CZ299290B6 - Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia - Google Patents

Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia Download PDF

Info

Publication number
CZ299290B6
CZ299290B6 CZ0295499A CZ295499A CZ299290B6 CZ 299290 B6 CZ299290 B6 CZ 299290B6 CZ 0295499 A CZ0295499 A CZ 0295499A CZ 295499 A CZ295499 A CZ 295499A CZ 299290 B6 CZ299290 B6 CZ 299290B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
chemically defined
fermentation
medium
strain
lactam compound
Prior art date
Application number
CZ0295499A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295499A3 (cs
Inventor
Laat@Wilhelmus Theodorus Antonius Maria De
Cornelis Gerardus Preusting@Johannes
Pieter Koekman@Bertus
Original Assignee
Dsm Ip Assets B.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dsm Ip Assets B.V. filed Critical Dsm Ip Assets B.V.
Publication of CZ295499A3 publication Critical patent/CZ295499A3/cs
Publication of CZ299290B6 publication Critical patent/CZ299290B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Compounds Of Alkaline-Earth Elements, Aluminum Or Rare-Earth Metals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Rešení se týká zpusobu výroby .beta.-laktamové slouceniny, jehož podstata spocívá v tom, že zahrnuje fermentaci vláknitého mikrobiálního kmene v prumyslovém merítku ve fermentacním médiu, kterým je chemicky definované médium v podstate sestávající zchemicky definovaných složek, a izolaci .beta.-laktamové slouceniny z fermentacního bujonu, jakož izpusobu prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene produkujícího .beta.-laktamovou slouceninu, který lze fermentovat v prumyslovém merítku v chemicky definovaném médiu, a použití chemicky definovaného fermentacního média pro výrobu .beta.-laktamové slouceniny fermentací vláknitého mikrobiálního kmene v prumyslovém merítku.

Description

Čermák HořejŠ Matějka a spol., JUDr. Karel Čermák, advokát, Národní 32, Praha 1, 11000 (54) Název vynálezu.
Způsob výroby beta-laktamové sloučeniny, způsob přípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentačního média (57) Anotace:
Řešení se týká způsobu výroby β-laktamové sloučeniny, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje fermentaci vláknitého mikrobiálního kmene v průmyslovém měřítku ve fermentačním médiu, kterým je chemicky definované médium v podstatě sestávající z chemicky definovaných složek, a izolaci β-laktamové sloučeniny z fermentačního bujónu, jakož i způsobu přípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene produkujícího β-laktamovou sloučeninu, který lze fermentovat v průmyslovém měřítku v chemicky definovaném médiu, a použití chemicky definovaného fermentačního média pro výrobu β-laktamové sloučeniny fermentaci vláknitého mikrobiálního kmene v průmyslovém měřítku.
CZ 299290 Β6
Způsob výroby β-laktamové sloučeniny, způsob přípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentačního média
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby β-laktamové sloučeniny, způsobu přípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentačního média.
Dosavadní stav techniky
Celá řada hodnotných sloučenin se vyrábí fermentační výrobou ve velkých průmyslových fermentorech, tj. mikroorganismus, který produkuje požadovanou hodnotnou sloučeninu, roste za řízených podmínek ve fermentoru o objemu 10 mI * 3 až 300 m3. V současných průmyslových fermentačních procesech se produkční organismus zpravidla fermentuje v komplexním fermentačním médiu. Komplexním médiem se rozumí médium, které obsahuje komplexní zdroj dusíku a/nebo uhlíku, jakým je například sójová mouka, mouka ze semen bavlníku, kukuřičný výluh, kvasnicový extrakt, kaseinový hydrolyzát, melasa apod.
Výhodami komplexního média je, že komplexní surové materiály, které tvoří toto médium, nejsou drahé, jsou snadno dostupné a tvoří úplný nebo téměř úplný nutriční zdroj pro mikroorganismus včetně zdroje uhlíku a dusíku a stejně tak vitaminů a minerálů. Kromě toho směs biologických makromolekul přítomných v komplexních surových materiálech, například proteinů, uhlovodíků, lipidů apod., musí být před spotřebováním rozložena enzymy vyměšovanými tímto mikroorganizmem. V důsledku toho jsou konzumovatelné malé molekuly rovnoměrně dostupné v celém fermentoru a v průběhu celého fermentačního procesu, čímž se eliminují koncentrační gradienty, a směšovací problémy a udržení koncentrace těchto konzumovatelných malých molekul na hodnotě nižší než je hodnota potlačující koncentrace. Kromě toho tyto makromolekuly a stejně tak organické kyseliny, které jsou rovněž přítomny v komplexním médiu, poskytují médiu pufrovací kapacitu a tím usnadňují kontrolu pH.
Kromě tohoto výčtu výhod má komplexní fermentační médium i několik závažných nevýhod. Nejzávažnějším problémem je, že komplexní surové materiály mají chemicky nedefinované složení a proměnlivou kvalitu, způsobenou, mimo jiné, změnou období a různým geografickým původem. Protože složení fermentačního média má podstatný vliv na fermentační parametry, jakými jsou například viskozita, tepelný přenos a přenos kyslíku, jsou komplexní surové materiály hlavní příčinou proměnlivosti procesu. Kromě toho představují překážku při dalším zpracování a mohou nežádoucím způsobem ovlivnit kvalitu finálního produktu. Například fermentační bujóny, což jsou v podstatě vláknité mikroorganismy, mohou v případě, že se použijí jako komplexní surové materiály, vykazovat sníženou filtrovatelnost.
Komplexní surové materiály mohou rovněž obsahovat sloučeniny, které se neúmyslně hromadí ve finálním produktu nebo které jsou s tímto finálním produktem izolovány. Těžké kovy, pesticidy nebo herbicidy představují příklady nežádoucích sloučenin, které mohou být přítomny v komplexních surových materiálech. Kromě toho mohou komplexní surové materiály obsahovat toxiny nebo mohou vést k jejich tvorbě.
Dalšími nevýhodami je to, že komplexní médium produkuje během sterilizace nepříjemný zápach a nežádoucí odpad.
I přes výše popsané nevýhody spojené s použitím komplexních médií jsou tato média pro průmyslové fermentační procesy stále výhodná. Existují různé důvody, proč média, která neobsahují komplexní surové materiály, například chemicky definovaná média, nelze brát v úvahu pro použití v průmyslových fermentačních procesech. Odborníkům v daném oboru jsou výhody
- 1 CZ 299290 B6 s použitím komplexních médií známy. Podstatnější skutečností je, že výtěžky produktů, které by se získaly za použití chemicky definovaného média v průmyslovém měřítku, by byly zpravidla podstatně nižší než výtěžky získané za použití média obsahujícího komplexní surové materiály. Kromě toho vysoce produktivní mikrobiální kmeny, které byly vyvinuty pro průmyslové procesy používající komplexní média, nemusí v chemicky definovaných médiích vykazovat stejně dobrou výkonnost. Jedním z důvodů nedostatečné výkonnosti v chemicky definovaném médiu může být to, že současné průmyslové kmeny byly podrobeny různým cyklům mutageneze a selekce bez toho, že by se vzala v úvahu jejich výkonnost v chemicky definovaných médiích.
Takže chemicky definovaná média se i nadále používala pouze pro výzkumné účely, například v laboratorních kulturách, v Petriho miskách a/nebo protřepávačkách nebo v relativně malých fermentačních objemech nepřesahujících zpravidla 20 1 až 40 1, viz například fermentační výroba sekundárních metabolitů, například penicilinu (Jarvis a Johnson, J. Am. Chem. Soc. 69, 3010— 3017 (1947); Stone a Farrell, Science 104, 445—446 (1946); White a kol., Arch. Biochem. 8, 303309 (1945)), kyseliny klavulanové (Romero a kol., Appl. Env. Microbiol. 52, 892-897 (1986)) a erythromycinu (Bushell a kol., Microbiol. 143, 475—480 (1997)).
Nicméně výsledky výzkumů, týkající se použití chemicky definovaných médií v malých výzkumných měřítcích, neposkytují odborníkům v daném oboru žádné informace týkající se aplikovatelnosti těchto médií ve velkých průmyslových fermentačních procesech prováděných zpravidla v objemu přibližně 10 m3 nebo vyšším.
Pro vyloučení problémů, souvisejících s použitím běžných předpisů pro komplexní média v současné průmyslové praxi, bude žádoucí použít pro fermentace prováděné v průmyslovém měřítku chemicky definovaná média.
Předložená přihláška vynálezu popisuje použití chemicky definovaných médií pro průmyslové fermentační procesy, která umožňují v kombinaci s vhodným kmenem produkovat hodnotné sloučeniny, například primární nebo sekundární metabolity, farmaceutické proteiny nebo peptidy, nebo průmyslové enzymy v ekonomicky atraktivním výtěžku.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob výroby β-laktamové sloučeniny, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje fermentaci vláknitého mikrobiálního kmene v průmyslovém měřítku ve fermentačním médiu, kterým je chemicky definované médium v podstatě sestávající z chemicky definovaných složek, a izolaci β-laktamové sloučeniny z fermentačního bujónu.
Výhodně chemicky definované médium obsahuje množství komplexního zdroje uhlíku a/nebo dusíku, které je nejvýše rovné okolo 10 % z celkového množství, uhlíku a/nebo dusíku (Kjeldahlův N), které je přítomno v chemicky definovaném médiu. Výhodně chemicky definované složky chemicky definovaného média zahrnují zdroj uhlíku zvolený ze skupiny sestávající z cukrů, například glukózy, laktózy, fruktózy, sacharózy, maltodextrinů, škrobu a inulinu, glycerolu, rostlinných olejů, uhlovodíků, alkoholů, například methanolu a ethanolu, organických kyselin, například acetátu a vyšších alkanových kyselin; a zdroj dusíku zvolený ze skupiny sestávající z močoviny, amoniaku, dusičnanu, amonných solí, například síranu amonného, fosforečnanu amonného a dusičnanu amonného, a aminokyselin, například glutamátu a lysinu. Výhodně je zdrojem uhlíku glukóza a zdrojem dusíku je amoniak a/nebo amonná sůl. Výhodně se fermentace provádí diskontinuálně, opakovaně diskontinuálně, procesem fed-batch, opakovaným procesem fed-batch nebo kontinuálně. Výhodněji se fermentace provádí procesem fed-batch. Výhodně se do procesu zavádí zdroj uhlíku a/nebo dusíku. Výhodně je zdrojem uhlíku glukóza a zdrojem dusíku je amoniak a/nebo amonná sůl. Výhodně je vláknitým kmenem houba. Výhodně je houbou kmen Penicillium. Výhodněji je houbou Penicillium chrysogenum. Výhodně je vláknitým kmenem bakterie. Výhodně je bakterií Actinomycetes. Výhodně Actinomycetes je Streptomycetes clavuligerus a β-laktamovou sloučeninou je kyselina klavulanová.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene produkujícího β-laktamovou sloučeninu, kterou lze fermentovat v průmyslovém měřítku v chemicky definovaném médiu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje podrobení vhodného rodičovského kmene mutagennímu ošetření zvolenému ze skupiny zahrnující fyzikální prostředky a chemické mutageny a/nebo DNA transformaci; analyzování výsledných mutantů a/nebo transformantů podle jejich schopnosti růstu na chemicky definovaném médiu a podle jejich produktivity v případě uvedené β-laktamové sloučeniny; a výběr mutantů a/nebo transformantů, které mají dobrou schopnost růstu na chemicky definovaném médiu a/nebo zvýšenou produktivitu v případě uvedené β-laktamové sloučeniny v porovnání s rodičovským kmenem.
Výhodně se rodičovský kmen zvolí ze skupiny sestávající z kmenů, které mají dobrou schopnost růstu na chemicky definovaném médiu, ale které potřebují zvýšit produktivitu. Rovněž výhodně se rodičovský kmen zvolí ze skupiny sestávající z kmenů, které mají vysokou produktivitu v případě požadované β-laktamové sloučeniny, ale relativně špatnou schopnost růstu na chemicky definovaném médiu.
Předmětem vynálezu je dále použití chemicky definovaného fermentačního média pro výrobu β-laktamové sloučeniny fermentací vláknitého mikrobiálního kmene v průmyslovém měřítku.
V celém popisu vynálezu je třeba průmyslový fermentační proces nebo průmyslový proces chápat jako fermentační proces prováděný v objemu, který je větší nebo roven 10 m3, výhodně větší nebo roven 25 m3, výhodněji větší nebo roven 50 m3 a nejvýhodněji větší nebo roven 100 m3.
Výraz „chemicky definované“ je zde použit pro fermentační média, která jsou v podstatě tvořena chemicky definovanými složkami. Fermentační médium, které je v podstatě tvořeno chemicky definovanými složkami, zahrnuje médium, které neobsahuje komplexní zdroj uhlíku a/nebo dusíku, tj. které neobsahuje komplexní surové materiály, které mají chemicky nedefinované složení. Fermentační médium, které je v podstatě tvořeno chemicky definovanými složkami, může dále obsahovat médium, které obsahuje velmi malé množství komplexního zdroje dusíku a/nebo uhlíku, tj. množství, které je definováno níže jako množství, které není dostatečné pro udržení růstu mikroorganismu a/nebo pro zajištění tvorby dostatečného množství biomasy.
V tomto ohledu mají komplexní surové materiály chemicky nedefinované složení, které je důsledkem skutečnosti, že tyto surové materiály obsahují například celou řadu rozdílných sloučenin, mj. komplexních hetero-polymemích sloučenin, a proměnlivé složení způsobené sezónními změnami a rozdílným geografickým původem. Typickými příklady komplexních surových materiálů, které působí při fermentaci jako komplexní zdroj dusíku a/nebo uhlíku, jsou sójová mouka, mouka ze semen bavln íku, kukuřičný výluh, kvasnicový extrakt, kaseinový hydrolyzát, melasa apod.
V chemicky definovaném médiu podle vynálezu může být přítomno velmi malé množství komplexního zdroje uhlíku a/nebo dusíku, který se sem například přenesl z inokula pro hlavní fermentaci. Inokulum pro hlavní fermentaci nemusí být nezbytně získáno fermentaci na chemicky definovaném médiu. Nejěastěji se přenos z inokula detekuje na základě přítomnosti malého množství komplexního dusíkového zdroje v chemicky definovaném médiu pro hlavní fermentaci.
Použití komplexního zdroje uhlíku a/nebo dusíku při fermentaci inokula pro hlavní fermentaci například urychlí tvorbu biomasy, tj. zvýší rychlost růstu mikroorganismu a/nebo usnadní regulaci vnitřního pH. Ze stejného důvodu může být výhodné přidání velmi malého množství komplexního zdroje uhlíku a/nebo dusíku, jakým je například kvasnicový extrakt, do počátečního stadia hlavní fermentace, a to zejména z důvodu urychlení tvorby biomasy v raném stadiu fermentačního procesu.
Velmi malé množství komplexního zdroje uhlíku a/nebo dusíku, které může být přítomno v chemicky definovaném médiu podle vynálezu, je definováno jako množství, které představuje nejvýše přibližně 10% celkového množství uhlíku a/nebo dusíku (Kjeldahl N), které je přítomno v chemicky definovaném médiu, výhodně množství, které představuje nejvýše 5 % celkového množství uhlíku a/nebo dusíku a ještě výhodněji množství, které představuje nejvýše 1 % celkového množství uhlíku a/nebo dusíku. Nejvýhodněji není v chemicky definovaném médiu podle vynálezu přítomen žádný komplexní zdroj uhlíku a/nebo dusíku.
Mělo by být zřejmé, že výraz „chemicky definované médium“, jak je použit v této přihlášce vynálezu, zahrnuje médium, do něhož jsou všechny nezbytné složky přidány před zahájením fermentačního procesu a dále médium, do něhož je část nezbytných složek přidána před zahájením fermentačního procesu a část během fermentačního procesu.
Vynález dále popisuje, že jsou mikrobiální kmeny schopny převést v průmyslovém měřítku prosté surové materiály chemicky definovaného média na ekonomicky atraktivní množství hodnotného produktu. Překvapivě se zjistilo, že produktivita mikrobiálních kmenů v chemicky definovaných médiích, měřeno v průmyslovém měřítku, může být srovnatelná, nebo v některých případech i vyšší, než jejich produktivita v komplexních médiích.
Další výhodou použití chemicky definovaných médií je to, že přenos kyslíku z plynné do kapalné fáze a přenos oxidu uhličitého z kapalné do plynné fáze je v porovnání s použitím komplexních médií lepší. Jak je známo odborníkům v daném oboru, koncentrace rozpuštěného kyslíku a koncentrace rozpuštěného oxidu uhličitého jsou u průmyslových fermentačních procesů dva důležité faktory, které mohou určovat hospodárnost průmyslového procesu. Zlepšení přenosu hmoty, k němuž dochází při použití chemicky definovaných médií, může být z určité části způsobeno nepřítomností podstatnějších množství sloučenin, které podporují splynutí plynových bublin, v těchto médiích. Sloučeniny podporující toto splynutí lze například nalézt mezi určitými hydrofobními a/nebo polymemími sloučeninami přítomnými v komplexních surových materiálech. Splynutí plynových bublin zpravidla vede ke snížení účinnosti při přenosu hmoty (van't Riet a Tramper v Basic Bioreactor Design, str. 236-273 (1991)).
Přenos kyslíku je často omezujícím faktorem fermentačních procesů, zejména při fermentaci vláknitých mikroorganismů. Zvýšená kapacita přenosu kyslíku, dosažená při fermentaci použitím chemicky definovaného média podle vynálezu, představuje mnohem lacinější způsob optimalizace produktivity než investice do technického zařízení, jakým je například přívod energie, obohacení přiváděného vzduchu kyslíkem nebo tlak fermentoru.
U průmyslových fermentačních procesů mají vypěstované vláknité mikroorganismy, jakými jsou vláknité bakterie, například aktinomycety, nebo vláknité houby, například Penicillium nebo Aspergillus, zpravidla peletovou morfologii. V tomto ohledu mají proteiny a peptidy, přítomné v komplexních fermentačních médiích, tendenci produkovat chomáčové pelety, které snadněji padají mimo dispergované podhoubí, které má velmi dlouhé a větvené hyfy v důsledku vysokých rychlostí růstu, kterých se při použití komplexních médií zpravidla dosahuje. Morfologie chomáčových pelet může tedy obecně způsobit nežádoucí vysokou viskozitu bujónu. Použití chemicky definovaných médií má příznivý vliv na morfologii, například produkcí mnohem tužších pelet, které neodpadávají během fermentace tak snadno. Tímto způsobem lze při použití chemicky definovaných médií dosáhnout podstatného snížení viskozity vláknitých fermentačních bujónů. Protože pro tvorbu produktu je výhodná nízká viskozita fermentačního bujónu, je řízení viskozity jedním z nejdůležitějších faktorů průmyslových fermentačních procesů.
Další výhoda použití chemicky definovaných médií byla zjištěna při následném zpracování produktu. Pro určité kombinace kmen-produkt, zejména pokud se fermentují vláknité kmeny, dochází při použití chemicky definovaných médií k podstatnému zlepšení následného zpracování produktu.
-4CZ 299290 B6
Chemicky definované médium, které má být použito ve způsobu podle vynálezu, by zpravidla mělo obsahovat tzv. strukturní a tzv. katalytické prvky.
Strukturními prvky jsou ty prvky, které jsou stavebními složkami mikrobiálních makromolekul, tj. vodík, kyslík, uhlík, dusík, fosfor a síra. Strukturní prvky vodík, kyslík, uhlík a dusík jsou zpravidla obsaženy ve zdroji uhlíku a dusíku. Fosfor a síra se zpravidla přidávají ve formě fosforečnanových a síranových a/nebo thiosíranových iontů.
Typ zdroje uhlíku a dusíku, který se použije v chemicky definovaném médiu, není pro vynález kritický za předpokladu, že má v podstatě chemicky definovaný charakter.
Výhodně se zdroj uhlíku zvolí ze skupiny tvořené cukry, například glukózou, laktózou, fruktózou, sacharózou, maltodextriny, škrobem a inulinem, glycerolem, rostlinnými oleji, uhlovodíky, alkoholy, například methanolem a ethanolem, organickými kyselinami, například acetátem a vyššími alkanovými kyselinami. Výhodněji se zdroj uhlíku zvolí ze skupiny tvořené glukózou, sacharózou a sójovým olejem. Nejvýhodnějším zdrojem uhlíku je glukóza. Je zřejmé, že výraz „glukóza“ zahrnuje i glukózové sirupy, tj. kompozice glukózy obsahující glukózové oligomery v definovaných množstvích.
Zdroj dusíku se výhodně zvolí ze skupiny sestávající z močoviny, amoniaku, dusičnanu, amonných solí, například síranu amonného, fosforečnanu amonného a dusičnanu amonného, a aminokyselin, například glutamátu a lysinu. Výhodněji se zdroj dusíku zvolí ze skupiny sestávající z amoniaku, síranu amonného a fosforečnanu amonného. Nejvýhodnějším zdrojem dusíku je amoniak. Výhoda použití amoniaku jako zdroje dusíku spočívá v tom, že amoniak dále působí jako činidlo regulující pH. V případě použití síranu amonného a/nebo fosforečnanu amonného jako dusíkového zdroje může být částečně nebo zcela splněn požadavek mikroorganismu, pokud jde o síru a/nebo fosfor.
Katalytickými prvky jsou ty prvky, které představují stavební složky enzymů nebo enzymových kofaktorů. Těmito prvky jsou například hořčík, železo, měď, vápník, mangan, zinek, kobalt, molybden, selen a bor.
Vedle těchto strukturních a katalytických prvků by měly být přítomny kationty, například draslíkové a sodíkové ionty, které působí jako protiionty, a regulují intracelulámí pH a osmolaritu.
Složkami, které mohou být případně zahrnuty v chemicky definovaném médiu, jsou chelatační činidla, například kyselina citrónová, a pufrační činidla, například fosforečnan monodraselný a didraselný, uhličitan vápenatý apod. Pufrační činidla se výhodně přidávají v případě, kdy se nepoužívá externí regulace pH. Kromě toho mohou být do fermentačního média přidány před zahájením fermentačního procesu a/nebo během fermentačního procesu činidla omezující pěnivost.
Makromolekuly a organické kyseliny, které jsou přítomny v komplexních médiích, poskytují těmto médiím pufrační kapacitu. V důsledku nepřítomnosti těchto sloučenin v chemicky definovaných médiích je pH regulace v těchto médiích složitější než u komplexních médií. Vynález ukazuje, že regulace pH přidáním kyseliny nebo báze, v závislosti na vývoji pH v bujónu, umožňuje dosáhnout správného profilu pH v chemicky definovaných průmyslových procesech.
Vitaminy označují skupinu strukturně nepříbuzných organických sloučenin, které jsou nezbytné pro normální metabolismus mikroorganismů. Mikroorganismy jsou známy tím, že se jejich schopnost syntetizovat požadované vitaminy velmi liší. Do fermentačního média mikroorganismu, který není schopen uvedený vitamin syntetizovat, by se měl tento vitamin přidat. Zpravidla mohou být chemicky definovaná fermentační média pro kvasinky nebo bakterie nebo
-5CZ 299290 B6 pro určité nižší houby, například mukoraly, obohacena jedním nebo více vitaminy. Vyšší houby ve většině případů žádný vitamin nevyžadují.
Vitaminy se zvolí ze skupiny sestávající z thiaminu, riboflavinu, pyridoxalu, kyseliny nikotinové nebo nikotinamidu, kyseliny pantotenové, kyanokobaltaminu, kyseliny listové, biotinu, kyseliny lipoové, purinů, pyrimidinů, inositolu, cholinu a heminů.
Strukturní a katalytické prvky a případně vitaminy jsou nezbytné pro růst mikroorganismu, například pro tvorbu biomasy.
Množství nezbytných sloučenin, tj. sloučenin obsahujících strukturní a katalytické prvky, a případně vitaminů, které má být přidáno do chemicky definovaného média, bude záviset zejména na množství biomasy, která má být při fermentačním procesu vytvořena. Množství vytvořené biomasy se může lišit a zpravidla představuje přibližně 10 g/1 fermentačního bujónu až 150 g/1 fermentačního bujónu. Fermentace produkující množství biomasy, které je nižší než přibližně 10 g/1 fermentačního bujónu nelze zpravidla považovat za průmyslové procesy.
Kromě toho bude optimální množství každé stavební složky definovaného média a stejně tak rozhodnutí o tom, které sloučeniny jsou podstatné a které nikoliv, záviset na typu mikroorganismu, který je podroben fermentaci v definovaném médiu, na množství biomasy a na produktu, který má být vytvořen. Použití chemicky definovaných médií tedy výhodně umožní změnu koncentrace každé složky média nezávisle na dalších složkách a tím usnadní optimalizaci složení média.
Pro tvorbu produktu může být nezbytné doplnění chemicky definovaného média dalšími sloučeninami a/nebo zvýšení koncentrace určitých sloučenin, které jsou již v chemicky definovaném médiu přítomny, nad úroveň, která je nezbytná pro růst mikroorganismu. Uvedené sloučeniny mohou indukovat a/nebo zvyšovat produkci požadované sloučeniny mikroorganismem a/nebo mohou působit jako prekurzor požadované sloučeniny.
Příklady sloučenin, které mají být doplněny a/nebo přidány do chemicky definovaného média ve zvýšeném množství, jsou síran ve zvýšeném množství při výrobě β-laktamových sloučenin, sloučeniny obsahující dusík ve zvýšeném množství při výrobě aminokyselin, zejména bazických aminokyselin, kyselina fenyloctová při výrobě penicilinu G, kyselina fenoxyoctová při výrobě penicilinu V, kyselina adipová při výrobě adipyl-7-ADCA a adipyl-7-ACA, a kyselina propionová při výrobě erythromycinu.
Při průmyslových fermentačních procesech podle vynálezu se celkové množství uhlíkového zdroje, přidaného do chemicky definovaného média, vyjádřené jako množství uhlíku na litr média, může pohybovat od 10 g C/l do 200 g C/l a výhodně od 20 g C/l do 200 g C/l.
Celkové množství dusíkového zdroje přidané do chemicky definovaného média se může pohybovat přibližně od 0,5 g N/l do 50 g N/l a výhodně od 1 g N/l do 25 g N/l, přičemž dusík je vyjádřen jako Kjeldahl N.
Poměr mezi uhlíkovým a dusíkovým zdrojem při fermentaci se může značně různit, přičemž určitým faktorem pro stanovení optimálního poměru mezi uhlíkovým a dusíkovým zdrojem je elementární složení produktu, který má být připraven.
Vodítkem pro určení koncentračních rozmezí dalších sloučenin potřebných pro růst mikroorganismů, například fosforečnanu, síranu nebo stopových prvků, jsou koncentrační rozmezí naznačená v tabulce 1. Koncentrační rozmezí těchto dalších sloučenin mohou být pro různé třídy mikroorganismů, tj. houby, kvasinky a bakterie, různá.
-6CZ 299290 B6
Koncentrace vitaminů se zpravidla pohybují v rozmezí od 0,1 (biotin) mg/1 do 500 (myoinositol) mg/1.
Množství složek média, které jsou nezbytné pro růst mikroorganismu, lze zpravidla určit ve vztahu k množství uhlíkového zdroje použitého při fermentaci, protože množství vytvořené biomasy bude primárně určeno množstvím použitého uhlíkového zdroje.
Tabulka 1
Typická koncentrační rozmezí složek média, které jsou vedle uhlíkového a dusíkového zdroje nezbytné pro růst různých tříd mikroorganismů (g/1)
Houby Kvasinky Bakterie (aktinomycety)
PO?'5 1-20
SO?'5
MgSO« . 7HZO3 0,5-10 0,5-2 0,5-2
CaCl2 . 2H2O3 0,01-0,1 0,1-1 0,05-0,5
FeS04 . 7H2O3 0,1-1,0 0,1-0,5 0,1-0,5
ZnSO« . 7H2O3 0,0005-0,1 0,002-1 0,002-0,1
MnS0< .1H2O3 0,0005-0,1 0,02-1 0,002-0,1
CuS04 . 5H2O3'4 < 0,005 0,001-0,01 0,001-0,01
C0SO4 . 7H2O3'4 <, 0,01 < 0,01 < 0,01
Na2MoO< . 2H2O4 £ 0,0005 0,001-0,005 0,001-0,005
h3bo3 4 < 0,0005 0,001-0,005 0,001-0,005
KI* < 0,002 < 0,002
1 Základní potřebné množství fosfátu bude 0,5 % až 1 % suché hmotnosti biomasy. Pro vsádkové procesy, prováděné v relativně malém měřítku, bude pro regulaci pH potřebný další fosforečnan.
2 Síran může být rovněž dávkován pomocí titračního činidla, například draselných a sodných kationtů.
3 Síran může být (částečně) nahrazen chloridem jako protiiontem ve stopových prvcích nebo naopak.
4 V případě některých stopových prvků je obtížné definovat spodní limity. Jejich požadavek může být například splněn jejich přítomností v dalších složkách média, například v síranu železnatém, ve vodě, v malých množstvích kvasinkového extraktu atd.
5 Fosforečnan a síran se přidávají ve formě draselných, amonných a/nebo sodných soli při následující preferenci. K > NH4 > Na.
Průmyslové fěrmentační procesy podle vynálezu, využívající chemicky definovaného média, lze provádět jako vsádkové, opakované vsádkové, plněné-vsádkové, opakovaně plněné-vsádkové nebo kontinuální fermentační procesy.
V případě vsádkového způsobu se všechny složky média přidávají jako celek přímo do média před zahájením fermentačního procesu.
- 7 CZ 299290 B6
V případě opakovaného vsádkového způsobu se část sklizně bujónu doplní částí doplňkového komplexního média, což se případně několikrát zopakuje.
V případě plně ného-vsádkového způsobu se do média před zahájením fermentace nepřidá buď žádná ze sloučenin nebo se přidá pouze část sloučenin obsahujících jeden nebo více strukturních a/nebo katalytických prvků a buď všechny resp. zbývající část těchto sloučenin obsahujících jeden nebo více strukturních a/nebo katalytických prvků se zavede během fermentačního procesu. Sloučeniny, které byly vybrány pro zavádění do fermentačního procesu mohou být zavedeny společně nebo samostatně.
Zejména u fermentačního procesu, ve kterém se původní fermentační médium naředí přidáním sloučenin obsahujících jeden nebo více strukturních prvků přibližně dvakrát nebo vícekrát, může zavedení kromě strukturních prvků dále zahrnovat zavedení katalytických prvků a dalších složek média.
V případě opakovaně plněného-vsádkového nebo kontinuálního fermentačního způsobu se celé výchozí médium postupně zavede během fermentace. Výchozí médium lze zavádět společně se zaváděnými strukturními prvky nebo odděleně. Při opakovaně plněném-vsádkovém způsobu se v pravidelných časových intervalech odstraňuje část fermentačního bujónu obsahujícího biomasu, zatímco u kontinuálního způsobu se odstranění části fermentačního bujónu provádí kontinuálně. Fermentační proces je tedy doplňován částí čerstvého média, která odpovídá množství odváděného fermentačního bujónu.
U výhodného provedení vynálezu se používá plněný-vsádkový nebo opakovaně plněný-vsádkový způsob, ve kterých je do fermentačního procesu zaváděn zdroj uhlíku a/nebo dusíku a/nebo fosforečnanu. U výhodnějšího provedení se do fermentačního procesu zavádí zdroj uhlíku a dusíku. Nejvýhodněji se do fermentačního procesu zavádí zdroj uhlíku a dusíku a rovněž fosforečnanu. V tomto ohledu je výhodným zdrojem uhlíku glukóza a výhodným zdrojem dusíku je amoniak a/nebo amonné soli.
Použití plněného-vsádkového způsobu zpravidla umožňuje použití podstatně vyššího množství zdroje uhlíku a dusíku než použití vsádkového způsobu. Množství zdroje uhlíku a dusíku, použité v případě plněného-vsádkového způsobu, může být konkrétně přibližně alespoň dvakrát vyšší než největší množství použité v případě vsádkového způsobu. To zase vede, v případě plněnéhovsádkového způsobu, ke tvorbě podstatně vyššího množství biomasy.
Další aspekt vynálezu se týká případného následného zpracování fermentačního bujónu. Po ukončení fermentačního procesu se může hodnotný produkt případně izolovat z fermentačního bujónu pomocí standardních technologií vyvinutých pro tyto hodnotné sloučeniny. Volba odpovídající technologie následného zpracování závisí na povaze a buněčné lokalizaci hodnotné sloučeniny. Nejprve se z fermentační tekutiny oddělí, například odstřeďováním nebo filtrací, biomasa. V případě, že je hodnotný produkt shromážděn uvnitř mikrobiálních buněk neboje s nimi spojen, se potom z izolované biomasy získá hodnotná sloučenina. V případě, že je hodnotný produkt mikrobiální buňkou vylučován, se tento produkt izoluje z fermentační tekutiny.
Použití chemicky definovaného média při průmyslové fermentační výrobě požadované hodnotné sloučeniny poskytuje velkou výhodu při následném zpracování, protože množství vedlejších produktů je podstatně nižší než při použití komplexních médií. Navíc se zlepší kvalita produktu, protože se s požadovanou sloučeninou neizolují žádné nežádoucí vedlejší produkty.
Ještě dalším aspektem vynálezu je identifikace vhodného kmene pro průmyslový fermentační proces používající chemicky definované médium.
Vhodným mikrobiálním kmenem pro průmyslový fermentační proces využívající chemicky definované médium může být libovolný standardní typ kmene produkující požadovanou hodnotnou
-8CZ 299290 Β6 sloučeninu za předpokladu, že na chemicky definovaném médiu vykazuje dobrý růst. Kromě toho může být vhodným mikrobiálním kmenem pro průmyslový fermentační proces používající chemicky definované médium kmen, který se získá a/nebo vylepší podrobením rodičovského kmene klasickému mutagennímu ošetření nebo rekombinantní DNA transformaci, rovněž za předpokladu, že výsledný mutant nebo transformovaný mikrobiální kmen bude vykazovat dobrý růst na chemicky definovaném médiu. Na růstu rodičovského kmene na chemicky definovaném médiu bude tedy záviset, zda výsledné mutantní nebo transformované kmeny budou vykazovat lepší nebo podobný růst na chemicky definovaném médiu v porovnání s růstem rodičovského kmene.
Mikrobiálním kmenem se rozumí kmen, který vykazuje na chemicky definovaném médiu dobrý růst při specifické rychlosti růstu (/z) na chemicky definovaném médiu, která je vyšší nebo rovna 0,05 hod1, výhodně vyšší nebo rovna 0,1 hod-1, výhodněji vyšší nebo rovna 0,2 hod-1 a nejvýhodněji vyšší nebo rovna 0,4 hod-1. Růst mikrobiálního kmene na chemicky definovaném médiu se běžně analyzuje fermentaci uvedeného kmene v chemicky definovaném médiu, v relativně malém měřítku, například v kultuře protřepávačky a/nebo deseti litrové stolní fermentace. Analýza růstu se výhodně provádí při použití desetilitrové stolní fermentace a při regulaci pH, teploty a koncentrace kyslíku.
U jednoho výhodného provedení vynálezu se mikrobiální kmeny, které lze fermentovat v chemicky definovaném médiu, získávají a/nebo vylepšují podrobením rodičovského kmene klasickému mutagennímu ošetření, které se provádí za použití fyzikálních prostředků, například UV záření, nebo za použití vhodného chemického mutagenu, například N-methyl-N-nitro-N-nitrozoguanidinu nebo ethylmethansulfonátu. U dalšího provedení vynálezu se mikrobiální kmeny, které lze fermentovat v chemicky definovaném médiu, získají a/nebo vylepší podrobením rodičovského kmene rekombinantní DNA technologii, při kterém se rodičovský kmen transformuje s jedním nebo více funkčními geny.
Předložený vynález obecně počítá se dvěma skupinami rodičovských kmenů, které mají být podrobeny klasické mutagenezí a/nebo DNA transformaci. U jednoho provedení podle vynálezu se rodičovský kmen zvolí ze skupiny kmenů, které vykazují dobrý růst na chemicky definovaném médiu, ale které musí být vylepšeny, pokud jde o jejich produktivitu v případě požadované sloučeniny. U dalšího provedení vynálezu se rodičovský kmen zvolí ze skupiny kmenů, které mají vysokou produktivitu v případě požadované sloučeniny, ale které vykazují relativně špatný růst na chemicky definovaném médiu. Mikrobiální kmeny se specifickou rychlostí růstu nižší než přibližně 0,05 hod'1 jsou považovány za kmeny s relativně špatným růstem na chemicky definovaném médiu.
Po obou procesech, jak po klasickém mutagenním ošetření, tak po DNA transformačním procesu, následuje analyzování výsledných mutantů nebo transformantů z hlediska jejich růstu na chemicky definovaném médiu a z hlediska produktivity v případě sledované sloučeniny. Mutantní kmeny nebo transformanty, které vykazují dobrý růst na chemicky definovaném médiu a/nebo zlepšenou produktivitu v případě sledované sloučeniny v porovnání s rodičovským kmenem, se izolují.
Je třeba poznamenat, že některé mikrobiální kmeny, zejména průmyslové kmeny, které již byly podrobeny extenzivnímu mutagennímu ošetření, jehož cílem bylo zvýšení jejich produktivity, mohou vykazovat špatný nebo vůbec žádný růst v chemicky definovaném médiu. Tento špatný nebo vůbec žádný růst mutagenovaného kmene může způsobovat skutečnost, že růst na chemicky definovaném médiu nikdy nefiguroval mezi kritérii pro selekci vhodných mutantů. Například je možné, že mutagenovaný kmen vykazuje mutaci, která způsobuje neznámé požadavky pro možnosti růstu (neznámá auxotropní mutace).
Mikrobiální kmeny, které jsou vhodné pro průmyslovou fermentaci využívající chemicky definované médium, zahrnují vláknité a nevláknité kmeny. Mikrobiální kmeny, které jsou vhodné pro fermentaci v chemicky definovaném médiu, například zahrnují kmeny hub, jakými jsou
-9CZ 299290 B6 například Aspergillus, Penicillium nebo Mucorales, kmeny kvasinek, například Saccharomyces, Pichia, Phaffia nebo Kluyveromyces, a bakteriální kmeny, například Actinomycetes. Použití chemicky definovaného média podle vynálezu je zvláště výhodné pro průmyslovou fermentaci vláknitých mikroorganismů.
Způsob podle vynálezu využívající chemicky definované médium je vhodný pro průmyslovou fermentační výrobu libovolné hodnotné sloučeniny zahrnující primární nebo sekundární metabolity, farmaceutické proteiny nebo peptidy, nebo průmyslové enzymy. Výhodnými hodnotnými sloučeninami jsou sekundární metabolity, například antibiotika nebo β-laktamové sloučeniny a ío zejména β-laktamová antibiotika.
Příklady kombinací kmen-produkt zahrnují A. niger, například A. niger CBS 513.88, pro amyloglukosidázu, A. oryzae pro α-amylázu, A. terreus, například A. terreus CBS 456.95, pro lovastatin, Mortierella alpina pro kyselinu arachidonovou nebo kyselinu arachidonovou obsahující lipid, Mucor myehel pro proteázu, P. chrysogenum, například P. chrysogenum CBS 455.95 nebo další vhodné kmeny, pro β-laktamové sloučeniny (penicilín G nebo V), Streptomyces clavuligerus, například S. clavuligerus ATCC 27064, pro kyselinu klavulanovou. Pichia ciferrii, například P. Ciferrii NRRL ¥—1031 F-60-10, pro tetraacetylíytosfingosin, Phaffia rhodozyma, například P. rhodozyma CBS 6938, pro astaxanthin, Saccharopolyspora erythraea pro erythromycin, K. lactis pro laktózu a Streptomyces natalensis pro natamycin.
Vynález rovněž počítá s použitím mikrobiálních kmenů, které se transformují s jedním nebo více funkčními geny a vzniká transformovaný kmen, který může přeexprimovat produkt již vyprodukovaný uvedeným kmenem, nebo vzniká transformovaný kmen, který může exprimovat produkt, který uvedený kmen přirozeně neprodukuje.
Je tedy ponecháno na volbě odborníka, který kmen pro transformaci zvolí, za předpokladu, že bude uvedený zvolený kmen vykazovat dobrý růst na chemicky definovaném médiu. Pro transformaci lze například zvolit kmen, který již byl podroben jednomu nebo více mutagenním ošetřením. Alternativně lze zvolit nemutagenovaný neboli standardní typ kmene. Kromě analýzy exprimační úrovně požadované sloučeniny by se u transformantů získaných transformací zvoleného kmene jedním nebo více funkčními geny měla analyzovat jejich schopnost růstu na chemicky definovaném médiu.
Příklady rekombinantních kmenů produkujících produkt, který není produkován uvedeným kmenem, jsou:
Streptomyces lividans, například 5. lividans TK21, obsahující expresní kazetu umožňující expresi glukózoizomerázy, přičemž gen kódující glukózoizomerázu pochází například z Actinoplanes missouriensis,
Penicillium chrysogenum, například P. chrysogenum CBS 455.95, obsahující jednu nebo více expresních kazet umožňujících expresi expandázy a případně hydroxy lázy a/nebo acetyltransferázy, přičemž geny kódující expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu, pocházejí například zAcremonium chrysogenum nebo Streptomyces clavuligerus, umožňují při použití kyseliny adipové (viz EP 532 341) nebo kyseliny 3-karboxymethyl-thiopropionové (viz WO 95/04 148) jako prekurzoru bočního řetězce produkci cefalosporinových sloučenin, například 7-ADCA nebo 7-ACA,
Aspergillus niger, například Aspergillus niger CBS 513.88, obsahující expresní kazetu umožňující expresi lidského laktoferrinu (viz WO 93/22 348) nebo bovinního chymosinu,
Kluyveromyces lactis obsahující expresní kazetu umožňující expresi bovinního chymosinu nebo fosfolipázy A2, inzulínu nebo rekombinantního lidského albuminu.
Příklady rekombinantních kmenů přeexprimujících enzym, který již uvedený produkt vyprodukoval, jsou:
- 10CZ 299290 B6
A. niger, například A. niger CBS 513.88, obsahující expresní kazetu umožňující přeexprimování fytázy (viz EP 420 358) nebo endoxylanázy I (viz EP 463 706).
Vynález je ilustrován na průmyslovém fermentačním procesu využívajícím chemicky definované médium, který se používá pro výrobu glukózoízomerázy rekombinantním kmenem Streptomyces, a na výhodném použití chemicky definovaného média při průmyslové fermentační výrobě kmene Penicillium v porovnání s použitím komplexního média.
Další příklady se týkají chemicky definovaných médií, která lze použít pro měření schopnosti růstu a produktivity kmene při růstu na takovém médiu v laboratorních podmínkách, které má identifikovat mikrobiální kmeny, vhodné pro fermentační výrobu hodnotné sloučeniny v chemicky definovaném médiu, v průmyslovém měřítku.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje náčrt pVGx.GIT; a
Obr. 2 znázorňuje vývoj celkově vyprodukované glukózoízomerázy v průběhu fermentace.
Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně stanoven přiloženými patentovými nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Průmyslová výroba glukózoízomerázy za použití kmene Streptomyces lividans
Konstrukce kmene Streptomyces produkujícího glukózoizomerázu
Glukózoizomerázový gen Actinoplanes missouriensis se nejprve klonoval jako 5,0kb DNA fragment v E. coli K12 kmene JM101.
Ukázalo se, že 1,7kb fragment uvnitř uvedeného 5,0kb fragmentu představuje úplnou kódovací sekvenci A. missouriensis glukózoízomerázy a její regulační oblast (rovněž viz Amore a Hollenberg (1989), Nucl. Acids Res. 17, 7515).
Glukózoizomerázový mutant vykazující zlepšenou termostabilitu se získal změnou glukózoizomerázového genu, tripletu, AAG kódujícího lysin v poloze 253 glukózoizomerázového proteinu na CGG kódující arginin. (Quax a kol., (1991), Bio/Technology 9), 738-742).
Pro klonování ve Streptomyces se jako vektor použil plazmid pIJ486 (Wart a kol. (1986), Mol. Gen. Genet. 203, 468-478). A. missouriensis DNA fragment s 1737 bazickými páry kódující glukózoizomerázu se zkombinoval s velkým Pstl DNA fragmentem pIJ486. Výsledný plazmid, označovaný jako pWGx.GIT, obsahoval v podstatě replikační oblast plazmidů plJlOl, thiostreptonově rezistentní gen a A. missouriensis DNA fragment kódující GIT. Schematická mapa plazmidů pWGx.GIT je znázorněna na obr. 1.
Kmen produkující glukózoizomerázu se konstruoval transformací kmene Streptomyces lividans TK21 (Hopwood a kol. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, Anglie) plazmidem pWGx.GIT.
- 11 CZ 299290 B6
Průmyslová výroba glukózoizomerázy
Pracovní buněčná banka produkčního kmene konstuovaného způsobem popsaným v příkladu 1 se připravila vybráním kolony rezistentní proti thiostreptonu a jejím pěstováním ve 20 ml bujónu Tryptone Soytone obsahujícím thiostrepton (50 mg/1) ve lOOml protřepávačce při 30 °C po dobu 40 až 48 hod a protřepáváním při frekvenci otáčení 280 min '.
Ekvivalentem podhoubí k 1 ml pracovní buněčné banky (čerstvým nebo skladovaným ve formě zmrazeného podhoubí při -80 °C) se v 500ml protřepávačce naočkuje do 100 ml očkovacího růstového média, které obsahuje 16 g/1 Bactopeptonu (Difco 0123/01), 4 g/1 Bacto soytone (Difco 0436/01), 20 g/1 hydrolyzátu kaseinu (Merck 2239), 10 g/1 trihydrátu hydrogenfosforečnanu draselného (Merck, Anal. Reagent), 16,5 g/1 monohydrátu glukózy, 0,6 g/1 sójového oleje a 50 mg/1 thiostreptonu. Pomocí hydroxidu sodného a/nebo kyseliny sirové se před sterilizací nastaví pH hodnota média na 7,0. Po sterilizaci se odděleně přidá glukóza a thiostrepton, přičemž thiostrepton se rozpustí v DMSO, v koncentraci 50 g/1 a sterilizuje filtrací přes 0,2 pm filtr Nalgene. Kultura se nechá růst 24 hodin při 30 °C v protřepávačce inkubátoru, při frekvenci otáčení 280 min'1.
ml Zcela vzrostlé kultury se přemístí do 6 1 očkovacího růstového média druhé fáze, které mělo podobné složení jako již zmíněné médium s výjimkou dvojnásobné koncentrace glukózy (33 g/1 monohydrátu glukózy), navíc přidaného činidla pro redukci pěnivosti (SAG5693, 0,6 g/1; silikonové činidlo od společnosti Basildon Company) a absence thiostreptonu. Glukóza se opět oddělí sterilizací v 50% roztoku a přidá do média po jeho sterilizaci (60 min, 121 °C). Kultura se nechala růst 36 hodin ve sterilizované probublávací koloně provzdušňované pomocí trysky obsahující 4 otvory s průměrem 2 mm, 840 1 sterilovaného vzduchu/hod, ve které se udržuje teplota 22 °C. Tuto fázi lze alternativně provádět v protřepávacích láhvích (například 12 x 500 ml média ve dvoulitrových Erlenmeyerových baňkách opatřených přepážkami) při podobných očkovacích poměrech a protřepávání při frekvenci otáčení 280 min”1 v orbitálním protřepávacím inkubátoru.
Zcela vzrostlá kultura se asepticky přemístí do očkovacího fermentoru, který obsahuje 4,5 m3 očkovacího média obsahujícího 16,3 kg monohydrátu kyseliny citrónové, 70,8 g heptahydrátu síranu železnatého, 109g heptahydrátu síranu zinečnatého, 109g monohydrátu síranu manganatého, 32,7 g hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 5,45 g dihydrátu molybdenanu sodného, 5,45 g kyseliny borité, 5,45 g pentahydrátu síranu měďnatého, 10,9 kg síranu amonného, 10,9 kg heptahydrátu stranu horečnatého, 463 g dihydrátu chloridu vápenatého, 1 090 g sójového oleje, 21,8 kg dihydrogenfosforečnanu draselného, 139 kg monohydrátu glukózy a 5,9 kg kvasnicového extraktu (pivovarnické kvasnice s 10 % Kjaldahl N, vztaženo ke hmotnosti sušiny). Médium se připraví následujícím způsobem. Všechny složky s výjimkou glukózy se v naznačeném pořadí vmísí do přibližně 2700 1 vodovodní vody. Hodnota pH se nastaví pomocí hydroxidu sodného a/nebo kyseliny fosforečné na 4,5 a médium se sterilizuje 60 minut při 122 °C. Glukóza se sterilizovala 60 minut při 122 °C v samostatné nádobě obsahující 1000 1 vody při pH 4,5. Po ochlazení obou částí se glukóza asepticky přemístila do očkovací nádoby. Po smísení obou částí se pH hodnota nastaví pomocí amoniaku na 7,0 a objem se doplní sterilní vodou na 4,5 m3. Teplota fermentace se nastaví na 30 °C a fermentor se provzdušňuje plynným amoniakem při průtoku 0,5 až 1,0 vvm za současného udržování pH 7,0 ± 0,1 a přetlaku 0,13 až 0,14 MPa.
Pěnivost se v případě potřeby kontroluje pomocí sterilizované směsi sójového oleje a silikonového činidla potlačujícího pěnivost, například SAG5693, které jsou ve směsi obsaženy v poměru 3:1. Koncentrace kyslíku se udržuje nastavením rychlosti míchadla (0,5 až 3 Kw/m3) nad 25 % vzduchovým nasycením. Kultura se přemístí do hlavní fermentace před tím, než se spotřebuje celý objem glukózy (jako ve všech předcházejících růstových fázích) a před tím, než rychlost spotřeby kyslíku přesáhne hodnotu 30 mmol/l objemu bujonu.hod.
Hlavní fermentační médium obsahuje 245,1 kg, monohydrátu kyseliny citrónové, 1062 g heptahydrátu síranu železnatého, 1634 g heptahydrátu síranu zinečnatého, 1634 g monohydrátu síranu manganatého, 490 g hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 82 g dihydrátu molybdenanu sodného, 82 g kyseliny borité, 82 g pentahydrátu síranu měďnatého, 163,4 kg síranu amonného, 163,4 kg heptahydrátu síranu horečnatého, 6,94 g dihydrátu chloridu vápenatého, 16,3 kg sójového oleje, 327 kg dihydrogenfosforečnanu draselného, 880 kg extraktu pivovarnických kvasnic (10% Kjaldahl N, vztaženo ke hmotnosti sušiny) a 556 kg monohydrátu glukózy. Médium se připraví způsobem popsaným pro fermentaci inokula (glukóza se sterilizovala odděleně). Pro glukózu lze alternativně použít cukrový sirup DE-95. Objem média, před naočkováním a po nastavení pH hodnoty na 7,0 pomocí amoniaku, je 65 m3.
Přívod glukózy se připraví jako 275 g glukózy/l až 550 g glukózy/1 přívodní roztok, buď jako monohydrát glukózy nebo jako glukózové ekvivalenty z >90-DE-sirupu. Hodnota pH se nastaví pomocí roztoku kyseliny fosforečné na 4,5 až 5,0. Sterilizace se provádí buď vsádkově (122 °C, 45 minut) nebo kontinuálně tepelným šokem nebo za použití filtrační sestavy.
Hlavní fermentace se udržuje při 30 °C ± 0,5 a pH 7,0 ±0,1 (pomocí amoniaku a kyseliny fosforečné). Proudění vzduchu se nastaví na 0,5 až 1,5 vvm, výhodně 0,7 vvm, přetlak se nastaví na 0,05 až 0,15 MPa a fermentor se míchá pomocí turbín Rushton při intenzitě 0,5 až 3 Kw/m3, s cílem zabránit poklesu koncentrace kyslíku pod hodnotu 0,2 mmol/1, měřeno na dolním konci míchadla. Glukóza se začíná přivádět, jakmile dojde k náhlému snížení rychlosti spotřeby kyslíku a ke zvýšení koncentrace rozpuštěného kyslíku a v momentu, kdy pH hodnota přejde ze 6,9 na 7,1. Koncentrace glukózy by měla být v tomto okamžiku mnohem nižší než 0,2 g/1.
Objem přiváděné glukózy, který odpovídá 93 kg glukózy/hod, se nejprve zvyšuje lineárně na 186 kg/hod, což je hodnota, které objem dosáhne 64 hod po zahájení dodávky glukózy. Po 100 hodinách přivádění glukózy se objem začne zvyšovat přibližně tak, že se během 200 hodin zavádění glukózy zvýší ze 186 kg/hod na 298 kg/hod.
Pěnivost se kontroluje buď kontinuálně zaváděním sterilního sójového oleje rychlostí 5,5 kg/hod nebo se do fermentace v průběhu prvních 100 hodin přidá každých 8 hodin 45 kg sterilního sójového oleje. V případě potřeby se provede další kontrola pěnivosti přidáním směsi sójového oleje a silikonového činidla snižujícího pěnivost, jakým je například SAG471 od společnosti Basildon, které jsou ve směsi obsaženy v poměru 3:1.
Koncentrace amoniaku se udržuje mezi 750 a 1500 mg/1 měřením prováděným každých 12 hodin a přidáním sterilního síranu amonného v množstvích odpovídajících 500 mg amoniaku/1, jakmile hladina poklesne pod 1000 mg/1.
Koncentrace fosforečnanu v kultivačním filtrátu by měla být udržována na hodnotě vyšší než 500 mg PO4/I přidáním sterilního dihydrogenfosforečnanu draselného v množstvích, která odpovídají 500 mg/I.
Produkci glukózoizomerázy lze měřit sklizením proteinů ajejich purifikaci z bujónu a následnými metodami pro určení proteinů, které jsou v daném oboru známy, nebo pomocí enzymatického testu aplikovaného na stabilizovaný vzorek bujónu. Vzorky bujónu se stabilizují odvážením 2 g bujónu a přidáním 5 ml stabilizačního roztoku obsahujícího 12 g/1 tris-hydroxymethylaminomethanu a 2,4 g/1 hexahydrátu chloridu kobaltnatého a následným třicetminutovým ohříváním při 73 °C. Po ochlazení se 0,42 ml stabilizovaného vzorku smísí s 0,8 ml glukózového roztoku (obsahujícího 27,25 g/1 Tris/HCl pufru pH 8,2, 67,56 g/1 glukózy, hexahydrát chloridu horečnatého, 22,33 g/1 2H2O.Na2-EDTA a 5 mg/1 Tritonu X-100) a inkubuje při 60 °C. Aktivita se stanoví měřením stupně konverze glukózy na fruktózu a vyjádři jako GU/g (1GU znamená množství enzymu potřebného pro vytvoření 1 pm fruktózy/min). Množství proteinu na kilogram bujónu lze stanovit pomocí specifické aktivity dvanácti jednotek na miligram proteinu.
Obr. 2 naznačuje celkové množství vyprodukovaného enzymu.
- 13 CZ 299290 Β6
Jak ukazuje tento příklad, v jednom výrobním cyklu prováděném plněným-vsádkovým způsobem se vyrobí 850 kg enzymu.
Příklad 2
Výroba penicilinu V
Konidiospory P. chrysogenum CBS 455.95 (nebo další vhodný kmen odvozený z Wisconsinu 54.1255 mutací a selekcí na nejvyšší produktivitu) se naočkovaly při 10E5-10E6 konidia/ml v produkčním médiu obsahujícím: 5 g/1 monohydrátu glukózy, 80 g/1 monohydrátu laktózy, 4,5 g/1 uhličitanu amonného, 1,1 g/1 síranu amonného, 2,9 g/1 síranu sodného, 5,2 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 4,8 g/1 trihydrátu dihydrogenfosforečnanu draselného, 10 ml/1 roztoku stopových prvků (150 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 15 g/1 heptahydrátu síranu železnatého, 150 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 0,0075 g/1 kyseliny borité, 0,24 g/1 pentahydrátu stranu měďnatého, 0,375 g/1 heptahydrátu síranu kobaltnatého, 1,5 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého, 2,28 g/1 monohydrátu stranu manganatého a 0,99 g/1 dihydrátu chloridu vápenatého) a 75 ml/1 10% roztoku fenoxyacetátu draselného pH 7. (Hodnota pH před sterilizací 6,5.)
Kultura se inkubuje 144 až 168 hodin při 25 °C v orbitální protřepávačce při frekvenci otáčení 280 min“1. Na konci fermentace se podhoubí odstraní odstřeďováním nebo filtraci a stanoví se jeho množství. Médium se analyzuje na penicilín HPLC metodami, které jsou v daném oboru dobře známy.
Příklad 3
Průmyslová fermentace penicilinu komplexními a definovanými médii
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54.1255 se optimalizoval pro růst a produkci penicilinu na chemicky definovaném médiu mutací a selekcí na definovaná média, které se provádějí způsobem popsaným v příkladu 2. Plněné-vsádkové fermentace se provádějí v objemu 60 m3 a za použití komplexního média, popsaného Hersbachem a kol. (Biotechnology of Industrial Antibiotics, str. 45-140, i Marcel Dekker lne., 1984, tabulka 4, médium B zahrnující soli, které byly zmíněny ve sloupci médium A), které obsahuje 50 kg/m3 pevných kukuřičných výluhů. Paralelně s tím se provádí fermentace v definovaném médiu popsaném v příkladu 2, jehož dávkování se zdvojnásobí z důvodu vysoké buněčné hustoty těchto plněných-vsádkových fermentací a současně se vynechá laktóza a močovina. Glukóza se přivádí do fermentoru, ve kterém se udržuje koncentrace glukózy nižší než 2 g/1, s cílem vyloučit represi glukózy. Za účelem regulace pH hodnoty a koncentrace amoniaku, síranu a kyseliny fenyloctové v požadovaných rozmezích (Hersbach, 1984) se do fermentoru zavádí amoniak, síran diamonný a kyselina fenyloctová.
Protože přenos kyslíku představuje důležitý parametr určující úspornost průmyslového fermentačního procesu, analyzuje se účinnost výše uvedených fermentačních procesů na základě stanovení rozsahu kyslíkového přenosu v každém procesu.
Vhodným měřítkem kyslíkového přenosu, dosaženého u fermentačního procesu, je relativní hodnota kLa, stanovená v rámci jednoho systému. Hodnota kLa je definována jako koeficient kyslíkového přenosu a vypočte se podle van't Rieta a Trampera (Basic Biorector Design, Marcel Dekker lne. (1991), str. 236-273).
Ukázalo se, že kapacita kyslíkového přenosu, vypočtená jako hodnota kLa, je během hlavní části fermentace v chemicky definovaném médiu o 10 % až 20 % vyšší než v komplexním médiu.
- 14CZ 299290 Β6
Příklad 4
Výroba 7-ADCA
Způsob popsaný v příkladu 2 se modifikuje použitím P. chrysogenum CBS 455.95 (nebo dalšího vhodného kmene odvozeného z Wisconsinu 54.1255 mutací a selekci pro zvýšení produktivity), který se transformuje expandázovou expresní kazetou, ve které expandázu kódující oblast poskytuje IPNS promotor, popsaný v EP 532 341, a použitím 10% roztoku adípátu draselného namísto fenoxyacetátu, přičemž modifikace výše popsaného média obsahuje 400 ml 10% roztoku adipátu draselného pH 5,5 namísto fenoxyacetátu (pH média před sterilizací je 5,5 namísto 6,5).
Výsledný adipoyl-7-ADCA se následně použitím enzymatického deacylačního procesu, který je v podstatě popsán v příkladu 4 nebo 5 patentového dokumentu WO 95/04 148, převede na 7-ADCA.
Příklad 5
Výroba lovastatinu
Konidiospory nebo kmen Aspergillus terreus CBS 456.95 (nebo kmeny z něj odvozené mutací a selekcí na vysokou produktivitu) se naočkují při 10E5-10E6 konidia/ml v produkčním médiu obsahujícím: 40 g/1 dextrózy, 2,2 g/1 octanu amonného, 4 g/1 síranu sodného, 3,6 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 35,1 g/1 trihydrátu hydrogenfosforečnanu draselného a 10 ml/l roztoku stopových prvků (viz výše, příklad 2).
Kultura se inkubuje 144 až 168 hodin při 28 °C v orbitální protřepávaěce při frekvenci otáčení 220 min*1. Na konci fermentace se podhoubí odstraní odstřeďováním nebo filtrací a stanoví se jeho množství. Médium se analyzuje na lovastatin pomocí HPLC metod, které jsou v daném oboru známy.
Příklad 6
Výroba kyseliny klavulanové
Kmen Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 nebo jeho mutant se naočkuje do prekultivačního média sestávajícího z: 2,75 g/1 stranu amonného, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 heptahydrátu stranu horečnatého, 0,01 g/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 21 g/1 kyseliny 3-(N-morfolino)propansulfonové, 19,9 g/1 glycerolu, 5,5 g/1 sukcinátu sodného a 0,06 ml/l roztoku stopových prvků (2,8 g/1 heptahydrátu stranu zinečnatého, 2,7 g/1 citrátu aminoželezitého, 0,125 g/1 pentahydrátu stranu měďnatého, 1 g/1 monohydrátu síranu manganatého, 0,1 g/1 hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 0,16 g/1 dekahydrátu borátu sodného a 0,054 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného).
Kultura se inkubuje 48 až 72 hodin při 28 °C v orbitální protřepávaěce při frekvenci otáčení 220 min“1 a použije pro naočkování 20 objemů produkčního média obsahujícího: 2 g/1 síranu amonného, 4 g/1 asparaginu, 1,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 0,01 g/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 21 g/1 kyseliny 3-(N-morfolino)propansulfonové, 19,9 g/1 glycerolu, 5,5 g/1 sukcinátu sodného, 0,06 ml/l roztoku stopových prvků (viz výše), 0,5 g/1 heptahydrátu síranu železnatého, 0,1 g/1 tetrahydrátu chloridu manganatého a 0,1 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého.
Naočkování trvá 144 hodin a výhodně se provádí v 500ml Erlenmeyerově baňce opatřené přepážkami s 50 ml kultivačního objemu. Na konci fermentace se podhoubí odstraní odstřeďováním nebo filtrací a stanoví se jeho množství. Filtrát se testuje pomocí HPLC metod, které jsou v daném oboru známy.
Příklad 7
Výroba amyloglukosidázy
Kmen Aspergillus niger CBS 513.88 nebo jeho mutant se naočkuje při 105 až 106 konidiospor/ml do média pro klíčení sestávajícího z: 0,75 g/1 trihydrátu hydrogenfosforečnanu draselného, 6,6 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 5,3 g/1 trihydrátu citrátu sodného, 0,45 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 25 g/1 monohydrátu glukózy, 8 g/1 síranu amonného, 0,5 g/1 chloridu sodného, 0,5 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 0,1 g/1 heptahydrátu síranu železnatého, 0,05 g/1 heptahydrátu stranu zinečnatého, 0,005 g/1 chloridu vápenatého, 0,0025 g/1 pentahydrátu síranu měďnatého, 0,0005 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 0,0005 g/1 kyseliny borité, 0,0005 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného, 0,13 g/1 EDTA a 3 g/1 Tweenu 80. V případě nutnosti lze pro zlepšení klíčivosti přidat 50 μ/ml argininu a/nebo prolinu.
Kultura se inkubuje 48 až 72 hodin v orbitální protřepávačce při 33 °C a frekvenci otáčení 295 min-1. Po inkubaci se kultura použije k naočkování 10 až 20 objemů produkčního média sestávajícího z: 1-5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 53 g/1 trihydrátu citrátu sodného, 4,05 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 70 g/1 dextrózových polymerů, 8 g/1 stranu amonného, 0,5 g/1 chloridu sodného, 0,5 g/1 heptahydrátu stranu horečnatého, 0,1 g/1 heptahydrátu stranu železnatého, 0,05 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého, 0,005 g/1 chloridu vápenatého, 0,0025 g/1 pentahydrátu síranu měďnatého, 0,0005 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 0,0005 g/1 kyseliny borité, 0,0005 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného, 0,13 g/1 EDTA.
V inkubaci se pokračuje 96 hodin, výhodně v 500ml Erlenmeyerově baňce obsahující 100 ml média. Na konci fermentace se podhoubí odstraní odstřeďováním nebo filtraci a určí se jeho množství. Filtrát se testuje na amylolytickou aktivitu.
Příklad 8
Výroba astaxanthinu
Kmen Phaffia rhodozyma CBS 6938 nebo jeho mutant se naočkuje do 25 ml prekultivačního média obsahujícího 10 g/1 kvasnicového extraktu, 20 g/1 peptonu a 20 g/1 glukózy. Kultura se inkubuje 72 hodin při 20 °C v lOOml Erlenmeyerově baňce s přepážkou, umístěné v orbitální protřepávačce, při frekvenci otáčení 275 min1 * * * V.
ml Prekultury se následně použije k naočkování 100 ml produkčního média obsahujícího: 30 g/1 glukózy, 4,83 g/1 chloridu amonného, 0,88 g/1 heptahydrátu stranu horečnatého, 0,06 g/1 chloridu sodného, 0,15 g/1 hexahydrátu chloridu vápenatého, 0,3 ml/1 roztoku stopových prvků (50 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 90 g/1 hexahydrátu síranu železnatoamonného, 16,7 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého, 2,5 g/1 pentahydrátu síranu měďnatého, 2 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 2 g/1 kyseliny borité, 2 g/1 dihydrátu mangananu sodného, 0,5 g/1 jodidu draselného, v 0,4N kyselině sírové), 1 až 5 ml/1 vitaminového roztoku (40 g/1 myo-inositolu, 2 g/1 kyseliny nikotinové, 2 g/1 Ca-D-pantothenátu, 2 g/1 vitaminu Bl, 1,2 g/1 kyseliny p-aminobenzoové, 0,2 g/1 vitaminu B6, 0,008 g/1 biotinu, v 0,07N kyselině sírové), 0,04 g/1 Pluronicu, 1 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného a 20 g/1 hydrogenfitalátu draselného (pH před sterilizací je 5,4)·
V inkubaci se pokračuje 96 hodin, výhodně v 500ml Erlenmeyerově baňce s přepážkou. Na konci fermentace se extrakcí rozpouštědla a měřením optické hustoty extraktu, při 470 až 490 nm, určí obsah astaxanthinu v biomase.
- 16CZ 299290 Β6
Příklad 9
Výroba kyseliny arachidonové
Jedna 1 ml lahvička obsahující suspenzi kmene Mortierella alpina ATCC 16266, skladovaná při -80 °C se asepticky otevřela a její obsah se použil k naočkování 500 ml produkčního média obsahujícího: 70 g/1 glukózy, 0,5 g/1 kvasnicového extraktu, 3,0 g/1 dusičnanu amonného, 7,2 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 1,5 g/1 heptahydrátu stranu horečnatého a 0,3 ml/1 roztoku stopových prvků (50 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 90 g/1 hexahydrátu síranu železnatoamonného, 16,7 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého, 2,5 g/1 pentahydrátu síranu měďnatého, 2 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 2 g/1 kyseliny borité, 2 g/1 dihydrátu mangananu sodného, 0.5 g/1 jodidu draselného, v 0,4N kyselině sírové) (pH před sterilizací 7,0).
Kultura se při 25 °C inkubuje 72 hodin ve dvoulitrové protřepávačce s přepážkami, umístěné v orbitální protřepávačce při frekvenci otáčení 250 min”1. Na konci fermentace se množství biomasy a obsah kyseliny arachidonové v biomase stanoví po odstředění, vysušení vymražením a extrakci rozpouštědla plynovou chromatografií, která je v daném oboru dobře známa.
Příklad 10
Výroba erythromycinu
Kmen Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 nebo jeho mutant (vybraný pro zvýšenou produktivitu) se naočkuje do 25 ml prekultivačního média obsahujícího: 15 g/1 rozpustného škrobu, 5 g/1 chloridu sodného, 15 g/1 sójové mouky, 10 g/1 uhličitanu vápenatého, 5 g/1 kvasnicového extraktu, 5 g/1 pevných kukuřičných výluhů a 670 gl lg/1 roztoku hexahydrátu chloridu kobaltnatého.
Kultura se při 32 až 34 °C 3 dny inkubuje ve lOOml protřepávací baňce bez přepážek umístěné v protřepávacím inkubátoru při frekvenci otáčení 250 min“1.
0,4 ml Kultury se naočkovalo do 25 ml sterilního produkčního média obsahujícího: 2 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 2 g/1 síranu amonného, 2 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 0,085 g/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 0,25 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 5 g/1 HEPES (= N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonová kyselina)), 1,5 g/1 glukózy, 20 g/1 rozpustného škrobu, 0,4 g/1 sójového oleje a 3,6 ml/1 roztoku stopových prvků (62,5 g monohydrátu kyseliny citrónové, 0,8215 g heptahydrátu síranu železnatého, 0,0625 g pentahydrátu síranu měďnatého, 0,375 g monohydrátu chloridu kobaltnatého, 0,0625 g kyseliny borité, 1,25 g heptahydrátu síranu zinečnatého, 1,25 g monohydrátu síranu manganatého a 0,0625 g dihydrátu molybdenanu sodného, ve 250 ml destilované vody). pH = 7,0. Do každé baňky se přidá 0,25 ml n-propanolu.
Kultura se inkubuje při 32 až 34 °C 5 dní ve lOOml protřepávačce s přepážkami umístěné v protřepávacím inkubátoru při frekvenci otáčení 300 min‘í. Na konci fermentace se bujón odstředí a stanoví se množství biomasy. Obsah erythromycinu v supematantu se stanoví v daném oboru známými HPLC metodami.
Příklad 11
Výroba β-karotenu
Suspenze výtrusů kmene Blakeslea trispora CBS 130.59 se použije pro naočkování 114 ml prekultivačního média (10 g/1 kvasnicového extraktu, 20 g/1 peptonu, 20 g/1 glukózy) v 500ml
- 17CZ 299290 B6 protřepávací baňce bez přepážek. Prekultura se inkubovala 42 hodin na rotační protřepávačce při frekvenci otáčení 250 min 1 a teplotě 26 °C. Biomasa se sklidí filtrací a třikrát propláchne 100 ml sterilované demineralizované vody, čímž se odstraní složky prekultivačního média. Potom se biomasa homogenizuje míšením, dokud nezůstanou pouze malé fragmenty, a resuspenduje ve 40 ml demineralizované vody.
Produkční médium se připraví ve lOOml dílech v 500ml protřepávacích baňkách s přepážkami. Složení produkčního média je následující: 40 g/l glukózy, 2 g/1 monohydrátu asparaginu, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného a 0,25 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého. Dále se přidá roztok stopových prvků (0,3 ml/1), který má následující složení: 50 g/1 monohydrátu kyseliny citrónové, 90 g/1 hexahydrátu síranu železnatoamonného, 16,7 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého, 2,5 g/1 pentahydrátu síranu měďnatého, 2 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 2 g/1 kyseliny borité, 2 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného a 0,5 g/1 jodidu draselného, v 0,4N kyselině sírové. Před sterilizací se pH hodnota média nastaví na 6,2. Baňky se sterilizují 20 minut při 120 °C a po sterilizaci se přidá 0,05 ml 1 mg/ml roztoku thiaminhydrochloridu v demineralizované vodě (sterilizované filtrací).
Produkční kultury se naočkují 0,5 až 10 ml suspenze výše připraveného fragmentovaného podhoubí. Kultury se inkubují 139 hodin na rotační protřepávačce (frekvence otáčení 250 min'1, 26 °C). Houbová biomasa se sklidí filtrací, promyje demineralizovanou vodou s cílem odstranit složky média a kvantifikuje.
Množství vyrobeného β-karotenu se určí extrakcí acetonu a následným měřením vymizení acetonové frakce ve spektrofotometru při 450 nm.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (18)

1. Způsob výroby β-laktamové sloučeniny, vyznačený tím, že zahrnuje fermentaci vláknitého mikrobiálního kmene v průmyslovém měřítku ve fermentačním médiu, kterým je chemicky definované médium v podstatě sestávající z chemicky definovaných složek, a izolaci β-laktamové sloučeniny z fermentačního bujónu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že chemicky definované médium obsahuje množství komplexního zdroje uhlíku a/nebo dusíku, které je nejvýše rovné okolo 10 % z celkového množství uhlíku a/nebo dusíku (Kjeldahlův N), které je přítomno v chemicky definovaném médiu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že chemicky definované složky chemicky definovaného média zahrnují zdroj uhlíku zvolený ze skupiny sestávající z cukrů, například glukózy, laktózy, fruktózy, sacharózy, maltodextrinů, škrobu a inulinu, glycerolu, rostlinných olejů, uhlovodíků, alkoholů, například methanolu a ethanolu, organických kyselin, například acetátu a vyšších alkanových kyselin; a zdroj dusíku zvolený ze skupiny sestávající z močoviny, amoniaku, dusičnanu, amonných solí, například síranu amonného, fosforečnanu amonného a dusičnanu amonného, a aminokyselin, například glutamátu a lysinu.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že zdrojem uhlíku je glukóza a zdrojem dusíku je amoniak a/nebo amonná sůl.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že se fermentace provádí diskontinuálně, opakovaně diskontinuálně, procesem fed-batch, opakovaným procesem fedbatch nebo kontinuálně.
- 18CZ 299290 B6
6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že se fermentace provádí procesem fedbatch.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že se do procesu zavádí zdroj uhlíku a/nebo dusíku.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že zdrojem uhlíku je glukóza a zdrojem dusíku je amoniak a/nebo amonná sůl.
9. Způsob podle některého z nároků laž8, vyznačený tím, že vláknitým kmenem je houba.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačený t í m , že houbou je kmen Penicillium.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že houbou je Penicillium chrysogenum.
12. Způsob podle některého z nároků laž8, vyznačený tím, že vláknitým kmenem je bakterie.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačený tím, že bakterií je Actinomycetes.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačený tím, že Actinomycetes je Streptomycetes clavuligerus a β-laktamovou sloučeninou je kyselina klavulanová.
15. Způsob přípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene produkujícího β-laktamovou sloučeninu, kterou lze fermentovat v průmyslovém měřítku v chemicky definovaném médiu, vyznačený tím, že zahrnuje podrobení vhodného rodičovského kmene mutagennímu ošetření zvolenému ze skupiny zahrnující fyzikální prostředky a chemické mutageny a/nebo DNA transformaci; analyzování výsledných mutantů a/nebo transformantů podle jejich schopnosti růstu na chemicky definovaném médiu a podle jejich produktivity v případě uvedené βlaktamové sloučeniny; a výběr mutantů a/nebo transformantů, které mají dobrou schopnost růstu na chemicky definovaném médiu a/nebo zvýšenou produktivitu v případě uvedené β-laktamové sloučeniny v porovnání s rodičovským kmenem.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačený tím, že rodičovský kmen se zvolí ze skupiny sestávající z kmenů, které mají dobrou schopnost růstu na chemicky definovaném médiu, ale které potřebují zvýšit produktivitu.
17. Způsob podle nároku 15, vyznačený tím, že se rodičovský kmen zvolí ze skupiny sestávající z kmenů, které máji vysokou produktivitu v případě požadované β-laktamové sloučeniny, ale relativně špatnou schopnost růstu na chemicky definovaném médiu.
18. Použití chemicky definovaného fermentačního média pro výrobu β-laktamové sloučeniny fermentaci vláknitého mikrobiálního kmene v průmyslovém měřítku.
2 výkresy
- 19CZ 299290 B6
Obr. 1 replOl PIJ101 specifický replikační protein orilOl pIJlOl původ replikace tsr gen. thiostreptonové rezistence
GIT kódující oblast pro GIT (mutant A. míssouriensís
CZ0295499A 1997-02-20 1998-02-20 Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia CZ299290B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97200494 1997-02-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ295499A3 CZ295499A3 (cs) 2000-04-12
CZ299290B6 true CZ299290B6 (cs) 2008-06-11

Family

ID=8228032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0295499A CZ299290B6 (cs) 1997-02-20 1998-02-20 Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia

Country Status (17)

Country Link
US (3) US20020039758A1 (cs)
EP (4) EP2256211A3 (cs)
JP (4) JP4217277B2 (cs)
KR (1) KR100576576B1 (cs)
CN (2) CN100351386C (cs)
AT (1) ATE327340T1 (cs)
AU (1) AU6400098A (cs)
BR (1) BR9807362A (cs)
CZ (1) CZ299290B6 (cs)
DE (1) DE69834630T2 (cs)
ES (1) ES2262228T3 (cs)
ID (1) ID23995A (cs)
PL (1) PL335227A1 (cs)
PT (1) PT970236E (cs)
RU (1) RU99120113A (cs)
SI (1) SI0970236T1 (cs)
WO (1) WO1998037179A2 (cs)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
EP2256211A3 (en) * 1997-02-20 2011-02-16 DSM IP Assets B.V. Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
US6004784A (en) * 1998-09-14 1999-12-21 General Electric Co. Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids
US6440708B1 (en) * 1998-09-29 2002-08-27 Dsm N.V. Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia
EP1251744B2 (en) * 2000-01-28 2015-08-26 DSM IP Assets B.V. Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acids by high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors
DE10106493B4 (de) * 2001-02-13 2010-11-04 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren
ATE420161T1 (de) 2002-07-01 2009-01-15 Novozymes As Monopropylenglykol als fermentationszusatz
KR100454508B1 (ko) * 2002-07-05 2004-11-03 허명준 소취기능과 다제내성균에 대한 멸균력을 갖는 자연기능수및 그의 제조방법
US6955892B2 (en) * 2002-11-12 2005-10-18 Akzo Nobel N.V. Feeding processes for fermentation
DE10317877A1 (de) * 2003-04-17 2004-11-18 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur Herstellung von Sporidiobolus ruineniae Stämmen mit verbesserter Coenzym Q10-Produktion
JP2006528970A (ja) 2003-05-28 2006-12-28 デーエスエム アイピー アセッツ ベー． ヴェー． セフェム化合物
WO2005078115A1 (en) 2004-02-04 2005-08-25 Merck & Co., Inc. Process for large scale production of plasmid dna by e. coli fermentation
NZ552133A (en) * 2004-06-16 2009-05-31 Dsm Ip Assets Bv Fermentation process using FABA beans as nitrogen source
WO2006102342A2 (en) 2005-03-18 2006-09-28 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
WO2006100292A1 (en) * 2005-03-24 2006-09-28 Dsm Ip Assets B.V. Process for microbial production of a valuable compound
US7990102B2 (en) * 2006-02-09 2011-08-02 Karl Frederick Scheucher Cordless power supply
KR100839874B1 (ko) * 2006-07-07 2008-06-19 자연과생명기술(주) 분말 발효제 제조 방법
EP2078092A2 (en) 2006-09-28 2009-07-15 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
EP2126100B1 (en) 2007-03-21 2012-11-14 DSM IP Assets B.V. Improved method for homologous recombination
BRPI0816290A2 (pt) * 2007-09-05 2014-10-14 Microbia Inc Isolamento de micro-organismos formadores de péletes
WO2010015627A2 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Adipoyl-7-adca producing strains
EP2213723A1 (en) 2009-01-30 2010-08-04 Novozymes A/S Isomaltose for fungus fermentation
WO2010097436A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Novozymes A/S Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production
BR112012000078A2 (pt) 2009-07-03 2017-03-01 Dsm Ip Assets Bv cepas de talaromyces e composições de enzima.
EP2955221A1 (en) 2009-11-04 2015-12-16 DSM IP Assets B.V. Talaromyces transformants
US8889395B2 (en) 2010-03-30 2014-11-18 Novozymes A/S Crystal metabolite recovery
KR101013456B1 (ko) * 2010-11-24 2011-02-14 주식회사 그린바이오텍 심플리실리움 라멜리콜라 ｂｃｐ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법
WO2012088276A2 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 J3H, Inc Phospholipid production and composition manipulation through media manipulation
US9347080B2 (en) 2011-01-31 2016-05-24 Novozymes A/S Use of browned glucose as a feed substrate
EP2683732B1 (en) 2011-03-11 2016-08-24 DSM IP Assets B.V. Vector-host system
US10160989B2 (en) * 2011-05-02 2018-12-25 Renewuel Llc System and method of co-cultivating microalgae with fungus
EP2742145A1 (en) 2011-08-12 2014-06-18 Novozymes A/S Reduction of culture viscosity by manganese addition
US20150197760A1 (en) 2012-06-19 2015-07-16 Dsm Ip Assets B.V. Promoters for expressing a gene in a cell
BR112014029846A2 (pt) 2012-07-06 2017-06-27 Novozymes As método de inativação da célula hospedeira microbiana em um caldo de fermentação
EP2889369B1 (en) * 2012-08-24 2020-03-25 Yamaguchi University Yeast culture medium
US20150291656A1 (en) 2012-11-01 2015-10-15 Novozymes A/S Method for removal of dna
EP3447136B1 (en) 2013-02-04 2020-05-13 DSM IP Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
US9943545B2 (en) * 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
WO2014202622A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202624A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202620A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202621A1 (en) 2013-06-20 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
EP2826384A1 (de) 2013-07-16 2015-01-21 Evonik Industries AG Verfahren zur Trocknung von Biomasse
JP6393898B2 (ja) * 2014-08-03 2018-09-26 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 酵母の培養方法
CN106793803B (zh) 2014-10-02 2021-03-09 赢创运营有限公司 通过挤压含pufa的生物质来制备含pufa的饲料的方法
WO2016050552A1 (de) 2014-10-02 2016-04-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur herstellung einer pufas enthaltenden biomasse mit hoher zellstabilität
CA2958439C (en) 2014-10-02 2022-09-20 Evonik Industries Ag Feedstuff of high abrasion resistance and good stability in water, containing pufas
ES2900848T3 (es) 2014-10-02 2022-03-18 Evonik Operations Gmbh Procedimiento para la producción de un pienso
BR112018011567A2 (pt) 2015-12-09 2018-11-27 Basf Se método de purificação de uma proteína de interesse, e, uso de um método.
CN105505829A (zh) * 2016-01-20 2016-04-20 黑龙江省中医药科学院 发酵类中药优势菌群选择性培养基及其制备方法和发酵类中药优势菌的筛选方法
WO2017178529A1 (en) 2016-04-12 2017-10-19 Bioscienz Holding B.V. Pseudomonas strains and consortia thereof for use in protection against plant diseases
US20190292514A1 (en) 2016-07-14 2019-09-26 Basf Se Fermentation medium comprising chelating agent
JP2018023356A (ja) * 2016-08-04 2018-02-15 三洋化成工業株式会社 有用物質の生産方法
CN110199014A (zh) 2016-08-11 2019-09-03 维姆德拉特咨询有限公司 来自嗜热真菌的单细胞蛋白质
CN111032856A (zh) 2017-08-07 2020-04-17 诺维信公司 基于pH的FCA控制的用途
CN110452945B (zh) * 2018-05-07 2023-06-23 华东理工大学 利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法
CN114127256A (zh) 2019-02-20 2022-03-01 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
US20220186177A1 (en) 2019-02-20 2022-06-16 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
EP3983425A1 (en) 2019-06-13 2022-04-20 Basf Se Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation
CN110283854B (zh) * 2019-08-08 2021-07-16 内蒙古金达威药业有限公司 一种发酵培养基及其应用和利用三孢布拉霉菌发酵制备番茄红素的方法
WO2021122687A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Basf Se Increasing space-time-yield, carbon-conversion-efficiency and carbon substrate flexibility in the production of fine chemicals
CN115135762A (zh) 2019-12-20 2022-09-30 巴斯夫欧洲公司 降低萜烯的毒性和增加微生物的生产潜力
KR102264895B1 (ko) * 2019-12-27 2021-06-15 명지대학교 산학협력단 메탄올을 소비하는 Aspergillus 균주를 이용한 유기산 생산 공정
US20230212634A1 (en) 2020-01-14 2023-07-06 The Protein Brewery B.V. Expression of Ovalbumin and its Natural Variants
EP4093850A1 (en) 2020-01-23 2022-11-30 The Protein Brewery B.V. Use of a defoamer for maintaining dispersed morphology in submerged fungal fermentation
WO2021176033A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 The Protein Brewery B.V. Improved single-cell protein production using antioxidants
MX2022011034A (es) 2020-03-06 2022-10-13 The Protein Brewery B V Pasteurizacion de biomasa microbiana apta para aplicaciones alimentarias.
CN111548944B (zh) * 2020-06-05 2022-06-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用
CA3181847A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Elisa LEUNE Novel food
BR112023003778A2 (pt) 2020-09-04 2023-03-28 Basf Se Método para separar uma molécula de interesse de um agente antiespumante em um caldo de fermentação, e, processo para purificar uma molécula de interesse de um caldo de fermentação
MX2023003276A (es) 2020-09-22 2023-05-03 Basf Se Método para recuperar una proteína de un caldo de fermentación que comprende un alto grado de células lisadas.
WO2023118565A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Novozymes A/S Reduction of residual dna in microbial fermentation products
WO2023242273A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Newmilkbuzz B.V. Expression of milk caseins in filamentous fungi
EP4349993A1 (en) 2022-10-06 2024-04-10 SecondCircle ApS Optimised fermentation of anaerobic bacteria
WO2024110509A1 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Newmilkbuzz B.V Improved casein secretion by non-mammalian host cells
WO2024133849A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 The Protein Brewery B.V. Ovalbumin fermentation

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700558A (en) * 1967-11-20 1972-10-24 Lepetit Spa Production of l-tryptophan by fermentation
FR2280709A1 (fr) * 1974-07-30 1976-02-27 Ici Ltd Production de glucose isomerase
US4556559A (en) * 1974-04-20 1985-12-03 Beecham Group P.L.C. Antibiotics
US5494808A (en) * 1994-09-15 1996-02-27 Merck & Co., Inc. Defined medium OMPC fermentation process

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3205150A (en) * 1961-11-27 1965-09-07 Ca Nat Research Council Hydroxy fatty acid production
US4164445A (en) * 1975-03-27 1979-08-14 E. R. Squibb & Sons, Inc. Ethanol as the major source of carbon and energy in penicillin production
US4077842A (en) * 1976-03-19 1978-03-07 Cory Robert Paul Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate
AU535944B2 (en) * 1979-06-15 1984-04-12 Merck & Co., Inc. Hypocholestermic fermentation products from aspergillus
US4231938A (en) * 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4348481A (en) * 1979-11-29 1982-09-07 Institute Po Microbiologia Method of obtaining glucose isomerase
US4374929A (en) * 1980-07-14 1983-02-22 Standard Oil Company (Indiana) Production of xanthan gum from a chemically defined medium introduction
JPS59205979A (ja) * 1983-05-11 1984-11-21 Agency Of Ind Science & Technol 微生物菌体の製造方法
AU600655B2 (en) * 1984-10-27 1990-08-23 Beecham Group Plc Preparation of clavulanic acid and its salts and esters
JP2746371B2 (ja) * 1987-12-21 1998-05-06 サントリー株式会社 ビスホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US5376536A (en) * 1988-07-15 1994-12-27 Gist-Brocades, N.V. Glucose isomerase enzymes and their use
EP0351029B1 (en) * 1988-07-15 2002-03-06 Genencor International, Inc. Novel glucose isomerase enzymes and their use
US5290690A (en) * 1988-07-15 1994-03-01 Plant Genetic Systems Methods and means for controlling the stability of proteins
CH680448A5 (cs) * 1990-01-17 1992-08-31 Nestle Sa
US5658767A (en) * 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5318896A (en) * 1991-09-11 1994-06-07 Merck & Co., Inc. Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA)
NZ245713A (en) * 1992-02-10 1994-12-22 Novopharm Ltd Production of the antibiotic lovastatin from genetically engineered aspergillus strains
GB9220670D0 (en) * 1992-09-30 1992-11-11 Unilever Plc Cosmetic composition
FR2700552B1 (fr) * 1993-01-19 1995-04-21 Pernod Ricard Mutants de Phaffia rhodozyma, procédé de production de beta-carotène et utilisation de biomasse riche en beta-carotène.
DE69434023D1 (de) * 1993-07-30 2004-10-28 Dsm Ip Assets Bv Verfahren zur effizienten Herstellung von 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA und 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA
JP2677949B2 (ja) * 1993-08-26 1997-11-17 常盤薬品工業株式会社 アラキドン酸含有健康食品
US5583019A (en) * 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
ATE303726T1 (de) * 1995-05-30 2005-09-15 Suntory Ltd Hühnereier mit einem hohen anteil an mehrfach ungesättigten fettsäuren, verfahren für deren herstellung und die verwendung derselben
US5731165A (en) * 1995-06-02 1998-03-24 Gist-Brocades, B.V. Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G
SI9500238A (en) * 1995-07-27 1997-02-28 Krka Tovarna Zdravil Procedure for the production of lovastatin
US5989877A (en) * 1995-08-03 1999-11-23 Gist-Brocades B.V. Selective process for the deacylation of acylated compounds
US20030143659A1 (en) * 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
US6255505B1 (en) * 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
EP2256211A3 (en) * 1997-02-20 2011-02-16 DSM IP Assets B.V. Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
ATE408701T1 (de) * 1997-03-04 2008-10-15 Suntory Ltd Verfahren zur herstellung von hochungesättigten fettsäuren und hochungesättigte fettsäuren enthaltendes lipid

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700558A (en) * 1967-11-20 1972-10-24 Lepetit Spa Production of l-tryptophan by fermentation
US4556559A (en) * 1974-04-20 1985-12-03 Beecham Group P.L.C. Antibiotics
FR2280709A1 (fr) * 1974-07-30 1976-02-27 Ici Ltd Production de glucose isomerase
US5494808A (en) * 1994-09-15 1996-02-27 Merck & Co., Inc. Defined medium OMPC fermentation process

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mao, W. et al.: "High production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in a fed-batch fermentation using a synthetic medium" Journal of Industrial Microbiology vol.11, 1-6, 1992 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE69834630D1 (de) 2006-06-29
JP2014087365A (ja) 2014-05-15
WO1998037179A2 (en) 1998-08-27
EP2345734A2 (en) 2011-07-20
JP2001512970A (ja) 2001-08-28
RU99120113A (ru) 2002-12-27
AU6400098A (en) 1998-09-09
ATE327340T1 (de) 2006-06-15
WO1998037179A3 (en) 1999-01-14
KR100576576B1 (ko) 2006-05-04
SI0970236T1 (sl) 2006-10-31
DE69834630T2 (de) 2007-04-19
CZ295499A3 (cs) 2000-04-12
EP1690945A3 (en) 2009-06-03
BR9807362A (pt) 2000-04-18
CN1127571C (zh) 2003-11-12
US20020039758A1 (en) 2002-04-04
ID23995A (id) 2000-06-14
EP2256211A3 (en) 2011-02-16
US20140342396A1 (en) 2014-11-20
EP0970236B1 (en) 2006-05-24
JP2008200053A (ja) 2008-09-04
JP4469401B2 (ja) 2010-05-26
PT970236E (pt) 2006-08-31
EP1690945A2 (en) 2006-08-16
CN100351386C (zh) 2007-11-28
JP2009195254A (ja) 2009-09-03
ES2262228T3 (es) 2006-11-16
CN1248294A (zh) 2000-03-22
US20070092955A1 (en) 2007-04-26
CN1495259A (zh) 2004-05-12
EP2345734A3 (en) 2012-03-21
PL335227A1 (en) 2000-04-10
EP0970236A2 (en) 2000-01-12
KR20000075487A (ko) 2000-12-15
JP4217277B2 (ja) 2009-01-28
EP2256211A2 (en) 2010-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ299290B6 (cs) Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia
EP2247737B1 (en) Fermentation medias and processes thereof
JP4573365B2 (ja) 改良された性質を有する形質転換微生物
CZ293836B6 (cs) Způsob výroby @@aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny působením expandázy na penicilin G
Phaff Industrial microorganisms
CN112300953B (zh) 枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用
WO2010115838A1 (en) Fermentation process
EP0783581B1 (en) Process for the production of secondary metabolites
Sharma et al. Effect of dissolved oxygen on continuous production of methionine
Murphy et al. Antibiotics, Enzymes and
Lowe et al. Contribution of mycology to the antibiotic industry
MXPA99007691A (en) Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
BRPI9816369B1 (pt) Fermentative production of useful industrial compounds using chemically defined media
KR0169061B1 (ko) 배양조건 최적화를 통한 자일리톨의 제조방법
PL182509B1 (pl) Sposób wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA)
CN1886519A (zh) 生产包含类胡萝卜素的生物质的方法
RU2257412C1 (ru) Штамм haemophilus influenzae b mech №1 - продуцент капсульного полисахарида - полирибозилрибитолфосфата
Stear Industrial Propagation and Production of Yeast for the Baking Industry

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20180220