze ergibt die Hydroxy« säuren III und IV. Die Hydroxysäuren III und IV können in die Verbindungen I und II bei saurem pH überführt werden«, Die Behänd· lung der Verbindungen I und II bei saurer oder basischer Katalyse mit Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol oder mit Phenyl, Diinethylamino oder Acetylaminoalkanolen ergibt die entsprechenden Ester der Verbindungen III. und.IV, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind.
Die Verbindungen III und IV und insbesondere III können zweckdienlich ohne das Erfordernis der Chromatographie in Form der Ammoniumsalze isoliert werden. Diese Isolierung ist zweckdienlich und ist für die technische Verwendung besser geeignet als die Chromatographie«. Salze von III und IV sind aktiver als die Verbindungen I und II in vitro bei. der Inhibierung der Cholesterinbiosynthese und als Mittel, die den Pilzbefall verhindern. Die Hydroxysäuren und ihre Salze scheinen die aktiven Formen zu sein. Diese Salze sind daher eine der besonders bevorzugten Dosisformen. Bevorzugte Salze zusätzlich zu Ammonium sind Tetramethylamnionium und die Salze von Äthylendiamin, Natrium, Kalium, Calcium, N-Methylglucamin, Lysin, Arginin und Ornithin.
Die physikochemischen Eigenschaften der Verbindung I,(MSD-803) werden im folgenden zusammengefaßt:
-ίο-
1. ' Schmelz2i2Ski 170 bis 171°C
2. MsiglSlÜiäEäiiiiShi · (Massenspektrum) 404
£PJ3£®i ^24^36^5
(gefunden durch
Massenspektrome-
trie . 404,2555
gemessen) 404,2563
(in Acetonitril): Maxijma.
230,5 nm mit.E# 505,7 •237,5 nm mit E% 576,6 246 nm mit E% 395,2
5« . . fi NMR chemische Schiebungen: Das Spektrum wurde.in CDCl^-Lösung (20,1 mg in 0,35 ml) bestimmt. Die chemischen Verschiebungen sind relativ zu dem inneren Tetramethylsilan bei null ppm aufgeführt. Bei den Versuchsbedingungen scheint das Losungsmittel(CDCl^)signal bei 70,0 ppm zentriert zu sein. In Übereinstimmung mit den Massenspektrumwerten werden 24 Kohlenstoffatome beobachtet. Die chemischen Verschiebungen sind: 11,5, 13,6, 16,0, 22,6, 24,1, 26,6, 27,2, 30,5, 32,5, 32,8, 35,9, 36,4y 37,1, 38,4, 41,3, 62,4, 67,8, 76,4, 128,4, 129,7, 131,7-, 133,2, .170,8 und 177,2 ppm.
6. ^H-NMR-Spektrum
Dieses Spektrum wird in 'CDCl^-Lösung aufgezeichnet un.d die chemischen Verschiebungen sind in der Figur 1 in ppm, bezogen auf das innere Tetramethylsilan bei null ppm, aufgeführt.
Das Infrarotspektrum wird in einer KBr-Tablettenpräparation der Probe bestimmt. Es ist in Figur 2 dargestellt.
Die spezifische optische Drehung [«]£· = 320,7" wurde in einer Lösung von 5«.30 mg/ml CH-,CN bestimmt. Dieser Wert wird 'erhalten,· indem man bei der Natrium-D-Linie' : die Wellenlänge bestimmt.
Aufgrund dieser und anderer Werte nimmt man an, daß die Struktur des Produkts mit bemerkenswerter Sicherheit die stereochemische Struktur:
aufweist.
Die entsprechende'Hydroxysäureverbindung III besitzt die Struktur:
CH.
Die absolute Konfiguration der AssymetrieZentren dieser Moleküle wurde aus den Röntgenbeugungsspektren bestimmt.
- tQ -
Die physikochemischen Eigenschaften der Verbindung II (MSD-883) sind wie folgt zusammengefaßt ι
1. 2. | Schmelzpunkt | 129 bis 131 C 406 |
3. · | Formel | C24H38°5 406,2706 406,2719 |
4. | (gefunden durch Mas- senspektrometrie gemessen) |
Dieses Spektrum wird in CDCl^-Lösung aufgezeichnet und die chemischen Verschiebungen sind in der Figur 3 in ppm, bezogen auf das innere Tetramethylsilan bei null ppm, aufgeführt.
5. IR-Spektrum
Das Infrarotspektrum wird in einer KBr-Tablettenpräparation der "Probe bestimmt. Es ist in Figur 4 dargestellt.
6. Optische Drehung,
-Die spezifische optische Drehung C«]^ = 148,6° wurde in einer Lösung von 5,23 mg/ml CILCN bestimmt. Dieser Wert wird erhalten, indem man bei der Natrium-D-Linie die Wellenlänge bestimmt,,
7. 1^C NMR Chemische Verschiebungen in CDCl.,
11,8, 14,9, 16,5, 21,1, 23,1, 26,7(2C), 30,9, 31,3,
33.0, 35,7, 35,9, 37,4, 38,5, 38,6, 41,9(2C), 62,3,
70.1, 76,5, 131,0, 132,6, 171,2-, 176,7.
Aufgrund dieser und anderer Werte nimmt man an, daß die Struktur dieses Produkts mit beachtlicher Sicherheit die chemische Struktur:
«| 4
Die entsprechende Hydroxysäurej Verb5.ndung IVy besitzt die Struktur ϊ
Die folgenden Beispiele erläutern die. Erfindung,
Verbindungen I und III
Fermentierung
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur MF-4833 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem 250-ml-Erlenmeyer--Impfkolben ohne Ablenkbleche, der etwa 20 ml Medium A enthält, suspendiert. Das Medium A besitzt die folgende Zusammensetzung:
Medium A . | Ίο | g | je 500 ml Medium B ent- | • | die folgende Zusammen- |
Maisquellwasser | 80 | ß . ' | ml pro Kolben Wachstum aus dem Impf- | 20 | |
Tomatenpaste ' · | ' 20 | ε | kolben inokuliert. Das Medium B besitzt | 10 | |
Hafermehl | 20 | ε . | setzung; | 20 | S |
Glucose | 20 | ml, ' " | Medium B | 5 | ε |
Spurenelementgemisch Nr. 2 | .1000 | Tomatenpaste | 1000 | έ | |
destilliertes Wasser | primäre Hefe | mg | |||
pH 6,8 mit NaOH | mg | CPC-Stärke | Diese beiden inokulierten Kolben werden | ml | |
Spurenelementgemisch Nr. 2 | 1000 | mg | CoCl2.6H2O | inkubiert 0 Ein Kolben wird | |
FeSO4.7H2O. j | ,. 1000 | mg ". ' | destilliertes Wasser | während 9.6 h bei 28°C . | |
MnSO4.4H2Of ' | 25 | mg | pH 7,2 bis 7,4 mit NaOH | ohne Bewegung inkubiert, der andere | |
CuCl2.2H2O\ | 100 | mg .£ | |||
CaCl2.2H2Oi | 56 | mg | |||
H3BO3 | 19 | mg | |||
(NH4)5Mo7024.4H20 | 200 | ml | |||
ZnSO4.7H2O | destilliertes entionisiertes WasseriOOO | L während 48 h bei 28°C auf einem | |||
Der inokulierte Kolben wire | Hublänge) geschüttelt. Zwei 2-1-Er- | ||||
220-Upm-Schüttler.(5,08 cm | lehmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche, die ; | ||||
halten, v/erden dann mit 10 | |||||
Kolben wird mit einer ISO-Upm-Schüttelvorrichtung.(5,08 cm Hublänge) inkubiert. Nach 96 h wird der Inhalt jedes Kolbens für die Isolierung'des Produktes zur Seite gestellt.
Isolierung der Verbindung; I.
Die gesamte Brühe wird während 20 bis 30 rain zentrifugiert» Die Feststoffe werden für die Extraktion aufgehoben„ Die überstehende Flüssigkeit (pH 6 bis 8) wird in eine 950-nil-Flasche gegeben und 150 ml ΧΑΌ-2-Harz werden zugegeben. Unter Verwendung einer automatischen Extraktionsvorrichtung wird mit einem vorgegebenen Schema gearbeitet, das Gemisch wird 2 h gerührt. Die verbrauchte Brühe wird dann-mit'einem Siphon entnommen und verworfen. Das Harz wird zweimal mit 200 ml entionisiertem Wasser;ge~ waschen und die Waschlösungen werden verworfen« Man gibt dann 300 ml Lösungsmittelgemischj Isopropanol/Äthylacetat/Dichlormethan-25/45/30 hinzu. Das Gemisch wird 2-,h gerührt. Die Lösungsmittel-Harz-Auf schlämmung wird auf einem Büchner-Trichter oder einem Trichter aus gesintertem Glas filtriert und das Harz wird verworfen. Die Feststoffe der Brühe werden mit 100 ml Aceton während 1/2 h verrührt. Das Gemisch wird dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert. Die vereinigten Filtrate und Dekantate. werden auf 15 ml konzentriert. -
Prüfung der Verbindung I
Die Filtrate werden als Inhibitoren auf das HMG-CoA-Reduktaseenzym gemäß dem Verfahren von Beg, Stonik und Brewer (1977 "FEBS Letters", 80s 123 bis 129) geprüft,- wobei Enzyme verwendet werdens_ die so hergestellt werden, wie es Von Kleinsek, Rangatham und Porter (1977 "Proc. Nat. Acad. Sei.", £4, 1431 bis 1435) beschrieben wird. Der positive Test (über 90^ Inhibierung bei 20 Mikrogramm pro ml - ein ICc0'von 2,3 Mikrogramm pro ml) zeigt die Anwesenheit eines sehr potenten Inhibitors für die Sterinsynthese, der bei dem HMG-CoA-Reduktasegehalt wirkt.
22 10 3* . -46-
Beispiel 2 · '
Herstellung der Verbindungen I und III
A. " Fermentiert!!^
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Aspergillus sp. MF-4833 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (Impfkolben Nr. 1) ohne Ablenkbleche, der 40 m. Medium C enthält, suspendiert. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung:
ί ·
Medium C i
Maisquellwässer . 5g
Tomatenpaste 40 g; ' . ;.
Hafermehl 10 g
Glucose . 10 g
Spurenelementgemisch Nr. 2 " 10 g . .
destilliertes V/asser 1000 ml'
pH 6,8 mit NaOH
Der inokulierte Kolben wird während 24 h bei 28°C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) während 24 h inkubiert. 8 weitere 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (Nr. 2 Impfkolben) ohne Ablenkbleche, die je 40 ml Medium C enthalten, werden dann mit 2 ml Kolbenwachstum aus dem Impfkolben Nr. 1 inokuliert. Diese 8 Nr.2-Kolben werden während 24 h bei 28°C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) inkubiert. 20 2-1 Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche, die .500 ml Medium B enthalten, werden mit 14 ml pro Kolben kombiniertem Wachstum der 8 Nr.2-Impfkolben inokuliert. Diese 20 Kolben werden bei 28°C ohne Bewegung während 11 Tagen inkubiert. Nach 11 Tagen Inkubation wird der Inhalt dieser 20 Kolben vereinigt.
B. Extraktion '·
10,2 1 Gesamtbrühe, pH 6,0, werden in einer Waring-Mischvorrich-
-IT
tlang. vermischt, tun die schweren Mycelbäusche aufzubrechen. Dann wird zentrifugiert und die klare überstehende Lösung abdekantiert«, Nach der Filtration werden 10 1 FiItrat mit 3 1 Äthylacetat extrahiert. Man erhält 1820 ml klaren Extrakt. Eine zweite Extraktion mit 3 1 Äthylacetat ergibt 3350 ml klaren Extrakte Die Brühenfeststoffe -werden durch Rühren während .1 h mit 2 1 Methanol extrahiert und, dann wird filtriert. Man erhält 2100 ml FiItrat.
Aliquote dieser Extrakte werden getrocknet und für den Assay gemäß dem Verfahren von Beispiel 1(C) zur Seite gestellt. Man erhält die folgenden Ergebnissei ·
C." | . Extrakt | Gesamte Aktivitätseinheiten | |
Volumen | (ml) Gesamtfeststoffe (mg) | : 1496695 | |
1820 | 1133 | 314900 : | |
3350 | 787 | 1144067 | |
2100 | 1315 | ||
Gelfiltration | |||
Die gesamten Feststoffe, die man bei den ersten beiden Extrakten von Beispiel 2(B) erhält, werden vereinigt, in Methanol gelöst und zur Entfernung unlöslicher Feststoffe filtriert. 30 ml FiI-trat werden auf eine Gelfiltrationssäule (2,5 cm χ 200 cm, 980 ml), die mit Sephadex LH-20 gepackt ist, gegeben und die Probe wird entsprechend der Molekulargewichtsgröße unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel fraktioniert. Unter Verwendung des Brechungsindex und von UV-Aufzeichnungen als Leitmöglichkeiten werden die besten Fraktionen durch Bioassay identifiziert
Gesamtfeststoffe (mg)
Gesamte Aktivitätseinheiten
Fraktion | 1 | 89 |
Fraktion | 2 | 278 |
Fraktion | 3 | - '· 779 |
106271 1099680
210357
D. Trennung und Reinigung
Eine Probe aus der obigen Fraktion 2 wird durch eine 1~g-Schicht aus Waters Bondapak C18/Porasil B filtriert und mit dem 5-fachen Volumen an Methanol eluiert. Das Methanoleluat wird auf 0.5 ml konzentriert« Diese Probe wird chromatographiert, wobei mehrere Versuche durchgeführt werden,, auf einer Waters uC18~Säule (3S9 mm χ 30 cm) mit Methanol 10,05 M Ammoniumphosphat, pH 2,9 (75:25) als .Entwicklungslösungsmittel. Die Fraktionen werden auf einem Beckman-Spektrophotometer geprüft und solche, die ein Absorptionsmaximum bei 236 nm mit Schultern bei 229 nm und 245 nm zeigen, werden vereinigt und bei verringertem Druck zu einer wäßrigen Lösung konzentriert. Der pH-Wert des Konzentrats wird auf 6,5 mit 2 M Kaliumhydroxid eingestellt und die aktiven Komponenten werden mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird getrocknet, zur Trockene konzentriert und der Rückstand wird in 0,3 ml Methanol gelöst. Die Methanollösung wird, wie oben beschrieben, chromatographiert und recyclisiert«, Schnitte, die früher abfließende Komponenten enthalten, werden vereinigt, zu einer wäßrigen Lösung konzentriert und mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformrückstand wird in Methanol aufgenommen und das Lösungsmittel wird unter Stickstoff entfernt. Man erhält 3,5 mg getrocknetes Produkt, welches als Hydroxysäure (Verbindung III) identifiziert wird. Schnitte, die die zweite Komponente enthalten, werden vereinigt und mit Chloroform, wie oben beschrieben, extrahiert. Man erhält 0,87 mg getrocknetes Produkt, das als Lacton (Verbindung I) identifiziert wird. '
Bestes Fermentierungsverfahren von MF-4833 unter Bildung der Verbindungen I und III
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Aspergillus sp. MF-4833 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben (Impfkolben) ohne Ablenkbleche, der 40 ml Me-
2 O 1 R ^ 9 /f α -
dium C enthält, suspendiert. Der inokulierte Kolben wird während 48 h bei 23°C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) inkubiert. 2 250-ml-Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche j, die je 40 ml Medium D enthalten, werden dann jeweils mit 2 ml pro Kolben des Wachstums aus dem Impf kolben inokulierte Das Medium D besitzt die folgende Zusammensetzungσ
Medium D
Lactose 20 g
Schlempen 15 g ^
autplysierte Hefe . 5g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7s0 mit NaOH
Diese beiden inokulierten Kolben werden 96 h bei 280C auf einer 150-Upm-Schüttelvorrichtung (5f08 cm Hublänge) inkubiert. Nach 96 h Inkubation wird der Inhalt dieser Kolben gemäß dem Verfahren von Beispiel 2(B) extrahiert. Die Gesamtproduktion in diesen Kolben beträgt 1450 bis 2000 Einheiten/ml.
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Aspergillus MF-4845 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem 250-ml~Er~ lenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche (Impfkolben Nr. 1), der 40 ml Medium C enthält, suspendiert. Der inokulierte Kolben wird während 24 bis 48.h bei 280C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) inkubiert. Ein Teil (ca. 0,5 ml) dieses Kolbens wird dann zur Inokulierung eines Rohrs mit Schrägkultur, das das Medium E enthält, verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:
Medium E . ' .
Hefeextrakt . 4g
MaIζextrakt' . 10 g ' '
Dextrose "4g
Agar . 20 g
destilliertes Wasser ' · 1000 ml. pH 7,0 mit NaOH ·
Das inokulierte Schrägkulturrohr wird während 11 Tagen bei Zimmertemperatur inkubiert. Es wird dann bei ~60°C während 3 bis Monaten gelagert. Ein Teil dieses- Inhalts dieses schrägen Rohrs wird dann in einem 250-ml~Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche (Impfkolben Njr. 2), der 40 ml Medium C enthält, suspendiert. Der inokuliert« Kolben wird während 24 h' bei 280C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) inkubiert. 6 250-ml-Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche (Impfkolben Nr. 3), die 40 ml Medium C enthalten, werden dann mit 2 ml pro Kolben des Wachstums von dem Impfkolben Nr. 2 inokuliert. Diese 6 inokulierten Kolben werden während 48 h bei 28°C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) inkubiert. :6 2-1-Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche, die je 500 ml Medium F enthalten, werden dann mit dem Inhalt des Impfkolbens Nr. 3 inokuliert. Das Medium F besitzt die folgende Zusammensetzung;
Medium F · -
MaisQuellwasser 15 g
CPC-Stärke ' 20 g
Maismehl .1 6
Sojabohnenmehl · . 4g
Glucose 5g
Sooabohnenöl · 2,5 g
(NH4)2S04 4g
KH2PO4 ' . 0,3 g
CaCo3 6g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH 6,7 mit NaOH
22 ι bau- . -ai- .
Die inokulierten Kolben werden während 11 Tagen ohne Bewegung bei 28°C inkubiert. Nach 11 Tagen wird die Brühe für die Extraktion gemäß dem Verfahren von Beispiel 2(B) verwendet. Die Gesamtproduktion in diesen Kolben beträgt 1231 Einheiten/ml.
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Aspergillus MF-4845 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche (Impfkolben), der 40 ml Medium C enthält·, suspendiert«, Der inokulierte Kolben wird während 30 h bei 28°C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichturig (5,08 cm Hubiänge) inkubiert. Ein 250-ml-Erlenmeyerkplben ohne Ablenkbleche, der 40 ml Medium G enthält, wird mit 2 ml pro Kolben des Wachstums aus dem Impfkolben inokuliert. Das Medium G hat die folgende Zusammensetzung;
Medium G
Dextrose 45 g
peptonisierte Milch 24 g
autolysierte Hefe 2,5 g
Polyglycol P2000 ' 2,5 ml
destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,0 mit NaOH
Dieser inokulierte Kolben wird während 120 h bei 280C auf einer 220-Upm-Schüttelvorrichtung (5?08 cm Hublänge) inkubiert. Nach 120 h Inkubation wird der Kolbeninhalt gemäß dem Verfahren von Beispiel 2(B) extrahiert. Die Gesamtproduktion in diesem Kolben beträgt 21500 Einheiten/ml..
A. Fermentierung in großem Maßstab mit _^lF~48_3^_unter Bildung der Verbindungen I_und_III
~ «.ei ~
Das bei jeder Fermentierungsstufe verwendete Medium enthält: | 5 | 1 | g | Ablenkbleche gibt man | während 24 h bei 28°C auf | 22p Upm. Neue Kolben wer- | • |
Maisquellwasser | 40 | i | g | 40 ml Medium und den Inhalt von einem Rohr lyophilisierter Orga | bei | Inhalts des ersten KoI- | |
Tomatenpaste | 10 | 25 | g | nismen MF-4833. Man schüttelt dann | des | C geschüttelt. In einen | |
Weizenmehl | 10 | 100 | g | einer Rotationsschüttelvorrichtung | bens beschickt und weitere 24 h bei 28° | 0 ml des Gemisches der | |
Glucose | 10 | 56 | ml | den dann mit 40 ml Medium und 1 ml | 2-1-Kolben gibt man 400 ml Medium und 1 | zweiten Fermentationsstufe und schüttelt weitere 24 h bei 280C. | |
Spurenelementlösung | 1000 | 19 | ml | In einen rostfreien 757-1-Fermentationskübel gibt man 501 1 | |||
destilliertes Wasser | 6,8 | 200 | eingestellt. | eines Mediums, das enthält: | |||
Der pH ist mit Natriumhydroxid auf | 1 | ||||||
Die Spurenelementlösung enthält: | g · i | ||||||
FeSO4.7H2O | g .' '·,. | ||||||
MnSO4.4H2O | mg | ||||||
CuCl2.2H2O | mg | ||||||
CaCl2 | mg :· | ||||||
HxBO7, | mg | ||||||
(NH4)6Mo7024.4H2O | mg | ||||||
ZnSO4.7H2O | 1 | ||||||
v. destilliertes Wasser | Vor der Inokulation mit einem Mikroorganismus werden alle Medien | ||||||
auf ihre Sterilität geprüft. | |||||||
In einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben ohne | |||||||
and dessen pH-Wert auf I9O eingestellt wird. Man sterilisiert 15 min bei 1210C0 1 1 der dritten Stufe oben wird dann zugegeben land das Gemisch wird'bei 130 Upm bei 280C während 96 h mit einem Luftstrom von 10 cfm inkubiert.
Lactose | 2 Gew. |
Schlempen | 1,5 |
autolysierte Hefe | 0,5 |
Polyglycol P2000 | 0,25 |
Isolierung der Verbindung I
' »I I|JI J. fcl.H Um I — « I Il II— H-JII I ΙιΙΜΓΙΜΓΤ >U J I^MHl» J'WiHM—<! I Wl li |l IM —fcl W JBlIIII ^ m M | I Il | | |]
Etwa 17 kg (3/4-Sack) eines Silicium enthaltenden Filterhilfs~ mittels werden zu 416 1 Gesamtbrühe aus der oben beschriebenen ffiP-4833-Kultur zugegeben. Das Gemisch wird durch eine 45,1-cm~ Filterpresse filtriert. Das geklärte Filtrat (pH 6,6) wird auf einen pH von 4,0 durch sorgfältige Zugabe von 450 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Es wird dann unter Schütteln mit etwa 1/3 Volumen (136 1 - 36 gal.) Äthylacetat extrahiert. Nach der Trennung wird die obere Lösungsmittelschicht entfernt und die Wasserphase erneut mit Äthylacetat (38 gal 144 1) auf ähnliche Weise extrahiert. Nach der Trennung werden die beiden Extrakte vereinigt und unter Rühren mit.etwa 45*4 1 (12 gal.) Wasser zurückgewaschen. Nach der Trennung wird die Äthylacetatlösung uJiter Vakuum bei einer Temperatur unter 3O0C konzentriert, zuerst in einem Rührkessel und schließlich in einem Rotationsvakuumverdampfer bis zu einem Restvolumen von etwas weniger als 3,79 1 (1 gal.).
Etwa 1 gal. (3800 ml) Äthylacetatkonzentrat aus der vorhergehenden Extraktion wird weiter in einer Rotationsverdampfungsvorrichtung (ca. 10 mm, 40°C-Bad) zu einem Sirup konzentriert und dann zweimal mehr nach Zugabe von etwa 1 1 Methylenchlorid in zwei Portionen, um den Sirup von polarem Lösungsmittel zu befreien, konzentriert. Das Endöl von etwa 300 ml, welches etwa
250 g Feststoffe als Trockengewicht enthält, wird -auf etwa 750 ml mit Äthylacetat/Methylenchlorid (30/70;· Volumen/Volumen) eingestellt und 200 g Silicagel werden zugegeben. Unter Bildung einer Aufschlämmung wird vermischt«, Diese Schicht wird auf eine 14 cm χ 36 cm-Schicht aus 2,5 kg Silicagel in einem Volumen von etwa 7,5 1 gegeben, wobei die Schicht als Aufschlämmung aus dem gleichen Lösungsmittelgemisch erhalten worden ist. Die Entwicklung mit dem gleichen Lösungsmittel wird weitergeführt, bis 3 1 Abstrom als Vorlauf entnommen worden sind. \
Man beginnt mit der Entwicklung mit Äthylacetat/Methylenchlorid (5O/5O; Volumen/Volumen) und nimmt 800 ml abfließende Fraktionen 12 Fraktionen werden entnommen und dann beginnt eine 100%ige Äthylacetateluierung. Nach 7 weiteren Fraktionen wird die 100?oig< Äcetoneluierung begonnen. Die Fraktionen 4 bis 24 werden auf ihre Bioaktivität in dem im Beispiel 1 beschriebenen HMG-CoA-Reduktaseinhibierungsassay geprüft. Die wesentliche Aktivität wird in den Fraktionen 7 bis 11 festgestellt. Die Peakaktivität wird in der Fraktion 8 festgestellt. Man konzentriert zu einem Öl für lie weitere Reinigung. Das Trockengewicht durch Feststoffbestimmung . beträgt 9,0 g.
Die Fraktion 8 aus der. Silicagelsäule wird mit 50 ml Methylenhlorid verrieben und filtriert. Der getrocknete Filterkuchen wiegt 4,9 g. Das Filtrat wird in einer 1 m langen Säule (Durchmesser: 5,08 cm), die mit Sephadex LH-20-Dextrangel (Pharmacia) gefüllt ist, mit Methylenchlorid angequollen und equilibriert ist, gegeben. Die Säule wird mit Methylenchlorid bei einer Rate von 15 ml/min elüiert. Die Verbindung I eluiert zwischen den 0,64- und 0,81-Säulenvolumen. Das Lösungsmittel wird aus diesem Peak entfernt, wobei ein etwas brauner Rückstand zurückbleibt, der etwa 0,290 g wiegt. Dieser Rückstand (213 mg) wird in 1,5 ml
(65-35) aufgenommen, auf eine vorgepackte und equi-Librierte Silicagelsäule (EM LOBAR Größe B) gegeben und mit
(65-35) bei 5 ml/min eluiert. Nach der Verdampfung
i 832
des Lösungsmittels aus dem Peakf der zwischen 235 *und 360 ml Eluierungsmittel eluiert wird, verbleiben 121 mg kristallines Produkt, Fp 155 bis 16O°C. Die HPLC dieses Materials auf einer EM-RP-IB-Umkehrphasenanalysensäule (E. Merck HIBAR II, Cat.'Nr. 906046) unter Verwendung von 0?05M Natriumphosphat, pH 3f0 Acetonitril (45-55) als Eluierungsmittel bei 2 ml/min zeigt einen charakteristischen UV~Absorptionspeak bei 11 min.
22 mg dieses Materials werden aus 0,6 ml absolutem Äthanol und erneut aus 0,4 ml des gleichen Lösungsmittels umkristallisiert, man erhält man dem Trocknen über. Nacht in einem Exsikkator über
pO,- 40 mg weißer federartiger Kristalle. Die analytische HPLC auf dem oben beschriebenen System ergibt einen einzigen scharfen Peak bei einer Eluierungszeit von 11 min. Nach weiteren Umkristallisationen erhält man einen Schmelzpunkt·von 170 bis 1710C.
Das Produkt wird durch Spektren usw. als Verbindung I identifiziert. Dieses Material ergibt bei dem in-vitro-HMG-CoÄ-Reduktasetest von Beispiel 1 ein 1C1-Q von 0,01 Mikrogramm pro ml.
des
der verbindung III
Die Brühe von der Fermentation von Beispiel 2OA (379 1-100 gal) wird mit H75PO. zu einem pH von 5 angesäuert. Äthylacetat (265 1 - 70 gal) wird zugegeben und das Gemisch wird heftig gerührt. Es wird dann von dem Mycelrückstand abfiltriert und der Kuchen wird mit einer geringen Menge Äthylacetat gewaschen und das Waschwasser wird mit dem Hauptextrakt vereinigt. Die organische-Fnase wird abgetrennt und mit 18,9 1 (5 gal) 0,2N Natriumhydroxidlösung vermischt. Das Gemisch wird heftig gerührt und kann sich dann absetzen. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und der pH wird von 9 auf 5 durch Zugabe von H^PO^ eingestellt. Man extrahiert dann zuerst mit 7,571 (2 gal) 2:1-Gemisch aus Hexan
und Äthylacetat und dann mit 3*8 1 (1 gal) des gleichen Gemischs Die getrennten organischen Extrakte werden vereinigt und dann über wasserfreiern MgSO^ getrocknet. Das Trocknungsmittel wird dann abfiltriert und der Kuchen wird mit 1 1 der gleichen Hexan/Äthylacetat-Lösung gewaschen. Das Spülwasser wird mit dem Filtrat vereinigt. Diese Filtratlösung wird nach der weiteren Verdünnung mit 2 1 Aceton gerührt, während Ammoniakgas eingeleitet wird. Das Gas wird absorbiert und ein kristalliner Niederschlag tritt auf. Wenn man keine weitere Absorption des Ammoniaks beobachtet und eine Verdunkelung der Färbung im Niederschlag auftritt, wird die Einleitung von Ammoniak beendet und das Gemisch mehrere h stehen gelassen. Danach wird es filtriert. Der rohe Ammoniumsalzfilterkuchen wird mit Aceton gewaschen, bis man ein· farbloses Waschwasser erhält, und dann an der Luft getrocknet. . ,
Das rohe Ammoniumsalz kann umkristallisiert werden, indem man es in 5,7 1 (1,5 gal) eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und konzentriertem wäßrigen Animoniumhydroxid (80:20:2) löst und das gefärbte unlösliche Material abfiltriert. Die Filtratlösung wird dann mit dem gleichen Volumen Aceton/Äther-(1:1)-gemisch verdünnt und über Nacht stehen gelassen. Das kristalline, dunkelgelb gefärbte Ammoniumsalz (96,5 g) wird bei der Filtration erhalten.
Eine weitere Reinigung kann erreicht werden, indem man 70 g des obigen umkristallisierten Materials in 2 1 siedendem Isopropanol/konzentriertem wäßrigen NH^OH (95:5) löst. 10 g Aktivkohle werden zugegeben und die heiße Lösung wird filtriert. Das Filtrat kann auf Zimmertemperatur abkühlen und wird über Nacht bei -200C gelagert. Nach der Filtration wird der Kuchen mit kaltem (-200C) Isopropanol und dann mit kaltem Aceton und dann mit Äther von Zimmertemperatur gewaschen. Das Produkt wird unter Stickstoff getrocknet. Man erhält etwa 60 g weißes kristallines Ammoniumsalz. ' ,
£4. ι ü a d
Zu einer Lösung von 40 mg Produkt von Beispiel 6 in 2 ml Äthanol gibt man 1ml wäßriges NaOH -(1O" Mol; 1 Äquivalent). Nach 1 h bei Zimmertemperatur wird das Gemisch zur Trockene im Vakuum aufgenommen,. Man erhält das Natriumsalz der Verbindung III«
Auf ähnliche Weise wird das Kaliumsalz unter Verwendung von einem Äquivalent Kaliumhydroxid hergestellt.
L-Lysinsalz der Verbindung!II
iiii^i» hi . nrr"^rr— in npirp r mTrriTtft-—~i p ifcraTirrrrgιιιτ-ιπ» n ι ι HIr-i ιι ι ^i ,- .
Eine Lösung von 146 mg L-Lysin in 1,5 ml 65%iger Äthanol wird zu einer Lösung von 440 mg Ammoniumsalζ der Verbindung III-ind 11,5 ml 85?oiger Äthanol gegeben. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird mit 10 ml warmem Äthanol verrieben, abgekühlt und filtriert. Der weiße Feststoff wird getrocknet, um 430 mg L-Lysinsalz der Verbindung III, Fp 178 bis 18O0C (Zersc) zu erhalten.
Analyse: | für | C30H52N2O8 | ϊ C | 63, | 35 | H | 9, | 22 | N | 4 | ,93 |
berechnet | C | €2, | 80 | H | 9f | 13 | N | 4 | ,83 | ||
gefunden; | der | Verbindung | III | ||||||||
L-Argininsalz | |||||||||||
Auf praktisch gleiche Weise, wie im Beispiel 9 beschrieben, wird .eine ,Losung aus 174 mg.L-Argininbase und eine Lösung aus 440 mg Ammoniumsalz der Verbindung ·III vereinigt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird mit warmem
ύ, <£, s O <3 &, — o<ö —
Äthanol verrieben, abgekühlt und filtriert sowie getrocknet«, Man erhält das L-Argininsalz der Verbindung III.
L-.Ornithinsalz der Verbindung_III
Auf praktisch gleiche Weise, wie im Beispiel 9 beschrieben, wird eine Lösung von 132 mg L~ornithinfreier Base und eine Lösung von 440 mg des Ammoniumsalzes der Verbindung III vereinigt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand wird mit warmem Äthanol verrieben, abgekühlt, filtriert und getrocknet. Man erhält :das L-Ornithinsalz der Verbindung III.
Beispiel 12 ...
N-Methvlglucaminsalz der Verbindung III
Auf ähnliche Weise, wie im Beispiel 9 beschrieben, wird eine Lösung von 195 mg N-Methylglucamin in 1,5 ml Wasser und 400 mg der Verbindung III - Ammoniums al ζ in 11,5 ml 85%igen Äthanols vereinigt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert. Man erhält das N-Methylglucaminsalz der Verbindung III.
Äthylendiaminsalz der Verbindung III
18 g der Verbindung I werden in 180 ml warmen Isopropanols gelöst und mit 90 ml 0,5M wäßriger NaOH-Lösung behandelt, 1h gealtert, mit 180 ml Wasser verdünnt, im Vakuum zur Entfernung des Isopropanols eingedampft und in einem Eisbad gekühlt, Langsam werden 90 ml 0,5M HCl zugegeben und das Gemisch wird mit 2 χ 150 ml Äthylacetat extrahiert und mit 100 ml Wasser zurückgewaschen und über MgSOr getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum bei niedriger Temperatur entfernt und der Rückstand wird in
150 ml Äthanol gelöst. 3 ml Äthylendiamin v/erden zugegeben und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand wird mit siedendem Äthylacetat verrieben, abgekühlt, filtriert und aus 30 ml Isopropanol umkriställisier't 'und im Vakuum über P2°5 getrocknet. Msh erhält 13,1 g weiße Kristalle, Fp 152 bis 153,50C
Analyses
berechnet für (^2λ.Η-^yOg)2. (C2H^qN2) !
C.66,35 H 9,35 N 3,0-9 gefunden; [ C 66,08 H 9,49 N 3,01.
Calciumsalz der Ver.bindunglll
87,9 mg Ammoniumsalz der Verbindung III werden in 3 ml H2O unter Rühren und Erwärmen gelöst. 7,4 mg analytische Qualität Ca(OH)2 werden dann zugegeben und das Gemisch wird gerührt und erhitzt, bis kein weiteres Ammoniak mehr verdampft und nur eine geringe Trübung zurückbleibt, die durch Zentrifugeerung entfernt wird. Die farblose,klare überstehende Lösung wird lyophilisiert und Proben des trockenen Materials werden für'die Kristallisation au verschiedenen Lösungsmitteln und Lösungsmittelgemischen entnommen. Das Produkt kristallisiert in Nadeln, wenn eine heiße konzentrierte Lösung in trockenem Isopropanol auf Zimmertemperatur abkühlen kann.
Beis-piel 15 .
Tetramethylammoniumsalz der Verbindung III
34 mg Verbindung I in 1 ml CH2Cl2 werden mit 0,04 ml 24%igem . Tetramethylammoniumhydroxid in Methanol behandelt. Das Produkt wird mit Äther in teilweise.kristalliner Form präzipitiert, zentrifugiert und der Niederschlag wird zuerst mit Äther gewaschen
und dann in Form hexagonaler Platten aus 1 ml Isopropanol durch Zugabe von 5 ml Äther.und etwa 5 ml niedrigsiedendem Petroläther umkristallisiert. Man erhält 27 mg oder 65%.
/H-IJMR-Sp ektr-um der Verbindung III - TetramethylammoniumsalZ (6 mg/O,35 ml bei 25°C in CDCl3 bei 300 MHz) 0,83 t (3H, J = 6,5) 0,84 -d (3H, J = 7) 1,02 d (3H, J =7)
1.05 d (3H, J = 7) '
1,24 m (^1H); 1,30 bis 1,80 br.m. Hülle
1,88 ddd (1H, J = 2, 8, 15) ' 1,98 dd (1H, 3, 15) 2,16 dd (1H, J =8,5, 15,5) 2,23 m (1H, verv/aschen) 2,32 m (1H, verwaschen)
2,37 dd (1H, J = 3, 15,5) :
2,40 m (^ 1H, verv;aschen) .
3,42 s (12H, MeN+) 3,79 m (IH, symmetrisches Multiplett)
4.06 m (1H, symmetrisches Multiplett) 5,32 dt (1H, J a/ 3) 5,50 br.s (1H) 5,79 dd (1H, J = 6,10) 5,98 d (1H, J = 10)
Die chemischen Verschiebungen sind in ppm feldabwärts des inneren TMS angegeben. Die Kupplungskonstanten in Klammern sind in Hz.
Abkürzungen: s = Singlett, d = Doublett, t = Triplett, m = Multiplett.
•«3.
BeisOiel 16 .
Ammoniumsalz der Verbindung III
Auf im wesentlichen gleiche Weise, wie im Beispiel 13 beschrieben, wird die Verbindung I in" die. Hydroxysäure, Verbindung III, überführt, in Äthylacetat extrahiert, über MgSO^ getrocknet, filtriert und mit wasserfreiem Ammoniak unter Rühren und Kühlen behandelt, um das Ammoniumsalz auszufallen.;
Beispiel 17 ' '
Das gemäß Beispiel 7 hergestellte Natriumsalz wird in 2 ml Äthanol/Wasser (1:1) wieder gelöst und zu 10 ml 0,1N Salzsäure zugegeben, woraus die freigesetzte Hydroxysäure mit Äthylacetat extrahiert wird. Das letztere Lösungsmittel wird einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum bei einer Badtemperatur nicht über 300C entfernt. Die erhaltene Hydroxysäure wandelt sich langsam beim Stehen in das Lacton um,
Verbindung III
453 mg des Athylendiaminsalzes der Verbindung III v/erden in 6 ml 80^igen Äthanols gelöst, in einem Eisbad abgekühlt, mit 1 ml 1M HCl behandelt, im Vakuum eingedampft, um das Äthanol zu entfernen, mit 3 ml Wasser behandelt, in 2 χ 5 ml Äthylacetat extrahiert und mit Wasser zurückgewaschen. Alle Lösungen werden'ir einem Eisbad gekühlt. Der Extrakt wird über MgSO^ getrocknet und im Vakuum zur Trockene konzentriert.-Man erhält die Hydroxysäure als farbloses Öl. ' ;
Ein 15C-NMR-Spektrum in CDCl3 (190 mg/ml) zeigt chemische Verschiebungen für die ersten sechs Kohlenstoffatome des Hydroxysäuremolekülteils, wie in der Tabelle angegeben. Beim Stehen wandelt sich diese Hydroxysäure langsam in das Lacton um.
yJ %j & - 30 -
T a b e 1 1 e
-X-NMR-Spektrum, .ppm, feldabwärts von Te'traroethylsilan
Hydroxysäure, Verbindimg III
2 ι ic. 174,8
68,8 72,3 34,9
Das Spektrum des restlichen Moleküls hat sich durch den Ringschluß nur etwas verändert. .
Beispiel 19 ' · ;-
Äthylester der Verbindung III
Eine Suspension von 500 mg (1,24 mMol) der Verbindung I (MSD-803) in 20 ml Äthanol wird bei Zimmertemperatur unter Stickstoff atmosphäre gerührt. Ein kleines Stück Natrium (ca. 1 mg) wird zugegeben. Nach 15 min wird ein zweites kleines Stück Natrium zugegeben. Nach einer gesamten Reaktionszeit von 30 min wird das homogene Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, mit Wasser und mit gesättigter Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSOr). Das Verdampfen des Lösungsmittels ergibt einen wachsartigen Feststoff. Die Analyse durch HPCL auf einer Whatman-Partasil-10-PAC-Säule (4,6 mm χ 25 cm) mit 10% Isopropanol/Hexan das mit 6 ml/min gepumpt wird, zeigt ein "Gemisch aus Äthylester und MSD-803 (77:23) an. Dieses Gemisch wird durch Mediumdruckchromatographie auf Silicagel (230 bis 400 Mesh)" durch Eluierung mit 3% Äthanol/Methylenchlorid getrennt. Die Fraktionen, die den Ester enthalten, werden vereinigt und verdampft. Man erhält 358 mg (66%) fast farblosen Feststoff, Fp 67°C.
I P
Ein Tell dieses Materials wird aus Hexan umkristallisiert. Man erhält farblose Nadeln, Fp 66,5 bis 6895°C.
Analyse:
berechnet für C gefunden;
26H42°6:
C 69?30. H 9,40 C 69,22 H 9,58.
Auf ähnliche V/eise wird durch Verwendung äquivalenter Mengen von Methanol, Propanol, Butanol, Isobutanol, t-Butanol, Amylalkohol, Isoamylalkohol, 2-Dimethylaminoäthanol, Benzylalkohol, Ehenäthanolj 2-Acetamidoäthanol und dergleichen der entsprechende Ester erhalten. .
Fermentierung
Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur MF-4845 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche (Impfkolben), der etwa 10 ml Medium der folgenden Zusammensetzung enthält, suspendiert.
Medium Maisquellwasser Tomatenpaste Weizenmehl Glucose Spurenelementlösung destilliertes Wasser pH 6,8 mit NaOH
Spurenelementlösung
5 g 40 g
10 g 10 g 10 g 1000 ml
FeSO^.7H2O
MnSO
1000 mg 1000 mg
CuCl2 | .2H2O | 4H2O | 25 | mg |
CaCl2 | .2H£0 | 100 | mg | |
HxBOx | entionisiertes Wasser | 56 | mg | |
CNH4) | 6Μο7°24· | 19 | mg | |
ZnSO^ | .7HpO | 200 | mg | |
destilliertes | 1000 | ml | ||
Der inokulierte Kolben' wird während 24 h bei 280C auf einer 220-Upm~Schüttelvorrichtung (5,08 cm Hublänge) inkubiert. Ein 2-1-Erlenmeyer-Kolben ohne Ablenkbleche, der 500 ml Medium enthält, wird dann mit 10 ml des Fermentierungswachstums aus der Impfkultür der ersten Stufe inokuliert. Diese beiden werden 24 h bei 280C geschüttelt.
In einen rostfreien 757-1-Stahlfermentationskübel gibt man . 485 1 eines Mediums, das enthält:
Cerelose | 4,5 Gew. | -%/Vol |
peptonisierte Milch | 2,5 | 11 |
autolysierte Hefe | 0,25 | It |
Polyglycol P2000 | 0,25 | η |
und dessen pHr-Wert auf 7,0 eingestellt ist. Man sterilisiert 15 min bei 121°C. 1 1 der zweiten Stufe oben wird dann einge füllt und das Gemisch wird bei 85 Upm während 12h, dann bei 130 Upm während 84 h bei 28°C mit einem Luftstrom von 5 cfm während 12 h und dann 10 cfm während 84 h inkubiert.
B-. Isolierung >
1. Extraktion
Zwei Ansätze von je 379 1 (100 gal) Gesamtbrühe werden vereinigt unter Rühren auf pH 4,1 durch sorgfältige Zugabe von 800 ml konzentrierter Salzsäure angesäuert und durch Zugabe von 284 1 (75 gal) Äthylacetat weiterem Rühren während 2 h extrahiert.
- 53. -
Etwa 11,3 kg (25 lbs) eines siliciumhaltigen Filterhilfsmittels werden dann zugegeben und die gesamte Aufschlämmung wird durch eine·60,9-cm~Filterpresse gepumpte Weitere 284 1 (75 gal) Äthylacetat werden zum Waschen des Preßkuchens verwendet und dann wird die Extraktion weitergeführt, indem man die Pumprichtung durch die Presse viermal umkehrt. Das gesamte Waschipsungsmit~ tel.wird aus der Presse entnommen und mit dem ersten Filtrat vereinigt«. Das zweiphasige Filtrat kann sich absetzen und die Wasserschicht wird entfernt. Die Äthylacetatschicht wird mit 37,9 1 (10 gal) entionisiertem Wasser gewaschen, die Phasen werden sich abtrennen gelassen und die Athylacetatextrakte .v/erden im Vakuum bis zu einem Rest von etwa 37,9 1 (10 gal) konzentrier
Um irgendeine Verbindung IV in dem Extrakt zu der Verbindung II zu cyclisieren, wird die folgende azeotrope Behandlung durchgeführt. _. :
Athylacetatextrakte von weiteren 3 χ 379 1 (300 gal) Brühe werden zu dem obigen Extrakt zugegeben und das Volumen wird auf etwa 114 1 (30 gal) durch Vakuumdestillation verringert. Etwa. 185 1 (50 gal) Toluol werden zugegeben und der Ansatz wird im Vakuum auf 121 1 (32 gal) konzentriert. Diese Stufe wird wiederholt. Dann wird ausreichend .neues Τοίμοί zugegeben, um das Volumen auf 284 1 (75 gal) einzustellen. Ohne Vakuum wird der Ansatz am Rückfluß erhitzt und 2 h bei dieser Temperatur, die über 1060C liegt, gehalten. . .
Die Lösung wird dann im Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt«, Sie wird weiter in einem großen Rotationsverdampfer unter Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert.
Chromatographie auf Silicagel
Der oben erhaltene Extrakt wird von anderen Lösungsmitteln
durch Zugabe von 7,6 1.(2 gal) Methylenchlorid und erneute Konzentrierung auf ein Öl befreit. .'..'
Der ölige Rückstand wird in etwa 18,9 1 (5 gal) Äthylacetat/Methylenchlor id™(30/70; Volumen/Volumen)-Gemisch gelöst und eine Aufschlämmung wird durch Zugabe von 2,8 kg Silicägel hergestellt
Die Aufschlämmung wird als obere Schicht auf eine 30,48 χ 127 cm (12 in. χ 50 in.)-Silicagelsäule, die mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gepackt wurde, gegeben.
Die Eluierung erfolgt mit Äthylacetat/Methylenchlorid (40/60; Volumen/Volumen) bei 800 ml/min. Ein Vorlauf von 37,9 1 (10 gal) wird gesammelt und dann werden weitere Fraktionen von je 15,1 1 (4 gal) gesammelt.
Die Fraktionen 6 bis 10 einschließlich werden im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert, der in heißem Äthylacetat gelöst, mit Kohle zum Entfärben behandelt, heiß filtriert und gekühlt wird. Kristalle von MSD 803 (Verbindung i) werden abfiltriert and die Mutterlaugen werden zu einem Öl für die weitere Chromatographie konzentriert.
4. ReChromatographie auf Silicagel
Mutterlaugenrückstände von ähnlichen Brühenextraktaufarbeitungen die äquivalent sind einer weiteren 2271-1-Fermentationsproduk-tion, werden mit der obigen Lösung in Methylenchlorid vereinigt. Die Hälfte dieser Lösung wird für die weitere Silicagelchromatographie entnommen. Ein geringer aliquoter Teil zeigt einen Gesamtfeststoffgehalt von 325 g. Die Lösung wird mit 40 g Kohle zum Entfärben behandelt, filtriert und der Kuchen wird mit Methylenchlorid gespült. Die· vereinigten Filtrate und Waschlösungen werden im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Dieser wird erneut in 800 ml Äthylacetat/Methylenchlorid (30/70;
Volumen/Volumen) gelöst und mit 225 g Silicagel aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird auf den oberen Teil einer 14 χ 36 cm-2äule aus Silicagel, die mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gepackt ist, gegeben. Die Entwicklung erfolgt mit Äthylacetat/ Ylethylenchlorid (40/60; VoIumen/Volumen), Ein Vorlauf von 3 1 '/ird zur Seite gestellt und dann werden Fraktionen von je 800 ml gesammelt» ' . ·
5. £32E2S^
ml der Fraktion 12 der obigen Chromatographie werden zu einem öl von 500 mg konzentriert und das Öl wird erneut in 5 ml Acetonitril gelöst. Diese Acetonitrillösung wird auf eine rostfreie Stahlchromatographiesäule mit einem Außendurchmesser von 0,1.6 cm (5/8") und einer Länge von 1,8 m (6 ft) gegeben, die mit einem Packmaterial für eine Chromatographiesäule des präparativen Umehrphasenflüssigkeitstyps gepackt ist, nämlich mit "Bondapak 1.8/Porasil B"(Water Associates Inc., MiIford, Mass. 01757). Die äule wird mit einem Gemisch eluiert, das 55 Vol.-% Acetonitril und 45 Vol.-# 0,05M Ammoniumphosphat, pH 3, enthält. Das Eluierungsvolumen zwischen I36O ml und 1700 ml wird auf der Grundlage der Brechungsindexanalyse vereinigt. Das organische Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und die verbleibende wäßrige Löung wird mit Äthylacetat extrahiert. Nach der Entfernung im Vakuum von Äthylacetat verbleiben 120 mg Titelverbindung, die aus iner konzentrierten. Acetonitrillösung kristallisiert und Kristalle MSD 883 (Verbindung II), Fp. 129 bis 131°C, ergibt.
Beispiel 21 · ·
Andere Isolierung der Verbindungen II und IV
Das rohe-Ammoniumsalz, das, wie-im Beispiel 7 beschrieben, aus
iner 4160-1-Fermentation isoliert wurde, wird lactonisiert, indem man es in Wasser löst, mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3 ansäuert, in Toluol extrahiert
und 2 h am Rückfluß erhitzt, wie im Beispiel 20-B-2 beschrieben. Die Konzentrierung im Vakuum auf ein geringes Volumen ergibt Kristalle aus roher Verbindung I, die mit einer geringen Menge an Verbindung II vermischt sind. Man filtriert die Kristalle ab und trocknet sie.
Das Material aus 12 solchen Ansätzen wird vereinigt und aus 45,5 kg (101 lbs) Äthanol umkristallisiert, filtriert und mit Äthanol gewaschen. Die vereinigten Mutterlaugen und Waschlösungen v/erden im Vakuum auf etwa 11,4 1 (3 gal) konzentriert und eine zweite Charge aus Kristallen der Verbindung I wird abfiltriert. Die Mutterlaugen aus dieser Filtration werden wie folgt aufgearbeitet:
Etwa 0,5 1 dieser Mutterlaugen werden für die Umkehrphasenchromatographie zubereitet, indem man sie in Vakuum zur Entfernung des Äthanols konzentriert, mit Acetonitril spült und Spuren an unlöslichen Materialien abfiltriert. Eine Lösung in 100 ml Acetonitril wird über eine 200-ml-Schicht aus C-18-Umkehrphasenpackung gegeben und die Schicht wird mit einem weiteren 1 Acetonitril gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden konzentriert und in insgesamt 360 ml chromatographischem Lösungsmittel (60% Acetonitril - h0% Wasser, Volumen/Volumen) gelöst und zur Entfernung von Spuren, an unlöslichen Materialien abfiltriert. Der Feststoffgehalt von aliquoten Teilen für die Tests beträgt 1.5,3 g.
Ein Ansatz von 160 ml dieses Beschickungsmaterials wird auf einem Waters-Prep-500-System unter Verwendung von zwei 5 x 30 cm Patronen C-18-Umkehrphasenpackung (Waters Assoc.; gebundener Octadecylüberzug auf Silica) und Äcetonitril/Wasser (60/40; Volumen/Volumen) als Eluierungsmittel bei 130 ml/min bei Umgebungstemperatur chromatographiert, wobei'ein Nachweis mit dem Brechungsindex folgt. Die Verunreinigungen, die mit den ersten 3900 ml Eluierungsmittel eluiert werden, werden verworfen. Ein
großer Peak der Verbindung I wird von 3900 bis 5850 ml Eluierungsmittel erhalten und zur Seite gestellt. Gemischte Fraktionen werden aus 5850 ml bis 6500 ml Eluierungsmittel erhalten. Diese werden für die Rechromatographie zur Seite gestellt«, Die gereinigte Verbindung II wird als letzter Peak erhalten. Die Fraktion zwischen 6500 und 8450 ml Elution wird gesammelt und zu einem öligen Rest von etwa 3 g konzentriert.
Die Hälfte (etwa 1,5 g) dieses Konzentrats der Verbindung II wird für die Chromatographie als Ammoniumsalz der Verbindung IV zubereitet, indem man eine Lösung in 6 ml warmem Methanol unter Rühren herstellt und sofort ausreichend 1N Natriumhydroxid zugibt, um den pH-Wert bei 10,5 bis 11 zu halten. 3,5 bis 3,8 ml Alkali sind erforderlich. Nach dem Stehen während 1/2 h wird die Lösung zur Entfernung einer Spur an unlöslichen Materialien filtriert und das Filtrat wird in eine Säule 2,54 χ 86,36 cm mit 200 bis 325 Mesh gemahlenem XAD-2~Harz (ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymer) gegeben und mit 23% Acetonitril - 77/ό.Ο,ΐΝ Ammoniumhydroxid bei 2 ml/min bei 400C eluiert. Fraktionen von 20 ml v/erden gesammelt. Die Fraktionen 1 bis 44 enthalten Verunreinigungen und einen Peak der Verbindung III - Salz, die verworfen wirde Die Fraktionen 45 bis 61 werden gesammelt, im Vakuum zu einem geringen wäßrigen Restvolumen konzentriert und gefriergetrocknet. Man erhält einen Rückstand aus Ammoniumsalz der Verbindung IV, Gewicht 0,72 g.
Salze der Verbindung IV
Zu einer Lösung aus 40 mg des Produkts von Beispiel 20 in 2 ml Äthanol gibt man 1 ml wäßrige NaOH (Kj1- Mol; 1 Äquivalent). Nach 1 h bei Zimmertemperatur wird das Gemisch zur Trockene im Vakuumfeingedampft. Man erhält das Natriumsalz der Verbindung IV.
- 38, -
Auf ähnliche Weise.werden das Kaliumsalz unter Verwendung von einem Äquivalent Kaliumhydr-oxid und das Calciumsalz unter Verwendung von einem halben Äquivalent CaO hergestellt.
Man .arbeitet "im;wesentlichen, wie in den Beispielen 9 bis 12 und 14 beschriebenj verwendet jedoch anstelle des Ammoniumsalzeε der Verbindung III in jedem Falle eine·äquivalente Menge des Ammoniumsalzes der Verbindung IV und stellt demgemäß die L-Lysin-, L-Arginin-, L-Ornithin-, N-Methylglucamin- und Calciumsalze der·Verbindung IV her.
Man arbeitet im wesentlichen, wie in den Beispielen 13, 15 und 16 beschrieben, verwendet jedoch anstelle der Verbindung I in jedem Falle eine äquivalente Menge der Verbindung III und stellt die Äthylendiamin-,· Tetramethylammonium- und Ammoniumsalze der Verbindung IV her.
Beispiel 23 ' ' . ' :·'. '
Herstellung der Hydroxysäure, Verbindung IV
Das Natriumsalz, hergestellt gemäß Beispiel 22, wird in 2 ml Äthanol/Wasser (1:1) wieder gelöst und zu 10 ml Ö,1N Salzsäure gegeben, woraus· die freigesetzte Hydroxysäure mit Äthylacetat extrahiert wird. Das letztere Lösungsmittel wird einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum bei einer Badtemperatur nicht über 3O0C entfernt. Die erhaltene Hydroxysäure lagert sich langsam in das Lacton beim Stehen um.
221 mg Ammoniumsalz der Verbindung IV werden in 4,5 ml 65/oigem Äthanol gelöst. Man kühlt in Eis, säuert mit etwa 0,5 ml 1M HCl
- "59.- -"
KJ
auf einen pH~-Wert von 3 an und verdampft bei niedriger Temperatur in einem Rotationsverdampfer bis ζυ. einem Volumen von etwa 2 ml« Es werden 2 ml Wasser zugegeben und dann wird in 2 χ 3 ml Äthylacetat extrahiert und mit 1 ml Wasser zurückgewaschen. Alle Lösungen werden in einem Eisbad gekühlt. Der Extrakt wird über MgSO, getrocknet und zur Trockene im Vakuum eingedampft. Man erhält die Hydroxysäure als farbloses öl.
Ein J C-NMR-Spektrum in CDCl, zeigt chemische Verschiebungen für die ersten sechs Kohlenstoffatome des' Hydroxysäureteils des Moleküls, wie in der Tabelle aufgefüllt. Nach dem Stehen lagert · sich diese Hydroxysäure langsam in.das Lacton um.
« P.Pm7,...£eidabwärts„von Tetramethyls.ilan
Ί '2 s
Co,
Hydroxysäure, Verbindung IV
175,0 42,2, 41,7 68,8 72,5 35,0
Das Spektrum des restlichen Teils des Moleküls ändert sich durch den Ringschluß nur kaum.
Beispiel 25 . >
Äthylester der Verbindung IV
Man arbeitet im wesentlichen, wie im Beispiel 19 beschrieben, verwendet jedoch anstelle der 1,24 mMol der Verbindung I eine äquimolare Menge der Verbindung II von Beispiel 20 und erhält den Äthylester der Verbindung IV.
Auf ähnliche Weise werden die Methyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl-, t.-Butyl-, Amyl-, Isoamyl-, 2~Dimethylaminoäthyl-, Benzyl-, Ehenäthyl- und 2-Acetamidoäthylester hergestellt.
Beispiel 26 . ·
A. in-vitro-Inhibierung der HI4G-Coenzym--A-jledukta.se
Das Verfahren von Beg et al. "FEBS Letters", 80, 3 23 (1977) wird etwas modifiziert, indem man das Enzym mit dem Inhibitor während 5 min inkubiert, bevor die Reaktion mit dem Substrat initiiert wird. Mt potenten Inhibitoren, wie den erfindungsgemäßen neuen Verbindungen, ergibt das Standardverfahren, bei dem nur Enzym zu dem Inhibitor/Substrat-Gemisch zugegeben wird, keine linearen kinetischen Ergebnisse.
Unter Verwendung des modifizierten Verfahrens ergibt das Natriumsalz der Verbindung IV einelC^Q bei der Inhibierung von HMG-CoA-Reduktase von 2,7 χ 10"9M verglichen mit 5,4 χ 10""9 M
für ML 236 B. i;
B. in-vivo-Inhibierung der Cholesterinsynthese (Verbindung II) .
Gruppen von männlichen Holtzmän-Ratten werden mit einer Magensonde entweder mit 5% Emulphor in Salzlösung oder der Testverbindung in Emulphor verabreicht. Nach 1 h v/erden 80 μg Ci von
C Acetat/kg i.p. verabreicht. 50 min später wird den Ratten
14
Blut entnonmen und das C-Cholesterin wird als Maß für die Sterinsynthese bestimmt.
Dosis, mg/kg ' % Inhibierung
0,15 . 38
0,6 51..
. 1,2« . 70
%fgj tüiä
..yon._l,.
ML-256" B als Inhibitoren für die Sterin-I
synthese in Zellkultur
Das Verfahren von A.W. Alberts et al. in "J. Biol. Chem.",
Ί Zi
5241 (1974)j bei dem die Menge an C-Sterinbiosynthese aus ,^-Essigsäure in Mäusen L-M-Zellen in Kultur bestimmt wird, wird mit Modifizierung verwendet.' Die Testverbindung wird in
t Ί Zj.
10 u1 DMSO den MonoSchichtkulturen mit 5 η g Ci von C-Acetat zugegeben.;Nach einer 3-stündigen Inkubierung werden die ZeI-
14
len verseift und das C-Sterin wird durch DünnschichtChromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Petroläther/Diäthyl- äther/Essigsäure (75:25:1) extrahiert und isoliert. Der Bereich
1 h '
der Platte, der C-Sterin enthält, wird durch Anfärben mit'J0
14 : ·
identifiziert und der C-Gehalt wird durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt.
Unter Verwendung des modifizierten Verfahrens ergibt die Verbindung II ICcq bei der Inhibierung von HTiG-CoA-Reduktase von 17 nM, verglichen mit 22 nM für die Verbindung I und 46 nM für ML-2.36 B.
Claims (6)
- ERFlNDUTIGSANSPRÜCHE1. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Strukturformeln:IIIIV \oder ihrer pharmazeutisch annehmbaren- Salze oder niedrigen Alkylester oder substituierten Niedrigalkylester der Verbindungen III und IV, worin der Substituent Phenyl, Dimethyl amino oder Acetylamino ist, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Nährmedium mit einem Mikroorganismus des Genus Aspergillus terreus fermentiert und die Produkte isoliert und gegebenenfalls die Verbindung I oder II mit einer Base hydrolysiert und gegebenenfalls das entstehende Salz zu Verbindungen III oder IV ansäuert oder gegebenenfalls die Verbindungen I oder II mit einem niedrigen Alkanol oder einem niedrigen Alkanol, substituiert mit Phenyl, Dimethylamino oder Acetylamino, behandelt.-3JL1R2-
- 2. ' . Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Strukturformeln:CX)OHIIIoder ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze oder niedrigen Alkylester oder substituierten niedrigen Alkylester der Verbindungen III oder IV, worin der Substituent Phenyl, Dimethylamine oder Acetylamino bedeutet, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Nährmedium mit einem Mikroorganismus des Genus Aspergillus terreus fermentiert und die Produkte isoliert und gegebenenfalls die Verbindungen I oder II mit einer Base hydrolysiert und gegebenenfalls das entstehende Salz sorgfältig zu Verbindungen III oder IV ansäuert oder gegebenenfalls die Verbindungen I oder II mit einem niedrigen Alkanol oder einem niedrigen Alkanol, substituiert mit Phenyl, Dimethylamine oder Acetylamino, behandelt.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als Mikroorganismus den bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer 20541 oder 20542 hinterlegten Mikroorganismus verwendet..
- 4. Verfahren nach Punkt 1 oder Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Isolierung das Fermentationsgemisch mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, und daß.eine Chromatographie durchgeführt wird.. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man als Base Ammoniak, Äthylendiamin, N-Methyl· lucamin, Lysin, Arginin oder.Ornithin verwendet.
- 6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß man als Base Ammoniak verwendet,
- 7. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man als Alkanol Äthanol verwendet.eichnungen
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