CN110199014A - 来自嗜热真菌的单细胞蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产单细胞蛋白质的方法，其中嗜热真菌在高温和酸性pH的可发酵的富含碳的原料上生长。这允许能够在非无菌条件下运行并且没有额外的冷却要求的成本有效的发酵方法。该方法可用于将来自农业或食物生产的副产品或废料、或城市固体废料的有机级分转化成有价值的单细胞蛋白质，其可用作人类食物或动物饲料中的蛋白质的膳食来源或蛋白质补充剂。

Description

来自嗜热真菌的单细胞蛋白质
发明领域
本发明涉及微生物学和发酵技术领域。具体而言，本发明涉及通过由嗜热真菌发酵富含碳和富含能量的原料来生产用于食物产品和动物饲料的单细胞蛋白质。
背景技术
增加的全球人口和财富导致对富含蛋白质的食物如肉类、乳制品、昆虫和鱼的快速增加的需求。因此，在巴西等国家中，大豆生产的增加导致热带雨林的损失，以便能够大规模生产大豆，所述大豆被出口到世界的其他地区。因此，需要更多本地生产的富含蛋白质的动物饲料。生产富含蛋白质的动物饲料的一种方法是通过发酵生产“单细胞蛋白质”(SPC)(Suman et al.，2015，Int J.Curr.Microbiol.Appl.Sci.，Vol 4.，No 9.，pp 251-262)。在这方面的发酵被理解为将富含碳水化合物的原料经微生物转化为富含蛋白质的产品，所述产品由微生物细胞如细菌、酵母或真菌组成。SCP作为动物饲料和食品成分的使用带来了进一步的优点：微生物细胞具有高含量的必需氨基酸，并且例如当用于补充基于谷物的饮食时，微生物细胞产生有用的酶，例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，所有这些都对具有高含量的例如抗营养化合物肌醇六磷酸、不易消化的纤维等的化合物饲料的消化率具有积极影响。此外，特别地，真菌细胞可以非常富含微量元素和维生素，使得发酵的饲料非常有营养。真菌(例如蘑菇)是独特的，在于它们含有植物不能产生的维生素B12。因为维生素B12主要是动物来源的，所以缺乏通常与素食者饮食相关。发现蘑菇含有0.32-0.65mg/克的维生素B12，使得仅3g新鲜蘑菇就提供该维生素的推荐每日容许量。素食者可发现这是获得该重要营养物的有用方式。
Outila等人(1999American Journal of Clinical Nutrition，69：95-98)发现蘑菇中的麦角钙化醇增加了血清25-羟基维生素D浓度，如同补充剂一样有效，使得蘑菇成为可靠的推荐天然维生素D来源。前维生素D存在于一些蘑菇中，尤其是香菇中，并且可以通过日光中的紫外线照射转化为维生素D。虽然几种蘑菇含有可检测量的作为β-胡萝卜素等价物测量的前维生素A，但是维生素A是不常见的。大多数培养的蘑菇被认为含有少量脂溶性维生素K和E，并且对维生素C的日常需求仅有小的贡献。
QuornTM(一种由Fusarium venenatum产生的真菌蛋白)含有维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、维生素B5(泛酸)和生物素(www.mycoprotein.org)。为了优化的目的，本领域技术人员可以选择应用于该方法的特定嗜热真菌，所述真菌维生素含量高，所述维生素是应用于鱼、昆虫、鸡、牛、猪等的饲料所需的，也是食物应用中生产肉替代代用品所需的。
SCP生产中的一个问题是在发酵液中产生的SCP-生物质的浓度，特别是在用细菌或酵母的浸没式发酵的情况下。另一个问题是需要昂贵的酶将廉价的多聚碳源转化为单体可发酵的糖。此外，为了避免感染，当使用嗜温微生物用于SCP生产时，需要应用无菌发酵条件，这由于高资本投资和能量需求导致难以承受的操作成本(Bajpai and Bajpai，1987，J.Ferment.Technol.65，3：349-351)。这些问题中的一些已经通过使用具有嗜热真菌的固态发酵来解决(Grajek，1987，Biotechnol.Bioengineer.32：255-260；and Grajek，1988，J.Ferment.Technol.66，6：675-679)。然而，扩大这种固态方法的规模造成通气和冷却的问题。
US 8,481,295B2公开了使用来自乙醇精炼厂的稀釜馏物进行分批发酵来生产嗜热真菌作为动物饲料成分。然而，其中使用的真菌菌株在pH＜4和高于45℃的温度表现不佳，这使得该方法对细菌和酵母污染敏感。
Gregory K.F等人(1977，Anim.Feed Sci.Technol.2：7-19)公开了使用耐热真菌转化木薯的尝试，在此过程中分离出许多耐热真菌。然而，这些尝试不导致商业化产品，因为它们的生物体保留了污染问题，或者使用了不期望的人类病原体(例如，烟曲霉(Aspergillus fumigatus))，而在大鼠研究中发现它们的毛霉菌属(Mucor)菌株是不易消化的。
几个作者报道了用于生产SCP的耐热真菌Cepalosporium eichornia。例如，Stevens等人(1987，Appl Environ Microbiol.53(2)：284-291)公开了在pH 3.75和45℃使用C.eichornia，在该条件下他们频繁地观察到细菌污染。此外，这些作者无法获得在沉降槽污泥样品中的生长。Varavinit等人(1996，Starch 48：379-380)在pH 3.8和45℃的气升发酵罐中从非常稀的木薯(2％干物质)中产生了的C.eichornia SCP，但从未能够将其商品化。Mikami等人(1982，Appl Environ Microbiol.43(2)：403-11)也进行了C.eichornia发酵并表明其在高于45℃的温度或在低于pH 3.8的pH不可能生长。
Reade和Gregory(1975，Appl Microbiol.30：897-904)公开了使用被鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的嗜热真菌来生产SCP，并且证明在温度为45℃时仍然存在酵母污染，其在温度为47℃时不再是这种情况。然而，由于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是人类病原体，它不适合生产用于食品或饲料的SCP。
本发明的一个目的是解决生产单细胞蛋白质中的这些问题。
发明内容
本发明寻求提供一种用于生产SCP的方法。该方法优选包括以下步骤：a)在含有可发酵的富含碳的原料的培养基中生长嗜热真菌；其中所述真菌在温度高于45℃和pH小于3.8的非无菌条件下以浸没式培养生长；和b)以步骤a)中生长的嗜热真菌的生物质的形式从培养基中回收SCP。优选地，在该方法中，富含碳的原料的浓度低于原料中有毒化合物降低真菌生长速率时所述原料的浓度，和/或富含碳的原料以一定速率补料到培养基中，在该速率时富含碳的原料的浓度保持低于原料中有毒化合物降低真菌生长速率时所述原料的浓度。应当理解，原料中有毒化合物不降低真菌生长速率时所述原料的浓度被定义和/或确定为富含碳的原料不导致真菌CO2产生速率和O2消耗速率中至少一个降低的最高浓度。因此，优选在本发明的方法中，培养基中的富含碳的原料处于小于5、4、3或2％(w/v)干物质的浓度，或以一定速率补料到培养基中以维持小于5、4、3或2％(w/v)干物质的浓度。
在一个实施方案中，根据本发明的方法是包括使用两个或更多个发酵罐的方法，其中至少第一发酵罐被清空用于收获和任选地清洁，而在至少第二发酵罐中继续真菌生长，其中优选在收获和任选地清洁之后，将空的第一发酵罐用第二发酵罐(其中在第一发酵罐收获和任选的清洁期间继续生长)的至少部分内容物填充。
本发明的优选方法是补料分批方法、重复补料分批方法或连续方法，其进一步优选的是碳限制方法，或者至少不是氮限制的方法。
在根据本发明的方法中生长的真菌优选是嗜热真菌，其是真菌属的菌株，所述真菌属选自以下：Rasamsonia、踝节菌属(Talaromyces)、青霉属(Penicillium)、支顶孢属(Acremonium)、腐殖霉属(Humicola)、拟青霉菌(Paecilomyces)、毛壳属(Chaetomium)、根毛霉属(Rhizomucor)、嗜热真菌属(Thermomyces)、根霉属(Rhizopus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Thermomucor、毛霉菌属(Mucor)、Stibella、Melanocarpus、畸枝霉属(Malbranchea)、Dactylomyces、Canariomyces、Scytalidium、Myriococcum、Corynascus和Coonemeria。更优选地，嗜热真菌是真菌物种的菌株，所述真菌物种选自以下：Rasamsonia composticola、Rasamsoniaemersonii、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、Thermomucor indica-seudaticae、Thielavaterricola、Thielava terrestris、Thermoascus thermophilus和根霉属物种(Rhizopussp)，其中更优选菌株Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersoniiCBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascus thermophilus CBS 528.71、Thielaviaterrestris CBS 546.86、埃默森踝节菌CBS 393.64和Thermothelomyces thermophilaCBS 117.65和根霉属物种CBS 143160，其中最优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS143027、CBS 143029、CBS 143160和CBS 143028。
在本发明的优选方法中，例如，如果应用于动物饲料中，可发酵的富含碳的原料是来自农业或食物生产的副产品或废料、青贮饲料和城市固体废料(MSW)的有机级分中的一种或多种。优选地，所述可发酵的富含碳的原料是甜菜浆、来自谷物加工的液体C-淀粉、来自生产去皮、切割蔬菜或废弃蔬菜的蔬菜废料、棕榈研磨残留物(包括棕榈油研磨流出物(POME)、和空果串(EFB)和棕榈叶)中的一种或多种。为了生产用于制造食物产品的SCP，本领域技术人员还可以使用玉米、马铃薯、小麦、大米、木薯、甘蔗或甘蔗汁、甜菜或甜菜汁或适合于食品应用的任何其它蔬菜产品的浓汁、葡萄糖糖浆。
在根据本发明的方法中进一步优选的是，所述培养基含有氮源和/或被补料氮源。优选地，氮源包括氨、尿素和硝酸盐中的一种或多种。更优选地，氮源是存在于得自糖蜜蒸发的负荷冷凝物、甜菜或甘蔗糟、来自葡萄酒工业的糟、葡萄残渣、马铃薯蛋白液(PPL)、玉米浆(CSL)、来自动物农场废气清洁洗涤器的氨和粪便处理的薄级分中的一种或多种胺。
在根据本发明的方法中，优选通过过筛、过滤和倾析中的至少一种从培养基中回收生物质，其中优选过滤的或破坏的生物质(滤饼)的干物质浓度为至少12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％(w/v)。优选地，通过转鼓过滤、压滤机、带式过滤器、筛网(sieve)或DSM筛、旋转筛、带式压力机和倾析离心机中的至少一种从培养基中回收生物质，并且其中更优选地，可以例如通过挤压出残留的水而进一步干燥生物质滤饼。
在根据本发明的优选方法中，在过筛、过滤、倾析和/或进一步压制生物质(滤饼)之后获得的水级分再循环回到发酵和/或用于另外的发酵批次。在本发明的另一优选方法中，操作发酵罐而不需要任何需要输入能量的冷却装置。
一方面，本发明涉及嗜热真菌菌株。优选地，真菌菌株选自以下菌株：Rasamsoniacomposticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS 143030、Thermomucorindicae-seudaticae CBS 143027、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、和根霉属物种CBS 143160。
在另一方面，本发明涉及SCP产品。SCP产品优选地包含来自至少一种嗜热真菌菌株的生物质的蛋白质，所述嗜热真菌菌株选自以下菌株：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascusthermophilus CBS 528.71、Thielavia terrestris CBS 546.86、埃默森踝节菌CBS393.64和Thermothelomyces thermophila CBS 117.65和根霉属物种CBS 143160，其中优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS 143027、CBS 143029、CBS 143028和CBS 143160。优选地，生物质中的蛋白质具有的总必需氨基酸的总和比大豆蛋白质中的总必需氨基酸的总和高至少10％，并且其中更优选地，生物质中的蛋白质具有赖氨酸含量为总氨基酸的至少8.5％和苯丙氨酸含量为总氨基酸的至少10％中的至少一种。
在进一步的方面，本发明涉及一种食物或饲料产品，其包含来自至少一种嗜热真菌菌株的生物质的蛋白质，所述嗜热真菌菌株选自以下菌株：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticaeCBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascusthermophilus CBS 528.71、Thielavia terrestris CBS 546.86、埃默森踝节菌CBS393.64和Thermothelomyces thermophila CBS 117.65和根霉属物种CBS 143160，其中优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS 143027、CBS 143029、CBS 143028和CBS 143160。
附图简述
下面将参照附图更详细地讨论本发明。图1描述了根据本发明方法的总方法概要，其中甜菜浆用作可发酵的富含碳的原料，用于生长嗜热真菌以生产单细胞蛋白质(BETUFEED)和制备真菌水解酶(BETUZYM)和液体甜菜浆的流，其可以直接销售给动物饲料客户或工业用途，但是它也可以根据市场需求补料到发酵罐中。
具体实施方式
本发明涉及生产单细胞蛋白质。具体而言，本发明涉及生产单细胞蛋白质的方法，其中生产嗜热真菌的生物质作为单细胞蛋白质。
术语“单细胞蛋白质”将缩写为“SCP”，并且在本文中理解为是指基本上由以单细胞或单个细胞状态存在的生物体的细胞(包括单细胞细菌、酵母、真菌或藻类)组成的生物质，并且其中生物质，优选干燥形式，适合作为人类食物或动物饲料中的蛋白质或蛋白质补充剂的膳食来源。
在本发明中，开发了新的方法概念，其使用诸如高温和低pH的方法条件，以及使用产生其自身细胞外水解酶的嗜热真菌，这允许该方法在非无菌条件下运行，因为在温度高于45℃和pH低于3.8时，其它(微)生物将不能侵入真菌和/或与真菌竞争。因此，优选使用可在富含能量的碳主导的原料上生长的嗜热真菌，所述原料包括简单的糖例如蔗糖和葡萄糖、果糖，以及聚合糖如淀粉、菊粉、纤维素、半纤维素、甲壳质、果胶以及有机酸如乳酸、乙酸、甲酸，以及乙醇和甲醇(这些代谢物经常在青贮饲料方法中形成或它们从果胶和半纤维素分裂出)，以及以甘油三酯或磷脂形式存在的脂质。还需要转化其它糖，例如存在于半纤维素中的那些；鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、木糖阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸等，以及优选棉子糖、蜜二糖、水苏糖等增强饲料成分的蛋白质产品并最小化来自滤液的碳负担，该滤液必须流向废水处理/生物气装置。还优选由真菌转化甜菜碱、阿魏酸和香豆酸以使产量最大化。在如堆肥的方法中存在的许多嗜热真菌的优点在于它们可以承受非常苛刻的条件并且可以产生酶以将多聚底物诸如碳水化合物分裂成单体糖并转化它们。
在第一方面，本发明涉及生产SCP的方法。该方法优选包括以下步骤：a)在含有可发酵的富含碳的原料的培养基中生长嗜热真菌。优选地，在步骤a)中，真菌以浸没式培养生长。优选地，在步骤a)中，真菌在非无菌条件下生长。优选地，在步骤a)中，真菌在46、47、48、49、50、51、52、53、54或55℃或更高的温度生长。优选地，在步骤a)中，真菌在3.8、3.75、3.74、3.73、3.72、3.71、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0或更小的pH中。该方法优选包括进一步的步骤：b)以步骤a)中生长的嗜热真菌的生物质的形式从培养基中回收SCP。
在低pH生产SCP中待解决的一个问题是许多可发酵的富含碳的原料的毒性。特别是水解的生物质或青贮饲料产品可能含有对大多数微生物有毒的化合物，包括例如有机酸如乙酸、乳酸、阿魏酸、香豆酸、甲酸。当这些酸处于非离解形式时，这些酸在低pH尤其有毒，并且因此可以容易地穿透细胞壁并酸化细胞的内部。当这种可发酵的富含碳的原料应用于低pH和干物质浓度(w/v)高于2、5或10％的发酵中时，毒性将抑制真菌生长。
因此，优选在本发明的方法中，在步骤a)中，富含碳的原料的浓度处于原料中的有毒化合物不降低真菌生长速率的水平。更优选地，富含碳的原料以原料中的有毒化合物不降低真菌生长速率的速率补料到培养基中。例如，在根据本发明的方法中，培养基中富含碳的原料的浓度为小于5、4、3或2％(w/v)干物质，或以一定速率补料到培养基中以维持浓度为小于5、4、3或2％(w/v)干物质。通过测量发酵罐的废气的CO2含量和O2含量中的至少一个，可以方便地检查或监测原料的可发酵性。因此，可以通过增加培养基中原料的浓度，直到达到CO2产生的速率和氧气消耗速率中的至少一个降低的浓度，来测定原料可以使用而不会对真菌的生长速率产生负面影响的最大浓度。因此，优选地，在本发明的方法中，原料中有毒化合物不降低真菌生长速率时所述原料的浓度被确定和/或定义为富含碳的原料不导致真菌的CO2产生速率和O2消耗速率中的至少一个降低的最高浓度。良好发酵的原料将允许CO2产生的速率或氧气消耗的速率快速增加，这可以分别通过来自发酵的废气中的CO2浓度的增加或氧气浓度的降低来测定。当CO2放出(evolution)速率低时，生长缓慢并且可以通过用水稀释来增强，直到生长开始增长(taking off)并且CO2产生加速。
在实例中，例如我们已经通过在接种前将水解的生物质稀释到＜2％干物质来应用补料分批技术，使分批阶段完成，并且当消耗有机酸和糖时，以缓慢的速率在葡萄糖限制条件(例如葡萄糖＝＜2g/L)用水解的生物质开始补料，以允许真菌消耗补料到发酵罐中的所有有毒有机酸。
因此，本发明的优选方法是补料分批方法、重复补料分批方法(其中重复收获发酵液的一部分)或连续方法。优选地，在这样的方法中，稀释速率，即原料被补料到发酵罐中的速率，应当尽可能高，但优选不高于真菌的最大特定生长速率，以防止将真菌洗涤出。在本发明的方法中，稀释速率优选在0.05至0.2l/hr的范围内，其是指在发酵罐中5至20小时的发酵罐中停留时间。因此，稀释速率优选为至少0.05或0.1l/hr，优选不高于0.2l/hr。
在本发明的另一优选方法中，所述方法包括使用两个或更多个发酵罐，其中至少第一发酵罐被清空用于收获和任选地清洁，而在至少第二发酵罐中继续生长真菌。空发酵罐的清洁优选包括消毒，例如通过用酸(例如硫酸或磷酸)、碱(如NaOH或KOH)、消毒剂(例如过氧化氢或过乙酸)或加热(例如蒸汽)冲洗，以便控制例如细菌或酵母对发酵的感染。优选使用CIP装置进行清洁。在一个实施方案中，所述方法在至少一对发酵罐中运行，所述发酵罐交替地清空用于每1、2或3天收获和任选清洗一次。该操作是一种改进版本的方法，其允许在没有方法的不稳定性或质量或方法稳定性偏差的情况下实施非无菌条件。在该方法的另一个优选实施方案中，在收获和任选的清洁之后，用第二发酵罐(其中在第一发酵罐收获和任选的清洁期间继续生长)的至少部分内容物填充空的第一发酵罐。在该方法的下一轮中，收获第二发酵罐并任选地清洁，然后用第一发酵罐(其中在第二发酵罐收获和任选的清洁期间继续生长)的至少部分内容物填充，等等。在该方法的又一个实施方案中，在另外的连续发酵阶段收集收获的发酵批次，以允许更高的产品产量和/或稳定的DSP区域补料。
在本发明的方法中优选的是，管理(原料的)干物质浓度使得氧气消耗速率不超过发酵罐的氧气转移能力，其将导致不充分的通气和不完全的底物氧化。
在本发明的方法中，进一步优选地优化培养基中原料的干物质浓度，使得下游加工是最具成本效益的。为了最小化待过滤和/或倾析的收获的发酵培养基的量，并且为了最小化待蒸发的水的量(例如，在销售矿物质肥料的情况下来自滤液的水)，培养基中原料的干物质浓度优选尽可能高。另一方面，当培养基中原料的干物质浓度过高时，真菌培养液的粘度将增加并且氧气转移将变得有问题。本发明人已经发现，取决于所用原材料、盐胁迫、有毒代谢物，发酵罐中培养基中原料的最佳干物质浓度在2-15％干物质(w/v)的范围内。此外，培养液的流变性部分地由真菌的生长形态决定。本发明方法中真菌的优选生长形态是足够短的菌丝长度，以提供低粘度的发酵液以允许容易的氧气转移和混合，但足够长以允许在低g值容易过滤或倾析。因此，菌丝长度优选在10-500μm(微米)的范围内，并且优选地，菌丝不大量分支。更优选地，菌丝长度在30-300μm的范围内。菌丝体优选可通过保留在筛网或筛子(优选具有0.1、0.5、1或2mm孔径)上而容易地收获。
进一步优选的是，在本发明的方法中，避免氮限制。真菌因此优选在碳限制下生长。因此，产生的生物质的蛋白质含量可以最大化，并且可以避免由于碳过量导致的碳储备和/或储存化合物(例如海藻糖、糖原和/或脂质)的积累。
在本发明的方法中使用的真菌，即在该方法中生长的真菌，优选是嗜热真菌。用于本发明的嗜热真菌优选是在至少45、46、47、48、50、51、52或55℃，有时甚至高于56℃的温度生长的真菌。用于本发明的嗜热真菌也优选是在低pH，即酸性pH生长的真菌。优选的嗜热真菌在3.8、3.75、3.74、3.73、3.72、3.71、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0或更小的pH生长。用于本发明的嗜热真菌优选是纤维素分解和/或半纤维素分解真菌。
“真菌”在本文中定义为真核微生物，并包括真菌亚门(Eumycotina)的所有物种(Alexopoulos et al.，1962，In：Introductory Mycology，John Wiley&Sons，Inc.，NewYork)。术语真菌因此包括丝状真菌和酵母。“丝状真菌”在本文中定义为真核微生物，其包括所有丝状形式的真菌亚门和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人于1983在Ainsworthand Brisby’s Dictionary of the Fungi.7th ed.Commonwealth MycologicalInstitute，Kew，Surrey所定义的)。丝状真菌的特征在于菌丝体壁由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成。营养生长是通过菌丝伸长和碳分解代谢是专性需氧的。
用于本发明的嗜热真菌优选是丝状真菌。在本发明中使用的优选的嗜热真菌是真菌属的菌株，所述真菌属选自以下：Rasamsonia、踝节菌属(Talaromyces)、青霉属(Penicillium)、支顶孢属(Acremonium)、腐殖霉属(Humicola)、拟青霉菌(Paecilomyces)、毛壳属(Chaetomium)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、嗜热真菌属(Thermomyces)、毁丝霉属(Myceliophthora)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、毛霉菌属(Mucor)、Stibella、Melanocarpus、畸枝霉属(Malbranchea)、Dactylomyces、Canariomyces、Scytalidium、Myriococcum、Corynascus和Coonemeria。更优选地，嗜热真菌是真菌物种的菌株，所述真菌物种选自以下：Rasamsonia composticola、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)、Rasamsonia emersonii、Thermomucor indica-seudaticae、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、Thielava terricola var minor、根霉属物种(Rhizopus sp)和Thermoascusthermophilus。这些嗜热真菌的合适菌株可例如从Dutch堆肥中分离，并已被发明人成功地用于证明这些嗜热真菌在高温和低pH在复合营养物上生长良好。接着，在本发明中使用的许多嗜热菌株，例如Thielava terricola var minor和Thermoascus thermophilus，其在高温和低pH也很好地生长。根霉属物种(Rhizopus sp)可以是米根霉(Rhizopus oryzae)、厚孢根霉(Rhizopus chlamydosporus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)或印度毛霉(Mucor indicus)中的任何一种。可选地，根霉属物种可以是与根霉属物种CBS 143160相对应的尚未鉴定的根霉或毛霉物种。优选的根霉属物种在食物中使用是安全的，更优选的根霉属物种是丹贝起子(tempeh starter)。
用于本发明的上述嗜热真菌的优选菌株包括以下在布达佩斯条约的规定下在荷兰(The Netherlands)Westerdijk Fungal Biodiversity Institute Utrecht (以前称为Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)保藏的菌株(给出保藏日期和保藏号)：Rasamsonia composticola CBS 141695(2016年7月29日)、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027(2017年7月21日)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CBS 143029(2017年7月21日)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)CBS 143028(2017年7月21日)、Rasamsonia emersonii菌株CBS 143030(2017年7月30日)、和根霉属物种(Rhizopus sp.)CBS 143160(2017年8月11日)。用于本发明进一步优选的菌株包括Thermomucor indicae-seudaticae CBS 104.75、Thermoascus thermophilus CBS 528.71、Thielaviaterrestris CBS 546.86、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)CBS 393.64和Thermothelomyces thermophila CBS 117.65。用于本发明的特别优选的菌株是Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027、米黑根毛霉CBS 143029、根霉属物种CBS143160和微小根毛霉CBS 143028。
在本发明中使用的嗜热真菌进一步优选的是可以从其获得具有高蛋白质含量的生物质的真菌。优选地，基于干物质，生物质的蛋白质含量为至少30％、35％、40％、45％、50％或55％(w/v)。高蛋白质菌株最可能具有较低含量的碳储备和/或储存化合物，例如海藻糖、糖原和/或脂质。
用于本发明的嗜热真菌进一步优选的是其中生物质中的蛋白质含有一种或多种必需氨基酸的真菌。优选地，蛋白质富含这些必需氨基酸。必需氨基酸在本文中被理解为包括赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、异亮氨酸和亮氨酸中的至少一种或多种，其中赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸是最优选的。
由于SCP产品旨在用于食物或用于人类消费的动物的饲料，因此不期望由待应用的嗜热真菌产生真菌毒素，例如赭曲毒素A和伏马菌素(fumonisin)。因此，优选选择不产生任何真菌毒素的嗜热真菌用于本发明。这种筛选优选通过遗传方式进行，通过例如利用PCR或利用全基因组测序验证真菌毒素途径中的基因是否存在，并且在存在这样的基因的情况下，验证在使用的方法条件下，这些基因不表达和/或这些有毒化合物不产生。
或者，在本发明的方法中待使用的嗜热真菌经遗传修饰以产生增加量的水解酶，优选在本发明中使用转化酶(例如，对于Rasamsonia)、纤维素分解和/或木质纤维素分解酶，如例如WO2011/000949中所述。增强的酶产生可以导致水解时间减少，然后可以使用较小的罐，并且可以将含有酶的滤液/倾析液商品化为次生产品。
用于本发明方法的可发酵的富含碳的原料可以是可用作嗜热真菌的碳源和能源的任何原料。这种富含碳的原料可以是从食品糖的初级生产中新鲜收获的作物，诸如玉米、甜菜、稀汁、浓汁、甘蔗汁。然而，特别是当打算将SCP应用于动物饲料中时，更具逻辑和优选的是使用来自农业和/或食物生产的富含碳的副产品(side-product)或副产物(by-product)或废料流作为原料，例如甜菜浆、来自谷物加工的液体C-淀粉、来自生产去皮或切割蔬菜或来自废弃蔬菜的蔬菜废料，例如来自马铃薯去皮的果皮和来自薯条生产的切割残留物、来自贸易被退回的马铃薯、以及棕榈研磨残渣例如包括棕榈油研磨流出物(POME)(其主要包含棕榈油和棕榈油脂肪酸)和空果串(EFB)或棕榈叶。本领域技术人员还可以考虑作为青贮饲料储存的原料，因此可以全年将其加工成SCP，而原料收获于活动(campaign)诸如在甜菜浆或马铃薯或甜菜叶的情况下。此外，可以使用来自全饲用甜菜的青贮饲料，例如与玉米或全玉米或其青贮形式结合，尽管富含木质素的玉米秸秆是不优选的，甘蔗渣也不是优选的。也可以使用例如来自木质纤维素水解产物的戊糖。这些糖浆主要含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖。用于本发明方法的可发酵的富含碳的原料的原材料的另一个巨大来源是城市固体废料(MSW)的有机级分。也可以使用来自厌氧废水的污泥，例如包括卫生纸。此外，该方法可以消除使用絮凝剂对厌氧污泥进行脱水，因为该方法中的真菌可以在没有絮凝剂的情况下过筛和压制。一旦收集实践已经改进并且可以收获足够干净有机流而无需进一步处理，则这可能变得更加重要。
为了生产用于制造食物产品(用于人类消耗)的SCP，与食物应用相容或在食物应用中可接受的任何植物来源的产品可以作为富含碳的原料应用于本发明中，包括例如玉米、马铃薯、小麦、大米、木薯、甘蔗或甘蔗汁、甜菜或甜菜汁或适用于食物应用的任何其它植物产品的浓汁、糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖糖浆、果糖糖浆。富含脂质的级分(例如植物油或其级分)也可作为富含碳的原料应用于本发明中，因为所选择的生物体还消耗甘油三酯，包括例如大豆油或向日葵油等。
在本发明的方法中，培养基进一步优选含有氮源和/或用氮源补料。优选地，氮源包括氨、尿素和硝酸盐(源)中的一种或多种。更优选地，氮源为还原形式，例如尿素和铵。NH3或H2NO3可以另外地控制发酵罐中的pH，或者尿素可以用作pH非依赖性的氮源供应。还优选来自废料流的氮源。这些包括例如存在于得自糖蜜蒸发的负荷冷凝物、甜菜或甘蔗糟、来自葡萄酒行业的糟、葡萄残渣、马铃薯蛋白液(PPL)、玉米浆(CSL)、来自动物农场废气清洁洗涤器的氨以及粪便处理的薄级分中的一种或多种胺。
在本发明方法的任选的进一步步骤b)中，以步骤a)中生长的嗜热真菌的生物质的形式从培养基中回收SCP。优选地，通过过筛、过滤和倾析中的至少一种从培养基中回收生物质。更优选地，通过转鼓过滤、压滤机、带式过滤器、倾析离心机和过筛的至少一种从培养基中回收生物质。优选通过用具有0.1、0.5、1或2mm孔径的筛网或筛子过筛回收生物质。更优选地，通过在筛网或筛子上进行至少两轮、三轮或四轮连续的过筛来回收生物质，其中在后续的每轮过筛中应用更小的孔径，例如，使用2mm孔径进行第一轮过筛，后续几轮是1、0.5和/或0.1mm。
优选地，过筛、过滤或倾析的生物质(滤饼)的干物质浓度为至少12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、52％、53％、54％或55％(w/v)。任选地，通过进一步除去水，即干燥，进一步增加过筛的、过滤的或倾析的生物质(滤饼)的干物质浓度。
可以通过例如压制出(更多)残留的水而进一步干燥生物质滤饼，其使用例如使用气动压力机的压缩空气和/或机械压制(使用例如带式压力机或螺旋压力机)。在温暖的气候中，生物质(滤饼)可以简单地在空气中(在阳光中)干燥。在将生物质压制成滤饼之后，任选地可以研磨或挤压滤饼，例如以使其干燥，优选空气干燥。优选地，压制的菌丝体生物质滤饼的粒度通过物理手段降低，以能够(更有效)干燥压制的滤饼。任选地，这可以通过使用本领域已知的挤压机通过直径为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2mm的孔挤压菌丝体滤饼来进行。然而，如果压制后压制的滤饼的干物质浓度很高，则不再可能挤压压制的滤饼(例如，当滤饼太硬而不允许挤压时)，可以通过研磨和过筛的组合来减小滤饼的粒度。作为研磨步骤，可以使用本领域已知的任何类型的研磨机，例如刀式研磨机或锤磨机等。为了获得研磨的压制滤饼的均匀粒度，可以在干燥之前通过用具有0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5或3mm孔径的筛网过筛而除去在研磨之后仍然存在的较大颗粒。所得的经研磨的滤饼优选在干燥之前具有1-3mm的粒度。通过减小粒度，从压制的滤饼中蒸发水更有效和更快。
优选地，通过使用废热，例如来自气体冷凝之后获得热水的设备(例如，乙醇蒸馏、马铃薯煮熟、马铃薯的蒸汽去皮等)，来进行滤饼的干燥。可以使用热交换器用来自热源的热水加热干燥空气来加热空气。
优选在温度30-70℃进行挤压的或碾磨的滤饼的干燥。然后热空气可以在带式干燥器或流化床干燥器中以温和且成本有效的方式干燥滤饼。不优选并避免在高温(例如＞80℃)的蒸汽干燥，因为它可以通过变性和烘焙以及甚至通过美拉德反应对氨基酸进行化学分解而对蛋白的消化率产生负面影响。
因此，在本发明的方法中应用的嗜热真菌优选具有良好的过滤性能(参见上文)，使得富含蛋白质的动物饲料滤饼可以通过简单的过滤获得，例如转鼓过滤、筛带、压滤机、带式过滤器等，或在低g力下操作的倾析离心机(Suman等人，2015见上文)、筛网、DSM筛、带式筛网、带式压力机、螺旋压力机。可以通过添加有机酸例如甲酸、乙酸、苯甲酸来稳定潮湿的产品，以防止微生物变质，任选地与保持pH≤4.5组合。尽管液体饲料的生产成本通常较低，但如果运输、物流和/或储存稳定性需求如此，则可考虑使用例如流化床干燥、鼓式干燥、带式干燥或任何其它干燥手段任选地干燥动物饲料滤饼。在特别优选的方法中，生物质的浓度在多个步骤和组合中达到：例如随后通过选自2mm、1mm、0.1mm和50μm中的至少两个的孔径过筛；然后通过筛带、使用螺旋压力机、带式压力机和气动压力机压制中的至少一种进行浓缩。在用于浓缩生物质的最优选的方法中，可以简单地是DSM筛(具有优化直径的筛)、筛带和带式压力机的组合。
在本发明方法的一个实施方案中，含有水和由真菌产生的酶的滤液可再循环并用于下一轮发酵。优选地，最小化整个方法中的水利用。因此优选在该方法中，将在过筛、过滤、倾析和/或进一步压制生物质(滤饼)之后获得的水级分(滤液)再循环回到发酵和/或(再)利用用于进一步发酵批次。当发酵以低干物质(例如，小于10％、5％或2％干物质)运行时，这是特别优选的。优选地，再循环至少10、20、50、60、70、80、90或95％来自回收方法的滤液。如果由于再循环盐和非耗材累积过高浓度，则滤液的一部分可被排放到废水处理和/或用于肥料生产。因此，优选地，选择该方法中的滴定剂，使得可以从滤液中获得合适的肥料组合物，优选包含N、P、K、S、Mg和Ca中的一种或多种的组合物。通过减少废水处理能力和/或淡水使用，水级分的再循环将提高该方法的整体经济性。任选地，可以在第二发酵中使用第一发酵的滤液，其允许第二生物体消耗第一生物体未消耗的碳源。在一个发酵中应用两种或更多种生物体也是可能的。两种不同的嗜热真菌的应用，同时或随后在两个或更多个发酵运行中，将允许优化产量、氨基酸谱、味道、物理行为和更多。在优选的实施方案中，得自具有一种或多种嗜热真菌菌株的第一发酵的滤液用于具有一种或多种嗜热真菌菌株的第二发酵中，其中第二发酵中的至少一种嗜热真菌菌株不同于在第一发酵中使用的菌株。优选地，选择的用于第一和第二发酵的菌株在其生物质的氨基酸谱和/或消耗富含碳的原料的级分的能力方面是互补的。优选地，在第一和第二以及任选的进一步发酵中使用的嗜热真菌菌株选自上文所提及的嗜热真菌和菌株。可随后使用的两种互补嗜热真菌的实例例如是如本文实施例11中例示的Thermomucor菌株和Rasamsonia 141695菌株。
或者，酶可以回收并作为用于动物饲料或洗涤剂、工业清洁等的酶制剂销售。
使用嗜热真菌的另一个优点是可以在没有任何冷却的情况下操作发酵罐(Suman等，2015见上文)，例如，没有需要能量输入的任何(主动)冷却装置。因此，既不需要发酵罐中的内部冷却盘管，也不需要搅拌式发酵罐的挡板中的冷却盘管，也不需要发酵罐壁中的冷却盘管，既不需要Riesel冷却，也不需要冷却塔。也不需要使用热交换器的外部冷却回路。这将减少设备的投资，因为冷却仅依赖于水的蒸发，并且将经由发酵罐的废气排出(通过其排出CO2和/或与发酵罐的环境被动交换的热量)离开发酵罐。
优选地，发酵罐具有用于引入无菌空气(以防止外来真菌孢子或酵母侵入)的装置，并且优选地具有用例如NH3和/或H2SO4或H2NO3控制pH的装置。在一些情况下，对磷酸盐的需求也可能是明显的，并且在这种情况下，在本发明的方法中优选使用磷酸铵。
在其中运行本发明的方法的发酵罐原则上可以是本领域已知的任何类型的发酵罐。有利地，发酵罐是简单的鼓泡塔，其可以以非常大的规模操作，例如＞100m3、＞200m3、＞500m3、＞1000m3、＞2000m3或＞3000m3，由此减少每个工厂的发酵罐数量、总投资和操作成本。
在根据本发明的方法中获得的SCP可以例如用于补充各种不同牲畜动物类型(包括猪、家禽、反刍牲畜以及水生鱼类和甲壳类动物)的饲料。对于SCP作为鱼饲料的应用，优选地，饲料富含ω-脂肪酸源，例如鱼油、或富含脂质的藻类，例如Cryptocodinium cohnii或Traustochytrium aureum。在根据本发明的方法中获得的SCP的另外的优点在于，生产SCP的酸性pH将防止有问题的细菌如大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肠杆菌(Enterobacteriaceae)、李斯特氏菌(Listeria)等(其可存在于在其它方法产生的SCP中)对SCP的污染。
或者，在根据本发明的方法中获得的SCP可以用作食物或食物成分。
鉴于例如大豆具有赖氨酸含量为约总氨基酸的6％，现有真菌SCP具有赖氨酸含量为总氨基酸的8.3％(对于Fusarium venenatum生物质(QuornTM))或5.6％(对于Pekilo蛋白(拟青霉(Paecilomyces varioti)))。本发明人在此已经发现，Rasamsonia composticola的蛋白质的总必需氨基酸的总和似乎比大豆蛋白质的总必需氨基酸的总和高16％，并且对于Thermomucor indicae-seudatica，甚至比大豆蛋白质的总必需氨基酸的总和高25％。此外，本发明人已经发现，来自Thermomucor indicae-seudatica(例如菌株CBS 143027)的SCP具有大于总氨基酸的8.5％以及甚至大于总氨基酸的10％的赖氨酸含量，且具有总氨基酸的至少10％的苯丙氨酸含量。因此，来自Thermomucor菌株的SCP不仅具有高蛋白质含量，而且具有高赖氨酸和苯丙氨酸含量。因此，Thermomucor SCP具有令人惊讶的高营养价值。
因此，在一个方面，本发明涉及由本发明人分离的嗜热真菌菌株。优选地，嗜热真菌菌株选自以下菌株：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersoniiCBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)CBS 143029、根霉属物种(Rhizopus sp.)CBS 143160和微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)CBS 143028。
在另一方面，本发明涉及包含来自生物质的蛋白质的SCP产品，所述生物质可在如本文上文所述的方法中获得或生产。优选地，SCP产品包含或由具有干物质浓度为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、52％、53％、54％或55％(w/v)的干燥生物质组成，并且其被研磨或挤压到平均粒度为1-3mm范围内。在此情况下，产品可被传送以将其打包，将其传送到下一处理步骤。然后可以干燥富含蛋白质的产品。
优选地，根据本发明的SCP产品包括来自至少一种选自以下菌株的嗜热真菌菌株的生物质的蛋白质：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersoniiCBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascus thermophilus CBS 528.71、Thielaviaterrestris CBS 546.86、埃默森踝节菌CBS 393.64和Thermothelomyces thermophilaCBS 117.65和根霉属物种CBS 143160，其中优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS143027、CBS 143029、CBS 143160和CBS 143028。因此，SCP产品可以是生物质或生物质滤饼，其如上文所述回收、压制、干燥、研磨和/或挤压。优选地，SCP产品(或生物质中的蛋白质)具有比大豆蛋白质中的总必需氨基酸的总和高至少10％的总必需氨基酸的总和。更优选地，SCP产品(或生物质中的蛋白质)具有至少为总氨基酸的8.5％的赖氨酸含量和至少为总氨基酸的10％的苯丙氨酸含量中的至少一种。
在进一步的方面，本发明涉及一种食物或饲料产品，其包含来自至少一种选自以下菌株的嗜热真菌菌株的生物质的蛋白质：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascus thermophilusCBS 528.71、Thielavia terrestris CBS 546.86、埃默森踝节菌CBS 393.64、根霉属物种CBS 143160和Thermothelomyces thermophila CBS 117.65，其中优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS 143027、CBS 143029、CBS 143160和CBS 143028。
除非另有说明，否则所有干物质百分比表示为每体积的重量百分比。在本文档和其权利要求中，动词“包括”及其词形变化以其非限制性含义使用，表示包括该词之后的项目，但是不排除未明确提及的项目。此外，除非上下文清楚地要求存在一个且仅一个元素，否则提及不定冠词“一”或“一个”元素不排除存在多于一个元素的可能性。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意味着“至少一个”。
在本说明书中引用的所有专利和文献参考文献的全部内容均通过引用并入本文。
以上已经参考如附图中示出并在下面的实施例中阐述的多个示例性实施方案描述了本发明。对一些部分或元素的修改和替换实施是可能的，并且被包括在如所附权利要求所限定的保护范围内。
实施例
实施例1.从甜菜浆生产富含蛋白质的动物饲料
将1ml冷冻的Rasamsonia composticola CBS 141695菌丝体(-80℃，甘油原液)解冻，并接种至250ml挡板式有氧锥形瓶中的35ml的pH 4.5的酵母提取物/葡萄糖培养基(各为20g/L)中，所述培养基在121℃灭菌20分钟，并在45℃以220rpm 25mm偏心距离孵育48小时。
将10ml该48小时预培养物转移到如下的甜菜浆培养基中：
在2L挡板式锥形瓶中制备250ml培养基，其含有足够K、P、S、Ca、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu的矿物质溶液(为了良好的真菌生长(US20020039758))、1.75gr/L NaNO3、1.75gr/L硫酸二铵(di-ammoniumsulfate)、0.1gr/L酵母提取物和20gr/L Fibrex 500(经碾磨到细糊状的商用甜菜浆Nordic Sugar)。培养基补充有10滴大豆油以防止发泡并在121℃灭菌20分钟。
发酵后，将发酵的糊状物通过Whatman过滤器过滤，然后在分析之前通过冷冻干燥将滤饼干燥成样品FSBP-1(发酵的甜菜浆)。鉴于甜菜浆基于干物质具有10-11％的蛋白质，发酵的甜菜浆样品FSBP-1具有的蛋白质含量为230g粗蛋白(N*6.25)每g干物质，并且下表1中给出氨基酸谱。
表1.与甜菜浆相比，发酵的甜菜浆中的氨基酸谱(Serena et al.Animal FeedScience and Technology 139(2007)109-124)。
甜菜浆 FSBP-1
必需的 ％ ％
精氨酸 6.2 5.7
组氨酸 5.0 3.2
异亮氨酸 5.9 5.8
亮氨酸 8.9 9.8
赖氨酸 10.6 6.6
甲硫氨酸 2.6 2.1
苯丙氨酸 5.3 5.9
苏氨酸 6.7 6.6
缬氨酸 9.1 8.1
非必需的
丙氨酸 6.8 7.0
天冬氨酸 10.6 10.9
半胱氨酸 1.9 1.7
谷氨酸 13.2 13.1
甘氨酸 6.2 6.1
鸟氨酸 0.0 0.0
脯氨酸 0.3 0.0
丝氨酸 0.2 7.2
酪氨酸 0.5 0.0
实施例2.在补料分批方法中生产SCP。
甜菜浆在45℃使用0.02g VisCO Reductase AC100(Weiss Biotech)每克来自青贮饲料方法的糖浆液化为27％干物质。将甜菜浆用水稀释至8％的干物质浓度，并在摇床培养箱中以150rpm 25mm偏心距离摇动。在液化开始时，青贮饲料的pH为3.8，并且在3小时后，将液化的甜菜浆加入到水解反应器中，用水稀释至5.2％干物质，并在15L搅拌槽反应器中以400rpm搅拌，并将温度设为60℃进行另外6小时，并使用8％氨作为滴定剂控制pH为pH 4。然后收获水解产物并冷冻直至用作发酵的补料。
将1ml冷冻小瓶(-80℃的甘油原液)的菌株Rasamsonia composticola CBS141695解冻并加入到250mL挡板式摇瓶中的35mL培养基中，所述培养基含有酵母提取物20g/L和葡萄糖(20g/L)，pH4.5，并在121℃灭菌20分钟。将培养物在45℃孵育24小时，然后转移到2L锥形瓶中的具有相同组成的250mL培养基中，并在180rpm 25mm偏心距离、45℃生长另外24小时。
总共440mL这种接种培养物(250mL的2个烧瓶，由于蒸发而损失一些水100mL)转移到具有以下培养基组成的15L发酵罐中：5.2％的740g甜菜浆水解产物(如上所述)、2L自来水、140克合适的矿物质原液溶液以提供足够的磷酸盐、钾、镁和微量元素)、14克硫酸二铵。使用硫酸将pH设定为3.5。将温度控制在45℃，同时使用空气喷射和增加搅拌速度保持高氧气(＞10％)。21小时后，用液化甜菜浆开始补料。在24小时内加入7.4kg。然后在250毫巴真空下使用Whatman 42Cat No 1442090滤纸在布氏漏斗上过滤培养液，并且可以非常容易地以＞300L/m2/hr的流量过滤培养液。生物质滤饼的干物质含量为33％干物质。
在pH 3.5和48℃在5％干物质，水解的甜菜浆(来自青贮的甜菜储存)的发酵是不可能的。由于在低pH的酸的有毒特性，在48小时后没有观察到发酵开始。
实施例3.从干燥的SCP生产鱼
将525g由实施例2获得的33％干物质生物质滤饼与小麦麸质12.4gr、市售的鱼饲料(27gr)和3.5g碳酸钙混合，通过1mm的挤压机挤压并在流化床干燥器中在30℃干燥。获得145g干燥的SCP，其基于干物质具有约30.8％的蛋白质。该饮食中所有蛋白质的80％来自SCP。将干燥的滤饼研磨并在0.5mm筛网上过筛。
在27-28℃用该实验饲料每天喂养总共15.4克鲜重的7条罗非鱼30天后，获得58.7g的鱼，而加入总共109.5g饲料，证明每克饲料获得0.54g鲜鱼。鱼非常活泼和健康，喜欢该食物并且有正常的粪便。
实施例4.从马铃薯蛋白液(PPL)生产单细胞蛋白质。
通过Van der Stelt(Emsland工厂)获得马铃薯蛋白液(PPL，53％干物质，基于干物质31.4％粗蛋白质，基于干燥物质15.1％钾)。
将1ml冷冻的Rasamsonia composticola CBS 141695菌丝体(-80℃，甘油原液)解冻，并接种至250ml挡板式有氧锥形瓶中的35ml的pH 4.5的酵母提取物/葡萄糖培养基(各为20g/L)中，所述培养基在121℃灭菌20分钟，并在45℃以220rpm 25mm偏心距离孵育48小时。
将25ml该48小时预培养物转移到如下的生长培养基中：
在2L挡板式好氧锥形瓶中制备250ml培养基，其含有酵母提取物/葡萄糖培养基(各为20g/L)，pH4。培养基补充有10滴大豆油以防止发泡并在121℃灭菌20分钟。第二阶段接种阶段的培养以180rpm、25mm偏心距离、在45℃进行。
将250ml生长非常好的培养物接种到含有3L水和1.25gr/L硫酸二铵的Sartorius的15L Cplus发酵罐中，并将PPL(同样的，非无菌)补料到发酵罐中，其补料速率开始在t＝0为10gr/hr，在10hr时增加到100gr/hr，并且保持至15hr，此时补料1000g的PPL。使用25％硫酸作为滴定剂(PPL具有5.6的pH)将pH控制在3.5+/-0.1。将温度控制在45℃，并且在100毫巴过压以0.5vvm通气进行通气，并以750rpm搅拌，通过调节搅拌器速度使氧气保持在40％或更高。基于在pH 3.5和45℃在PPL上的CO2放出，生物体的最大特定生长速率是0.35l/hr，具有2.9小时的倍增时间。
然后取出样品并在过滤和冷冻干燥为FPPL-1(FPPL发酵的马铃薯蛋白液)后进行分析。在废气中测量的CO2产生减少至最大的30％后，通过在3880g离心2分钟来收获细胞，然后用水洗涤沉淀一次并在冷冻干燥器中干燥。FPPL-1粉末通过Dumas方法测定具有35.5％蛋白质的蛋白质含量。在53％干物质时，每kg PPL产生总共115g的FPPL干物质。当添加额外的葡萄糖以平衡培养基的碳与氮之比时，可产生额外的20g的FPPL干物质，其将上清液的铵含量降低至零。这对于最大化钾肥价值是重要的，因为钾肥的氮含量应当尽可能地低以具有最高价值。
实施例5.具有滤液再循环的重复补料分批
在1L发酵罐的培养基中预培养Rasamsonia composticola CBS 141695，所述培养基包含50g/L麦芽糖糊精和20g/L酵母提取物和0.5gr/l向日葵油并且pH设定为4.5且在121℃灭菌20分钟。并用2ml冷冻小瓶的接种材料接种。通气为0.5L/m并且以1200rpm搅拌，温度45℃。
5.1第一发酵(马铃薯废料)
48小时后，将1L培养物转移至15L Cplus发酵罐，其含有2L自来水、0.5L马铃薯液化物(通过组合10L马铃薯洗涤水与0.8％固体、0.8kg 11％固体的蒸汽去皮(马铃薯蒸汽去皮)、和来自蒸汽锅旋风分离器的0.8kg马铃薯泥(6.5％固体)制备)，其通过加入氨以增加pH至4.3、加入1gα-淀粉酶Fuelzyme(Verenium)、并随后在95℃加热1小时来液化，同时在Sartorius的Cplus发酵罐中以500rpm搅拌，1小时后，在使用之前将培养基冷却至70℃。当组合的原料混合时，平均在液化原料中存在19g干物质/kg(1.9％dm)。加入10克确定的培养基矿物质溶液以防止矿物质的短缺，并且加入10g/次的磷酸氢二铵以确保存在过量的铵以构建蛋白质。作为滴定剂，12.5％的铵和7％的HNO3连接到pH控制泵。温度为48℃，pH设定为3.6+/-0.1，发酵罐以2.5L/分钟(LPM)通气、pO2＞10％，搅拌器800-1500rpm。
在16小时的分批生长完成后，可以通过使用Bluesense O2CO2计在发酵罐的出口气体中测量的CO2生产的稳定和减少来观察到。
以2L/小时的速率开始补料，在加入2.5L培养基后，通过加入有毒的液化物(毒性主要是由于存在在马铃薯副产品储存期间形成的有机酸如乙酸和乳酸)完全阻断发酵。为了克服毒性，将培养基用3L水稀释，将pH增加至4.0(使有机酸毒性降低)。然后在已收获3升之后加入4升的水，并再次将pH降低至3.6以防止细菌生长爆发。
在40小时后，菌丝体已经适应培养基，并且以1L/hr补料液化物是可能的，因此我们能够将所有的液化物转化成真菌生物质。菌丝体通过2mm筛网、1mm筛网和0.315mm筛网收获，并且80％的生物质可以在2mm筛网上收获，并且18％在1mm筛网上收获，2％在0315mm筛网上收获。将来自筛网的生物质组合并压制成15.5％干物质的滤饼，并标记为BSZ0174，用于对氨基酸干物质和粗蛋白进行分析。1200g马铃薯终发酵液用于接种使用红甜菜的第二轮。
在显微镜下未见污染。
5.2第二发酵(熟的红甜菜)
收集来自筛网的马铃薯-渗透液(2840克)，并用于悬浮3500克碾磨和熟的红甜菜(来自Albert Heijn)(Beta vulgaris subsp.vulgaris var.ruba)，并且用1200克来自马铃薯发酵的培养液接种6340克糊状红甜菜，加入4000g水以稀释糊状物，以具有11540g的起始重量，其干物质浓度为3.5％。发酵条件再次为48℃、pH3.6(HNO3和NH3)、2.5L空气/min、pO2＞10％、搅拌器800-1500rpm。
24小时后，除了用于下一发酵的1L和由于泡沫溢出(out)问题而损失的2L培养液之外，将培养液过筛。获得500g滤饼，具有21.7％干物质，并将其编码为BSZ0175。
显微镜下未见污染。
5.3第三发酵(生的红甜菜)
通过加入3000g生的红甜菜(Beta vulgaris subsp.vulgaris var.ruba)，在厨房机中捣碎红甜菜之后，使用2977g来自红甜菜发酵的渗透液作为稀释水。将1000g的红甜菜浆加入到具有2000g的自来水和1000g的具有来自第二发酵的菌丝体的培养液的第三发酵罐中。加入10g的新鲜面包酵母以混入(dose)转化酶，因为Rasamsonia composticola不能在蔗糖上生长(至少不是在所有情况下都生长)，并且然后这些酶活性必须来自原材料。pH设定点再次为3.6，温度48℃，2.5L/min通气，pO2＞10％，搅拌器800-1500rpm。在10小时的分批阶段之后，使用来自第二发酵的渗透液进一步稀释剩余的5000g的红甜菜浆，并且在一个小时内补料7000g稀释的补料。
24小时后，将发酵的糊状物在2mm筛网上过筛(95％的干物质在2mm筛网上收获，且4％在1mm筛网上收获)。将压制的滤饼编码为BSZ0176并具有18.0％的干物质。
未见污染。
5.4第四发酵
进行第四发酵以制备乳清发酵。
该批次培养基为：1000g来自第三发酵的培养液，来自第三发酵的4L渗透液。
pH 3.6(HNO3/NH3)，pO2＞10％，搅拌器800-1500rpm，通气2.5LPM，48℃。
补料：
乳糖40g/L，确定的培养基矿物质混合物30g/L，硫酸二铵4g/L，pH 3.3(硫酸)
以80g/hr补料。
在补料50小时后，收获4300g培养液，并且通过一组筛网过筛细胞，并在低生长速率观察到较短的菌丝体，且90％的菌丝体在1mm筛网上，细胞在以乳糖作为唯一碳源在确定培养基上生长，并且培养物保持纯净，未见污染。
没有进一步处理菌丝体滤饼。
5.5第五发酵
将2kg的全甜菜(Beta vulgaris subsp.vulgaris var.altissima)补料到第四发酵留下的5000g培养液中，所述全甜菜在来自第三发酵的4.1L滤液中研磨，并加入10克新鲜面包酵母，以确保蔗糖转化。
在50℃进行发酵，因为我们认为一些酵母出现在第四发酵中。pH 3.6+/-0.1(HNO3/NH3)、通气2.5Lpm、pO2＞10％、搅拌器800-1500rpm、加入3ml止泡剂Basildon。
在发酵20小时后加入1L水后，部分收获10L糊状物(留下4kg培养液)，将糊状物过筛，80％在2mm筛网中，19％在1mm筛网中。将滤饼压制到17.9％dm并编码为BSZ0177。
将来自当地干酪工厂的具有乳酸菌和乳酸的新鲜干酪乳清补料，以200g/hr开始，在补料19小时后，补料速率降低到100g/hr，因为溶解氧低。
当铵达到<300ppm时，我们加入磷酸氢二铵以得到NH3＞500ppm。
将温度增加到52℃以观察对菌丝体长度的影响。
将乳清补料稀释2X以降低菌丝体浓度。
在以600g/hr补料96小时和收获2X稀释的乳清之后，90％的所有菌丝体可以在1mm筛网上收获。
接下来我们再次测试乳清是否可以通过在pH3.6将4L的未稀释的乳清加入到4L培养液中来分批发酵，可以在废气中的CO2产生上看到发酵停止。明显的是，乳酸和乙酸是非常有毒的。在培养液中，我们在该时间测量到3.2g/L的乳酸和0.05g/L的乙酸。在用8至12L的水稀释后，回收发酵，并再次开始用2X稀释的乳清补料。在乳清上生长之后收获的菌丝体编码为BSZ0178，压制后的干物质浓度为19.9％。
在显微镜下未见污染。
5.6第六发酵
使用来自第五发酵的1L培养液，并在5L水(矿物盐培养基和12g磷酸氢二铵与300g蔗糖)中稀释。发酵在52℃、pH 3.6+/-0.1(HNO3/NH3)通气2.5Lpm、pO2＞10％、搅拌器800-1500rpm进行。
16小时后，在蔗糖上生长速率非常低(10小时倍增时间)。加入4g新鲜面包酵母以加速生长。
40小时后，通过过筛和压制收获培养液，并且将样品编码为BSZ0179，干物质为17.9％。
在显微镜下未见污染。
5.7第七发酵
使用来自第六发酵的1L培养液接种该发酵，并且使用3L水稀释该培养液，并且使用具有22.7g/L麦芽糖糊精和矿物盐培养基原液溶液和0.54g/L磷酸氢二铵、pH 3.4(硫酸)的麦芽糖糊精补料。
补料流量为60g/hr。在52℃、pH 3.6+/-0.1(HNO3/NH3)、通气2.5Lpm、PO2＞10％和搅拌器800-1500rpm进行发酵。
补料16小时后，补料流量增加到80g/hr，继续补料5天。
5天后，通过以15.5％压缩菌丝量(Packed Mycelial Volume)(以3880rpm离心15分钟之后的沉淀级分)进行大量收获，将发酵罐培养液体积减少到3.75L。
接下来我们采用猪粪便，将粪便在2mm筛网上过筛以除去固体。4.6kg猪粪便分离成1.6kg厚粪便(未使用)和含有8933ppm NH3的3L薄级分粪便。猪粪便被用于补料到发酵罐中。
当以90g/hr补料薄级分粪便时，继续发酵以高速率产生CO2。但是在22.5小时后，将剩余的1L薄粪便在1小时内泵出，然后完全停止发酵，表明粪便当在低pH应用高浓度时的毒性。粪便中的有毒元素可以是有机酸，如乙酸，也可以是戊酸、丁酸、丙酸，其已知在低pH是极其有毒的，并且当补料太快时不能被消耗并且将抑制真菌生长。
5.8菌丝体组合物的分析
分析7个上述发酵中收获的菌丝体的氨基酸谱和粗蛋白含量。结果示于表2中。
表2清楚地表明产品的氨基酸谱1)不取决于所用的原材料，2)所有Rasamsoniacomposticola CBS 141695样品(BSZ174至BSZ179)的必需氨基酸的总和比大豆蛋白质的高16％，而Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027(以下实施例7描述的发酵)的所有必需氨基酸的总和比大豆蛋白质的甚至高29％，且赖氨酸含量格外高，为＞总氨基酸的9％，且苯丙氨酸尤其高，为＞总氨基酸的10％。
表2：来自所示发酵的真菌生物质的氨基酸谱
实施例6.PPL-发酵
马铃薯蛋白液(PPL)是来自马铃薯加工工业的副产品，并且含有大量的氮、钾和乳酸(由蛋白质和淀粉提取过程中的各个加工步骤中乳酸菌的生长造成)，之后将稀释的蛋白液蒸发为棕色液。PPL由于高灰分不适合于动物饲料，并且由于高浓度的容易消耗的有机物质导致土壤中的厌氧性而不优选作为肥料。
本发明的想法是首先在碳和氮和磷酸盐上生产富含蛋白质的原料，然后过滤生物质并蒸发发酵的PPL以产生更适合作为肥料的产品(含有不太容易消耗的有机物)。
在摇瓶中使用麦芽糖糊精(20g/L和酵母提取物20g/L、向日葵油0.5g/L，pH4.5)在无菌培养基(121℃，20min)中繁殖Rasamsonia composticola，以45℃、220rpm培养3天到厚菌丝体培养液，然后加入到发酵罐中(将250ml的接种培养物加入到4L具有葡萄糖1aq200gr/L和3L水的培养基中)。以10g/hr开始用PPL补料，在10小时内线性增加至100g/hr。用25％的硫酸将pH控制在3.5，并且将温度保持在45℃，同时通过以2.5Lpm通气并在需要时增加搅拌器速度来保持pO2＞10％的饱和度。在补料开始后19小时，停止补料并加入1281gPPL。之后，使发酵继续，直到从培养液中除去所有的氨。
表3：PPL在发酵之前(PPL-EMS)和之后(FPPL-2)的组成
PPL-EMS FPPL-2
干物质％ 41.8 43.4
灰分％ 12.6 20.5
有机物质％ 29.2 22.9
P2O5％ 1.1 1.1
N％ 2.4 1.8
K2O％ 7.4 6.2
K2O/N比 3.1 7.2
K2O/dm％ 7.4 16.6
PPL是可发酵的，并且在发酵之后，将所有生物质过筛并压制成动物饲料滤饼，确定其组成并在以上实施例5的表2中给出，其基于干物质具有30％的粗蛋白和非常好的氨基酸谱。
表3显示了在与有机钾肥料发酵之前，PPL的组成的比较(FPPL＝发酵的马铃薯蛋白液)，并且显示后者通过使钾含量增加一倍以上而改善，并且钾/干燥物质含量提高2.5倍。
在发酵期间测定葡萄糖、乳酸、糊精和DP2(聚合程度＝2，包括例如麦芽糖和异麦芽糖)的水平(数据未显示)。结果表明，Rasamsonia composticola可以共消耗乳酸和葡萄糖，并且通过在pH 3.5温和地补料浓度不超过15g/L的乳酸而存活。相反，如果在pH 3.5在45℃用纯PPL开始分批发酵，则我们观察到根本没有生长。
实施例7.具有间歇清洁的重复补料分批
在2L挡板式摇瓶中预培养Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027，所述摇瓶具有250mL培养基(具有50g/L麦芽糖糊精和20g/L酵母提取物和0.5gr/L向日葵油、pH设定为4.5并在121℃灭菌20分钟)。然后将该预培养物转移到Sartorius的15L Cplus发酵罐，称为发酵罐A，其具有5L确定的矿物质培养基并具有20g/L葡萄糖和2g/L硝酸铵。温度为46℃且pH 3.7+/-0.1(7.5％NH34N H3PO4)，pO2通过以900rpm搅拌和以2.5L/min通气来控制。
在过夜生长后，以40g/L糖和2g/L磷酸氢二铵的浓度和208g/hr的补料速率开始用糖蜜补料。在补料5L培养物之后，将10L培养物分成两份5L于发酵罐A和B中。在两个发酵中，均以357g/hr开始用糖蜜补料(与之前相同)。两个发酵罐均以2.5Lpm和900rpm通气、46℃且pH控制在pH 3.7+/-0.1(7.5％NH3 4N H3PO4)。在加入补料后，通过随后过筛2mm、1mm和0.315mm筛网和0.08μm筛网，收获发酵罐A的所有生物质。在这些筛网上，滤饼的分布分别为80％、18％、1％和1％。将滤饼压制，在50℃在流化床干燥器中干燥，得到用于氨基酸分析的样品BSZ0209(参见实施例5)。滤液是澄清的。由于我们在显微镜下看到一些细菌球菌，我们使用25％的硫酸使发酵罐B的发酵液酸化至pH 2.2达30分钟，同时我们用含有70％磷酸的pH2.2的热水冲洗发酵罐A 20分钟以杀死发酵罐A中的细菌，然后将发酵罐B分成发酵罐A和B，从而使两个发酵罐中再次为5L，并且我们以357g/hr重新补料，同时将pH控制在3.3以及将温度控制在48℃。在14小时后补料至全体积后，将发酵罐进一步通气4小时以上以消耗所有残留的糖和有机酸，收获发酵罐B并过筛。
35％的滤饼在筛网2mm、70％的在筛网1mm，且5％的在较小的筛网中，表明菌丝体在pH3.3和48℃的第二次运行中变得更短，并且其在50℃压制和干燥，得到用于氨基酸分析的样品BSZ0210(参见实施例5中的表2)。
现在将发酵罐B清洁并酸洗，将发酵罐A酸化至pH 2.2持续30分钟，然后按50％-50％分至发酵罐A和B，随后在pH 3.3和48℃进行第三发酵，然后压制并干燥以获得用于氨基酸分析的样品BSZ0211(参见实施例5中的表2)。
以此方式，我们可以在原则上无限地可控地操作和保持污染，但是通常仅每3、6或12个月必须在工业规模上停止以维护停止或大清洁。
实施例8.菌丝滤饼的机械脱水和空气干燥
如从实施例7的前2个循环的筛网(即，筛网2mm和1mm)收获的Thermomucorindicae-seudaticae CBS 143027的菌丝体具有11-15％的干物质浓度，并且随后用手通过实验室尼龙布压制到20-30％干物质，并使用实验室规模的具有可调节时间和压力的气动压力机(Mareco Mini PER MMP3)压制至45-50％干物质。
压制后的干物质百分比在表4中给出，此时初始滤饼输入为75g、干物质28.0％。表5显示了Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027已经在糖蜜或全玉米上生长之后的干物质。初始干物质为25％，75克批次在2巴压制。
表6显示了75g在糖蜜或碾磨的玉米上生长的Rasamsonia composticola CBS141695浓缩物在2巴压制之后的干物质。从以手压制的26.2％干物质开始。通过以0.2gr/kg玉米干物质使用淀粉酶αFuelzyme(Weiss Biotech GmbH)液化全玉米粉来生产生长菌丝体的玉米，玉米以5％剂量的浓度悬浮于水中，使用10％硫酸和4N NaOH将pH调节至4.3，然后加热至90℃1小时，然后在接种前冷却至46。在接种前使用10％磷酸进一步调节pH至3.6，加入2g/L硫酸二铵，并且用2％完全生长的Thermomucor indicae-seudaticae接种体CBS143027培养物接种发酵罐。在发酵期间使用12.5％的氨将pH控制在3.6+/-0.1，并且通过以0.5vvm喷射空气以及800rpm或更高的搅拌在所有时间将pO2保持在＞20％，并且温度为46℃。24小时后，通过在1mm筛网上过筛并手动用粗棉布压制至33％干物质来收获培养物。
机械脱水Rasamsonia composticola(生长于50℃)和Thermomucor indicae-seudaticae(生长于46℃)非常有前景，并且当在糖蜜(2％最终糖于10升培养液中)上生长时以及当在玉米粉(5％玉米粉，2gr/L磷酸氢二铵)上生长时，可以获得非常高水平的干物质。在没有筛网的情况下，可以通过Retch研磨机以8000rpm将非常干燥的滤饼研磨成颗粒产品。颗粒可用作新鲜动物饲料成分，且其可容易地在流化床干燥器中在50℃干燥。在实验室规模流化床干燥器中，其在30分钟内干燥＞90％。
表4：压制Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027生物质之后的干物质随时间和压力变化的百分比(在糖蜜上生长)。
时间 压力 2巴 3.5巴 5巴
30sec 37.2％ 39.2％ 42.5％
60sec 41.1％ 42.6％ 45.6％
120sec 51.4％ 46.2％ 48.8％
表5：在糖蜜或全玉米上生长的Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027生物质的干物质随压制时间变化的百分比的比较。
表6：在糖蜜或全玉米上生长的Rasamsonia composticola CBS 141695生物质的干物质随压制时间变化的百分比的比较。
时间(min) 糖蜜 玉米
0.0 26.2％ 30.0％
0.5 37.1％ 40.6％
1.0 40.9％ 44.2％
1.5 42.3％ 45.4％
2.0 42.7％ 46.3％
3.0 46.5％ 48.5％
5.0 46.1％ 47.3％
实施例9.替代的菌株
测试一组替代的菌株，它们是在高温和低pH制备SCP的合适的替代。部分菌株从得自Van Iersel Biezenmortel BV的荷兰堆肥中分离。通过向1L水中加入100g堆肥，将其彻底混合30分钟，2mm筛网过筛，并将其加入Cplus发酵罐中含有0.5％Fibrex 500(甜菜浆纤维)、0.5％小麦麸、0.5％、纤维素BH2000.5％和麦芽糖糊精0.5％和2g/L硫酸二铵的6L培养基中。矿物质培养基矿物质溶液包含足够的K、P、S、Ca、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu用于良好真菌生长(US20020039758)，并且发酵罐以3L/分钟通气，以及100毫巴超压、500rpm、50℃、pH 3.6(用稀释的磷酸和12.5％铵控制)。发酵罐运行1周，温度和pH改变，在50-60℃之间、pH在2.7-3.2的各种组合之间变化。真菌以直至10-6的系列稀释铺板，铺板在从Eindhoven的Tritiummicrobiologie获得的OGYE琼脂培养基上。在48℃的板上生长2天后，挑选最高稀释上最显著的真菌，重新划线菌落，并且使用PCR扩增以及来自Base Clear的测序服务(利用它们的ITS真菌身份确定)来确定身份。使用ZR Fungal/Bacterial DNA Microprep kit(D6007)提取基因组DNA。用引物组ITS1-PCR、ITS5-PCR、ITS1-F-PCR、SR6R-PCR和fungi-28s-UNIR(表7)运行一次单一PCR扩增反应。对在六个不同的反应中所获得的扩增子进行测序，每个反应用不同的引物。用于Sanger测序的引物描述于表8中。每个菌株的6条测序的链在NCBI数据库中进行核苷酸BLAST，以对应序列。
表7：用于ITS扩增的PCR引物。
ITS1-PCR TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS5-PCR GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS1-F-PCR CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
SR6R-PCR AAGTAAAAGTCGTAACAAGG
fungi-28s-UNIR GGTCCGTGTTTCAAGACG
表8：用于Sanger测序的引物。
ITS2-SEQ GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS3-SEQ GCATCGATGAAGAACGCAGC
ITS4-PCR TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5-PCR GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
Fungi-28s-UNIF GGTCCGTGTTTCAAGACG
Fungi-28s-UNIR GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG
获得6株分离株并测定为：
Rasansonia emersonii(1701-3-7)
Thermomucor indicae-seudaticae(分离株11)
Thermomucor indicae-seudaticae(1701-1-2)
米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)(1701-1-9)
微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)分离株13
微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)分离株12
接下来，从CBS订购许多嗜热真菌菌株以及一些我们自己的分离株，以筛选在高温和低pH生长、可过筛的形态和生产大量蛋白质的菌株(42℃，在具有葡萄糖1％、酵母提取物4％的培养基中，在220rpm摇动3天并通过过滤收获，用水洗涤菌丝体并冷冻干燥成＞98％干物质)。结果总结于表9中。
表9：嗜热真菌菌株的特性
ND＝未测定
在15L规模的发酵罐上再测试一些菌株以评价生物质产量、蛋白质含量和氨基酸谱。在各种pH和温度生长时，使用甘蔗糖蜜作为C限制补充的碳源(葡萄糖＜2g/L，NH3＞500ppm)，补料中含有2g/L的磷酸氢二铵，将甘蔗糖蜜补料入发酵罐中至终浓度为2％糖。pO2控制在＞10％，使用4N H3PO4和12.5％NH3来控制pH。在Rasamsonia composticola的情况下，在甘蔗糖蜜上的发酵将0.5gr/L的活性干酵母加入到分批培养基中，因为Rasamsoniacomposticola不在蔗糖上快速生长，因为其缺乏转化酶活性，且蔗糖的酸水解可能太慢。在糖上的生物质干物质的典型产量为大约0.5g干物质每g糖，并且可通过在1mm筛网上过筛收获＞99％的生物质。结果总结于表10中。
表10：所选择的嗜热真菌菌株在甘蔗糖蜜上的发酵。
实施例10.在废水污泥上生长嗜热真菌和在没有絮凝剂的情况下脱水
Rasamsonia composticola CBS 141695以实验室规模在2L锥形瓶中的250ml培养基预生长，所述培养基基于卫生纸作为唯一碳源(10gr/L和硫酸铵2gr/L，补充有本领域已知的矿物质培养基，将pH调节至4，并且培养基在121℃灭菌20分钟)。冷却下来之后，接种烧瓶并在48℃孵育2天。然后将完全生长的培养物以8gr/L干物质转移到具有7L初级废水污泥的7L鼓泡塔中，将鼓泡塔以0.3vvm通气，并且将温度保持在48℃以及pH 3(磷酸4N)。将培养基培养两周，每天收获2L，并补充新鲜的污泥。然后将2L发酵的污泥在1mm筛网上过滤，并将滤饼在de Mareco MiniPress MMP3上压制。可以以这种方式获得具有45％干物质的滤饼而不添加絮凝剂。
实施例11.用Thermomucor发酵玉米，收获菌丝体并将滤液用第二生物体Rasamsonia发酵以增加产量
预培养条件
解冻以-85℃冷冻的菌株Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和菌株Rasamsonia composticola CBS 141695的真菌培养物，并用于接种在含有121℃灭菌15分钟的250毫升YG液体培养基(20g L-1葡萄糖、20g L-1酵母提取物、用H2SO4/MaOH调节pH 4.5)的挡板式摇瓶中。将培养物在42℃并以180rpm摇动孵育直到完全生长(大约3天)。
生长培养基
对于在玉米上生长菌株CBS 143027，将500g玉米粉溶解于9500g水中(5％w/w)。对于该溶液的淀粉液化，加入0.2ml的商用内-α-淀粉酶 LF(WeissBiotech，Germany)。在pH4.5(用H3PO4调节)和90℃进行液化3小时。此后，将温度降低至46℃并加入(NH4)2HPO4至终浓度为2g L-1。然后使用H3PO4将pH调节至pH 3.5。
培养菌株CBS143027
使用487g完全生长的菌株Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027的预培养物接种玉米培养基。培养在15升的 Cplus发酵罐(Sartorius StedimBiotech，Bangalore，India)中在100巴的压力、搅拌500rpm，空气流入5L min-1(VVM＝0.5)和46℃进行。在发酵过程中使用12.5％氨和20％w/w H3PO4将pH连续调节至pH 3.50。在废气中连续测量O2和CO2的浓度。如果溶解的氧低于饱和值的30％，则自动增加搅拌速度以保持其高于该阈值。在培养的整个期间以1g h-1的速率加入止泡剂(葵花油)。
收获T.indicae-seudaticae生物质并用R.composticola接种下一发酵
培养46小时后，收获反应器的内容物并用孔径为2、1、0.315和0.180mm的金属筛网过筛。对每一个筛网中的滤饼进行称重并使用粗棉布过滤器手工压制。对这两个步骤的滤液进行称重并保存用于使用菌株Rasamsonia composticola CBS141695的下一培养循环。在开始该培养之前，将发酵罐的壁用水洗涤以除去不能通过标准收获最初除去的生物质。
将具有1.1％的第一培养循环的滤液放回到发酵罐中，并用479g的菌株Rasamsonia composticola CBS141695的完全生长预培养物接种。培养条件为：100巴，空气流入5L min-1，搅拌1000rpm，48℃和pH 3.20。还以1g h-1连续加入止泡剂。在生长45小时后收获发酵罐的全部内容物。
结果
Thermomucor indicae-seudaticae在5％干物质的无毒全玉米培养基中生长良好。在玉米培养基上培养46小时后，收获10.05kg培养物并过筛。过筛得到2252g湿滤饼，其中大部分98％用1mm(18％)和2mm(80％)金属筛网分离。为了从该滤饼中除去更多的液体，使用粗棉布过滤它。这得到干物质含量32.0％的682g滤饼。总共收获218.2gr的干菌丝体。
从过筛和粗棉布过滤回收8994g滤液，其干物质含量为1.10％±0.18％。该滤液具有pH 3.12和氨浓度430ppm。滤液具有1.1％干物质的事实表明一些糖和/或其它可溶性底物没有被有效地消耗。如果是这种情况，则该方法可以通过在该来自第一发酵的滤液上生长更宽的或不同底物范围的菌株来实现改善。
将来自Thermomucor发酵的8336g滤液用作Rasamsonia composticola生长的培养基。培养45小时后，收获8.03kg培养物。在具有2mm、1mm、0.315mm和0.18mm的4个筛网上分别进行过筛并收集收获物，得到5.69％dm的911g湿滤饼。生物质产量为51.9gr干物质。滤液现在含有0.86％dm。
整个方法的总生物质产量现在是218.2gr的Thermomucor+51.9gr的Rasamsonia，这意味着在500*0.88＝440gr的玉米干物质中得到总共270.1gr的干菌丝体，在每gr投入该方法的玉米干物质中产生0.61gr干SCP的高蛋白产量。
添加第二步骤使生物质产量增加24％，并且滤液中的干物质减少22％。
实施例12.根霉属物种(Rhizopus sp.)的分离和适应酸性条件和高温
通过在OGYE琼脂上铺板并在通风橱下在37℃培养，从商业丹贝起子中分离根霉属菌株。为了分类鉴定，分离基因组DNA，并扩增内转录间隔区(ITS)区域并测序。使用引物5’-TGCCAGTAGTCATATGCTTGT‘3(Euk20f；正向)和5’-ACCAGACTTGTCCTCCAAT-‘3(反向)(Integrated DNA Technologies)扩增ITS片段。使用用于扩增ITS的相同引物，由BaseClear(Leiden，the Netherlands)进行Sanger测序。用正向引物获得的测序结果显示为SEQ ID NO：13并且用反向引物获得的那些显示为SEQ ID NO：14。当这些序列在NCBI数据库进行blast时，没有发现具有100％相同性和100％覆盖率的单个根霉属物种。发现具有99-100％百分比相同性和96-98％覆盖率的为米根霉(Rhizopus oryzae)、厚孢根霉(Rhizopus chlamydosporus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)和印度毛霉(Mucor indicus)。
随后在含有用于真菌生长的培养基(US20020039758)以及足够的K、P、S、Ca、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu并加入2g/L NH4NO3、1.7g/L Yeast Nitrogen Base(没有氮源)和20g/L葡萄糖的摇瓶中生长菌株。通过加入H2SO4和/或NaOH将pH调节至pH 3.5。将35mL该培养基加入到挡板式锥形瓶中，并在121℃灭菌15分钟。
然后通过在每次连续转移(1mL进入下一35mL培养基)后提高生长温度，使分离株适应更高的温度。当在220rpm、2.5cm冲程摇动培养物时通过目视检查获得厚培养物之后(通常在2-3天后)进行转移。在pH 3.5和46℃生长后，倍增时间小于15小时，将菌株保藏为CBS 143160。
序列表
<110> 维姆德拉特咨询有限公司
<120> 来自嗜热真菌的单细胞蛋白质
<130> P6062208PCT
<150> NL2017309
<151> 2016-08-11
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
cttggtcatt tagaggaagt aa 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
aagtaaaagt cgtaacaagg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
ggtccgtgtt tcaagacg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
gctgcgttct tcatcgatgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
gcatcgatga agaacgcagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
ggtccgtgtt tcaagacg 18
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
tgccagtagt catatgcttg t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
accagacttg tcctccaat 19
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<212> DNA
<213> Rhizopus sp.
<400> 13
cskksmgkgt ymywaggtat aaataacttt atattgtgaa actgcgaatg gctcattaaa 60
tcagttatga tctacgtgac aaattcttta ctacttggat aaccgtggta attctagagc 120
taatacatgc aaaaaagccc tgacttacga aggggtgcac ttattagata aaaccaacgc 180
ggggtaaaac ctgtttcttg gtgaatcata ataattaagc ggatcgcatg gccttgtgcc 240
ggcgacggtc cactcgattt tctgccctat catggttgag attgtaagat agaggcttac 300
aatgcctaca acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac 360
ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg 420
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<212> DNA
<213> Rhizopus sp.
<400> 14
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gtcactacct ccccgtgtcg ggattgggta atttgcgcgc ctgctgcctt ccttggatgt 120
ggtagccgtt tctcaggctc cctctccgga atcgaaccct aattccccgt tacccgttgt 180
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taactgattt aatgagccat tcgcagtttc acaatataaa gttatttata cttagacatg 480
catggcttaa tctttgagac aagcatatgc ttwactggca 520

Claims (15)

1.一种用于生产单细胞蛋白质(SCP)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在含有可发酵的富含碳的原料的培养基中生长嗜热真菌；其中所述真菌在高于45℃的温度和pH小于3.8的非无菌条件下以浸没式培养生长；和，
b)以步骤a)中生长的嗜热真菌的生物质的形式从培养基中回收SCP。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述富含碳的原料的浓度低于所述原料中的有毒化合物降低所述真菌生长速率时所述原料的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，将所述富含碳的原料以保持富含碳的原料浓度低于所述原料中的有毒化合物降低所述真菌生长速率时所述原料的浓度的速率补料到所述培养基中，并且其中优选地，所述原料中的有毒化合物降低所述真菌生长速率时所述原料的浓度被定义为所述富含碳的原料不会导致所述真菌CO2的产生速率和O2的消耗速率中的至少一个降低的最高浓度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基中的富含碳的原料的浓度为小于5％(w/v)干物质或以维持浓度为小于5％(w/v)干物质的速率补料到所述培养基中。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用两个或更多个发酵罐，其中至少第一发酵罐被清空用于收获和任选地清洁，而在至少第二发酵罐中继续真菌生长，其中优选地在收获和任选的清洁之后，将空的第一发酵罐用所述第二发酵罐的至少部分内容物填充，其中所述第二发酵罐在所述第一发酵罐的收获和任选的清洁期间继续生长。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是补料分批方法、重复补料分批方法或连续方法，优选碳限制方法。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述嗜热真菌是真菌属的菌株，所述真菌属选自以下：Rasamsonia、踝节菌属(Talaromyces)、青霉属(Penicillium)、支顶孢属(Acremonium)、腐殖霉属(Humicola)、拟青霉菌(Paecilomyces)、毛壳属(Chaetomium)、根毛霉属(Rhizomucor)、嗜热真菌属(Thermomyces)、毁丝霉属(Myceliophthora)、热子囊菌属(Thermoascus)、毛霉菌属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、Thermomucor、梭孢壳属(Thielavia)、Stibella、Melanocarpus、畸枝霉属(Malbranchea)、Dactylomyces、Canariomyces、Scytalidium、Myriococcum、Corynascus和Coonemeria，其中更优选地，嗜热真菌是真菌物种的菌株，所述真菌物种选自以下：Rasamsonia composticola、Rasamsoniaemersonii、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)、Thermomucor indica-seudaticae、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、根霉属物种(Rhizopus sp)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、Thielava terricola var minor和Thermoascus thermophilus，其中更优选菌株Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascus thermophilus CBS 528.71、Thielavia terrestrisCBS 546.86、埃默森踝节菌CBS 393.64和Thermothelomyces thermophila CBS 117.65和根霉属物种CBS 143160，其中最优选CBS 141695、CBS 143030、CBS 143027、CBS 143029、CBS 143160和CBS 143028。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可发酵的富含碳的原料是农业或食物生产的副产品或废料青贮饲料、城市固体废料(MSW)的有机级分和与食物应用相容的植物来源产品中的一种或多种，其中优选地，所述可发酵的富含碳的原料是甜菜浆、来自谷物加工的液体C-淀粉、来自生产去皮、切割蔬菜或废弃蔬菜的蔬菜废料、包括棕榈油研磨流出物(POME)、空果串(EFB)棕榈叶的棕榈研磨残留物、玉米、马铃薯、小麦、大米、木薯、甘蔗或甘蔗汁、甜菜或甜菜汁或浓汁、糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖糖浆、果糖糖浆和植物油。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基含有氮源和/或被补料氮源，其中优选氮源包含氨、尿素和硝酸盐中的一种或多种，其中更优选氮源是存在于得自糖蜜蒸发的负荷冷凝物、甜菜或甘蔗糟、来自葡萄酒工业的糟、葡萄残渣、马铃薯蛋白液(PPL)、玉米浆(CSL)、来自动物农场废气清洁洗涤器的氨和粪便处理的薄级分中的一种或多种胺。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过过筛、过滤和倾析中的至少一种从所述培养基中回收所述生物质，其中优选地，过筛的、过滤的或倾析的生物质(滤饼)的干物质浓度为至少12％(w/v)，并且其中更优选地，通过转鼓过滤、压滤机、带式过滤器、筛子、筛网、带式筛网、DSM筛、带式压力机、螺旋压力机和倾析离心机中的至少一种从所述培养基中回收所述生物质，并且其中更优选地，可以通过例如将残留的水压制出而进一步干燥生物质滤饼。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在过筛、过滤、倾析和/或进一步压制生物质(滤饼)之后获得的水级分再循环回到发酵和/或用于另外的发酵批次。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中操作发酵罐而不需要任何需要输入能量的冷却装置。
13.一种嗜热真菌菌株，其中所述菌株选自以下菌株：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersonii CBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS143027、米黑根毛霉CBS 143029、根霉属物种CBS 143160和微小根毛霉CBS 143028。
14.一种SCP产品，其包含来自至少一种嗜热真菌菌株的生物质的蛋白质，所述嗜热真菌菌株选自以下菌株：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsonia emersoniiCBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascus thermophilus CBS 528.71、Thielaviaterrestris CBS 546.86、根霉属物种CBS 143160和Thermothelomyces thermophila CBS117.65，其中优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS 143027、CBS 143029、CBS 143160和CBS 143028，其中优选生物质中的蛋白质具有的总必需氨基酸的总和比大豆蛋白质中的总必需氨基酸的总和高至少10％，并且其中更优选地，生物质中的蛋白质具有赖氨酸含量为总氨基酸的至少8.5％和苯丙氨酸含量为总氨基酸的至少10％中的至少一种。
15.一种食物或饲料产品，其包含来自至少一种嗜热真菌菌株的生物质的蛋白质，所述嗜热真菌菌株选自以下菌株：Rasamsonia composticola菌株CBS 141695、Rasamsoniaemersonii CBS 143030、Thermomucor indicae-seudaticae CBS 143027和CBS 104.75、米黑根毛霉CBS 143029、微小根毛霉CBS 143028、Thermoascus thermophilus CBS 528.71、Thielavia terrestris CBS 546.86、根霉属物种CBS 143160和Thermothelomycesthermophila CBS 117.65，其中优选菌株CBS 141695、CBS 143030、CBS 143027、CBS143029、CBS143160和CBS 143028。
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